KR20070080561A

KR20070080561A - 중추 또는 말초 신경계 손상 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20070080561A
Application number: KR1020070010585A
Authority: KR
Inventors: 손영숙; 지광범
Original assignee: 재단법인 한국원자력의학원
Priority date: 2006-02-07
Filing date: 2007-02-01
Publication date: 2007-08-10
Also published as: WO2007091790A1; US20090175835A1

Abstract

본 발명은 피하조직으로부터 유도된 신경전구세포, 상기 신경전구세포를 분화시킨 신경세포 또는 상기 신경전구세포를 분화시킨 희소돌기아교세포 또는 슈완 세포를 포함하는 중추 또는 말초 신경계 손상 치료용 조성물; 중추 또는 말초 신경계 손상 치료제의 제조를 위한 피하조직으로부터 유도된 신경전구세포, 상기 신경전구세포를 분화시킨 신경세포 또는 상기 신경전구세포를 분화시킨 희소돌기아교세포 또는 슈완 세포의 용도; 및 포유동물에게 치료상 유효량의 피하조직으로부터 유도된 신경전구세포, 상기 신경전구세포를 분화시킨 신경세포 또는 상기 신경전구세포를 분화시킨 희소돌기아교세포 또는 슈완 세포를 투여함을 포함하는 중추 또는 말초 신경계 손상의 치료 방법을 제공한다. 추가로 본 발명은 본 발명의 신경전구세포, 신경세포, 희소돌기아교세포 또는 슈완 세포를 제조하는 방법을 제공한다.

피하조직, 신경전구세포

Description

중추 또는 말초 신경계 손상 치료용 조성물{A composition for treating damage of central or peripheral nerve system}

도 1은 래트의 피부의 절단면을 H&E 염색한 사진으로 진피 하단부에 있는 피하조직을 보여준다.

도 2는 피하조직에서 분리한 세포들을 N2, bFGF(basic fibroblast growth factor) 및 EGF(epidermal growth factor)를 함유한 DMEM/F12(dulbecco`s modified eagle medium: nutrient mixture F-12) 배지에 3일 배양하여 형성된 스피어(sphere)를 보여준다.

도 3은 형성된 스피어를 17일간 연속 배양하여 성장한 스피어를 보여 준다.

도 4는 신생 래트의 뇌 해마에서 분리하여 B27, bFGF 및 EGF를 함유한 뉴로버살 미디움(Neurobasal medium)에서 17일간 배양한 뉴로스피어를 보여준다.

도 5는 피하조직으로부터 얻은 스피어를 FBS(fetal bovine serum) 함유 DMEM/F12 배양액에서 24시간 동안 배양한 후, 스피어로부터 세포들이 뻗어 나오는 형태적 변화를 보여준다.

도 6은 해마로부터 얻은 뉴로스피어를 FBS를 함유한 DMEM/F12 배양액에서 24시간 동안 배양한 후, 스피어로부터 세포들이 뻗어 나오는 형태적 변화를 보여준 다.

도 7은 NT3(neurotrophin 3)를 함유한 뉴로버살 미디움에서 신경세포로 분화를 유도시킨 후 24시간에 세포가 양극적(bipolar) 형태로 변화한 모습을 보여준다.

도 8a 내지 도 8d는 도 7의 세포를 신경세포로 분화 유도시킨 후 8일째의 세포 형태를 보여준다.

도 9은 도 7의 세포를 신경세포로 분화 유도시킨 후 10일째의 세포 형태를 보여준다.

도 10은 도 8의 세포를 네스틴(nestin), GFAP(Glial fibrillary acidic protein), βⅢ-튜불린(βⅢ- tubulin), 뉴로필라멘트200KD(neurofilament 200kd), 올리고덴드로사이트(oligodendrocytes), CSPG(chondroitin sulfate proteoglycan) 및 A2B5 등의 신경세포 특이적 표식자를 이용해 면역형광분석한 결과를 보여준다.

도 11은 피하조직에서 유래한 스피어를 신경세포로 분화 유도시키기 전과 신경세포로 분화 유도시킨 후 8일째의 세포들의 RT-PCR (reverse transcriptase - polymerase chain reaction ) 결과를 보여준다.　

도 12는 성숙 래트 피하조직에서 분리한 세포를 N2 및 bFGF 함유 배양액에서 7 일간 배양시 형성된 스피어 유사 구조를 보여준다.

도 13은 성숙 래트 피하조직에서 분리한 스피어 형성 세포를 FBS 함유 DMEM/F12 중에서 5번 단층 계대 배양(P5)하여 단층 배양한 세포 형태를 보여준다.

도 14는 단층배양으로 계대 배양한 세포(P5)를 G5 서플먼트를 함유한 DMEM/F12 중에서 24시간 배양 시 세포가 군집을 이루기 시작한 모습들을 보여준다.

도 15은 단층 배양으로 계대배양한 세포(P5)를 G5 서플먼트를 함유한 DMEM/F12 중에서 4일 배양 시 재형성된 스피어를 보여준다.

도 16은 계대배양한 세포(P5)에서 형성된 스피어를 FBS 및 레티노산(all-trans-retinoic acid(RA))을 함유한 알파-MEM(minimum essential medium alpha medium)에서 4시간 배양한 후 스피어의 형태적 변화를 보여준다.

도 17 및 도 18은 도 16의 세포를 FBS 및 레티노산을 함유한 알파-MEM에서 배양 4일째에 분리하여, FBS, 포스콜린(forskolin), bFGF, PDGF-AA(platelet-derived growth factor AA) 및 헤레글린1-베타1(heregulin1-β1)을 함유한 알파-MEM에서 슈완세포(schwann cell)로 분화를 유도시킨 2일째의 세포 형태를 보여준다.

도 19는 슈완세포로 분화 유도 시 PDL 코팅한 배양접시에서 FBS, 포스콜린, bFGF, PDGF-AA 및 헤레글린1-베타1을 함유한 알파-MEM에서 배양한지 6일째에 세포들이 그물망과 유사한 구조를 취함을 보여준다.

도 20은 대조군으로 신생 래트의 좌골 신경에서 분리 배양한 슈완 세포로 배양 2일째의 세포 형태를 보여준다.

도 21은 성숙 피하조직 세포를 슈완 세포로 유도하고 α-MEM 배지, 10% FBS, 5μM 포스콜린, 10ng/ml bFGF, 5ng/ml PDGF-aa, 200ng/ml 헤레글린-베타1, 10ng/ml NT3을 포함한 배지에서 확장시킨 후의 슈완세포 특이적 마커 O4, A2B5, GFAP , P75, S100및 RIP에 대해 면역형광 분석을 실시한 결과를 보여준다.

도 22은 성숙 래트 피하조직 유도 세포의 상이한 시점에서의 슈완세포 마커 에 대한 RT-PCR 분석의 결과를 보여준다.

도 23는 실험군에서 척수 손상 중심 부위의 5HT, GABA 및 CGRP에 대한 면역형광 사진을 보여준다.

도 24은 척수 손상 부위의 GFAP 및 CSPG에 대한 면역형광 사진을 보여준다.

도 25은 실험 군에서의 P75 및 뉴로필라멘트 200KD에 대한 면역형광 사진을 보여준다.

도 26은 실험 군에서의 MBP 및 P0에 대한 면역 형광 사진을 보여준다.

도 27은 실험 군에서의 척수 손상 중심 부위에서의 OMG에 대한 면역 형광 사진을 보여준다.

도 28는 실험 군 척수 손상 중심 부위에서의 파이브로넥틴과 뉴로필라멘트 200 KD의 면역 형광 이중 염색 사진을 보여준다.

본 발명은 피하조직으로부터 유도된 신경전구세포, 상기 신경전구세포를 분화시킨 신경세포 또는 상기 신경전구세포를 분화시킨 희소돌기아교세포 또는 슈완 세포를 포함하는 중추 또는 말초 신경계 손상 치료용 조성물; 중추 또는 말초 신경계 손상 치료제의 제조를 위한 피하조직으로부터 유도된 신경전구세포, 상기 신경전구세포를 분화시킨 신경세포 또는 상기 신경전구세포를 분화시킨 희소돌기아교세 포 또는 슈완 세포의 용도; 및 포유동물에게 치료상 유효량의 피하조직으로부터 유도된 신경전구세포, 상기 신경전구세포를 분화시킨 신경세포 또는 상기 신경전구세포를 분화시킨 희소돌기아교세포 또는 슈완 세포를 투여함을 포함하는 중추 또는 말초 신경계 손상의 치료 방법에 관한 것이다. 추가로 본 발명은 피하조직으로부터 유도된 신경전구세포, 상기 신경전구세포를 분화시킨 신경세포 또는 상기 신경전구세포를 분화시킨 희소돌기아교세포 또는 슈완 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.

최근 배아줄기세포(embryonic stem cell) 또는 신경줄기세포(neural stem cell)를 신경세포로 분화시킨 뒤 이들 신경세포를 뇌에 이식하여 신경계 질환을 치료하고자 하는 시도가 시작되었다. 파킨슨병이나 뇌졸중의 동물 모델에서는 임상증세 호전, 이식세포 생존 등의 양호한 결과를 보이고 있어서 파킨슨병, 뇌졸중, 근위축성 척수측색경화증 및 척수 손상 등의 환자에서도 가까운 시일 내에 줄기세포로부터 유래한 신경세포의 뇌이식이 시도되리라 기대되고 있다.

신경줄기세포는 증식을 계속하는 능력, 즉 자기복제능력을 가지고 있으며, 중추신경계를 구성하는 신경세포(neuron), 성상세포(astrocyte) 또는 희소돌기아교세포(oligodendrocyte) 등으로 분화하는 다분화능력을 가진 미분화세포라 정의할 수 있다. 신경줄기세포는 신경전구세포나 글리아전구세포의 단계를 거쳐서 신경세포/뉴런이나 글리아세포로 분화한다. 따라서 신경세포나 글리아세포로 분화유도하는 기전이나 제어기전의 연구는 신경계 발생의 연구에서뿐만 아니라 신경계 질환 발병 기전 연구 및 치료전략에서도 대단히 중요한 비중을 차지한다.

신경줄기세포가 뇌의 어느 부위에 존재하는가 그리고 신경계 발생의 어느 시기에 발생하여 어느 시기에 소멸하는가에 대해서는 의문이 있었다. 이를 밝히기 위한 연구에서는 신경줄기세포나 신경전구세포에 특유한 세포표지자(marker)인 네스틴(nestin)이라는 중간세사(intermediate filament)를 지표로 사용한다. 척수동물의 발생 초기인 신경관(neural tube)이 형성되기 이전에 이미 신경판(neural plate)에 네스틴을 발현하는 신경줄기세포가 존재한다는 것이 확인되어 있다. 신경관 형성 이후에는 신경관의 뇌실 주변 부위(periventricular zone)에도 네스틴을 발현하는 신경줄기세포가 존재한다. 이들 신경줄기세포는 신경줄기세포 자신 및 신경줄기세포에서 분화한 뉴런/글리아세포 두 타입의 자식 세포(daughter cell)를 생산하는 비대칭성 분열(asymmetrical division)을 계속한다.　

이와 같이 신경계 발생 초기에 존재하는 것으로 알려져 있던 신경줄기세포가 최근 성숙 포유동물에도 존재하고 있음이 밝혀졌다. 지난 100년 동안 성숙 포유동물에서는 뉴런이 새롭게 생산되지 않는다는 것이 정설이었으나, 최근 성인의 중추신경계 중 해마(hippocampus) 또는 뇌실하층(subventricular zone)에서 신경줄기세포가 발견되고 있다.　

그러나, 해마 또는 뇌실하층에 존재하는 신경줄기세포는 인간의 뇌 깊숙한 곳에 자리잡고 있어 파킨슨병, 뇌졸중, 근위축성 척수측색경화증, 척수 손상, 운동신경손상 또는 외상에 의한 말초신경손상 등의 신경계 손상에 이용할 수 있는 자가 신경줄기세포원이 되기가 어렵다.　

이에 좀더 용이하게 취할 수 있는 신경줄기세포원의 확보에 관한 여러 연구 가 진행되었으며, 골수 세포(bone marrow cell), 제대혈 세포(umbilical blood cell), 또는 배아줄기세포(fetal hepatocyte)로부터 얻은 단핵 세포 분획(mononuclear cell fraction)이 신경계 세포로의 분화능력을 가지는 것으로 보고된 바 있다.　

그러나 골수 세포는 접근성이 좋지 않고, 제대혈 세포는 현재 일부 신생아들에 한해 제대혈 저장이 이루어지고 있을 뿐이어서 신경계 손상의 치료를 위한 자가이식요법에는 아직 적당하지 않으며, 배아줄기세포는 그 이용에 대해 윤리적 문제가 일고 있을 뿐만 아니라, 산업상 이용하기에는 실질적으로 많은 어려움이 있다.

또한 골수 세포, 배아줄기세포 등의 기존의 공여 줄기세포들은 임상적 적용을 위해서는 다량으로 세포수를 증식시켜야 한다는 문제점이 있었다.　 이에 국제특허출원 PCT/JP02/11294에서는 불사화한(immortalized) 중배엽 간세포로부터 신경계 세포로의 분화 유도 방법을 개시하면서, 중배엽 간세포를 불사화하여 대량으로 증식시키는 방법을 제시한 바 있다. 그러나 불사화 유전자를 삽입한 세포는 비정상 세포가 될 가능성을 완전히 배제하지 못한다.

이러한 타 공여 줄기세포들의 문제점을 타개할 수 있는 시도로서, 캐나다의 Freda Miller group(Jean G. Toma, et al., Nature Cell Biology, vol 3, Sep. 2001)은 두피 조직에서 3개월간 스페로이드 배양(spheroid culture)으로 신경세포, 신경교세포, 근육세포 또는 지방세포 등으로 분화할 수 있는 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)를 동정하였다고 보고한 바 있다(미국 특허출원 제 09/991,480호). 만일 피부 진피를 공여 줄기세포로 이용할 수 있다면, 다른 공여 줄기세포에 비해 수집이 용이할 뿐만 아니라, 임상적 적용을 위해 충분한 공여 지역을 갖는다는 이점을 갖는다.　

그러나, Freda Miller group의 실험이 피부 진피를 공여 줄기세포로서 이용하여 기존의 타 공여줄기세포가 갖고 있던 문제점을 일부 해결한 면은 있으나, 이들의 실험 방법은 3개월이라는 장기간의 세포 배양을 요하므로 실질적으로 적용하기 어렵고, 또한 장기간의 배양에 의해 형질전환, 탈분화 등의 다양한 세포 변형이 일어났을 가능성을 배제할 수 없다는 문제점이 있었다.　

이에, 본원 발명자들은 성인의 피부 진피를 6일 내지 12일의 단기간 내에 신경전구세포로 유도할 수 있는 배양 방법을 개발한 바 있다(한국특허출원 제2004-0099394호).

본 발명자들은 뒤이은 연구에서, 신경줄기세포의 공여원으로서 피부 중에서도 진피 세포의 이용만을 개시하고 있던 선행 기술의 연구에서 한 발 더 나아가, 신생 및 성숙 래트의 피하조직에서 분리한 세포로부터 스피어(sphere)를 형성하고 네스틴(nestin)을 발현하는 신경전구세포를 유도할 수 있음을 밝혔다.

진피에는 피지선, 땀샘 및 모낭 등 표피세포 유래의 여러 부속 기관이 많이 존재하므로, 진피로부터 스피어를 형성하는 신경전구세포를 분리하여 세포 치료제로 개발하는 경우 피부 부속 기관으로부터 유래한 세포들이 혼합될 가능성이 높아 스피어를 형성하는 세포의 획득률이 피하조직보다는 낮다는 문제점이 있었다.

반면 피하조직을 채취하는 경우 피부 부속 기관의 손상 없이 조직을 채취할 수 있고, 피하조직은 인체에서는 매우 넓게 분포되어 있고 주로 지방조직과 결합 조직이 함유되어 있어 구조상 비교적 단순하고 접근이 용이하다는 점에서, 자가 신경치료제 개발 시 피부에서 표피와 진피 층을 보류하고 흉터 면적을 최소화하면서 충분한 양의 피하 조직을 채취하여 신경치료제 개발에 사용할 수 있다는 이점이 있다. 따라서, 피하조직으로부터 신경전구세포를 유도하여 세포치료제로 사용할 수 있다면 임상적으로 매우 실용적이고 유용하게 이용할 수 있을 것이다.

이에, 본 발명은 피하조직으로부터 유도된 신경전구세포, 상기 신경전구세포를 분화시킨 신경세포 또는 상기 신경전구세포를 분화시킨 희소돌기아교세포 또는 슈완 세포를 포함하는 중추 또는 말초 신경계 손상 치료용 조성물; 중추 또는 말초 신경계 손상 치료제의 제조를 위한 피하조직으로부터 유도된 신경전구세포, 상기 신경전구세포를 분화시킨 신경세포 또는 상기 신경전구세포를 분화시킨 희소돌기아교세포 또는 슈완 세포의 용도; 포유동물에게 치료상 유효량의 피하조직으로부터 유도된 신경전구세포, 상기 신경전구세포를 분화시킨 신경세포 또는 상기 신경전구세포를 분화시킨 희소돌기아교세포 또는 슈완 세포를 투여함을 포함하는 중추 또는 말초 신경계 손상의 치료 방법; 및 본 발명의 신경전구세포, 신경세포, 희소돌기아교세포 또는 슈완세포를 제조하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 피하조직으로부터 유도된 신경전구세포를 유효성분으로 포함하는 중추 또는 말초 신경계 손상 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 구체예에서, 상기 피하조직으로부터 유도된 신경전구세포는 뉴로스피어를 형성하고 네스틴 및/또는 SOX10을 발현한다.

본 발명의 한 실시예에서, 상기 신경전구세포는 피하조직세포를 N2 서플먼트, bFGF 및 EGF를 포함하는 배양액에서 배양하여 형성된 스피어로부터 얻은 세포이다.

또한, 본 발명은 피하조직으로부터 유도된 신경전구세포를 분화시킨 신경세포를 유효성분으로 포함하는 중추 또는 말초 신경계 손상 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 한 실시예에서, 상기 신경세포는 피하조직으로부터 유도된 신경전구세포를 NT3를 포함하는 뉴로버살 미디움에서 분화시킨 세포이다.

본 발명은 또한 피하조직으로부터 유도된 신경전구세포를 분화시킨 희소돌기아교세포 또는 슈완 세포를 유효성분으로 포함하는 중추 또는 말초 신경계 손상 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 한 실시예에서, 상기 희소돌기아교세포 또는 슈완 세포는 피하조직으로부터 유도된 신경전구세포를 레티노산 함유 배양액에서 배양한 후, 혈청, 포스콜린, bFGF, PDGF-AA 및 헤레글린을 포함하는 배양액에서 분화시킨 세포이다.

또한, 본 발명은 중추 또는 말초 신경계 손상 치료제의 제조를 위한 피하조직으로부터 유도된 신경전구세포, 상기 신경전구세포를 분화시킨 신경세포 또는 상기 신경전구세포를 분화시킨 희소돌기아교세포 또는 슈완 세포의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 포유동물에게 치료상 유효량의 피하조직으로부터 유도된 신경전구세포, 상기 신경전구세포를 분화시킨 신경세포 또는 상기 신경전구세포를 분화시킨 희소돌기아교세포 또는 슈완 세포를 투여함을 포함하는 중추 또는 말초 신경계 손상의 치료 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 중추 또는 말초 신경계 손상은 파킨슨병, 뇌졸중, 근위축성 척수측색경화증, 척수 손상, 운동신경손상 또는 외상에 의한 말초신경손상을 포함한다.

또한 본 발명은 피하조직세포로부터 신경전구세포, 신경세포, 희소돌기아교세포 또는 슈완 세포를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 피하조직세포를 N2 서플먼트, bFGF 및 EGF를 포함하는 배양액에서 배양함을 포함하는 피하조직세포로부터 신경전구세포를 제조하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 방법에 따라 얻은 피하조직세포 유래의 신경전구세포를 NT3를 포함하는 뉴로버살 미디움에서 신경세포로 분화시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 방법에 따라 얻은 피하조직세포 유래의 신경전구세포를 레티노산을 포함하는 배양액에서 배양한 후, 혈청, 포스콜린, bFGF, PDGF 및 헤레글린을 포함하는 배양액에서 희소돌기아교세포 또는 슈완 세포로 분화시키는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 피하조직으로부터 유도된 신경전구세포는 피하조직에서 세포를 분리한 후 피하조직세포를 N2 서플먼트, bFGF 및 EGF를 포함하는 배양액에서 배양하는 과정을 통해 얻어진다.

피하조직으로부터 유도된 신경전구세포를 보다 다량으로 확보하기 위해서는, 먼저 피하조직에서 세포를 분리한 후 스피어를 형성하는 세포를 선별하고 이들 세포를 분리하여 5 계대까지 단층 배양하여 대량 세포를 확보하고, 확장된 세포를 다시 스피어로 유도시키는 과정을 거치는 것이 효과적이다.

예를 들어, i) 피하조직세포를 N2 서플먼트, bFGF 및 EGF를 포함하는 배양액에서 배양하여 스피어를 얻고, ii) 상기 스피어를 B27 서플먼트, bFGF 및 EGF를 포함하는 배양액에서 배양하거나,

피하조직세포를 N2 서플먼트를 함유하는 DMEM/F12 배지에 현탁하여 배양하고, 혈청을 포함하는 배양액에서 단층 계대 배양한 후, N2 서플먼트, bFGF 및 EGF를 포함하는 배양액 또는 G5 서플먼트를 포함하는 배양액에서 배양하여 수행될 수 있다.

상기 방법에 따라 피하조직세포로부터 얻은 신경전구세포는 NT3를 포함하는 뉴로버살 미디움에서 배양하여 신경세포로 분화시키거나, 레티노산을 포함하는 배양액에서 배양한 후, 혈청, 포스콜린, bFGF, PDGF 및 헤레글린을 포함하는 배양액에서 배양하여 희소돌기아교세포 또는 슈완 세포로 분화시킬 수 있다.

본 발명에 따른 신경전구세포의 분리, 배양 및 분화 방법을 신생 래트(New born rat)를 중심으로 하여 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.

(1) 신생 래트 피하조직으로부터 분리해 낸 세포를 N2 서플먼트를 함유하는 DMEM/F12 배양액에 현탁하여 배양하고 (단계 1),

(2) 단계 1에서 비 부착된 세포를 원심 분리하여 수확하고 B27 서플먼트를 함유하는 DMEM/F12 배양액에 다시 플레이팅하여 스피어 형태로 배양하며(단계 2),

(3) 단계 2에서 형성한 스피어를 단일 세포로 분산시켜 B27을 함유하는 DMEM/F12 배양액에서 스피어 형태로 계대 배양한 후(단계 3),

(4) 단계 3에서 계대배양한 스피어를 NT3을 함유한 뉴로버살 미디움에서 8-10일간 배양하여 신경세포로 분화를 유도하고(단계 4),

(5) 신경세포 특이 표식자로 면역형광분석을 진행 및 mRNA(messenger RNA)를 추출하여 RT-PCR로 유전자발현 분석하여 신경세포로의 분화여부를 확인하였다(단계 5).

또한, 본 발명에 따른 신경전구세포의 분리, 배양 및 분화 방법을 성숙 래트(matured rat)를 중심으로 하여 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.

(1) 성숙 래트의 피하조직으로부터 분리해 낸 세포를 N2를 함유하는 DMEM/F12 배지에 현탁하여 배양하고(단계 1),

(2) 단계 1의 비 부착된 세포를 원심분리하여 수확하고 혈청을 함유한 DMEM/F12에서 단층 계대배양(monolayer culture)을 5회 수행한 후(단계 2),

(3) 단계 2의 계대배양 5계대 세포(P5)를 N2 서플먼트, bFGF 및 EGF를 포함 하는 배양액으로 코팅한 배양 접시에서 3일간 배양하고 G5 서플먼트를 함유한 DMEM/F12로 전액 교체하여 6일간 배양하여 스피어를 형성시킨 후(단계 3),

(4) 단계 3의 세포를 FBS 및 레티노산을 함유한 알파-MEM에서 4일 배양하고(단계 4),

(5) 단계 4의 세포를 알파-MEM, FBS, 포스콜린, bFGF, PDGF-AA 및 헤레글린1-베타1, NT3을 함유한 슈완세포 분화 유도 배양액에서 P4-5까지 계대 배양한 후(단계 5),

(6) 단계 5의 세포를 분리하여 코팅한 배양 접시에서 슈완세포 분화 유도 배양액으로 3일간 배양하고, 면역형광분석을 진행하고, mRNA를 추출하여 RT-PCR로 유전자 발현 분석을 하여 슈완세포로 분화 여부를 확인하고, 또한 단계 5의 세포를 인 비트로( in vitro)에서 PKH26 형광물질로 세포막을 레이블링(labeling) 한 후 래트 척수 손상 중심 부위에 마이크로 주사를 하여 8주 후 체내에서 위 세포의 작용을 추정 분석 하였다(단계 6).

본 발명의 방법으로 분리·배양된 피하조직세포는 신경전구세포, 신경세포, 희소돌기아교세포 또는 슈완 세포로 분화 유도될 수 있음을 확인하였다. 나아가 in vivo 실험을 통해 피하조직으로부터 유도된 신경전구세포를 분화시킨 슈완 세포가 마우스 척수 손상 부위의 회복에 중요한 역할을 한다는 사실을 확인하였다.

따라서, 본 발명에 따른 피하조직으로부터 유도된 신경전구세포, 상기 신경전구세포를 분화시킨 신경세포 또는 상기 신경전구세포를 분화시킨 희소돌기아교세 포 또는 슈완 세포를 포함하는 중추 또는 말초 신경계 손상 치료제, 및 중추 또는 말초 신경계 손상 치료제의 제조를 위한 피하조직으로부터 유도된 신경전구세포, 상기 신경전구세포를 분화시킨 신경세포 또는 상기 신경전구세포를 분화시킨 희소돌기아교세포 또는 슈완 세포의 용도를 제공한다.

본 발명의 중추 또는 말초 신경계 손상 치료제로 치료할 수 있는 중추 또는 말초 신경계 손상에는 파킨슨병, 뇌졸중, 근위축성 척수측색경화증, 척수 손상, 운동신경손상, 또는 외상에 의한 말초신경손상이 포함될 수 있다.

본 발명에 있어서, 피하조직세포의 신경전구세포로의 유도 배양 또는 상기 신경전구세포의 신경세포로의 분화 배양을 위해 필요한 배지의 성분은 필요에 따라 동일한 효과를 나타내는 다른 성분으로 대체될 수 있다. 신경전구세포의 배양을 위한 배지 또는 신경세포로의 분화를 위한 배지에서 사용되는 성분은 당업자에게 공지되어 있으며, 필요에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있다.

또한, 신경전구세포의 배양 배지 또는 신경세포로의 분화 배지에서 사용되는 성분들의 함량은 당업자가 배양 또는 분화시키고자 하는 목적이나 정도에 따라 다르게 사용할 수 있음은 자명하다.

다만, 이에 제한되는 것은 아니나, 본 발명의 실시예에 있어서, bFGF는 바람직하게는 1-100 ng/ml, 더욱 바람직하게는 10-40 ng/ml의 범위로 사용할 수 있으며, 헤파린(heparin)은 바람직하게는 0.5-20㎍/ml, 더욱 바람직하게는 2-10㎍ /ml의 범위로 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에서 사용된 N2 서플먼트의 조성은 인슐린 500㎍/ml + 인간 트 랜스퍼린 10mg/ml + 프로게스테론 0.63㎍/ml + 푸트레신 1.611mg/ml + 셀레니트 0.52㎍ /ml이고, G5 서플먼트의 조성은 인슐린 500㎍/ml + 인간 트랜스퍼린 5mg/ml + 셀레니트 0.52㎍/ml + 비오틴 1.00㎍/ml + 하이드로코티손 0.36㎍/ml + FGF 0.50㎍ /ml + EGF 1.0㎍/ml이다. B27 서플먼트의 조성성분은 공개되지 않고 있으나 현재 시판되고 있어 신경전구세포 및 신경세포 배양을 위해 당업자에게 널리 이용되고 있다.

또한 본 발명은 포유동물에게 치료상 유효량의 피하조직으로부터 유도된 신경전구세포, 상기 신경전구세포를 분화시킨 신경세포 또는 상기 신경전구세포를 분화시킨 희소돌기아교세포 또는 슈완 세포를 투여함을 포함하는 중추 또는 말초 신경계 손상의 치료 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 중추 또는 말초 신경계 손상을 치료하기 위한 본 발명에 따른 피하조직으로부터 유도된 신경전구세포, 상기 신경전구세포를 분화시킨 신경세포 또는 상기 신경전구세포를 분화시킨 희소돌기아교세포 또는 슈완 세포의 유효 용량은 1×10⁴ 내지 1×10⁷ 세포/kg 일 수 있다. 그러나 이 용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 증상의 경중도에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.

본 발명에 따른 치료제는 비경구, 국소 투여에 의해 인체에 적용될 수 있으며, 정맥 내 투여, 동맥 내 투여, 뇌 척수액 내 투여 등의 방법으로 투여될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 유효 성분을 통상의 방법에 따라 약제학적으로 허용가능한 담체에 현탁시키거나 용해시킬 수 있으며, 이 때 생리식염수 등의 수용성 담체 를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

실시예 1: 신생 래트 피하조직세포의 신경세포로의 분화 유도 확인

1-(1). 피하조직세포의 분리 및 스피어 배양

신생 래트의 등 뒤 부위에서 피하조직을 포함한 피부를 채취하였다. 무균 환경에서 해부용 현미경을 이용하여 피하조직을 진피와 표피를 포함한 피부조직으로부터 분리하였다. 분리한 피하조직을 동일한 부피의 PBS(phosphate-buffered saline)로 세척하여 적혈구 및 잔해로 인한 오염을 제거하였다. 이후, 분리한 피하조직을 0.1% 콜라게네이즈로 37℃에서 40분간 소화시켰다. 효소 활성을 DMEM 중의 10％ 소태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)으로 중화시키고, 1500rpm/min에서 5분 동안 원심분리하였다. 생성된 펠렛을 재현탁하고, PBS 중에서 0.1％ DNase로 1분 동안 소화시키고, DMEM으로 10회 파이페팅하여 기계적으로 분리시키고, 40㎛ 세포 여과기를 통해 여과하였다. 세포 현탁액을 세척한 후 1500rpm/min에서 5분 동안 2회 원심분리하였다.

모든 분리된 세포를 20ng/㎖ bFGF (R&D), 20ng/㎖ EGF(R&D), N2 서플먼트, 2㎍/㎖ 헤파린(heparin,Sigma), 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/ streptomycin, JBI)을 함유하는 DMEM/F12(3:1) 배양액 중에 플레이팅하여 100mm 배양접시 중에서 배양하였다.

3일째에, 비부착된 세포들을 모으고, 1500rpm/min에서 5분 동안 원심분리하였다. 1％ B27(Gibco), 20ng/㎖ bFGF, 20ng/㎖ EGF, 2㎍/㎖ 헤파린, 1％ 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 DMEM/F12(3:1) 중의 세포 현탁액을 100mm 배양접시에 씨딩하였다. 배지의 2/3을 매 3일마다 교환하고, 형성된 스피어 유사 구조를 매 7-10일 간격으로 불로 소독한 파스퇴르 피펫으로 파이페팅했다.

1-(2). 피하조직에서 유도한 세포의 스피어 형성 확인

실시예 1의 1-(1)에 따른 피하조직세포를 배양하면 스피어가 형성된다. 도 2는 피하조직에서 분리한 세포들로부터 형성된 스피어 유사 구조를 보여준다(3일째). 이들을 연속적으로 배양하면 도 3에서 볼 수 있는 바와 같은 뉴로스피어(neurosphere) 유사 구조를 형성한다(17일째). 이는 도 4의 신생 래트의 뇌 해마의 뉴로스피어(17일째)와 유사함을 알 수 있다.

도 5는 피하조직으로부터 얻은 뉴로스피어 유사 구조를 10％ FBS 함유 DMEM/F12(3:1) 중에서 24시간 동안 배양한 후의 형태 변화를 보여준다. 이는 도 6의 해마로부터 얻은 뉴로스피어를 10% FBS 함유 DMEM/F12(3:1) 중에서 24시간 동안 배양한 후의 형태 변화와 매우 유사함을 알 수 있다.

2-(1). 신경세포로의 분화 유도

스피어를 불로 소독한 파스퇴르 피펫으로 분산시키고, 단일 세포 현탁액을 70,000 세포/㎖의 밀도로 뉴로버살 미디움(Gibco), 1㎍/㎖ 라미닌(laminin, sigma), N2(invitrogen), 20ng/㎖ bFGF(R&D) 및 20ng/㎖ EGF(R&D)를 함유하는 배지에서 희석하였다. 세포 현탁액의 500㎕ (또는 10ml)의 분취량을 24-웰 플레이트(또는 100mm 배양접시) 중의 폴리-D-라이신(poly-D-lysin, PDL)/라미닌 코팅된 플라스크 및 커버 글래스 상에 씨딩하였다. 48시간 후, 배지를 제거하고, 뉴로버살 미디움 (Gibco), 1㎍/㎖ 라미닌(sigma), N2(Gibco) 및, 20ng/㎖ 뉴로트로핀-3(NT3)(R&D)를 함유하는 분화 배지로 교체하였다. 배지의 2/3을 매 2일 마다 교체하면서 지속 배양하였다.

2-(2). 신경세포 분화 유도 확인

실시예 1의 2-(1)에 따라 신경세포분화를 유도하자 피하조직세포들은 신경세포의 모습을 나타내었다.　 도 7, 도 8a-8d 및 도 9는 각각 24시간, 8일, 10일 후의 세포들의 형태를 보여준다.　　

도 7의 신경세포분화 유도 24시간 후 세포들은 길쭉한 모양을 보여준다.　 도 8a-8d의 신경세포분화 유도 8일 후의 세포들은 대부분 뉴런 세포의 형태를 나타내고 있다.　 도 8에서 흑색 화살표는 뉴런 세포의 형태를, 백색 화살표는 희소돌 기아교세포의 형태를 가리키고 있다. 도 9는 신경세포분화 유도 10일 후의 세포들 또한 뉴런 세포의 형태를 나타내고 있으며, 희소돌기아교세포의 형태를 나타내는 세포도 있다(흑색 화살표).

3-(1). 면역형광분석을 통한 분화 확인

실시예 1의 2-(1)에 따라 세포를 배양한지 8일 후, 24웰 내의 세포를 면역형광 분석 전에 PBS 중의 차가운 4％ 포름알데히드(formaldehyde) 중에서 30분 동안 고정하였다.

커버 슬립 상에 고정된 세포를 PBS로 10분 동안 3회 세척하고, 0.2％ 트립톤 X-100 중에서 10 분 동안 침투화시킨 후, PBS로 10분 동안 3회 세척했다. 커버 슬립을 1시간 동안 실온에서 10％ 정상 말 혈청으로 블로킹시켰다. 일차 항혈청(마우스 항-튜불린-βIII(1:50, Chemicon); 마우스 항-네스틴(1:50, Chemicon); 마우스 항-GFAP(1:100 Chemicon); 마우스 항-뉴로필라멘트 200kd(1:100, Chemicon); 마우스 항-Oligodendrocytes (1:100, Chemicon); 마우스 항-CSPG(1:100, Chemicon); 마우스 항-A2B5(1:50, Chemicon))을 5％ 정상 말 혈청 중에 희석시키고, 4℃에 밤새 두었다. 일차 항체를 제거하고, 세포를 10분 동안 3회 세척한 후, 플루오레세인(fluorescein) -마우스 Ig (H+L) 항체를 1:100으로 5％ 정상 말 혈청 중에서 1.5 시간 동안 실온에서 희석시켰다. 그 후, 그 슬립을 PBS로 10분 동안 3회 세척하고, 핵을 DAPI로 염색하고, 슬립을 슬라이드에 올려 놓고 레이카 마이크로시스템(Leica Microsystem)을 이용해 가시화했다.

3-(2). 면역형광분석의 결과

신경세포로의 분화 유도 8일 후의 세포들을 네스틴, GFAP, 튜불린-βIII, 뉴로필라멘트200KD, Oligodendrocytes, CSPG, A2B5에 대한 면역형광분석을 시행한 결과 도 10의 결과를 나타내었다.　 도 10에서 확인할 수 있는 바와 같이 피하조직세포를 신경세포로 분화 유도하면 신경전구세포가 가지는 특성을 나타내는 것을 알 수 있다.　

이 결과를 요약하면 하기 표와 같다.

4-(1). RT-PCR 분석을 통한 분화 확인

실시예 1의 2-(1)에 따라 세포를 배양한지 8일 후, 100mm 배양접시 중의 세포를 EDTA/트립신(Gibco)를 이용하여 분리하고, PBS 중에서 세척하고 3회 원심분리한 후, 계속적으로 전체 mRNA를 프로토콜에 따라 알엔이지 미디 키트(RNeasy midi kit, Qiagen)에 의해 추출하였다.

제조사의 지시에 따라 옴니스크립트 알티 키트(Omniscript RT kit, Qiagen)으로 cDNA를 합성하고, 하기와 같은 PCR을 통해 유관 유전자의 발현을 분석하였다.

4-(2). RT-PCR 분석 결과

신경세포 분화 유도 전의 세포[1-(1)의 세포]와 신경세포 분화 유도 8일 후의 세포[2-(1)의 세포]에 대해 네스틴, 튜불린-βIII, GFAP, Sox10 및 GAPDH 분석을 실시하였다. Sox10은 신경 능선 줄기세포(Neural crest stem cell)의 마커이다.

분석 결과는 도 11과 같다.

신경세포 분화 유도 후, 네스틴, 튜불린-βIII 및 Sox10의 발현양이 감소했다. 신경세포 분화 유도 전과 후의 GAPDH의 양을 동일한 수치로 가정할 때, 네스틴 및/또는 SOX10의 발현량은 분화 유도 전보다 감소하고, 튜불린-βIII의 발현량은 증가한 것으로 보인다.

이 결과는 피하조직세포가 신경전구세포의 성격을 띠고 있으며, 신경분화 유도 조건 하에서 신경세포로 분화될 수 있다는 것을 의미한다.

실시예 2: 성숙 래트의 피하조직세포의 슈완세포로의 분화 유도 확인

1-(1). 피하조직세포의 분리 및 스피어 배양

성숙 암컷 Sprague-Dawley 래트 (350g)를 마취하여 무균 상태에서 조심스럽게 피부 아래에서 피하조직을 분리하였다. 이 조직을 100U/ml 페니실린 및 100ug/ml 스트렙토마이신이 포함된 PBS로 세척하여 잔해와 적혈구를 제거하고 1mm 수술용 칼을 이용하여 잘게 썬 후 0.5% collagenase type I 을 처리하여 37℃에 1시간 동안 두었다. 소화 후 collagenase와 동량의 10% FBS을 포함한 DMEM/F12 (1:1)을 처리하여 1500rpm/min으로 5분간 원심 분리하였다. 조심스럽게 상등액은 버리고, DMEM/F12 (3:1)로 2번 세척한 후 40mm strainer filter로 여과하여 조직덩어리를 제거하였다.

여과 후 원심분리 하여 분리된 피하조직세포를 N2 supplement, 20ng/ml EGF, 20ng/ml bFGF, 2ug/ml 헤파린을 포함하는 DMEM/F12 (3:1)) 배양액이 들어있는 75cm² 플라스크에 플레이팅하여 배양하였다. 배지를 3일 마다 교체하였다.

7-10일 후 스피어가 생기면 원심분리하여 분리해 내고, 이 스피어를 불로 소독한 파스퇴르 피펫을 이용하여 단일 세포로 만들었다. 원심분리 후 이 분리된 cell을 75 cm² flask에 10% FBS을 포함한 DMEM/F12(3:1)에 플레이팅했다(5x10⁵/ml). 배지의 2/3을 매 3일마다 교환하면서 세포가 90% confluence해졌을 때 0.5% EDTA/트립신으로 세포를 분리하여 1:3의 비율로 세포를 희석하여 P5까지 계대 배양하였다.

1-(2). 피하조직에서 유도한 세포의 스피어 형성 확인

실시예 2의 1-(1) 에 따라 피하조직세포를 배양하면 스피어가 형성된다. 도 12는 성숙 래트 피하조직에서 분리한 세포를 N2 및 bFGF 함유 배양액에서 7 일간 배양시 형성된 스피어 유사 구조를 보여준다. 성숙 래트의 계대배양 세포 P5 (도 13과 같은 세포)를 20ng/ml bFGF(R&D),20ng/ml EGF(R&D), N2 서플먼트(Gibco), 2μg/ml 해파린 및 1% 페니실린/스트렙마이신을 함유한 DMEM/F12(3:1)배지에서 3일 간격으로 2/3배지를 교체하면서 연속 6일 혹은 3일 후 배지를 뉴로버살 미디움, G5 서플먼트, 2μg/ml 라미닌, 2ug/ml 헤파린을 함유하는 배지로 교체하고 24시간 배양하면 도 14와 같은 세포 형태를 나타내며, 상기 배지에서 3-4일간 배양하는 경우 도 15와 같은 스피어 형태가 형성되는 것을 관찰할 수 있다.

2. 슈완세포로의 분화 유도 및 분화 유도 확인

상기 1-(2) 의 7일 후 스피어를 원심분리하여 poly-L-lysine이 코팅된 디쉬에 α-MEM 배지, 10% FBS, 35ng/ml all-trans 레티노산, 100u/ml 페니실린 및 100mg/ml 스트렙토마이신이 포함된 배지 (transdifferentiation medium)에 플레이팅하여 4일동안 배양하였다. 도 16은 배양 4일후 스피어 형태 변화를 보여준다. 4일 후 트립신-EDTA 용액으로 분리한 세포를 poly-L-lysine이 코팅된 디쉬에 α-MEM 배지, 10% FBS, 5μM 포스콜린, 10ng/ml bFGF, 5ng/ml PDGF-aa, 200ng/ml 헤레글린-베타1을 포함한 배지에 플레이팅하여 8일 동안 배양하였다. 4일마다 배지의 2/3 씩 교체하였다. 도 17-18은 2일째, 도 19는 6일째 세포 형태를 나타낸다. 이는 도 20에서 보여주고 있는 신생 래트의 좌골 신경 슈완 세포를 초기 배양(2일)한 세포 형태와 유사함을 확인할 수 있다. Confluence 후 세포를 분리하여 포스콜린을 10ng/ml NT3 (neurotrophin-3)로 교체하고 기타 성분은 변경하지 않은 위 배지로 20일 동안 계대 배양하였다.

3-(1). 면역형광분석을 통한 분화 확인

슈완세포로 유도된 세포는 전환분화(transdifferentiation) 후 계대 배양하여 커버 슬립에 씨딩한 후 α-MEM 배지, 10% FBS, 5μM 포스콜린, 10ng/ml bFGF, 5ng/ml PDGF-aa, 200ng/ml 헤레글린-베타1, 10ng/ml NT3를 포함한 배지에서 4일 동안 배양하여 면역형광염색으로 분석하였다. 4% 파라포름알데하이드(PFA)를 포함하는 PBS 중에서 세포를 30분 동안 고정시켰다. PBS로 3번 세척한 후, 0.2% Triton X-100를 포함한 PBS 중에서 침투와 시키고 PBS로 3번 세척하였다. 20% 염소 혈청을 포함한 PBS 중에서 1시간 동안 블로킹시키고 4℃에서 밤새 일차항체[ 마우스 항-O4 (1:500; chemicon), 마우스 항-A2B5 (1:500; chemicon), 마우스 항-RIP (1:1000; chemicon), 염소 항-PDGFra ( 1:50; Santacruz), 마우스 항-P75 (1:200; chemicon), 마우스 항-GFAP (1:200; chemicon), 마우스 항-S100 (1:100; chemicon), 마우스 항-비멘틴(1:200; chemicon)]를 처리했다. PBS로 3번 세척한 후 상온에서 1시간 동안 2차 항체로서 항-마우스 IgG (1:200; chemicon) 를 처리했다. 결과는 Leica 형광현미경으로 관찰했다.

본 실시예에서 사용된 세포 및 조직 면역학적 분석 마커는 다음과 같다.

O4	immature schwann cell and oligodendrocyte
A2B5	Schwann cell and Oligodendrocyte
RIP	Schwann cell and oligodendrocyte
S-100 protein	Schwann cell
P75	Schwann cell
GFAP	schwann cell and astrocyte
CSPG (chondroitin sulfate proteoglycan)	inhibitor of axon regeneration
Neurofilament 200KD	Neuron axon
MBP (myelin basic protein)	major constituent of CNS , PNS myelin
P0	major constituent of PNS myelin
OMG ( oligodendrocyte myelin glycoprotein)	Expressed by neuron and oligodendrocytes. That inhibits neurite outgrowth
5HT	Serotonin neuron
GABA	GABA-ergic neuron
CGRP (calcitonin gene related peptide)	Sensory neuron
Fibronectin	Fibroblast or other cells

3-(2). 면역형광분석의 결과

도 21은 성숙 피하조직 세포를 슈완 세포로 유도하고 α-MEM 배지, 10% FBS, 5μM 포스콜린, 10ng/ml bFGF, 5ng/ml PDGF-aa, 200ng/ml 헤레글린-베타1, NT3을 포함한 배지에서 확장시킨 후의 슈완세포 특이적 마커에 대해 면역형광 분석을 실시한 결과를 보여준다.

분화 유도 후 95% 이상의 세포들이 슈완세포 특이적 마커인 O4, A2B5, GFAP, S100 및 RIP를 발현하고 P75는 부분적으로 발현함을 확인할 수 있었다.

Name	Level of Expression
O4	++
A2B5	++
GFAP	++
P75	+
S100	++
RIP	++

4-(1). RT-PCR 분석을 통한 분화 확인

각 배양 단계마다 트립신-EDTA(Gibco)를 처리하여 세포를 분리하고, PBS로 세척한 후 1500rpm/min로 5분 원심분리하였다. mRNA는 RNase mini kit (Queagen)를 이용하여 분리하고 cDNA는 Superscript^TM III first stand systhesis system for PCR을 이용하여 합성하였다. PCR은 100ng cDNA로 Perfect PreMix ver 2.1(Taq, TaKaRa)을 사용하여 하였다.

RT-PCR 분석에서 사용하는 마커는 다음과 같다.

S100b	schwann cell
P75	schwann cell
Protein 22 (PMP22/egr2)	a protein component of peripheral nerve myelin with proposed roles in myelin formation and stability
SCIP (OCT6/Tst-1)	related to cAMP levels of neuron and making myelin on neuron axon
PLP (myelin proteoliqid protein or lipophilin/DM20)	a major constituent of myelin , mainly in CNS myelin
Krox-20	transcription factor of key importance in myelination
L1	adhesion molecule secreted by schwann cells , to which injured axons attach and grow and important for ensheathment and myelination.
ErbB2	respective receptor for the applied growth factor heregulin-beta1 relate to glia cell differentiation and axon generation
PDGFr-aa	oligodendrocyte
NSE	neural stem cells

또한, RT-PCR 분석을 위해 사용된 프라이머는 다음과 같다.

primer	left primer (5`-3)	right primer(5`-3`)	size (bp)	A.T.(℃)
S100β	GAGAGAGGGTGACAAGCACAA	GGCCATAAACTCCTGGAAGTC	169	52
P75	TGTGTGAAGAGTGCCCAGAG	TCCACAGAGATGCCACTGTC	496	52
Pmp22	TCCTCATCTGTGAGCGAATG	ACAGACCAGCAAGGATTTGG	163	52
SCIP	ATTCCCCGGGAGAATGGACGAAAAGAGGAGAGTCC	AGGTGCGAGAAGAGGCGCGGAAAGAATAAAGTGAC	126	62
Krox-20	AGATACCATCCCAGGCTCAGT	CTCTCCGGTCATGTCAATGTT	300	56
L1	TGGAAGTGGAGGAAGGAGAAT	AAGTGGGCATTGCAGATGTAG	202	52
ErbB2	AATGCCAGCCTCTCATTCCTG	GACTTCGAAGCTGCAGCTCC	235	52
PDGFR-α	CTGTAACTGGCAGGCTCGGAG	GTTGTCTGCAGTACAAGTTGGCG	331	55
NSE	TGTGGTGGAGCAGGAGAAGC	GATGCATCGGGAAGGGTCAG	556	58
GAPDH	ATGGGAAGCTGGTCATCAAC	GGATGCAGGGATGATGTTCT	440	58
PLP/DM20			421	55
GFAP			430	55

* Primers GFAP( RD-149-025) and PLP/DM20 (RDP-152-025) from R&D system

4-(2). RT-PCR 분석의 결과

도 22은 실시예 2에 따라 배양된 성숙 래트 피하조직 유도 세포의 상이한 시점에서의 슈완세포 마커에 대한 RT-PCR 분석의 결과를 보여준다. 라인 A는 마커를 나타내고, 라인 B는 단층 배양 세포의 유전자 발현을 나타내며, 라인 C는 스피어 형성 세포의 유전자 발현을 나타내고, 라인 D는 슈완 세포 표현형으로의 유도 후의 유전자 발현을 나타내며, 라인 E는 래트의 좌골 신경으로부터 얻은 슈완 세포의 양성 유전자 발현을 나타내며, 라인 F는 음성 대조군인 물을 나타낸다. 슈완세포 표현형으로의 유도 후(라인 D) 슈완세포 특정 유전자 마크들의 발현이 정상 슈완세포(라인 E)와 매우 유사하고 특히 유도 이전보다 수초 형성에서 중요한 역할을 하는 SCIP, PLP, Krox-20, 및 L1 마커를 많이 발현하는 것을 확인할 수 있다.

위 세포면역학적 및 PCR 분석결과는 유도 분화 후 슈완세포 특성을 가진 세포들로 분화 되였음을 설명한다. 이런 슈완세포/회소돌기아교세포 특성을 지닌 세 포는 중추 및 말초 신경 손상 이식치료에서 수초형성(myelination)을 나타내는 성숙된 희소돌기아교세포 또는 슈완세포로 분화에 더욱 용이하여 더욱 좋은 치료효과를 기대할 수 있다.

실시예 3: 척수 손상 래트의 세포 이식 실험

1. 척수 손상 과정 및 세포 이식

체중 250-300g의 성숙 암컷 Sprague-Dawley rat(N=20)을 ketamin(80mg/kg)와 Rompun(7.4mg/kg)을 피하주사 하여 마취하였다. 척수의 T9-T11 부분을 노출시켰다. 손상시킬 부분을 깨끗이 한 후 클립(20-30g)으로 1분간 척수 양쪽을 집었다. 6-0 suture를 이용하여 근육과 피부를 봉합하였다. 수술 후 따뜻한 패드 위에 두고 마취에서 깨어나면 우리로 옮겼다. 스스로 소변을 볼 수 있을 때까지 하루에 두 번씩 소변을 보게 하였다. 일주일 동안 2일마다 세파졸린을 주사하였다.

실험 3시간 전에 본 발명에 따라 슈완세포로 전환분화된 세포의 5계대 세포를 배양 플라스크에서 떼어내어 10% FBS 포함된 배지로 2번 세척했다. 이 세포의 막을 형광염료인 PKH26(sigma)로 레이블링하였다. 염색된 세포를 세척하고, 1500rpm/min로 5분간 원심분리하였다. 이 과정을 2번 더 반복하였다. PBS에 1x10⁵/ul 밀도로 이식 전까지 얼음에 보관하였다. 이 세포의 viability는 레이블링 후 트립토판 블루로 95% 이상임을 확인하였다.

실험군은 손상 부위 중앙에 레이블링된 세포를 29-게이지 바늘을 부착한 10ul Hamilton 주사기로 5분 동안 1.3mm 깊이에 1ul/min의 속도로 미세주사하였다. 주사 바늘은 주사 후 천천히 제거하였다. 6-0 suture로 근육과 스킨을 봉합하였다. 대조군은 세포 대신 같은 양의 PBS를 같은 방법으로 주사하였다. 수술 후 바닥을 따뜻하게 해 주고 마취에서 깨어나면 우리로 옮겼다. 스스로 소변을 볼 수 있을 때까지 하루에 두 번씩 소변을 보게 하였다. 일주일 동안 2일마다 세파졸린을 주사하였다. 수술 후 같은 세포를 다시 플레이팅하여 하루가 지난 후 (overnight 후) viability를 관찰하였다. 모든 래트는 이식 3일전부터 실험이 끝날 때까지 1mg/100g씩 사이클로스포린을 주사하였다.

2. 면역학 및 면역조직화학적 분석을 통한 세포 이식의 효과 확인

2-(1). 조직 샘플의 제조

ketamin(80mg/kg)과 Rompun(7.4mg/kg)을 주사하여 래트를 마취시키고, 개복한 뒤 심장 우심방을 열고 좌심실에 헤파린 1u/ml을 포함한 PBS 200ml을 perfusion(관류)하였다. 곧바로 차갑게 한 4% 파라포름알데하이드(0.1M PBS) 300ml를 관류하였다. 척수를 분리하여 4% 파라포름알데하이드(0.1M PBS)에 담아 4℃에 24시간 동안 두었다. 3일 후 이 샘플을 30% 수크로스(sucrose)에 담궜다. 손상된 부위는 OCT compound(Tissue Tek, Sakura)로 블로킹하여 사용할 때까지 -80℃에 보관하였다.

2-(2). 면역학 및 면역조직화학적 분석 방법

상기 샘플을 crystal section 방법에 의해 20um 두께로 절단하여 Superfrost Plus Slide(VWR international, USA)에 표본제작하였다. 실온에서 완벽히 말린 후 0.3% Triton X-100(sigma, St. Louis, Mo, USA)(0.01M PBS)에 1시간 동안 두었다. 2% H₂O₂(0.01M PBS)에 30분 둔 후 0.01M PBS로 세척한 후, 10% 염소-혈청으로 특이적 반응을 블로킹하였다. 그 후 4℃에서 밤새 일차 항체: 래빗 항-세로토닌(5HT)(1:500, Chemicon), 래빗 항-GABA(1:500, Chemicon), 래빗 항-CGRP(1:1000, Chemicon)를 처리하였다.

3시간 동안 비오틴화된 항체를 처리하고, 1시간 30분 동안 아비딘-비오틴 퍼옥시다제 복합체(avidin-biotin peroxidase complex)(ABC Kit; vector laboratory Burlingame, CA, USA)를 처리하였다. 마지막으로 DAB 퍼옥시다제 기질 키트(DAB peroxidase substrate kit)(ABC Kit; vector laboratory, Burlingame, CA, USA)를 사용하였다.

면역형광 분석을 위해 절편을 0.3% Triton-100(0.01M PBS)에 1시간 두었다. 0.01% PBS로 3번 세척한 후 상온에서 1시간 10% 정상 염소 혈청이나 10% 말 혈청으로 블로킹한다. 이 절편에 4℃에서 밤새 일차 항체: 마우스 항-GFAP (1:200, chemicon), 마우스 항-CSPG (1:200, chemicon), 마우스 항-P75(1:500, chemicon), 마우스 항-뉴로필라멘트 200KD (1:200), 마우스 항-튜불린-III 베타1 (1:300, chemichon), 염소 항-MBP (1:50, santacruz), 염소 항-P0 (1:50, santacruz), 염소 항-OMG(oligodendrocyte myelin glycoprotein) (1:50, santacruz), 래빗 항-파이브로넥틴 (1:80, chemicon), 마우스 항-ED1 (1:100, serotec)를 처리했다.

다음날 0.01M PBS로 3번 세척하고 상온에서 1시간 동안 FITC 또는 AMCA가 컨쥬게이트 되어 있는 2차 항체(1:200 goat anti mouse, chemicon or 1:100 goat anti rabbit, vector)를 처리한다. 0.01M PBS로 3번 세척한 후 핵 염색을 위한 DAPI를 포함한 Vectashield (vector, Burlingame, CA)로 표본을 제작했다.

이 절편을 형광 현미경(Leica CTR 4000)으로 관찰하고 디지털 이미지는 zeiss LSM 510 META 공초점 현미경으로 얻었다.

2-(3). 면역학 및 면역조직화학적 분석 결과

도 23은 실험군에서 척수 손상 중심 부위의 5HT, GABA 및 CGRP에 대한 면역형광 사진을 보여준다. 즉, 척수 손상 중심 부위에 많은 수의 세로토닌 신경, GABA-ergic 뉴론 및 감각 신경이 새로 생겼음을 알 수 있다.

도 24는 척수 손상 부위의 GFAP 및 CSPG에 대한 면역형광 사진을 보여준다. 우측 사진은 좌측 사진 중의 흰 상자를 확대한 사진이다. GFAP는 미성숙 슈완 세포 또는 성상세포에 대한 마커이고, CSPG는 신경재생 저해자의 마커이다. 대조군은 큰 구멍이 형성되어 있는 반면, 실험군의 세포들은 손상 부위에 균일하게 잘 분포되어 있는 것을 볼 수 있다. GFAP와 CSPG는 두 그룹에서 모두 발현하였지만 대조군에서는 새로 형성된 조직의 가장자리에서 대부분 강하게 발현되었고, 실험군에서는 새로 형성된 조직 내에 골고루 발현되었다.

도 25 내지 도 27의 면역형광 사진에서 녹색은 기존의 세포를, 붉은 색은 상기 실시예 3의 1-(1)에서 PKH26으로 레이블링되어 척수 손상 부위에 주입된 슈완세포로 전환분화된 세포의 5계대 세포를 나타낸다.

도 25는 실험군에서의 P75 및 뉴로필라멘트 200KD에 대한 면역형광 사진을 보여준다. P75는 슈완세포에 대한 마커이고, 뉴로필라멘트 200KD는 뉴런 액손의 마커이다. 도 26의 A는 뚜렷한 P75 양성 항원이 척수 손상 중심 영역의 전역에 분포되어 있는 모습을 보여주며, B는 DAPI 세포핵 염색 사진을 보여주고 있다. C는 대부분의 영역들이 붉은 색을 나타내는 세포로 채워져 있는 모습을 보여준다. D는 손상된 영역 내에 분포되어 있는 다량의 뉴로필라멘트 200KD를 보여준다. E는 세포 가장자리에 PKH26 레이블링에 의해 붉은 색을 띄는 화이버(fiber)를 보여준다. F는 D와 E를 합성한 사진이며, G, H, J 는 각각 D, E, F의 흰 상자 영역을 확대한 사진이다. J를 살펴보면, PKH26 레이블링에 의해 붉은 색을 띄는 화이버가 뉴로필라멘트 200KD 양성 액손을 측면에서 둘러 싸고 있다.

도 26은 실험 군에서의 MBP 및 P0에 대한 면역 형광 사진을 보여준다. MBP는 중추신경계(CNS)와 말초신경계(PNS) 수초화의 주요 성분 마커이며, P0는 PNS 수초화의 주요 성분 마커이다. 도 26로부터 알 수 있는 바와 같이, 실험 군에서 다량의 MBP 및 P0 항원 양성 반응이 관찰되었다. 이들 수초화 단백질은 관 모양으로 화이버를 감싸고 있고, 이들의 두께와 분포는 붉은 색을 띄는 fiber와 일치하는 것을 알 수 있다(F, Q). 일부 화이버는 랑비에르 결절 구조(node of ranvier structure)를 보인다(arrow, E). C는 A와 B를 합성한 사진이며, D, E, F는 각각 A, B, C의 흰 상자 영역을 확대한 사진이다. 또한, J는 G와 H를 합성한 사진이며, K, L, Q는 각각 G, H, J의 흰 상자 영역을 확대한 사진이다.

도 27은 실험 군에서의 척수 손상 중심 부위에서의 OMG에 대한 면역 형광 사진을 보여준다. OMG는 뉴런 및 올리고덴드로사이트의 마커이다. 손상 부위 가장자리에 다량의 OMG가 발현하고 있고(A 및 D), 붉은 색의 fiber 표면과 연결되어 있다 (화살표, F). C는 A와 B를 합성한 사진이고, D, E, F는 각각 A, B, C의 흰 상자 영역을 확대한 사진이다.

도 28는 척수 손상 중심 부위에서의 파이브로넥틴과 뉴로필라멘트 200 KD의 면역 형광 이중 염색 사진이다. 파이브로넥틴은 섬유아세포의 마커이고, 뉴로필라멘트 200 KD는 뉴런 액손의 마커이다. 도 28로부터 손상 중심 부위에 뉴런 액손(청색)이 대량적으로 존재하고 새로 형성된 조직 가장자리 주위에 파이브로넥틴이 많이 발현되고, 많은 수의 액손이 정상 척수와 연결되어 있음을 알 수 있다(화살표). 오른쪽의 사진은 왼쪽의 흰 상자 부분을 확대한 사진이다.

본 발명을 통해 피하조직세포를 신경전구세포로 유도할 수 있음이 밝혀졌다. 피하조직을 신경전구세포의 공여원으로 이용하는 경우, 중추신경계의 신경줄기세포나 배아줄기세포에 비해 접근성이 뛰어나며, 임상적 적용을 위한 충분한 공여 지역을 제공할 뿐만 아니라, 진피 세포를 이용하는 경우에 비해 보다 규모 있는 공여원이 될 수 있으며 또한 땀샘, 모낭 또는 피지선 등의 피부 부속기관의 혼합 가능성이 없고, 공여 후 공여자에게 흉터를 최소화시킬 수 있다는 점에서 큰 장점을 갖는 다. 따라서, 피하조직으로부터 유도된 신경전구세포, 상기 신경전구세포를 분화시킨 신경세포 또는 상기 신경전구세포를 분화시킨 희소돌기아교세포 또는 슈완 세포를 포함하는 세포 치료제는 중추 또는 말초 신경계 손상의 치료를 위해 매우 유용하다.

Claims

피하조직으로부터 유도된 신경전구세포를 유효성분으로 포함하는 중추 또는 말초 신경계 손상 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 피하조직으로부터 유도된 신경전구세포가 뉴로스피어를 형성하고 네스틴 및/또는 SOX10을 발현하는 세포인 조성물.
제2항에 있어서, 상기 신경전구세포가 피하조직세포를 N2 서플먼트, bFGF 및 EGF를 포함하는 배양액에서 배양하여 형성된 스피어로부터 얻은 세포인 조성물.
피하조직으로부터 유도된 신경전구세포를 분화시킨 신경세포를 유효성분으로 포함하는 중추 또는 말초 신경계 손상 치료용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 신경세포가 피하조직으로부터 유도된 신경전구세포를 NT3를 포함하는 뉴로버살 미디움에서 분화시킨 세포인 조성물.
피하조직으로부터 유도된 신경전구세포를 분화시킨 희소돌기아교세포 또는 슈완 세포를 유효성분으로 포함하는 중추 또는 말초 신경계 손상 치료용 조성물.
제6항에 있어서, 희소돌기아교세포 또는 슈완 세포가 피하조직으로부터 유도된 신경전구세포를 레티노산을 포함하는 배양액에서 배양한 후, 혈청, 포스콜린, bFGF, PDGF 및 헤레글린을 포함하는 배양액에서 분화시킨 세포인 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 중추 또는 말초 신경계 손상이 파킨슨병, 뇌졸중, 근위축성 척수측색경화증, 척수 손상, 운동신경손상 또는 외상에 의한 말초신경손상인 조성물.
피하조직세포를 N2 서플먼트, bFGF 및 EGF를 포함하는 배양액에서 배양함을 포함하는 피하조직세포로부터 신경전구세포를 제조하는 방법.
제9항에 따라 얻은 피하조직세포 유래의 신경전구세포를 NT3를 포함하는 뉴로버살 미디움에서 신경세포로 분화시키는 방법.
제9항에 따라 얻은 피하조직세포 유래의 신경전구세포를 레티노산을 포함하는 배양액에서 배양한 후, 혈청, 포스콜린, bFGF, PDGF 및 헤레글린을 포함하는 배양액에서 희소돌기아교세포 또는 슈완 세포로 분화시키는 방법.