KR102568532B1 - 3차원 배양을 통한 신경줄기세포 제조 방법 - Google Patents

3차원 배양을 통한 신경줄기세포 제조 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102568532B1
KR102568532B1 KR1020210004617A KR20210004617A KR102568532B1 KR 102568532 B1 KR102568532 B1 KR 102568532B1 KR 1020210004617 A KR1020210004617 A KR 1020210004617A KR 20210004617 A KR20210004617 A KR 20210004617A KR 102568532 B1 KR102568532 B1 KR 102568532B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
stem cells
cells
neural stem
delete delete
cell
Prior art date
Application number
KR1020210004617A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20220102357A (ko
Inventor
도정태
윤상훈
Original Assignee
건국대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 건국대학교 산학협력단 filed Critical 건국대학교 산학협력단
Priority to KR1020210004617A priority Critical patent/KR102568532B1/ko
Publication of KR20220102357A publication Critical patent/KR20220102357A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102568532B1 publication Critical patent/KR102568532B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0623—Stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0062—General methods for three-dimensional culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/70—Polysaccharides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 종래의 부유 배양, 레티노산(retinoic acid), 공배양 (stromal cells), dual SMAD 억제제 (noggin & SB431542) 처리 또는 신경계 세포 유도 물질 처리 없이 특정 배양 방법으로 단시간에 줄기세포에서 신경줄기세포로 분화시키는 방법에 관한 것으로, 본 발명에서는 마커 유전자를 배아 줄기 세포에 형질전환함으로써 초기 신경조직을 쉽게 구별하였으며, 이를 하이드로겔의 드롭 내부에서 배양하여 3차원 형태로 배양함으로써 신경 계통 분화 유도 인자 없이 초기 신경계 세포 응집체로 분화시켰고, 이를 2차원 배양함으로써 종래에 비해 현저히 단축된 기간 (약 3주 이내)에 신경줄기세포를 제조할 수 있으므로, 분화 방법이 간단하고, 비용이 절감되는 효과가 있다.

Description

3차원 배양을 통한 신경줄기세포 제조 방법{METHOD FOR PRODUCING NEURAL STEM CELLS VIA 3D CULTURE}
본 발명은 종래의 부유 배양, 레티노산(retinoic acid), 공배양 (stromal cells), dual SMAD 억제제 (noggin & SB431542) 처리 또는 신경계 세포 유도 물질 처리 없이 특정 배양 방법으로 단시간에 만능줄기세포에서 신경줄기세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.
줄기세포(stem cell)란, 미분화 상태를 유지하면서 무한히 증식할 수 있으며 일정한 환경과 조건이 주어질 경우 특정 기능과 형태를 갖도록 분화할 수 있는 세포를 말한다. 줄기세포는 확립 방법 및 근원 (source)에 따라 분류할 수 있는데, 배아(embryos)로부터 확립된 "배아줄기세포(embryonic stem cells, ESC)"와 성체의 조직으로부터 분리된 "성체줄기세포(adult stemcells)", 및 체세포 리프로그래밍 과정을 통해 인공적으로 확립된 "유도줄기세포 (induced stem cells)" 등으로 나눌 수 있다. 또한, 분화 능력에 따라 분류할 수도 있으며, 한 종류의 세포로 분화할 수 있는 "단분화능(Unipotency)", 여러 종류의 세포로 분화할 수 있는 "다분화능(Multipotency)", 그리고 모든 조직세포로 분화할 수 있는 "만능성 (Pluripotency)" 줄기세포 등으로 나눌 수 있다. 만능성 줄기세포에는 배아줄기세포(embryonic stem cells, ESC)와 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSCs) 등이 있으며, 미분화 상태를 유지하면서 무한대로 자가 증식할 수 있는 능력과, 인체의 모든 세포로 분화할 수 있는 분화능력을 가지고 있기 때문에, 재생 의학적 활용에 있어 그 가치가 높이 인정되고 있다. 배아줄기세포는 수정란이 형성된 후 자궁내막에 착상하기 전의 매우 초기 단계인 포배기(blastocyst) 배아 중 태아로 발생할 세포괴(inner cell mass; ICM)로부터 분리해낸 줄기세포로서, 내배엽, 외배엽 및 중배엽의 세 가지의 배엽(embryonic germ layer)에 의해 생성되는 모든 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재력이 있는(pluripotent) 세포이다. 인간 배아줄기세포는 적당한 체외 배양조건에서 자가 증식(self-renewal)을 지속적으로 할 수 있고, 인체를 이루고 있는 모든 종류의 세포로 분화할 수 있는 전분화능(pluripotency)을 가진다. 따라서, 인체의 발생, 분화 및 성장에 대한 기초 지식을 이해하기 위해서뿐만 아니라 인체의 손상 또는 다양한 질환의 근본적인 치료 방법인 세포 치료제 개발 및 다양한 신약 후보물질의 약효 검색, 질환의 원인 규명, 치료법 개발 등 다양한 측면에서 이를 대상으로 한 연구결과의 활용범위가 확대되고 있다. 지금까지 만능줄기세포는 주로 핵 이식 및 세포 융합에 의해 생성되었다 (Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363(1500): 2079-2087). "유도 만능줄기세포(iPSC)"는 배아줄기세포(ESCs)와 비슷한 특성을 나타내는 세포이다. 유도 만능줄기세포는 2006년에 마우스 섬유아세포(Cell 126: 663-676 (2006)) 및 2007년에는 인간 섬유아세포(Science 318: 1917-1920 (2007),)로부터 지정 인자(defined factor)들의 발현을 증대시킴으로써 최초로 생성되었다.
신경계 세포는 크게 두 종류로 구분할 수 있는데, 뇌와 척수를 구성하는 중추신경계 세포와, 운동신경, 감각신경, 자율신경 등을 구성하는 말초신경계 세포로 나눠진다. 중추신경계 (뇌와 척수)를 구성하는 신경세포(neuron), 성상세포(astrocyte) 및 희돌기교세포(oligodendrocyte)는 만능 줄기 세포에서 분화된 신경줄기세포(neural stem cell 또는 neural progenitor cell)를 분화시켜 만들 수 있으며, 반면에 말초신경계를 구성하는 말초신경세포 (운동신경, 자율신경, 및 감각신경)과 슈반세포(Schwann cell)는 만능 줄기 세포에서 분화된 신경능선세포(Neural crest stem cell: NCSC)로부터 유래된다. 따라서 중추신경계 세포와 말초신경계 세포는 만능 줄기 세포로부터 서로 다른 분화경로를 따라, 각각 신경전구세포와 신경능선세포를 거쳐 만들어지게 되며, 이러한 서로 다른 경로는 주변 환경과 세포 내 신호전달 체계에 따라 좌우되는 것으로 알려져 있다. 신경줄기세포(NSC)는 신경계의 자가-재생 다능 줄기 세포인데, 이는 신경세포, 성상교세포(astrocytes) 및 희돌기교세포(oligodendrocytes)로 분화되는 능력을 가진다. 신경줄기세포는 태아 및 성인 중추 신경계로부터 직접적으로 또는 만능 줄기 세포로부터 유도된 신경 분화에 의해 얻어질 수 있다. NSC는 퇴행성 신경질환, 예컨대 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 등뿐만 아니라 부동을 야기하는 척수 손상의 회복 치료를 위한 관점적 치료로서도 고려된다.
인간 배아줄기세포로부터 신경줄기세포를 유도하는 기술은 꾸준히 연구되고 있다. 종래에는 만능줄기세포로부터 신경줄기세포 또는 신경세포로의 분화를 위해 부유 배양(suspension culture)을 실시했으며, 배양 과정에서 레티노산(retinoic acid), 공배양 (stromal cells과 같이 배양), 이중 SMAD 억제제 (noggin & SB431542)를 처리하는 방법을 기존에 사용해왔다. 분화 유도된 신경전구세포는 특정 신경세포로 분화되거나, 신경전구세포 혹은 더 분화된 신경세포 단계에서 뇌신경계 질환 동물 모델에 이식되어 그 임상적 적용 가능성을 확인하는데 이용되고 있다. 그러나 종래의 방법은 미분화 상태의 인간 배아줄기세포로부터 특정 신경세포로의 분화 과정까지 여러 단계의 분화 과정을 거쳐 오랜 시간이 소요되는 (예컨대, 1달 이상) 단점이 존재하였다.
중추 신경계 질환은 크게 뇌 질환과 척수 질환으로 나뉘는데 뇌의 기능 이상으로 발생하는 질환으로는 뇌졸중, 치매, 파킨슨병 등이 있다. 척수손상은 갑작스런 부상에 의해 야기되며 척수의 기능이 손상되면 운동 조절 능력 상실, 감각 상실, 방광 조절 능력 상실 등의 문제들이 발생하며 평생 동안 고통 가운데 살게 된다. 이 밖에 많은 중추신경계 질환에 의해 고통 받고 있는 사람들은 전 세계적으로 고령화가 진행되면서 급속히 증가하고 있으며 따라서 환자와 가족들의 삶의 질 저하와 사회에 큰 사회적/경제적 부담을 주기 때문에 이들을 치료하기 위한 노력들이 시급한 실정이다.
따라서, 중추 신경계 질환들에 대한 가장 근본적인 치료법으로 여겨지는 세포 대체치료법(cell replacement therapy)을 개발하기 위해, 만능줄기세포를 중추 신경계 세포들의 모세포인 신경줄기세포로 효율적으로 분화시키는 방법을 확립하는 것이 필요하다.
본 발명의 목적은 만능줄기세포로부터 신경줄기세포(neural stem cells, NSC)를 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 신경줄기세포를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 척수손상 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 목적은 퇴행성 신경질환 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 신경줄기세포를 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 신경줄기세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 신경줄기세포를 포함하는 척수손상 치료용 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 신경줄기세포를 포함하는 퇴행성 신경질환 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 방법에 따르면, 마커 유전자를 배아 줄기 세포에 형질전환함으로써 초기 신경조직을 쉽게 구별하였으며, 이를 하이드로겔의 드롭 내부에서 배양하여 3차원 형태로 배양함으로써 신경 계통 분화 유도 인자 없이 초기 신경계 세포 응집체로 분화시켰고, 이를 2차원 배양함으로써 종래에 비해 현저히 단축된 기간 (약 3주 이내)에 신경줄기세포를 제조할 수 있으므로, 분화 방법이 간단하고, 비용이 절감되는 효과가 있다.
도 1은 Sox1-GFP ESC의 신경 줄기 세포(NSC)로의 분화를 확인한 도이다:
A: NSC 유도 프로토콜의 개략도;
B: 마트리젤 액적에 내포된(embeded) Sox1-GFP ESCs의 단일 세포;
C: 마트리젤에 내포된 Sox1-GFP ESC의 응집체 형성 (3일차);
D: Sox1-GFP 발현하는 응집체 (10일차); 및
스케일 바: 200 μm.
도 2는 Sox1-GFP 발현하는 ESCs 응집체를 이용하여 제작한 신경줄기세포(NSCs)를 나타낸 도이다:
A: 젤라틴-코팅된 디쉬에 부착된 GFP-발현 응집체 (1일차);
B: 젤라틴-코팅된 디쉬에 부착된 GFP-발현 응집체 (3일차);
C 내지 E: 전형적인 NSC 형태를 나타내는 계대 (P) 3, 4 및 5에 응집체로부터 제작된 NSC.
도 3은 제작된 NSCs의 특성을 확인한 도이다:
A: NSC-특이적 마커를 이용한 면역세포화학 분석 결과; 및
B: NSC 마커 유전자를 이용한 Real-time RT-PCR 분석 결과.
도 4는 제작된 NSCs의 분화능을 확인한 도이다:
A: NSC에서 분화된 세포의 신경 아형 (신경세포, 성상교세포 및 희돌기교세포) 마커를 이용한 면역세포화학 분석 결과; 및
B: 신경세포, 성상교세포 및 희돌기교세포 특이적 마커 유전자를 이용한 Real-time RT-PCR 분석 결과.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
일 측면에서, 본 발명은 (A) 미분화 줄기 세포에 신경 계통 세포에서 특이적으로 발현되는 마커 유전자를 형질전환하는 단계; (B) 3차원 배양하여 세포 응집체를 형성하는 단계; (C) 마커 유전자를 발현하는 세포 응집체를 선별하는 단계; 및 (D) 선별한 세포 응집체를 2차원 배양하는 단계를 포함하는 신경줄기세포(neural stem cells, NSC)를 제조하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 줄기세포는 배아 줄기세포(Embryonic Stem Cell, ESC), 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSCs), 배아 생식세포, 배아 종양세포 및 성체 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 만능 줄기 세포(Pluripotent stem cells, PSCs)일 수 있으며, 배아 줄기세포인 것이 더욱 바람직하다.
일 구현예에서, 마커 유전자는 Sox1(Sry-related-HMG box 1),Olig2 및 Sox2 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 신경 발달의 초기 단계에 특이적인 마커인 Sox1(Sry-related-HMG box 1)일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 마커 유전자에 검출가능한 표지를 추가로 포함할 수 있으며, 검출가능한 표지는 형광 표지, 프로브, 발광성 물질(luminescent material), 광색성 화합물, 단백질성 형광 표지, 자기 표지, 방사성표지, 택(tag) 및 합텐으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 형광 표지는 Atto 염료, 알렉사플루오르 염료, 양자점, 히드록시쿠마린, 아미노쿠마린, 메톡시쿠마린, 캐스케이드 블루, 퍼시픽 블루, 퍼시픽 오렌지, 루시퍼 옐로우, NBD, R-피코에리트린 (PE), PE-Cy5 접합체, PE-Cy7 접합체, 레드 613, PerCP, 트루레드, 플루오르X, 플루오레세인, 바디피-FL, Cy2, Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, TRITC, X-로다민, 리사민 로다민 B, 텍사스 레드, 알로피코시아닌 (APC), APC-Cy7 접합체, Indo-1, Fluo-3, Fluo-4, DCFH, DHR, SNARF, GFP (Y66H 돌연변이), GFP (Y66F 돌연변이), EBFP, EBFP2, 아주라이트, GFPuv, T-사파이어, 세룰리언, mCFP, m터쿼이즈2, ECFP, CyPet, GFP (Y66W 돌연변이), m케이마-레드, 태그CFP, 암시안1, mTFP1, GFP (S65A 돌연변이), 미도리시 시안, 야생형 GFP, GFP (S65C 돌연변이), 터보GFP, 태그GFP, GFP (S65L 돌연변이), 에메랄드, GFP (S65T 돌연변이), EGFP, 아자미 그린, Zs그린1, 태그YFP, EYFP, 토파즈, 비너스, m시트린, YPet, 터보YFP, Zs옐로우1, 쿠사비라 오렌지, m오렌지, 알로피코시아닌 (APC), mKO, 터보RFP, td토마토, 태그RFP, Ds레드 단량체, Ds레드2 ("RFP"), m스트로베리, 터보FP602, As레드2, mRFP1, J-레드, R-피코에리트린 (RPE), B-피코에리트린 (BPE), m체리, Hc레드1, 카투사, P3, 페리디닌 클로로필 (PerCP), m케이트 (태그FP635), 터보FP635, m플럼, 및 m라즈베리로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일 구현예에서, 마커 유전자를 형질전환한 줄기 세포는 3차원 배양 전에 피더가 없는 조건에서 배양될 수 있다.
일 구현예에서, 3차원 배양은 세포가 하이드로겔 내부에서 배양되는 것일 수 있으며, (a) 마커 유전자를 형질전환한 미분화 줄기 세포를 단일 세포로 분리하는 단계; (b) 분리한 단일세포와 하이드로겔을 혼합한 뒤 경화시키는 단계; 및 (c) 만능 줄기 세포 배지로 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 3차원 배양 배아 줄기세포를 초기 신경계통 세포로 분화시키는 것일 수 있다.
일 구현예에서, 하이드로겔은 세포 외 기질 물질 또는 세포 외 기질 유사 물질을 포함할 수 있으며, 세포 외 기질 유사 물질은 젤라틴, 폴리에틸렌글라이콜, 콜라겐, 알지네이트, 키토산, 히알루론산, 덱스트란, 피브린, 셀룰로스, 피브로인, 피브로넥틴, 라미닌, 코드로이틴 설페이트, 마트리젤(matrigel) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일 구현예에서, 분리한 단일세포와 혼합한 하이드로겔은 경화되면서 3차원 세포배양 구조체를 이룰 수 있으며, 드롭(drop), 방울 또는 액적의 형태일 수 있다.
일 구현예에서, 하이드로겔은 졸-겔 상변이를 통해 경화될 수 있다.
일 구현예에서, 세포 응집체는 초기 신경계 세포로 분화된 세포의 응집체일 수 있으며, 스페로이드(spheroid) 형태일 수 있고, 2중층(2-layered)의 응집체일 수 있다.
일 구현예에서, 3차원 배양은 8 내지 14일 동안 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 2차원 배양은 세포 응집체를 하이드로겔 표면 상에서 배양하는 것일 수 있으며, 3 내지 7일 동안 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 2차원 배양 신경줄기세포 증식(expand) 배지로 세포 응집체를 하이드로겔 표면 상에서 배양함으로써 이를 증식시킬 수 있다.
일 구현예에서, 상기 단계 (D)에서 2차원 배양하여 증식된(expanded) 세포 응집체를 단일 세포로 분리하여 계대배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "줄기세포"는 자기 복제능 및 분화증식능을 갖는 미분화 세포를 의미한다. 줄기세포에는, 분화 능력에 따라서, 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell), 단분화능 줄기세포(unipotent stem cell)등의 아집단이 포함된다. 상기 전분화능 줄기세포는 생체를 구성하는 모든 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미하며, 다분화능 줄기세포는 모든 종류는 아니지만, 복수 종의 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 단분화능 줄기세포는 특정한 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 전분화능 줄기세포로서는, 배아 줄기세포(ES Cell), 미분화생식선세포(EG Cell), 역분화줄기세포(iPS cell) 등을 들 수 있으며, 다분화능 줄기세포로서는,간엽계 줄기세포(지방유래, 골수유래, 제대혈 또는 탯줄 유래 등), 조혈계 줄기세포(골수 또는 말초 혈액 등에서 유래), 신경계 줄기세포, 생식 줄기세포 등의 성체 줄기세포 등을 들 수 있으며 단분화능 줄기세포로는 평소에는 분열능이 낮은 상태로 존재하다가 활성화 이후 왕성한 분열로 오직 간세포들만을 만드는 간세포(Committed stem cell) 등을 들 수 있다.
본 발명에서 용어, "만능 (pluripotency 또는 pluripotent)"이란, 3개의 배엽층: 내배엽 (예를 들어, 위장 내부층, 위장관, 폐), 중배엽 (예를 들어, 근육, 뼈, 혈액, 비뇨 생식기), 또는 외배엽 (예를 들어, 표피 조직 및 신경계) 중 어느 하나로 분화할 가능성을 갖는 줄기 세포를 나타낸다. 본 명세서에서 "만능 세포"는 "만능 줄기 세포"와 상호 교환적으로 사용된다. 반면, 다분화능 줄기 세포는 특정 기관 내의 몇몇 유형의 세포 중 하나가 될 수 있다. 예를 들어, 다분화능 혈액 줄기 세포는 적혈구 전구 세포, 백혈구 또는 혈소판 생성 세포로 발전할 수 있다. 성체 줄기 세포는 다분화능 줄기 세포이다.
본 발명에서 용어, "유도 만능 줄기 세포"(iPSC)는 비만능 세포로부터 인위적으로 유도된 만능 줄기세포의 한 유형이다. CiPSC는 iPSC이나, 그것들은 만능성을 부여하기 위해 유전자 공학에 의해 생성된 것이 아니라는 점에서 iPSC와는 일부 상이하다.
본 발명에서 용어, "하이드로겔(hydrogel)"은 졸-겔 상변이를 통해 물을 분산매로 하는 액체가 굳어 유동성을 상실하고 다공성 구조를 이루는 물질을 말하며, 세포 배양에 적합한 하이드로겔이라면 특별히 제한되지 않으며, 본 발명의 일 실시예에서는 마트리젤을 사용하였다.
본 발명에서 용어, "분화(differentiation)"란 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 세포의 구조나 기능이 특수화되는 현상을 의미한다.
본 발명에서 용어, "역분화 (dedifferentiation)"는 분화된 세포가 하나 이상의 서로 다른 조직 형태로 분화하기 전에 '줄기세포'-유사 또는 다능성 세포 상태 (multipotent state)를 획득하는 현상에 대한 것이다.
본 발명에서 용어, "액적(drop 또는 droplet)"은 하이드로겔 재료(액체 또는 겔일 수 있음)의 임의의 결속 부피를 지칭한다. 물 액적의 부피는 일반적으로 1.0 mL 미만이나, 점성 물질의 경우 이보다 큰 부피일 수 있으며, 매질의 단일 결속 부피를 액적으로 칭한다.
본 발명에서 용어, "스페로이드(spheroid)"는 세포가 응집되어 대체적으로 단면이 원형 또는 타원형으로 보일 수 있을 정도로 형성된 입체 구조를 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어, "배지(medium)"는 in vitro 상에서 세포들의 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배지를 의미하고, 상기 만능 줄기 세포 배지는 초기 신경계 세포로 분화시킬 수 있는 당 분야에서 사용되는 통상의 적절한 배지를 모두 포함한다. 이런 만능 줄기 세포 배지에는 예들 들어, Epiblast stem cell medium등이 있으나, 이로 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "젤라틴"이란, 동물의 뼈, 가죽, 힘줄, 연골 등을 구성하는 천연 고분자 단백질인 콜라겐(교원질)을 가수분해하여 얻어지는 유도 단백질이다. 젤라틴의 일반적 구성 성분은 약 단백질(protein): 84 내지 90%, 수분(water): 8 내지 12% 및 무기염류(mineral salts): 2 내지 4%로 구성될 수 있다. 본 발명에서 젤라틴은 다양한 젤 강도(gel strength), 점도(viscosity)를 가질 수 있다. 본 발명에서 젤라틴은 천연물질로부터 분리 또는 합성될 수 있으며, 그 원료의 종류는 한정되지 않으나, 바람직하게는 포유동물 또는 어류 등의 가죽, 뼈 껍질 등으로부터 분리된 콜라겐을 가수분해하여 생산할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 신경줄기세포에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 신경줄기세포는 Nestin, Sox2, N-Cadherin 및 Musashi를 발현하며, 신경세포, 성상교세포 및 희돌기교세포로 분화 가능하다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 신경줄기세포를 유효성분으로 포함하는 척수손상 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "척수손상(Spinal Cord Injury, SCI)"은, 후천적인 사고로 인하여 척수에 손상이 가해져 손상된 자리를 통과하는 감각신호와 운동신호의 수행이 영향을 받게 되어 감각신경(sensory neuron)이나 운동신경(motor neuron)의 전달 장애를 초래하여 인체기능을 부분적 또는 완전 마비 상태에 이르게 하는 질환을 의미한다. 구체적으로, 상기 척수 손상은 교통사고, 추락 등의 외상에 의해 발생하는 것일 수 있다. 상기 척수 손상은 손상 정도에 따라 완전손상과 불완전 손상으로 나눌 수 있다. 척수손상은 주로 손상부위 이하에서 운동 신경의 마비로 기능을 소실하게 되는 증상을 수반할 수 있다. 구체적으로 완전손상은 척수의 완전 횡 절단에 의해 척수의 운동, 감각 기능을 완전 소실하게 될 수 있다다. 불완전 손상은 완전손상과 달리 손상 부위 이하의 일부 감각, 운동 기능이 보전된 상태로 나타날 수 있다. 손상부에 따라 증상이 달라질 수 있으며, 일 예로, 경수 손상에 의해 사지마비와 혈압, 맥박, 체온, 호흡수가 모두 떨어지는 증상이 나타날 수 있으며. 흉수 이하 손상에 의한 하지마비, 감각기능의 소실, 대장과 방광 및 성기능의 소실을 보일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 신경줄기세포를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "퇴행성 신경질환"은 신경세포의 기능 감소 또는 소실에 의해 운동조절능력, 인지기능, 지각기능, 감각기능 및 자율신경의 기능 이상을 의미하는 것으로, 주요 증상에 따라 진행성 인지기능 장애, 진행성 운동실조, 근력저하 및 근위축 그릅으로 나뉠 수 있다. 상기 퇴행성 신경질환은 파킨슨씨병(Parkinson's disease), 알츠하이머(Alzheimer's disease), 피크병(Pick's disease), 헌팅톤병(Huntington's disease), 근위축성 측색 경화증(amyotriophic lateral sclerosis), 허혈성 뇌질환(stroke), 탈수초질환(demyelinating disease), 다발성 경화증, 간질 및 퇴행성 신경질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 것 일 수 있으나, 이에 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "예방"은 본 발명의 조성물에 의해 척수 손상을 비롯한 신경 퇴행성 질환의 진행을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어, "치료"는 본 발명의 조성물에 의해 척수 손상을 비롯한 신경 퇴행성 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
만약, 수혜동물이 조성물의 투여에 견딜 수 있거나, 조성물의 그 동물에의 투여가 적합한 경우라면, 조성물은 "약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능함"을 나타낸다. 투여된 양이 생리학적으로 중요한 경우에는 상기 제제는 "치료학적으로 유효량"으로 투여되었다고 말할 수 있다. 상기 제제의 존재가 수혜 환자의 생리학적으로 검출가능한 변화를 초래한 경우라면 상기 제제는 생리학적으로 의미가 있다.
본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여, 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 중량부 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "투여"란, 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여 (예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 주사 제형으로 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여 (예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 상기 조성물 중 포함되는 유효성분의 농도는 대상에 따라 다양하게 선택할 수 있음은 자명하며, 바람직하게는 약학적 조성물에 0.01 ~ 5,000 ㎍/ml의 농도로 포함되는 것이다. 그 농도가 0.01 ㎍/ml 미만일 경우에는 약학 활성이 나타나지 않을 수 있고, 5,000 ㎍/ml를 초과할 경우에는 인체에 독성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 조성물은 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화될 수 있다. 경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경질, 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/ 또는 폴리에틸렌 글리콜)를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제제이며, 주사용 제제의 용매로서 물, 링거액, 등장성 생리식염수 또는 현탁액을 들 수 있다. 상기 주사용 제제의 멸균 고정 오일은 용매 또는 현탁 매질로서 사용할 수 있으며 모노-, 디-글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정오일도 이러한 목적으로 사용될 수 있다. 또한, 상기 주사용 제제는 올레산과 같은 지방산을 사용할 수 있다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 3D 배양 시스템을 이용한 초기 신경계 세포로의 분화 유도
만능 줄기 세포(Pluripotent stem cells, PSCs)의 직접적인 분화에도 원하는 세포의 순수한 집단을 얻는 것은 거의 불가능하고, 다양한 유형의 원하지 않는 세포들이 원하는 세포들과 함께 유도되고 이종 세포 집단을 형성하므로, 초기 신경 계통으로의 분화를 효율적으로 식별하기 위해, 계통 특이적 마커를 사용하였다. 즉, PSCs의 분화 동안 초기 신경계 세포 유형을 선별하고자, 신경 발달의 초기 단계를 식별하기 위한 마커로서 신경 발달 분화에 중요하고 신경관에서 신경 상피 세포의 초기 형성에 특이적인 Sox1(Sry-related-HMG box 1)의 통제 하에 GFP(green fluorescence protein)가 발현되는 (Sox1-GFP) 형질전환 ESCs를 사용하였다. 구체적으로, Sox1-GFP ESC를 37℃의 5% CO2 인큐베이터에서 피더(feeder) 없는 조건으로 배양하였다. 이 때, 사용된 배지는 무혈청 N2B27 배지 (N2 보충제(supplement) (Gibco), B27 보충제 (Gibco), 100x 페니실린/스트렙토마이신/글루타민 (Gibco), LIF(Leukemia inhibitory factor) (ESGRO; Chemicon), 3μM GSK 억제제 (Sigma) 및 1μM MEK 억제제 (Sigma)가 포함된 DMEM/F12 배지 (Gibco) 및 Neurobasal 배지 (Gibco)의 1:1 혼합물)이다. 계대 배양 하루 전에 마트리젤(Matrigel)을 4℃에 두어 액체 상태로 준비한 뒤, 트립신-EDTA (Gibco)를 이용하여 분화되지 않은 Sox1-GFP ESCs를 단일 세포로 만들고 헤마토사이토미터로 세포 수를 계수하여 3,000개의 단일 세포를 4웰 디쉬의 50㎕ 마트리젤 (Corning) 액적(drop)에 분주하였다. 그 후 마트리젤 액적을 37℃의 5% CO2 인큐베이터에서 1시간 동안 고형화한 뒤, 고형화된 마트리젤 액적을 DMEM/F12 (Gibco), 100x 페니실린/스트렙토마이신/글루타민 (Gibco), 5% Knockout serum (Gibco), 100x NEAA(Non-essential amino acid) (Gibco), 20 ng/ml Activin A 보충제 (PeproTech) 및 10 ng/ml bFGF 보충제 (R&D system)를 포함하는 Epi 배지로 배양하여 Sox1-GFP ESC의 분화를 유도하자 (도 1B), Sox1-GFP ESC가 증식하여 배양 후 약 3일 후에 3D 환경에서 일종의 ESC 콜로니와 같은 구형의 응집체가 형성되었다 (도 1C). Sox1-GFP+ 응집체의 일부 (약 30%)는 마트리젤 액적에서 배양한지 7일 후에 Sox1-GFP (Sox1-GFP+)를 발현하는 2중층의 응집체를 형성하기 시작했다 (도 1D). 즉, 배양 10일차에 Sox1-GFP를 균일하게 발현하는 세포로 구성된 응집체가 나타나 (도 1E), Sox1-GFP ESCs가 3D 배양 7일만에 초기 신경계세포 또는 신경상피세포로 분화된 것을 확인하였다. 이 후 이 응집체를 실시예 2에서 신경줄기세포(neural stem cells, NSC) 유도에 사용하였다 (도 2A).
실시예 2. 2D 배양 시스템을 이용한 신경줄기세포 제작
상기 실시예 1에서 3D 배양 방법으로 배양하고 10일차에 거의 모든 세포가 Sox1-GFP를 발현하는 응집체를 선택하여 2D 배양 시스템으로 신경줄기세포(NSC)를 유도하였다. 구체적으로, Sox1-GFP ESCs를 마트리젤에서 3D 배양한 후, 11 내지 12일차에 Cell Recovery Solution (Corning)을 이용하여 마트리젤을 제거하였다. 그 후, 형광 현미경을 이용하여 신경구(neurospheres) 형태의 콜로니들 중 거의 모든 세포가 Sox1-GFP를 발현하는 콜로니 (응집체)를 골라서 젤라틴이 코팅된 24웰 디쉬로 옮겨 NSC 증식(expand) 배지 (DMEM/F12 (Gibco), 100x 페니실린/스트렙토마이신/글루타민 (Gibco), B27 보충제 (Gibco), 10ng/ml EGF(epidermal growth factor) (Gibco) 및 10ng/ml bFGF(basic fibroblast growth factor) (R&D system))로 3 내지 4일 동안 2D로 세포를 배양하였다 (도 2A 및 B). 증식된 신경구를 0.25% 트립신 (Gibco)을 처리하여 단일 세포로 분리한 뒤 젤라틴이 코팅된 디쉬에서 NSC 증식 배지로 2 내지 3일마다 계대 배양하자, 전형적인 NSC의 형태인 극성-형태 세포가 형성되었다 (도 2C). 이 후, 후속 배양을 통해 활발히 자가-증식(self-renewing)하는 NSC가 제작되는 것을 확인하였다 (도 2D 및 E). 이를 통해, ESCs가 3D 배양 (약 10일) 및 2D 배양 (약 7일)을 통해 17일 이내에 효과적으로 2D NSCs로 분화하는 것을 확인하였다.
삭제
실시예 3. 신경줄기세포의 특성 확인
상기 실시예 1 및 2를 통해 제작된 NSCs가 전형적인 NSC 특성을 나타내는지 확인하기 위해, 주요 NSC 마커를 이용하여 면역세포화학(immunocytochemistry, ICC) 및 real-time RT-PCR 분석을 수행하였다. 구체적으로, ICC 분석을 위해, 상기 실시예 2에서 2D 배양하여 제작한 NSCs를 4% PFA(paraformaldehyde)로 4℃에서 20분 동안 고정한 뒤, PBS (welgene)로 세척하고 3% BSA (Gibco) 및 0.3% Triton X-100 (Sigma)를 첨가한 PBS를 처리한 후, 상온 (24℃, RT)에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, NSCs의 마커인 Nestin, Sox2, Pax6 및 Musashi의 항체 (anti-Nestin (Nestin; monoclonal, 1:500, Millipore), anti-Sox2 (Sox2; polyclonal, 1:500, Millipore), anti-Musashi-1 (Musashi-1; polyclonal, 1:500, Millipore) 및 anti-Pax6 (Pax6; monoclonal, 1:500, Adcam))를 1차 항체로 이용하고, 형광 물질 (Alexa fluor 488 또는 568; Molecular probes, Eugene, OR, USA)이 표지된 2차 항체를 이용하였다. 또한, 핵을 표시하기 위해 DAPI로 염색하여 면역세포화학 분석을 수행하였다. 아울러, real-time RT-PCR 분석을 위해, 상기 실시예 2에서 2D 배양하여 제작한 NSCs에서 RNA를 TRIzol reagent (Invitrogen)를 이용하여 추출한 뒤, SuperScript Ⅲ reverse transcriptase (Invitrogen, Grand Island, NY, USA)를 이용하여 총 RNA의 1 mg으로부터 cDNA를 합성하고 하기 표 1의 프라이머 세트 및 TOPreal™ qPCR 2x PreMIX (Enzynomics)를 이용하여 Roche LightCycler 480에서 realtime PCR(Real-time polymerase chain reaction)을 95℃에서 10초, 60℃에서 10초 및 72℃에서 20초로 45 사이클의 조건으로 3회 반복 수행하였다.
Fowrard Reverse
Nestin 5'-AAGTTCCCAGGCTTCTCTTG-3' 5'-GTCTCAAGGGTATTAGGCAAGG-3'
Sox2 5'-GAACGCCTTCATGGTATGGTCC-3' 5'-CGGGTGCTCCTTCATGTGC-3'
N-Cadherin 5'-GTACCGCAGCATTCCATTCAGG-3' 5'-GGCAATCAAGTGGAGAACCCC-3'
Oct4 5'-GGCTTCAGACTTCGCCTTCT-3' 5'-TGGAAGCTTAGCCAGGTTCG-3'
Olig2 5'-GCCTGCTCAAGTCACCGTCG-3' 5'-CACACGCCATCAACACTGGTCGC-3'
S100b 5'-GGTTGCCCTCATTGATGTCTTCC-3' 5'-CATCCCCATCTTCGTCCAGCC-3'
GFAP 5'-CTGATGTCTACCAGGCGGAGC-3' 5'-CCAGGTTGTTCTCTGCCTCCAG-3'
NeuN 5'-CACCTCCGCCTCATCCCAC-3' 5'-GTCTGTGCTGCTTCATCATCTGCC-3'
TUBB3 5'-GCTCACGCAGCAGATGTTCG-3' 5'-GGATGTCACACACGGCTACC-3'
Actb 5'-CGCCATGGATGACGATATCG-3' 5'-CGAAGCCGGCTTTGCACATG-3'
ICC 분석 결과, NSC-특이적 마커인 Musashi, Nestin, Sox2 및 N-Cadherin가 상기 실시예 2에서 제작한 NSCs에서 발현되어 있음을 확인하였으며 (도 3A), Real-time RT-PCR 분석 결과에서도 Nestin, Sox2 및 N-Cadherin와 같은 NSC 마커 유전자가 본 발명의 방법으로 제작된 NSCs에서 발현되고 있는 것으로 나타났으나, 전분화능(pluripotency) 마커인 Oct4는 발현이 확인되지 않았다 (도 3B). 아울러, 만능 줄기 세포 및 NSCs 둘 다에 대한 마커인 Sox2는 ESCs 및 NSCs 모두에서 고발현되고 있었다.
실시예 4. 신경줄기세포의 분화능 확인
NSCs는 다양한 아형의 신경세포 및 신경교세포(glial cells)로 분화할 수 있는 다능성(multipotent) 줄기세포이므로, 상기 실시예에서 제작한 Sox1-GFP ESCs 유래 NSCs가 신경세포(neuron), 성상교세포(astrocytes) 및 희돌기교세포(oligodendrocytes)로 분화하는 능력을 가지고 있는지를 ICC 및 real-time RT-PCR 분석을 통해 확인하였다. 구체적으로, 신경 분화 배지(neuronal differentiation medium) (1% FBS (Hyclone), N2 (Gibco), B27 보충제(Gibco) 및 1x 페니실린/스트렙토마이신/글루타민 (Gibco)를 보충한 DMEM/F12 배지 (Gibco) 및 neurobasal 배지 (Gibco)의 1:1 혼합 배지)에서 3주 동안 배양하여 신경 세포 및 신경교세포로 무작위로 분화시키고 각 세포 특이적 마커 및 관련 유전자에 특이적인 프라이머들을 이용하여 ICC 및 real-time RT-PCR 분석으로 분화를 확인하였다.
ICC 분석 결과, 본 발명의 조건으로 제작된 NSCs가 신경세포 (Tuj1+ 및 MAP2+), 성상교세포 (GFAP+ 및 S100b+) 및 희돌기교세포 (Sox10+)로 분화할 수 있음을 확인할 수 있었다 (도 4A). 특히, 후기 성상교세포 마커인 S100b의 발현을 통해 Sox1-GFP ESC-유래 NSCs가 후기 성상교세포(late astrocyte) 단계로 분화될 수 있음을 확인하였다. 또한, Quantitative RT-PCR 분석 결과에서도 신경세포 (Tuj1 및 NeuN), 성상교세포 (GFAP 및 S100b) 및 희돌기교세포 (Olig2) 마커 유전자의 발현이 관찰되어 Sox1-GFP ESC-유래 NSCs가 신경세포, 성상교세포 및 희돌기교세포로 분화할 수 있음을 확인하였다 (도 4B).

Claims (22)

  1. (A) 미분화 줄기 세포에 신경 계통 세포에서 특이적으로 발현되는 마커 유전자를 형질전환하는 단계;
    (B) 3차원 배양하여 세포 응집체를 형성하는 단계;
    (C) 마커 유전자를 발현하는 세포 응집체를 선별하는 단계; 및
    (D) 선별한 세포 응집체를 2차원 배양하는 단계를 포함하는 신경줄기세포(neural stem cells, NSC)를 제조하는 방법로서,
    상기 (A) 단계의 미분화 줄기 세포는 배아 줄기세포(Embryonic Stem Cell, ESC)이고, 마커 유전자는 Sox1(Sry-related-HMG box 1)을 발현하는 것이며,
    상기 (B) 단계의 3차원 배양은;
    (a) 마커 유전자를 형질전환한 미분화 줄기 세포를 단일 세포로 분리하는 단계;
    (b) 분리한 단일세포와 하이드로겔 및 젤라틴을 혼합한 뒤 졸-겔 상변이를 통해 경화시키는 단계; 및
    (c) 만능 줄기 세포 배지로 배양하는 단계를 포함하고,
    3차원 배양은 10일동안 수행되어 지는 것이며,
    상기 (D) 단계의 2차원 배양은 하이드로겔 표면상에서 3 내지 7일 배양하며,
    상기 (D) 단계의 신경줄기세포는 신경세포, 성상교세포 및 희소돌기아교세포 분화하는 것인, 제조 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서, 마커 유전자에 검출가능한 표지를 추가로 포함하는 신경줄기세포를 제조하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 검출가능한 표지는 형광 표지, 프로브, 발광성 물질(luminescent material), 광색성 화합물, 단백질성 형광 표지, 자기 표지, 방사성표지, 택(tag) 및 합텐으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 신경줄기세포를 제조하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 3차원 배양은 세포가 하이드로겔 내부에서 배양되는 것인, 신경줄기세포를 제조하는 방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제 1항에 있어서, 세포 응집체는 초기 신경계 세포로 분화된 세포의 응집체인, 신경줄기세포를 제조하는 방법.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 제 1항에 있어서, 2차원 배양은 신경줄기세포 증식(expand) 배지로 배양하는, 신경줄기세포를 제조하는 방법.
  17. 제 1항에 있어서, 상기 단계 (D)에서 2차원 배양하여 증식된(expanded) 세포 응집체를 단일 세포로 분리하여 계대배양하는 단계를 추가로 포함하는, 신경줄기세포를 제조하는 방법.
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
KR1020210004617A 2021-01-13 2021-01-13 3차원 배양을 통한 신경줄기세포 제조 방법 KR102568532B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210004617A KR102568532B1 (ko) 2021-01-13 2021-01-13 3차원 배양을 통한 신경줄기세포 제조 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210004617A KR102568532B1 (ko) 2021-01-13 2021-01-13 3차원 배양을 통한 신경줄기세포 제조 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20220102357A KR20220102357A (ko) 2022-07-20
KR102568532B1 true KR102568532B1 (ko) 2023-08-18

Family

ID=82609328

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020210004617A KR102568532B1 (ko) 2021-01-13 2021-01-13 3차원 배양을 통한 신경줄기세포 제조 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102568532B1 (ko)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102013064B1 (ko) * 2018-03-20 2019-08-21 건국대학교 산학협력단 테라토마 유래 오가노이드 제조 방법

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101731068B1 (ko) * 2014-03-07 2017-04-28 울산과학기술원 체세포로부터 희소돌기아교 전구세포로의 직접교차분화 유도용 조성물 및 이의 이용
CN106456672B (zh) * 2014-05-22 2020-03-13 纽约干细胞基金会有限公司 源于多能干细胞的功能性少突胶质细胞及其制备和使用方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102013064B1 (ko) * 2018-03-20 2019-08-21 건국대학교 산학협력단 테라토마 유래 오가노이드 제조 방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
INTERNATIONAL JOURNAL OF STEM CELLS, VOL. 7, NO. 2, P.143_152, 2014 [DOI.ORG/10.15283/IJSC.2014.7.2.143]
과제보고서, 한국연구재단, 바이오·의료기술개발사업, 차세대응용오믹스사업, NO. 2016M3A9 B6946835, 주관: 건국대학교 산학협력단, 2019

Also Published As

Publication number Publication date
KR20220102357A (ko) 2022-07-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102487142B1 (ko) 만능 세포를 분화시키는 방법
Bixby et al. Cell-intrinsic differences between stem cells from different regions of the peripheral nervous system regulate the generation of neural diversity
CA2771901C (en) Substantially pure human retinal progenitor, forebrain progenitor, and retinal pigment epithelium cell cultures and methods of making the same
Klassen et al. Stem cells and retinal repair
Hatami et al. Human embryonic stem cell-derived neural precursor transplants in collagen scaffolds promote recovery in injured rat spinal cord
Huang et al. Directing adult human periodontal ligament–derived stem cells to retinal fate
CN111793608B (zh) 定向诱导hiPSC分化为神经细胞体系的HS5条件培养基
Takagi et al. Survival and differentiation of neural progenitor cells derived from embryonic stem cells and transplanted into ischemic brain
CN105940101A (zh) 由人多能干细胞特化功能性颅基板衍生物
JP2014509192A (ja) 患者特異的な多分化能ニューロン幹細胞を生成する方法および組成物
KR20160090339A (ko) 종뇌 또는 그 선구 조직의 제조 방법
CN105392881A (zh) 体细胞基于小分子转化为神经嵴细胞
CN109312303A (zh) 表达间充质和神经元标志物的干细胞、其组合物及其制备方法
KR20070080561A (ko) 중추 또는 말초 신경계 손상 치료용 조성물
JP4126060B2 (ja) 間葉系幹細胞の神経細胞への分化法と神経変性疾患用の神経細胞含有薬剤成分
CN101124319B (zh) 神经干细胞
US10472607B2 (en) Culture medium and method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into neuroepithelial cells
Viczian Advances in retinal stem cell biology
KR20200026984A (ko) 랜드마크 전사 인자를 사용한 줄기 세포 분화에 의한 신경 전구 세포, 핍지교세포 전구 세포, 및 핍지교세포의 유도
KR102568532B1 (ko) 3차원 배양을 통한 신경줄기세포 제조 방법
Masjkur et al. Neurovascular signals suggest a propagation mechanism for endogenous stem cell activation along blood vessels
TWI575069B (zh) A method for continuously maintaining the growth of motor neuron precursor cells and a pharmaceutical composition
CN107250350B (zh) 持续维持运动神经元前驱细胞生长的方法及医药组合物
CN103031274A (zh) 小分子化合物tws119作为神经干细胞分化诱导剂的新应用
Bakhshalizadeh et al. Neuronal differentiation of green fluorescent protein expressing P19 embryonal carcinoma cells by deprenyl, an antiparkinson drug.

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant