CN107250350A - 持续维持运动神经元前驱细胞生长的方法及医药组合物 - Google Patents

Abstract

提供了一种持续维持运动神经元前驱细胞生长的方法及医药组合物，其中，该持续维持运动神经元前驱细胞生长的方法通过将运动神经元前驱细胞培养在由嗅神经髓鞘细胞所建构的环境中，使运动神经元前驱细胞长期地维持自我复制以及得以被诱导分化为成熟神经元的能力。

Description

持续维持运动神经元前驱细胞生长的方法及医药组合物 技术领域

本发明有关于维持神经干细胞生长的方法，特别指一种持续维持运动神经元前驱细胞生长的方法及医药组合物。

背景技术

万能胚胎干细胞可作为一种生产所需神经细胞群的来源，为目前具有潜力的细胞取代疗法(Kozubenko N et al.,2010；Mandai M et al.,2010；Boddington SE et al.,2010)。一般来说，胚胎干细胞分化步骤包含依序提供神经诱导因子以及区域形成因子(regional patterning factors)，用以引导细胞分化以及细胞类型的转换(cell fate conversion)，给予发育阶段的胚胎信号，可使胚胎干细胞在体外，重现体内个体的早期发育(Muguruma K et al.,2012；Willerth SM,2011)。举例来说，抑制BMP信号，均可使胚胎个体与胚胎干细胞产生原始神经上皮前驱细胞(neuroepithelial progenitor cells，EPCs)。当EPCs进一步通过给予音波状蛋白(sonic hedgehog，SHH)以及视黄酸(retinoic acid，RA)，可形成脊髓运动神经元。先前研究显示，胚胎干细胞衍生的神经细胞，与胚胎中的正常神经元相似，并可表现神经元正常生理功能，如释放神经传导物质以及可产生动作电位(action potential)。在疾病模式动物，移植胚胎干细胞衍生神经元可回复其运动能力以及行为表现，但其成功率取决于被移植的神经元是否具有高活性与高存活率(Lopez-Gonzalez R et al.,2009；Harper JM et al.,2004；Chiba S et al.,2003)。

由于脊髓及脑干的运动神经元其生理与病理的重要性，因此，其成为一个独特的神经元族群而被广泛地研究(Lopez-Gonzalez R et al.,2012；Chipman PH et al.,2012；Jessell TM et al.,2011；Thonhoff JR et al.,2009)。虽然发育过程中，复数个运动神经元的特异性转录因子(lineage-specific transcription factors)已被发现(Chipman PH et al.,2012；Wu CY et al.,2012；Takazawa T et al.,2012；Wada T et al.,2009)，但是，相较于脑室旁与海马回的神经干细胞族群，目前几乎没有对于运动神经元群自我复制及维持的分子基础研究。由基因修饰小鼠的研究结果显示，音波状蛋白及其下游Gli路径为运动神经元前驱细胞生长的关键因子(Wu SM et al.,2012；Oh S et al.,2009；Ruiz i Altaba A,1998)，但，目前仍无法得知运动神经元前驱细胞群的生长，是否需要其他分泌因子。此外，由于运动神经元族群制备的低产出及低纯度，导致关于与运动神经元增生的研究受到限制。而通过脊髓神经元与小鼠N18神经母细胞融合，虽然得以建立且获得永生杂交运动神经元细 胞株(Raimondi A et al.,2006；Cashman NR et al.,1992)，但，该永生杂交运动神经元细胞株不仅具有多核且基因异常，能够持续增生，并且无法呈现典型运动神经元形态及功能，例如具有长且细的轴突与传导动作电位。

嗅神经髓鞘细胞(Olfactory ensheathing cells，OECs)类似于周围神经系统的许旺细胞(Schwann cells)，为分布于嗅神经细胞纤维上的神经胶质细胞(Mackay-Sim A et al.,2011；Su Z et al.,2010；Raisman G et al.,2007)。嗅神经髓鞘细胞引导嗅神经轴突通过间质组织生长，并且分泌多种用以保护嗅觉神经元的神经滋养因子。嗅神经髓鞘细胞的鉴定，并得通过神经胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)、s100、p75以及中间丝蛋白(nestin intermediate filaments)的表现而被辨认。当嗅神经髓鞘细胞与神经干细胞共培养时，可促进神经干细胞的分化与神经突起(neurites)的形成，但无法促进神经干细胞的生长与复制。

干细胞移植可成为对退化性神经疾病以及中枢神经系统病变的一种有效的治疗方法。具体来说，干细胞移植是通过将干细胞递送进入或靠近受损的中枢神经部位，使受损中枢神经系统的神经细胞再生。目前研究证实，移植嗅神经髓鞘细胞或神经前驱细胞对于脑部损伤的实验啮齿动物机能性改善具有正向结果，例如动物患有肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)及脊髓损伤(Mackay-Sim A et al.,2011)。但，目前研究的实验时间持续数个月，并且仅具有暂时改善神经受损相关症状的效果，而该短期治疗效果是与移植细胞的低存活率具有高度相关性。详言之，由于个体对于被移植细胞会产生局部发炎及排斥反应，常无法提供被移植细胞存活的适当环境与生长因子，当被移植的细胞无法复制或细胞活性降低时，将导致被移植的细胞无法与宿主细胞整合。因此，移植细胞的低存活率可能造成治疗效果无法持续。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种持续维持运动神经元前驱细胞生长的方法，其通过将运动神经元前驱细胞培养在一由嗅神经髓鞘细胞所建构的环境中，使运动神经元前驱细胞长期地维持自我复制以及得以被诱导分化为成熟神经元的能力，据以有效地发挥对于运动神经元的保护作用。

本发明的另一目的在于提供一种医药组合物，其包含有效量的运动神经元前驱细胞以及至少一药学上可接受的载体。通过将该医药组合物投予至一罹患运动神经元受损相关疾病的患者，例如中风、脊髓损伤、神经退化性疾病等，能够达到重建个体的神经功能以及促进运动神经元生长的功效。

为能达成上述目的，本发明所揭的一实施例提供一种持续维持运动神经元前 驱细胞活性的方法，其将一运动神经元前驱细胞培养在一由嗅神经髓鞘细胞所构筑且适合生长的培养环境中，使该运动神经元前驱细胞能够维持自我复制且具有分化为成熟运动神经细胞的能力。

较佳地，该培养环境为一具有嗅神经髓鞘细胞的培养基。

其中，以低密度形式培养运动神经元前驱细胞。

其中，将数量至少一个的该运动神经元前驱细胞接种于嗅神经髓鞘细胞上进行培养。

较佳地，该培养环境为一先处理嗅神经髓鞘细胞后的培养基，但不含有嗅神经髓鞘细胞，其中，以高密度形式进行培养运动神经元前驱细胞。

通过本发明所揭方法，该运动神经元前驱细胞在该培养环境中被持续扩大增生超过10代，并且，单个的该运动神经元前驱细胞能形成细胞群落。

本发明的另一实施例揭露一种医药组合物，其包含一有效量的运动神经元前驱细胞以及至少一药学上可接受的载体，其中，该运动神经元前驱细胞以一由嗅神经髓鞘细胞所构筑的环境中进行前处理。

较佳地，该运动神经元前驱细胞以嗅神经髓鞘细胞进行前处理。

较佳地，该运动神经元前驱细胞以一已先处理嗅神经髓鞘细胞后的培养基进行前处理。

较佳地，该医药组合物更包含有嗅神经髓鞘细胞。

较佳地，该运动神经元前驱细胞与该嗅神经髓鞘细胞以等比例进行前处理。

而本发明所揭的医药组合物具有治疗运动神经元疾病的用途。

较佳地，该疾病为中风、脊髓损伤、退化性神经疾病、肌萎缩侧索硬化症或任何具有运动神经元正在进行死亡的疾病。

本发明的有益效果在于：本发明提供的一种持续维持运动神经元前驱细胞生长的方法及医药组合物，使运动神经元前驱细胞长期地维持自我复制以及得以被诱导分化为成熟神经元的能力，以有效地发挥对于运动神经元的保护作用，进而修复或重建个体的神经受损部位，用以达到具有显著治疗运动神经元疾病的功效。

附图说明

图1A及图1B分别为嗅神经髓鞘细胞培养第4天及第7天的外形。

图2为嗅球的嗅神经髓鞘细胞、嗅粘膜的嗅神经髓鞘细胞以及幼仓鼠纤维母细胞分别进行免疫细胞染色法的结果。

图3A为以荧光活化细胞分选技术分析以p75抗体染色的嗅神经髓鞘细胞，其中，红色表示被p75抗体染色的嗅神经髓鞘细胞，蓝色表示未被染色的细胞。

图3B为嗅神经髓鞘细胞的生长曲线图。

图4为HB9::GFP胚胎干细胞与小鼠成骨细胞株PA6共同培养的流程示意图。

图5为与小鼠成骨细胞株共同培养至第8天的HB9::GFP⁺细胞。

图6为HB9::GFP胚胎干细胞以不同处理条件进行培养的流程示意图。

图7为单个HB9::GFP⁺细胞接种于嗅神经髓鞘细胞经培养一周而形成细胞群落的结果。

图8为单个HB9::GFP⁺细胞接种于丝裂霉素C处理的嗅神经髓鞘细胞，培养一周后的结果。

图9为经嗅神经髓鞘细胞扩增后的HB9::GFP⁺细胞接种于PA6细胞上进行培养后的结果。

图10A为以免疫组织染色法分析各组大鼠表现CD11b的结果。

图10B为统计分析各组大鼠表现CD11b的结果，其中，*表示P值<0.05，**表示P值小于<0.01。

图11A为以免疫组织染色法分析各组大鼠运动神经元表现胆碱乙酰转移酶的结果。

图11B为统计分析各组大鼠运动神经元表现胆碱乙酰转移酶的结果，其中，*表示P值<0.05，**表示P值小于<0.01。

具体实施方式

除非另有定义，在本发明的说明书及权利要求书所使用的技术及科学名词的意义，其与本发明所属技术领域且具通常知识者的一般理解相同。若有矛盾的情形，以本发明内容为准。

所谓“HB9::GFP胚胎干细胞”为未分化，且不具荧光的胚胎干细胞，其染色体带有一外来基因，此基因带有HB9基因的启动子及绿色荧光蛋白质(green fluorescent protein,GFP)。

而所谓“HB9::GFP⁺细胞”为胚胎干细胞衍生运动神经元前驱细胞或成熟的运动神经元，具有绿色荧光。而该绿色荧光蛋白质的表现被运动神经元专一性启动子HB9所调控(Miles GB et al.,2004；Wichterle H et al.,2002)。HB9为一运动神经元的专一性转录因子(Arber S et al.,1999)，因此，仅在运动神经元能被侦测到表现绿色荧光蛋白(Miles GB et al.,2004；Soundararajan P et al.,2006)。在本发明的实施例中，将以HB9::GFP⁺细胞，探讨嗅神经髓鞘细胞对于运动神经元增生效率的影响，以及量化与嗅神经髓鞘细胞共培养的运动神经元的增生能力。

所谓“有效量”一词指要产生所求特定效果所需化合物或活性成份的量，以其在组合物中所占重量百分比表示。如同本发明所属技术领域中具有通常知识者 所了解，该有效量会因为要引起特定效果的投予途径而有所不同。一般来说，活性成分或化合物在组合物中的量可占该组合物重量的约1％至约100％，较佳为约30％至约100％。

所谓“药学上能接受的载体”一词包含任何标准于医药产品上所使用的载体，而该载体依据组合物的形态，可为固态、半固态或液态。举例来说，载体包含，但不限于，明胶、乳化剂、烃类混合物、水、甘油、生理食盐水、缓冲生理盐水、羊毛脂、石蜡、蜂蜡、二甲基硅油、乙醇。

所谓“医药组合物”一词包含一有效量的要产生特定效果的所需化合物或活性成份，以及至少一载体。而如同本发明所属技术领域中具有通常知识者所了解，组合物的形态得随着欲引起特定效果的投予途径有所不同，如锭剂、粉剂、针剂等，并且，该载体也随着组合物的形态而可为固态、半固态或液态。

所谓“投予”一词指将一物递送至一个体特定部位、特定细胞、特定靶点的方式，或其与个体接触作用的途径，一般来说，投予途径包含有，但不限于，口服、涂抹、喷洒、吸入、注射等。

以下，为能更进一步说明本发明的功效，将举若干实施例作详细说明，但，该实施例为用以解说的例示，其中所使用的任何词汇并不限制本发明说明书及权利要求书的范围及意义。

必须先加以说明，以下有关于动物试验的实施例皆已通过台湾台中荣民总医院的伦理委员会审查。并且，除非另有加以说明，以下实施例中所有用以培养及分化干细胞的基底培养基及添加成份皆于市面上(Invitrogen)购买取得。

实施例一：胚胎干细胞的维持及分化

自美国哥伦比亚大学取得分离自HB9::GFP转基因小鼠的HB9转基因胚胎干细胞(以下简称HB9::GFP胚胎干细胞)，其可分化为运动神经元前驱细胞及成熟运动神经元(以下简称HB9::GFP⁺细胞)。

该HB9::GFP胚胎干细胞被维持于含有丝裂霉素C(mitomycin C)处理的小鼠胚胎纤维母细胞的高葡萄糖DMEM培养基，添加有15％胎牛血清、2mM的谷氨酰胺、0.1mM的非必须氨基酸、1mM的丙酮酸、0.1mM的2-巯基乙醇(2-mercaptoethanol，Sigma-Aldrich)以及1000U/ml的白血病抑制因子(Chemicon)。

而神经分化方法的细节为本发明技术所属领域且具通常知识者依据先前技术所揭内容所周知，包含无血清类胚体(serum-free embryoid-body-like，SFEB)(Watanabe K et al.,2005)、neurobasal/N2B27培养基(Ying QL et al.,2003)以及间质细胞衍生诱导活性方法(stroma cell-derived inducing activity methods，SDIA  methods)(Kawasaki H et al.,2000)。

胚胎干细胞开始分化的首日被定义为第0天，在第3-5天将0.1μM的视黄酸(Sigma-Aldrich)加入分化培养基中，并且在5-7培养日的每天分别加入并替换200μM的外源音波状蛋白(R&D Systems)或2μM的2,6,9-三取代嘌呤化合物(Purmorphamine，PU，Tocris)。

实施例二：嗅神经髓鞘细胞的培养与纯化

取重量约为250～300公克SD大鼠(Sprague-Dawley Rat)，并自该大鼠的嗅粘膜(olfactory mucosa，OM)或嗅球分离出嗅神经髓鞘细胞。将该嗅神经髓鞘细胞连续培养于选择性培养基中，在显微镜下观察培养第4天及第7天的细胞外型，结果如图1所示。由图1可知，该嗅神经髓鞘细胞的外型呈现典型纺锤状。

更进一步地分别将分离自嗅粘膜及嗅球的嗅神经髓鞘细胞以及幼仓鼠纤维母细胞(baby hamster kidney fibroblast cells，BHK-21 cell)以免疫细胞染色法进行分析。将上述各该细胞以4％多聚甲醛(paraformaldehyde)固定及以0.3％的采酮(Triton-X 100)穿透各该细胞后，先以S100及p75的初级抗体进行免疫反应后，以0.1％Tween-20的磷酸缓冲液清洗，再与适当具荧光标记的二级抗体进行反应，并且以DAPI进行核反染色，最后以直立式显微镜(Nikon ECLIPSE 80I)或共轭焦显微镜(LSM510 Meta,Zeiss)观察免疫染色的结果，结果如图2所示，其中，图中上排红色为以p75抗体染色的结果，图中下排红色为以S100进行免疫染色的结果，图中蓝色皆为以DAPI染色的结果。

将该嗅神经髓鞘细胞以p75抗体进行染色，并且以荧光活化细胞分选技术(Fluorescence Activated Cell Sorter，FACS)进行分析，再以锥虫蓝(trypan blue)排除死亡细胞，分析该嗅神经髓鞘细胞的细胞数量，并且纪录其生长曲线，结果如图3A及图3B所示。

由图2的结果显示几乎所有被培养的嗅神经髓鞘细胞表现嗅神经髓鞘细胞标记，例如p75、s100。但幼仓鼠纤维母细胞则不表现p75以及s100抗原。证明本培养方法可产生高纯度的嗅神经髓鞘细胞。再者，由图3A的结果显示，相较于未被染色的嗅神经髓鞘细胞(图中蓝色部份)，大多数嗅神经髓鞘细胞能够被p75抗体染色(图中红色部份)，并且，该嗅神经髓鞘细胞能够增殖，其中，细胞数达二倍量的时间(a double time)约为28～32小时。

实施例三：共培养小鼠成骨细胞株与自胚胎干细胞衍生的运动神经元

请参阅图4，将实施例一中自小鼠HB9::GFP胚胎干细胞与小鼠成骨细胞株(PA6细胞)依据下列培养流程进行共同培养，而此培养流程为先前文献所揭内容(Pan HC et al.,2011)：培养第0-3天使用10％的KSR(Knockout serum  replacement)培养基中，培养第3-5天使用含有视黄酸的KSR培养基，培养第5-7天使用含有视黄酸及2,6,9-三取代嘌呤化合物的NB培养基(neurobasal medium，Invitrogen)，进行共同培养。而后再以NB培养基进行培养，观察培养至第8天的该HB9::GFP⁺细胞，如图5所示。

由图5的结果显示，与小鼠成骨细胞株PA6共同培养的该HB9::GFP⁺细胞已分化为运动神经元而能表现绿色荧光蛋白，并且，其外型呈现运动神经元典型的外型。另由本案发明人等过去研究可知，自小鼠胚胎干细胞衍生的运动神经元会表现胆碱乙酰转移酶以及运动神经元的专一性蛋白MNR2(Pan HC et al.,2011)，据此可知HB9::GFP胚胎干细胞与小鼠成骨细胞株PA6共同培养后会分化成为成熟的且具有功能的运动神经元。

实施例四：嗅神经髓鞘细胞能维持HB9::GFP⁺细胞自我复制能力

请参阅图6，首先，依据实施例一或实施例三所揭方法培养HB9::GFP胚胎干细胞，培养至第5天。此时绿色荧光刚在分化的胚胎干细胞中表现，而表现绿色荧光的细胞形态为卵圆形，无神经突起，因此，此时期的绿色荧光细胞代表运动神经元前驱细胞，而与培养至第8天的成熟的运动神经元不同。

培养至第5天时，以流式细胞仪(Influx，nozzle 100m，25psi，Becton-Dickinson)分选出能表现绿色荧光的单个HB9::GFP⁺细胞。再以100cells/mL的低密度条件进行细胞培养，并将单个HB9::GFP⁺细胞分别接种于嗅神经髓鞘细胞、PA6细胞及基质胶上，培养一周。

经一周培养后发现，单个HB9::GFP⁺细胞仅会在嗅神经髓鞘细胞上形成一群落(colony)，如图7所示，并且，该HB9::GFP⁺细胞形成的细胞群落在嗅神经髓鞘细胞继代超过10代而仍持续表现绿色荧光蛋白质。相反地，该HB9::GFP⁺细胞接种于PA6细胞或基质胶上时，仅会均匀分布且分化成为成熟运动神经细胞，无法进行自我复制及生长。

再者，将分选出的单一HB9::GFP⁺细胞接种于丝裂霉素C处理的嗅神经髓鞘细胞上，使其失去细胞复制的能力。经培养一周后，结果如图8所示。由图8的结果可知，不能进行细胞复制的嗅神经髓鞘细胞会降低HB9::GFP⁺细胞的增生效率，并且HB9::GFP⁺细胞仅能继代5代以内。

此外，将分选出的单一HB9::GFP⁺细胞，以高密度条件：10000cells/mL进行培养，与经嗅神经髓鞘细胞培养一天的条件培养基(conditional media)共培养，但不与嗅神经髓鞘细胞接触。经培养两周，每两天更换培养液。由此培养结果发现，单一HB9::GFP⁺细胞在未与嗅神经髓鞘细胞接触下，仍可以形成细胞群落且复制，并可以继续继代。

由上述结果显示，通过与健康的嗅神经髓鞘细胞共培养，或以已培养过嗅神经髓鞘细胞的条件培养基进行培养，分别能够提供维持运动神经元前驱细胞自我复制的专一性环境(niches)，而能作为维持HB9::GFP⁺细胞的重要环境因子。

实施例五：运动神经元的分化能力

以流式细胞仪(Influx，nozzle 100μm，25psi，Becton-Dickinson)分选出与嗅神经髓鞘细胞共同培养所得的单一第5代HB9::GFP⁺细胞。将分选出的该HB9::GFP⁺细胞接种于PA6细胞上后，培养3天内，观察到大多数细胞可快速地延伸出轴突，成为成熟运动神经元，并且呈现出典型已分化的运动神经元形态，如图9所示。由图9显示，在嗅神经髓鞘细胞上进行增生的HB9::GFP⁺细胞仍然维持分化能力，而能够分化为成熟运动神经元。

实施例六：制备脊髓损伤动物模式

本实施例中用以产制脊髓损伤动物模式的方法参考先前文献(Cheng FC,et al.,2012；Cheng FC et al.,2010；Yang DY et al.,2012)。

取250～300公克中SD大鼠，以4％异氟醚诱导麻醉后，再以1-2％异氟醚维持麻醉状态。通过一平行于锁骨而由胸骨到腋下的水平切口接触到右侧臂丛神经。将胸大肌移位，留下完整无缺的头静脉。锁骨下方血管被定位，解剖躯干下部。通过钳子将C7根部自脊髓抽出5分钟后，再将伤口予以缝合，用以制备脊髓损伤大鼠。

实施例七：动物试验

将实施例六中所制备的脊髓损伤大鼠分为四组，并且，在脊髓受损2周后，各该大鼠在脊椎T7-T8处进行全椎板切除手术，分别于至其受伤脊髓前角(ventral horn)以及对侧未受伤的部位进行不同条件的细胞移植，其中，第一组为2μl的磷酸盐缓冲液，第二组为移植5x10⁵个嗅神经髓鞘细胞，第三组为移植5x10⁵个HB9::GFP⁺细胞，第四组为以2.5x10⁵个移植嗅神经髓鞘细胞先处理(pretreatment)2.5x10⁵个HB9::GFP⁺细胞一天后，促使HB9::GFP⁺细胞复制，再进行移植。

细胞移植以显微注射方式进行，其中，脊柱右侧的显微注射将细胞打入白质，投予位置为脊椎T8及T9中线起算0.75公厘及深度1.2公厘处，注射时间为20分钟，注射完维持5分钟；脊柱左侧的显微注射将细胞打入前角，投予位置为脊椎T8及T9中线起算0.5公厘及深度1.2公厘处，注射时间为20分钟，注射完维持5分钟。各组大鼠进行移植1周后，将各组大鼠予以麻醉，以25毫升磷酸盐缓冲液及100毫升、4％的多聚甲醛灌流，并且分别取其脊髓进行免疫组织化学染色，观察CD11b、胆碱乙酰转移酶的表现，结果如图10A、图10B及图11A、图11B所示。

由于脊髓损伤大鼠的微胶细胞(microglial cells)过度活化，产生神经细胞发 炎的现象，微胶细胞会大量表现CD11b，并且使运动神经元受到破坏。由图10A、图10B及图11A、图11B的结果可知，第一组大鼠的CD11b表现量明显高于其他组，并且以胆碱乙酰转移酶标定脊髓前角的运动神经元，显示第一组大鼠的运动神经元损伤严重。而相较于第一组大鼠，第四组大鼠的CD11b表现量显著降低，并且可侦测到表现胆碱乙酰转移酶的大量运动神经元，显示其内生性运动神经元大多数皆未损伤。另通过比对第四组大鼠与第二组大鼠或第三组大鼠可知，相较于单纯移植运动神经元或嗅神经髓鞘细胞，共移植运动神经元及嗅神经髓鞘细胞对宿主运动神经元的修复具有加乘效益。

通过上述实施例的结果可知，本发明所揭持续维持运动神经元前驱细胞活性的方法确实能够使运动神经元前驱细胞在健康嗅神经髓鞘细胞存在的环境下，维持其自我复制的能力，而能对于运动神经元提供较先前技术更为显著的保护作用。并且，培养过程中所得的该运动神经元前驱细胞在分化条件下，仍能分化成为成熟运动神经元，能有助于运动神经元的生长以及神经功能的重建。通过上述方法，本发明得提供一种医药组合物与处理方式，用以将具有自我复制能力及分化能力的运动神经元前驱细胞移植至一个体中，使该运动神经元前驱细胞先行复制，进而修复或重建个体的神经受损部位，用以达到具有显著治疗运动神经元疾病的功效。

以上仅是通过各该实施例详细说明本发明，熟知该技术领域者在不脱离本发明精神下，而对于说明书中的实施例所做的任何简单修改或是变化，均应为本案权利要求书所涵摄。

参考文献

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Claims (15)

1. 一种持续维持运动神经元前驱细胞生长的方法，其特征在于，将一运动神经元前驱细胞在一由嗅神经髓鞘细胞所构筑的培养环境中进行培养，使该运动神经元前驱细胞能够维持自我复制且具有分化为成熟运动神经细胞的能力。
2. 如权利要求1所述持续维持运动神经元前驱细胞活性的方法，其特征在于，所述培养环境为一具有嗅神经髓鞘细胞的培养基。
3. 如权利要求1所述持续维持运动神经元前驱细胞活性的方法，其特征在于，所述培养环境为一先处理嗅神经髓鞘细胞后的培养基，但不含有嗅神经髓鞘细胞。
4. 如权利要求2所述持续维持运动神经元前驱细胞活性的方法，其特征在于，以低密度形式进行培养。
5. 如权利要求3所述持续维持运动神经元前驱细胞活性的方法，其特征在于，以高密度形式进行培养。
6. 如权利要求2所述持续维持运动神经元前驱细胞活性的方法，其特征在于，将数量为至少一个的所述运动神经元前驱细胞接种于嗅神经髓鞘细胞上进行培养。
7. 如权利要求1所述持续维持运动神经元前驱细胞活性的方法，其特征在于，所述运动神经元前驱细胞在所述培养环境中被持续扩大增生超过10代。
8. 如权利要求1所述持续维持运动神经元前驱细胞生长的方法，其特征在于，单个的所述运动神经元前驱细胞在所述培养环境中形成一细胞群落。
9. 一种医药组合物，其包含一有效量的运动神经元前驱细胞以及至少一药学上可接受的载体，其中：

   其特征在于，所述运动神经元前驱细胞以一由嗅神经髓鞘细胞所构筑的环境中进行前处理。
10. 如权利要求9所述医药组合物，其特征在于，所述运动神经元前驱细胞以嗅神经髓鞘细胞进行前处理。
11. 如权利要求9所述医药组合物，其特征在于，所述运动神经元前驱细胞以一已先处理嗅神经髓鞘细胞后的培养基进行前处理。
12. 如权利要求9所述医药组合物，其特征在于，更包含有一嗅神经髓鞘细胞。
13. 如权利要求9所述医药组合物，其特征在于，所述运动神经元前驱细胞与所述嗅神经髓鞘细胞以等比例进行前处理。
14. 一种如权利要求9所述医药组合物的在制备治疗运动神经元疾病的药物中的用途。
15. 如权利要求14所述用途，其特征在于，所述疾病选自由中风、脊髓损伤、退化性神经疾病、肌萎缩侧索硬化症及病征为运动神经元正在进行死亡的疾病所组成的群。