KR20220060384A

KR20220060384A - 인간 전분화능 줄기세포 유래 신경전구세포를 유효성분으로 포함하는 혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR20220060384A
Application number: KR1020200146323A
Authority: KR
Inventors: 박동혁; 강호영; 장진혁; 김수빈; 한충성
Original assignee: (주) 넥셀; 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2020-11-04
Filing date: 2020-11-04
Publication date: 2022-05-11
Also published as: KR102477030B1

Abstract

본 발명은 인간 전분화능 줄기세포(hPSC, human Pluripotent Stem Cell)를 분화 유도용 배지에서 배양하여 분화 유도시켜 마련되는 신경전구세포(Neural Progenitor cell)를 유효성분으로 포함하는 혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물로서, 정맥 내 투여를 통한 이식용으로 제형화되어 인지기능의 장애를 회복하고 신경 염증 반응의 감소 및 신경 섬유 다발의 회복이 이루어질 수 있도록 한다.

Description

인간 전분화능 줄기세포 유래 신경전구세포를 유효성분으로 포함하는 혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물 {PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR VASCULAR DEMENTIA TREATMENT OR PREVENTION CONTAINING NEURAL PROGENITOR CELL FROM HUMAN PLURIPOTENT STEM CELL AS AN EFFECTIVE INGREDIENT}

본 발명은 인간 전분화능 줄기세포 유래 신경전구세포를 유효성분으로 포함하는 혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

치매의 가장 흔한 원인으로 가장 많은 치매 환자가 알츠하이머병(Alzheimer's disease)을 앓고 있으며, 알츠하이머병 다음으로 흔한 치매 유형으로 혈관성 치매가 있다.

국내 노령의 치매 사례에서 25%가 혈관성 치매일 것으로 추정될 정도인데, 이러한 혈관성 치매의 원인은 뇌로 가는 혈관이 좁아지거나 막힘에 따라 뇌 혈류량이 감소하게 되어 인지 기능의 장애 및 일상 생활 수행 능력의 저하로 이어지게 되는 형태를 띠고 있다.

따라서 뇌경색 또는 뇌출혈과 같은 일련의 뇌혈관 질환의 발생과 뇌의 소혈관이 좁아져 뇌 조직의 허혈성 손상이 발생하게 되면 혈관성 치매가 나타날 수 있다.

이러한 혈관성 치매의 치료제 개발을 위해 국내, 외 수많은 실험과 연구들이 이루어지고 있으며, 현재까지는 확실히 치료 효과가 입증된 직접적인 치료제는 개발되지 않았지만, 국내에서는 크게 아세틸콜린 분해소소 억제제와 NMDA(N-Methyl-D-aspartate) 수용체 억제제가 혈관성 치매의 치료용 약제로서 사용되고 있다.

다만, 이러한 혈관성 치매의 치료용 약제로 제시된 성분들은 근본적인 질병 조절 치료보다는 일시적인 증상 완화를 목적으로 하고 있다 보니, 치료 효과를 충분히 제공함에 분명한 한계를 가지고 있다.

결과적으로 현재는 혈관성 치매의 치료를 위해서 원인이 되는 혈관성 장애를 관리하거나, 이와 관련한 위험 인자들을 조절하는 치료방식에 그치고 있다.

또한, 혈관성 치매의 예방 혹은 치료와 관련하여 마련된 종래기술에 대한 선행문헌에는 대한민국 등록특허공보 제10-1523841호의 "Nadph 산화효소 1의 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈관성 치매의 치료 또는 예방용 조성물"(이하, '종래기술1'이라고 함) 및 일본 공개특허공보 JP 2000-229854호의 "허혈성 신경세포사 치료ㅇ예방용 뇌실내 투여제, 혈관성 치매증 치료ㅇ예방용 뇌실내 투여제, 및 뇌내 수술시 투여제"(이하, '종래기술2'이라고 함)가 있다.

하지만, 종래기술1과 같이 특정하게 재조합 혹은 수득된 DNA, RNA 또는 단백질 등과 같은 성분을 이용하거나 종래기술2와 같이 천연의 생물로부터 얻어지는 특정 성분을 이용하여 혈관성 치매의 예방 혹은 치료에 이용할 경우, 혈관성 치매의 예방 혹은 치료의 효과 수준이 여전이 유의하지 못하여 적극적으로 유용하게 이용됨에 한계가 있는 문제점이 있었다.

본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위해 창작된 것으로써, 본 발명의 목적은 인간 전분화능 줄기세포(hPSC, human Pluripotent Stem Cell)로부터 유래된 특정 세포를 유효성분으로 이용해 혈관성 치매의 예방 혹은 치료의 효과가 유의하게 충분히 나타날 수 있는 혈관성 치매의 예방 혹은 치료용 약학 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따른 혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물은, 인간 전분화능 줄기세포(hPSC, human Pluripotent Stem Cell)를 분화 유도용 배지에서 배양하여 분화 유도시켜 마련되는 신경전구세포(Neural Progenitor cell)를 유효성분으로 포함한다.

여기서, 혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물은 정맥 내 투여를 통한 이식용으로 제형화될 수 있다.

또한, 상기 혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물은 예방 또는 치료 대상 뇌의 대뇌피질(Cortex) 및 해마(Hippocampus) 내 미세아교세포(Microglia)의 활성으로 인한 신경염증이 줄어들게 한다.

또한, 상기 혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물은 예방 또는 치료 대상 뇌의 뇌량(Corpus callosum) 및 해마(Hippocampus) 내 신경교섬유질산성단백질(GFAP, Glial fibrillary acidic protein)의 표지인자에 양성을 띠는 성상세포(Astrocyte)의 수를 감소시킬 수 있다.

아울러, 상기 혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물은 예방 또는 치료 대상 뇌의 뇌량(Corpus callosum)을 지나가는 신경섬유다발의 병변이 회복시킬 수 있다.

그리고 상기 신경전구세포는 인간 전분화능 줄기세포를 N2 및 B27이 포함된 신경외배엽 분화 유도용 배지에서 6일 동안 배양하여 신경외배엽 세포(Neuroectoderm)로 분화 유도시킨 뒤, 분화 유도된 신경외배엽 세포를 신경전구세포 분화 유도용 배지에서 7일 동안 배양하여 신경전구세포(Neural Progenitor cell)로 분화 유도시키는 과정을 통해 마련된다.

여기서, 상기 신경외배엽 분화 유도용 배지는 N2 및 B27이 포함된 DMEM/F12 배지에 BMP 신호전달체계의 억제제 150nM 내지 250nM, TGFβ 신호전달체계의 억제제 5ㅅM 내지 15ㅅM 및 인슐린 유사 성장인자 수용체(IGF1R)의 억제제 500nM 내지 1000nM가 추가 처리된 상태로 마련되며, 상기 신경외배엽 분화 유도용 배지는 DMEM/F12 배양액 50ml를 기준으로 N2를 0.4ml 내지 0.6ml의 부피로 포함하고, B27를 0.5ml 내지 1.5ml의 부피로 포함한다.

또한, 상기 신경전구세포 분화 유도용 배지는 DMEM/F12 배양액 25ml와 Neurobasal 배양액 25ml로 혼합된 배양액을 기준으로 N2를 0.4ml 내지 0.6ml의 부피로 포함하고, B27을 0.5ml 내지 1.5ml의 부피로 포함하는 상태로 마련된다.

본 발명에 의하면 다음과 같은 효과가 있다.

첫째, 인간 전분화능 줄기세포(hPSC, human Pluripotent Stem Cell)를 분화 유도용 배지에서 배양하여 분화 유도시켜 마련되는 신경전구세포(Neural Progenitor cell)를 유효성분으로 포함하는 혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물을 이용해 혈관성 치매 예방 또는 치료에 유의한 효과를 충분히 제공할 수 있다.

둘째, 본 발명의 혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물을 정맥 투여하는 방식으로 이식함으로서, 혈관성 치매로 인한 인지기능의 장애를 회복할 수 있다.

셋째, 본 발명의 혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물을 정맥 투여하는 방식으로 이식함으로서, 신경 염증 반응의 감소 및 신경 섬유 다발의 회복이 이루어질 수 있다.

도1은 본 발명의 혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물을 이용한 효과 검증을 위해 설개된 동물모델 제작 및 실험진행 방식에 대한 모식도이다.
도2는 본 발명의 혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물을 적용 여부에 따른 Y자형 미로 실험의 결과를 도시한 그래프이다.
도3은 본 발명의 혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물을 적용 여부에 따른 수동 회피반응 실험 및 물체 인지검사의 결과를 도시한 그래프이다.
도4는 본 발명의 혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물을 적용 여부에 따른 뇌 조직 분석을 수행하기 위해 'Iba1'을 일차항체로 면연 반응시킨 결과를 도시한 형광현미경 관찰 사진 및 그래프이다.
도5는 본 발명의 혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물을 적용 여부에 따른 뇌 조직 분석을 수행하기 위해 'GFAP'를 일차항체로 면연 반응시킨 결과를 도시한 형광현미경 관찰 사진 및 그래프이다.
도6은 본 발명의 혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물을 적용 여부에 따른 뇌 조직 분석을 수행하기 위해 'MBP'를 일차항체로 면연 반응시킨 결과를 도시한 형광현미경 관찰 사진 및 그래프이다.

본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 첨부된 도면을 참조하여 더 구체적으로 설명하되, 이미 주지된 기술적 부분에 대해서는 설명의 간결함을 위해 생략하거나 압축하기로 한다.

1. 혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 설명

본 발명에 따른 혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물은 인간 전분화능 줄기세포(hPSC, human Pluripotent Stem Cell)를 분화 유도용 배지에서 배양하여 분화 유도시켜 마련되는 신경전구세포(Neural Progenitor cell)를 유효성분으로 포함한다.

여기서, 혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물의 유효성분으로 포함되는 신경전구세포(Neural Progenitor cell)이 인간 전분화능 줄기세포(hPSC, human Pluripotent Stem Cell)로부터 어떠한 과정을 통해 분화가 이루어지는 지에 대해 이하에서 상세하게 설명한다.

(1) 신경외배엽 세포 분화 유도단계

본 단계에서는 인간 전분화능 줄기세포(hPSC, human Pluripotent Stem Cell)를 N2 및 B27이 포함된 신경외배엽 분화 유도용 배지에서 배양하여 신경외배엽 세포(Neuroectoderm)로 분화 유도시키는 과정이 이루어진다.

여기서, 신경외배엽 세포 분화 단계(S100)는 신경외배엽세포로의 분화 유도를 위해 인간 전분화능 줄기세포(hPSC)가 배양되는 신경외배엽 유도용 배지에 BMP 신호전달체계의 억제제(LDN193189), TGFβ 신호전달체계의 억제제(SB431542) 및 인슐린 유사 성장인자 수용체(IGF1R)의 억제제(GSK1838705A)를 추가 처리하는 것을 가장 큰 특징으로 삼고 있다.

더욱 구체적으로, 신경외배엽 세포 분화 단계(S100)는 N2(Thermo Fisher사 제품) 및 B27(Thermo Fisher사 제품)이 포함된 DMEM/F12 배지(Hyclone사 제품)에 BMP 신호전달체계의 억제제 150nM 내지 250nM, TGFβ 신호전달체계의 억제제 5ㅅM 내지 15ㅅM 및 인슐린 유사 성장인자 수용체(IGF1R)의 억제제 500nM 내지 1000nM가 추가 처리된 신경외배엽 분화 유도용 배지에서 인간 전분화능 줄기세포를 6일 동안 배양하여 신경외배엽 세포로 분화 유도시킨다.

아울러, N2 및 B27이 포함된 DMEM/F12 배지(Hyclone사 제품)에 해당하는 신경외배엽 분화 유도용 배지는 DMEM/F12 배양액 50ml를 기준으로 N2를 0.4ml 내지 0.6ml의 부피로 포함하고, B27를 0.5ml 내지 1.5ml의 부피로 포함이 바람직하다.

결과적으로, 신경외배엽 분화 유도용 배지는 DMEM/F12 배양액 50ml를 기준으로 N2를 0.4ml 내지 0.6ml의 부피로 포함하고, B27를 0.5ml 내지 1.5ml의 부피로 포함된 상태에, BMP 신호전달체계의 억제제 150nM 내지 250nM, TGFβ 신호전달체계의 억제제 5ㅅM 내지 15ㅅM 및 인슐린 유사 성장인자 수용체(IGF1R)의 억제제 500nM 내지 1000nM이 추가 처리된 후, 인간 전분화능 줄기세포(hPSC)가 배양될 경우 6일만에 신경외배엽 세포로 분화 유도가 진행된다.

가장 바람직하게는 신경외배엽 분화 유도용 배지가 DMEM/F12 배양액 50ml를 기준으로 N2를 0.5ml의 부피로 포함하고, B27를 1.0ml의 부피로 포함된 상태에, BMP 신호전달체계의 억제제 200nM, TGFβ 신호전달체계의 억제제 10ㅅM 및 인슐린 유사 성장인자 수용체(IGF1R)의 억제제 500nM이 추가 처리되어 마련된다.

또한, DMEM/F12 배지(Hyclone사 제품) 내 신경외배엽 세포 분화 유도를 위한 배양은 CO₂ 5%의 호흡환경, 37℃의 온도환경 내에서 진행될 수 있으나, 이에 한정되지는 아니한다.

이와 관련해, 신경외배엽 세포의 분화를 위해 마련되는 DMEM/F12 배지(Hyclone사 제품)에 첨가되는 인슐린 유사 성장인자 수용체(IGF1R)의 억제제(GSK1838705A)는 500nM 내지 1000nM의 농도 조건을 갖춤이 바람직한데, 이는 인슐린 유사 성장인자 수용체(IGF1R)의 억제제(GSK1838705A)가 500nM 미만의 농도를 갖출 경우 신경외배엽 세포로의 분화 유도에 의해 발현되어야 하는 특정 유전자의 발현 수준이 현저히 낮게 측정되며 신경외배엽 세포로의 분화 유도에 더욱 많은 기간이 소요되어 종래와 큰 차이를 보이지 못하며, 인슐린 유사 성장인자 수용체(IGF1R)의 억제제(GSK1838705A)가 1000nM을 초과한 농도를 갖출 경우 분화 유도과정에서 세포가 생존하지 못하거나, 추후 진행될 신경전구세포로의 분화 유도 과정에 기능상 부정적 영향을 끼치는 문제점이 발생하기 때문이다.

구체적으로, 인슐린 유사 성장인자 수용체(IGF1R)의 억제제(GSK1838705A)의 추가 처리는 신경외배엽 분화 유도 기간의 단축에 가장 중요한 역할로 작용하게 되는데, 인간 전분화능 세포가 다양한 세포로의 분화능력과 함께 지니고 있는 높은 수준의 자가재생능력(Self-Renewal)을 인슐린 유사 성장인자 수용체(IGF1R)의 억제제(GSK1838705A)가 효과적으로 억제하기 때문이다.

(2) 신경전구세포 분화 유도단계

본 단계에서는 신경외배엽 세포 분화 단계를 통해 분화 유도된 신경외배엽 세포를 신경전구세포 분화 유도용 배지에서 배양하여 신경전구세포(Neural Progenitor cell)로 분화 유도시키는 과정이 이루어진다.

여기서, 신경전구세포 분화 유도단계(S200)는 DMEM/F12 배양액(Hyclone사 제품) 25ml와 Neurobasal 배양액(Thermo Fisher사 제품) 25ml로 혼합된 배양액을 기준으로 N2(Thermo Fisher사 제품)를 0.4ml 내지 0.6ml의 부피로 포함하고, B27(Thermo Fisher사 제품)을 0.5ml 내지 1.5ml의 부피로 포함하는 신경전구세포 분화 유도용 배지에서 신경외배엽 세포 분화 단계(S100)를 통해 분화 유도된 신경외배엽 세포를 7일 동안 배양하여 신경전구세포로 분화 유도시킨다.

또한, 신경전구세포 분화 유도용 배지 내 신경전구세포 분화 유도를 위한 배양은 CO₂ 5%의 호흡환경, 37℃의 온도환경 내에서 진행될 수 있으나, 이에 한정되지는 아니한다.

가장 바람직하게는 신경전구세포 분화 유도용 배지가 DMEM/F12 배양액 25ml와 Neurobasal 배양액 25ml를 기준으로 N2를 0.5ml의 부피로 포함하고, B27를 1.0ml의 부피로 포함된 상태로 마련된다.

이와 같은 일련의 분화 과정을 거쳐 마련되는 인간 전분화능 줄기세포(hPSC, human Pluripotent Stem Cell) 유래 신경전구세포(Neural Progenitor cell)는 본 발명에 따른 혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물의 유효성분으로서 아래 설명될 적용 대상의 인지기능 장애를 회복시키고, 심경 염증 반응을 감소시키며, 신경 섬유다발의 손상을 회복시키는 효과를 제공하게 된다.

2. 혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물의 효과 검증 시험 결과에 관한 설명

본 발명의 혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물과 관련하여 해당 약학 조성물에 기인한 혈관성 치매 예방 또는 치료의 효과 수준을 각종 시험을 통해 확인하였으며, 해당 시험은 당업계의 기술자들에게 자명한 수단에 의한 성질 등을 정의하기 위한 목적으로 하기 실험 방법들을 이용하였다.

참고로, 아래 설명될 실험의 결과는 평균ㅁ표준오차(meansㅁSEM)로 나타내었다. 통계학적인 유의성은 일원분산분석(One-way ANOVA)를 사용하였으며, 사후 검정으로는 Scheffe의 방법을 수행하였다.

(1) 혈관성 치매 동물모델의 제작 및 실험설계

우선, 혈관성 치매 동물모델인 생쥐는 C57BL/6 생쥐를 실험에 사용하였다.

구체적으로, 도1에 도시된 바와 같이 12주령의 C57BL/6 생쥐를 2% isoflurane을 기계 환기해 마취시킨 뒤, 생쥐의 목 부위 정중선을 따라 2 cm 정도 절개하고 미주신경이 손상되지 않도록 조심하면서 왼쪽 총경동맥을 노출시킨 후 5-0 검은 봉합사를 이용하여 들어 올려 진 상태에서 마이크로 코일(내경 0.18mm)을 장착하고, 오른쪽 역시 마찬가지로 진행하고 피부를 봉합하여 양쪽을 마무리하였다.

그 후, 실험군은 마이크로 코일을 장착한 후 24시간이 경과한 시점에서 투여한 물질에 따라 Sham(n=4), PBS 주입군(n=5) 및 신경전구세포 주입군 (n=6, 1x10⁶)으로 구분하였다.

여기서, 실험군에 투여되는 모든 물질은 동물의 꼬리 정맥을 통해 주입되었다.

즉, 3개월령의 C57BL/6 생쥐를 기준으로 우선 수술을 받지 않은 Sham 군의 생쥐를 대조군으로 이용하였으며, 양측 총경동맥 협착술(BCAS)을 수행 후 24시간째에 VEH (PBS)과 신경전구세포 (NPC, 1x10⁶)를 각각 1회씩 동물의 꼬리 정맥으로 주입한 생쥐를 각각 PBS 주입군 및 신경전구세포 주입군으로 이용하였다.

각 실험군은 물질을 주입한 후 3개월이 경과된 시점에서 행동분석 실험을 진행하였고, 이와같은 행동분석을 마친 동물들은 뇌를 적축하여 조직 검사를 진행하였다.

무엇보다, 신경전구세포 주입군 (n=6, 1x10⁶)의 마련을 위해 정맥 투여 형태로 이식되는 신경전구세포는 앞 서 설명한 방법에 따라 인간 전분화능 줄기세포로부터 유래된 신경전구세포를 적용하였다.

(2) 혈관성 치매 동물모델의 행동 분석-Y자형 미로 실험

본 발명의 인간 전분화능 줄기세포로부터 유래된 신경전구세포를 유효성분으로 포함하는 혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물의 효과를 확인하기 위하여, 혈관성 치매 생쥐의 기억능력을 평가하는 Y자형 미로실험(Y-maze test)을 수행하였다.

구체적으로, Y 자형 미로 장치는 세 갈래의 가지가 120ㅀ로 동일하게 배치된 백색의 아크릴판 (35cmㅧ6cmㅧ15cm)으로 구성되어 있으며, 각 가지를 A, B, C로 정한 후 한 쪽 가지에 실험동물을 조심스럽게 놓고 8분간 자유롭게 탐색하도록 하고 그 움직임을 비디오 카메라로 녹화하였다.

또한, 네 발이 모두 한 쪽 가지에 완전히 들어가야 1회 출입으로 인정하고, 세 개의 서로 다른 가지에 차례로 진입한 경우를 실제 변경(actual alternation)으로 규정하였다.

즉, ABC, ACB, BAC, BCA, CAB, CBA를 각각 1점으로 인정한다. 자발적 변경율(spontaneous alteration)은 다음의 수식으로 계산하였으며, 높은 자발적 변경율은 기억 능력이 향상된 것으로 간주할 수 있다.

- 자발적 변경율 계산식 : Alternation (%)= 실제 변경/(총 변경-2)ㅧ100

이에 따른 앞 설명한 도1의 모식도에 따른 인간 전분화능 줄기세포로부터 유래된 신경전구세포의 투여가 이루어진 혈관성 치매 동물모델인 C57BL/6 생쥐(NPC), 생리식염수(PBS)의 투여가 이루어진 혈관성 치매 동물모델인 C57BL/6 생쥐(VEH) 및 정상의 대조군(Sham) 생쥐 각각의 Y자형 미로실험(Y-maze test) 결과는 도2(도면참고-도2 : p=0.074 / 도2B : *P<0.05, **P<0.01)에 도시된 바와 같이 만성대뇌저혈류 유도 후 3개월째에 각 실험군의 자발적인 행동 변경력 분석 결과를 보여주고 있다.

도2A를 살펴보면, VEH 실험군은 수술을 받지 않은 대조군(Sham)에 비해 Y자형 미로 검사에서 낮은 행동 변경력을 보이며 인지기능의 저하가 나타나는 것을 확인할 수 있는 반면, NPC 실험군은 수술을 받지 않은 대조군(Sham)과 비슷한 수준의 인지기능을 보이도록 인지기능 장애의 회복이 이루어지고 있음을 확인할 수 있다.

이에 부가적으로, 수술을 받지 않은 대조군(Sham)을 비롯해 모든 실험군에서 기존적인 동물의 운동능력에는 도2B와 같이 차이가 거의 없었다.

(3) 혈관성 치매 동물모델의 행동 분석-수동 회피반응 실험

본 발명의 인간 전분화능 줄기세포로부터 유래된 신경전구세포를 유효성분으로 포함하는 혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물의 효과를 확인하기 위하여, 앞 서 설명한 Y 자형 미로 실험을 수행한 동물모델들을 대상으로 혐오자극에 대한 기억력을 평가하는 수동 회피반응 실험(Passive avoidance test)을 하였다.

구체적으로, 수동 회피반응 실험은 바닥에 전기충격장치가 있는 두 개의 공간으로 구성된 상자 (avoidance system; sitechkorea)를 이용하였으며, 두 개의 공간 사이에는 길로틴 도어(guillotine door)가 장착되어 있어 두 공간의 왕래가 가능하다. 훈련 시도일에 동물을 한 공간 (A chamber)에 넣고, 15초간 탐색하게 한다.

이 후, 15초가 경과된 시점에서 생쥐가 있는 공간에 불이 켜지고, 길로틴 도어가 열리면, 반대편 어두운 공간( B chamber)으로 생쥐가 이동하게 된다. 동물의 네 발이 모두 어두운 공간으로 진입하면 길로틴 도어가 닫히면서 전기 충격(0.3mA, 3초)이 주어진다.

훈련 시도 후 24시간째에 기억유지검사(retention test)를 시행하였으며, 훈련시도에서와 같이 동물모델이 된 생쥐들을 한 공간에 넣어, 불을 켜고 길로틴 도어를 열어 반대쪽의 어두운 상자로 이동하는데 걸리는 시간(response latency)을 기록하였다.

이에 따른 앞 설명한 도1의 모식도에 따른 인간 전분화능 줄기세포로부터 유래된 신경전구세포의 투여가 이루어진 혈관성 치매 동물모델인 C57BL/6 생쥐(NPC), 생리식염수(PBS)의 투여가 이루어진 혈관성 치매 동물모델인 C57BL/6 생쥐(VEH) 및 정상의 대조군(Sham) 생쥐 각각의 수동 회피반응 실험 결과는 도3A(도면참고- *P<0.05, **P<0.01)에 도시된 바와 같다.

도3A을 살펴보면, VEH 실험군은 훈련 시 주어진 전기 자극을 기억하지 못하는 반면, NPC 실험군은 수술을 받지 않은 대조군(Sham)의 기억력 수준과 비슷한 정도까지 회복이 이루어짐을 확인할 수 있다.

(4) 혈관성 치매 동물모델의 행동 분석-새로운 물체 인지 검사

본 발명의 인간 전분화능 줄기세포로부터 유래된 신경전구세포를 유효성분으로 포함하는 혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물의 효과를 확인하기 위하여, 앞 서 설명한 수동 회피반응 실험(Passive avoidance test)을 수행한 동물모델들을 대상으로 단기 작업 기억능력을 평가하는 새로운 물체 인지(Novel object recognition)검사를 수행 하였다.

구체적으로, 새로운 물체 인지(Novel object recognition)검사는 검사 전날 두 개의 물체(A, B)가 들어있는 상자에 동물을 넣어 탐색하게 하여 물체에 익숙하게 한 뒤, 다음 날 두 개 중 하나의 물체를 다른 것(A, C)으로 바꾸어 탐색하게 하면 정상 동물은 새로운 물체(C)를 탐색하는 데 더 많은 시간을 보내게 된다.

이러한 과정에서 물체 인식의 변별력 정도는 새로운 물질을 탐색한 시간(N)에서 익숙한 물체 탐색한 시간(F)을 뺀 값을 두 물체 모두를 탐색한 시간의 합으로 나누어 계산하게 되고, 결과적으로 변별력 지수(Discrimination Index) = (N-F/N+F) 와 같은 공식에 따라 측정하게 된다.

이에 따른 앞 설명한 도1의 모식도에 따른 인간 전분화능 줄기세포로부터 유래된 신경전구세포의 투여가 이루어진 혈관성 치매 동물모델인 C57BL/6 생쥐(NPC), 생리식염수(PBS)의 투여가 이루어진 혈관성 치매 동물모델인 C57BL/6 생쥐(VEH) 및 정상의 대조군(Sham) 생쥐 각각의 새로운 물체 인지(Novel object recognition) 검사 결과는 도3B(도면참고- *P<0.05, **P<0.01)에 도시된 바와 같다.

도3B을 살펴보면, VEH 실험군은 변별력 지수가 매우 낮아지는 반면, NPC 실험군은 수술을 받지 않은 대조군(Sham)의 변별력 지수 수준과 비슷한 정도까지 회복이 이루어짐을 확인할 수 있다.

따라서 NPC 실험군은 VEH 실험군에 비해 훈련 시 달라진 새로운 물체를 인식하고 더 많은 시간을 탐색하는 행동을 보여주게 된다.

(5) 혈관성 치매 동물모델(BCAS 생쥐)의 뇌 조직 분석

본 발명의 인간 전분화능 줄기세포로부터 유래된 신경전구세포를 유효성분으로 포함하는 혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물의 효과를 확인하기 위하여, 앞 서 설명한 각종 인지 기억능력 평가를 마친 동물모델들의 실제 뇌 조직 내 특정 성분들의 변화를 알아보기 위해 조직화학적 분석을 수행했다.

우선, 인간 전분화능 줄기세포로부터 유래된 신경전구세포의 투여가 이루어진 혈관성 치매 동물모델인 C57BL/6 생쥐(NPC), 생리식염수(PBS)의 투여가 이루어진 혈관성 치매 동물모델인 C57BL/6 생쥐(VEH) 및 정상의 대조군(Sham) 생쥐 각각을 마취 후 심장관류를 통해 4% 파라포름알데히드로 고정하여 뇌 조직을 적출하였다.

여기서, 적출된 뇌 조직들은 30% sucrose 용액에서 4일간 냉장보관하였다. 이후, 동결 포매제(OCT compound)로 포매한 뇌조직은 냉동절편기(CM3050S, Leica)를 사용하여 20㎛의 두께로 잘라 슬라이드 (silane coated slide)에 부착시켰다.

먼저, 뇌 조직 절편을 염소혈청완충액 (10% horse serum, 0.3% Triton X-100 in PBS)으로 반응시켜 비특이적 항체 결합을 차단한 후, 각 일차항체를 4ㅀC에서 면역 반응시켰다.

여기서, 일차항체는 IBA-1(1:200; Wako), GFAP(Glial fibrillary acidic protein / 1:200; Dako) 및 MBP(1:25; Millipore)이 해당된다.

또한. 완충용액으로 세척한 뇌 조직 절편은 이어서 Alexa 488 또는 Alexa594 형광 접합된 이차항체와 반응시켰고, 마운팅 용액을 사용해 커버슬립으로 봉입하였다. 염색을 마친 조직 슬라이드는 형광현미경 (BX61; Olympus)하에서 이미지를 얻어 양성세포 수와 형광의 강도를 측정하였다.

이를 통한 뇌 조직의 조직화학적 분석 결과는 도4 내지 도6에 도시된 바와 같다.

도4(도면참고- Scale Bar=50ㅅm, *P<0.05, **P<0.01)를 살펴보면, NPC 실험군에 해당하는 생쥐의 뇌 조직 중 대뇌피질(Cerebrum Cortex) 및 해마(Hippocampus, CA1) 내 미세아교세포(Microglia) 표지인자인 IBA-1의 축적이 VEH 실험군에 해당하는 생쥐와 비교해 현저히 감소하여 정상 수준에 가까워지고 있음을 확인할 수 있다.

여기서, IBA-1의 표지 대상이 되는 대뇌피질(Cerebrum Cortex) 및 해마(Hippocampus) 내 미세아교세포(Microglia)는 뇌 조직의 염증반응을 매개하는 염증세포이다.

따라서 대뇌피질(Cerebrum Cortex) 및 해마(Hippocampus) 내 미세아교세포(Microglia)의 표지인자인 IBA-1의 발현 감소가 확인됨은 혈관성 치매에 의한 뇌 조직의 염증반응을 일으키는 미세아교세포(Microglia)의 양이 감소하며 항염 효과가 이루어져 병증 악화가 방지 혹은 감소하고 있음을 의미한다.

도5(도면참고- Scale Bar=50ㅅm, *P<0.05, **P<0.01)를 살펴보면, NPC 실험군에 해당하는 생쥐의 뇌 조직 중 뇌량(Corpus callosum) 및 해마(Hippocampus) 내 양성을 띠는 성상세포(Astrocyte) 표지인자인 신경교섬유질산성단백질(GFAP, Glial fibrillary acidic protein)의 축적이 생VEH 실험군에 해당하는 생쥐와 비교해 현저히 감소하여 정상 수준에 가까워지고 있음을 확인할 수 있다.

여기서, GFAP의 표지 대상이 되는 뇌량(Corpus callosum) 및 해마(Hippocampus) 내 성상세포(Astrocyte)는 혈관성 치매의 병인 발생(Pathogenesis)에 관여하는 세포이다.

따라서 뇌량(Corpus callosum) 및 해마(Hippocampus) 내 성상세포(Astrocyte)의 표지인자인 GFAP의 발현 감소가 확인됨은 혈관성 치매를 발병시킬 수 있는 성상세포(Astrocyte)의 양이 감소하며 혈관성 치매의 발별 가능성이 낮아져 발병이 예방될 수 있음을 의미한다.

도6(도면참고- Scale Bar=20ㅅm, *P<0.05)을 참조하면, 뇌 조직 중 백질 부위인 뇌량(Corpus callosum)을 지나가는 심경섬유다발을 염석하여 분석한 결과 NPC 실험군에 해당하는 생쥐의 뇌량(Corpus callosum)을 지나가는 심경섬유다발의 병변이 대조군(Sham)의 수준으로 회복되고 있음을 알 수 있다.

즉, 본 발명의 인간 전분화능 줄기세포로부터 유래된 신경전구세포를 유효성분으로 포함하는 혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물의 효과 검증을 위한 뇌 조직의 조직화학적 분석을 수행한 결과, 본 발명의 인간 전분화능 줄기세포로부터 유래된 신경전구세포를 유효성분으로 포함하는 혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물을 투여하면 뇌 조직 내 염증반응 발생에 매개체로 작용하는 미세아교세포(Microglia) 및 혈관성 치매 발병의 원인이 되는 성상교세포(Astrocyte)의 뇌 조직 내 발현 및 축적이 감소하고 뇌의 백질 부위에 해당하는 뇌량을 지나가는 신경다발의 병변 회복이 일어나며 궁극적인 혈관성 치매 예방 또는 치료가 가능해진다.

본 발명에 개시된 실시예는 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의해서 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 보호범위는 아래 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

인간 전분화능 줄기세포(hPSC, human Pluripotent Stem Cell)를 분화 유도용 배지에서 배양하여 분화 유도시켜 마련되는 신경전구세포(Neural Progenitor cell)를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는
혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물은 정맥 내 투여를 통한 이식용으로 제형화되는 것을 특징으로 하는
혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물은 예방 또는 치료 대상 뇌의 대뇌피질(Cortex) 및 해마(Hippocampus) 내 미세아교세포(Microglia)의 활성으로 인한 신경염증이 줄어들게 하는 것을 특징으로 하는
혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물은 예방 또는 치료 대상 뇌의 뇌량(Corpus callosum) 및 해마(Hippocampus) 내 신경교섬유질산성단백질(GFAP, Glial fibrillary acidic protein)의 표지인자에 양성을 띠는 성상세포(Astrocyte)의 수를 감소시키는 것을 특징으로 하는
혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물은 예방 또는 치료 대상 뇌의 뇌량(Corpus callosum)을 지나가는 신경섬유다발에 발생한 병변을 회복시키는 것을 특징으로 하는
혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 신경전구세포는 인간 전분화능 줄기세포를 N2 및 B27이 포함된 신경외배엽 분화 유도용 배지에서 6일 동안 배양하여 신경외배엽 세포(Neuroectoderm)로 분화 유도시킨 뒤, 분화 유도된 신경외배엽 세포를 신경전구세포 분화 유도용 배지에서 7일 동안 배양하여 신경전구세포(Neural Progenitor cell)로 분화 유도시키는 과정을 통해 마련되며,
상기 신경외배엽 분화 유도용 배지는 N2 및 B27이 포함된 DMEM/F12 배지에 BMP 신호전달체계의 억제제 150nM 내지 250nM, TGFβ 신호전달체계의 억제제 5ㅅM 내지 15ㅅM 및 인슐린 유사 성장인자 수용체(IGF1R)의 억제제 500nM 내지 1000nM가 추가 처리된 상태로 마련되며,
상기 신경외배엽 분화 유도용 배지는 DMEM/F12 배양액 50ml를 기준으로 N2를 0.4ml 내지 0.6ml의 부피로 포함하고, B27를 0.5ml 내지 1.5ml의 부피로 포함하는 것을 특징으로 하는
혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제6항에 있어서,
상기 신경전구세포 분화 유도용 배지는 DMEM/F12 배양액 25ml와 Neurobasal 배양액 25ml로 혼합된 배양액을 기준으로 N2를 0.4ml 내지 0.6ml의 부피로 포함하고, B27을 0.5ml 내지 1.5ml의 부피로 포함하는 상태로 마련되는 것을 특징으로 하는
혈관성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물.