JPH10508487A - ブタ中脳細胞、および神経変性疾患による神経的欠乏の処置におけるその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ブタの中脳細胞、およびこの細胞を使用して神経変性による神経的欠乏を処置する方法を記載する。ブタの中脳細胞を、ヒトのような異種移植個体に移植するために適するように修飾できる。例えば、ブタの中脳細胞を、異種移植個体中の細胞に対する免疫反応を剌激できる細胞表面上の抗原（例えば、ＭＨＣクラスＩ抗原）を変化させて（例えば、抗−ＭＨＣクラスＩ抗体、またはその断片または誘導体との接触による）、個体に導入された時に細胞の拒絶を抑制するように修飾できる。１つの態様では、ブタの中脳細胞を、受容体個体に感染または疾患を伝播できる生物または物質を本質的に含まないブタから得る。本発明のブタの中脳細胞は、この細胞を個体の脳内に導入することにより、異種個体（例えば、癲癇、頭部外傷、発作、筋萎縮性外索硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー疾患またはハンチントン病を持つヒト）の脳中の神経変性による神経的欠乏を処置するために使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】 ブタ中脳細胞、および神経変性疾患による神経的欠乏の処置におけるその使用発明の背景 パーキンソン病へのL-DOPAの薬理学的投与を除いて、一般的に神経変性疾患に は効果的な処置が不足している。これまでの神経変性疾患の研究では、症状は局 所的な神経の回転の障害について二次的に起こり、そして全身性のドラッグデリ バリーでは効果的に処置できないことを示唆する。その結果、神経変性疾患に関 する別の処置が現れた。損傷を受けた神経回路を再構成し、そして欠失したニュ ーロンおよび神経伝達系を置き換えるための努力におけるそのような処置は、遺 伝的に操作された細胞（例えば、Breakefield,X.O.ら、(1989)Neurobiol.Aging 10:647-648；Gage,F.H.ら(1987)Neuroscience 23:795-807；Horellou P.ら、(19 90).Eur.J.Neurosci 2:116-:119；Rosenberg.M.B.ら（1988）Science 242:1575- 1578；Wolff,J.A.ら、(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9011-9014を参照にさ れたい）、または胎児細胞（Bjorklund,Aら(1983)Acta.physiol.Scand.Suppl.52 2:1-75；Dunnett,S.B.ら、（1990）脳の修復(Brain Repair)（Bjorklund,Aら編 集）ウェナー-グレン インターナショナル シンポジウム シリーズ(Wenner-Gren International Symposium Series)56:335-373(マックミラン出版：McMillan Pr ess、ロンドン)；Isacson,O.ら、(1984)Nature 311;458-460を参照にされたい) の、神経変性の領域への移植を含む。 操作した細胞は細胞株に由来するか、または受容した宿主の繊維芽細胞または 他の細胞から成長させ、そして次に脳の特定部位への移植後に 物質を生産、そして分泌するように改質できる。この送達様式に従うことができ る神経活性物質は、神経ペプチドおよび化学的伝達物質を含む。例えば研究者の １グループは、遺伝的に操作した神経成長因子−産生ラット繊維芽細胞が、ニュ ーロトキシンを注入する前にラットの線条体に移植された時に、エクサイトトキ シン(excitotoxin)-誘導傷害から神経を保護すると報告された生物系を開発した (Schumacher,J.M.ら、(1991)Neuroscience 45(3):561-570)。L-DOPAまたはドパ ミンを産生するように遺伝的に改質されたラット繊維芽細胞を、ラットの黒質線 条体経路の6-ヒドロキシドパミン傷害に移植した別のグループは、移植した繊維 芽細胞が創傷したラットの行動異常を減少させることを報告した(Wolff,J.A.ら 、(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9011-9014)。遺伝的に操作した細胞の代わ りに、脳に移植される細胞は、例えばPCl２細胞によるカテコールアミンおよび 不死化海馬ニューロンによる神経成長因子のような、それらの重要成分の内在性 放出により選択できる。 神経活性物質を産生、そして分泌するように操作された細胞の移植は、単独で 、または胎児神経祖先細胞の脳内の神経変性領域への移植と組み合わせて使用で きる。例えば線条体中の神経変性により損傷した機能的連結を修復するために、 線条体の神経損失領域中へ移植された細胞は、神経変性の領域からかなり離れて 位置する多数の標的構造中に、シナプスとニューロンとの接続性を再度、確立し なければならない。ラットを対象とした線条体間(intrastriatal)の同種移植片 の接続の軸索追跡では、求心性および遠心性の両方の接続が、適切な領域中で移 植ニューロンと宿主ニューロンとの間で確立されることを示し(Labandeira-Garc ia,J.L.ら(1991)Neuroscience 42:407-426；Liu,F.C.ら、(1990)J.Comp. Neurol .295:1-14；Wictorin,K.ら、(1988)Neuroscience 27:547-562；Wictorin, K.ら、(1989)Neuroscience 30:297-311；Xu,Z.C.ら、(1991)J.Comp.Neurol.303: 22-34）、そして宿主−移植接続は電気生理学および超構造分析により実証され た。Rutherford,A.ら、(1987)Neuroscience Lett.83:275-281；Xu,Z.C.ら、(199 1)J.Comp.Neurol.303:22-34。しかし線条体同種移植片からの遠心性接続の程度 は、接続数に関して(WalkerP.D.ら、(1987)Brain Res.425:34-44；Wictorin,K. ら、(1989)Neuroscience 30:297-311)、そして遠方標的に対する接続に関して(M cAllister,J.ら、(1989)Brain Res.476:345-350；Pritze1ら、(1986);Wictorin, Kら、(1989)Neuroscience.30:297-311;Zhou,H.F.ら、(1989)Brain Res.504:15-3 0)、限定されている。したがって神経祖先細胞の供給源、および移植から受容体 脳組織への遠心性接続および遠方の受容体脳標的への接続を促進または発生を強 化する神経移植方法が必要である。 例えば黒質中の神経変性疾患により傷害を受けたドパミン作用性細胞を交換す るために、ドパミン作用性ニューロン損失の領域への細胞移植は、末端を持つ線 条体で飽和し、そしてフィードバック制御系を介してドパミンを産生しなければ ならない。ドパミンの生合成に作用する酵素を発現するように操作された細胞は 、ドパミンを構成的に分泌することが知られている。Kang,U.J.ら、(1993)J.Neu rosci .13(12):5203-5211。ドパミンの構成的分泌は、小胞での有意な保存能力が なく、または分泌レベルでの調節が無いと報告された。Kang,U.J.ら、(1993)J.N eurosci .13(12)：5203-5211；またはFisher,L.J.ら、(1993)Ann.N.Y.Acad.Sci.6 95:278-284(取り組んだ問題としてではなく、神経伝達物質の構成的分泌を述べ ている)も参照にされたい。すなわち、神経伝達物質をフィー ドバック制御機構を介して生成する神経祖先細胞の供給源の必要性もある。発明の要約 本発明は、少なくとも部分的にはブタの神経細胞、および特に妊娠発生の特定 の段階で単離されたブタの胎児の神経細胞が、異種の個体の脳に移植された時に 、宿主個体中の移植細胞と遠い脳の標的との間の遠心性の接続の発生を促進し、 そして宿主からの求心性のインプットを受け取ると言う知見に基づく。さらに、 本発明のブタ神経細胞はフィードバック制御系により調節される神経伝達物質の 供給源も提供する。 したがって、本発明は異種移植の個体、特にヒト個体に移植するために適する ブタの神経細胞または単離されたブタの神経細胞の一群に関する。このブタの神 経細胞は未改質（未修飾）の状態で異種の個体中、特にヒトの細胞に対して免疫 反応を刺激することができる、少なくとも１つの抗原を細胞表面上に有する。ブ タの神経細胞の表面抗原は、異種移植個体に導入された時に細胞の拒絶を抑制す るように変化している。１つの態様では、変化した細胞表面抗原は、ＭＨＣクラ スＩ抗原である。このＭＨＣクラスＩ抗原は異種移植個体に移植される前に、少 なくとも１つのＭＨＣクラスＩ抗体またはその断片または誘導体（これは細胞表 面のＭＨＣクラスＩ抗原と結合するが、補体を活性化せず、または細胞の溶解を 誘導しない）と接触できる。ＭＨＣクラスＩ抗体の１例は、モノクローナル抗体 PT85のＭＨＣクラスＩF(ab')₂断片のようなＭＨＣクラスＩF(ab')₂断片である。 神経変性疾患によるヒトの神経的欠乏の処置の使用に、特に好適なブタの神経 細胞は中脳、線条体および皮質細胞である。典型的にはこれら の細胞は、妊娠発生の選択された段階中に胎児のブタから得る。例えば、妊娠の 約20日と30日の間、より好ましくは約24日と30日の間、そしてさらに好ましくは 約25日と28日の間、そして一層好ましくは約26日と28日の間、そして最も好まし くは約27日の胎児のブタから得た腹側中脳細胞が、異種の個体、特にヒト個体へ の移植に適すると決定された。同様に、約20日と50日の間、より好ましくは約30 日と40日の間、そして最も好ましくは約31日と38日の間の胎児のブタから得たブ タ線条体細胞は、異種移植個体への移植に適すると決定された。１つの態様では 、線条体細胞はブタ（例えば胎児のブタ線条体）の神経節隆起（例えば側方の神 経節隆起）から得る。妊娠の約30日と50日の間、より好ましくは約31日と40日の 間の胎児のブタから得た胎児の皮質細胞は、異種移植個体への移植に適すると決 定された。本発明のブタ神経細胞群は、例えば神経祖先細胞、グリア祖先細胞お よびグリア細胞から選択される少なくとも２つの異なる細胞型を含むことができ る。さらに、本発明の神経細胞は、細胞培養物として成長させることができる。 例えば、本発明はブタの中脳細胞（例えば、腹側の中脳細胞）の細胞培養物を含 み、ここで少なくとも約１％−５％のブタ中脳細胞がチロシンヒドロキシラーゼ を産生する。好ましくは少なくとも約10％、より好ましくは少なくとも約20％、 さらに好ましくは少なくとも約30％、一層好ましくは少なくとも約40％、そして 最も好ましくは少なくとも約50％以上の細胞培養物中の細胞がブタの中脳細胞で ある。本発明の別の観点は、単離されたブタの中脳細胞（例えば腹側中脳細胞） であり、異種移植個体へ移植された時にドパミンを産生する。 本発明の別の観点は、単離されたブタ線条体細胞群に関する。そのよ うなブタ線条体細胞の好適な供給源は、胎児のブタの線条体、そして特に上記の 妊娠日齢中に単離された線条体の、神経節隆起、例えば側方の神経節隆起を含む 。同様に、ブタ線条体細胞は上記のように改質できる。単離されたブタ線条体の 細胞群は、一般的に神経祖先細胞から成るが、例えば神経祖先細胞、グリア祖先 細胞およびグリア細胞から選択される少なくとも２つの異なる細胞型を含んで成 ることができる。１つの態様では、グリア細胞は細胞表面の糖タンパク質CD44を 発現する。そのような細胞は異種移植個体中に移植され、GABA-作用性の伝達を ブタ線条体細胞の移植部位で増強することができる。ブタ線条体細胞(例えば、 胎児のブタ線条体細胞、例えば側方神経節隆起から得る)から成る細胞培養物(こ こで好ましくは少なくとも約10％、より好ましくは少なくとも約20％、さらに好 ましくは少なくとも約30％、一層好ましくは少なくとも約40％、最も好ましくは 少なくとも約50％以上がブタ線条体細胞の細胞である)も、本発明の意図すると ころである。これらの細胞培養物はグリア細胞も含むことができ、例えば少なく とも約10％、より好ましくは少なくとも約20％、さらに好ましくは少なくとも約 30％、一層好ましくは少なくとも約40％、最も好ましくは少なくとも約50％以上 のグリア細胞である。本発明の別の観点は、異種移植個体中に移植された時に少 なくとも１つの神経プロセスを個体の脳の少なくとも１領域に広げる、単離され たブタ線条体細胞を含む。個体の好適な標的領域には、黒質および淡蒼球のよう な脳の正常な線条体細胞の遠心性標的領域を含む。 本発明のさらなる観点は、単離されたブタ皮質細胞群に関する。そのようなブ タ皮質細胞の好適な供給源には、胎児のブタ皮質を含む。ブタ皮質細胞が単離さ れる好適な位置は、基底前脳である。これらブタ皮質 細胞は上記のように改質することができる。ブタ胎児皮質細胞は、少なくとも神 経プロセス生長の一部が始まったような妊娠日齢で選択される。好ましくは細胞 は短および長距離神経プロセス生長の両方が始まったような妊娠日齢で選択され る。皮質細胞群は、例えば神経祖先細胞、グリア祖先細胞およびグリア細胞から 選択される少なくとも２つの異なる細胞型を含むことができる。そのような細胞 は、異種移植個体に移植されて傷害を受けた、または破壊された皮質細胞と交換 される。移植された皮質細胞は、脳内全体に標的一特異的軸索を広げることがで きる。ブタの皮質細胞（例えば、胎児のブタ皮質細胞）を含んで成る細胞培養物 （ここで好ましくは少なくとも約10％、より好ましくは少なくとも約20％、さら に好ましくは少なくとも約30％、一層好ましくは少なくとも約40％、最も好まし くは少なくとも約50％以上の細胞が少なくとも１つの神経プロセスを有する）も 、本発明の意図するところである。本発明のさらなる観点は、異種移植の個体中 に移植された時に少なくとも１つの神経プロセスを、個体の脳の少なくとも１つ の皮質または皮質下の標的領域に広げる、単離されたブタ標的細胞を含む。脳の 典型的な皮質細胞遠心性標的領域には、新皮質、海馬、脳梁、帯状束、内皮膜お よび大脳脚を含む。 さらに本発明の観点は、感染または病気を細胞の異種移植受容体、例えばヒト に伝播できる生物を本質的に含まないブタから単離した、ブタの神経細胞または 神経細胞群に関する。病原体を含まないという場合のブタの病原体のカテゴリー は、寄生虫、細菌、マイコプラズマおよびウイルスを含むことができる。細胞を 上記のように改質して、異種移植個体中に導入された時に細胞の拒絶を抑制する ことができる。本発明のブ タの神経細胞は、細胞の成長を支持するために適当な培地中で細胞培養物とし成 長させることができる。そのような細胞培養物は、血管新生因子、神経栄養因子 、抗アポトーシス因子(antiapoptic factor)、抗酸化剤および一酸化窒素の生成 を抑制する薬剤から成る群から選択される少なくとも１つの薬剤または因子も含 むことができる。血管新生因子の例には、血管内皮増殖因子、血小板−由来増殖 因子、繊維芽細胞増殖因子および上皮細胞増殖因子を含む。神経栄養因子の例に は、グリア細胞系−由来増殖因子、脳−由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子 、ミドカイン(midkine)、インスリン−様増殖因子ＩおよびII、インスリン、繊 維芽細胞増殖因子、ニューロトロフィン-3、ニューロトロフィン4/5、トランス フォーミング増殖因子β、FK506およびシクロスポリンＡを含む。抗アポトーシ ス因子の例には、bcl-2遺伝子産物、bcl-xL遺伝子産物、bcl-Xβ遺伝子産物、cr mA遺伝子産物、神経成長因子、血小板−由来増殖因子、スーパーオキシドジスム ターゼ、カタラーゼおよびN-アセチルシステインを含む。細胞培養に加えること ができる抗酸化剤には、スーパーオキシドジスムターゼ、グルタチオン ペルオ キシダーゼ、N-アセチル システイン、ラザロイド(lazaroid)、ビタミンＣ、ビ タミンＥおよびベータカロチンを含む。一酸化窒素の生成を抑制する薬剤の例に は、ガングリオシド、FK506、シクロスポリンＡおよびスーパーオキシドジスム ターゼを含む。さらにブタの神経細胞は、細胞を個体へ導入し易くする送達デバ イス中（例えば、シリンジ）に挿入できる。好適な神経細胞型、細胞日齢および 細胞起源は、上記の通りである。そのようなブタからブタの神経細胞を単離する 方法（この方法では細胞の受容者に感染または病気を伝播できる生物の存在また は不在を試験した）、お よび単離した神経細胞も本発明の範囲内である。さらに個体(例えばヒト)の脳内 の神経変性を、そのようなブタから単離したブタの神経細胞を個体に導入するこ とにより、処置する方法も本発明の意図するところである。 本発明はまた、本発明のブタの神経細胞（例えば、改質した、または非改質の ブタ神経細胞）を、個体（例えばハンチントン病のヒト）の脳内の神経変性の領 域（例えば線条体）に移植することにより、異種移植個体の脳内の神経変性によ る神経的欠乏を処置するための方法も提供する。ブタの神経細胞の移植は、血管 新生因子、神経栄養因子、アンチアポプティック因子、抗酸化剤、および本明細 書に記載の一酸化窒素の生成を抑制する薬剤から成る群から選択される少なくと も１つの薬剤または因子、ならびに免疫抑制剤(例えば、シクロスポリンA、FK50 6、RS-61443またはT細胞抗体)を個体に投与することにより行うことができる。 １つの態様では、異種移植個体の脳内の神経変性による神経的欠乏は、ブタの 線条体細胞（例えば、ブタの線条体の側方神経節隆起のような神経節隆起から得 た線条体細胞のような胎児のブタの線条体細胞）を、個体の脳内の神経変性領域 に移植することにより処置される。この方法は、基底神経節の神経変性を処置す るために、そして特にハンチントン病に患っているヒトのような個体の線条体中 の神経変性を処置するために使用できる。胎児のブタの線条体(例えば、胚日20- 50、より好ましくは約30−40日の胚日、そして最も好ましくは約31−38日の胚日 )の側方神経節隆起から得たらブタの線条体細胞を、神経変性の部位に移植する ことが好適である。本発明の神経細胞は、癲癇を処置するために使用することも できる。例えば、本発明の線条体細胞または皮質細胞のようなGA BA-作用性神経細胞は、癲癇患者の脳（例えば海馬のCA1領域のような海馬中、エ ントルヒナル(entorhinal)皮質または黒質で起こり得るような、例えば神経変性 または癲癇性の焦点領域）に移植できる。 別の態様では、異種移植個体の脳内の神経変性による神経的欠乏は、本発明の ブタの中脳細胞を個体の脳内の神経変性領域に移植することにより処置される。 この方法は、中脳内の神経変性、そして特にパーキンソン病を患っているヒトの ような個体の中脳内の神経変性を処置するために使用できる。ブタの中脳細胞は 、妊娠の約20日と30日の間、より好ましくは約24日と30日の間、さらに好ましく は約25日と28日の間、そしてさらに好ましくは約26日と28日の間、そして最も好 ましくは約27日に胎児のブタの腹側中脳から得た胎児の腹側中脳細胞であること が好ましい。そのような細胞を異種移植個体の脳内の神経変性部位に移植するこ とができる。 さらに別の態様では、異種移植個体の脳内の神経変性による神経的欠乏は、本 発明のブタの皮質細胞を個体の脳内の神経変性領域に移植することにより処置さ れる。この方法は、皮質中の神経変性、そして特に例えば発作、頭部外傷、筋萎 縮性外索硬化症、多発性硬化症、ハンチントン病およびアルツハイマー疾患を患 っている個体、例えばヒトの皮質中の神経変性を処置するため使用できる。ブタ の皮質細胞は、妊娠の約25日と50日の間、より好ましくは約28日と40日の間に胎 児のブタの皮質から得た胎児の皮質細胞であることが好ましい。そのような細胞 は、異種移植個体の脳内の神経変性部位に移植できる。 本発明はまた、胎児のブタ線条体の側方神経節隆起から細胞を単離する方法も 特徴とする。この方法は、妊娠日齢約30-40日の間の胎児のブ タの線条体の中心軸の神経節隆起から、側方神経節隆起を切開することを含む。図面の簡単な説明 図１は、異なる日齢の胎児のブタに由来する腹側中脳（ＶＭ）細胞の単離後の 細胞生存率試験の結果を表す。 図２は、6-ヒドロキシドパミン創傷動物に導入された胎児のブタ中脳移植片を 含有するラットに関する、組織学的分析および行動試験の結果を表す。この移植 片は、多数のドパミンニューロン（パーキンソン病を処置するために必要なニュ ーロン）を含み、そしてラットにおいて行動的欠陥を矯正することを示した。移 植片を受容したラットの行動を分析するために使用した方法は、以下に“本質的 に病原体を含まないブタから得たブタの神経細胞を使用して、異種個体の脳内の 神経変性による神経的欠乏を処置する方法”という表題に記載する。 図３は、ブタ、ラットおよびヒトの胚発生の比較を表すグラフである。ブタ、 ラットおよびヒトの冠から尻の長さ(crown-to-rump:CRL)対 妊娠日齢をプロット した。これらは同じグラフにプロットするように、誕生時の％総ＣＲＬおよび％ 総妊娠ＣＲＬとして表した。ブタ、ラットおよびヒトの妊娠期間は、それぞれ11 5、21および266日である。矢印は、ハンチントン病について神経細胞収穫に適す るブタ、ラットおよびヒトの妊娠日齢を記す。 図４Ａ−４Ｅは、E50（50日齢）のブタ胎児に由来する各移植片を表し、２、 ３の神経成分を示している。これはすべての細胞内容（Nissl、図４Ａ）、神経 要素（AChE、図４ＢおよびＴＨ、図４Ｅ）、ならびにグリア要素（ＧＦＡＰ、図 ４ＣおよびＣＤ４４、図４Ｄ）について染色し た、50日齢のドナーに由来する各移植片である。Nissl染色は、移植片の境界を 同定し、そしてグリアおよび神経細胞染色を比較すると、移植片の神経染色量が 減少していることが分かる。 図５Ａ−５Ｃは、31日齢のブタ胎児に由来する各移植片を表す。各々の移植片 は、31日齢のブタ胎児脳側方神経節隆起(LGE)に由来し、神経およびグリア要素 でバランスがとれた移植片を表している。図５Ａは、神経マーカーニューロフィ ラメント70kDに関する移植片染色を表す。図５Ｂおよび５Ｃは、それぞれ抗-Ｍ ＨＣ−Ｉおよび抗−ＣＤ４４を用いたグリア要素に関する移植片染色を表す。 図６Ａ−６Ｄは、胎児ブタ供与体の特徴および切開手順を表す。図６Ａは、本 明細書に記載した実験中に記録されたブタ胎児の、冠から尻の長さと、予想され る妊娠日齢との間の関係を示すグラフである（移植していないものも含む）。図 ６Ｂは、Ｅ３５胎児ブタ脳の図解であり、終脳小胞内の神経節隆起の位置を表す 。図６Ｃおよび６Ｄは、Ｅ３５胎児ブタ脳の冠状区分であり、神経節隆起を通る ２つのレベルを表している。中央神経節隆起(MGE)から側方神経節隆起(LGE)を分 ける溝は、より前区分（図６Ｃ）で明らかに示されており、そして後区分（図６ Ｄ）で細く消えてる。Ｍ＝中央神経節隆起；Ｌ＝側方神経節隆起。尺度棒＝200 μm。 図７Ａ−７Ｃは、AChE-染色区分から測定するように、移植された生存胎児ブ タ細胞数とその後に生成した８週間後の線条体異種移植片の容量との関係を決定 するための用量／反応実験の要約を表す。図７Ａは、100,000/50,000細胞比較で 、２つの移植片を表す。図７Ｂは、200,000/10,000細胞比較で、２つの移植片を 表す。図７Ｃは、移植した胎児ブタLGE細胞数と2ケ月後の異種移植片の容量との 間の用量-応答関係を表し ている。尺度棒＝200μm。 図８は、本実験で観察された移植片細胞の回り、および移植片と宿主細胞との 間の関係を、略図的に表した要約図解である。移植細胞と宿主の脳構造の間で観 察された関係は、右上の箱枠に表し、移植片の軸索およびグリアファイバーの宿 主白質管中への優先的な広がり、ならびに移植片軸索と移植片グリアとの移植片 の外側での会合を含む。移植片中の種々の細胞型間で観察された関係は、右下の 箱枠に示し、AChE-陽性DARPP-陽性、ニューロンリッチゾーンから、GFAP-および CD44-IRグリア-リッチ領域の分離を含む。移植片のグリア領域に関する移植片軸 索の優先性も表される。 図９は、処理無し、後Ｆ(ab')₂処理およびシクロスポリンＡ(CsA)処理後のブ タ線条体異種移植片の生存率を表す移植片である。黒および白スタックカラムは 、それぞ生存および非−生存移植片に対応する。各カラム内の数字は、各カテゴ リー中の移植片数を表す。Pearsonカイ自乗分析により、F(ab')₂対処理無しにつ いて※Ｐ＜0.005、そしてCsA対処理無しについてＴｐ＜0.001。CsAとF(ab')₂と の間の差異は、統計的に有意ではない。 図１０は、F(ab')₂およびシクロスポリンＡ（CsA）処理後のブタ線条体移植片 容量を表す棒グラフである。白丸は、個々の移植片容量に対応する。カラムは平 均値を表す。P＜0.05、不対t-試験。 図１１は、２匹の異なるサルのＰＥＴスキャンを表す。このＰＥＴスキャンは 、サルがF(ab')₂または非F(ab')₂−処理の胎児30日のブタ側方神経節隆起細胞の 移植を受ける前、および後に作成した。 図１２は、サルが非-F(ab')₂−処理の胎児30日のブタ側方神経節隆起 細胞の移植を受けた後に、アポモルフィン−誘導運動異常性を表す棒グラフであ る。 図１３は、サルがF(ab')₂−処理の胎児30日のブタ側方神経節隆起細胞の移植 を受けた後に、アポモルフィン−誘導運動異常性を表す棒グラフである。 図１４Ａ−１４Ｂは、ブタの中脳細胞を移植する前、および移植４−６週間後 の間隔で、個々のラットについてプロットしたアンフェタミンが誘導した正味の 回転非対称スコア(rotation asymmetry scores)(90分間に、創傷と同じ側の回転 から、創傷と反対側の回転を引いた)を表すグラフである。図１４Ａは、シクロ スポリンＡ(CyA)処理ラット(n=11)を表し、そして図１４Ｂは非ーCyA処理ラット (n=11)を表すグラフである。 図１５Ａ−１５Ｂは、ラットに移植された１９週間後のCyA処理および非ーCyA 処理ブタ中脳細胞中の生存TH+ニューロンの数の比較（図１５Ａ）、およびCyA処 理および非ーCyA処理ラット中のブタ中脳のグラフ容量の比較（図１５Ｂ）を提 供する棒グラフである。棒はSEMを表す。※ｐ＜0.05、不対 t-試験。 図１６は、TH+ニューロン生存と、ブタの中脳細胞を移植され、そしてCyA(方 形はCyA処置群からの個々のラットを表す)で処置したラット群とブタの中脳細胞 を移植され、そしてCyA(丸は非-CyA処置群からの個々のラットを表す)で処置さ れなかったラット群との間の機能回復の程度の関係を表すグラフである。非−直 線回帰分析は、式ＲＲ＝ＲＲmax※N/N₅₀＋Nに適する飽和性の関係を明らかにし 、ここでRR＝回転の減少：ＲＲmax＝最大の回転の減少；Ｎ＝TH+ニューロンの数 ;Ｎ₅₀＝回転を5 0％減少させるために必要なTH+ニューロンの数(ＲＲ＝104※N/[77+N]；ｒ²＝0.6 42)。 図１７Ａ−１７Ｈは、Nissl（図１７Ａおよび１７Ｅ）、NF70（図１７Ｂおよ び１７Ｆ）およびCD44（図１７Ｄおよび１７Ｈ）で染色したCyA処理ラット（図 １７Ａ−１７Ｄ）、および非-CyA処理ラット（図１７Ｅおよび１７Ｈ）の各々の ブタ中脳移植片を通る、隣接対照区分の写真を表す。尺度棒＝200μm。 図１８Ａ−１８Ｃは、皮質創傷および移植部位ならびに特徴的な創傷および移 植片の細胞構造を表す写真（および概略図）である。 図１９Ａ−１９Ｄは、ラット皮質同種移植片中の移植片−宿主境界での、移植 片および宿主の接続性を表す写真である（各場合で、移植片は矢印の左側である ）。 図２０Ａおよび２０Ｆは、ブタの皮質異種移植片から生長する軸索およびグリ ア繊維を表す写真である。 図２１Ａ−２１Ｂは、皮質移植片から同側性の大脳皮質に広がるNF70-陽性ブ タ移植片軸索を表すグラフである。 図２２は、幾つかの異なる単離物から、胎児腹側中脳細胞の各々の像の位相一 蛍光対(phase-fluoresence pairs)の１組の写真である。細胞はチロシンヒドロ キシラーゼ(TH)に対するポリクローナルウサギ抗体、またはニューロン特異的エ ノラーゼ(NSE)に対するモノクローナルマウス抗体のいずれかで染色し、そして 次に蛍光ヤギ抗-ウサギまたはヤギ抗−マウス第二抗体でそれぞれ染色した。染 色に使用した抗体は、各対について左上に記す。典型的には、THについて１−５ ％の細胞が陽性に染色され、そして一般化された脳細胞特異的マーカーであるNS Eについ てはすべての細胞が染まる。発明の詳細な説明 Ｉ．本発明の単離細胞および細胞群 Ａ．改質ブタ神経細胞および改質ブタ神経細胞の単離群 本発明は、異種移植受容体、特にヒト個体に導入するために適するブタの神経 細胞を特徴とする。本明細書で使用するように句「ニューロン細胞」とは、神経 細胞（すなわち、ニューロン、例えばユニ−、ビ−またはマルチ極性ニューロン ）およびそれらの前駆体ならびにグリア細胞（例えば、オリゴデンドロサイト、 シュワン細胞およびアストロサイトのようなマクログリア、またはミクログリア ）およびそれらの前駆体を含む。用語「前駆体」、「祖先細胞」および「幹細胞 」は本明細書では互換的に使用し、そして多能性、すなわち神経細胞を含む多く の異なる細胞型に生育できる細胞を言う。そのような幹細胞を、本発明のブタ神 経細胞の供給源として使用でき、すなわち本発明の神経細胞はそのような幹細胞 に由来する。本明細書で使用するように、用語「由来（からの）」とは、祖先の 多能性幹細胞から発生した、または分化した細胞、または祖先として有する細胞 を言う。本発明の細胞を生成するために、このような多能性幹細胞を、典型的に は本明細書に簡単に記載するように、そして詳細には1995年5月11日に公開され た国際公開第95/12665号明細書（この内容は、引用により本明細書に編入する） 記載されているように得られ、そして処理される。 例えば神経細胞が特定細胞の運命に定っていない妊娠日齢中に、メスのブタか らブタ胎児を取り出すことができる。１つの態様では、発生の大変初期にブタの 胚盤胞または胚から幹細胞を得、そして増殖を促進す る条件下で培養する。例えばこれらの幹細胞を神経細胞型（例えば、本明細書に 記載するような細胞型）に分化促進するレチン酸、神経成長因子のような薬剤を 、培養に加えることができる。生成する分化した神経細胞は、本明細書に記載す るように受容体個体に移植することができる。 本発明の神経細胞は、ブタ中枢または末梢神経系の任意の位置から得ることが できる。非改質状態で、ブタの神経細胞は、異種移植個体中の細胞に対して免疫 応答を刺激できる少なくとも１つの抗原を細胞表面上に有する。細胞が異種移植 個体中に導入された時、細胞の拒絶反応を抑制するために、細胞表面上の抗原を 移植前に変化させる。未変化の状態では、細胞表面上の抗原は、細胞を個体（本 明細書では、受容体または受容個体とも言う）に投与した時に、細胞に対して免 疫反応を刺激する。抗原を変化させることにより、ブタの神経細胞の正常な免疫 的認識が受容体の免疫系細胞により破壊され、そしてさらに、この変化した抗原 の状態の「異常な」免疫学的認識は、受容体中でブタ神経細胞に特異的な長期の 非応答性を導くことができる。個体へ細胞を導入する前にブタの神経細胞上の抗 原の変化は、細胞の投与に続く宿主の免疫系細胞によるブタの神経細胞の認識の 初期相を妨げるらしい。さらに、抗原の変化は免疫学的非応答性または耐容を誘 導し、これにより最終的に正常な免疫応答中に外来細胞を拒絶する原因である免 疫応答のエフェクター相の誘導（例えば、Ｔ細胞生成、抗体生成等）を妨害する 。本明細書で使用するように、用語「変化した」とは、抗原の免疫原性を減少す る少なくとも１つのブタの神経細胞抗原（１つまたは複数）が作成される変化を 包含し、これにより受容体の免疫系による抗原（１つまたは複数）の免疫学的認 識を妨げる。 本発明に従い変化する抗原には、異種移植（または同種移植）受容個体中で免 疫細胞と相互反応でき、これにより受容体中のブタの神経細胞に対して特異的な 免疫応答を刺激する、ブタの神経細胞上の抗原を含む。抗原と免疫細胞との間の 相互反応は、間接的な相互作用でよく（例えば、免疫細胞中、反応を誘導する可 溶性因子、例えば体液により媒介される）、または好ましくは抗原と免疫細胞上 の表面に存在する分子との間の直接的な相互作用である（すなわち細胞−細胞媒 介）。本明細書で使用するように、用語「免疫細胞」とは、特定の免疫で役割を 果たす（例えば、免疫応答に関与する）、または自然な免疫で役割を果たす細胞 を含むことを意図する。免疫細胞の例には、リンパ球のすべての明らかなクラス （ヘルパーＴ細胞および細胞毒性Ｔ細胞のようなＴリンパ球、およびＢリンパ球 、およびナチュラルキラー細胞）、単球、マクロファージ、他の抗原提示細胞、 樹状細胞、白血球（例えば、好中球、好酸球および好塩基球）を含む。好適な態 様では、抗原はＴリンパ球と受容体中で相互作用するものである（例えば通常、 Ｔリンパ球表面上のレセプターと結合する抗原）。 １つの態様では、変化させるブタの神経細胞上の抗原はＭＨＣクラスＩ抗原で ある。あるいは、ＮＣＡＭ-１またはＩＣＡＭ-１のような細胞表面上の接着分子 を変化させることができる。ＭＨＣクラスＩ抗原のように細胞に対する細胞性の 免疫応答を刺激する抗原は、細胞と抗原に結合する分子とを接触させることによ り、移植前に変化させることができる。抗原に結合するための好適な分子は、抗 体またはその断片（例えば、抗-ＭＨＣクラスＩ抗体またはその断片、抗-ＩＣＡ Ｍ-１抗体またはその断片、抗-ＬＦＡ-３抗体またはその断片、あるいは抗-β₂ ミクログロ ブリン抗体またはその断片）である。好適な抗体断片は、F(ab')₂断片である。 ポリクローナル、またはより好ましくはモノクローナル抗体を使用できる。抗原 （例えばＭＨＣクラスＩ抗原）を変化させるために使用できる他の分子は、抗原 に結合するペプチドおよび小さい有機分子を含む。さらに、細胞表面上の同じま たは異なる抗原について、２つ以上の異なるエピトープを変化させることができ る。ブタの神経細胞上のＭＨＣクラスＩ抗原の変化のために、特に好適なモノク ローナル抗体はPT85（ベタリナリーメディスンリサーチディベロップメント:Vet erinary Medicine Research Development、プルマン、ワシントン州から入手で きる）である。ＭＨＣクラスＩ抗原を変化させるために、PT85を単独で使用でき 、あるいは各抗体が異なるエピトープに特異的ならば、PT85はＭＨＣクラスＩ抗 原に結合すると知られている別の抗体と組み合わせて使用して、細胞表面上の抗 原を変化させることができる。移植のために細胞表面抗原を変化させる適当な方 法は、FaustmanおよびCoe(1991)Science 252:1700-1702および国際公開第92/040 33号明細書に詳細に記載されている。移植のために細胞上の表面抗原に関する多 エピトープを変化させる方法は、国際特許出願公開第95/26741号明細書に詳細に 記載されており、これらの内容は引用により本明細書に編入する。 変化した（ここではまた、「改質した（修飾した）」とも言う）ブタの神経細 胞は、細胞群を含んで成ることができる。本明細書で使用するような用語「群」 とは、２種以上の細胞の群を言う。群のブタの神経細胞は、典型的には脳の選択 された領域から得る。本発明のブタの神経細胞群は、形態学的および機能的に均 一な細胞を排池的に含む必要はない。細胞群中に神経細胞に加えて非神経細胞の 存在は、受容個体への移植に 際して神経細胞の生存および成長を促進することができる。例えば、グリア細胞 は神経栄養因子または神経移動のための物質を提供できる。さらにグリア細胞は 、例えば受容体の免疫細胞から神経組織を防護し、これにより神経移植片の拒絶 を抑制することにより、神経移植片の長期の生存を可能とする。 本明細書に記載する改質または非改質細胞は、細胞の成長を支持するために適 当な培地中で、細胞培養物として成長することができる（すなわちインビトロで 成長する細胞群のように）。ブタの神経細胞の成長を支持するために使用できる 培地には、Gibco BRL(ゲチスバーグ、メリーランド州)により製造されているよ うな哺乳類細胞培養基を含む。1994年GibcoBRLカタログ＆レファレンスガイドを 参照にされたい。培地は無血清またはウシ胎児血清のような動物の血清を補充す ることができる。 移植実験およびヒトの神経変性から生じる神経的欠乏に使用するために、本発 明の変化したブタの神経細胞は、異種移植個体中に移植した後に成長、再生およ び分化が可能となるように発生の適切な段階で単離する。神経変性または神経変 性疾患から生じるそのような神経的欠乏には、例えばヒトの頭部外傷、発作、筋 萎縮性外索硬化症（ALS）、多発性硬化症、アルツハイマー疾患、パーキンソン 病およびハンチントン病を含む。したがって頭部外傷、発作、ALS、多発性硬化 症、ハンチントン病およびアルツハイマー疾患の処置に使用するために好適なブ タの神経細胞は、皮質細胞、より好ましくは胎児の皮質細胞であり；パーキンソ ン病の処置に使用するために好適なブタの神経細胞は、中脳細胞、より好ましく 胎児の中脳細胞であり；そしてハンチントン病の処置に使用するために好適なブ タの神経細胞は、線条体細胞、より好ましくは胎児の線 条体細胞である。受容個体に移植された際に、ブタの神経細胞、そして特にブタ の皮質細胞、ブタの中脳細胞およびブタの線条細胞の成長、再生および分化を提 供するために、最適な供与体が選択される。典型的には本発明の神経細胞は、望 ましい移植特性を表すブタの胎児から単離されたブタの胚細胞である。例えば一 般的に、繊維芽細胞−様の形態を有する神経細胞は、未熟すぎて収穫および移植 できない。神経細胞の好適な形態は、ニューロンに特徴的な正常の形態であり、 例えば培養皿のような培養媒体にグリア細胞（これは比較的平らな細胞体を有す る傾向がある）ほどは強く接着しない小さな丸い細胞体である。正常なニューロ ンの形態はまた、一般的に神経突起プロセスの存在を含む。すなわち、少なくと も約１％、より好ましくは少なくとも約10％、さらに好ましく少なくとも約20％ 、一層好ましくは少なくとも約30％、そして最も好ましくは少なくとも約40％の 培養中の神経細胞が、移植のために収穫される時に特徴的なニューロンの形態を 有する。本発明の神経細胞培養物は、本明細書に記載するグリア細胞のような、 さらなる細胞型も含むことができる。加えて、移植した細胞の生存能を増大させ る種々の方法を、本明細書に記載する。 ａ．移植に適当な日齢の中脳細胞の選択 中脳(mesencephalon)または中脳(midbrain)は、四丘体および大脳脚から成る 。各大脳脚の成分は、黒質である。黒質はパーキンソン病のヒト患者に見いださ れる主な神経変性領域の１つである。例えば黒質の神経変性疾患を処置するため に、ブタの中脳細胞を胎児の供与体であるブタ(swine)(本明細書ではブタ(pig) とも呼ぶ)の原側中脳から単離する。好ましくは、中脳細胞を選択した妊娠日齢 て胎児のブタから単離する。 細胞の単離のために選択した妊娠日齢(ブタの全妊娠期間は115日である)は、以 下の基準に基づき決定した：単離時の細胞の生存能、異種移植個体（例えばラッ ト）に実験的に誘導した行動の欠乏を矯正するための移植した細胞の能力、およ び周辺の結合組織に由来する腹側中脳（ＶＭ）脳組織を特別に切開する能力。異 種移植個体（特にヒト）中に移植するために適する中脳細胞を得るための胎児の ブタの好適な妊娠日齢は、約２４から２５日の間、および２９日から３０日の間 であることが見いだされた。この中脳細胞単離のために好適な妊娠日齢は、図１ に示すように実験的に決定した。日齢を変えて胎児由来の細胞単離後の細胞生存 能試験結果を表す。これらの実験結果は、発生の約２９から３０日よりも遅い胎 児中の単離ＶＭ細胞の生存能に、鋭い下降を示す。さらに50％未満の生存能の細 胞は、一般的に生きている移植片を生じない。したがって、２９から３０日より も古い胎児のブタは、ヒトへの移植用の中脳細胞の好適な供給源ではない。約２ ４から２５日よりも若い胎児のブタは、結合組織が所望する脳組織から容易に分 離しない。しかし２４日よりも若いブタから得た細胞は、所望により移植に使用 できる。すなわち、ブタの中脳細胞の単離に好適な範囲は、妊娠日齢２４から２ ９から３０日の間である。ブタの中脳細胞の別の単離に好適な範囲は、妊娠日齢 約２４から２８日の間である。ブタの中脳細胞の単離に、より好適な範囲は、妊 娠日齢約２６から２８日の間である。本発明のブタの中脳細胞の単離に特に好適 な胎児発育日齢は、２７日である。これは、胎児の冠から尻への長さ（ＣＲＬ） が18と25mmの間に相当する。そのような組織に由来する移植片（すなわち、ラッ トへの胎児のブタ組織）を、チロシンヒドロキシラーゼ（これは、ドパミンの合 成の速度制限酵素であり、そして ドパミンニューロンのマーカーである）に対する抗体を用いて染色することによ り検定し、これらがドパミンニューロン(パーキンソン病を処置するために必要 なニューロン)を含むことを示す。そのような細胞の移植は、実験ラットで行動 的欠乏を矯正することが判明した（図２）。ラットの行動的欠乏を分析するため に使用する方法は、以下の「本質的に病原体を含まないブタから得たブタの神経 細胞を使用して、異種移植個体中の脳の神経変性による神経的欠乏を処置する方 法」という表題の下に記載する。 さらに本発明のブタの中脳細胞は、細胞培養物として成長させることができる 。例えば、本発明はブタの中脳細胞（例えば、腹側中脳細胞）の細胞培養物を含 み、ここで少なくとも約１％−５％のブタの中脳細胞がチロシンヒドロキシラー ゼを生成する。チロシンヒドロキシラーゼは、ドパミン合成に関与する周知の酵 素であり、そして抗体を用いて検出できる。図２２は、幾つかの異なる単離物に 由来する胎児腹側中脳細胞の、１組の各々の画像の位相−蛍光対の写真を表す。 細胞は、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）に対するポリクローナルウサギ抗体 、またはニューロン−特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）に対するモノクローナルマウ ス抗体のいずれかで染色し、そして次に蛍光ヤギ抗−ウサギまたはヤギ抗−マウ ス第二抗体でそれぞれ染色した。染色に使用した抗体は、各対の左上に記した。 典型的には、１−５％の細胞がＴＨについて陽性に染色され、そしてＮＳＥ（こ れは一般化された脳細胞特異的マーカー）についてはすべての細胞が染色される 。好ましくは少なくとも約10％、より好ましくは少なくとも約20％、さらに好ま しくは少なくとも約30％、一層好ましくは少なくとも約40％、そして最も好まし くは少なくとも約50％ 以上の細胞培養物中の細胞が、ブタの中脳細胞である。本発明の別の観点では、 単離したブタの中脳細胞（例えば、腹側中脳細胞）を含み、これは異種移植個体 に移植された時、ドパミンを産生する。インビボのドパミンの産生は、例えば移 植片が位置する領域、またはその付近でミクロダイアリス プローブ(microdialy s probe)を使用して測定できる。ミクロダイアリス プローブは、1つのチップに 透過性の膜を有する。人工的な脳脊髄液（ＣＳＦ）をプローブを通して循環させ 、このようにしてドパミンが膜を通ってプローブ中の人工的なＣＳＦ中に入る拡 散を可能とする。生成した人工的ＣＳＦを、高性能液体クロマトグラフィーカラ ムに添加し、そしてドパミンを検出できる。 ｂ．移植に適当な日齢の線条体細胞の選択 線条体(striatum)または線条体(corpus striatum)は、脳幹神経節（尾状核お よび被殻）およびそれらを分ける内包のファイバーから成る小脳半球中の構造で ある。ブタ以外の動物に由来する線条体細胞は、移植実験に使用され(例えば、P akzaban,P.ら、(1993)Exp.Brain Res.97:13-22(ラットの線条体細胞)を参照にさ れたい)、ヒト個体への移植に適するブタの線条体細胞の単離のために、最適な 胚の段階が実験的に決定された。例えば、ブタとラットの胎児発生を比較するこ とにより（図３）、ラットの胚の発育はブタとは異なる経過をたどる。しかしラ ット細胞の単離に関する妊娠日齢に基づいて、実験的に決定したような最適な日 齢よりは有意に遅いブタの細胞の単離に関する妊娠日齢を選択するだろう。線条 体組織について、ラットの最適な供与体日齢は、発生から１４と１５日の間であ り、これは全妊娠期間の67％に相当する。ブタを対象として同等の段階は、70日 である（図３を参照にされたい）。しかし、胎児 のブタから線条体細胞の単離に関して実験的に決定した最適な日齢は、妊娠の約 ２０日から約５０日の間であり、より好ましくは約３０日から４０日の間、さら に好ましくは約３１日から約３８日の間、そして最も好ましくは約３４日から約 ３６日の間である。約５０日、より好ましくは約４０日、そして最も好ましくは 約３８日または３９日後には、線条体中の適切な標的組織が確かに切開できず、 そして移植後の移植片の品質が劣る（図４Ａ−４Ｅおよび５Ａ−５Ｃを参照にさ れたい）。すなわちヒトへの移植に適する胎児のブタの線条体細胞は、妊娠から 好ましくは約２０日から約５０日の間、より好ましくは約３０日から４０日の間 、さらに好ましくは約３１日から約３８日の間、そして最も好ましくは約３４日 から約３６日の間の胎児のブタから得る。 ブタの線条体細胞（例えば、胎児のブタの線条体細胞、例えば側方神経節隆起 から得た）を含んで成る細胞培養物、ここで少なくとも約10％、より好ましくは 少なくとも約20％、さらに好ましくは少なくとも約30％、一層好ましくは少なく とも40％、そして最も好ましくは少なくとも約50％以上の細胞がブタの線条体細 胞であるものも本発明の意図するものである。これらの細胞培養物は、グリア細 胞も含んでよく、例えば少なくとも約10％、より好ましくは少なくとも約20％、 さらに好ましくは少なくとも30％、一層好ましくは少なくとも約40％、そして最 も好ましくは少なくとも約50％以上のグリア細胞である。本発明の別の観点には 単離したブタの線条体細胞を含むが、これは異種移植個体に移植される際に、少 なくとも１つの神経プロセスを個体の脳の少なくとも１つの領域に広げる。本明 細書で使用する句「神経プロセス」とは、細胞の任意の伸長を含み、例えばニュ ーロン中の軸索または樹状突起あるいはグリア細胞 の軸索の回りにミエリン鞘を形成する膜状のプロセス、例えば乏枝神経膠である 。Kandel,E.R.およびSchwartz.J.H.編集、(1991)神経科学の原理(Principles of Neural Science)、第３版、（エルセビア、ニューヨーク）第14-19頁を参照に されたい。個体の好適な標的領域には、黒質および淡蒼球のような脳の正常な線 条体細胞遠心性標的領域を含む。 ｃ．移植に適当な日齢の皮質細胞の選択 大脳皮質は薄く、小脳半球の灰白質の表層を巻き込んでおり、主に５層中に整 列したニューロンの細胞体から成る。皮質は伝統的に４つの葉に分割された：前 頭葉、頭頂葉、後頭葉および側頭葉である。皮質領域の神経変性による神経的欠 乏を処置するために、ブタの皮質細胞を皮質から、例えば皮質領域が未だ明らか に限定されていない時の発生段階で単離する。したがって本発明の皮質細胞は、 任意の皮質の場所から単離できる。基底前脳コリン作用性ニューロンの変性、そ して続いて皮質中のアセチルコリン（ACh）の消費は、アルツハイマー疾患の特 に顕著な特徴であるので、本発明の皮質細胞を単離するために好適な場所は、ブ タの基底前脳である。基底前脳コリン作用性細胞は、妊娠の約２０日から３０日 で、より好ましくは妊娠の約２４日から２８日、そして最も好ましくは約２７日 のブタ胎児から単離できる。そのようなブタの細胞は、アルツハイマー疾患個体 で失った基底前脳コリン作用性細胞と置き換えるために使用し、そして付随する 認識欠乏を減少することができる。好ましくは、皮質細胞を選択した妊娠日齢で 胎児のブタから単離する。移植に適当な妊娠日齢の皮質細胞は、神経プロセス形 成の程度および広がりに基づき選択できる。一般的に、それらの標的に到達する ために最長距離に生長する皮質細胞は、発生の最初に生長プロセスを始め、そし て それらの標的に到達するために短距離に生長する皮質細胞は、生長プロセスを後 から始める細胞である。神経プロセス生長は、誕生および誕生後までつづく胎児 の発育後期段階まで起こるが、長距離神経プロセス生長は、初期段階（すなわち 、胎児発生の約３０日）で止まる。したがって移植に適当な妊娠日齢の皮質細胞 は、少なくとも神経プロセス生長の一部が始まったような発生段階で、皮質細胞 を同定することにより選択できる。好ましくは、細胞は短および長距離神経プロ セス生長の両方が始まったが、すべての長距離生長が始まる前に選択される。移 植のために適切な妊娠日齢でブタの皮質細胞を選択するために、採用できるパラ メーターの例は、以下を含む：（１）皮質細胞は好ましくは、例えば³Ｈ−チミ ジン取り込みにより決定できるような、最近有糸分裂した後である。例えば最も 暗い核をチミジン適用の後に示す細胞は、分割が適用直後に止まったものであり 、そしてそれゆえに最近有糸分裂した後である；（２）皮質細胞は好ましくは細 胞中に移動しているか、または最近それらの最終的な運命に到達した；および（ ３）皮質細胞は好ましくは精巧な神経プロセスには送られず、これは例えば単離 中に別れるとき、細胞死を生じることができる。異種移植個体、特にヒトへの移 植に適するブタの皮質細胞を得る、胎児のブタの好適な妊娠日齢は、妊娠の約２ ７日から約５０日の間、より好ましくは２７日から４０日の間、さらに好ましく は２７日から３９日の間、一層好ましくは２７日から３８日の間、さらに一層好 ましくは２７日から２７日の間、そして最も好ましくは３１日から３４日の間で あることが判明した。 ブタの皮質細胞（例えば、胎児のブタの皮質細胞）を含んで成る細胞培養物、 ここで少なくとも１つの神経プロセスを有する好ましくは少な くとも約10％、より好ましくは少なくとも約20％、さらに好ましくは少なくとも 約30％、一層好ましくは少なくとも約40％、そして最も好ましくは少なくとも約 50％以上の細胞が本発明の意図するものである。本発明のさらなる観点では、単 離したブタの皮質細胞を含むが、これは異種移植個体に移植される際に、少なく とも１つの神経プロセスを個体の脳内の少なくとも１つの皮質下の標的領域に広 げる。脳内の典型的な皮質細胞遠心性標的には、脳梁、帯状束、内包および大脳 脚を含む。Ｂ．単離されたブタ線条体細胞群、個体に移植された時にGABA-作用性の伝達を 増強させる単離されたブタ線条体細胞群、および単離された皮質細胞群 また本発明は、ブタ線条体から得た単離細胞群も特徴である。線条体の位置お よび成分は上述する。本明細書で使用するように、用語「単離した」とは、自然 な環境から分離された細胞または細胞群を言う。この用語は、自然環境からの粗 い物理的分離、例えば供与体動物（例えばブタ）からの取り出し、および例えば 解離により細胞と直接接している隣接細胞との関係の変化を含む。用語「単離さ れた」は、組織区分中の、組織区分の一部として培養される、または組織区分の 状態で移植される細胞または細胞群を呼ばない。ブタの神経細胞の群を呼ぶため に使用する時、用語「単離された」は、本発明の単離された細胞の増殖から生じ る細胞群を含む。用語「群」は、２つ以上の細胞の群を含むとする。細胞群中の 細胞は、同じ、または異なる供給源（１つまたは複数）、例えば同じブタまたは 数頭の異なるブタから得ることができる。しかし、細胞は同じ細胞型である必要 はない。ブタの線条体から得た細胞は、例えば限定するわけではないが神経細胞 および神経祖先細胞を含む、種々の 範囲の細胞型を含むことができる。例えば、ブタ線条体細胞（または他の本発明 の神経細胞群）の単離された群は、神経細胞、神経祖先細胞、グリア細胞、グリ ア祖先細胞、上皮細胞および造血細胞を含むことができる。祖先または前駆体細 胞は、例えば種々の染色によりコミットされている(committed)細胞から識別で きる。例えば神経およびグリア細胞前駆体はビメンチンを発現し、そしてビメン チン−特異的染色を用いて同定でき、一方成熟神経細胞およびグリア細胞は、一 般的にビメンチンを発現しない。さらに神経およびグリア細胞前駆体は、神経上 皮幹細胞抗原（NESTIN）について染色することにより、それらのコミットされて いる対から識別できる。神経およびグリア細胞前駆体染色は、NESTINについて陽 性であり、一方それらのコミットされている対は染色されない。Frederiksen,K. ら(1988)J.Neurosci.8:1144-1151。 １つの態様では、単離されたブタ線条体細胞群は、胎児のブタ線条体から得ら れ、そして少なくとも神経祖先細胞を含む。胎児のブタの線条体細胞は、好まし くは胎児のブタから、約２０日から約５０日の間、より好ましくは約３０日から ４０日の間、さらにより好ましくは約３１日から約３８日の間、そして最も好ま しくは約３４日から約３６日の間で得る。 本発明のブタの線条体細胞は、好ましくは線条体の神経節隆起（すなわち、側 方および／または中央神経節隆起）から得られるが、より好ましくはブタの線条 体の側方神経節隆起から、本明細書に記載の好適な妊娠日齢で得られる。 １つの態様ては、単離されたブタの線条体細胞群は少なくとも２つの異なる細 胞型を含む。好ましくはこれらの細胞型は、神経祖先細胞およ びグリア細胞である。単離されたブタの線条体細胞群に含むことができるグリア 細胞の例は、クラスターオブ−ディファレンシエーションファクター44(CD44、H -CAMまたはヘルメス抗原としても知られている)を発現するグリア細胞である。C D44は、滑膜、粘膜およびリンパ節のＴ細胞／内皮細胞相互作用において、ヒア ルロン酸塩を細胞表面に結合する(Asher,R.およびBignani、A.(1992)Exp.Cell.R es.203:80-90)ことに関与した、約90kDの細胞表面糖タンパク質である(Hale,L.P .ら、(1989)J ．Immunol.143:3944-3948)。CD44はグリア細胞のサブセットにより 、ヒトＣＮＳ白質中に、および幾つかの灰白質構造の神経網内に発現される。(V bgel,E.ら、(1992)J.Neurocytol.21:363-373)。ブタの線条体CD44-免疫反応性グ リアは、ブタの線条体細胞が個体に導入された時に、ブタの線条体移植片から周 辺組織に線条体の軸索成長を促進する基質および他の影響物質（例えば、神経栄 養因子）を提供する。 本発明の別の観点は、異種移植個体に導入された時にGABA-作用性の伝達を移 植されたブタの線条体細胞が集まる領域内およびその回りに増強させる、単離さ れたブタ線条体細胞群に関する。典型的には、GABA（ガンマ−アミノ酪酸）-作 用性の伝達を増強させるブタ線条体細胞は、側方の神経節隆起に由来する。好適 な態様では、ブタ線条体細胞は胎児のブタの線条体に由来する。句「GABA-作用 性の伝達を増強する」とは、本発明のブタ線条体が導入された異種移植個体中の ガンマ−アミノ酪酸の産生が、ブタ線条体細胞以外のブタ神経細胞またはブタ神 経祖先細胞が導入された異種移植個体中のガンマ−アミノ酪酸の産生よりも多い ことを含むものとする。 本発明は、ブタの単離された皮質細胞群、好ましくは例えば本明細書 に記載の妊娠日齢の胎児のブタの皮質細胞が特徴である。用語「単離された」お よび「群」も、本明細書で説明する。Ｃ．本質的に病原体を含まないブタから単離したブタの神経細胞 また本発明は、細胞の異種移植受容体個体、例えばヒト受容体に、感染または 病気を伝播できる生物または物質を本質的に含まないブタから単離したブタの神 経細胞が特徴でもある。典型的には、ブタの神経細胞を、ヒト病原体を本質的に 含まないブタから単離する。例えば、ブタが含まない病原体の例には、限定する わけではないが、以下の病原体のカテゴリーからの１つ以上の病原体を含む：寄 生虫、細菌、マイコプラズマおよびウイルス。句「本質的に生物を含まない」（ 本明細書では、「本質的に病原体を含まない」とも言う）とは、細胞が単離され るブタに関する時、異種移植受容体、例えばヒトに感染または病気を伝播できる 量でブタに生物が存在しないことを意味する。実施例VIIは各々、限定するわけ ではないが本質的に種々の生物を含まないブタの選択法を提供する。そのような 生物を本質的に含まないと定められた胎児または出生後のブタを、神経細胞の供 給源として使用するまで、適切な条件下で維持する。 本質的に病原体を含まないブタから単離した好適な神経細胞は、皮質細胞、中 脳細胞および線条体細胞を含む。これらの細胞を単離する最適なブタの妊娠日齢 は、本明細書に詳細に記載する。本質的に病原体を含まないブタから単離したブ タの神経細胞は、本明細書に記載されたようにさらに改質して、異種移植個体中 に移植した後に、細胞の免疫原性を下げることができる。 II ．本発明の方法 Ａ．本質的に病原体を含まないブタからのブタの神経細胞の単離法 本発明の別の観点は、細胞の異種移植受容体に感染または病気を伝播できる生 物または物質を本質的に含まないブタから、神経細胞を単離する方法に関する。 この方法に従い、ブタを細胞の異種移植受容体、例えばヒト受容体に感染または 病気を伝播できる生物または物質の存在または不在について試験する。そのよう な生物は、限定するわけではないが、以下の病原体のカテゴリーの１つ以上の病 原体を含む：寄生虫、細菌、マイコプラズマおよびウイルス。 神経細胞組織の単離法は、当該技術分野で既知である。例えば固体の神経組織 試料を周辺の脳組織から、例えば顕微鏡下の組織切開により切開することができ る。次に神経組織試料中の細胞は、機械的手段（例えば切り刻み、および／また は連続的なピペットトリチュレーション）により、あるいは化学的手段（例えば 酵素）により解離することができる。神経細胞の供給源として本発明の方法に使 用するブタには、胎児のブタ（ブタ胎児）および出生後のブタを含む。もし胎児 のブタを神経細胞の供給源として使用するならば、本質的に疾病伝播生物を含ま ないと試験された雄ブタからの精液を、そのような生物を本質的に含まない雌ブ タに人工的に注入するために使用する。選択した妊娠日齢（例えば、本明細書に 記載の細胞型、例えば皮質細胞、中脳細胞または線条体細胞の妊娠日齢）で、子 宮摘出を適当な滅菌条件下で行い、そしてその後、胎児をそれぞれの個体の羊膜 嚢から取り出す。その後、適当な神経細胞または組織を適当な滅菌条件下で回収 する。 受容体個体に感染または病気を伝播する生物または物質を本質的に含まないブ タを、広範な細胞(例えば、神経細胞)の供給源として使用で きる。本発明の方法に従い、単離できるブタの神経細胞は、例えば本明細書に詳 細に記載した皮質細胞、中脳細胞および線条体細胞を含む。本質的に病原体を含 まないブタから単離したブタの神経細胞を、本明細書に記載のようにさらに改質 できる。Ｂ．改質されたブタの神経細胞を使用して、異種移植個体の脳の神経変性疾患に よる神経的欠乏を処置する方法 さらに本発明の観点は、異種移植個体、特にヒト個体の脳の神経変性疾患によ る神経的欠乏を処置する方法に関し、この方法ではブタの神経細胞を個体の脳内 の神経変性領域に導入する。本明細書で使用するように「神経的欠乏」とは、正 常な神経的機能の障害または不在、あるいは異常な神経的機能の存在を含む。ブ タの神経細胞は、非改質状態で、異種移植個体中の細胞に対して免疫応答を刺激 できる、少なくとも１つの抗原を細胞表面上に有する。異種移植個体に導入され た時に、細胞の拒絶を抑制するために、移植前に細胞表面上の抗原を変化させる 。本明細書で使用するように用語「導入する」、「移植する(implanting)」また は「移植する(transplanting)」は、互換的に使用する。本発明のブタの神経細 胞は個体に、細胞を個体の所望する位置に送達する任意の適当な経路により導入 される。例えば、個体の脳内に細胞を投与する通常の方法は、脳の神経変性領域 中への細胞の直接的な定位的注入による。例えば、Bjorklund,A.ら、(1983)Acta Physiol.Scand.Suppl .522:1-75を参照にされたい。細胞は、緩衝塩溶液のよう な生理的に適合性のあるキャリアー中で投与される。ヒト個体の脳内の片側の神 経変性による神経的欠乏を処置するために、約1200−2000万個の本発明の神経細 胞が神経変性の領域に導入される。両側で起こる脳の神経変性領域を持つヒトに は、 約1200−2000万個の本発明の神経細胞が、各神経変性領域へ導入され、全部で24 00−4000万個の神経細胞が必要である。約200万個の神経細胞が、各胎児のブタ から回収できる。したがって、約２−約12匹の胎児ブタ(約１リットルの胎児の ブタ)が、一般的にヒト個体へ導入するための適切な細胞数を得るために使用さ れる。 本発明の細胞は、細胞の個体への導入を容易にする送達デバイス（例えば、注 射による）中に挿入することができる。そのような送達デバイスは、細胞および 流体を受容体個体の体内に注入するための管（例えばカテーテル）を含む。好適 な態様では、この管はさらに針、例えばシリンジのような針を有し、これを通っ て本発明の細胞を個体の所望の位置に導入することができる。本発明のブタの神 経細胞を、そのような送達デバイス（例えばシリンジ）中に溶液状態で挿入でき る。あるいは、そのような送達デバイス中に含まれる時、細胞を支持マトリック スに埋め込むことができる。本明細書で使用するように、用語「溶液」は、中に 本発明の細胞が生存して留まる、医薬的に許容できるキャリャーまたは希釈剤を 含む。医薬的に許容できるキャリャーおよび希釈剤には、塩溶液、水性緩衝液、 溶媒および／または分散媒質を含む。そのようなキャリャーおよび希釈剤の使用 は、当該技術分野では周知である。溶液は好ましくは滅菌されており、そして容 易にシリンジを利用できる程度の流体である。好ましくは溶液は製造および保存 条件下て安定であり、そしてパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコ ルビン酸、チメロサール等の使用を通して、細菌およびカビのような微生物の混 入作用に対して保護されている。本発明の溶液は、本明細書に記載のブタの神経 細胞を医薬的に許容できるキャリャーまたは希釈剤、および必要に応じ て上記に列挙した他の材料に包含し、続いて濾過滅菌することにより調製できる 。 中にブタの神経細胞が取り込まれ、または埋め込まれる支持マトリックスには 、受容体−適合性があり、かつ受容体に無害な生成物に分解するマトリックスを 含む。天然および／または合成の生分解性マトリックスは、そのようなマトリッ クスの例である。天然の生分解性マトリックスには、コラーゲンマトリックスを 含む。合成の生分解性マトリックスには、ポリアンヒドリド、ポリオルトエステ ルおよびポリ乳酸のような合成ポリマーを含む。 本発明の方法は、脳内の神経変性から生じた神経的欠乏を表しているヒト個体 を処置するために特に有用である。そのような脳の神経変性は、疾患、傷害およ び／または加齢から生じる。本明細書で使用するように、神経変性には、神経細 胞または神経細胞群の形態的および／または機能的異常を含む。限定するわけで はないが、形態的および機能的異常には、身体的な衰え、および／または神経細 胞の死、神経細胞の異常な成長パターン、神経細胞間の物理的連結における異常 、神経細胞による物質（１つまたは複数）（例えば、神経伝達物質）の不十分な 、または過剰生産、神経細胞が通常生産する物質（１つまたは複数）を生産でき ない、異常なパターンまたは異常な時期の物質生産（例えば神経伝達物質）、お よび／または電気的なインパルスの伝達を含む。神経変性は個体の脳の任意の領 域で生じることができ、そしてこれは、例えば頭部外傷、発作、ＡＬＳ、多発性 硬化症、ハンチントン病、パーキンソン病およびアルツハイマー病を含む多くの 疾患で見られる。 本発明の１つの態様では、好ましくは妊娠の約３１日から３８日の間 の胎児のブタの側方神経節隆起から得たブタの線条体細胞を、基底神経節、例え ば線条体(striatum)または線条体(corpus striatum)、尾状核および被殻を形成 する１つまたは両方の核中で起こる神経変性による神経的欠乏を処置するために 、ヒト個体の脳に移植する。ハンチントン病での神経変性は、典型的にはこれら 領域中の変性が関与する。妊娠の約３１日から３８日で胎児のブタの側方神経節 隆起から得た線条体細胞も、影響を受けた脳領域、例えば癲癇の個体の癲癇病巣 で生じる神経変性による神経的欠乏を処置するために、ヒト個体の脳内に移植で きる。限定するわけではないが、そのような領域の例には海馬のCAl領域、扁桃 、帯状核、エントリヒナル(entorhinal)皮質および黒質を含む。 別の態様では、好ましくは胎児のブタの腹側中脳から妊娠の約２６日から２８ 日、好ましくは約２７日に得た中脳細胞を、非線条体領域内で起こる神経変性、 例えばパーキンソン病で起こる神経変性による神経的欠乏を処置するために、ヒ ト個体の脳に移植する。ヒトのパーキンソン病は、主に皮質下構造、特に黒質お よび青斑に影響を及ぼす。黒質中のドパミンニューロンの損失が特徴であり、こ れはそれらの主な標的器官として基底神経節を有する。 さらに別の態様では、好ましくは胎児のブタの皮質から妊娠の約２７日から４ ０日に得たブタの皮質細胞を、皮質で起こる神経変性による神経的欠乏を処置す るために、ヒト個体の脳に移植する。皮質の神経変性は、影響を受けた皮質の領 域に依存して、種々の疾患を生じる。例えば、頭部外傷および発作は、皮質のす べての領域および脳幹での神経変性に付随し；ＡＬＳは運動皮質および脳幹での 神経変性に付随し；ハンチントン病は、線条体および運動皮質での神経変性に付 随し；そしてアルツ ハイマー疾患は、海馬、新皮質、主前頭葉、頂頭葉および前区側頭葉、ならびに 扁桃および臭覚系での神経変性に付随する。 本発明のブタの神経細胞の、ヒト個体の脳（１つまたは複数の神経変性領域） への移植は、傷害を受けた神経回路の再構成および／または失ったニューロンお よび神経伝達物質系の交換を生じる。用語「個体」は、傷害を受けた、加齢の、 および／または疾患に関連した神経変性が疑われる哺乳類、特にヒトを含むもの とする。また用語「個体」は、免疫応答が同種移植または異種移植細胞に対して 現れる哺乳類を含む。個体の例には、霊長類（例えばヒトおよびサル）を含む。 本明細書で使用するように「異種移植個体」とは、別の種の細胞が移植される、 または移植される予定の個体である。ブタの神経細胞は、傷害を受けた神経回路 を再構成し、かつ／または失ったニューロンおよび神経伝達物質系を交換するた めに、神経変性により引き起こされる神経的欠乏の少なくとも一部の矯正が存在 するような適当量で個体に導入される。好適なブタの神経細胞は、胎児のブタか ら得られ、そして本明細書に詳細に記載した胚の日齢で選択された中脳細胞、線 条体細胞および皮質細胞である。 個体の脳内の神経変性領域に導入する前に、ブタの神経細胞をそれらの神経再 生能力を増大させ、かつ／または免疫拒絶を抑制するために改質することができ る。ブタの神経細胞は、上記に詳細に説明したように、少なくとも１つの免疫原 性細胞表面抗原（例えばＭＨＣクラスＩ抗原）の変化により、異種移植個体への 導入に適当するようにすることができる。同種移植または異種移植の移植受容体 中で、移植されたブタの神経細胞の拒絶を抑制し、そして免疫的な非−応答性を 達成するために、本発明の方法は、個体に導入される前にブタの線条体細胞表面 上の免疫原 性抗原の変化を含むことができる。このブタの神経細胞表面上の１つ以上の免疫 原性抗原を変化させる工程は、単独で、または個体に個体のＴ細胞活性を抑制す る薬剤を投与することと組み合わせて行える。あるいはブタの神経細胞移植片の 拒絶の抑制は、ブタの線条体細胞表面上の免疫原性抗原の変化前の不在下で、個 体のＴ細胞活性を抑制する薬剤を個体に投与することにより行うことができる。 本明細書で使用するように、Ｔ細胞活性を抑制する薬剤は、個体のＴ細胞の除去 （例えば封鎖）、またはＴ細胞破壊、または個体中のＴ細胞機能の抑制（すなわ ち、Ｔ細胞は個体中に未だに存在するが、それらが増殖できないか、またはエフ ェクター機能、例えばサイトカイン生産、細胞毒性等を発現または行うことがで きないような、非−機能的な状態である）を生じる薬剤と定義する。用語「Ｔ細 胞」とは、成熟末梢血Ｔリンパ球を包含する。Ｔ細胞活性を抑制する薬剤は、未 成熟Ｔ細胞（例えば胸腺細胞）の活性または成熟化も抑制することができる。 受容体個体のＴ細胞活性を抑制するために使用する好適な薬剤は、免疫抑制薬 である。用語「免疫抑制薬または薬剤」は、正常な免疫機能を抑制または妨害す る薬剤を含むことを意図する。好適な免疫抑制薬は、シクロスポリンＡである。 他の使用できる免疫抑制薬には、FK506およびRS-61443を含む。１つの態様では 、免疫抑制薬を少なくとも1つの他の治療剤と組み合わせて投与する。投与でき るさらなる治療薬は、ステロイド（例えば、プレドニソン、メチルプレドニソン およびデキサメタソンのようなグルココルチコイド）および化学療法剤（例えば 、アザチオプリンおよびシクロホスホアミド）を含む。別の態様では、免疫抑制 薬をステロイドおよび化学治療薬の両方と組み合わせて投与する。適当 な免疫抑制薬は市販されている（例えば、シクロスポリンＡはニュージャージー 州、イーストハノーバーのサンドス社：Sandoz,Corp.から入手できる）。 免疫抑制薬を、投与経路に適合する組成で投与する。適当な投与経路は、静脈 注射（単回注入、多回注入または時間をかける静脈点滴のいずれか）、腹腔内注 射、筋肉内注射および経口投与を含む。静脈注射には薬剤を、滅菌されており、 かつシリンジを利用できる生理的に許容できるキャリアーまたは希釈剤（例えば 、緩衝塩溶液）に溶解できる。薬剤の分散液も、グリセロール、液体ポリエチレ ングリコール、およびそれらの混合物中に、および油中に調製できる。免疫抑制 薬に便利な投与経路およびキャリアーは、当該技術分野で周知である。例えばシ クロスポリンＡは、塩溶液中で静脈投与でき、またはオリーブ油もしくは他の適 当なキャリアーまたは希釈剤中で経口、腹腔または筋肉投与できる。 免疫抑制薬は、所望の治療効果を達成するために十分な投与量で受容体個体に 投与される（例えば、移植した細胞の拒絶反応を抑制する）。一緒に投与できる 免疫抑制薬および他の薬剤（例えば、ステロイドおよび化学療法剤）の投与量範 囲は、当該技術分野で周知である(例えば、Freedら、New Engl.J.Med.(1992)327 :1549:Spencerら、(1992)New Engl.J.Med ．327:1541;Winderら、(1992)New Engl .J.Med ． 327:1556;Lindvallら、(1992)Ann.Neurol.31:155;およびLindvallら、( 1992)Arch.Neurol.46:615を参照にされたい)。ヒトを処置するために適当な免疫 抑制薬の好適な投与量範囲は、１日あたり約１−30mg/kg体重である。シクロス ポリンＡの好適な投与量範囲は、１日あたり約１−10mg/kg体重、より好ましく は１日あたり約１−５mg/kg体重である。投与量は受容体 個体の血清中の免疫抑制薬の最適レベルを維持するために調整できる。例えばヒ ト個体中のシクロスポリンＡについて投与量は、約100-200ng/mlの好適な血清レ ベルを維持するために調整できる。投与量の値は、個体の疾患状態、年齢、性別 および体重のような因子に従い、変動してよい。投薬は個人の必要性、および投 与し、そして組成物の投与を管理する人の専門的判断に従い、最適な治療反応を 提供するように時間をかけて調整され、そして本明細書で設定した投与量の範囲 は例示のみであり、そして特許請求する組成物の範囲およびプラクティスを限定 するものではない。 本発明の１つの態様では、個体中の移植細胞の耐容を誘導するために十分な時 間、免疫抑制薬を一時的に個体に投与する。免疫抑制薬の一時的な投与は、長期 の移植片−特異的耐容を移植片受容体に誘導すると判明した(Brunsonら、(1991)Transplantation 52:545；Hutchinsonら、(1981)Transplantation 32:210;Green ら、(1979)Lancet 2:123；Hallら、(1985)J.Exp.Med.162:1683を参照にされたい )。薬剤の個体への投与は、細胞を個体に移植する前に始めることができる。例 えば、薬剤投与の開始は、移植の数日前（例えば１−３日）であることができる 。あるいは薬剤投与は、移植当日または移植の数日後（一般的に３日より長くは ない）に始めることができる。薬剤の投与は、薬剤の投与が終了した時に、受容 体により供与体細胞が続いて受け入れられるように、供与体細胞−特異的耐容を 受容体中に誘導するために十分な時間、続けられる。例えば、薬剤は短くても移 植後３日間、または長くても３カ月投与できる。典型的には、薬剤は移植後少な くとも１週間、しかし１カ月よりは長くなく投与する。個体中に移植した細胞に 対する耐容の誘導は、 免疫抑制薬の投与を止めた後に移植細胞が連続して受け入れられることにより示 される。移植組織の受容は、形態学的に（例えば、移植組織の検査またはバイオ プシーによる皮膚の移植片を用いて）、あるいは移植片の機能的活性の評価によ り測定できる。 個体中でＴ細胞活性を抑制するために使用できる別の種類の薬剤は抗体または その断片または誘導体であり、これは受容体中のＴ細胞を消費または封鎖する。 個体中に投与された時にＴ細胞をインビボで消費または封鎖できる抗体は、当該 技術分野で周知である。典型的には、これらの抗体はＴ細胞表面上の抗原に結合 する。ポリクローナル抗血清、例えば抗−リンパ球血清を使用できる。あるいは 、１つ以上のモノクローナル抗体を使用できる。好適なＴ細胞消費抗体には、Ｔ 細胞表面上のCD2、CD3、CD4またはCD8に結合するモノクローナル抗体を含む。こ れらの抗原に結合する抗体は、当該技術分野で周知であり、そして市販されてい る（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション）。ヒトＴ細胞上のCD3 に結合するために好適なモノクローナル抗体は、OKT3(ATCC CRL8001)である。抗 体のＴ細胞上の表面抗原との結合は、個体中のＴ細胞の封鎖を容易にし、かつ／ または内因性の機構により個体中のＴ細胞の破壊を容易にできる。あるいは抗体 がＴ細胞に結合した時にＴ細胞の破壊を容易にするために、Ｔ細胞表面の抗原に 結合するＴ細胞−消費抗体を、トキシン（例えばリシン）または他の細胞毒性分 子（例えば放射性同位体）に結合できる。本発明に使用できる抗体の生成に関す るさらなる詳細は、国際特許出願公開第95/26740号明細書を参照にされたい。 受容体個体中のＴ細胞活性を抑制するために使用できる別の種類の抗体は、Ｔ 細胞増殖を抑制する抗体である。例えば、IL-2のようなＴ細胞 増殖因子に対する抗体、またはIL-2レセプターのようなＴ細胞増殖因子レセプタ ーは、Ｔ細胞の増殖を抑制できる(例えば、DeSilva,D.R.ら、(1991)J.Immunol.1 47:3261-3267を参照にされたい)。したがって、IL-2またはIL-2レセプター抗体 は、移植された細胞の拒絶を抑制するために受容体に投与できる(例えば、Wood ら、(1992)Neuroscience 49:410を参照にされたい)。さらにIL-2およびIL-2レセ プター抗体の両方をＴ細胞活性を抑制するために同時に投与するか、または別の 抗体と共に投与できる（例えば、Ｔ細胞上の表面抗原に結合する）。 受容体中でＴ細胞を消費、封鎖または抑制する抗体は、移植に際して細胞の拒 絶を抑制するための投与量および適当な期間で投与できる。抗体は好ましくは、 医薬的に許容できるキャリャーまたは希釈剤中（例えば、滅菌塩溶液で静脈に投 与される。抗体投与は、移植前に始め（例えば、移植の１−５日前）、そして所 望の効果を達成するためにに移植後も毎日続けることができる（例えば、最高移 植の１４日後まで）。抗体をヒト個体へ投与するための好適な範囲は、１日あた り約0.1−0.3mg/kg体重である。あるいは単回の高投与量の抗体(例えば、投与量 約10mg/kg体重のボーラス)をヒト個体に、移植日に投与できる。抹消血からＴ細 胞を消費する抗体処置の効果は、抗体処理前および後の個体から採血した血液試 料中のＴ細胞計数を比較することにより定められる。投薬は個人の必要性、およ び組成物を投与し、そして管理する人の専門的判断に従い、最適な治療反応を提 供するように時間をかけて調整される。本明細書で説明した投与量の範囲は例示 のみであり、そして特許請求する組成物の範囲またはプラクティスを限定するも のではない。 別の態様では、例えば神経再生能力を増大するために、本発明のブタ の神経細胞（例えば、神経細胞、神経祖先細胞）を遺伝的に工作して、外来分子 （例えば、神経栄養因子、神経伝達物質または神経保護剤）を発現および／また は分泌するようにする。さらに、非改質または改質したブタの神経細胞を、有用 な機能を行うように遺伝的に改質した別の種類の細胞（例えば、ブタの線条体に 由来する他の細胞、または他の起源に由来する細胞）と一緒に、異種移植個体の 脳に導入できる。例えば、個体の脳内の神経変性領域中のニューロンの成長を促 進するために、ブタの線条体に由来する神経祖先細胞を、例えば神経栄養因子を 分泌するように改質された別の細胞と一緒に神経変性の領域へ移植できる。導入 遺伝子の個体脳へのキャリャーとして作用する細胞の例は、繊維芽細胞(Fisher, L.J.ら、(1991)Neuron 6:371-380;Rosenberg,M.B.ら、(1988)Science 242:1575- 1578)、アドレナル クロマフィン細胞(Cunningham,L.A.ら(1991)Brain Res.561 :192-202)、星状細胞(Suhr,S.T.およびGagemF.H.(1933)Arch.Neurol.50(11):125 2-1268)、および筋芽細胞(Jiao,S.ら、(1993)Nature 362:450-453;Jiao,S.ら、( 1992)Brain Res.575:143-147;Jiao,Sら、(1992)Hum.Gene Ther.3:21-33)を含む 。例えば、繊維芽細胞、グリア細胞のような細胞も、レトロウイルス含有遺伝子 （例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子）を運ぶために使用でき、その 遺伝子産物は、それらの成長を抑制するために細胞（例えば腫瘍細胞）を標的と するための他の治療薬または薬剤（例えば、ガンシクロビア）の標的である。Cu lver,K.ら(1992)Science 256:1550-1552;Chen,S-Hら、(1994)Proc.Natl.Acad.Sc i.USA 91:3054-3957。あるいは、例えばインプラントの成長および発育を増強さ せるための神経栄養因子を生成するために、神経変性領域に移植されるブタの線 条体に由来する 祖先細胞それ自体を遺伝的に改質する。 神経変性を本発明の方法、または本発明の方法と組み合わせて使用することに より処置できる幾つかのメカニズムがある。例えば、新しい機能は、表現型が有 用な方法で標的細胞（例えば、傷害をうけた神経細胞）に導入できる。新たな機 能は、標的細胞と強固な連結または他の接触を確立できる遺伝的に改質した細胞 （例えば、ブタの線条体細胞、繊維芽細胞、筋芽細胞等）を導入することにより 、そのように不完全な標的細胞（例えば、傷害をうけた神経細胞）中で発現する ことができる。そのような接触の中には、代謝的に重要な小分子を１つの細胞か ら別の細胞へと効率的に拡散させ、受容体細胞の表現型の変化を導くことができ る、と知られているものもある。Lowenstein,W.R.(1979)Biochim.Biophys.Acta. 560:1-66。この過程は「代謝協同」と呼ばれ、そして繊維芽細胞とグリア細胞と の間で起こることが知られている。Gruber,H.E.ら、(1985)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82:6662-6666。この種の協同性は、CNS-障害後のコリン作用性神経死のNGF- 媒介保護の場合のように、CNS細胞を用いて実証された。Hefti,F.(1986)J.Neuro sci .6:2155;Williams,L.R.ら、(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:9231-9235。 本発明の方法を用いることにより神経変性を処置できる別のメカニズムには、 近くの標的細胞により取り込まれ、そして使用されることができる拡散性の遺伝 子産物を発現または分泌できる、さらに別の遺伝的に改質した細胞の生成を含む 。神経変性疾患の動物モデルを対象として行われた１つの方法は、組織移植を通 して脳内の神経伝達機能を増加させることである。例えば繊維芽細胞系が、コリ ンアセチルトランスフェラーゼを発現するように改質された。改質された繊維芽 細胞はラットの海 馬中に移植され、ここで移植後、繊維芽細胞はアセチルコリンを生産そして放出 し続ける。Fisher,L.J.ら、(1993)Ann.N.Y.Acad.Sci.695:278-284。繊維芽細胞 もチロンシヒドロキシラーゼ(チロンシをL-DOPAに転換する)を生産するように遺 伝的に改質され、そしてすでに6-ヒドロキシドパミン損傷をもつ受容体ラットの 線条体に移植された。移植された繊維芽細胞は、宿主の線条体中でチロンシをL- DOPAに転換し続け、そして行動的測定を通して評価されるように、宿主の脳に影 響を与え続ける。Fisher,L.J.ら(1991)Neuron 6:371-380。 神経変性疾患の動物モデルを対象として行われた別の方法は、神経生長因子(N GF)(これはニューロンの成長および発生を維持し、損傷が誘導する死を防ぎ、そ して軸索発生および再生の成長を神経変性領域に誘引する）ような神経栄養因子 を送達することである。繊維芽細胞は、ＮＧＦを分泌するように改質できる。こ れらの繊維芽細胞がラットのような個体の線条体に導入された時、これらはエキ サイトトキシン(excito toxin)-誘導損傷からニューロンを保護する。Schumache r,J.M.ら(1991)Neuroscience 45(3):561-570。本発明のブタの線条体細胞および ブタの線条体細胞と一緒に移植される他の細胞型は、さらにグリア細胞系−由来 神経栄養因子(GDNF)（中脳ドパミン作用性ニューロンを強化する有力な神経栄養 因子）を発現するように遺伝的に操作できる(Leu-Fen.H.ら、(1993)Science 260 :1130-1132)。 個体に導入される細胞は、移植前にインビトロで遺伝的に改質されるか、また は代わりに細胞は移植後インビボで直接改質できる。Suhr,S.T.およびGage,F.H. (1993)Arch.Neurol.50(11):1252-1268；Gage F.H.ら(1987)Neuroscience.23(3): 795-807。種々の方法がブタの神経細胞の ような供与体細胞を、受容体個体へ移植する前に遺伝的に改質するために利用可 能である。これらの方法には直接的なＤＮＡ取り込み（トランスフェクション） 、およびウイルスベクター（レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイル スおよびアデノ−随伴ウイルスベクターのような）を用いた感染を含む。Shur,S .T.ら、(1993)Arch.Neurol.50(11):1252-1268。トランスフェクションは沈殿し たＤＮＡのエンドサイトーシス、ＤＮＡを含むリポソームの融合またはエレクト ロポレーションにより行うことができる。Suhr,S.T.ら、(1993)Arch.Neurol.50: 1252-1268。供与体細胞をトランスフェクションする別の方法は、「遺伝子銃(ge negun)」の使用を介する。この方法では、微細なＤＮＡ−被覆粒子を焦点管を通 して高速度で加速し、そしてインビトロ(Klein,R.M.ら、(1992)Biotechnology 2 4:384-386；Zelenin,A.V.ら、(1989)FEBS Lett.244:65-67)またはインビボ(Zele nin,A.V.ら、(1991)FEBS Lett.280:94-96)の細胞中に「打つ」または注入する。 この細胞は創傷部位の回りに近ずき、そして粒子上の細胞に運ばれる遺伝子を発 現する。 レトロウイルスベクターは、典型的に外来遺伝子を細胞中、特に哺乳類細胞中 に導入および発現する最も効率的な、かつ特徴が明らかな手段を提供する。これ らのベクターは大変広範な宿主および細胞型の範囲を持ち、合理的に良く理解さ れたメカニズムにより宿主ゲノムの不規則部位に組み込まれ、遺伝子を安定かつ 効率的に発現し、そしてほとんどの条件下でそれらの宿主細胞を殺したり、また は明らかに害を与えることはない。レトロウイルスベクターの調製法は、文献に 広く記載され（Suhr,S.T.およびGage,F.H.(1993)Arch.Neurol.50(11):1252-1258 ;Ray,J.およびGage,F.H.(1992)Biotechniques 13(4):598-603;Anderson,W.F.(1 984)Science 226:401-409:Constantini,F.ら、(1986)Science 233:1192-1194;Gi lboa,E.ら(1986)Biotechniques 4:504-512;Mann,R.ら、(1983)Cell 33:153-159; Miller,A.D.ら(1985)Mol.Cell.Biol.5:431-437;およびReadhead,C.ら、(1987)Ce ll 48:703-712）、そして現在は多くの研究室で共通に使用されている。他の遺 伝的に改質された細胞の生成法は、国際特許出願公開第95/27042号明細書に詳細 に記載されている。その出願内容は、引用により本明細書に編入される。 Ｃ．ブタ線条体細胞を使用する異種被験体の脳の神経変性による神経学的欠損の 治療方法 異種被験体の脳の神経変性による神経学的欠損の治療のために本明細書で開示 されるひとつの方法は、当該被験体の脳の神経変性領域へのブタ線条体細胞の導 入を包含する。本発明の方法での使用で好まれるブタ線条体細胞は、線条体の外 側神経節隆起から得られるブタ胚線条体細胞である。線条体の外側神経節隆起が 得られるブタ胚は、外側および内側の神経節隆起が形態学的に互いに区別され得 る妊娠齢のものである。一般には、これらの領域は、妊娠約20日と約50日、より 好ましくは約30日と40日、さらにより好ましくは約32日と約38日、そして最も好 ましくは約34日と約36日の間のブタ胚で形態学的に明確である。 ブタ胎児の脳から外側神経節隆起を切開するには、胎児を断頭し、そして脳を 正中矢状切開により頭蓋から摘出する。傍矢状切開を各半球の背面に沿って創造 し、脳側室の腹側外側壁に内側および外側神経節隆起を露出させる。この切開は その後円周状に完遂され、半球の腹側外側壁（神経節隆起をもつ）を脳の残部よ り引き離す。半球の引き離された壁の外側（皮質性）の表面を、その後、しっか りした支持体（例えば切開 用皿）で平らにならし、それにより内部表面上に神経節隆起が露出する。内側隆 起を切除する。今や脳側室の引き離された壁上に単離された外側神経節隆起をそ の後、その底部に沿って切除（例えば湾曲した微小ハサミで）し、そして分離用 の適切な容器（例えばペトリ皿）に移す。 外側神経節隆起が内側神経節隆起から分離されれば、外側神経節隆起細胞を、 ブタ胎児線条体細胞の単離に適する条件下で分離する。これらの条件下では、細 胞が分離される溶液の成分は、生存可能な線条体細胞の最も高いパーセントを維 持するように調整される。例えば、好まれる分離溶液では、カルシウム、マグネ シウム、重炭酸塩およびフェノールレッドを含まないハンク(Hank)の平衡塩溶液 が使用される。これらの成分は分離後に生存可能な細胞のパーセントを低減させ ることが見出されているためである。加えて、分離の間に細胞上に置かれるずり 応力(shear strain)の量を低減するための予防措置が取られる。これらの予防措 置は、分離の間の気泡の創製を最小限とすること、および、ピペットの孔の大き さを徐々に減少させてピペットを通して細胞を穏やかに摩砕することを包含する 。好ましくは、ブタ胎児脳および切開されたブタ胎児脳の部分は、分離前には４ ℃よりもむしろ室温で保存する。 修飾されたもしくは未修飾（未改変）のブタ線条体細胞、およびとりわけブタ 胚線条体細胞が、ハンチントン病のヒト患者に存在するような神経変性に起因す る神経学的欠損の治療に使用され得る。いくつかの異なる動物で神経変性疾患の モデルが開発されており、それに本発明のブタ線条体細胞が移植され得、それら の神経再生能力が評価される。例えば、ハンチントン病のラット（アイザックソ ン(Isacson，O.)ら(1985)ニューロサイエンス(Neuroscience)16:799-817）、ザ ル（カナザワ(K anazawa，I.)ら(1986)Neurosci．Lett．71:241-246）およびヒヒ（ハントレイ(H antraye，P.)ら(1992)プロシーディングス オブ ナショナル アカデミー オ ブ サイエンス ＵＳＡ(Proc．Natl．Acad．Sci．USA)89:4187-4191；ハントレ イ(Hantraye，P.)ら(1990)Exp．Neurol．108:91-014；アイザックソン(Isacson ，O.)ら(1989)Exp．Brain Res．75(1):213-220)のモデルが記述されており、そ れらでの効果的な治療はヒトでの治療の有効性の前兆となる。 例証的実施例として、ハントレイ(Hantraye)らは、尾状核−被殻にイボテン酸 の損傷を受けたヒヒでハンチントン病のモデルを創製している。ハントレイ(Han traye，P.)ら（1992）プロシーディングス オブ ナショナル アカデミー オ ブ サイエンス ＵＳＡ(Proc．Natl．Acad．Sci．USA)89:4187-4191。イボテン 酸で損傷したヒヒは、ヒトでの死後のハンチントン病研究で観察される尾状核− 被殻の神経病理学に類似するそれ、および、ドーパミン作働性の薬理学的活性化 後の舞踏病様運動のような多様な薬物誘発性ジスキネジーを呈する。治療戦略を 評価するため、ブタ線条体細胞およびとりわけ外側神経節隆起から得られるブタ 胚線条体細胞が、ヒヒの尾状核−被殻の損傷された領域内に導入され得る。形態 学的および免疫組織化学的研究がその後、慣習的技術により実行され得、ブタ線 条体移植片が形態学的におよび機能的にの双方で周囲の組織内に統合されるかど うかが決定される。行動試験もまた標準的技術を使用して実行され得、移植片の 周囲の組織との機能的統合が確認される。例えば、エリス(Ellis，J.E.)ら(1992 )Exp．Neurol．115(3):376-387；ハントレイ(Hantraye，P.)ら（1992）プロシー ディングス オブ ナショナル アカデミー オブ サイエンス ＵＳＡ(Proc ．Natl．Acad． Sci．USA)89:4187-4191を参照。本明細書中の実施例３は、行動異常の矯正に帰 着した、サルの損傷された脳領域内への本発明の線条体細胞の移植を記述する。 癲癇の場合は、ラットおよびサルの双方のモデルが存在し、その効果的な治療 はヒトでの治療の有効性の前兆となる。例えば、聴原性癲癇発作を表すラットは 商業的に入手可能である。かように、これらのラットの癲癇の病巣がつきとめら れれば、本発明の細胞、好ましくは本明細書に記述される線条体細胞、または、 ＧＡＢＡを産生するよう遺伝子的に修飾されているグリア細胞もしくは筋肉細胞 のような他の細胞タイプが、癲癇の病巣に移植され得る。癲癇発作の発生および 程度の減少がその後決定され得る。ラットおよびサルの癲癇のモデルはまた興奮 によっても創製され得る。これらの動物での癲癇の病巣がその後つきとめられ得 （例えば、癲癇の病巣は例えば海馬に存し得る）、そして本発明の細胞、好まし くは本明細書に記述される線条体細胞もしくはＧＡＢＡの十分な量を産生する細 胞が、その癲癇の病巣に移植され得る。そうした移植に起因する行動の修飾がそ の後決定され得る。 Ｄ．本質的に病原体を含まないブタから得られるブタ神経細胞を使用する異種被 験体の脳の神経変性による神経学的欠損の治療方法 異種被験体の脳の神経変性による神経学的欠損の治療のための本明細書で開示 される別の方法は、当該被験体に感染もしくは疾患を伝達することが可能である 生物体もしくは物質を本質的に含まないブタから得られる神経細胞を異種被験体 の脳の神経変性領域へ導入することを包含する。受容被験体に感染もしくは疾患 を伝達することが可能である生物体もしくは物質を本質的に含まないブタは、上 に、見出し「本質的に病原 体を含まないブタから単離されたブタ神経細胞」および「本質的に病原体を含ま ないブタからのブタ神経細胞の単離方法」のもとに記述される。神経変性および 神経変性領域は、上に、見出し「修飾（改質）されたブタ神経細胞を使用する異 種被験体の脳の神経変性の治療方法」のもとに記述される。受容被験体に感染も しくは疾患を伝達することが可能である生物体もしくは物質を本質的に含まない ブタから得られる、好まれるブタ神経細胞は、本明細書に記述される線条体細胞 、皮質細胞および中脳細胞を包含する。脳の神経変性領域で神経集団を再構築す るためには、これらの細胞は、それらが標準的技術を使用して由来する脳の領域 と異なる被験体の神経変性領域内へ付加的に導入され得る。例えば、レンフラン ツ(Renfranz，P.J.)ら（1991）セル(Cell)66(4):713-729を参照。 本質的に病原生物体を含まないブタから得られたブタ線条体細胞は、上に、見 出し「ブタ線条体細胞を使用する異種被験体の脳の神経変性による神経学的欠損 の治療方法」のもとに記述されるハンチントン病および癲癇のモデルのようなモ デルでそれらの神経再生能力について評価され得る。同様に、本質的に病原生物 体を含まないブタから得られるブタ中脳細胞は、中脳の神経変性の多様な動物モ デルでそれらの神経再生能力について評価され得る。例えば、パーキンソン病の いくつかの動物モデルが創製されており、そこでの効果的な治療はヒトでの治療 の有効性の前兆となる。これらの動物モデルは、３種のラットモデル（６−ヒド ロキシドーパミン、１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロ ピリジン（ＭＰＴＰ）での処理、もしくは黒質線条体経路の外科的横断切開によ り引き起こされる黒質のドーパミン作働性（作用性）細胞の損傷を有するラット ）（例えばビョルクルンド(Bjorklund，A.) ら（1982）ネイチャー(Nature)298:652-654を参照）、１種のアカゲザルモデル （ＭＰＴＰでの処理により引き起こされる黒質のドーパミン作働性細胞の損傷を 有するサル）（例えば、スミス(Smith，R.D.)ら（1993）ニューロサイエンス(Ne uroscience)52(1):7-16；ベイケイ(Bakay，R.A.)ら（1985）Appl．Neurophysiol ．48:358-361；ザミール(Zamir，N．)ら（1984）Brain Res．322:356-360を参照 ）、および１種のヒツジモデル（ＭＰＴＰでの処理により引き起こされる黒質の ドーパミン作働性細胞の損傷を有するヒツジ）（バシュキン(Baskin，D.S.)ら（ 1994）Life Sci．54(7):471-479）を包含する。パーキンソン病のこれらのモデ ルのいずれかひとつでの治療の有効性はヒトでの治療の有効性の前兆となる。 治療戦略を評価するために、ブタ中脳細胞、およびとりわけ上に記述される本 質的に病原体を含まないブタから得られるブタ胚中脳細胞が、これらの動物モデ ル内に導入され得る。形態学的および免疫組織化学的研究がその後、慣習的技術 により実行され得、当該ブタ中脳移植片が、形態学的におよび機能的にの双方で 、周囲の組織内に統合されるかどうかが決定される。行動試験もまた実行され得 、移植片の周囲の組織との機能的統合が確認される。例えば、普遍的な行動試験 は回転対称性モデルである。フリード(Freed，W.J.)ら（1984）「トランスプラ ンテーション オブ カテコールアミン−コンテイニング ティシューズ トゥ リストア ザ ファンクショナル キャパシティ オブ ザ ダメージド ニグ ロストリアタル パスウェイ(Transplantation of catecholam in-containing t issues to restore the functional capacity of the damaged nigrostriatal p athway)」、スラデク(Sladek，J.R.)（編）ニュ ーラル トランスプランツ：ディベロップメント アンド ファンクション(Neu ral Transplants: Development and Function)」中（プレナムプレス(Plenum Pr ess)、ニューヨーク）373-406。簡単には、動物例えば黒質線条体経路の一側の ６−ヒドロキシドーパミン損傷のあるラットは、アンフェタミンを注入された場 合に損傷された側（同側性）の方向での回転を表す。成功した移植の後は同側性 の回転は抑制され、また、逆（反対側性）に向けられた回転がしばしば観察され る。ブランディン(Brundin，P.)ら（1987）Progress in Brain Res．71:293-308 。回転のデータはその後、同側性の回転から反対側性の回転を差し引くことによ り算出される正味の同側性の回転として記録される。中脳移植片の統合の評価に 使用され得る行動試験の他の例は、グリップ強度試験（デュネ(Dunnett，S.B.) ら（1984）Brain Res．215:147）および水迷路試験（例えば、コピオフ(Kopyov ，O.V.)らTransplantaion Proc．24(2):547-548を参照）を包含する。 治療戦略を評価するために、ブタ皮質細胞、およびとりわけ上に記述される本 質的に病原体を含まないブタから得られるブタ胚皮質細胞が、皮質機能不全の動 物モデル内に導入され得る。皮質の損傷は、例えば、ＮＭＤＡ（ビール(Beal，M .F.)ら（1991）J．Neuroscience 11(1):147-158）を包含する様々な物質により 実験動物中で誘発され得る。形態学的および免疫組織化学的研究がその後、慣習 的技術により実行され得、当該ブタ皮質移植片が、形態学的におよび機能的にの 双方で、周囲の組織内に統合されるかどうかが決定される。行動試験もまた実行 され得、移植片の周囲の組織との機能的統合が確認される。 Ｅ．被験体の脳の神経変性領域内に導入されたブタ神経細胞の生存を増 大する方法 本発明のブタ細胞は、移植のためのそれらの調製のいずれの段階、例えば切開 、トリプシン処理、分離および培養、ならびに／もしくは移植のための細胞懸濁 液の産生の間、インビトロおよび／もしくはインビボすなわち受容被験体での当 該細胞の生存、増殖（生育）および分化を促進する多数の作用物質もしくは因子 とともにインキュベーションされ得、および／もしくはそれらで処理され得る。 ひとつの態様において、そうした作用物質もしくは因子は、本発明の細胞が受容 被験体の移植部位に移植された後にそこに添加され得る。いくつかの例では、こ れらの作用物質は、例えば、移植のために当該細胞を調製するのに使用される処 置に起因する細胞への有害な影響を最小にし得るかもしくは打消し得る。例えば 、ブタ細胞は、ドナーのブタから単離しそして移植のために調製される場合、ス ーパーオキシドラジカルアニオン、過酸化水素およびヒドロキシルフリーラジカ ルのような活性酸素種（ＲＯＳ）の産生につながる細胞の傷および／もしくは低 酸素状態を経験しうる。コルトン(Colton，C.A.)ら（1995）Exp．Neurol．132:5 4-61。ＲＯＳは、おそらく、イオンチャンネル、膜脂質、Ｎａ／Ｋ ＡＴＰアー ゼおよびＮａ＋／グルタミン酸交換移送のような移送メカニズムならびにグルタ ミン合成酵素のような細胞質酵素を包含する多様な膜および細胞内の成分に影響 を与えることにより、神経機能に悪影響を及ぼすことが知られている。コルトン (Colton，C.A.)ら（1995）Exp．Neurol．132:54-61。ＲＯＳへの神経末端の急性 の被曝は神経伝達機能不全をもたらす。コルトン(Colton，C.A.)ら（1991）Free Rad．Res．Commun．14:385-393；コルトン(Colton，C.A.)ら（1989）Free Rad ．Biol．Med．7:3-8。ＲＯＳへの神経 末端の長期の被曝は神経突起の収縮、そして徐々に神経死に帰着する。ハリウェ ル(Halliwell，B.)ら フリー ラジカルス イン バイオロジー アンド メ ディシン(Free Radicals in Biology and Medicine)、第２版（クラレンドン プレス(Clarendon Press)、オクスフォード、イギリス 1989）。加えて、ＲＯＳ は膜脂質の過酸化を誘発し、結果として移植物中の神経細胞の生存を減少させる ことが知られている。 移植のための調製の間のこれらのタイプの酸化的ストレスの悪影響を最小限に しおよび／もしくは打ち消すため、本発明の細胞は、調製の間のいずれの段階で も抗酸化剤とともにインキュベーションされ得、および／もしくはそれらで処理 され得る。こうした抗酸化剤の例は、それぞれベーリンガー マンハイム(Boehr inger Mannheim)（インジアナポリス、インジアナ州）およびシグマ ケミカル カンパニー(Sigma Chemical Company)（セントルイス、ミズーリ州）から商業 的に入手可能な酵素抗酸化剤スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）およびグ ルタチオンペルキシダーゼ（コルトン(Colton．C.A.)ら（1995）Exp．Neurol．1 32:54-61）、グルタチオン形成を促進する作用物質例えばこれもまたシグマ(Sig ma)から商業的に入手可能なＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、ならびにアッ プジョン(Upjohn)から入手可能なラザロイド例えばＵ−７４３８９ＧおよびＵ− ８３８３６Ｅ(ナカオ(Nakao，N.)ら（1994）プロシーディングス オブ ナショ ナル アカデミー オブ サイエンス ＵＳＡ(Proc．Natl．Acad．Sci．USA)91 :12408-12412;フロドル(Frodl，E.M.)ら（1994）ニューロレポート(NeuroReport )5:2393-2396）のような他の既知の抗酸化剤を包含する。ＳＯＤのような抗酸化 酵素は、ＲＯＳを捕獲しそして過酸化亜硝酸アニオンを形成するスーパーオキシ ドの一酸化窒素との反応を防止する。過酸化亜硝酸アニオンは培養したニューロ ンに毒性であることが示されている。ナカオ(Nakao，N.)ら（1995）ネイチャー メディシン(Nature Medicine)1(3):226-231。これらの酵素は上に記述される ように本発明の細胞とともにインキュベーションされ得る。これらの酵素を本発 明の細胞調製物中に導入する別の方法は、こうした酵素をコードする核酸を含有 するように細胞を遺伝子的に修飾することである。この遺伝子的に修飾された細 胞はその後、受容被験体中の移植された細胞の生存、増殖および分化を高める作 用物質を産生し得る。例えば、本発明のブタ細胞は、酸素フリーラジカルの無毒 化での中枢の酵素Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼに対するヒト遺伝子 でトランスフェクションされ得る（ナカオ(Nakao，N.)ら（1995）ネイチャー メディシン(Nature Medicine)1(3):226-231）。これらのトランスフェクション された細胞はその後ＳＯＤを発現し、そして、結果として組織の調製および移植 の間に創製されるＲＯＳを効率的に無毒化し、それにより移植片の生存を増大さ せる。 ラザロイドはグルココルチコイド活性を欠く21−アミノステロイドであり、か つ、細胞膜内に局在しそして脂質過酸化を阻害するよう特異的にデザインされて いる（それらの脂溶性部分をリン脂質二重層内に挿入することにより膜を安定化 する（ナカオ(Nakao，N.)ら(1994)プロシーディングス オブ ナショナル ア カデミー オブ サイエンス ＵＳＡ(Proc．Natl．Acad．Sci．USA)91:12408-1 2412；フロドル(Frodl，E.M.)ら（1994）ニューロレポート(NeuroReport)5:2393 -2396））。ラザロイドはまたフリーラジカル、とりわけヒドロキシルラジカル を捕獲することも知られている。細胞培養系および細胞懸濁液に添加され得る抗 酸化剤の他の例は、ＴＧＦβ（プレーン(Prehn，J.H.M.)ら（1994）プロシーデ ィングス オブ ナショナル アカデミー オブ サイエンス ＵＳＡ(Proc．N atl．Acad．Sci．USA)91:12599-12603）、ビタミンＥ（ナカオ(Nakao，N.)ら（1 995）ネイチャー メディシン(Nature Medicine)1(3):226-231）、ビタミンＣ、 ベータカロチン、ならびに、ＲＯＳを捕獲し、ＲＯＳの産生を阻害し、および／ もしくは脂質過酸化を阻害する他の化合物を包含する。 加えて、インビトロの細胞の酸化的環境は細胞の酸化的ストレスを阻害するよ うに修飾され得る。例えば、移植のためのブタ細胞の調製の間、細胞の環境中の 酸素分圧は、通常の酸素分圧すなわちおよそ150トールＯ₂から減少した酸素分圧 すなわち38トールＯ₂（約５％Ｏ₂）まで減少され得る。酸化的ストレスを減少す るこの方法は、上に記述される抗酸化剤のひとつもしくはそれ以上での細胞の処 理と組み合わせられ得る。例えば、38トール（例えば５％Ｏ₂）の酸素分圧とＮ ＡＣでの処理との組み合わせはＴＨ+ニューロンの生存を促進するのに有効であ る。コルトン(Colton，C.A.)ら（1995）Exp．Neurol．132:54-61。 移植のための本発明の細胞の調製に伴う低酸素状態の間に、細胞外空間での興 奮性アミノ酸の放出がＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）レセプター を刺激し、一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）の活性を増大させる。これは順に一酸 化窒素（ＮＯ）の増大した生合成に帰着する。一酸化窒素は過剰形成の状況下で は毒性であり得る神経伝達物質である。ドーソン(Dawson，T.)ら（1995）ニュー ロサイエンティスト(The Neuroscientist)1(1):7-17。ＮＯの毒性効果は、過酸 化亜硝酸を形成するスーパーオキシドアニオンとの相互作用を通じて発生する。 過酸化亜硝酸 はタンパク質をニトロシル化しおよび脂質過酸化を開始することが可能である、 高度に反応性の分子である。過酸化亜硝酸はまた、ヒドロキシルフリーラジカル および二酸化窒素フリーラジカルを自発的に分解もする。これらのラジカルは多 様な毒性効果を媒介する。ドーソン(Dawson，T.)ら（1995）ニューロサイエンテ ィスト(The Neuroscientist)1(1):7-17。ガングリオシド、ＦＫ５０６およびシ クロスポリンＡ（ドーソン(Dawson，T.)ら（1995）ニューロサイエンティスト(T he Neuroscientist)1(1):7-17）のようなＮＯＳ阻害剤がＮＯの産生を阻害する ために細胞調製物に添加され得、それにより過酸化亜硝酸およびその誘導体の産 生を減少させる。スーパーオキシドジスムターゼは、ＮＯの過剰産生の悪影響お よびそれが媒介する毒性効果を低減し得る、別の作用物質である。ドーソン(Daw son，T.)ら（1995）ニューロサイエンティスト(The Neuroscientist)1(1):7-17 。 傷およびそれが関連する悪影響、例えば、移植のための本発明の細胞の調製に より誘発される、膜の過酸化、フリーラジカル誘発性の細胞損傷（ゴンザレス− ガルシア(Gonzalez-Garcia，M.)ら（1995）プロシーディングス オブ ナショ ナル アカデミー オブ サイエンス ＵＳＡ(Proc．Natl．Acad．Sci．USA)92 :4304-4308；チョン(Zhong，L-T.)ら（1993）プロシーディングス オブ ナシ ョナル アカデミー オブ サイエンス ＵＳＡ(Proc．Natl．Acad．Sci．USA) 90:4533-4537）もまた移植された細胞のプログラムされた細胞死（アポトーシス ）に帰着し得る。移植された細胞でのアポトーシスの発生を低減するため、本発 明のブタ細胞は、ｂｃｌ−２（タレイ(Talley，A.K.)ら（1995）Moll．Cell Bio l．15(5):2359-2366；メリー(Merry，D.E.)ら（1994）ディベ ロップメント(Development)120:301-311；プレーン(Prehn，J.H.)ら（1994）プ ロシーディングス オブ ナショナル アカデミー オブ サイエンス ＵＳＡ (Proc．Natl．Acad．Sci．USA)91:12599-12603；チョン(Zhong，L-T.)ら（1993 ）プロシーディングス オブ ナショナル アカデミー オブ サイエンス Ｕ ＳＡ(Proc．Natl．Acad．Sci．USA)90:4533-4537）、ｂｃｌ−ｘＬ、ｂｃｌ−ｘ β（ゴンザレス−ガルシア(Gonzalez-Garcia，M.)ら（1995）プロシーディング ス オブ ナショナル アカデミー オブ サイエンス ＵＳＡ(Proc．Natl．A cad．Sci．USA)92:4304-4308）、および／もしくはｃｒｍＡ（タレイ（Talley， A.K.)ら（1995）Moll．Cell Biol．15(5):2359-2366）遺伝子産物のような、抗 アポトーシス遺伝子産物をコードする核酸でトランスフェクションされ得る。こ れらの遺伝子産物はプログラムされた神経細胞死を阻害することが示されている 。加えて、本発明のトランスフェクションされたブタ細胞は、細胞により産生さ れる抗アポトーシス遺伝子産物の神経保護効果を増すために、これらの遺伝子産 物の発現もしくは機能をアップレギュレーションする作用物質、例えば、ｂｃｌ −２の発現をアップレギュレーションするＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３（ゴンザ レス−ガルシア(Gonzalez-Garcia，M.)ら（1995）プロシーディングス オブ ナショナル アカデミー オブ サイエンス ＵＳＡ（Proc．Natl．Acad．Sci ．USA）92:4304-4308；プレーン(Prehn，J.H.)ら（1994）プロシーディングス オブ ナショナル アカデミー オブ サイエンス ＵＳＡ(Proc．Natl．Acad ．Sci．USA)91:12599-12603）で処理され得る。神経増殖因子（ＮＧＦ）および 血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）のような他の因子が抗アポトーシス活性を有す ることが見出されている（チョ ン(Zhong，L-T.)ら（1993）プロシーディングス オブ ナショナルアカデミー オブ サイエンス ＵＳＡ(Proc．Natl．Acad．Sci．USA)90:4533-4537）。本 発明の細胞は、従って、これらの因子をコードする核酸でもまたトランスフェク ションされ得る。スーパーオキシドジスムターゼおよびカタラーゼ（ボンフォコ (Bonfoco，E.)ら（1995）プロシーディングス オブ ナショナル アカデミー ブ サイエンス ＵＳＡ(proc．Natl．Acad．Sci．USA)92:7162-7166）のよう な酵素抗酸化剤ならびにＮＡＣ（タレイ(Talley，A.K.)ら（1995）Moll．Cell B iol．15(5):2359-2366）のような他の抗酸化剤もまた、本発明の細胞が移植のた めの調製の間にプログラムされた細胞死を受けるのを防止するのに使用され得る 。 受容被験体での本発明のブタ細胞の生存をさらに促進するため、当該細胞は、 血管新生作用物質とともに移植され得るか、もしくは血管新生作用物質をコード する核酸でトランスフェクションされ得る。移植に際し、この血管新生作用物質 はブタ神経移植片内への血管の伸長を促進する。血管の内部へのこの伸長の結果 として、移植片細胞は受容被験体内で増殖しかつ生存するのに十分な栄養を得る 。多くの増殖因子が血管新生活性を表す。例えば、そのｍＲＮＡの代替のスプラ イシングによる４個の形態で存在する血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（ドレイク （Drake,C.J.)ら（1995）プロシーディングス オブ ナショナル アカデミー オブ サイエンス ＵＳＡ(Proc．Natl．Acad．Sci．USA)92:7657-7661;シャ ルマ(Sharma，H.S.)ら（1995）Biochim．Biophys．Acta 1260:235-238；ミラウ アー(Millauer，B.)ら（1993）セル(Cell)72:835-846）は強力な内皮有糸分裂促 進物質である。ＰＤＧＦ、酸性および塩基 性の線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）（ドレイク(Drake，C.J.)ら（1995）プロシ ーディングス オブ ナショナル アカデミー オブ サイエンス ＵＳＡ(Pro c．Natl．Acad．Sci．USA)92:7657-7661）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）およびＫ− ＦＧＦ（ブリストル(Brustle，O.)ら（1992）オンコジーン(Oncogene)7(6):1177 -1183）もまた血管新生活性を所有し、かつ、本発明の方法において本発明の移 植される細胞への血管の伸長を助長するのに使用され得る。 神経向性因子のような、神経発達、神経線維形成およびニューロンの維持に寄 与する他の因子は、移植のための調製の間にインビトロで本発明の細胞に、およ び／もしくは本発明の細胞と共にの受容被験体への導入のために細胞懸濁液それ 自身に、添加され得る。本発明の細胞はまた、本明細書に記述されるような神経 向性因子を産生するように遺伝子的に修飾もされ得る。本発明の細胞に添加され る神経向性因子は、移植されるべき細胞上のそのレセプターの存在に基づき選択 され得る。例えば、中脳細胞は以下の神経向性因子についてのレセプターを所有 する。すなわち、中脳細胞の生存、その形態学的分化、および中脳細胞への高親 和性のドーパミン取り込みを促進するグリア細胞株由来神経向性因子（ＧＤＮＦ ）（トマ(Tomac，A.)ら（1995）ネイチャー（Nature）373:335-339；ベック(Bec k，K.D.)ら（1995）ネイチャー（Nature）373:339-341；プールソン(Poulson，K .T.)ら（1994）ニューロン(Neuron)13:1245-1252； シュトレムベルク(Stromber g，I.)ら（1993）Exp．Neurol．124:401-412）；脳由来神経向性因子（ＢＤＮＦ ）（トマ(Tomac，A.)ら（1995）ネイチャー（Nature）373:335-339；ハイマン(H yman，C.)ら（1994）J．Neurotics．14(1):335-347）；中脳細胞の軸索切断術誘 発性変性を 防止する繊毛神経向性因子（ＣＮＴＦ）（ハグ(Hag，T.)ら（1993）プロシーデ ィングス オブ ナショナル アカデミー オブ サイエンス ＵＳＡ(Proc．N atl．Acad．Sci．USA)90:6315-6319）；中脳細胞の生存および分化を促進するミ ドカイン（キクチ(Kikuchi，S.)ら（1993）Neurosci．Lett．160:9-12）；中脳 細胞の生存および成熟を増大するＥＧＦ（キャスパー(Casper，D.)ら（1991）J ．Neurosci．Res．30:372-381；クヌゼル(Knusel，B.)ら（1990）J．Neurosci． 10:558-570）；インスクリン様増殖因子ＩおよびIIならびにインスリン（クヌゼ ル(Knusel，B.)ら（1990）J．Neurosci．10:558-570）；酸性ＦＧＦ（エンゲレ( Engele，J.)ら（1991）J．Neurosci．11:3070-3078）；神経突起をもっ細胞の数 およびそれらの線維ネットワークの程度での大きな増大を誘発する塩基性ＦＧＦ （フェラーリ(Ferrari，G.)ら（1989）Devel．Biol．133:140-147）；ニューロ トロフィン−３（ＮＴ−３）およびニューロトロフィン ４／５（ＮＴ−４／５ ）（ハイマン(Hyman，C.)ら（1994）J．Neurosci．14(1):335-347）；ならびに トランスフォーミング増殖因子−β２（ＴＧＦβ２）およびトランスフォーミン グ増殖因子−β３（ＴＧＦβ３）（プールソン(Poulson，K.T.)ら（1994）ニュ ーロン(Neuron)13:1245-1252）。 線条体細胞の生存を促進する神経向性因子は線条体細胞上のレセプターの存在 に基づいて選択され得る。塩基性ＦＧＦについてのレセプター（フェラーリ(Fer rari，G.)ら（1989）Devel．Biol．133:140-147）、ＢＤＮＦのレセプター（ハ イマン(Hyman，C.)ら（1994）J．Neurosci．14(1):335-347）、ＮＴ−３および ＮＴ−４／５のレセプター（ハイマン(Hyman，C.)ら（1994）J．Neurosci．14(1 ):335-347）が線条体細胞 上に見出され得る。かように、ひとつの態様において、本発明の線条体細胞はこ れらの因子のひとつもしくはそれ以上をコードする核酸でトランスフェクション され得る。別の態様においては、これらの因子のひとつもしくはそれ以上が移植 に先立ち線条体細胞の調製物に添加され得る。これらの神経向性因子は、受容被 験体での本発明の細胞、とりわけ本発明の線条体細胞の生存を高める。同様に、 皮質細胞に特異性を表し、そして結果として受容被験体内への移植に際してそう した細胞の生存を促進するのに使用され得る神経向性因子は、例えば軸索切除さ れた前脳のコリン作働性神経の委縮を防止する神経増殖因子（ＮＧＦ）（リンゼ イ(Lindsay，R.M.)ら（1994）TINS 17(5):182-190）；ＢＤＮＦならびにＮＴ− ３およびＮＴ−４／５（リンゼイ(Lindsay，R.M.)ら（1994）TINS 17(5):182-19 0）を包含する。 別の態様においては、本明細書に記述される神経向性因子が、それらの神経向 性効果を増すために神経伝達物質のような他の化合物と一緒にもしくは組み合わ せて使用され得る。例えば、酸性もしくは塩基性のいずれかのＦＧＦとカテコー ルアミンの組み合わせは、同時にもしくは連続して適切な神経細胞と接触される 場合に、チロシンヒドロキシラーゼの発現を誘発し得る。テュ(Du，X.)ら（1995 ）J．Neurosci．15(7):5420-5427。加えて、本明細書に記述される神経向性因子 の様々な組み合わせは相乗作用的に作用し得、そして従って本発明の移植された 細胞の生存を促進するのに一緒に使用され得ることが企図される。 ある薬物もまた神経向性活性を所有する。そうした薬物の例は、例えばＮＯＳ のリン酸化されるレベルを増すことによりＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（Ｎ ＭＤＡ）レセプターで作用するグルタミン酸により導 き出される神経毒性を阻害するＦＫ５０６およびシクロスポリンＡ（リヨン(Lyo ns，W.E.)ら（1994）プロシーディングス オブ ナショナル アカデミー オ ブ サイエンス ＵＳＡ(Proc．Natl．Acad．Sci．USA)91:3191-3195）を包含す る。リン酸化されたＮＯＳがその触媒活性を阻害すると、これらの薬物はＮＯ形 成を効果的に抑制し、そしてこれらの細胞に対するＮＭＤＡの神経毒性効果を防 止する。神経向性活性を所有しかつ本発明で使用され得る他の薬物は、ＦＫ５０ ６および／もしくはシクロスポリンＡと同じ結合タンパク質に結合しそして従っ て類似の神経保護効果を媒介するそうした小さな分子である。リヨン(Lyons，W. E.)ら（1994）プロシーディングス オブ ナショナル アカデミー オブ サ イエンス ＵＳＡ(Proc．Natl．Acad．Sci．USA)91:3191-3195。 上に記述される作用物質および因子のひとつもしくはそれ以上の組み合わせが 、本発明の細胞が受容被験体内に移植される前もしくは後に、当該細胞の生存を 促進するために使用され得ることが本明細書でとりわけ企図される。例えば、本 発明の細胞は、インビトロおよび／もしくはインビボでの当該細胞の生存を促進 させるために本明細書に記述される作用物質もしくは因子のひとつもしくはそれ 以上と接触され得る。別の態様においては、本発明の細胞は、本明細書に記述さ れる作用物質もしくは因子のひとつもしくはそれ以上の核酸でトランスフェクシ ョンされ得、かつ、本明細書に記述される作用物質もしくは因子のひとつもしく はそれ以上ともまた接触され得る。さらに、本明細書に記述される神経向性因子 の多くは特定の細胞タイプに特異的であるにもかかわらず、これらの因子のそう した細胞タイプとの関連(association)は、その因子 の異なる細胞タイプとの使用を排除しない。本発明の細胞の本明細書に記述され る作用物質もしくは因子での処理は、同時にもしくは連続的に存在し得る。 本発明は、決してさらに制限されるように解釈されるべきでない以下の実施例 によりさらに具体的に説明される。この明細書全体で引用される全ての引用され る参考文献の内容（論文の参考文献、発行された特許、公開された特許明細書お よび同時出願中(co-pending)の特許明細書を包含する）はこの結果引用により明 白に組み込まれる。 実施例 実施例１：損傷されたラット脳へのブタ線条体細胞の移植および移植された細胞 の組織学的検査 実験デザイン 一連の実験で、75匹の成体の雄性シュプラグ−ドーレイ(Sprague-Dawley)ラッ ト（300〜350g）が新線条体の興奮神経毒性損傷を、その後７日後にブタ胎児脳 の線条体原基からの細胞の線条体内移植を受けた。移植されたラットはシクロス ポリンＡで免疫抑制し、そしてそれらの移植片を移植後１ないし４ヶ月成熟させ た。このラットはその後組織学的分析のために殺した。 ブタ胎児脳切開処置 授精後22ないし50日に、妊娠ヨークシャーブタ（115日の正常妊娠期間をもつ ）を、タフツ大学獣医学部（グラフトン、マサチューセッツ州）で標準的な獣医 学的処置に従い安楽死させた。子宮角を除去し、そして無菌実験施設（ダイアク リン インク(Diacrin，Inc.)、チャールズタウン、マサチューセッツ州）への 移送のため氷上で保存した。無菌実験 施設で胎児をそれらの子宮嚢より取り出しそして滅菌したリン酸緩衝液処理生理 的食塩水（ＰＢＳ）に移した。頭から臀部までの長さ（ＣＲＬ）を測定して匹敵 する妊娠齢を確認した（第６Ａ図）。層流フード下で胎児を断頭し、そして正中 矢状切開により全脳を取り除いた。胎児脳の切開は切開顕微鏡下にＰＢＳ中で実 行して基底終脳中の神経節隆起を露出させた（第６Ｂ図）。妊娠齢30日と40日の 間のブタ胎児(Ｅ30−40)は、終脳の基底中で外側神経節隆起（ＬＧＥ）と内側神 経節隆起（ＭＧＥ）の間の明瞭な区分を表した。胎児脳の発達のこの段階はＥ15 ラットで見られるそれに形態学的に類似する。これはＭＧＥおよび下にある皮質 の双方を排除するＬＧＥの選択的切除を可能にした（パクザバン(Pakzaban)ら（ 1993）Exp．Brain Res．97(1):13-22の処置に従う）。第６Ｂ図は胎児脳中の外 側神経節隆起の配置を図式的に図示する。Ｅ35ブタ胎児脳中のＬＧＥおよびＭＧ Ｅの配置および外観が第６Ｃ図および第６Ｄ図の顕微鏡写真に示される。Ｅ30よ り若い胎児を検査したが、しかし切開のために神経節隆起を区別するには終脳の 発達において未熟すぎることを見出し、一方、Ｅ40より成長した胎児では、ＬＧ ＥとＭＧＥの間の形態学的区別は識別できなかった。 切開後、切除した各ＬＧＥ断片を、カルシウム、マグネシウム、重炭酸塩およ びフェノールレッドを含まないハンク(Hank)の平衡塩溶液（ＨＢＳＳ；シグマ ケミカル カンパニー(Sigma Chemical Co.)、セントルイス、ミズーリ州）を含 有する収集皿に移し、そして細胞が分離されることになるまで室温で保存した。 重炭酸塩の存在は分離後の生存可能な細胞のパーセントを低減することが見出さ れている。一腹の全胎児脳の双方の半球由来の組織断片を合わせた。この組織を 、ＨＢＳＳ（シグ マ(Sigma)）中0.5％トリプシン−ＥＤＴＡおよびデオキシリボヌクレアーゼ中で 37℃で15分間インキュベーションし、その後ＨＢＳＳで３度洗浄し、それから、 乳状の懸濁液が得られるまで、徐々により小さい直径の火で磨いた(fire-polish ed)パスツールピペットの先端を通して穏やかに磨砕した。徐々により小さい直 径のパスツールピペットの使用は、分離の間に細胞上に置かれるずり応力を低減 する。分離のためのピペットの孔での漸進的変化の一例は以下のようである。す なわち、組織片を、まず、火で磨かれているがしかし通常の大きさの開口を有す るパスツールピペットで分離する。胎児脳組織の小片を、分離媒質の腫膨に変化 がなくなる（すなわち、組織の小片から付加的な細胞が放出されない）まで、気 泡の導入を避けて上下に慎重にピペッティングする。この時点で、より小さな開 口の火で磨いた新たなパスツールピペットをより大きな開口のピペットと取り替 える。一般に、全部で４種の徐々により小さいピペット先端の開口のパスツール ピペットを細胞を分離するために使用する。先端の開口の小さすぎるピペットの 使用を避けることが重要である。かように、より小さい先端の開口のピペットへ の進行は、さらなる分離が要求されるがしかし現在の先端の大きさを使用しては 起こらなくなるまで試みられるべきではない。分離の間の組織の小さな凝集塊の 除去もまた、細胞上に置かれるずり応力を最小にする。加えて、100単位/mlのヒ ト組み換えデオキシリボヌクレアーゼＩが、細胞の望まれない凝集を防止するの に分離の間に包含される。細胞濃度および生存能力は、血球計算器および蛍光顕 微鏡でのＵＶ外側照明法(UV epi-illumination)下でのアクリジンオレンジ／臭 化エチジウム染色を使用して測定した（ブランディン(Brundin)ら（1985）Brain Res．331:251-259）。 損傷、移植および灌流の処置 ラットをペントバルビタール（65mg/kg、腹腔内）で麻酔しそしてコフ(Kopf) の定位枠に設置した。小さな切開によりバー孔を頭蓋に創製し、そしてキノリン 酸の１μl注入（120nM）を、５μlのハミルトンシリンジを使用し、新線条体内 に（前頂に関しての定位座標：前方＝±0.1、外側＝±2.5、腹側＝−4.5、切歯 バー＝−2.5）一側に（ｎ＝59）もしくは両側に（ｎ＝16）送達した。７日後、 損傷した各ラットを同じプロトコールに従い再麻酔し、そして同じ定位座標にブ タ胎児細胞懸濁液移植片を与えた。10,000個と200,000個の間の生存可能な細胞 （実験に依存する、結果を参照）を含有する懸濁液５μlを注入した。細胞懸濁 液は、22Ｓゲージ針（内径＝0.41mm）を備えつけた５μlのハミルトンシリンジ で10分間にわたり１μlの増量で注入し、追加の２分間をおき針をゆっくりと取 り除く前に最後の注入圧の平衡を可能にした。 移植の日に開始し、実験の間、ラットをシクロスポリンＡ（10〜15mg/kg、毎 日皮下注）で免疫して移植片の拒絶を防止した（ブランデイン(Brundin)ら（198 5）Brain Res．331:251-259）。移植後の生存時間は５週間から16週間まで変動 した。強いペントバルビタール麻酔（130mg/kg、腹腔内）下に、ラットを100ml のヘパリン−生理的食塩水（0.9％生理的食塩水中0.1％ヘパリン）で、その後20 0mlの0.1Mリン酸緩衝液処理生理的食塩水ｐＨ7.4（ＰＢＳ）中４％パラホルムア ルデヒドで、経噴門的(transcardially)に灌流した。 組織学的調製、染色および免疫組織化学的処置 ラット宿主脳をＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで６〜８時間・後固定し、 そしてその後、40μmの凍結したミクロトーム切片を切断する 前にＰＢＳ中30％ショ糖に１〜３日間浸した。切片を６〜８層(series)に分割し そしてＰＢＳ中４℃で保存した。個々の層は、ニッスル染色（酢酸クレシルバイ オレット）、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）組織学的染色、およびＡ ＢＣ免疫組織化学（ベクター ラブス(Vestor Labs)、バーリンゲイム、カリフ ォルニア州）のいずれかのために処理した。この研究で使用された免疫組織化学 的マーカーは、ドーパミンおよび環状ＡＭＰ調節性リンタンパク質、32kD（ＤＡ ＲＰＰ−32；ポール・グリーンガード(Paul Greengard)博士、ロックフェラー大 学、により恵与される）；グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ；ベーリンガー マンハイム バイオケミカ(Boehringer Manheim Bichemica)、インジアナポリ ス、インジアナ州）；微小管関連タンパク質１ｂ（ＭＡＰ１Ｂ；トーマス・シー ア(Thomas Shea)、マクリーン(McLean)病院、ベルモント、マサチューセッツ州 、より恵与される）；分化抗原44のブタのクラスター（ＣＤ44）およびウシ神経 フィラメント、70kD（ＮＦ70；バイオデザイン インク(Biodesign，Inc.)、ケ ンネブンクポート、メリーランド州）、に対する抗体を包含する。 ＣＤ44およびＮＦ70に対する種特異的細胞マーカーの特徴づけ おそらくブタ脳抗原に結合すると思われる２個の候補の抗体すなわちＣＤ44お よびＮＦ70に対する抗体を種特異性について試験した。ブタ成体の前脳では、Ｃ Ｄ44との免疫反応性（ＣＤ44-ＩＲ）は脳梁および内包の線維束を包含する全て の主要な白質路で見出されるが、しかし皮質の灰白質もしくは線条体で見出され ない。白質構造内では、ＣＤ44−ＩＲはミエリン化された軸索の束に沿って伸長 するフィラメントの突起を標識する。正常な成体ラット脳への、および興奮神経 毒性の線条体の損 傷のみをもつラットでの非特異的結合のコントロール試験は、抗ブタＣＤ44抗体 が対応する実験条件下でラット抗原と交差反応しないことを示す。 ブタ成体の前脳では、ウシＮＦ70との免疫反応性（ＮＦ70−ＩＲ）が白質およ び灰白質の構造の双方で見出される。ＮＦ70−ＩＲの軸索はミエリン化された線 維路内で束を形成し、そして灰白質構造内で少しではあるものの密に染色される が、しかしながら、ＮＦ70−ＩＲの神経体はほとんど観察されない。正常な成体 ラット脳および興奮神経毒性の線条体の損傷のみをもっ成体ラットへの非特異的 結合のコントロール試験は、抗ウシＮＦ70抗体が対応する実験条件下でラット抗 原と交差反応しないことを示す。 移植片の体積に対する最初の細胞投与の影響 成体のブタおよびラットの脳、ならびにそれぞれ内の線条体の大きさの差異を 考えると、ラット線条体に適切な大きさの同種移植片を産生することが示される 胎児ラット細胞の数は同じ大きさのブタ異種移植片を産生するとあてにできない とみられる。従って、移植片の過剰増殖のいかなる都合の悪い影響も避け、そし てラットの同種移植片の研究に匹敵しうる結果を提供するためには、移植される ドナー細胞の投与量と得られる移植片の大きさとの間の関係の予備的研究を実行 することが必要であった。 宿主ラットにブタＬＧＥ細胞懸濁液の異なる用量を両側に移植した。８匹のラ ットは右線条体内に移植された100,000個の生存可能な細胞および左線条体内に 移植された50,000個の生存可能な細胞を受け入れ、また、８匹のラットは右線条 体内に移植された200,000個の生存可能な細 胞および左線条体内に移植された10,000個の生存可能な細胞を受け入れた。得ら れた移植片の体積を増殖８週後に測定した（第７Ａ〜７Ｃ図）。各細胞投与量の 合わせたサンプルの体積の比較は増大する用量反応関係を示す。200,000個の細 胞移植片は5.5mm3の平均体積を有し、また、ラット線条体の損傷された部分の大 きな画分を満たしたがしかし肥大性ではなかった（第７Ａ図、左）。他の全ての 用量は線条体の損傷された領域より小さい移植片を産生する。これらの移植片は 殺した時点では未だ未熟であったにもかかわらず、それらの大きさは比較しうる ラット同種移植片の範囲内に良好にあると判断された。従って、その後の全ての 実験では100,000個および200,000個の細胞の範囲内の細胞用量を使用した。 異なる移植片齢での異種移植片の形態学の展開(development) 移植後の発生の４ないし５週後（おおよそ正常ブタ脳内の細胞の生存期間の中 間点に対応する）、ブタ異種移植片は細胞構造で比較的同質である。それらは主 として釘の軌跡を取り巻く円柱を形成する小さくかつきつく詰め込まれた体から なり、そしてその移植片の小さな部分のみがＡＣｈＥ活性について染色される。 発生の８週後、ブタ異種移植片は損傷された線条体内に伸長しておりかつ細胞構 造的異種性を表す。ニッスル染色は、その移植片が大きな細胞の領域に対し明瞭 な小細胞の領域に分離されることを示し、また、これらは、近接するＡＣｈＥ染 色された切片に見られるようにそれぞれＡＣｈＥの豊富な領域およびＡＣｈＥの 乏しい領域に対応する（より詳細に以下に記述される）。この段階で、ＡＣｈＥ の豊富な領域は移植片の総体積の25％から40％までであると測定された。発生の 16週後、移植片のより大きな画分は、これもまたＡＣｈＥが豊富である大きな神 経体クラスターから成り、そしてこの移植片 は線条体の損傷された部分に伸長しており、明確な小区域に組織化される、異な る形態学および密度の細胞を包含する。 ブタ異種移植片の細胞構造的および免疫組織化学的な特徴づけ ブタＣＤ44に対する抗体がこの移植片のブタ由来のグリア組織に選択的に結合 するという証拠は、移植片全体に近接する切片でのＣＤ44およびＧＦＡＰに対す る抗体で染色される構造の比較により、ならびに、ＣＤ44−ＩＲの細胞の形態学 的外観により提供される。８週齢のブタ異種移植片の付近では、ＧＦＡＰに対す る抗体は、移植片を取り巻くラット宿主の星状細胞および移植片内のブタグリア 細胞の双方を染色する。結果として、移植片−宿主の境界は不明瞭であるが、と はいえ移植片内の比較的より高いＧＦＡＰとの免疫反応性（ＧＦＡＰ−ＩＲ）の 細胞密度が、それをさらに周囲の損傷された線条体内へ漸進的に減少するＧＦＡ Ｐ−ＩＲの細胞の密度と区別する。ＧＦＡＰ−ＩＲは正常な成体ラット線条体で は極微量である（そして移植された動物の脳の反対側の正常な線条体には本質的 に存在しない）にもかかわらず、ＧＦＡＰの発現は損傷に応答してアップレギュ レーションされることが知られており（ビグナミ(Bignami，A.)らアドヴァンシ ーズ イン セルラー ニューロバイオロジー(Advances in Cellular Neurobio logy)中、フェデロフ(Federoff，S.)とヘルツ(Hertz，L.)編（アカデミック プ レス(Academic Press)、ニューヨーク 1980）、1:285-310；ビョルクルンド(Bj orklund，A.)ら（1986）Brain Res．371:267-277；コフェイ(Coffey，P.J.)ら（ 1990）ニューロサイエンス(Neuroscience)35:121-132；アイザックソン(Isacson ，O.)ら（1987）ニューロサイエンス(Neuroscience)20:1043-1056）、また、お そらく移植片を取り巻くこれらの細胞のかなりの数の 原因である。対照的に、ＣＤ44−ＩＲは発生のこの段階では主として移植片に限 られる。ブタＣＤ44−ＩＲの主な領域は、ニッスルおよびＡＣｈＥで染色される 近接する切片で同定されるように、移植片の体積に密接に対応し、また、最も密 集したＧＦＡＰ−ＩＲの領域に対応する。ＣＤ44で染色されるフィラメントが移 植片の境界線を越えて伸長するのが見られ得るが、しかしほとんどの部分につい ては、宿主線条体の周辺の損傷されたおよび正常な領域はＣＤ44−ＩＲの構造を ほとんど含有しない。移植片の集合体から分離して見出され得る少数の単離され たＣＤ44−ＩＲの細胞は、ＧＦＡＰに対し免疫反応性である細胞と形態学的に極 めて類似し、星状細胞様の外観を表す。ＣＤ44−ＩＲはまた、近接する白質路中 の線条体の外側でも、主として不規則な形をとったフィラメントの形態で見られ る。 これらの移植片の最も著しい細胞構造的特徴のひとつは、ニッスル染色される 切片で見られる大きなニューロンのクラスターへの配置である。これらのクラス ターは直径およそ250μmから600μmまでにわたり、かつ、より小さくそしてより 密に詰め込まれた細胞を含有する移植片の周囲の領域からそれらを分離する、比 較的細胞を含まない環にしばしば取り巻かれる。ニッスル染色される小さな核の 存在により指摘されるように、これらの神経クラスターを伴うグリア細胞が疑い なしに存在するにもかかわらず、それらはこの研究で使用された２種のグリアマ ーカー、ＧＦＡＰおよびＣＤ44のいずれかで最小限度に染色される。近接する切 片でのＡＣｈＥの組織化学的染色もまたこの細胞クラスター形成とのかなり正確 な一致を表す。大きな神経体のクラスターはＡＣｈＥに関して最も濃く染色され る領域に配置される。濃いＡＣｈＥ染色のこれらの領域と、 神経クラスターを囲む細胞を含まない環に一致するＡＣｈＥの乏しい境界物との 間の、はっきりした境界がしばしば存在する。対照的に、反対の染色パターンが ＧＦＡＰもしくはＣＤ44のいずれかで染色される近接する切片で表される。ＡＣ ｈＥが豊富であるニューロンの同じクラスターは、ＧＦＡＰおよびＣＤ44双方に ついて密に染色される周辺領域に比較して、ＧＦＡＰ−ＩＲもしくはＣＤ44−Ｉ Ｒのいずれかについて本質的に陰性である。ＡＣｈＥが豊富なクラスターをＣＤ 44の豊富な周囲の移植片と区別する境界は極めて明確であり得る。これらの２種 のマーカーは、移植片を、ニューロンが豊富な組織もしくはグリアが豊富な組織 のいずれかである２種の補足的な組織タイプに分割する。 これらのクラスター内の大きなニューロンはまたＤＡＲＰＰ−32に免疫反応性 （ＤＡＲＰＰ−32ＩＲ）でもあるが、しかしながら、初期の段階（すなわち８週 ）では、このクラスターを取り巻く領域内に線維のＤＡＲＰＰ−32染色もまた存 在する。より後期の段階（すなわち16週）では、ＡＣｈＥ染色およびＤＡＲＰＰ −32ＩＲの双方とも、より強くかつより良好に共局限されるようになる。加えて 、神経クラスター、周囲の移植片および損傷された宿主線条体の染色での差異は より大きくなる。移植後16週までに、神経クラスター内の細胞および好中球の双 方が強くＡＣｈＥ陽性かつＤＡＲＰＰ−32−ＩＲとなる。 ブタ異種移植片中の軸索の発生 ブタ神経フィラメントのエピトープに結合するがラットのエピトープとは結合 しない抗体の利用性が移植片軸索の発生および伸長を直接追跡することを可能に する。ラット中のブタ軸索のＮＦ70との免疫反応性は高度に特異的であり、かつ 、個々の軸索でさえも切片の平面内のかなり の距離が追跡されることを可能にする。ＮＦ70−ＩＲの線維は５週齢の移植片内 ではほとんど見出されないが、しかし８週までにはＮＦ70−ＩＲの線維の密な叢 が移植片の体積の大部分を満たす。移植片内の軸索の密な分布と対照的に、それ らは近接する損傷された宿主線条体の移植片のちょうど外側にかなりより低い密 度で存在する。これは、ブタのＣＤ44−ＩＲの細胞と宿主線条体との間のはっき りした境界と共存する移植片の境界の印象を与える。この境界は灰白質もしくは 白質の宿主組織のいずれかと優先的に相関しない。 ＮＦ70との免疫反応性のパターンは、別の軽い神経フィラメント関連タンパク 質すなわち微小管関連タンパク質１Ｂ（ＭＡＰ１Ｂ）のそれと似ている。このタ ンパク質は初期の神経発生の間は高レベルで発現されるが、しかし軸索の発生の より後期の段階ではダウンレギュレーションされる（フィッシャー(Fischer，I. )とロマノ・クラルケ(Romano-Clarke，G.)（1990）Mol．Cell Neurosci．2:39-5 1；フリークナー(Fliegner，K.H.)とリーム(Liem，R.K.H.)（1991）Int．Rev．C ytol．131:109-167；ウロラ(Ulola，L.)ら（1993）J．Neurochem．61:961-972） 。ＭＡＰ１Ｂ−ＩＲの線維は、正常な成体ラット脳で、もしくは移植片から離れ た移植された脳の領域では観察されなかった。ＮＦ70抗体およびＭＡＰ１Ｂ抗体 の双方が、８週齢の移植片の体積内の密に部分的に重なる軸索の標識、および、 周囲の宿主の好中球および近接する白質内に伸長するいくつかの線維を立証する 。これらの２種の抗体の高度に相関する染色がＮＦ70の軸索特異性をさらに確証 する。加えて、ＭＡＰ１Ｂ−ＩＲの線維の比較密度は、この段階でのブタ移植片 の比較未熟度のひとつの指標である。 同じ移植片の、近接するニッスル染色切片、ＡＣｈＥ染色切片およびＮＦ70で 免疫染色切片の比較は、軸索が、ＡＣｈＥについて染色されない密に詰め込まれ た小さな細胞で満たされる移植片領域内に優先的に伸長することを示す。この相 補性は、主としてグリア細胞領域内に散在する無数の神経細胞クラスターを含有 する８週齢の移植片で明らかである。２個の８週齢の移植片で、神経細胞クラス ターの付近のＡＣｈＥ染色およびＮＦ70との免疫反応性のパターンが観察される 。神経体クラスターの周囲に濃くＡＣｈＥ染色される環内へのＮＦ70−ＩＲの線 維の若干の侵入が存在しうるが、しかし、クラスターの中心へはない。神経体の 付近でのＮＦ70−ＩＲの線維の欠如は、その神経体に隣接しない軸索のより遠位 の部分に局限されたＮＦ70の発現を反映し、また、増殖する線条体移植片の軸索 が比較的成熟した線条体様のニューロンのクラスターを含有する移植片領域に再 び入らない傾向があることも指摘する。 移植片の集合体内のＮＦ70−ＩＲの線維の広汎な増殖と比較すれば、移植片を 越える宿主脳への線維の伸長はまばらである。ドナーと宿主細胞の間の中間面を 越えると軸索密度の著明な低減が存在する。これはまた周囲の損傷された線条体 中のＣＤ44−ＩＲの細胞の低減とも一致する。しかしながら、若干の軸索は、近 接する線条体および淡蒼球領域をめぐり、移植片の境界から500μmまでの距離に 伸長するのが見られ得る。移植片から突出しそして近接する灰白質構造に突入す る軸索の最多数は、内側に淡蒼球へ、および腹側に腹側淡蒼球へ、とりわけ前方 交連の付近で伸長する。 近接する宿主線条体への軸索のまばらな伸長、および近接する淡蒼球領域への 短い突出と対照的に、隣接する移植片の境界を越えて伸長する 移植片軸索のかなりの割合は移植片に近接する線条体に浸透する内包線維束、脳 梁および前方交連を包含する白質路で見出される。ミエリン化された線維路内へ 成長するドナーの軸索はそれらの路内の宿主線維の軌跡に平行に向けられる傾向 があり、また、灰白質構造を通って伸長するそれらより移植片からさらに遠くへ 伸長する傾向がある。 ブタのＣＤ44−ＩＲの構造の大多数は形態はフィラメント状であるが、とはい え星状細胞様の外観をもつ構造のかなりの数もまた観察され得る。移植片を取り 巻く宿主線条体の領域にブタのＣＤ44−ＩＲの細胞もしくは細胞突起がほとんど 存在しないにもかかわらず、ブタのＣＤ44−ＩＲの線維が比較的多数で移植され た線条体を取り巻く脳梁に存在する。脳梁内のＣＤ44−ＩＲの構造の密度は移植 片からの距離とともに減少するが、しかし若干は反対側の脳梁の中央で観察され 得る。宿主の白質路内のＣＤ44−ＩＲの線維の形態学および方向は、成体ブタ脳 の白質路内で観察されるものと類似する。 ＣＤ44およびＮＦ70について処理された脳梁全体の近接する切片の比較は、ド ナー由来のグリアおよび神経線維を含有する領域間の緊密な一致が存在すること を指摘する。先駆するグリアおよび軸索線維は、移植片からこれらの同じ宿主脳 構造へ対応する密度で芽生える。双方とも周囲の宿主灰白質では比較的まばらで あり、かつ近くの白質路でより密集して現れる。 異種移植のドナー種の移植片のグリアおよび軸索のタンパク質に対する種特異 的な抗体の使用は、多数の他の不明瞭な細胞の相互関連およびドナーと宿主の細 胞相互作用が明視化されかつ研究されるのを可能にする。８ないし16週後、ブタ 線条体移植片は、細胞構造および染色の２種 の一般的パターン、すなわちａ）ＡＣｈＥが豊富でかつ対比されるＤＡＲＰＰ− 32ＩＲのニューロンのクラスターを含有する領域、ｂ）ＡＣｈＥが乏しくかつグ リアマーカーのＧＦＡＰおよびＣＤ44について強く染色される密に詰め込まれた 小さな細胞を含有する領域、のうちひとつを表す領域により特徴づけられる局所 的な異種性を発生している。ＮＦ70−ＩＲの軸索は移植片のＡＣｈＥが乏しくグ リアが豊富な部分を密に満たすことが見出される。移植片の境界線を越えると、 ＣＤ44−ＩＲおよびＮＦ70−ＩＲの構造の密度のかなりの低下が存在するが、し かしながら、それらは双方とも近接する淡蒼球領域、ならびに脳梁、前方交連お よび内包線維束内へ伸長することが見出される。これらの関係は第８図に概要図 により要約される。 ブタ異種移植片のラット同種移植片との比較 ラット同種移植片が発生すると、ＡＣｈＥの組織化学的染色の強度の漸進的増 大、および、移植片内のＡＣｈＥの乏しい区域に比較してＡＣｈＥの豊富な比率 の増大の双方が存在する（ラバンデイラ−ガルシア(Labandeira-Garcia，J.L.) ら（1990）ニューロサイエンス(Neuroscience)42:407-426）。この傾向はまたブ タ異種移植片でも観察される。５週齢であるブタ異種移植片ではＡＣｈＥ活性の 表示は実に少ないが、しかし８週までには移植片内にＡＣｈＥの豊富な多数の領 域が存在する。とはいえ移植片体積の大きな画分はＡＣｈＥが乏しいままである 。16週（この研究で最長の生存期間）までには移植片のＡＣｈＥの豊富な比率が 優勢となり、また、若干の領域は、ＡＣｈＥについて成体の線条体組織が染まる と同じくらい濃く染色される。ＤＡＲＰＰ−32−ＩＲもまた、８週齢での移植片 での比較的薄く染色される体および広汎性の薄く染色さ れる好中球から、16週齢での移植片での濃く染色される神経体および局限された 密に染色される好中球まで、漸進的に発展する。 ブタ線条体異種移植片でのＡＣｈＥ染色およびＤＡＲＰＰ−32−ＩＲの双方の 増大の時間経過は、ラット同種移植片に比較してかなり延長される。２つの種の 妊娠期間の比（21日対115日）が発達の時間経過の差異のおおまかな近似として 使用される場合、その場合は２つの種の発達速度に５ないし６倍の差異が存在す るはずである。しかしながらこれはおそらく過大評価であろう。なぜならラット はブタよりも出生時により未熟であると思われるからである（ディッカーソン(D ickerson，J.W.T.)とドビング(Dobbing，J.)（1967）Proc．Roy．Soc．B．166:3 84-395；ザッハー(Sacher，G.A.)とシュタフェルト(Staffeldt，E.F.)（1974）A mer．Natur．108:593-616；スノウ(Snow，M.H.L.)とタム(Tam，P.P.L.)（1980） ネイチャー(Nature)286:107）。あるいは、これら２つの種の胎児脳が対応する 神経節隆起の形態学を表す齢（15日対35日）は、ラットよりブタで２ないし３倍 大きいのみである。これらの種での対応する発達齢を同定する精密な生化学的マ ーカーが欠如しているにもかかわらず、胎児脳の形態学、妊娠の長さおよび移植 片の発生の特徴に基づき、ブタ移植片の発達は３ないし４の係数で延長されると 推定され得る。これは多数の他の胎児の特性の比較発生形態学由来の推定値と矛 盾しない（ウルレイ(Ullrey，D.E.)ら（1960）J．Animal Sci．24:711-717）。 かように、移植後５、８および16週でのブタ異種移植片は、それぞれ移植後＜１ 、１〜２、および３〜４週でのラット同種移植片に匹敵するはずである。これは この研究で分析されたもっとも成長した移植片でさえ相対的に未熟であることを 示唆する。 この研究でのブタ線条体異種移植片でのＡＣｈＥ染色のモザイク様の外観は、 このドナー種での脳発生の発生のタイミングに関連して、および、線条体移植片 の他の研究に比較してのここでのドナー細胞を提供する胎児脳構造の差異に関し て、の双方で考慮されるべきである。 移植片の成熟段階は重要である。というのは、ＡＣｈＥの乏しくかつＤＡＲＰ Ｐ−32陰性の神経組織が線条体（フォスター(Foster，G.A.)ら（1987）J．Neuro sci．7:1994-2018）および比較的未熟な移植片（ラバンディラ−ガルシア(Laban deira-Garcia，J.L.)ら（1990）ニューロサイエンス(Neuroscience)42:407-426 ）の発達での初期の特徴的であるからである。これらのブタ異種移植片中へのＡ ＣｈＥ陰性移植片領域の包含は、かようにそれらの比較未熟性を指摘しうる。し かしながら、ＡＣｈＥ陰性移植片組織の存在はまた、非線条体の発達の結果にゆ だねられる細胞の包含にも起因する。ラットからラットへの同種移植の典型を使 用して、発達するラット中脳の外側神経節隆起（ＬＧＥ）が胎児線条体移植片に 線条体様のＡＣｈＥの豊富な領域を後に形成する神経原種をもつがしかし内側神 経節隆起（ＭＧＥ）はもたないことが以前に立証されている(パクザバン(Pakzab an，P.)ら（1993）Exp．Brain Res．97:13-22）。この研究で使用されたブタ細 胞はブタ胎児のＬＧＥからのみ由来したため、得られる移植片中のＡＣｈＥの乏 しい領域の相対的豊富さが２つの種でのこの胎児脳構造の非相同性についての証 拠として解釈され得るであろう。しかしながら、これらのブタ異種移植片中のＡ ＣｈＥの乏しい領域はまた比較的ニューロンが乏しくかつグリアが豊富でもある 。かように、これらのＬＧＥ移植片でのＡＣｈＥ染色のモザイク様の分布は、外 側および内側の神経節隆起の双方からの細胞を組み合わせる ことに由来する同種移植片で以前に観察されたように（ディフィグリア(DiFigli a，M.)ら（1988）J．Neurosci．8:1112-1130；グレイビール(Graybiel，A.M.)ら （1989）J．Neurosci．9:3250-3271；アイザックソン(Isacson，O.)ら（1987） ニューロサイエンス(Neuroscience)22:481-497；ラバンデイラ−ガルシア(Laban deira-Garcia，J.L.)ら（1990）ニューロサイエンス(Neuroscience)42:407-426 ；ウィクトリン(Wictorin,K.)ら（1989）ニューロサイエンス(Neuroscience)30: 313-330）、非線条体細胞集団に対する線条体集団の分離ではなく、グリア集団 に対する神経集団の分離を反映する。これらの移植片のＡＣｈＥの乏しい領域は グリアが豊富でかつニューロンが乏しいため、これらはＬＧＥ＋ＭＧＥ移植片の ＡＣｈＥの乏しい領域に類似してもおらず（アイザックソン(Isacson，O.)ら（1 987）ニューロサイエンス(Neuroscience)22:481-497；パクザバン(Pakzaban，P. )ら（1993）Exp．Brain Res．97:13-22；シリナトシングジ(Sirinathsinghji，D .J.)（1993）ニューロレポート(Neuroreport)4:659-662）、成体の線条体のＡＣ ｈＥの乏しい領域の前駆体であるようでもない（グレイビール(Graybiel，A.M.) ら（1990）Trends Neurosci．13:244-254；グレイビール(Graybiel，A.M.)ら（1 989）J．Neurosci．9:3250-3271）。 ＡＣｈＥが豊富で神経が豊富な移植片領域へであるがしかしグリアが豊富でＡ ＣｈＥ陰性の領域へではないＤＡＲＰＰ−32−ＩＲの体の局在（ウィクトリン(W ictorin)ら（1989）ニューロサイエンス(Neuroscience)30:313-330）は、ＬＧＥ 由来の神経前駆体がラットおよびブタ双方の胎児で線条体の発達の結果にゆだね られているというさらなる証拠を提供する（パクザバン(Pakzaban，P.)ら（1993 ）Exp．Brain Res．97:1 3-22）。非線条体神経細胞もしくは未熟な線条体神経前駆体の存在がこれらの移 植片のＡＣｈＥの乏しい領域で排除され得ないにもかかわらず、これらの領域で 表されるＣＤ44およびＧＦＡＰに対する密な免疫反応性はそれらが主としてグリ アとともに存在することを示唆する。ヒトからラットへの胎児ＬＧＥ異種移植片 もまた、初期の発生段階で、ドナー由来の神経および非神経集団の類似の分離を 表す（未発表の観察）。これらの考察は、この移植片でのモザイク様の染色パタ ーンが、主としてグリアおよびおそらくまた線条体神経原種細胞からも成る未熟 な線条体成分の存在を反映することを示唆する。６ヶ月より成長した齢のブタ移 植片との比較は、ＬＧＥ異種移植片のこのＡＣｈＥの乏しくグリアが豊富な成分 がその後の移植片の発生で完全に排除されるかどうかを決定するのに必要である 。 移植片軸索とＣＤ44−ＩＲの移植片グリアとの間の関連 移植片ニューロンからの軸索は、主としてＣＤ44−ＩＲが存在するがしかし主 として神経である移植片領域を欠く移植片領域内へ優先的に伸長する。ＣＤ44− ＩＲの移植片グリアおよび移植片軸索の共局在はまた、宿主白質中の移植片の外 側でも観察される。一緒にすると、これらの知見は、ＣＤ44−ＩＲの移植片グリ アが移植片からの線条体軸索の成長を促進する基質もしくは他の影響を提供する ことを示唆する。胎児のグリア細胞に対するこうした成長支持的な役割はインビ トロ（アード(Ard，M.D.)ら（1988）Soc．Neurosci．Abstr．14:748；ファロン( Fallon，J.R.)（1985）J．Cell Biol．100:198-207；フォーセット(Fawcett，J. W.)ら（1989）Dev．Biol．135:449-458；レモン(Lemmon，V.)ら（1992）J．Neur osci．16:64-72；ノーブル(Noble，M.)ら（1984）J．Neurosci．4 :1892-1903）およびインビボ（ブルイ(Bray，G.M.)ら（1987）J.Exp.Biol．132: 5-19；モントゴメリー(Montgomery，C.T.)とロビンソン(Robinson，J.A.)（1993 ）Exp．Neurol．122:107-124；ニエト−サンペドロ(Nieto-Sampedro，M.)ら（19 84）プロシーディングス オブ ナショナル アカデミー オブ サイエンス ＵＳＡ(Proc．Natl．Acad．Sci．USA）81:6250-6254；クロマー(Kromer，L.F.) ら（1981）プロシーディングス オブ ナショナル アカデミー オブ サイエ ンス ＵＳＡ(Proc．Natl．Acad．Sci．USA)82:6330-6334；シルヴァー(Silver ，J.)とオガワ(Ogawa，M.Y.)（1983）サイエンス(Science)220:1067-1069）の双 方で立証されている。 移植片軸索の大多数は移植片内に留まったままのようであり、宿主の境界に対 して明確な移植片境界を産生する。移植片の外側に比較して移植片内での軸索の 高い密度もまたヒト線条体異種移植片について報告されている（ウィクトリン(W ictorin)ら（1990）ネイチャー(Nature)347:556-558）。これは、部分的には、 周囲の線条体の興奮神経毒性の損傷に応じて蓄積する活性化された小グリア細胞 の軸索成長阻害効果の結果でありうる（ボヴォレンタ(Bovolenta，P.)ら（1993 ）ニューロレポート(Neuroreport)5:345-348；コフェイ(Coffey，P.J.)ら（1990 ）Neurosci．35:121-132）が、しかし軸索の成長を可能にするかもしくは阻害す る基質の識別的な存在もしくは非存在もまた反映しうる（ファロン(Fallon，J.R .)（1985）J．Cell．Biol．100:198-207;ピニ(Pini，A.)（1993）サイエンス(Sc ience)261:95-98）。 移植片内の、ニューロンが豊富でＡＣｈＥが豊富なＤＡＲＰＰ−32−ＩＲの神 経領域もまたＮＦ70−ＩＲの移植片軸索を含まない傾向がある。 こうしたほとんど軸索を含まない移植片の領域は、成熟した線条体の特性に相同 である特性を表し、かつ多様な線条体の求心性システムからの求心性神経につい ての好まれる移植片の標的である（ラバンデイラ−ガルシア(Labandeira-Garcia ，J.L.)ら（1991）Neurosci．42:407-426；プリツェル(Pritzel，M.)ら（1986） Exp．Brain Res．65:112-126；ラザフォード(Rutherford，A.)ら（1987）Neuros ci．Lett．83:275-281；ウィクトリン(Wictorin，K.)ら（1988）Prog．Brain Re s．78:55-60；ウィクトリン(Wictorin，K.)ら（1989）ニューロサイエンス(Neur oscience)30:313-330）。この研究でのこれらの移植片領域への移植片軸索の最 小限の浸透は、従って、おそらく特異的な基質の差異によるとみられる。これら の領域が成熟な線条体と相同であると仮定すると、これらの移植片領域を通して 移植片軸索を成長させないようにするいかなる因子もしくは親和性も、宿主線条 体を通じ、軸索の低下した成長にもまた寄与しうる。主要な線条体の遠心性神経 の軸索についての標的が線条体の外側に存するため、これらの線条体様の移植片 ニューロンからの軸索が線条体様組織に最小限の親和性を示すことは驚くことで はない。ＣＤ44−ＩＲのグリアが線条体の軸索の成長を援助する基質を提供する 場合、軸索が、移植片の神経クラスターおよび宿主の線条体の双方を包含するこ うしたグリアを欠く領域内へ成長する傾向はないとみられる。これらのデータか らは、しかしながら、移植片軸索は単に移植片由来のＣＤ44−ＩＲのグリアによ り大きな親和性を表すのみなのか、もしくはそれらが付加的な反発する影響にも また応答するのかどうかは決定され得ない（ピニ(Pini，A.)（1993）サイエンス (Science)261:95-98）。 宿主脳内への軸索の成長に関するこれらの明らかな制約は、ラット同 種移植片に比較して、ヒトおよびブタの異種移植片からの軸索の伸長での差異の 起源に対する手掛かりを提供しうる。ラット移植片（ラバンデイラ−ガルシア(L abandeira-Garcia,J.L.)ら（1989）ニューロサイエンス(Neuroscience)42:407-4 26）もしくはマウス移植片（ウィクトリン(Wictorin，K.)ら（1990）Prog．Brai n Res．82:391-399）と比較すると、ヒトおよびブタの移植片でのグリアおよび 軸索の成長の発生的に延長された期間は、移植片細胞の突起が比較的非許容的な 成体宿主組織を通る経路を配置するかもしくは創造することが可能であろうとい う見込みを増大させうる。 宿主脳内への軸索の生長 淡蒼球への短距離の軸索の成長は標的特異的成長の証拠を提供する。移植片部 位の近くでは、軸索が、典型的な局所の線条体の遠心性神経の標的である、近接 する淡蒼球領域を浸透するのが見られ得る。より多くの線維が、その境界に近く 、比較的腹側および内側に置かれた移植片から淡蒼球を浸透するのが見られる。 ８週齢の移植片においてさえ、軸索が移植片から隣接する淡蒼球まで約200μmほ ど伸長するのが観察され、また、個々の軸索の分枝は移植片から500μmまで見出 され、腹側淡蒼球領域を浸透する。標的への移植片の近接は、軸索が発生のこの 初期の段階までにそれらの標的に到達するであろうという可能性に影響を与える 重要な因子であるようである。 しかしながら、軸索の成長の完全な範囲がＮＦ70での標識により過小評価され ると考える理由が存在する。というのは、ＮＦ70との免疫反応性は移植片軸索の 完全長にわたってはっきりとは発現されていないからである。同じ脳での、70kD のウシ神経フィラメント抗体の軸索染色とチ ロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）抗体を使用する軸索染色との比較は、70kD神経 フィラメントの抗体がＴＨ免疫組織化学で明視化され得る末端軸を染色し損なう ことを示す（ウィクトリン(Wictorin，K.)とビョルクルンド(Bjorklund，A.)（1 992）ニューロレポート(Neuroreport)3:1045-1048）。線条体移植片からの末端 軸を示す独立の軸索マーカーを欠くため、軸索の樹枝状分岐がＮＦ70免疫組織化 学により明視化される軸索のその部分よりさらに伸長するかどうかは証明されて いない。 ８週齢の移植片は軸索の長距離の成長を示すが、しかし、ヒト線条体の異種移 植片について報告された軸索の長距離の成長（ウィクトリン(Wictorin，K.)ら（ 1990）ネイチャー(Nature)347:556-558）とは異なり、ＮＦ70−ＩＲの移植片の 軸索は尾側では黒質までは観察されない。しかしながら、この研究での移植後の 最長の生存はヒト線条体異種移植片での25週間に比較して16週間であり（ウィク トリン(Wictorin，K.)ら（1990）ネイチャー(Nature)347:556-558；ウィクトリ ン(Wictorin，K.)ら（1992）J．Comp．Neurol．323:475-494；ウィクトリン(Wic torin，K.)とビョルクルンド(Bjorklund，A.)（1992）ニューロレポート(Neuror eport）3:1045-1048）、そのため軸索の成長の期間の差異が、部分的に、ヒト異 種移植片の軸索のより大きな伸長の原因でありうる。ブタ異種移植片に匹敵する 移植後の発生の時間が、これら２個のドナー種からの移植片の軸索の成長能力の 明白な比較に必要とされるであろう。 ヒトおよびブタ双方の異種移植片からの軸索の長距離の成長の主要パターンは 、脳梁、内包および前方交連の線維束による同調化を必要とする。これらの路内 では、移植片軸索およびＣＤ44−ＩＲのグリア線維の双方が宿主線維との平行な 整列で伸長する傾向を示す。いくつかの場合 には、脳梁内では移植片からの軸索の距離が１cmに到達する。宿主のミエリン化 された線維路に従う移植片の遠心性神経線維の傾向もまた、ヒト線条体異種移植 片(ウィクトリン(Wictorin，K.)ら（1990）ネイチャー(Nature)347:556-558)、 マウス線条体異種移植片およびラットのドーパミン細胞を枯渇させた中脳に置か れたヒト腹側中脳異種移植片からの軸索（ウィクトリン(Wictorin，K.)ら（1992 ）J．Comp．Neurol．323:475-494）について報告される。 脳梁および前方交連への明らかに非特異的な移植片軸索の突出に加え、いくつ かのＮＥＦ70−ＩＲの線維が大脳皮質の下層に進入しているのもまた見られる。 ウィクトリン(Wictorin，K.)ら（(1990)ネイチャー(Nature)347:556-558）もま た、これらの同じ白質構造を通りかつ大脳皮質内へのヒト線条体の異種移植片か らの長距離の軸索の生長を示す。典型的でない成長の軌跡は移植片中の若干の非 線条体細胞タイプの存在を指摘し得るであろうが、しかしながら、この研究での 胎児神経節隆起の精密に制限された切開はそうした汚染を最小限にしているはず である。このような成長パターンはまた、異種移植片軸索の成長は正常なラット 軸索の成長よりもより特異的でないことも示唆しうる。しかしながら、異種移植 片での同様の成長の傾向は、ドナーの軸索に特異的なマーカーの欠如のために気 づかれずに消えてしまったようである。にもかかわらず、広汎な非特異的突出は マウスからラットへの線条体移植片について報告されなかった（ウィクトリン(W ictorin，K.)ら（1988）Prog．Brain Res．82:391-399）。軸索の成長の非特異 性の若干の程度は、しかしながら、多数の前脳システムからの遠心性神経の初期 の生長の通常の特徴であり、そしてその後にこれらの非特異的な軸索の側枝の大 きな画分 が取り除かれて成体での接続の模倣を産生する期間が続く（オレアリイ(O'Leary ，D.D.M.)とケスター(Koester，S.E.)（1993）ニューロン(Neuron)10:991-1006 を参照）。ブタおよびヒトの移植片からの比較的より活発な軸索の成長は、それ らのラット宿主に比較してこれらのドナー種の細胞の延長された発生によるこれ らの非特異的成長パターンの強調因子を反映しうる。加えて、正常な胎児脳の成 長環境と成体脳内で発生する胎児移植片のそれとの間の多くの差異が、これらの 解釈をさらに複雑にする。成体脳は、ミエリン化された線維路のような、正常の 胎児の発生の間に存在しない成長の合図を提供しうる。これが移植片軸索の成長 の軌跡を一方に偏らせうる。 宿主線維路への移植片軸索の優先的な伸長は軸索誘導のメカニズムに関する他 の問題を生じさせる。ミエリンに関連した軸索の成長を阻害する物質の立証（カ ローニ(Caroni，P.)とシュワブ(Schwab，M.E.)（1988）ニューロン(Neuron)1:85 -96；シュワブ(Schwab，M.E.)（1990）Trends Neurosci．13:452-455）にもかか わらず、再生および移植片の多数の他の研究はミエリン化された線維路に沿った 軸索の成長に対する好みを示している（ウィクトリン(Wictorin，K.)ら（1990） ネイチャー(Nature)347:556-558；ウィクトリン(Wictorin，K.)ら（1992）J．Co mp．Neurol．323:475-494；ウィクトリン(Wictorin，K.)とビョルクルンド(Bjor klund，A.)（1992）ニューロレポート(Neuroreport)3:1045-1048）。匹敵するも の(parallels)もまた、異所性に移植された末梢神経線維路の中枢神経系の軸索 の成長を高めもしくは導く能力（アガヨ（Aguayo，A.J.)ら（1984）Neurosci．L ett．45:53-58；ベンフェイ(Benfey，M.)とアガヨ(Aguayo，A.J.)（1982）ネイ チャー(Nature)296:150-152；デイ ヴィッド(David，S.)とアガヨ(Aguayo，A.J.)（1981）サイエンス(Science)214: 931-933；ゲイジ(Gage，F.H.)ら（1985）Exp．Brain Res．60:584-589）、およ び中枢神経系組織（デュネ(Dunnett，S.B.)ら（1989）Exp．Brain Res．75:523- 535；クロマー(Kromer，L.F.)ら（1981）Brain Res．210:173-200）もしくは培 養されたシュヴァン(Schwann)細胞（クロマー(Kromer，L.F.)とコーンブルック ス(Cornbrooks，C.J.)（1985）プロシーディングス オブ ナショナル アカデ ミー オブ サイエンス ＵＳＡ(Proc．Natl．Acad．Sci．USA)82:6330-6334； モントゴメリー(Montgomery，C.T.)とロビンソン(Robinson，J.A.)（1993）Exp ．Neurol．122:107-124）の移植のそれにより再生する軸索が離れた標的にまで 成長し得る架橋を提供する能力において見出され得る。移植片グリア細胞および 宿主白質中の移植片軸索に加えての線維の存在は、線維路内への軸索の成長がこ れらの細胞タイプ間の支持的な成長の関連に依存しうることを示唆する。そうし たグリアの支持の存在は、軸索がミエリン化された組織内で阻害シグナルに打ち 勝つのを助けうる。胚グリア細胞は最初の軸索誘導に直接関与し得る（バスチア ニ(Bastiani，M.J.)とグッドマン(Goodman，C.S.)（1986）J．Neurosci．6:3542 -3551；ジェイコブス(Jacobs，J.R.)とグッドマン(Goodman，C.S.)（1989）J．N eurosci．9:2402-2411；シルヴァー(Silver，J.)ら（1982）J．Comp．Neurol．2 10:10-29）。終脳の橈骨神経グリア（ラキック(Rakic，P.)（1981）Trends Neur osci．4:184-187）、小脳のベルグマン(Bergman)グリア（ラキック(Rakic，P.) （1971）J．Comp．Neurol．141:283-312）、および終脳の中線の構造的グリア（ シルヴァー(Silver，J.)ら（1982）J．Comp．Neurol．210:10-29；スミス(Smith ，G.M.)ら（1986）J．Comp．Neur ol．251:23-45）は、正常な神経の移動および軸索の成長に不可欠な基質を提供 する。発達する基底の終脳での橈骨神経グリアは、神経節隆起の脳室領域から端 を発し、そして、神経の移動および突起の伸長の双方の基質を提供する発達する 線条体の集合体を外尾腹側で通過する（ミッション(Mission，J.P.)ら（1988）D ev．Brain Res．44:95-108；ハリデイ(Halliday，A.L.)とセプコ(Cepko，L.C.) （1992）ニューロン(Neuron)9:15-26）。本胎児移植片で観察される初期のグリ ア細胞およびそれらの線維の伸長は、正常胎児の線条体原基の発達上一過性の橈 骨神経グリア細胞に相同でありうる。 神経体は宿主組織の移植片の外側でほとんど見出されないにもかかわらず（リ ウ(Liu，F.C.)ら（1993）ニューロサイエンス(Neuroscience)55:363-372）、胎 児神経移植片からのグリアの移動は多数の研究で観察されている（エメット(Emm ett，C.J.)ら（1991）J．Comp．Neurol．311:330-341；ゴールドベルグ(Goldber g，W.J.)とバーンスタイン(Bernstein,J.J.)（1988）J.Neurosci．Res．20:38-4 5；ジャック(Jacque，C.M.)ら（1986）Dev．Neurosci．8:142-149；ジャック(Ja cque，C.M.)ら（1992）J．Neurosci．12:3098-3106；スアード(Suard，I.M.)ら （1989）J．Neurosci．Res．23:172-179；ゾウ(Zhou，H.F.)ら（1990）J．Comp ．Neurol．292:320-330；ゾウ(Zhou，H.F.)ら（1992）Exp．Neurol．122:155-16 4；ゾウ(Zhou，H.F.)とルンド(Lund，R.D.)（1992）Brain Res．Dev．Brain Res ．65:127-131）。インビトロ研究は星状細胞が伸長する軸索の成長に支持的であ り得ることを立証している（アード(Ard，M.D.)ら（1988）Soc．Neurosci．Abst r．14:748；フォーセット（Fawcett，J.W.)ら（1989）Dev．Biol．135:449-458 ；ノーブル(Noble，M.)ら（1 984）J．Neurosci．4:1892-1903）。従って、移動する移植片グリアが移植片軸 索の誘導に役割を演じるとみられることが示唆されている（リンゼイ(Lindsay， R.M.)とレイズマン(Raisman，G.)（1984）ニューロサイエンス(Neuroscience)12 :513-530；マッケオン(McKeon，R.J.)ら（1989）Exp．Neurol．103:213-221；ス ミス(Smith，G.M.)ら（1986）J．Comp．Neurol．251:23-45）。例えば、リンゼ イ(Lindsay)とレイズマン(Raisman)(1984)は「グリア細胞の移動の道筋はそれに 沿って移植物の神経線維が宿主に浸透し得る経路を決定しうる」ことを示唆した 。宿主脳内の移植片の外側の移植片軸索と移植片グリアとの間で観察される緊密 な空間的関連はこの仮説に支持を加える。 移植片の発生が正常な発生の間の軸索の伸長および排除に関与する過程を反復 する程度までは、これらの移植片で観察されるグリアと軸索の関連は、正常な発 生および移植片の発生での軸索の成長過程に関する手掛かりを提供する。構造的 グリアおよび胎児星状細胞は、発生の間、一過性の細胞タイプとなる傾向がある (レヴィット(Levitt，P.)とラキック(Rakic，P.)（1980）J．Comp．Neurol．193 :815-840；シュメヒェル(Schmechel，D.E.)とラキック(Rakic，P.)（1979）Anat ．Embryol．156:115-152；シルヴァー(Silver，J.)ら（1982）J．Comp．Neurol ．210:10ー29；スミス(Smith,G.M.)ら（1986）J．Comp．Neurol．251:23-45）。 これらの移植片で同定されるドナー由来のＣＤ44−ＩＲの細胞が胎児線条体の一 過性のグリア細胞に相同であるという可能性は、２個の観察により支持されるよ うである。すなわち、第一に、胎児の橈骨神経グリアもまたＣＤ44−ＩＲである （フォーゲル(Vogel，H.)ら（1992）J．Neurocytol．21:363-373）。そして第二 に、成体脳でのＣＤ44−ＩＲの低下 した発現および移植片の発生の間の神経領域に対するグリアの減少する比が存在 する。発達する脳でのグリア誘導線維のように、ＣＤ44−ＩＲの移植片グリア線 維は移植片軸索の伸長の初期の段階の重要な支持的基質を提供しうる。これは、 確立された機能性シナプスからの標的由来の向性の支持への到達を軸索が得る前 の初期の軸索の生長期の間にとりわけ重要でありうる（パーヴズ(Purves，D.)ボ ディ アンド ブレイン：ア トロフィック セオリー オブ ニューラル コ ネクションズ(Body and Brain: A Trophic Theory of Neural Connections)。( ハーヴァード大学出版局、ケンブリッジ、マサチューセッツ州(1988))）。正常 な発生および移植片の発生の双方でのそうした支持的グリア線維のその後の排除 は、その時点までに適切な標的シナプスを補充し損なった軸索の側枝の除去に寄 与する因子でありうる（オレアリイ(O'Leary，D.D.M.)とケスター(Koester，S.E .)（1993）ニューロン(Neuron)10:991-1006）。 実施例２：修飾されたブタ線条体細胞の損傷されたラット脳への移植および移植 された細胞の組織学的検査 実験デザインおよび処理群 体重300〜350gmの82匹の成体雄性シュプラグ−ドーレィ（Sprague-Dawley)ラ ット（チャールズ リバー ラボラトリーズ(Charles River Laboratories)、ア メリカ合衆国）は、移植の１週間前に右新線条体にキノリン酸の一側性の定位注 入を受けた。損傷されたラットは、線条体中に、ブタ胎児終脳の外側神経節隆起 （ＬＧＥ）から調製した線条体細胞懸濁液を移植された。５つの異なるブタ腹子 それぞれ由来のＬＧＥ細胞懸濁液（Ｅ30−Ｅ40）を別個の外科的処置でラット宿 主に移植した。74匹 の生存ラットを免疫抑制方法により３個の釣り合わせた群に分割した。第１群（ ネガティブコントロール；Ｎ＝１４）では、動物はいかなる種類の免疫抑制も受 けなかった。第２群で（Ｎ＝２９）では、移植された線条体細胞はブタＭＨＣ− Ｉに対するモノクローナル抗体のＦ(ａｂ')2断片で前処理した。第３群（ボジテ ィブコントロール；Ｎ＝31）では、未処理の細胞を移植した動物をシクロスポリ ンＡ（ＣｓＡ：10g/kg；サンド ファーマシューティカルズ(Sandoz Pharmaceut icals)、イーストハノーヴァー、ニュージャージー州）の連日の皮下注入で免疫 抑制した。全ての動物は術前に抗生物質セファロチン（ケフリン；10mg/kg；リ リー インク(Lilly Inc.)、インジアナポリス、インジアナ州）の単回皮下投与 で処理され、そしてその後、それらの飲料水中（250mg/l）にテトラサイクリン （パナマイシン；20〜40mg/kg/日；アップジョン(Upjohn)、カラマズー、ミネソ タ州）を与えられた。ＣｓＡ処理した動物は毎週体重を測定し、また、それらの ＣｓＡ用量をそれに従って調整した。ＣｓＡの十分な血清濃度を確実にするため 、ＣｓＡ処理した動物からの心内血液（灌流時に得られる）をラジオイムノアッ セイによるＣｓＡ濃度の測定に寄託した（デイモン ラボラトリーズ(Damon Lab oratries)、ウエストウッド、マサチューセッツ州）。動物は異種移植片の組織 学的分析のため移植３〜４ヶ月後に灌流した。 ブタ胎児ＬＧＥの切開 授精の30ないし40日後、超音波で確認した妊娠家畜ブタ５匹を、タフツ大学獣 医学部（グラフトン、マサチューセッツ州）で標準的な獣医学的処置に従い安楽 死させた。選択的切開およびＬＧＥ移植に適する妊娠齢の範囲は以前の研究で明 らかにされた。ディーコン(Deacon，T.)ら（1 993）Soc．Neurosci．Abstr．19:284.15。子宮角を無菌的様式で除去し、そして 迅速に氷上で無菌実験施設に移送した。無菌実験施設で死亡した胎児を取り出し そして滅菌したダルベッコ(Dulbecco)のリン酸緩衝液処理生理的食塩水（ＰＢＳ ）に移した。頭から臀部までの長さ（27〜35mm）の測定後、胎児を断頭しそして 胎児脳を正中矢状切開により頭蓋から慎重に摘出した。ＬＧＥの切開は以前に記 述されたように40倍の拡大下にダルベッコ(Dulbecco)のＰＢＳ中で実行した。パ クザバン(Pakzaban，P.)ら（1993）Exp．Brain Res．97(1):13-22。簡単には、 傍矢状切開を各半球の背面に沿って創造し、脳側室の腹側外側壁に内側および外 側神経節隆起を露出させた。切開をその後円周状に完遂させ、半球の腹側外側壁 （神経節隆起をもつ）を脳の残部から引き離した。半球の引き離した壁の外側（ 皮質）表面をその後切開用皿で平らにし、内側表面上に神経節隆起を露出させた 。内側隆起は切除しそして廃棄した。今や脳側室の引き離された壁上に単離され た外側隆起をその底部に沿って湾曲した微小ハサミで慎重に切除し、そして、フ ェノールレッドを欠いたカルシウムおよびマグネシウムを含まないハンク(Hank) の平衡塩溶液（ＨＢＳＳ；シグマ(Sigma)）を含有するペトリ皿に移した。一腹 の全胎児からのＬＧＥ組織断片を合わせた。 細胞懸濁液の調製およびＦ(ａｂ')₂処理 ＬＧＥ組織断片をＨＢＳＳ（シグマ(Sigma)）中0.5％トリプシン−ＥＤＴＡ１ mlとともに37℃で10分間インキュベーションした。断片を新鮮なＨＢＳＳで４度 洗浄し、その後、目に見える組織断片のない乳状の懸濁液が得られるまで、徐々 により小さい内径の火で磨いたパスツールピペットの先端を通して穏やかに磨砕 した。細胞数および生存能力をアク リジンオレンジ／臭化エチジウム法により測定した。ブランディン(Brundin，P. )ら（1985）Brain Res．331:251-259。各移植処置について細胞懸濁液のおよそ 半分をＦ(ａｂ')₂処理した。Ｆ(ａｂ')₂断片は、イムノピュア(ImmunoPure)Ｆ( ａｂ')₂調製キット(ピアース(Pierce)、ロックフォード、イリノイ州)を使用し 、ブタＭＨＣ−Ｉに対するモノクローナル抗体（ＰＴ85Ａ；ヴェテリナリー メ ディシン リサーチ アンド デベロップメント インク（Veterinary Medicin e Research and Development，Inc.)、プルマン、ワシントン州）の酵素的切断 により調製した。ＬＧＥ細胞を、間歇的に混合しながら４℃で30分間、ＨＢＳＳ 中のＦ(aｂ')₂断片（１μgのＦ(ａｂ')₂／細胞10⁶個）とインキュベーションし 、500ＲＰＭで５分間の遠心分離により沈降させ、そして未処理の細胞（第１群 および第３群）の濃度に等しい濃度を得るように算出した体積のＨＢＳＳ中に再 懸濁した。最終の生存可能細胞数は、異なる腹子由来の細胞懸濁液で１μlあた り細胞30,000から80,000個までに及んだ。 蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ） ＬＧＥ細胞懸濁液中の細胞上のＭＨＣクラスＩ抗原の存在をＦＡＣＳ分析によ り証明した。ベクトン−ディッキンソン(Becton-Dickinson)のＦＡＣＳｃａｎを 使用した。当該ＬＧＥ細胞懸濁液をインキュベーション緩衝液中20μg/ml濃度の ブタＭＨＣ−Ｉに対するモノクローナル抗体（ＰＴ85Ａ；ラットのＭＨＣ−Ｉに 対しては反応性でない。免疫組織化学を参照）と氷上で１時間インキュベーショ ンした。このインキュベーション緩衝液は、0.5％ウシ血清アルブミンを含む、 カルシウムおよびマグネシウムを含まないＰＢＳから成った。細胞をその後イン キュベーション緩衝液中で３度洗浄し、そしてインキュベーション緩衝液中１μ g/mlの濃度のヤギ抗マウス蛍光抗体（カペル(Cappel)、デューラム、ノースカロ ライナ州）と１時間インキュベーションした。ラット胎児ＬＧＥ細胞およびブタ 内皮細胞は、ブタＭＨＣ−ＩのＰＴ85Ａでの免疫標識のそれぞれネガティブコン トロール、ポジティブコントロールとしてはたらいた。それぞれの場合に、ＰＴ 85Ａによる細胞の特異的蛍光標識を、一次抗体を割愛した場合の細胞の非特異的 標識と比較した。 損傷および移植外科手術 ラットをペントバルビタール（65mg/kg）の腹腔内注入により麻酔し、そして コフ(Kopf)の定位枠に設置した。26Ｓゲージ針（内径／外径＝0.11mm／0.46mm） を備えつけた５μlのハミルトンシリンジを使用して、キノリン酸120ナノモル（ １μl）を各動物の右新線条体内に（前頂に関しての座標：前方＝＋1.0mm、外側 ＝−2.5mm、腹側＝−4.5mm、切歯バー−2.5mm）１分間かけて送達させた。針は 追加の１分の後取り除いた。７日後、キノリン酸で損傷した動物を以前の移植の 準備でのように麻酔した。22Ｓゲージ針（内径／外径＝0.41mm／0.71mm）を備え つけた10μlのハミルトンシリンジを使用し、損傷に使用したと同じ座標で右新 線条体に0.5μl/分の速度でＬＧＥ細胞懸濁液を慎重に送達した。第１〜３群の ラットを移植された全生存可能細胞量に基づき４群に交差分類した。すなわち、 １匹あたり細胞80,000個（Ｎ＝11）、１匹あたり細胞150,000個（Ｎ＝22）、１ 匹あたり細胞200,000個（Ｎ＝25）、および１匹あたり細胞240,000個（Ｎ＝16） 。 灌流および組織の処理 移植の３ないし４ヶ月後、動物を灌流のための準備でペントバルビタールの過 剰用量で終末的に麻酔した。動物を、ヘパリン−生理的食塩水 溶液（0.9％生理的食塩水11中1000単位のヘパリン）で、その後100mMリン酸緩衝 液（ｐＨ7.4）中４％パラホルムアルデヒド300〜400mlで、左脳室を通して灌流 した。脳を直ちに除去しそして同じ４％パラホルムアルデヒド溶液中で８時間、 後固定した。後固定の後、脳をＰＢＳ（ｐＨ7.4）中30％ショ糖で平衡化させ、 その後、凍結するミクロトーム上40μmの厚さで前脳を通り冠状縫合に沿って切 開しそしてＰＢＳ中に収集した。移植片からの軸索の生長の別の平面の検査には 、選択した脳を40μmの厚さで矢状面で切開した。 ６切片ごとに顕微鏡のスライドガラス上に固定し、そしてクレシルバイオレッ トで染色した。近接する切片はケレ(Koelle)の方法に従ったアセチルコリンエス テラーゼ（ＡＣｈＥ）組織化学を受けた。ケレ(Koelle，G.B.）（1954）J．Comp ．Neurol．100:211-235。簡単には、スライドガラスに固定した切片を、30mM酢 酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ5.0、９mM硫酸銅、16mMグリシン、４mMヨウ化チオコ リンアセチルおよび0.1mMエトプロパジンを含有するインキュベーション溶媒中 で６時間キュベーションした。インキュベーション後、スライドガラスを蒸留水 で洗浄し、10％フェリシアン化カリウム中で発色させ、そして0.5％硫化ナトリ ウムに30〜40秒曝すのに先立ち再度蒸留水中で洗浄した。 免疫組織化学 免疫染色はアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ法（ベクター ラブス(Vec tor Labs)）により実施した。自由に浮遊する切片を、ＰＢＳ中50％メタノール および３％過酸化水素で20分間前処理し、ＰＢＳ中で３度洗浄し、そして振盪台 上での一次抗体との一夜のインキュベーションに先立ちＰＢＳ中10％正常ウマ血 清（ＮＨＳ）中で60分間インキュベ ーションした。この研究で使用した一次抗体およびインキュベーション緩衝液は 、ＰＢＳで2000倍に希釈した分化抗原44のブタのクラスターのモノクローナル抗 体（ＣＤ44）、ＰＢＳ中１％ウシ血清アルブミン、１％ＮＨＳおよび0.1％トリ トンＸ−100で40倍に希釈した神経フィラメント70kDaに対するモノクローナル抗 体（ＮＦ70；バイオデザイン(Biodesign)、ケンネブンクポート、メリーランド 州）、ＰＢＳ中１％ＮＨＳで50倍に希釈したラット白血球共通抗原に対するモノ クローナル抗体（ＯＸ１；アキュレート(Accurate)、ウェストベリー、ニューヨ ーク州）、ＰＢＳ中１％ＮＨＳおよび0.1％トリトンＸ−100で50倍に希釈したラ ット補体レセプター３に対するモノクローナル抗体（ＯＸ42；アキュレート(Acc urate)、ウェストベリー、ニューヨーク州）、およびＰＢＳで1000倍に希釈した ブタＭＨＣ−Ｉに対するモノクローナル抗体（ＰＴ85Ａ；ＶＭＲＤ インク(VMR D Inc.)、ブルマン、ワシントン州）より成った。ＰＢＳ中10分間の１度のすす ぎおよび５％ＮＨＳ中10分間の２度の洗浄の後、切片を、ＰＢＳ中２％ＮＭＳで 200倍希釈のビオチニル化ウマ抗マウス抗体（ラットに吸着される；（ベクター ラブス(Vector Labs)）中、室温で60〜90分間インキュベーションした。当該 切片をその後、ＰＢＳ中で３度すすぎ、そしてＰＢＳ中アビジン−ビオチン複合 体（ベクタスタチンＡＢＣキットエリート(ELITE)；（ベクター ラブス(Vector Labs)）中、60〜90分間室温でインキュベーションした。ＰＢＳおよびトリス緩 衝液処理生理的食塩水での十分のすすぎの後、切片を、トリス緩衝液処理生理的 食塩水中0.04％過酸化水素および0.05％３，３’−ジアミノベンジジン（シグマ (Sigma)）中で発色させた。一次抗体の割愛のあるコントロールを選択した切片 で実行して染色の特異性を証 明した。 ＣＤ44、ＮＦ70およびＰＴ−85Ａ抗体はブタ組織を認識するがラット組織は認 識せず、そのためブタからラットへの異種移植片でのドナー特異的マーカーとし て使用した。ＣＤ44およびＮＦ70は、以前に記述されたように、それぞれドナー のグリアおよびニューロンのマーカーとして使用した。ディーコン(Deacon，T.W .)ら（1993）Soc．Neurosci．Abstr．19:284.15。ＯＸ１はリンパ球および活性 化された小グリア細胞を標識するのに使用した。フィンゼン(Finsen，B.R.)ら（ 1991）J．Neuroimmunol．32:159-183。ＯＸ42はマクロファージ、顆粒球および 小グリア細胞を標識するのに使用した。フィンゼン(Finsen，B.R.)ら（1991）J ．Neuroimmunol．32:159-183。 形態計測分析 移植片の体積の定量化は以前に記述されたようなコンピュータ画像分析（マッ キントッシュのイメージ(Image)v．1.44）の助けを借りて実行した。パクザバン (Pakzaban，P.)ら（1993）Exp．Brain Res．97:13-22。簡単には、顕微鏡像をコ ンピュータ画面に映し、そして移植片の境界をビデオの顕微鏡像上に重ね合わせ た目盛りをつけた画像分析ウインドウ中でなぞった。それぞれの複写により囲ま れた面積の自動計算の後、横断面積を移植片の吻から背の伸長を横切って積分し 、移植片の体積を得た。 ブタＬＧＥ細胞上のＭＨＣ−Ｉの発現 ブタＬＧＥ細胞上のＭＨＣ−Ｉの発現はブタＭＨＣ−Ｉに対するモノクローナ ル抗体（ＰＴ85Ａ）を使用するＦＡＣＳ分析により確認した。簡単には、ブタ外 側神経節隆起細胞（ＬＧＥ）、ラットＬＧＥ細胞（ネ ガティブコントロール）およびブタ内皮細胞（ポジティブコントロール）のＦＡ ＣＳ分析に対応する蛍光強度ヒストグラムを得た。黒と灰色のヒストグラムは一 次抗体の存在下もしくは非存在下で実行したＦＡＣＳ分析に対応した。ＰＴ85Ａ の存在下での蛍光シグナルのバックグラウンドの蛍光（ＰＴ85Ａの非存在下）と の比較は、蛍光強度ヒストグラムの右方へのシフトを示した。特異的標識の閾値 をバックグラウンドの蛍光強度の95％と定義した場合には、細胞の20.1％がＰＴ 85Ａにより特異的に標識されることが見出された。蛍光強度ヒストグラムの大き なシフトは、ラットＬＧＥ細胞（ネガティブコントロール）をＰＴ85Ａで標識し た場合に観察されなかった。対照的に、ブタ内皮細胞（ポジティブコントロール ）の99.6％はＰＴ85Ａで特異的に標識された。 線条体異種移植片の生存および大きさに対するＭＨＣ−Ｉ遮蔽の影響 移植３〜４ヶ月後の線条体異種移植片の生存を、それぞれドナー由来のニュー ロンおよびグリア要素のマーカーであるブタＮＦ70およびＣＤ44についての免疫 染色により評価した。Ｆ(ａｂ')₂処理した動物の29移植片中15個が生存し、一方 、非免疫抑制動物では14移植片中１個のみであった（第９図）。ＭＨＣ−Ｉ遮蔽 後の移植片の生存の改善は、ピアソン(Pearson)のχ²解析により有意であること が見出された（Ｐ＜0.005、χ²＝8.03、ｄｆ＝１）。同様に、ＣｓＡ処理後の移 植片の生存（23/31）は免疫抑制の非存在下でのそれより有意に大きかった（Ｐ ＜0.001、χ2＝17.42、ｄｆ＝１；第９図）。Ｆ(ａｂ')₂処理群とＣｓＡ処理群 との間の移植片の生存での差異は統計学的に有意ではなかった（Ｐ＞0.05、χ² ＝3.26、ｄｆ＝１）。重要なことに、後者の群でのＣｓＡの血中濃度(832〜1309 μg/l：平均1175±115μg/l)は均一に治療上２〜３lで あった。 移植片の体積の定量化はＦ(ａｂ')₂処理群およびＣｓＡ処理群のより詳細な比 較を可能にした（第１０図）。Ｆ(ａｂ')₂処理した動物での平均移植片の体積（ 1.07±0.30mm³；平均±標準誤差）は、ＣｓＡ処理した動物でのそれより小さか った（3.14±0.51mm³；Ｐ＜0.005、ｔ＝3.06、ｄｆ＝36；非ペアード(unpaired) t検定）。各処理群での移植された細胞投与量の移植片の体積に対する影響につ いて制御するため、分散の２方向解析を実行した。Ｆ(ａｂ')₂処理群とＣｓＡ処 理群との間の移植片の体積での差異は有意のままであった（Ｐ＜0.05、Ｆ比＝5. 24、ｄｆ＝１）が、移植片の体積に対する細胞投与量の影響は、検討した投与量 範囲で統計学的有意に到達しなかった（Ｐ＞0.05、Ｆ比＝0.33、ｄｆ＝３）。Ｆ (ａｂ')₂およびＣｓＡで処理した線条体異種移植片の細胞構造体系的組織化 線条体異種移植片の内部の組織化がＦ(ａｂ')₂処理により変化するかどうかを 決定するため、Ｆ(ａｂ')₂処理した移植片の細胞組成をＣｓＡ処理した移植片の それと比較した。ニッスル染色した切片上では、双方の群の移植片はより小さな 細胞の索状組織により囲まれる大きなニューロン様細胞の多数のクラスターから 成った。大きな細胞のクラスターのニューロン（および線条体）の表現形は、近 接する切片上のこれらの領域とＡＣｈＥ陽性領域との間の精密な一致により確認 された。若干のニューロンのクラスターはＡＣｈＥ染色の混合した密度を表し、 これはこれらの成熟するブタ移植片中のＡＣｈＥの最近の発現に矛盾しなかった 。ディーコン(Deacon，T.W.)ら（1993）Soc．Neurosci．Abstr．19:284.15。近 接する切片上のＮＦ70およびＣＤ44の免疫染色の比較は、Ｆ(ａｂ ')₂およびＣｓＡで処理した動物の双方での移植片のＮＦ70との免疫反応性（Ｎ Ｆ70−ＩＲ）のニューロン成分およびＣＤ44−ＩＲのグリア成分の矛盾しない分 離を示した。双方の群で、ＮＦ70−ＩＲの領域はＡＣｈＥ陽性のニューロンのク ラスターに対応し、一方、ＣＤ44−ＩＲのグリアはニューロンのクラスターを取 り囲みかつ分離する索状組織に沿って分布した。移植片の細胞構造体系的組織化 は双方の群で同様であったが、ＮＦ70−ＩＲの要素の相対比はＣｓＡ処理した移 植片でより大きいようであった。 選択した移植片でのブタＭＨＣ−Ｉについての免疫染色は、生存する異種移植 片の周辺でのドナーＭＨＣ−Ｉの持続する発現を示した。重要なことに、ドナー ＭＨＣ−Ｉの発現パターンは双方の処理群でドナー由来のＣＤ44ＩＲのグリアの 分布に対応した。ＮＦ70−ＩＲのニューロンのクラスターでは近接する切片での ＭＨＣ−Ｉの発現が全くなかった。若干の脳（３群全てで）では、壊死的移植片 レムナントがニッスル染色された切片で検出された。無傷の宿主線条体白質路の 間に散在したこれらの領域は、ニッスル染色上、小さな細胞で浸潤されていた。 近接する切片のＯＸ１（リンパ球および活性化された小グリア細胞を標識する） およびＯＸ42（マクロファージおよび小グリア細胞を標識する）での免疫染色は 、これらの領域での宿主の免疫細胞および／もしくは活性化された小グリア細胞 の蓄積の部分的に重なり合うパターンを示した。免疫浸潤ははっきりと限局され 、かつ、線条体白質路および移植片の残存すニューロンの豊富な部分のほとんど を残していた。 Ｆ(ａｂ')₂およびＣｓＡ処理した線条体異種移植片からの軸索の生長 Ｆ(ａｂ')₂処理した移植片の宿主脳内への軸索の伸長能力を、選択した 矢状切開した脳でのブタＮＦ70での免疫染色により、ＣｓＡ処理した移植片のそ れと比較した。豊富なＮＦ70−ＩＲの突起は、ＣｓＡおよびＦ(ａｂ')₂処理した 動物の双方で、線条体内の移植片の尾極から端を発し、そして宿主の淡蒼球およ び中脳の方向に尾側にさらに伸長した。双方の群での標的に向けられた生長は他 の方向での軸索の生長に卓越した。ＣｓＡ処理した移植片でと同じように、Ｆ( ａｂ')₂処理したニューロンに端を発する軸索は宿主内包に沿って３mmまで伸長 した。 これらのデータは、ドナーＭＨＣ−Ｉに対するＦ(ａｂ')₂抗体断片での異種胎 児神経細胞の前処理が、非免疫抑制コントロールに比較して神経の異種移植片の 生存を大きく高めることを示す。Ｆ(ａｂ')₂処理した異種移植片は、ＣｓＡ処理 した移植片より小さいにもかかわらず、典型的な線条体異種移植片の細胞構造体 系的組織化を表し、かつ、標的に向けられた長距離の軸索の生長についての能力 を維持した。 実施例３：損傷されたサル脳でのブタ線条体細胞の移植および移植された細胞の 機能的分析 定位外科手術 ニューイングランド地域霊長類研究センター(New England Regional Primate Research Center)（ＮＥＲＰＲＣ、サウスボロ、マサチューセッツ州、アメリカ 合衆国）で繁殖した、体重2.5〜3.5kgの５匹の雄性アカゲザル（マカカ ムラタ (Macaca mulatta)）は、ＮＥＲＰＲＣの外科施設で行われた８回の手術処置でキ ノリン酸（ＱＡ）の定位の線条体内への注入を受けた。それぞれのサルの定位座 標は術前のＭＲＩの検討に基づき決定した（下を参照）。各手術に先立ち、動物 を鎮静し、そしてケタミン（10mg/kg、筋肉内）、キシラジン（１mg/kg、筋肉内 ）、アトロ ピン（0.05mg/kg、筋肉内）、およびケフリン（10mg/kg、筋肉内）を前投薬した 。1.0％イソフルランでの一般的な気管内麻酔の導入の後、動物をコフ(Kopf)の 定位枠に仰臥位に置いた。耳バーおよび眼窩バーは、下位眼窩縁から外耳道まで 広がる平面（眼窩道面）が水平面に平行でかつ注入の組み立て(assembly)の軸に 直行であるように調整した。枠内の頭蓋の対称的配置は３面でのＸ線により確認 した。重要なことに、術前に得られたＭＲＩ像もまた眼窩道面に垂直に向いてお り、かように線条体の標的のＭＲＩ座標の定位枠の座標への移行を容易にした。 頭皮の進入部位の上に横たわる手術場所を抗菌溶液で調製し、そして無菌ドレ ープで分離した。修飾した22ゲージ針（長さ３インチ、外径0.028インチ、内径0 .016インチ、斜角45°）に取りつけた20μlハミルトンシリンジから成る注入の 組み立てをキノリン酸で満たし、そして枠上に固定した。ＱＡはリン酸緩衝液（ ｐＨ7.4）中200mMの濃度で調製し、50μlのアリコートとして−20℃で保存し、 そして手術の間は氷上で保存した。頭蓋を５cmの矢状縫合の頭皮切開で露出させ 、そして２×２cmの頭蓋局部切開を予期される針の進入部位に創造した。下にあ る硬膜を分割して軟膜表面を露出させた。注入の組み立てを、３次元でのＭＲＩ の参照点として外耳道、矢状静脈洞および軟膜表面を使用して術前のＭＲＩに基 づき算出した定位の標的部位まで低下させた。ＱＡは２分あたり１μlの速度で 注入し、その後針の取り除きの前に２分間待機した。全体でＱＡ10μl（２マイ クロモル）を各標的部位で２個の注入路に沿って注入した。初期の標的部位は、 Ｍ12およびＭ14での右尾状核、Ｍ15での右吻側被殻、およびＭ16での右尾側被殻 から成った。最初の損傷の設定のおよそ２ヶ月後、Ｍ12は右吻側被殻に付加的損 傷を受け、また、Ｍ 14およびＭ15は右尾側被殻に付加的損傷を受けた。Ｍ17は１回の処置で尾側被殻 を両側性に損傷した。５匹のサルでの尾状核の標的の定位座標は以下の範囲にわ たって分布した。すなわち、耳バーに関して前方18〜22mm、矢状縫合に関して外 側４〜６mm、そして軟膜表面に関して腹側13〜15mm。同様に、吻側および尾側の 被殻の標的の座標の範囲は、それぞれ、Ａ：17〜22、Ｌ：10〜12、Ｖ：16〜17、 およびＡ：11〜16、Ｌ：12〜14、Ｖ：17〜19であった。一連の注入の終了時に頭 皮を縫合して閉じ、そして動物を覚醒させかつそのケージにもとした。 磁気共鳴画像法 それぞれのサルは、最初の外科手術に先立ち、また各損傷手術の１〜２ヶ月後 、Ｔ1およびＴ2加重ＭＲ画像法を受けた。ＭＲＩの検討は、ＧＥ シグナ(Signa )1.5テスラ画像システムを使用し、鎮静した動物（ケタミン／キシラジン、15／ 1.5mg/kg)筋肉内）で実行した。動物は仰臥位に置き、それらの頭をリストコイ ル内にしっかりと置いた。眼窩道面（上記参照）を、最初に、矢状縫合探索Ｔ1 加重画像で輪郭を描いた。偽冠状縫合Ｔ1加重画像をその後、3.0mmの厚さの薄片 、300m秒の反復時間（ＴＲ）、および20m秒のエコー時間（ＴＥ）で、フランク フォルト（Frankfort)平面に垂直な薄片の方向で得た。Ｔ2加重のダブルスピン エコー画像は、同じ方向で、ＴＲは3000m秒、また、ＴＥは第一エコーおよび第 二エコーについてそれぞれ40および80m秒で得た。 陽電子放射断層法 リガンド¹¹Ｃ−ＳＣＨを、ベンゾナフタゼピン（シェーリング(Schering)化合 物39166）の直接の¹¹Ｃ−ヨウ化メチルでのメチル化により合成した。簡単には 、¹¹Ｃ−ヨウ化メチルを、0.1mlのＣＨ₃ＣＮ：ＤＭＦ （９：１）中のＮ−デメチル化された前駆体（ノル−ＳＣＨ）の100μgのアリコ ートと反応させ、そして活性を溶媒の蒸発の後リンゲル乳酸緩衝液中に溶解した （＞600Ci/mmol）。精製および分析は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ） を使用して実行した。ＰＥＴ測定は、360ＢＧＯ検出器（ＦＷＨＭ解像度：4.5mm ；感度：46,000Hz/μCi/ml）の１個のリングを装備した高分解能ＰＥＴスキャン ニングシステム（ＰＣＲ−Ｉ）を使用して実行した。放射データは実験の終了ま で（90分）のトレーサー注入時間から得た。鎮静したサル（ケタミン／キシラジ ン、15／1.5mg/kg，筋肉内）は頭部ホルダー内に頭を固定して仰臥位に置いた。 ７個の断層平面（尾状核および被殻を通る５個の水平面ならびに小脳を通る２個 の水平面）を、耳バーを含有する正面の平面の10、15、20、25および30mm前方な らびに５および10mm後方に配置された予め決められた位置で、被験体のベッドを 動かすことにより、連続して検討した。データはファルデ(Farde)ら（1986）サ イエンス(Science)231:258-261およびセドヴァル(Sedvall，G.)ら（1991）Ann． Neurol．32:358-364に従って定量化した。 行動分析 研究の開始時に、全動物を、全体で６時間を分割した期間で、1.5m×1.5m×1. 5mのプレキシガラスフィルムで覆ったケージに慣らした。動物はその後、ＱＡ損 傷手術の前と後の双方に３週間の間隔で、このケージ中でビデオ撮影した。各回 とも、動物を最初に20分間フィルムで覆ったケージに慣らさせ、その後10分間刺 激せずに（薬物のない状態）撮影し、そして最後にアポモルヒネ（0.5mg/kg筋肉 内）を投与しそしてさらに30分間撮影した。これは自発運動性行動およびジスキ ネジーを引き起こす ようデザインされたドーパミン作働性刺激後の行動の双方の評価を可能にした。 観察者は、実際のビデオ撮影の間、動物の行動に対する外的影響を最小限にする よう、存在しなかった。ビデオテープは、後で２名の独立した観察者により検分 された。この観察者は、失調性体位、四肢の攣縮、衝撃性運動、舞踏病状および アテトーシス様の運動、頭部および首の捻転、体幹のねじれ、および骨盤の回転 を包含する異常な不随意運動（ジスキネジー）の全ての症状発現の数および持続 時間を記録するよう指導された。記録は、ＰＰにより書かれたマッキントッシュ のハイパーカードに基づくプログラム（ハイパーモンキー(Hypermonkey)2.0）の 助けで容易にされた。30分間の撮影中、サルがアポモルヒネ誘発性のジスキネジ ー状態で過ごす時間全体（秒数で）を、その回のサルのジスキネジースコアとし て定義した。ジスキネジーの持続時間はその後、ＰＥＴおよびＭＲＩの検討に基 づく動物の線条体内の興奮神経毒性の損傷の場所との相互に関連させた。 ＱＡ損傷の解剖学的位置推定 それぞれのサルの線条体中のＱＡ損傷の場所および程度は、線条体のドーパミ ン受容性(dopaminoceptive)ニューロンの損失の指標としてＤ1レセプター結合で の減少を使用し、ＭＲ画像法および定量的ＰＥＴ分析により評価した。ブラウネ ル(Brownell，A.-L.)ら（1994）Exp．Neurol．125:41−51。興奮神経毒性の領域 のＭＲシグナルは、損傷後の最初の月にはＴ1加重画像上で低強度から高強度ま で展開したが、しかし、全てのＴ2加重画像上では高強度であり、以前の報告に 矛盾しなかった。ハントレイ(Hantraye，P.)ら（1992）プロシーディングス オ ブ ナショナル アカデミー オブ サイエンス ＵＳＡ(Proc．Natl．Acad．S ci． USA)89:4187-4191。全例で、損傷の意図された位置、Ｔ1およびＴ2加重画像上の ＭＲシグナルの場所、ならびにＰＥＴによるＤ1レセプター結合の局所的枯渇の 間に優れた相関が存在した。全ての損傷は、広がりが焦点的であることが見出さ れ、３個の領域すなわち尾状核頭部（例えばＭ12）、被殻の前半分（例えばＭ15 ）もしくは被殻の後半分（例えばＭ16）のうちの１個に限られた。３個の代表的 な例でのＰＥＴデータの定量化は、無傷の反対側に比較して、それらのそれぞれ の領域でのＤ1レセプター結合で類似の枯渇を示した。尾状核頭部での損傷は、 示された５mmの薄片でＤ１レセプター結合の18％の枯渇を示した。前方被殻への 損傷の後、被殻のＤ1レセプター結合の26％の損失が前方の薄片で観察された。 最後に、後方被殻への損傷はこの後方の５mmの薄片で27％のＤ1レセプター結合 での被殻の枯渇を生み出した。この定量化は選択的損傷はおおまかに大きさに等 価であることを確認した。 顕著な自発的もしくはアポモルヒネ誘発性のジスキネジーを呈しなかった動物 は、最初の損傷後約２ヶ月に異なる線条体領域に第二の損傷を受けた。とりわけ 、尾状核頭部に損傷のある２匹の動物（Ｍ12およびＭ14）は、前方被殻（Ｍ12' ）もしくは後方被殻（Ｍ14'）に第二の損傷を受け、また、前方被殻に最初の損 傷をもつ１匹の動物（Ｍ15）は後方被殻に第二の損傷を受けた（Ｍ15'）。後方 被殻に最初の損傷のある１匹のジスキネジーの動物は第二の損傷を受けなかった （Ｍ16）。損傷のこれらの７個の設定に対応する行動データに基づき（以下を参 照）、後方被殻での両側性の選択的ＱＡ損傷の運動性行動に対する影響を１匹の 動物（Ｍ17）で検討した。 選択的な一側性の線条体損傷の運動性行動に対する影響 一側性に損傷された全ての動物は損傷手術の直後に困難なく摂食および毛づく ろいが可能であり、また、いずれも不全片麻痺もしくは痛覚鈍麻の兆候を表さな かった。アポモルヒネの非存在下では、動物は損傷後の最初の１週間に、軽度の 一過性のジスキネジー攣縮または反対側の腕もしくは脚の失調症体位を様々に表 したが、しかし全てのそうした自発的運動は２週目までに消失した。若干の動物 （Ｍ12、Ｍ14およびＭ16）は一側への自発的回転の好みを発生したが、しかし回 転の方向は異なる動物で異なり、また、１匹の動物で時間とともに変わり得た。 例えば、Ｍ14は、右尾状核損傷後の最初の14日の連日の10分間の観察時間に、左 （損傷の側の反対側）への125〜180回の完全な回転を表した。対照的に、Ｍ12は 右尾状核損傷後２日目には71回の反対側への回転（10分あたり）を、４日目には 10回の同側への回転を、10日目には243回の同側への回転を（ピーク）そして14 日目には142回の同側への回転を表した。 自発的ジスキネジー運動は第１週後に消失したにもかかわらず、一時的ジスキ ネジー状態はアポモルヒネ投与により常に誘発され得た。無傷の動物ではアポモ ルヒネ誘発性のジスキネジーは存在しないかもしくは短時間かのいずれかであっ た。無傷の動物でのこうしたジスキネジーの累積持続時間は1800秒の試験間隔で 84秒を越えなかった。尾状核損傷のある２匹の動物のうち、Ｍ12はアポモルヒネ 誘発性のジスキネジーを表さなかったが、一方、Ｍ14は短時間の左脚の失調症体 位をはっきりと表示した。尾状核損傷への前方被殻の損傷の追加はジスキネジー を生み出さなかった（Ｍ12'）が、一方、尾状核損傷のある動物での後方被殻の 損傷の追加（Ｍ14'）は、顕著な攣縮および全ての四肢の持続的失調症、体幹の 間歇性のねじれ、首の捻転、ならびに不規則な頭部運動により特 徴づけられる、著明な持続するアポモルヒネ誘発性のジスキネジーを生み出した 。同様に、最初の尾状核損傷の非存在下では、孤立した前方被殻の損傷はジスキ ネジーを生み出さなかった（Ｍ15）が、一方、選択的な後方被殻の損傷は、全て の四肢の著明な不規則な攣縮および尾の失調症を生み出した（Ｍ16）。興味深い ことに、後方被殻の損傷の存在はアポモルヒネ誘発性のジスキネジーの発生と相 関したにもかかわらず、先の前方被殻の損傷のある動物への後方被殻の損傷の追 加はジスキネジー症候群を生み出せなかった（Ｍ15'）。 選択的な両側の後方被殻の損傷 一側性に損傷された動物と対照的に、両側性に損傷された動物（Ｍ17）は損傷 後の最初の48時間に著明な自発性のハンチントン様の運動を呈した。この動物は 全ての四肢での正常な強さおよびよく保存された申し分ない運動協調（食餌ペレ ットへの到達により評価される）を有するように見えたが、隣接する四肢の運動 の乏しい協調、腕の間歇的伸長、前腕および手首の不規則な曲がり、失調症、骨 盤の回転、体幹の捻転、口顔のジスキネジー、および軟食を必要とする咀嚼運動 の協調不能を表した。この研究で観察された全ての異常な運動性行動のうち、こ の両側性に損傷された動物での異常な自発的運動の型は、ハンチントン病の特徴 を示す舞踏病失調症運動に最も密接に似ていた。この自発的運動性症候群は損傷 後第３日までに消散し、そして動物は食餌ペレットを咀嚼しかつ毛づくろいする 能力を回復した。アポモルヒネ誘発性の運動性症候群は、しかしながら、存続し かつ迅速なジスキネジー性運動および短時間の舞踏病の症状発現により特徴づけ られた。 サル脳の損傷された領域への線条体細胞の移植 薬理学的免疫抑制（Ｆ(ａｂ')₂断片を使用するブタ線条体細胞の修飾もしくは シクロスポリン投与のいずれか）と共に、妊娠30日後、外側神経節隆起から得た 約100万個の神経細胞を含有するブタ胎児細胞懸濁液を、サルＭ15、Ｍ16および Ｍ18の損傷部位に移植した。サルＭ15およびＭ18にはＦ(ａｂ')₂処理線条体細胞 を移植した。サルＭ16には非Ｆ(ａｂ')₂処理線条体細胞を移植したが、しかし、 移植の１日前に開始したシクロスポリンで処理した。 移植前および移植後４ヶ月のサルＭ15およびＭ16のＰＥＴ像を上に記述された ように創製し、そして第１１図に示す。第１１図に示されるように、移植後、双 方の動物の損傷された側でＰＥＴシグナルの増大が存在する。 サルＭ16およびＭ18はその後、上で記述されたように、アポモルヒネ誘発性の ジスキネジーにより測定されるような行動欠損について試験した。ジスキネジー の測定は移植の前および後の双方で行った。これらの試験結果は第１２図および 第１３図にグラフの形態で示される。第１２図に示されるように、サルＭ16での 回復は移植後２ヶ月で観察され、そして移植後４、６、９、および13ヶ月で継続 していた。第１３図に示されるように、サルＭ18での回復は移植後６ヶ月で観察 され、そして移植後９ヶ月継続していた。 実施例４：損傷されたラット脳へのブタ腹側中脳細胞の移植ならびに移植された 細胞の組織学的および機能的分析 損傷外科手術、行動試験および実験群 成体の雌性シュプラグ−ドーレイ(Sprague-Dawley)ラットは、10μl ハミルト ンシリンジを使用する内側前脳束中の２個の部位での６−ＯＨ ＤＡ（3.6μg/μl 生理的食塩水中0.02％アスコルビン酸）の定位注入（１部位 あたり2.5μl）による一側のドーパミン（ＤＡ）を枯渇する損傷を受けた（前頂 に関しての座標：ＡＰ＝−4.0、Ｌ＝−0.8、Ｖ＝−8.0、切歯バー＝＋3.4；ＡＰ ＝−4.4、Ｌ＝−1.2、Ｖ＝−7.8、切歯バー＝−2.4）。６−ＯＨＤＡは１μl/分 の速度で注入し、そして針は取り除くのに先立ちさらに２分間その場所に残した 。全ての手術はコフ(Kopf)の定位枠内でペントバルビタールナトリウム（65mg/k g、腹腔内）麻酔下に行った。損傷後３週に、ラットを、自動回転計（サンディ エゴインストゥルメンツ(San Diego Instruments)を使用してアンフェタミン誘 発性（5mg/kg、腹腔内）の回転の非対称性について試験した。ウンガーシュテッ ト(Ungerstedt，U.)ら（1970）Brain Res．24:485-493。 およそ97％のＤＡ枯渇を反映する（シュミット(Schmidt，R.H.)ら（1982）J． Neurochem．38:737-748）90分あたり800回転より多い正味の同側の回転（反対側 の回転を差し引いた同側の回転）のある24匹のラットを、移植前の回転スコアに 関して釣り合わせた２個の実験的異種移植群に分割した。Ａ群（ｎ＝12）では、 ラットは、移植前１日に開始するシクロスポリンＡ（ＣｙＡ）の連日の注入(サ ンドイミュン；10mg/kg、オリーブ油で希釈する、皮下投与；サンド(Sandoz)、 イーストハノーヴァー、ニュージャージー州)を受けた。Ｂ群（ｎ＝12）ではラ ットはＣｙＡを投与されなかった。ＣｙＡ処理ラットは、移植後30日から開始す るそれらの飲料水（250mg/l）を介してテトラサイクリン（パナマイシン；１日 あたりおよそ20〜40mg/kg；アップジョン(Upjohn)、カラマズー、ミネソタ州） を投与された。回転の非対称性を移植後４〜６週の間隔でモニターし、移植片に 関連した機能回復を評価した。Ａ群の１匹のラッ トが移植手術の間に死亡し、また、Ｂ群の１匹のラットがアンフェタミン回転の 後に死亡した。 ブタ胎児腹側中脳の調製および移植 胎児は、タフツ大学獣医学部（グラフトン、マサチューセッツ州）の標準的処 置に従い、超音波で確認した２匹の授精後27日の妊娠ヨークシャーブタから得た 。胎児（頭から臀部までの長さ、ＣＲＬ＝21mm）を、冷やした無菌のカルシウム およびマグネシウムを含まないダルベッコ(Dulbecco)のリン酸緩衝液処理生理的 食塩水（ＰＢＳ）を入れた皿に移し、そして腹側中脳（ＶＭ）を周囲の組織から 切開してそしてダルベッコのＰＢＳを含有するペトリ皿に収集した。ＶＭ断片を 、予め温めたカルシウムおよびマグネシウムを含まないハンク(Hank)の平衡塩溶 液（ＨＢＳＳ）中の0.05％トリプシン−0.53mMＥＤＴＡ（シグマ(Sigma)）1.5ml 中、37℃で10分間インキュベーションした。組織をその後、50μg/mlのプルモザ イム（ヒト組み換えデオキシリボヌクレアーゼ、ジェネンテック(Genentech)） を含むＨＢＳＳで４度洗浄し、そしてその後、単独の細胞および細胞の小さな塊 を含有する細胞懸濁液が得られるまで、減少する直径の火で磨いた一連のパスツ ールピペットを通して穏やかに磨砕した。細胞数および生存能力を、先に記述し たようにアクリジンオレンジ−臭化エチジウムを使用する蛍光顕微鏡下に決定し た。ブランディン(Brundin，P.)ら（1985）Exp．Brain Res．60:204-208。 ラットは先のセクションに記述されたように麻酔し、そしておよそ200,000個 のＶＭ細胞の懸濁液を脱神経した線条体中に移植した。10μlのハミルトンシリ ンジを使用し、ＶＭ細胞懸濁液２μlを、１μl/分の速度で２個の線条体部位の それぞれに注入し、その後、針を取り除くのに 先立ち２分間小休止した。（前頂に関しての座標：ＡＰ＝＋1.5、Ｌ＝−2.8、Ｖ ＝−5.0ないし−4.5；ＡＰ＝＋0.5、Ｌ＝−3.0、Ｖ＝−5.0ないし−4.5、切歯バ ー＝−3.3）。全てのラットはセファロチン（ケフリン；10mg/kg、皮下；リリー インク(Lilly，Inc.)，インジアナポリス、インジアナ州）およびメチルプレ ドニゾロン（デポ−メドロール；５mg/kg、筋肉内；アップジョン(Upjohn)、カ ラマズー、ミネソタ州）の術前用量を受けた。 灌流および組織学的処置 移植後19週に、動物をペントバルビタールナトリウムで終末的に麻酔し、そし て250mlの冷ヘパリン化生理的食塩水（1000単位ヘパリン／１1 0.9％生理的食塩 水）その後250mlの100mMＰＢＳ（ｐＨ7.4）中冷４％パラホルムアルデヒドで左 脳室を通し還流した。脳を除去しそしてＰＢＳ（ｐＨ7.4）中30％ショ糖に移す 前にこの同じパラホルムアルデヒド溶液中で８時間、後固定した。平衡化の後、 一連の40μmの冠状縫合切片を凍結ミクロトームを使用して切断しそしてＰＢＳ 中に収集した。 ６切片ごとに移植片の生存を評価するためにクレシルバイオレットで染色した 。ニューロンの生存および移植片の形態学を評価するため、近接の切片を、チロ シンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、神経フィラメントもしくはドナー由来のグリア について、アビジン−ビオチンペルオキシダーゼ法（ベクター ラブス(Vector Labs)、バーリンゲイム、カリフォルニア州）により免疫染色した。自由に浮遊 する切片はＰＢＳ中50％メタノールおよび0.3％過酸化水素で20分間前処理し、 ＰＢＳ中で３度すすぎ、そしてその後、一次抗体との一夜のインキュベーション に先立ちＰＢＳ中10％正常ブロッキング血清（ＮＢＳ；ＴＨおよびＮＦ70につい ては正常ヤギ血清；ＣＤ44については正常ウマ血清）で１時間プレインキュベー ションした。ＴＨ抗体（ペル−フリーズ(Pel-Freez)、ロジャース、アーカンソ ー州)は１％正常ヤギ血清、１％ウシ血清アルブミンおよび0.1％トリトンＸ−10 0を含有するＰＢＳで250倍に希釈した。神経フィラメント分子量70,000に対する モノクローナル抗体（ラットに吸着される、ＮＦ70；バイオデザイン(Biodesign )、ケンネブンクポート、メーン州）、はＰＢＳで1000倍に希釈した。ドナーの グリアを免疫染色するために、分化抗原44のブタのクラスターに対するモノクロ ーナル抗体（ＣＤ44；ダイアクリン インク(Diacrin Inc.)、チャールズタウン 、マサチューセッツ州）をＰＢＳを2000倍に希釈した。切片をその後ＰＢＳ中で 洗浄し、そして、ＰＢＳ中２％ＮＢＳで200倍（ＴＨ、ＣＤ44）もしくは1000倍 （ＮＦ70）に希釈したヤギ抗ウサギ（ＴＨ；ベクターラブス(Vector Labs)）、 ヤギ抗マウス（ＮＦ70；シグマ(Sigma)）もしくはウマ抗マウス（ＣＤ44；ベク ター ラブス(Vector Labs)）のビオチン化された二次抗体と90分間インキュベ ーションした。３度のＰＢＳでのすすぎの後、切片をアビジン−ビオチン複合体 （ベクタスタチンＡＢＣキットエリート(ELITE)、ベクター ラブス(Vector Lab s)）と90分間インキュベーションし、ＰＢＳで１度そして0.05Mトリス緩衝液処 理生理的食塩水（ＴＢＳ）で２度すすぎ、その後ＴＢＳ中0.04％過酸化水素およ び0.05％３，３’ジアミノベンジジン（シグマ(Sigma)）で５〜15分間発色させ た。 選択された切片では、ドナー由来の細胞をジゴキシゲニンで標識したブタ反復 エレメント（ＰＲＥ）ＤＮＡプローブでのインジツハイブリダイゼーションを介 して同定した。このプローブは脳の切片について以下 の修飾をもち、先に記述されたように（エッティンガー(Oettinger，H.F.)ら（1 995）Cell Transplant．4:253-256）ブタ核と特異的に反応する。簡単には、Ｔ Ｈ免疫組織化学的染色の後、切片をスライドガラス上に置き、乾燥させ、ペプシ ンで覆い、そして50℃で15分間インキュベーションした。２×塩化ナトリウム− クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中での２度の５分間のすすぎの後、切片を乾燥さ せ、そして、ハイブリソル(Hybrisol)VIIIで希釈（700倍；オンコー インク(On cor，Inc.)、ゲイタースバーグ、メリーランド州）した234bpのＰＣＲ産物をジ ゴキシゲニンで標識したＰＲＥプローブを含有する（25mg/ml）ハイブリダイゼ ーション混合物で覆った。ＰＲＥプローブは反復配列に隣接するプライマーを使 用するＰＣＲにより創製し、そしてジゴキシゲニンで標識した（ジゴキシゲニン ＤＮＡラベルキット、ベーリンガー マンハイム(Boehringer Mannheim)、イン ジアナポリス、インジアナ州）。切片をガラス製のカバーグラスで覆い、そして 100℃で10分間変性させた。37℃での一夜のハイブリダイゼーションの後、スラ イドガラスを２×ＳＳＣに浸してカバーグラスを取り除き、そして切片を２×Ｓ ＳＣ中65％ホルムアミド溶液中で、37℃で２度そして42℃で１度、10分間ずつす すいだ。切片をその後ＰＢＳ中で２度すすぎ、そしてアルカリフォスファターゼ 結合抗ジゴキシゲニン抗体（ＰＢＳ中２００倍希釈；ベーリンガー マンハイム (Boehringer Mannheim)、インジアナポリス、インジアナ州）と室温で２時間イ ンキュベーションした。切片をその後５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル リン酸／４−ニトロブルー塩化テトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）基質（ザイ メッド(Zymed)、サンフランシスコ、カリフォルニア州）で発色させ、そしてヌ クレアーファストレッドで対 比染色した。 形態計測的および統計学的分析 回転のデータは、ＳＡＳ6.08（ＳＡＳ インスティトチュート(SAS Institute )、ケリー、ノースカロライナ州）での分散の反復測定分析（一般的線型モデル ）により、その後多重比較のためのコントラスト(CONTRAST)およびボンフェロニ (Bonferonni)の捕正により分析した。非線型回帰は、マーカード−レーベンベル ク(Marquardt-Levenberg)のアルゴリズムを使用し、デルタグラフ プロフェッシ ョナル(DeltaGraph Professional)3.5（デルタポイント(Delta Point)、モンタ レー、カリフォルニア州）で実行した。ＴＨ陽性のニューロンを各移植片の６切 片ごとに計測し、そしてアベルクロンビー(Abercrombie)の式（アベルクロンビ ー(Abercrombie)（1946）Ana．Rec．94:239-247）を使用して移植片あたりのＴ Ｈニューロンの総数として表し、また、移植片の総体積を、コンピュータ画像解 析システム（イメージ(Image)v．1.52、マッキントッシュ用）の助けを借りてＣ Ｄ44陽性移植片領域を測定しそして移植片を横断する横断面積を積分することに より、定量化した。ＴＨ陽性ニューロンの生存および移植片の体積は、非ペアー ドｔ検定により群間で比較した。ｐ＜0.05の値は統計学的に有意と考えた。ブタ 腹側中脳移植片の回転の非対称性に対する影響 アンフェタミン誘発性の回転の非対称性を、ＤＡを枯渇させたラット線条体へ のブタ胎児ＶＭ細胞の移植の後、４〜６週の間隔で評価した。ＣｙＡ処理および ＣｙＡ非処理ラットについての個々の正味の回転スコアは第１４Ａ〜１４Ｂ図に 要約される。ＣｙＡ処理群では、８匹のラットが移植前に関連して移植後８週で の回転で50％より大きな減少を示し、 また、９匹目のラットは13週までに回転の低減を示した。13週に機能性移植片の 行動的証拠のあった２匹のラットは、移植後18週までに移植前の基礎の回転レベ ル近くに戻った。さらに２匹のＣｙＡ処理ラットは、この研究の進行の間に行動 の回復のいかなる証拠も示さなかった。 回復の類似の時間経過は、11匹のラットのうち６匹が移植後８週に回転の非対 称性の50％より大きな低減を示した非ＣｙＡラットで明らかであった。さらに１ 匹のラットが移植後13週に機能性移植片の影響を示した。しかしながら、本研究 の終点では、４匹の非ＣｙＡラットのみがこの低減を維持した。この群のラット のうち４匹は機能回復の証拠を表さなかった。 群間では移植前の正味の回転スコアに有意の差異は存在しなかった（非ペアー ドｔ検定）。群中で回転行動に対する時間の有意な影響が存在した（ｐ＝0.0001 ）が、それにもかかわらず群と時間の有意の相互作用は存在しなかった。さらに 、群の分析は、移植後８週にＣｙＡ群および非ＣｙＡ群の双方が、それらそれぞ れの移植前の値と比較して回転の対称性に有意の低下を示したことを立証した（ ＣｙＡ：前＝1170.0±76.9、平均±標準誤差、８週＝483.9±167.8、ｐ＝0.023 ；非ＣｙＡ：前＝1205.4±89.5、８週＝357.0±138.6、ｐ＝0.004）。ＣｙＡ処 理群については、回転の欠損のこの弱化は、移植後19週の最終的な回転値（465 ±178.17）が８週で達成されたそれと有意に異ならずかつ移植前の値より有意に 低いままである（ｐ＝0.01）という知見により指摘されるように、この試験の進 行の間維持された。対照的に、非ＣｙＡ群は移植後８週での回転で有意の減少を 示したとはいえ、この矯正は移植後19週で維持されなかった。この時点では正味 の回転スコア(734.4±160.1)は８週の回 復点で観察されたそれより有意に大きかった（ｐ＝0.029）。さらに、この研究 の終点では、ＣｙＡ処理群は移植前の基礎のスコアと有意に異ならなかった。 ブタ腹側中脳移植片の生存および大きさ 神経の異種移植片の生存を移植後19週にＴＨ免疫組織化学およびニッスル染色 により評価した。ＣｙＡ処理ラットの移植片中の生存するＴＨ+の細胞集合体の 平均数（ｎ＝６；3690±1023、平均±標準誤差）は、非ＣｙＡ動物でのそれより 有意に大きかった（ｎ＝６；257±164；ｐ＝0.0078、第１５Ａ図）。類似の生存 効果はドナー特異的なグリアマーカーＣＤ44について免疫染色した切片の移植片 の体積の測定に際し明らかであった（第１５Ｂ図）。ＣｙＡ処理群での平均の移 植片の体積（1.10mm³±0.29）はＣｙＡ非処理群のそれより有意に大きかった（0 .14mm³±0.06、ｐ＝0.0084）。 ＴＨ⁺ニューロンの生存と機能回復の間の相関 正味の回転での変化により測定されるようなＴＨ⁺ニューロンの生存および機 能回復の程度の非直線回帰分析は、およそ80〜100個のＴＨ⁺ニューロンの生存が 正味の回転の非対称性での50％低減を達成するのに必要であることを指摘する飽 和可能な(saturable)関連（ｙ＝10⁴ｘ／［77＋ｘ］；ｒ²＝0.642）を示した（第 １６図）。およそ850〜1000個のＴＨ⁺ニューロンの生存で、行動的回復は回転に 対するさらなる影響を提供しない付加的ニューロンの生存でプラトーになった。 各群には、行動的回復の証拠を示したにもかかわらず組織学的分析に際して利用 可能な組織学的技術を使用して生存する移植片が示されなかった１匹のラットが 存在した。これらの動物はこの相関分析には包含しなかった。 ブタ胎児腹側中脳移植片の形態学および組織化 ＣｙＡ処理およびＣｙＡ非処理群での腹側中脳異種移植片のニューロンおよび グリアの組織化をニッスル染色ならびにＴＨ、ＮＦ70およびＣＤ44免疫染色によ り評価した。ＣｙＡ処理ラットのニッスル染色した切片は、宿主細胞に良好に統 合される大きくニューロンの豊富な移植片を示した（第１７Ａ図）。この移植物 はＳＮＤＡニューロンの特徴的な形態学をもつ多数のＴＨ⁺細胞集合体を含有し た（第１７Ｂ図）。ブタＶＭ異種移植片は、移植片の周辺のＴＨ⁺ニューロンの 大きなクラスター、ならびに移植物内のかつ移植片から周囲の宿主線条体に神経 を分布するように伸長するＴＨ⁺および非ドーパミン作働性のＮＦ70⁺ニューロン 線維の密なネットワークをもつ、ＳＮの器官典型的な特徴を表した（第１７Ｂ〜 １７Ｃ図）。ドナー由来のグリアのＣＤ44免疫染色は、移植片および移植物から 宿主線条体内へ伸長するグリア線維内の明瞭なグリアの区画化を示した（第１７ Ｄ図）。行動的回復の損失を示した２匹のＣｙＡ処理ラットのニッスル染色は、 進行中の免疫拒絶を連想させる移植部位での小さい細胞の浸潤および壊死の制限 された領域を示した。加えて、行動的補償を示さなかった２匹のＣｙＡ処理ラッ トでニューロンの移植片の生存の証拠は存在しなかった。わずかな瘢痕（長さお よそ50〜100μm）がこれらの２匹の動物の針の軌跡に沿って存在した。 ＣｙＡ処理ラットと対照的に、非ＣｙＡラットからの移植片は特徴として小さ く、また、ほとんどない生存するニューロンと凝縮した（第１７Ｅ〜１７Ｇ図） 。この群からの全ての生存する移植片は進行中の拒絶過程を示唆する小さい細胞 の浸潤の変化する程度を含有した。興味深いことに、ＣｙＡ処理ラットで明らか なグリアの区画化は明らかに拒絶を 受けている移植片では欠けており、また、線維の生長は限られた（第１７Ｈ図） 。しかしながら、非ＣｙＡラットでは、移植片のグリア成分のより大きな生存が ニューロン成分に関して明らかであった。有意の宿主組織の損傷は、それらの移 植片を明らかに拒絶したラットの移植部位を越えては明らかでなかった。 ＰＲＥ ＤＮＡのインジツハイブリダイゼーションは、移植された線条体の境 界内のドナー細胞のみならず、反対側の半球に移動した宿主の白質路内の細胞も また検出した。移植片由来の線維は線条体の広がり全体に神経を再分布した。Ｔ Ｈ⁺ニューロンの染色は６−ＯＨＤＡ損傷の同側のＳＮには存在せず、このこと は密な線条体の神経分布はドナー由来であることを指摘した。 今回の結果は、ＤＡを枯渇させたラット線条体内に移植されたＥＤ27ブタ神経 芽細胞が宿主に神経を再分布し、そしてアンフェタミン誘発性の回転の非対称性 により測定されるような機能回復を媒介することが可能であることを立証する。 行動的回復の広がりは、生存するＴＨ+ニューロンの数と高度に相関することが 見出された。 機能性移植片の行動的証拠はＣｙＡ非処理群に存在し、そして、この群での異 種移植片の生存の比較的延長された期間を示唆する。これは、本研究で術前に投 与された免疫抑制ステロイドメチルプレドニゾロンの単回用量によるとみられる 。ステロイドはいくつかの臨床的な神経移植のプロトコールで使用される（ウィ ドナー(Widner，H.)ら（1992）ニュー イングランド ジャーナル オブ メデ ィシン(N．Engl．J．Med．327:1556-1563；リントファル(Lindvall，O.)ら（199 4）Ann．Neurol．35:172-180）とはいえ、神経移植に対するそれらの正確な治療 上の利点 は未知のままである。最近の研究は、メチルプレドニゾロンの30mg/kg/日は移植 片の生存を高めるが、一方、15mg/kg/日のより低い用量は拒絶される移植片の大 多数に帰着することを立証している。かように、この研究で採用されたメチルプ レドニゾロンの単回用量が、短期間の移植片の生存および遅延した拒絶に帰着す る移植の時点で比較的強力な免疫抑制活性を有した可能性もある。あるいは、コ ルチコステロイド処理が移植片の生存を低減しうることが報告されている。パテ ィノ(Patino，P.)ら（1992）Soc．Neurosci．Abstr．18(1-2):59。 にもかかわらず、移植後８週のＣｙＡ群および非ＣｙＡ群の双方でアンフェタ ミン誘発性の回転の有意の低減が存在したとはいえ、この影響は非ＣｙＡラット で持続しなかった。本研究の終点では、非ＣｙＡ群は移植前の基礎の回転値に戻 っていた。反対に、移植後19週では、ＣｙＡ群での回転は移植前の値よりも有意 により低いままであり、かつ移植後８週でみられたスコアと異ならなかった。こ れらの結果は、ＣｙＡの免疫抑制下でブタ移植片が成体の宿主脳中で長期間生存 し、かつ、アンフェタミン誘発性の回転試験に際して持続性の機能回復を媒介す ることが可能であることを立証する。 ＴＨ⁺ニューロンの生存および移植片の体積の評価はニューロンの生存に対す るＣｙＡの免疫抑制的影響を反映する。ＣｙＡ群での移植片は、非ＣｙＡ群に比 較して有意により大きいＴＨ⁺ニューロンの生存およびより大きな体積を有した 。 生存する移植されたＴＨ⁺ニューロンの数と行動的回復の程度との間の相関の 高い程度が存在した。回帰分析はアンフェタミン誘発性の回転で最低50％の低減 を得るのに必要なおよそ80〜100個のニューロンの閾 値の数を示した。線条体のドーパミンの３％の返還のみがアンフェタミン誘発性 の回転の回復に必要であることが測定されている（シュミット(Schmidt，R.H.) ら（1982）J．Neurochem．38:737-748；シュミット(Schmidt，R.H.)ら（1983）A cta．Physiol.Scand．Suppl．552:19-28）。 ＣｙＡ処理群での生存する移植片の組織学的分析は、ＴＨ+細胞集合体を伴う ニューロンの豊富な移植片が主として移植片と宿主の中間面に配置されること、 および、移植片内かつ移植された完全な線条体全体に伸長する線維を示した。６ −ＯＨＤＡ損傷に関連するＳＮでのＴＨ⁺ニューロンの完全な損失はこれらの線 維がドナー由来であることを指摘する。同様に、ＮＦ70免疫染色は線維の密なネ ットワークおよび移植されたブタニューロンの莫大な神経再分布能力を示した。 ＣＤ44免疫染色は、白質路内のグリアの組織化および宿主内への線維の伸長を立 証した。対照的に、ＣｙＡ非処理ラットでの移植片の大多数は小さく、かつ、ニ ューロンのまばらな分布を含有した。ブタ特異的ＤＮＡマーカーを使用して、ド ナー由来の細胞の相対的広がりが、周囲の線条体および反対側の半球への細胞の 若干の移動を伴い、移植片全体で密であることが示された。 実施例Ｖ：損傷を生じさせたラット脳へのブタ腹面中脳及びブタ線条体細胞の移 植、並びに移植された細胞軸索標的特異性の組織学的例証移植用細胞懸濁液及び細胞培養物の調製 線条体組織培養のために、ブタ胚（Ｅ３５）からの側方神経節丘（ＬＧＥ）（ Ｐａｋｚａｂａｎ、Ｐ．等、（１９９３）Ｅｘｐ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．９７： １３−２２）を解離し、または黒質培養のために、腹面中脳（Ｅ２５）を解離し 、そして、これらをフェノールレッドを欠いているカルシウム及びマグネシウム フリーのハンクス平衡塩溶液（ＨＢ ＳＳ；Ｓｉｇｍａ）を含んでいるペトリ皿へ移した。線条体及び黒質培養用の細 胞懸濁液の調製のために、ＬＧＥ及びＶＭ組織断片をそれぞれ各ブタ同腹子から プールした。これらの組織断片を、ＨＢＳＳ（Ｓｉｇｍａ）中１ｍｌの０．５％ トリプシン−０．５３ｍＭＥＤＴＡで３７℃で１０分間インキュベートした。こ れらの断片を新しいＨＢＳＳで４回洗浄し、次に、目に見える組織断片がない乳 状の細胞懸濁液が得られるまで、段階的により小さい内径の火仕上げしたパスツ ールピペットの先を通して穏やかに研和した。細胞数及び生存度をアクリジンオ レンジ−臭化エチジウム法により測定した。 線条体培養物の調製のために、Ｎｅｕｒｏ−Ｃ培地中ポリ−Ｄ−リジン（１０ ０μｇ ｍｌ^-1）で３０分間処理したカバーガラス上で解離した細胞を培養した 。Ｎｅｕｒｏ−Ｃ培地（Ｃｏｏｎ、Ｈ．Ｇ．等（（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１７０３−１７０７により開発された培 地の修正）を、基礎培地としてＫａｉｇｈｎ’ｓ修正Ｈａｍ’ｓＦ１２と、以下 の加えられた補充物、すなわち、１５μｇ ｍｌ^-1アスコルビン酸，０．２５％ 仔ウシ血清、６．２５μｇ ｍｌ^-1インシュリン、６．２５μｇ ｍｌ^-1トランス フェリン、６．２５μｇ ｍｌ^-1亜セレン酸、１．２５ｍｇ ｍｌ^-1ウシ血清アル ブミン（ＢＳＡ）、５．３５μｇ ｍｌ^-1リノール酸、３０ｐｇ ｍｌ^-1チロキシ ン（Ｔ３）、３．７ｎｇ ｍｌ^-1ヒドロコルチゾン、１０ｎｇ ｍｌ^-1ソマトスタ チン、１０ｎｇ ｍｌ^-1Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ（肝細胞成長因子）、０．１μ ｇ ｍｌ^-1上皮成長因子（ＥＧＦ）、５０μｇ ｍｌ^-1ウシ下垂体抽出物（ＢＰＥ ）とで調整した。ＢＰＥは、Ｎｅｉｆｆｅｎｅｇｇｅｒ（Ｗｏｏｄｌａｎｄ、Ｃ ａｌｉｆｏｒｎｉａ）から購 入した冷凍ウシ下垂体で公開された方法に従って調製し、全ての他の培地添加物 は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から購入した。 免疫組織化学または免疫蛍光のために処理する前に、細胞を数週間培養した。 染色のために、細胞をカルシウム及びマグネシウムフリーのＤｕｌｂｅｃｃｏ’ ｓ ＰＢＳ（Ｄ−ＰＢＳ）中４％のパラホルムアルデヒド中に３７℃で１５分間 固定させた。広い種を認識するＣＤ−４４抗体クローンＢＡＴ３１ＡはＶＭＲＤ 、Ｉｎｃ．（Ｐｕｌｌｍａｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）から購入し、ＣＤ４４に 対するモクローナルブタ特異的抗体も用いた（クローン１０−１４、Ｄｉａｃｒ ｉｎ、Ｉｎｃ．、Ｃｈａｒｌｅｓｔｏｗｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）。ウ サギ抗−ＧＦＡＰをＳｉｇｍａから購入した。モノクローナル抗−ガラクトセレ ブロシド抗体（ＧａｌＣ）をＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから購入 した。ウシ７０−ｋＤニューロフィラメント（ＮＦ７０）に対するモノクローナ ル抗体をＢｉｏｄｅｓｉｇｎ（Ｋｅｎｎｅｎｂｕｎｋｐｏｒｔ、Ｍａｉｎｅ）か ら購入した。フルオレセインを結合したヤギ抗−ウサギ及びローダミンを結合し たヤギ抗−マウス抗体をＣａｐｐｅｌ（Ｄｕｒｈａｍ、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌ ｉｎａ）から購入し、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣペルオキシダ ーゼキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ 、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を免疫組織化学染色のために用いた。インビボ移植実験の考案及び治療群 黒質ドーパミンニューロンの事前の選択的な一側性の損傷を有するラットにお いて線条体のドーパミン作動性の神経分布をインビボで再構成するために、側方 神経節丘のために記述したもの（上記）と同じ条件を用 いて、ブタ腹面中脳（Ｅ２５）を細胞懸濁液に解離した。神経膠及び軸索成長へ の無傷のまたは損傷を生じた領域中の異所的及び同所的配置の影響を評価するた めに、ラットホストの線条体（ｎ＝２１）または中脳（ｎ＝９）部位のいずれか に胚の腹面中脳細胞を移植した。 胎児の線条体神経細胞との線条神経回路再構成のインビボモデルのために、３ ００−３５０ｇの重量の成長したオスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（ Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、移植の一週間前 に右の新線条体へのキノリン酸の片側だけのの定位固定注射を与えた。Ｐａｋｚ ａｂａｎ、Ｐ．等、（１９９３）Ｅｘｐ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．９７：１３−２ ２。損傷を生じたラット（ｎ＝５０）に、ブタ胎児終脳に関して以前記述された （Ｐａｋｚａｂａｎ、Ｐ．等（１９９３）Ｅｘｐ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．９７： １３−２２；Ｄｅａｃｏｎ、Ｔ．Ｗ．等（１９９４）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．６６ ８：２１１−２１９）ようにＬＧＥから調製した線条体細胞懸濁液（細胞濃度、 マイクロリットル当たり５０−７５ ｘ １０³細胞）を、線条体に片側だけに移 植した。一回の手術において、幾匹かのブタ同腹子（Ｅ３５）由来のＬＧＥ細胞 懸濁液をラットホスト線条体に移植した（２−３μｌ；全ての動物において１５ ０ ｘ １０³の総細胞量）。免疫抑制 ８０匹の移植されたラットは、手術前にシクロスポリンＡ（ＣｓＡ．１０ｍｇ ｋｇ^-1；Ｌｉｌｌｙ Ｉｎｃ．Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ） の毎日の皮下注射により全身的な免疫抑制を受け、そして、テトラサイクリン（ パナマイシン、２０−４０ｍｇ ｋｇ^-1；Ｓａｎｄｏｚ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ ｉｃａｌｓ、Ｅａｓｔ Ｈａｎｏｖ ｅｒ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）を与えられた。手術前に、全ての動物を単一の皮 下服用量の抗生物質のセファロチン（ケフリン、１０ｍｇ ｋｇ^-1；Ｌｉｌｌｙ Ｉｎｃ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ）で処理し、その後、 これらの飲み水（２５０ｍｇ ｌ^-1）中にテトラサイクリン（パナマイシン、一 日当たり２０−４０ｍｇ ｋｇ^-1、Ｕｐｊｏｈｎ、Ｋａｌａｍａｚｏｏ、Ｍｉｃ ｈｉｇａｎ）を与えた。ＣｓＡの適当な血清レベルを確かめるために、（灌流時 に得られた）ＣｓＡ処理した動物からの心臓内血液を、ラジオイムノアッセイ（ Ｄａｍｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔｗｏｏｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕ ｓｅｔｔｓ）によるＣｓＡレベルの測定のために供した。異種移植組織及びホス ト脳の形態学的分析のために、移植後１ないし１５カ月に、全ての動物を４％パ ラホルムアルデヒドで灌流した。神経移植組織の免疫組織化学及び顕微鏡検査 免疫染色のために、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ法（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた。浮動性切片をＰＢＳ中５０％のメタノ ール及び３％の過酸化水素で２０分間前処理し、ＰＢＳ中で３回すすぎ、ＰＢＳ 中１０％の正常ウマ血清（ＮＨＳ）中で６０分間インキュベートし、その後、第 一抗体と共に動いている台の上で一晩インキュベートした。この研究に用いた第 一抗体及びインキュベーションバッファーは、ＰＢＳ中に１：２，０００で希釈 されたブタＣＤ４４（クローン１０−１４）を検出するためのモノクローナル抗 体、ＰＢＳ中１％のＢＳＡ、１％のＮＨＳ、及び０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１ ００に１：４０で希釈された７０−ｋＤニューロフィラメント（ＮＦ７０）を検 出するためのモノクローナル抗体、１：２５０に希釈されたチ ロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ、Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ、Ｒｏｇｅｒｓ、Ａｒｋａ ｎｓａｓ）？？？からなった。ＰＢＳ中１０分のすすぎ及び５％ＮＨＳ中１０分 の２回の洗浄後、ＰＢＳ中２％のＮＨＳ中１：２００に希釈した適当なビオチン 化第二抗体（ラット吸着した、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に切 片を室温で６０−９０分間インキュベートした。次に、これらの切片をＰＢＳ中 で３回洗浄し、ＰＢＳ中アビジン−ビオチン複合体（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ａ ＢＳ Ｋｉｔ ＥＬＩＴＥ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に室温 で６０−９０分間インキュベートした。ＰＢＳ及びトリス緩衝食塩水で十分にす すいだ後、トリス緩衝食塩水中０．０４％の過酸化水素及び０．０５％の３，３ ’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ、Ｓｉｇｍａ）中で切片を染色した。 染色の特異性を確かめるために、第一抗体を省略したコントロールを選択した 切片に行った。ＣＤ４４及びＮＦ７０抗体はブタ組織に結合したが、ラット組織 には結合せず、ブタからラットへの移植におけるドナー特異的マーカーとして用 いた。以前記述された（Ｐａｋｚａｂａｎ、Ｐ．等、（１９９３）Ｅｘｐ．Ｂｒ ａｉｎ Ｒｅｓ ．９７：１３−２２；Ａｓｈｅｒ、Ｒ．等（１９９２）Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ．２０３：８０−９０：Ｇｉｒｇｒａｈ、Ｎ．等、（１９９１ ）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．５０：７７９−７９２）よ うに、ＣＤ４４及びＮＦ７０を、それぞれドナーの神経膠及びニューロンのマー カーとして用いた。顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ）、カメラ（Ｐａｎ ａｓｏｎｉｃ ＷＶ−ＣＤ）、及び画像システム（Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈ ｏｐ ２．５ソフトウェア及びＭａｃｉｎｔｏｓｈシ ステム）を用いて、移植された胚ブタ細胞の存在に関して、全ての切片を評価し た。調整した画像分析ウインドー上の移植組織の境界を定め、続いて解剖学的マ ッピングを行うことにより、種特異的マーカーを用いて、移植組織の配置を決定 した。暗視野顕微鏡法を用いて、ニューロン及び神経膠繊維を追跡し、位置を定 めた。神経膠繊維及び軸索の二重標識のために、まず、Ｖｅｃｔｏｒ ＶＩＰ基 質キット（＃ＳＫ４６００）と処理される抗−ＣＤ４４抗体と切片をインキュベ ートし、紫色の反応生成物を生じる。同じ切片を抗−ＮＦ７０と再インキュベー トした後、ＤＡＢ基質と共に標準Ｖｅｃｔａｓｔａｔｉｎ（Ｋｉｔ ＥＬＩＴＥ 、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）との処理を続け、褐色の反応生成 物を生じた。顕微鏡下で、これらの２つの反応生成物を色により明らかに識別で きる。移植されたブタ神経膠及び軸索繊維の成長 ラット線条体に移植されたブタＬＧＥからの神経芽細胞を用いた一連の異種移 植実験において、異なる時点（１−１５カ月）で細胞成熟及び繊維成長を分析し た。移植後１カ月で、ＮＦ７０⁺軸索及びＣＤ４４⁺神経膠繊維がホスト組織中に 伸びていた。２ないし４カ月までに、広範囲に及ぶＣＤ４４⁺神経膠繊維の成長 が、全てのホストの移植組織近くの白質領域（ｔｒａｃｔ）において観察され、 そして、ＮＦ７０⁺の成長もまた、幾匹かのホストの移植片近くの白質及び灰白 質組織において観察されたが、軸索は神経膠繊維ほど広範囲ではなく、またこれ らの領域内でそれほど遠くまでは伸びなかった。６カ月までに、そして全ての後 の時点で、ＣＤ４４⁺星状神経膠細胞体が移植片近くの大部分の白質領域（ｔｒ ａｃｔ）において観察され、そしてＣＤ４４⁺繊維は移植片か ら８ｍｍまでに観察された。この段階で、ＮＦ７０⁺軸索もまた、移植細胞型に 適合したホストの白質領域（ｔｒａｃｔ）及び灰白質標的組織において観察され る。後の時点は、連続した軸索成長を示さない。この時間経過にわたって、細胞 構造及び免疫組織化学染色もまた、ブタ線条体（またはＶＭ）の正常な成熟に典 型的である成熟変化を反映して変化した。要約すると、ＣＤ４４⁺神経膠繊維は 白質への豊富な非特異的成長を示し、一方、軸索の成長はより特異的で灰白質へ も侵入する。移植組織の成長は新しいドナーの移植片におけるよりもより延長さ れるが、ブタの成熟にとって例外的ではない。 神経回路再構成における神経移植組織の神経膠及び軸索成長パターンを測定す るために、黒質緻密部領域の一側性損傷により生じたドーパミン細胞及び軸索の 枯渇を示すパーキンソン病の動物モデルを用いた。Ａｇｕａｙｏ、Ａ．Ｊ．等（ １９８４）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．４５：５３−５８；Ｂｒｕｎｄｉｎ、 Ｐ．等（１９８５）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．３３１：２５１−２５９。移植後１な いし６カ月で、死後の分析において、ブタＶＭ（胚の２５日（Ｅ２５））由来の ドナーの胚細胞は、免疫抑制下でホストの成体ラット線条体内に伸びるのが見ら れた。ＶＭ移植片からのＣＤ４４⁺神経膠細胞からの繊維性突起は、ホストの線 条体の有髄繊維束に侵入しているのが見られた。そのようなＣＤ４４⁺神経膠細 胞及び繊維はいつも内包の有髄繊維束中へ伸び、そこから、数ミリメートルまで の繊維長で多数のホストの繊維神経索（ｔｒａｃｔｓ）にも達した。ＶＭ移植片 のＮＦ７０染色を用いて、線条体外部に位置するホストの標的領域への非ドーパ ミン作動性細胞の突起を調べた。軸索が非常に多量に成体ホストの内包の有髄繊 維神経索（ｔｒａｃｔｓ）内 部に伸びているのが見られた。胎児ＶＭ移植組織からのこれらの非ドーパミン作 動性軸索のいくつかは、腹面前部及び中背面の視床の灰白質に選択的に突起して いた。これらの領域には、通常、そのようなＶＭ領域において黒質網状組織部及 び深中脳核としてそれぞれ位置するニューロンが発達している。視床に達するこ れらのＮＦ７０⁺ブタ軸索により用いられる経路は、内包のような有髄神経索（ ｔｒａｃｔｓ）に限定された。 ＶＭ由来の移植片は、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ⁺）に対する免疫組織 化学染色により確認されたように、低い割合（約５−１０％）のドーパミン作動 性であるニューロンを含んだ。ＶＭ移植片のニューロンコアから、ＴＨ⁺軸索が ホストの内包有髄繊維束間の線条体灰白質に直接数ミリメートル分岐した。ＴＨ⁺ 軸索はこの灰白質標的領域に豊富に分岐したが、稀にしか白質領域に侵入また はこれを越えなかった。ラット中脳に置かれた移植組織からのドーパミン作動性 の軸索（異所的、背面、または同所的のいずれかの腹面ｎｉｇｒａｌ配置）は、 ドーパミン作動性の繊維が次にホストの灰白質中へ広範囲に分岐する線条体への 途中の有髄繊維束の内部に見られた。中脳に置かれたＶＭ移植組織の場合におけ るように、神経膠繊維もホストの白質有髄繊維束内部に伸びているはっきり識別 できる繊維束または分岐した形態として見られたが、ドナーの軸索と異なり、こ れらはいかなる灰白質領域にも侵入しなかった。ドナーの軸索及び神経膠繊維の二重標識 ドナーの神経膠及びドナーの軸索の形態を明白に確認するために、特異的な抗 体での二重標識を個々の脳切片に行った。二重標識は、神経膠繊維及び軸索の形 態が、同じ白質領域（ｔｒａｃｔ）において近接して 伸びている時でさえ、非常に異なることを示した。ＮＦ７０⁺軸索は、二重標識 （褐色対紫色）及び異なる形態により、いつもＣＤ４４⁺繊維から区別できた。 神経膠繊維は非特異的にホストの白質中へ伸びたが、ホストの灰白質には伸びな かった。 ＣＤ４４⁺神経膠繊維はいつも、特有の厚みのある不揃いな表面の非常に分岐 した突起を有した。これに反して、ＮＦ７０⁺軸索はいつも、ＣＤ４４⁺繊維から 離れそしてホストの有髄神経索（ｔｒａｃｔｓ）と平行して伸びている小内径の 突起を有し、白質内で分岐しなかった。灰白質においては、ＮＦ７０⁺軸索のみ が見られた。そのような軸索は、時々分岐した。要約すると、ドナーの軸索のみ が、遠い灰白質標的中へ侵入するのが見られ、一方、ＣＤ４４⁺神経膠繊維は、 移植部位から広がる全ての白質領域（ｔｒａｃｔ）において見られ、移植組織自 身より外部のホストの灰白質においては決して見られなかった。灰白質ホスト標的領域への特異的な軸索の侵入 ホストの異なる脳領域における神経膠繊維及び軸索の成長の体系的な比較は、 これらの異なる向性特徴を示す。例えば、４カ月のＬＧＥ移植片からの軸索は、 有髄内包繊維束内部に伸び、そこでいくつかの軸索は、ホストの淡蒼球に直接向 かっているのが見られた。これらのＮＦ７０⁺繊維は、線条体のこの正常灰白質 標的領域内部で広範囲に樹枝状になっていた。これに比べて、ＣＤ４４⁺神経膠 繊維は、この灰白質標的領域内へ伸びなかった。その代わりに、神経膠繊維は、 尾部方向に突出している内包の有髄繊維神経索（ｔｒａｃｔ）内とどまる。ｅｎ ｔｏｐｅｎｄｕｎｃｕｌａｒ核及び腹面淡蒼球領域（中扁桃核の近くの）におい て、同じパターンが観察された。ＮＦ７０⁺軸索繊維が、ＣＤ４４⁺神経膠繊 維に沿って内包中に伸びているのが見られた。しかしながら、ＮＨ７０⁺軸索の みが、ラットエントペンダンクラー（ｅｎｔｏｐｅｎｄｕｎｃｕｌａｒ）核に侵 入及び分岐し、そして扁桃核の灰白質中へ進んでいるのが見られ、一方、神経膠 突起は、同じ切片面における白質領域（ｔｒａｃｔ）に限定される。黒質の離れ た線条体標的部位で、ドナーの神経膠突起と異なる灰白質への誘導された標的特 異的軸索成長も見られた。線条体のドナー軸索は、黒質網状組織部の灰白質領域 中へ侵入した。ＣＤ４４⁺神経膠繊維もＮＦ７０⁺繊維に沿って皮質脊髄路に伸び たけれども、これらはこの中脳灰白質線条体標的領域中へ伸びなかった。 実施例VI：損傷を生じたラット脳へのラット及びブタ皮質細胞の移植並びに移植 された細胞の組織学的検査実験動物 実験の開始時に２００−２５０ｇの重量の３２匹のメスのＳｐｒａｇｕｅ Ｄ ａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）をこの研究に用いた。１２時間の明暗周期の下で 、コロニー室においてかご当たり２ないし３匹の群で収容した。これらの動物を 以下の３群、すなわち、刺激毒性の皮質損傷を有する１２匹のラット、損傷に加 えて胎児ラット移植片を有する１１匹のラット、及び損傷に加えて胎児ブタ移植 片を有する９匹のラットに分けた。移植用細胞懸濁液の調製 一定期間のペントバルビタール麻酔の下で、定期に交尾させた妊娠しているＳ ｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットから、（頭殿長（ＣＲＬ）１２−１４ｍｍ、 １３−１４日の妊娠期間と概算される；Ｃｈａｒｌｅ ｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにより供給された）１４匹のラット 胎児を取り除いた。滅菌したリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中４０倍の倍率で、各 胎児から皮質神経組織を両側に解離した。Ｔｕｒｆｔｓ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｇｒａｆｔｏｎ、ＭＡ）での標準的 な獣医学の方法に従った安楽死の後、定期に交尾させた妊娠しているＹｏｒｋｓ ｈｉｒｅブタから（ＣＲＬ３７ｍｍ、３８−３９日の妊娠期間と概算される）８ 匹のブタ胎児を取り除いた。無菌研究室施設（Ｄｉａｃｒｉｎ、Ｉｎｃ．、Ｃｈ ａｒｌｅｓｔｏｗｎ、ＭＡ）へ子宮ホーン（ｈｏｒｎｓ）を氷上で運んだ。次に 、子宮袋を開き、胎児を滅菌したＰＢＳへ移した。これらの胎児の脳を次に取り 除き、大脳辺縁皮質ではなく予定運命の運動／体性感覚皮質だけを取り除くよう に気をつけながら、皮質原基を解離した。 ラット及びブタ組織を、滅菌したハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＣＯ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中に別々に集めた。ラ ットの組織を０．１％トリプシン中３７℃で２０分間インキュベートした。ブタ の組織を０．５％トリプシン及びＤＮａｓｅ（８０Ｋｕｎｉｔｚ ｕｎｉｔｓ／ ｍｌ）中３７℃で３０分間インキュベートした。次に、両組織をＨＢＳＳで３回 洗浄し、均質の懸濁液が得られるまで、火仕上げしたパスツールピペットで注意 深く研和した。アクリジンオレンジ／臭化エチジウム排除法（Ｂｒｕｎｄｉｎ、 Ｐ．等（１９８５）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．３３１：２５１−２５９）により測定 された、ラット細胞の生存度及び濃度は、それぞれ９７％及び３０，０００細胞 ／μｌであり、そしてブタ細胞の生存度及び濃度は、それぞれ９６％及び１８， ０００細胞／μｌであった。損傷及び移植手術 全ての３２匹のラットを右背側皮質のキノリン酸損傷に供した。ケフリン（１ ０ｍｇ／ｋｇ）及びアトロピン（０．１ｍｇ／ｋｇ）の前処理後、ペントバルビ タール麻酔（６５ｍｇ／ｋｇ）の下で、各ラットをＫｏｐｆラット定位固定フレ ーム（ＩＢ：−３．３）上に載せ、頭皮及び骨膜を通って正中線切開を行った。 両耳間ゼロからＡＰ＋０．５、Ｌ−２．４と測定された位置で、穿頭穴をあけた 。この穿頭穴を通して、水平面から１０°の角度で吻部方向に注入をおこなった 。５μｌのＨａｍｉｌｔｏｎ注入器を用いて、皮質に（硬膜から測定して）１０ ｍｍ水平に侵入させ、計５μｌのリン酸緩衝食塩水，ｐＨ７．４（ＰＢＳ）中１ ００ｍＭのキノリン酸溶液（５００ｎｍｏｌｅｓ）（Ｓｃｈｗａｒｔｚ、Ｒ．等 （１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：３１６−３１９）を注入した。これらの 注入物は、針路に沿って２ｍｍ離れた間隔の５つの異なる部位間で等しく分配さ れた（図１８Ａ参照）。各部位で２分にわたって１μｌのキノリン酸塩を注入し 、続いて１分中断した。針を引き抜いた後、収縮した皮膚の端を注意深くっつけ 縫合した。 図１８Ａ−１８Ｃは、皮質の損傷及び移植部位、並びに損傷及び移植片の特徴 的な細胞構造を示す。図１８Ａは、Ｐａｘｉｎｏｓ及びＷａｔｓｏｎ（（１９８ ６）Ｔｈｅ Ｒａｔ Ｂｒａｉｎ ｉｎ Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ Ｃｏｏｒｄ ｉｎａｔｅｓ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）の図表集 から描き直した切片上の損傷及び移植片の定位固定位置及び経路の概要図を表す 。注入部位を示す小さい丸い点と共に、針路の位置を線で示す。図１８Ｂは、軟 膜表面のｓｐａｒｉｎｇ、下にある線条体の容積の減少、及び脳室拡大を示して いる、典 型的な皮質損傷を受けた冠状切片を示す（損傷後８カ月）。図１８Ｃは、損傷場 所の完全な充填及び移植片内の細胞の密集した組織化を示している、典型的な皮 質移植を受けた冠状切片を示す（損傷及び移植後８カ月）。図１８Ｂ及び１８Ｃ は同じ縮尺まで拡大され、図１８Ｃにおける縮尺線は５００μｍを示す。 刺激性毒素を運ぶために用いたのと同じ斜め定位固定の方法を移植手術のため に用いた。損傷手術後３日目に、１１匹のラットに、損傷を生じた経路に沿って ３．５μｌの胎児ラット皮質懸濁液（約１００，０００細胞）を与えた。損傷後 ４日目に、９匹のラットに同じように４μｌの胎児ブタ移植片（約９０，０００ 細胞）を与えた。これらの９匹のラットを、移植前日に始まり実験の期間中、シ クロスポリンＡ（ＣｓＡ：１０ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．；Ｓａｎｄｏｚ Ｐｈａｒ ｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｅａｓｔ Ｈａｎｏｖｅｒ、ＮＪ）の毎日の注入によ り免疫抑制した。灌流及び組織処理方法 同種移植及び異種移植群の生存期間は、それぞれ３１及び３４週であった。損 傷のみの群のうち７匹を３１週目で殺し、そして５匹を３４週目で殺した。深い ペントバルビタール麻酔の下で、２５０ｍｌの冷ヘパリン添加食塩水（０．９％ 食塩水中０．１％のヘパリン）で次いで２００ｍｌのＰＢＳ中４％のパラホルム アルデヒド（ＰＦＡ）により、各動物に心臓内灌流を行った。全ての動物から脳 を取り除き、ＰＢＳ中４％のＰＦＡに４℃中で一晩後固定した後、これらをＰＢ Ｓ中３０％のショ糖中における平衡化により不凍にした。次に、凍結しているミ クロトーム上で４０μｍの厚さで冠状または矢状のいずれかに脳を切断し、切片 を ６連続でＰＢＳ中に連続して置いた。ニッスル染色及びアセチルコリンエステラーゼ組織化学 一般的な形態分析のために、各脳からの一組（６番目の切片ごと）を酢酸塩− アルコール法によりクレシルバイオレットで染色した（ニッスル染色）。 移植片内、並びに移植片及びホストの皮質間の繊維の融合の程度を分析するた めに、Ｇｅｎｓｅｒ−Ｊｅｎｓｅｎ、Ｆ．Ａ．及びＢｌａｃｋｓｔａｄ、Ｔ．Ｗ ．（１９７１）Ｚ．Ｚｅｌｌｆｏｒｓｃｈ １１４：４６０−４８１の方法によ り、各脳からの一組にアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）組織化学を行っ た。簡潔に言えば、切片をスライドグラスに載せ、乾燥させ、次に３０ｍＭ酢酸 ナトリウムバッファー、ｐＨ５．０、０．１ｍＭエトプロパジン、４ｍＭヨウ化 アセチルチオコリン、１６ｍＭグリシン、及び９ｍＭ硫酸銅を含んでいるインキ ュベーション溶液中で６時間インキュベートした。これらのスライドグラスを次 に蒸留水ですすぎ、１０％フェリシアン化カリウム中で９０秒間染色し、再び蒸 留水中で洗浄し、０．５％硫化ナトリウムに３０−４０秒間さらした。免疫組織化学 移植片への求心性神経分布を分析するために、移植された脳からの６番目ごと の切片を、それぞれ黒質及び青斑からのドーパミン作動性及びノルアドレナリン 作動性の繊維のマーカーであるチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）に対して免疫 染色した。加えて、ブタ移植片からラットホストへの軸索及び神経膠繊維の伸長 を調べるために、ブタ脳においては発現されるがラット脳では発現されないタン パク質に対する抗体で、こ れらの脳を免疫染色した。これらのドナー特異的なタンパク質は、分化抗原（Ｃ Ｄ４４）のブタ群、ブタ星状細胞の神経膠繊維上に見られる膜タンパク質、及び ブタ軸索のマーカーであるウシニューロフィラメント（ＮＦ７０）である。 アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ法（Ｖｅｃｔａｓｔａｔｉｎ ＡＢＣ Ｋｉｔ ＥＬＩＴＥ；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ ）を用いて、免疫組織化学を行った。浮動性の切片をＰＢＳ中５０％のメタノー ル及び３％の過酸化水素で２０分間前処理し、ＰＢＳ中で３回すすぎ、そしてＰ ＢＳ中１０％の正常ブロッキング血清（ＮＢＳ；ＣＤ４４及びＮＦ７０染色には 正常ウマ血清を用い、ＴＨ染色には正常ヤギ血清を用いた。）中で６０分間イン キュベートし、その後、動いている台の上で第一抗体と共に一晩インキュベート した。この研究に用いた第一抗体及びインキュベーションバッファーは、ＰＢＳ 中に１：２０００に希釈されたブタＣＤ４４（クローン１０−１４；Ｄｉａｃｒ ｉｎ、Ｃｈａｒｌｅｓｔｏｗｎ、ＭＡ）に対してマウス中で作られたモノクロー ナル抗体、ＰＢＳ中１％のウシ血清アルブミン、１％のＮＢＳ、及び０．１％の Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中に１：４０に希釈されたＮＦ７０（Ｂｉｏｄｅｓｉ ｇｎ、Ｋｅｎｎｅｂｕｎｋｐｏｒｔ、ＭＥ）を検出するためにマウス中で作られ たモノクローナル抗体、及びＰＢＳ中２％のウシ血清アルブミン、１％のＮＢＳ 、及び０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中に１：５００に希釈されたＴＨ（ Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｒｏｇｅｒｓ、ＡＫ）を検出 するためにウサギ中で作られたポリクローナル抗体からなる。ＰＢＳ中で１０分 すすぎ、５％ＮＢＳ中で１０分間２回洗浄した後、２％ＮＢＳ中 に１：２００に希釈した（ＣＤ４４及びＮＦ７０に対して染色した切片に対して は）ビオチン化したウマ抗マウス抗体または（ＴＨに対して染色した切片に対し ては）ビオチン化したヤギ抗ウサギ抗体中で切片を室温で６０分間インキュベー トした。次に、これらの切片をＰＢＳ中で３回洗浄し、ＰＢＳ中のアビジン−ビ オチン複合体中に室温で９０分間インキュベートした。ＰＢＳ及びトリス緩衝食 塩水（ＴＢＳ）中で十分にすすいだ後、切片をＴＢＳ中０．０４％の過酸化水素 及び０．０５％の３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中で染色した。トレーサーの注入 同種移植片からの繊維の成長を調べるために、皮質同種移植片により潜在的に 神経を分布されることのできた皮質下領域に蛍光退行性色素を注入した。特に、 殺す７日前に、同種移植プロトコルの動物（ｎ＝１１）を麻酔にかけ、Ｆａｓｔ Ｂｌｕｅ（３％溶液；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）及びＦｌｕｏｒ ｏ−Ｇｏｌｄ（２．５％溶液；Ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ、Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ 、ＣＡ）の０．５μｌ注入物を、移植された皮質と同じ側の線条体及び大脳脳脚 にそれぞれ与えた。同じ側の皮質への色素の漏れによる誤った標識を避けるため に、注入は、反対側の大脳半球を通り標的部位へ斜めに行った。注入位置及び角 度は以下の通りである。線条体へのＦａｓｔ Ｂｌｕｅの注入は、垂直面から６ ５°の角度でブレグマからＬ：＋５．０ｍｍ、ＡＰ：０、Ｖ：−９．０ｍｍと計 算された位置で行った。大脳脳脚へのＦｌｕｏｒｏ−Ｇｏｌｄの注入は、垂直面 から３０°の角度でブレグマからＬ：＋３．０ｍｍ、ＡＰ：−６．０ｍｍ、Ｖ： −９．５ｍｍと測定された位置で行った。皮質損傷の形態学的分析 皮質損傷のみを有する場合の調査は、背側皮質（前頭部及び感覚運動皮質を含 む領域）中の尾−吻側の円柱状の腔においてニューロンが失われ、一方、硬膜及 びその下にある脳梁は大部分無傷のままであるでことを明らかにした（図１８Ｂ 参照）。多くの場合において、損傷と同じ側の線条体の収縮及び腔の拡大もまた 明白であった。これは、脳梁を通してのキノリン酸の漏れ、及び／または損傷を 生じた皮質中の線条体突出領域の破壊により生じた続いて起こる線条体における 退行性の退化により引き起こされたのかもしれない。同種移植片の組織学的分析 このプロトコルの１１匹の動物全ては、ホスト組織に対してはっきりと区別さ れる残存している移植片を有するのが見られた。３つの場合のほか全てにおいて 、これらの移植片は正常な皮質とほぼ等しい程度に全損傷腔を充填した（図１９ Ｃ参照）。 図１９Ａ−１９Ｄは、ラット皮質同種移植における移植片−ホスト境界での細 胞構造、並びに移植片及びホストの接続性を示す（各場合において、移植片は矢 印の左側である）。図１９Ａは、移植片内の細胞の乏しい境界及び細胞の非薄層 状配置を示している、細胞体のニッスル染色を示す。図１９Ｂは、移植片へのＡ ＣｈＥ陽性繊維の広範囲に及ぶ侵入を示している、アセチルコリンエステラーゼ 組織化学染色を示す。図１９Ｃは、移植片及びホストにおける求心性繊維の類似 した密度を示している、繊維のチロシンヒドロキシラーゼ免疫組織化学染色を示 す。図１９Ｄは、同じ側の線条体及び大脳脳脚への蛍光退行性トレーサー色素の 沈着後の、移植片の近くではあるが移植片内ではないホスト皮質中の錐 体細胞の細胞体の退行性標識を示す。図１９Ａ−１９Ｃは、同じ縮尺に拡大され 、Ａにおける縮尺線は２５０μｍを示す。図１９Ｄはより高い倍率に拡大され、 その縮尺線は５０μｍを示す。 ３つの場合において、移植片はホストの皮質より厚く、その下にある脳梁及び 線条体に取って代わった。ニッスル染色した切片は、正常な皮質に特徴的な薄層 状組織がこれらの移植片内にはないことを明らかにした。その代わりに、移植片 の形態は、大部分が白質からなる領域によりお互いから分離されたニューロンが 豊富な領域により特徴づけられる（図１８Ｃ及び１９Ａ参照）。これらの集団は 、移植片の全体にわたって散在した小さな介在ニューロンと共に、大きい錐体様 ニューロンからなった。 ＡＣｈＥ繊維密度は、周囲にあるホストの皮質におけるより移植片においてわ ずかに低く、また正常な薄層状パターンを欠いた。しかしながら、多数のＡＣｈ −Ｅ陽性繊維が移植片内に観察され、ホストの皮質と連続的な網状組織を形成し た（図１９Ｂ参照）。無傷の反対側の皮質において見られるもの匹敵する、多数 のＴＨ陽性の繊維が移植片中に見られた。広範囲に及ぶ標識が隣接したホストの 皮質において見られたけれども、線条体に注入されたＦａｓｔ Ｂｌｕｅ及び大 脳脳脚に注入されたＦｌｕｏｒｏ−Ｇｏｌｄからのニューロンの蛍光退行性標識 は、同種移植片内に存在しなかった。異種移植片の組織学的分析 異種移植プロトコルの９匹の動物のうち５匹が、残存している移植片を有する のが見られた。これらの５匹のうち２匹は、損傷腔を完全に充填した移植片を有 した。肉眼では、これらの外観は同種移植片に非常に 類似していた。移植組織はホスト組織からはっきりと区別され、またニューロン の集団も示した。ＡｃｈＥ及びＴＨ繊維の分布も、残存しているブタ移植片にお いて同種移植群のものに非常に類似していた。 しかしながら、ドナーの遠心性成長に関して、同種及び異種移植片間で著しい 違いがあった。図２０Ａ−２０Ｆは、ブタ皮質異種移植片からの軸索及び神経膠 繊維の成長を示す。図２０Ａは、（矢じりで囲んだ）移植片の位置及び細胞構造 を示しているニッスル染色したラットホスト脳のパラサジタルヴュー（ｐａｒａ ｓａｇｇｉｔａｌ ｖｉｅｗ）、並びに７０ｋＤニューロフィラメント（ＮＦ７ ０）を用いてブタ軸索に対して（図２０Ｂ−２０Ｄ）及びＣＤ４４表面抗原に対 する抗体を用いてブタ星状神経膠繊維に対して（図２０Ｅ−２０Ｆ）特異的に免 疫反応させた選択された領域を示す代表的な写真（図２０Ｂ）のおおよその解剖 組織の位置を示す。図２０Ｂは、移植部位の下の脳梁（ｃｃ）に侵入しているＮ Ｆ７０陽性のブタ移植片軸索（矢印）を示す。図２０Ｃは、移植片と同じ側のホ スト線条体の灰白質中のＮＦ７０陽性の移植片軸索（矢印）を示す。図２０Ｄは 、脳梁の膝状湾曲構造の周りを通った後、中前脳束内の尾−腹面方向に伸びてい るＮＦ７０陽性のブタ移植片軸索（矢印）を示す。図２０Ｅは、黒質のレベルで 同じ側の大脳脳脚内に伸びているＣＤ４４陽性のブタ星状神経膠繊維を示す。移 植片の軸索は、このレベルで見られなかった。図２０Ｆは、淡蒼球のレベルで内 包内でＣＤ４４陽性の星状神経膠繊維を示す。画像は同じ縮尺ではない。図２０ Ｂ、２０Ｄ、及び２０Ｆにおける縮尺線は、５０μｍを示す。図２０Ｃ及び２０ Ｅの縮尺線は１００μｍを示す。 ＮＦ−７０免疫反応性に基づくと、移植片はドナー由来の軸索で密に 充填されていた（図２０Ａ参照）。かなり多数の軸索が、移植片から５ｍｍまで ホストの背面線条体に神経分布するために無傷の脳梁を横切っている（図２０Ｂ ）が、大部分の軸索は背面脳梁に沿ったわずかに接する経路をとり、白質へ入る 代わりに皮質組織へ突起した。比較的少数の軸索が内包繊維束に入り、線条体よ り尾側には何も見られなかった（図２０Ｃ）。これらの短距離の突起の一つの大 きい例外は、基底前脳の中前脳束への帯状束を通ったかなり大きい突起であった （図２０Ｄ）。これらの軸索は、少なくとも１０ｍｍであると概算される脳梁の 膝状湾曲構造の周りの遠回りの経路をたどった。コロサル（ｃｏｌｌｏｓａｌ） 突起によるホストの皮質及び反対側の大脳半球へのドナーの軸索成長は、同種移 植実験において以前観察された（Ｉｓａｃｓｏｎ、Ｏ．及びＳｏｆｒｏｎｅｉｗ 、Ｍ．Ｖ．（１９９２）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１１７：１５１−１７５）より もより広範囲であった。 図２１Ａ−２１Ｂは、皮質移植片からラットホストの同じ側の大脳皮質（図２ １Ａ）及び反対側の脳梁（図２１Ｂ）へ突起しているＮＦ７０陽性のブタ移植片 軸索のパラサジタル（ｐａｒａｓａｇｇｉｔａｌ）切片を示す。特に、図２１Ａ は、皮質移植片から移植片（この移植片は、図の左端をちょうど越えた所に位置 する）の後ろのホストの大脳皮質への非常に長い距離のブタ軸索突起を示す。縮 尺線は２５０μｍを示す。図２１Ｂは、移植片と反対側の脳梁中の反対側の皮質 に向かって突起している移植片軸索（垂直に向いた小さい白い繊維）を示す。こ の脳梁は、左（吻側）から右（尾側）に向いた明るいバンドとして見ることがで きる。縮尺線は１００μｍを示す。 種特異的ブタ細胞表面星状神経膠マーカー（ＣＤ−４４）を用いて、 ホスト脳における長距離の繊維様伸長も観察された。そのようなドナー由来の神 経膠突起は、多くの前脳ホスト白質領域（ｔｒａｃｔｓ）において存在していた 。これらは、脳梁、大脳脳脚、内包、及び帯状束を含んだ。ドナーの神経膠細胞 及びこれらの突起が、線条体及び視床のレベルで内包のようなホストの白質組織 内の繊維神経索（ｔｒａｃｔｓ）に平行に向き（図２０Ｆ）、そして大脳脳脚ま で遠く突起したのが見られた（図２０Ｅ）。同種移植片及び異種移植片間の比較：形態及び移植片−ホストの神経分布 成体ラット中の我々の皮質同種移植組織の全体的な外観は、皮質神経移植に関 する以前の研究（「Ｎｅｕｒａｌ Ｇｒａｆｔｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ Ｍａｍｍ ａｌｉａｎ ＣＭＳ」（Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ、Ａ．Ｓｔｅｎｅｖｉ、Ｕ．、ｅｄ ｓ．、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）中のＤａｓ、Ｇ．Ｄ．（１９８ ５）「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｏｃｏｒｔｉｃａｌ Ｔｒａｎｓｐ ｌａｎｔｓ」１０１−１２３頁、；Ｇｏｎｚａｌｅｚ、Ｍ．Ｆ．等（１９８８）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ ．９９：１５４−１６５；Ｓｏａｒｅｓ、Ｈ．及びＭｃＩ ｎｔｏｓｈ、Ｔ．Ｋ．（１９９１）Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ． ＆ Ｐｌａｓｔ ．２：２０７−２２０、Ｇｒａｂｏｗｓｋｉ、Ｍ．等（１９９２ ）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１１６：１０５−１２１；Ｉｓａｃｓｏｎ、Ｏ．及び Ｓｏｆｒｏｎｉｅｗ、Ｍ．Ｖ．（１９９２）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１１７：１ ５１−１７５）と一致した。ＡＣｈＥ染色及びＴＨ免疫組織科学により明白に示 されたように、皮質同種移植片は求心性及び内在繊維系を維持できる一方で、蛍 光路追跡結果は、皮質同種移 植片による皮質外組織の再神経分布のいかなる証拠も示さない。これらの結果は 、以前の研究（Ｇｏｎｚａｌｅｚ、Ｍ．Ｆ．等（１９８８）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏ ｌ ．９９：１５４−１６５：Ｉｓａｃｓｏｎ、Ｏ．及びＳｏｆｒｏｎｉｅｗ、Ｍ ．Ｖ．（１９９２）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１１７：１５１−１７５）と一致す る。 それに反して、ブタ皮質異種移植片は、同種移植片に類似した細胞構造を示す 一方で、これらはまた、成体ホストに突起を伸ばす顕著な能力を示した。これら の突起は、脳梁を越えてその下にある線条体へ、並び帯状束を経て脳梁の膝状湾 曲構造を回って基底前脳中の中前脳束へ伸びた。内包及び大脳脳脚におけるＣＤ −４４免疫反応性により明白に示されたように、移植片由来の神経膠繊維は、よ り遠くの領域にさえ達することができた。これは、成体脳における同所的な胎児 皮質移植片が、非皮質組織に神経分布し、白質領域（ｔｒａｃｔｓ）を越えて伸 び、そして皮質下領域へのホスト繊維神経索（ｔｒａｃｔｓ）内に伸びているか なり多数の軸索を長距離伸ばすことができる最初の証拠である。加えて、同種移 植片に関して以前報告されたこと（Ｉｓａｃｓｏｎ、Ｏ．及びＳｏｆｒｏｎｉｅ ｗ、Ｍ．Ｖ．（１９９２）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１１７：１５１−１７５）に 比べて、ホスト皮質への移植片の神経分布は、同じ側及び反対側の両方で異種移 植片により高められる。 意外な発見は、内包及び大脳脳脚への神経膠繊維の長距離の突起であった。こ れらの神経膠繊維由来の移植片は、胎児脳内の星状様神経膠繊維に相当する可能 性がある。ニューロンの移動における構造神経膠及び星状ガイド繊維の役割、並 びに発達中の脳における軸索案内は、よく記録されている（Ｄｏｄｄ、Ｊ．及び Ｊｅｓｓｅｌｌ、Ｔ．Ｍ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：６９２−６９９；Ｓｉｌｖｅｒ、Ｊ．等（１９９３）Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ ．３２８：４１５−４３６；Ｓｔｅｉｎｄｌｅｒ、 Ｄ．Ａ．等（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６：４４５−４ ５６）。膠芽細胞及び神経芽細胞の両方とも胎児皮質細胞懸濁液中に含まれるの で、これらの領域（ｔｒａｃｔｓ）への移植片神経膠繊維の成長は、そうでなけ れば許容されない基質内への侵入及び成長を促進する成長促進基質を移植片軸索 に与える可能性がある。 実施例VII：ブタにおける病原体を検出する方法Ａ．病原体の徴候のためのブタ胎児サンプルの収集、処理、及び分析 ブタの直腸から糞便を手で取り出し、滅菌容器の中に置いた。被検物の約１． ５ｃｍ直径の部分を、１０ｍｌの０．８５％食塩水中で十分に混合した。次に、 この混合物を１５ｍｌ円錐遠心管にワイヤメッシュの濾過器を通してゆっくりと 濾し、残っている糞便物質を沈殿させるために６５０ ｘ ｇで２分間遠心分離す る。沈殿物を取り除かないようにこの上清を注意深くデカントし、１０％緩衝ホ ルマリンを９ｍｌの印まで加えた後、十分に混合する。この混合物を５分間静置 させる。混合物に４ｍｌの酢酸エチルを加え、その混合物に蓋をし、逆さの位置 で３０秒間激しく混合する。次に、この蓋を通気させるために取り除き、次いで 置き換える。この混合物を５００ ｘ ｇで１分間遠心分離する（４層が生じるは ずである；酢酸エチル、残骸小塊、ホルマリン、及び沈澱物）。塗薬用棒を用い て、残骸小塊の縁を外す。溶媒容器に注ぐことにより、上三層を注意深く除く。 管の側面に付着した残骸は、塗薬用綿棒を用いて取り除く。少量のホルマリンま たはデカント後管の中に残っている少 量のホルマリンのいずれかの中で、沈澱物を混合する。二つの別個の滴をスライ ドグラス上に置き、これに少量のＬｕｇｏｌ’ｓヨウ素を加える。両滴にカバー ガラスをし、病原体の徴候、例えば、栄養体の原虫類シスト、腸内寄生虫の卵、 及び幼虫に関して注意深く調べる。必要な場合、原虫類シストの同定はトリクロ ム染色により確かめられる。Ｂ．ブタ細胞におけるヒト及び動物ウイルスの存在を検出するための共培養アッ セイ 材料 細胞株 アフリカ緑ザル腎臓、（ＶＥＲＯ）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔ ｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ細胞株、（ＡＴＣＣ ＣＣＬ８１）、ヒト胚の肺 繊維芽細胞、（ＭＲＣ−５）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ細胞株、（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１７１）、ブタ腎臓、（ＰＫ −１５）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ ｎ細胞株、（ＡＴＣＣ ＣＲＬ３３）、ブタ胎児精巣、（ＳＴ）、Ａｍｅｒｉｃ ａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ細胞株、（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７４６）培地、抗生物質、及び他の細胞、並びに装置 ウシ胎児血清、ＤＭＥＭ、ペニシリン１０，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ストレ プトマイシン１０ｍｇ／ｍｌ、ゲンタマイシン５０ｍｇ／ｍｌ、モルモット赤血 球、ニワトリ赤血球、ブタ赤血球、陰性コントロール（滅菌した細胞培養用培地 ）、陽性コントロール：ＶＥＲＯ及びＭＲＣ−５細胞：弱毒化したポリオウイウ ス１型、（ＡＴＣＣ ＶＲ−１９２）及 び麻疹ウイルス、Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株、（ＡＴＣＣ ＶＲ−２４）、ＰＫ−１ ５及びＳＴ細胞：ブタインフルエンザＡ型、（ＡＴＣＣ ＶＲ−９９）、ブタパ ルボウイルス、（ＡＴＣＣ ＶＲ−７４２）、及びブタの伝達できる胃腸炎（Ａ ＴＣＣ ＶＲ−７４３）。装置：組織培養用インキュベーター、逆位顕微鏡、生 物学的安全キャビネット。 これらの材料を共培養アッセイ（広い範囲のヒト、ブタ、及び他の動物ウイル スを検出することのできる細胞株（ＶＥＲＯ、ＭＲＣ−５、ＰＫ−１５及びＳＴ ）に試験物を接種する工程）に用いることができる。Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｖ ｉｒｏｌｏｇｙ、１９８２（Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ ｅｗ Ｈａｖｅｎ、ＣＴ、１９８２）中のＨｓｕｉｎｇ、Ｇ．Ｄ．、「Ｐｏｉｎ ｔｓ ｔｏ Ｃｏｎｓｉｄｅｒ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉ ｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ Ｕｓｅｄ ｔｏ Ｐｒｏｄｕｃｅ Ｂｉｏ ｌｏｇｉｃａｌｓ」。実験の考案及び方法論 各細胞株の計３フラスコ（Ｔ２５）に、少なくとも１ｍｌの試験物を接種する 。陰性コントロールとして、各細胞株の３フラスコに適当な滅菌した細胞培養用 培地も接種できる。陽性コントロールウイルスを各細胞株の３フラスコに接種す る。吸収期間の後、接種材料を取り除き、全てのフラスコを３５−３７℃で２１ 日間インキュベートする。ウイルス起源の細胞変性効果（ＣＰＥ）の進展に関し て、一週間当たり少なくとも３回全てのフラスコを観察する。ウイルスＣＰＥを 示す試験物で接種したあらゆるフラスコから採取を行う。 ７日目に、各試験物のフラスコから上清の一部及び細胞を取り、少な くとも１ｍｌを各細胞株の３つの新しいフラスコの各々に接種する。これらの継 代培養物を、３５−３７℃で少なくとも１４日間インキュベートする。全てのフ ラスコを上記のように観察し、試験する。 ７日目に、モルモット、サル、及びニワトリの赤血球を用いて接種後１４日目 に２−８℃及び３５−３７℃で、各試験物からのフラスコをウイルスの血液吸着 （ＨＡｄ）に関して試験もする。 ２１日目に、ＣＰＥが認められない場合、各フラスコからの上清の一部を取り 、プールし、モルモット、サル、及びニワトリの赤血球を用いて２−８℃及び３ ５−３７℃で、ウイルスの赤血球凝集（ＨＡ）に関して試験する。ウイルスの同 定は、特徴的なウイルスの細胞変性効果（ＣＰＥ）及びＨＡ ＨＡｄ試験におけ る反応性に基づく。 以下のようにして、ウイルスの細胞変性効果に関して試験サンプルを観察する 。すなわち、最低２１日のインキュベーションの間、各週少なくとも３回、ウイ ルスＣＰＥに関して全ての培養物を観察する。インキュベーターから培養物を取 り出し、少なくとも４０ｘの倍率を用いて逆位顕微鏡を用いて観察する。１００ ｘまたは２００ｘ倍率を適切として用いる。細胞単層において、ウイルスＣＰＥ を含むいかなる異常でも認められる場合、またはいかなる試験物でも細胞単層の 完全な破壊を引き起こす場合、これらのフラスコから上清及び細胞を取り、サン プルを同じ細胞株の追加のフラスコに継代培養する。継代培養するまで、サンプ ルを−６０℃ないし−８０℃で保存できる。７及び１４日のインキュベーション 後に、各サンプルで接種した全てのフラスコから上清及び細胞を取ることにより 、各試験物の２つの盲継代接種を行う。継代培養するまで、サンプルを−６０℃ ないし−８０℃で保存できる。 血液吸着ウイルスを、以下の方法により検出する。すなわち、インキュベーシ ョンの２１日目に、血液吸着ウイルスの存在を検出するために血液吸着試験を行 う。試験物またはコントロールを接種した各フラスコから上清液を取り、プール する。モルモット、サル、及びニワトリの赤血球を用いてこれらの液体を試験す る。赤血球凝集試験も、継代培養のインキュベーションの２１日後に行う。生育 が認められた細胞株、ウイルスＣＰＥの特徴、血液吸着反応、及び赤血球凝集反 応に基づいて、ウイルス単離物を同定する。適当な場合には、有効なアッセイに おいて、この研究に用いた細胞株のいずれかがウイルスＣＰＥ、ＨＡ、またはＨ Ａｄを示す場合、その試験物はウイルス因子の存在に関して陰性と考えられる。 Ｃ．ブタ細胞においてウイルスを検出するために用いた細胞株を調製及び維持 するための方法材料 ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ＤＭＥＭ、ペニシリン１０，０００ｕｎｉｔｓ／ｍ ｌ、ストレプトマイシン１０ｍｇ／ｍｌ、ゲンタマイシン５０ｍｇ／ｍｌ、Ｔ２ ５組織培養フラスコ、細胞培養用インキュベーター（５％ＣＯ₂、３７℃）方法 接種及び移しかえを行う時は滅菌技術を行う。全ての接種及び移しかえは、生 物学的安全キャビネット中で行う。最初の接種には１０％ＦＣＳを、培養物の維 持には５％ＦＣＳを、並びに５００ｍｌの培地当たり５．０ｍｌのペニシリン／ ストレプトマイシン及び０．５ｍｌのゲンタマイシンを加えることにより、培地 を調製する。Ｔ２５組織培養用フラ スコの底を覆うように十分な培地を加える。このフラスコに所望する細胞株を接 種し、細胞が８０ないし１００％融合するまで、３７℃、５％ＣＯ₂でインキュ ベートする。次に、これらのフラスコにウイルス（ＱＣＰ２５）を接種する。 Ｄ．血液吸着（ＨＡｄ）及び赤血球凝集（ＨＡ）ウイルス検出試験に用いる赤血 球（ｒｂｃ）懸濁液の調製材料 リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２、モルモット赤血球ストック溶液、 ブタ赤血球ストック溶液、ニワトリ赤血球ストック溶液、滅菌した使い捨て遠心 管、１５または５０ｍＬの実験用遠心機方法 適量の赤血球（ｒｂｃ）をストック溶液から得る。約１０００ ｘ ｇで１０分 間の遠心分離により、これらの赤血球をＰＢＳで３回洗浄する。まとめた赤血球 の各１に対してＰＢＳを９の割合で加えることにより、１０％懸濁液を調製する 。この１０％ｒｂｃ懸濁液を、一週間以下の間２−８℃で保存する。１０％ｒｂ ｃ懸濁液の各１に対してＰＢＳを１９の割合で加えることにより０．５％ｒｂｃ 懸濁液を調製する。各日の試験の前に、新しい０．５％ｒｂｃ懸濁液を調製する 。赤血球凝集（ＨＡ）試験 赤血球凝集試験は、試験物中の赤血球を凝集する特性を有するウイルスを検出 する試験である。Ｈｓｕｉｎｇ、Ｇ．Ｄ．（１９８２）Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｈ ａｖｅｎ、ＣＴ）；Ｓｔｉｔｅｓ、Ｄａｎｉｅｌ Ｐ及びＴｅｒｒ、Ａｂｂａ Ｉ、（１９９１）、Ｂａｓｉｃ ａ ｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａ ｎｇｅ、Ｅａｓｔ Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）。材料 試験物で接種したＶＥＲＯ細胞株、ＭＲＣ−５のフラスコ、陽性及び陰性コン トロールのフラスコからの上清、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２、モ ルモット赤血球（ＧＰＲＢＣ）、ＰＢＳ中０．５％の懸濁液、ニワトリ赤血球（ ＣＲＢＣ）、ＰＢＳ中０．５％の懸濁液、ブタ赤血球（ＭＲＢＣ）、ＰＢＳ中０ ．５％の懸濁液方法 全てのサンプル収集及び試験を認可された生物学的安全キャビネット中で行う 。各型の赤血球の０．５％懸濁液を上記のように調製する。接種後少なくとも１ ４日で、試験物のサンプルを接種した全ての細胞株においてＨＡを試験する。陽 性及び陰性コントロールの培養物を各サンプルに対して含み、サンプルを集める 前に単層が損なわれていないことを保証するために単層調べる。 試験物を接種した各フラスコから少なくとも１ｍｌの培養液を取り、プールす る。陰性及び陽性コントロール培養物からの１ｍｌサンプルも取り、プールする 。一組の管にサンプル番号及び加える赤血球の型（陽性及び陰性懸濁液を区別す る）のラベルを張る。赤血球の型を区別するためにラックにラベルを張ることが できる。各管に０．１ｍｌのサンプルを加える。各管に０．１ｍｌの適当な赤血 球懸濁液を加える。各管をパラフィルムで覆い、十分に混合する。約３０−６０ 分のうちに陰性コントロールにおいて堅いボタン形の物（ｂｕｔｔｏｎｓ）がで きるまで、一組の管を２−８℃でインキュベートする。約３０−６０分のうちに 陰 性コントロールにおいて堅いボタン形の物ができるまで、もう一組の管を３５− ３７℃でインキュベートする。 赤血球の堅いボタン形の物の形成は、陰性結果を示す。赤血球での管の底の被 覆は、陽性結果を示す。 Ｅ．（Ｂ及びＣ項において記述したような）細胞培養技術を用いたブタ細胞中の ウイルスの検出において使用したフラスコから得た細胞懸濁液の蛍光抗体染色の ために用いる方法方法 （Ｂ及びＣ項において記述した）細胞をＴ２５フラスコから離すためにトリプ シン消化し、トリプシン活性を中和するために十分な培地を加える。各顕微鏡ス ライドガラス上に少量の細胞懸濁液を置き、空気乾燥させる。各蛍光抗体用のス ライドガラスを調製する。アセトン中に５分間浸すことにより、細胞を固定する 。各蛍光抗体溶液を細胞を覆うように各スライドガラスの上に置き、これらのス ライドガラスをインキュベーター内の給湿室中で３６℃で３０分間インキュベー トする。次に、これらのスライドガラスをＰＢＳ中で５分間洗浄する。新しいＰ ＢＳ中で５分間洗浄を繰り返した後、ＤＩ水ですすぐ。 細胞を覆うように各スライドガラス上にエバンスブルー溶液を室温で５分間置 くことにより、細胞を対比染色剤で着色する。次に、これらのスライドガラスを ＰＢＳ中で５分間洗浄する。新しいＰＢＳ中で５分間洗浄を繰り返した後、ＤＩ 水ですすぐ。これらのスライドガラスを次に空気乾燥させる。各スライドを蛍光 顕微鏡下で調べる。感染に特有のいかなる蛍光封入体も、ウイルスの存在に関す る陽性結果と考えられる。 Ｆ．菌血症ブタを特定するための方法材料 嫌気性ＢＭＢ寒天（５％ヒツジ血液、ビタミンＫ、及びヘミン［ＢＭＢ／血液 ］、Ｉｓｏ Ｖｉｔａｌｅｘを有するチョコレート寒天、Ｓａｂａｒｏｕｄデキ ストロース寒天／Ｅｍｍｏｎｓ、７０％イソプロピルアルコールスワブ、ベタジ ン溶液、３５−３７℃の５％ＣＯ₂インキュベーター、嫌気性血液寒天プレート 、グラム染色試薬（Ｃｏｌｕｍｂｉｓ Ｂｒｏｔｈ Ｍｅｄｉａ）、好気性血液 培養用培地（ビタミンＫ及びヘミンを有する嫌気性脳心臓注入物）、セプティチ ェック（ｓｅｐｔｉｃｈｅｃｋ）培地系、ビティック（ｖｉｔｅｋ）バクテリア 同定系、層流フード、顕微鏡、並びにバクテロイデス及びバチルスストック方法 層流フード下で、ブタから得られた血液の好気性及び嫌気性血液培養物用の瓶 の蓋を７０％イソプロピルアルコール、次いでベタジンで消毒する。好気性血液 培養瓶からゴム栓及び蓋を取り除き、腎臓ｓｅｐｔｉｃｈｅｃｋ培地系を瓶につ ける。これらの瓶を５％ＣＯ₂中３５−３７℃で２１日間インキュベートし、バ クテリア生育のいかなる徴候（すなわち、気泡、濁り、変色、またははっきり区 別される集塊）に関しても毎日観察する。各瓶中５ｃｃの滅菌食塩水からなる陰 性コントロール、並びに好気性瓶中バチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓ ｕｂｔｉｌｉｓ）及び嫌気性瓶中バクテロイデス・ブルガリス（Ｂａｃｔｅｒｉ ｏｄｅｓ Ｖｕｌｇａｒｉｓ）からなる陽性コントロールを用いる。バクテリア の成長の徴候が観察される場合、グラム染色を調製し、いかなるバクテリアまた は菌類の存在に関しても１００ｘ油液浸で顕微鏡で調べる。陽性の瓶を次に、Ｉ ｓｏ Ｖｉｔｌｅｘを有するチョコレート寒 天プレート及びＢＭＢプレートの両方の上に継代培養する。チョコレートプレー トを３５−３７℃で５％ＣＯ₂中２４時間、そしてＢＭＢを嫌気的に３５−３７ ℃で４８時間インキュベートする。グラム染色で明らかであるいかなる酵母また は菌類も、Ｓａｂａｒｏｕｄデキストロース／Ｅｍｍｏｎｓプレート上に継代培 養する。Ｖｉｔｅｋ自動化系を、バクテリア及び酵母を同定するために用いる。 菌類は、肉眼及び顕微鏡で見える特徴により同定する。２１日の終わりに成長の 何の徴候も見られない場合、グラム染色を調製し、バクテリア及び菌類の存在に 関して顕微鏡で観察する。 陰性コントロール瓶中で成長がなく、陽性コントロール瓶中で成長があること は、有効な試験を示す。好気性及び嫌気性血液培養瓶の両方において成長のいか なる徴候もないこと、並びにグラム染色において見られる微生物が何もないこと は、陰性の血液培養を示す。好気性または嫌気性血液培養瓶のいずれかにおける 微生物の存在及び同定は、陽性の血液培養を示し、これは典型的に菌血症状態の ためである。 実施例VIII：パーキンソン病の患者へのブタ神経細胞の移植のためのプロトコルＡ．プロトコル 患者含有規準 この研究のために選択された全ての患者は、７ないし２０年間の進行したパー キンソン病にかかっている。全ての患者において、治療はつきているか、ひどい 動作の緩慢さ、運動障害、及び著しいオン／オフ現象の徴候と共につき始めてい る。脳内移植のための核となる評価プログラム（Ｃｏｒｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎ ｔ Ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ Ｉｎ ｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）（ＣＡＰＩＴ）を 患者を評価するために用いた。ＣＡＰＩＴは、移植実験及びそれに続く患者の評 価における患者の含有のための合意規準である。核となる規準は、臨床診断規準 及びＬ−ドーパ反応性に基づく。パーキンソン病の診断は、この疾患の認識され る徴候及び症状により明確に確立されなければならない。パーキンソン病は本来 突発性でなければならず、腫瘍、感染、脳血管の疾患または外傷のためであって はならない。 パーキンソン病は、以下、すなわち、１）動作の緩慢さ、２）震え、３）硬直 、または４）体位の不安定さのうち、少なくとも１つは震えまたは動作の緩慢さ のいずれかである２つを示すことにより決定されるように突発性でなければなら ない。患者は、ＣＡＰＩＴにおいて定義される最も悪いオフにおいて測定された 統一パーキンソン病評価尺度（Ｕｎｉｆｉｅｄ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉ ｓｅａｓｅ Ｒａｔｉｎｇ Ｓｃａｌｅ）（ＵＰＤＲＳ）得点より３３％の改善 を示すことにより、Ｌ−ドーパ治療に対して明白に反応しなければならない。患 者は、最適な薬物治療にもかかわらず、頻繁なオフ症状の出現、オンの間の無力 にする運動障害または硬直（ｆｒｅｅｚｉｎｇ）を含む難治性の症状を有さなけ ればならない。患者はまた、磁気共鳴映像（ＭＲＩ）で陰性でなければならない 。患者排除規準 患者は、パーキンソン「プラス」症状により示されるような二次パーキンソン 病の診断に基づいて排除される。痴呆は、付随するアルツハイマー病または広汎 性レビ小体病の存在を示すことができ、そして痴呆は、薬物治療に対する耐性ま たは患者を適切に調べる試験官の能力を妨げる ので、２２またはそれより少ないミニ精神状態得点（最大＝３０）を有する患者 は、痴呆を除くために排除される。鬱状態は、正確なＵＰＤＲＳ得点及び全体的 な評価結果を得るのを妨げ得るので、重い鬱状態の患者を除くために、２０また はそれより多い得点のハミルトン鬱病尺度得点を有する患者は除外される。患者 はまた、いかなる長期間の追跡及び評価も妨げ得る著しい医学疾患の存在に基づ き排除される。 患者のパーキンソン病の評価規準−コア評価 ＵＰＤＲＳを主要な臨床評価尺度として用いて、患者を評価する。Ｈｏｅｈａ ｎ及びＹａｈｒ段階づけ（Ｈｏｅｈａｎ ａｎｄ Ｙａｈｒ Ｓｔａｇｉｎｇ） 並びにＣＡＰＩＴによる運動障害評価尺度（Ｄｙｓｋｉｎｅｓｉａ Ｒａｔｉｎ ｇ Ｓｃａｌｅ）評価系によっても評価を確立する。 回内回外試験、２点間の手／腕移動、指の敏捷さ、及び起立−歩行−着席試験 を含む運動機能の定期試験により、評価を補足する。薬理学試験を、ＣＡＰＩＴ において定義されたような明白なオフ状態における単一服用量Ｌ−ドーパ試験と して行う。患者及び家族は各評価会合の前一週間毎日日記をつけ、そして会合の 各々はビデオテープに録画される。ＭＲＩを行い、そしてポジトロンエミッショ ントモグラフィー（ＰＥＴ）スキャンを行う。 パーキンソン病における日々の変化のために、患者は、確かな基準臨床状態を 確立する前に１−３カ月の期間にわたって評価される。終日の観察を含む１ない し３つの別個の評価がある。評価期間の間、患者の薬物治療を一定にしておかな ければならない。評価及び観察の実際の月数 は、この研究に入る前にどのくらい長く個々の患者がすでにＬａｈｅｙ Ｃｌｉ ｎｉｃで精察されているかによる。手術後の評価 手術後３年間、患者を３カ月ごとに行うコア評価で追跡する。追跡ＰＥＴスキ ャンを、手術後６−８カ月目並びに２年及び３年の間に行う。 手術前後のビデオテープを独立した試験官が評価する。これらの試験官は、手 術に対する患者の時間及び録画に関して知らされない。移植される細胞の型、数、及び濃度 胎児中脳細胞懸濁液を、Ｅ２６−２８年齢の胎児からのブタ胚組織の腹面中脳 の吻側半分の解離物から調製する。定期に交尾させ超音波検査により確認した妊 娠しているＹｏｒｋｓｈｉｒｅブタを、Ｔｕｒｆｔｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｎｏｒｔｈ Ｇｒａｆｔｏｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）での標準的な獣医学方法に従っ て安楽死させる。これらの胎児からの腹面中脳を、顕微鏡案内の下で注意深く解 離し、次いでプールし、インキュベートし、そして移植用の細胞懸濁液を調製す るためにトリプシン消化する。細胞をマイクロリットル当たり５０，０００細胞 の濃度に調製し、生存度を評価する。片側の被殻中の６つの定位固定標的の各々 で４０マイクロリットル容量までの細胞懸濁液を移植する。このようにして、計 ２４０μｌまでを注入する。これらの細胞の１０％が移植後に生き残ることが、 ラットの実験において見いだされている。それ故、約１０％が中脳のドーパミン 作動性細胞であると見いだされた約１２ ｘ １０⁵の生き残っている細胞を得る ために、１２ ｘ １０⁶までの細胞を注入する（Ｂｒｕｎｄｉｎ、Ｐ．等（１９ ８５）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ ．３３１：２５１−２５９；Ｄｕｎｎｅｔｔ、Ｓ．Ｂ．（１９９４）「Ｉ ｍｐｒｏｖｉｎｇ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｎｉｇｒａｌ Ｇｒａｆｔｓ ｉｎ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔ ｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅ」第５回神経移植国際シンポジウム Ｃｈａｔｅｒｙ− Ｍａｌａｂｒｙ、Ｐａｒｉｓ．ＡＧＯＮ．Ｓ．２７）。結果として、１２ ｘ １ ０⁴の細胞を補う。進行したパーキンソン病において、患者は、通常、被殻へド ーパミンを提供する２５ ｘ １０⁴のドーパミン作動性細胞の少なくとも８０− ９０％を失っている。移植部位及び方法 前部被殻中の２つの部位及び後部被殻中の４つの部位を、ブタ神経細胞の移植 のための標的とする。ＭＲＩ誘導技術を用いて、全ての患者に片側だけを定位固 定した細胞移植を行う。この方法のために、ＣＲＷ定位固定フレームを用いる。 この装置は、通常、生検または機能的な切除治療のための脳における組織の正確 な標的設定のために用いられる。用いるカニューレは、Ｄｉａｃｒｉｎ、Ｉｎｃ ．、Ｃｈａｒｌｅｓｔｏｗｎ、ＭＡで開発され、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡの Ｒａｄｉｏｎｉｃｓ ｃｏｍｐａｎｙにより製造された。カニューレの外径は１ ．０ｍｍであり、内部の寸法は０．５ｍｍである。マイクロマニピュレーター装 置を定位固定フレームローカライザーと連結して用いる。被殻中の特定の位置を 標的とするために研究を行うＭＲＩスキャナーへ患者を連れて行く。次に、この 患者を手術室へ連れて行き、滅菌状態の下で、右前頭皮に３ｃｍの切開を行う。 正中線の横２ｃｍ及び冠状縫合の前１ｃｍの頭蓋冠に穿頭孔をあける。カテーテ ルの安全及び円滑な挿入のために、 凝血剤を用いて髄膜を開く。カテーテルを、先に計算された被殻中の標的へ置く 。患者は、この全手続きの間起きていて、頭皮において皮下にリドカイン及び静 脈内にいくつかの穏やかに作用する鎮痛剤だけを与えられる。脳には痛みの受容 体がないので、カテーテルの通過及び移植手続きは無痛である。移植手続きの最 後に、切開をナイロン縫合糸で閉じ、滅菌した包帯をつけ、そして、定位固定フ レームを取り除く。患者を回復室へ連れて行き、２４時間密接に観察する。手術 後１日目に、患者は食事をすることを許され、通常の活動を始める。手術後２日 目にもし患者が良好な状態にあれば、密接な追跡をして退院させる。免疫抑制 患者に経口でシクロスポリンを与える。シクロスポリン治療の主要な有害反応 は、増加する感染の危険、腎機能不全、高血圧、多毛症、及び目やに（ｇｕｍ） の過形成である。最初のシクロスポリン服用量は、１５ｍｇ／ｋｇの単一服用量 として移植の１２時間前に与えられる。１４ないし１８ｍｇ／ｋｇの毎日の服用 量を用いる。手術後２週間、シクロスポリンを、５−１０ｍｇ／ｋｇの維持服用 量まで週当たり５％ずつ減らす。血液シクロスポリンレベルをモニターし、血液 学的及び腎機能の頻繁な検査を各患者において行い、それに従って服用量の修正 をする。Ｃ．評価プロトコル パーキンソン病の評価 患者を、先に述べたようなパーキンソン病の程度に関して評価する。この安全 性研究の点において、移植された細胞の不都合な副作用に関して主に患者をモニ ターする。実験室試験 血清クレアチニン、ＢＵＮ、肝臓の酵素、血清ビリルビン、全血球計算及び血 小板機能、赤血球、及びシクロスポリンレベルにより、肝臓及び腎臓の機能を定 期的に評価する。ＭＲＩスキャン 各患者に、手術前後のＭＲＩスキャンを行う。これらのＭＲＩスキャンは、手 術前３カ月以内及び細胞の外科移植後７日目に再び行う。追跡ＭＲＩを６カ月目 に再度行う。６−［¹⁰Ｆ］フルオロ−Ｌ−ドーパ（ＦＤ）でのＰＥＴ映像 手術前のＰＥＴスキャニングを、移植の前３カ月間以内、並びに手術後９及び １８カ月目に再度行う。患者は一晩断食し、全ての抗パーキンソン病薬物治療を ＰＥＴ映像の前１２時間はやめる。ＰＣ−４０９６スキャナー（Ｓｃａｎｄｉｔ ｒｏｎｉｘ ＡＢ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、ＰＥＴ研究を行う。この装置に特 徴的な手順は、文献（Ｒｏｔｏ Ｋｏｐｓ、Ｆ．等（１９９０）Ｊ．Ｃｏｍｐｕ ｔ．Ａｓｓｉｓｔ．Ｔｏｍｏｇｒ ．１４：（３）：４３７−４４５）に詳細に記 述されている。ＰＣ−４０９６カメラの一次映像パラメーターは、ｉｎ−ｐｌａ ｎｅで、６．０ｍｍ ＦＷＨＭの垂直方向の解像度、６．５ｍｍ分割の連続した スライス、及び＝５．０００ｃｐｓ／μＣｉの感度である。７ｍｍ ＦＷＨＭの ｉｎ−ｐｌａｎｅ解像度に対する通常の傾斜後方映写アルゴリズムを用いて、全 ての画像を再構築する。⁶⁸ＧＥを含む回転しているピン源を用いて得た伝達デー タから、減衰修正を行う。Ｌｕｘｅｎにより記述された方法（Ｌｕｘｅｎ、Ａ． 等（１９９０）Ａｐｐｌ Ｒａｄｉａｌ Ｉｓｏｔ、４１：２７５−２８１）に より、ＦＤを放射化学純度＞９５％、比活性＝４００ｍＣｉ／ｍｍｏｌｅに調製 する。 レーザーの照準を合わせて、個々に製作したヘッドホールダー（Ｔｒｕ Ｓｃ ａｎ Ｉｍａｇｅ Ｉｎｃ．、Ａｎｎａｐｏｌｉｓ、ＭＤ）中スキャナーに患者 を位置する。ガントリー角度を、眼窩外耳孔線に平行であるように調整する。全 ての研究を薄暗い照明中で開かれた目及び最少の聴覚刺激で行う。 脱炭酸反応を抑制するために、カルビドーパ（２００ｍｇ）を各トレーサー注 入の１時間前に経口で与え、ＦＤ（５−１０ｍＣｉ）を映像の開始時にボーラス として静脈内に注入する。注入後すぐに始まる１２の１０分の連続したエミッシ ョンスキャンを得る。 全血サンプル（１ｍｌ）を以下のように、すなわち、トレーサー注入の間に始 まる最初の１分の間に８サンプル、次の１分の間に４サンプル、３、４、５、７ 、１２、及び１７分に１サンプル、並びに２５から１１５分までに１０分ごとに １サンプル、橈骨動脈カテーテルから取り出す。この血液を遠心分離し、全血漿 放射能を０．５ｍｌサンプルについて測定する。バッチ接触アルミナ抽出法（Ｃ ｈａｎ、Ｇ．等（１９９１）Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．５０：３０９−３１８）により ２．５、５、７、１０、１５、２０、３０、４５、６０、７５、９０、及び１２ ０分に取り出した５ｍｌのサンプルから、ＦＤの血漿代謝産物（３−０−メチル −ＦＤ）を測定する。データ分析 高いカウント密度の合成画像を作るために、ＦＤ注入後６０から１２０分に得 られた画像をまとめる。以下のようにして、目的の領域（ＲＯＩ’ｓ）をこの画 像から引き出す。すなわち、一つの円形のＲＯＩ（直径８ＭＭ）を各尾状核上で の検査により位置し、平均ＲＯＩ活性を最大 にするために合成画像上で調整する。３つの円形のＲＯＩ’ｓ（直径８ＭＭ）を 各被殻の軸に沿って置き、同様に調整する。３つのバックグラウンドの円形ＲＯ Ｉ’ｓ（直径２０ＭＭ）を側頭−頭頂皮質の各側に置く。尾状核及び被殻がはっ きりと見える全てのスライスに対して、この手順を繰り返す。次に、ＲＯＩ’ｓ の完全な組を全ての時間枠にわたって折り重ねる（ｒｅｐｌｉｃａｔｅｄ）。各 枠に対して、右及び左の尾状核、右及び左の被殻、並びにバックグラウンドに対 して別個の測定値を生じるために、類似した組織のＲＯＩ’ｓを平均する。単一 の患者に対する各スキャンを分析するために、同じ組のＲＯＩ’ｓを用いる。必 要な時は、再配置を補正するために位置を調整する。 線条体活性からバックグラウンドを引くことにより、線条体の時間活性データ におけるＦＤ及び３−０−メチル−ＦＤの修正を行う（Ｍａｒｔｉｎ、Ｗ．Ｒ． Ｗ．等（１９８９）Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ２６：５３５−５４２）。ＦＤの線 条体蓄積に対する速度定数を、Ｐａｌｌａｋ及び同僚により記述された図式的な 方法（Ｍａｒｔｉｎ、Ｗ．Ｒ．Ｗ．等（１９８９）Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ２６ ：５３５−５４２；Ｐａｔｌａｋ、Ｃ．Ｓ．等（１９８３）Ｊ．Ｃｅｒｅｂ Ｂ ｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ ．３：１−７；Ｐａｔｌａｋ、Ｃ．Ｓ．等（１ ９８５）Ｊ．Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．５：５８４−５ ９０）により計算する。この分析を、注入後２０から１２０分に得たデータの全 てのＲＯＩ’ｓに対して行う。合成画像上のバックグラウンドに対する標的の比 率（比率法）としても、スキャンを分析する。ＲＯＩ’Ｓの領域に対する修正後 、線条体活性をバックグラウンド活性で割る。 同等物 当該技術分野において熟練した者は、通常の実験法だけを用いて、本明細書に 記述された本発明の特定の態様の多数の同等物を認めたりまたは確認することが できる。そのような同等物は、以下の請求の範囲により含まれると解釈される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．未修飾状態で、異種移植個体中の細胞に対する免疫応答を刺激できる少なく とも１つの抗原を細胞表面上に有し、ここで細胞表面上の抗原は異種移植個体中 に導入された時に細胞の拒絶を抑制するように変化させられている、ブタの中脳 細胞。 ２．変化させられている細胞表面上の抗原が、ＭＨＣクラスＩ抗原である、請求 の範囲第１項に記載のブタの中脳細胞。 ３．異種移植個体中に移植する前に、細胞表面上のＭＨＣクラスＩ抗原と結合す るが、補体を活性化せず、細胞の溶解を誘導もしない、少なくとも１つの抗−Ｍ ＨＣクラスＩ抗体またはその断片またはその誘導体と接触させられる、請求の範 囲第２項に記載のブタの中脳細胞。 ４．抗−ＭＨＣクラスＩ抗体が、抗−ＭＨＣクラスＩ F(ab')₂断片である、請求 の範囲第３項に記載のブタの中脳細胞。 ５．抗−ＭＨＣクラスＩ F(ab')₂断片が、モノクローナル抗体PT85のF(ab')₂断 片である、請求の範囲第４項に記載のブタの中脳細胞。 ６．異種移植個体がヒトである、請求の範囲第１項に記載のブタの中脳細胞。 ７．胎児の腹側中脳細胞である、請求の範囲第６項に記載のブタの中脳細胞。 ８．妊娠の約２０日から３０日の間の胎児のブタから得られる、請求の範囲第７ 項に記載のブタの中脳細胞。 ９．妊娠の約２４日から２８日の間の胎児のブタから得られる、請求の範囲第８ 項に記載のブタ中脳細胞。 １０．妊娠の約２６日から２８日の間の胎児のブタから得られる、請求 の範囲第９項に記載のブタ中脳細胞。 １１．妊娠の約２７日の胎児のブタから得られる、請求の範囲第１０項に記載の ブタ中脳細胞。 １２．表面に結合する抗体、抗体断片、または誘導体を有する、単離されたブタ の中脳細胞。 １３．抗体が抗−ＭＨＣクラスＩ抗体である、請求の範囲第１２項に記載のブタ の中脳細胞。 １４．抗−ＭＨＣクラスＩ抗体が、抗−ＭＨＣクラスＩ F(ab')₂断片である、請 求の範囲第１３項に記載のブタの中脳細胞。 １５．抗−ＭＨＣクラスＩ F(ab')₂断片が、モノクローナル抗体PT85のF(ab')₂ 断片である、請求の範囲第１４項に記載のブタの中脳細胞。 １６．中脳細胞が表面に結合する抗体、抗体断片または誘導体を有する、妊娠の 約２６日から２８日の間の胎児のブタから得られる、単離されたブタの中脳細胞 。 １７．抗体が抗−ＭＨＣクラスＩ抗体である、請求の範囲第１６項に記載の単離 された中脳細胞。 １８．抗−ＭＨＣクラスＩ抗体が、抗−ＭＨＣクラスＩ F(ab')₂断片である、請 求の範囲第１７項に記載のブタの中脳細胞。 １９．ブタの中脳細胞、およびブタの中脳細胞の表面上の抗原に結合する抗体を 含んで成る組成物。 ２０．さらに血管新生因子、神経栄養因子、抗アポトーシス因子、酸化防止剤、 および一酸化窒素の生成を抑制する薬剤から成る群から選択される少なくとも１ つの薬剤または因子を含んで成る、請求の範囲第１９項に記載の組成物。 ２１．血管新生因子が、血管内皮増殖因子、血小板由来増殖因子、繊維芽細胞増 殖因子、および上皮増殖因子から成る群から選択される、請求の範囲第２０項に 記載の組成物。 ２２．神経栄養因子が、グリア細胞系−由来増殖因子、脳−由来神経栄養因子、 毛様体神経栄養因子、ミッドカイン、インスリン−様増殖因子ＩおよびII、イン スリン、繊維芽細胞増殖因子、ニューロトロフィン-３、ニューロトロフィン-4/ 5、トランスフォーミング増殖因子β、FK506およびシクロスポリンＡから成る群 から選択される、請求の範囲第２０項に記載の組成物。 ２３．抗アポトーシス因子が、bcl-2遺伝子産物、bcl-xL遺伝子産物、bcl-Xβ遺 伝子産物、crmA遺伝子産物、神経成長因子、血小板由来増殖因子、スーパーオキ シドジスムターゼ、カタラーゼおよびN-アセチルシステインから成る群から選択 される、請求の範囲第２０項に記載の組成物。 ２４．酸化防止剤が、スーパーオキシドジスムターゼ、グルタチオンペルオキシ ダーゼ、N-アセチルシステイン、ラザロイド、ビタミンＣ、ビタミンＥおよびベ ータカロチンから成る群から選択される、請求の範囲第２０項に記載の組成物。 ２５．一酸化窒素の生成を抑制する薬剤が、ガングリオシド、FK506、シクロス ポリンＡおよびスーパーオキシドジスムターゼから成る群から選択される、請求 の範囲第２０項に記載の組成物。 ２６．未修飾状態で、異種移植個体中の細胞に対する免疫応答を刺激できる少な くとも１つの抗原を細胞表面上に有し、ここで細胞表面上の抗原は異種移植個体 中に導入された時に細胞の拒絶を抑制するように変化させられている、単離され たブタの中脳細胞群。 ２７．変化させられている細胞表面上の抗原が、ＭＨＣクラスＩ抗原である、請 求の範囲第２６項に記載の細胞群。 ２８．異種移植個体中に移植する前に、細胞表面上のＭＨＣクラスＩ抗原と結合 するが、補体を活性化せず、細胞の溶解も誘導しない、少なくとも１つの抗−Ｍ ＨＣクラスＩ抗体またはその断片またはその誘導体と接触させられる、請求の範 囲第２７項に記載の細胞群。 ２９．腹側中脳細胞を含んで成る、請求の範囲第２６項の細胞群。 ３０．胎児の腹側中脳細胞群を含んで成る、請求の範囲第２９項の細胞群。 ３１．胎児の腹側中脳細胞群が、妊娠の約２０日から３０日の間のブタから得ら れる、請求の範囲第３０項に記載の細胞群。 ３２．胎児の腹側中脳細胞群が、妊娠の約２４日から２８日の間のブタから得ら れる、請求の範囲第３１項に記載の細胞群。 ３３．胎児の腹側中脳細胞群が、妊娠の約２６日から２８日の間のブタから得ら れる、請求の範囲第３２項に記載の細胞群。 ３４．胎児の腹側中脳細胞群が、妊娠の約２７日のブタから得られる、請求の範 囲第３３項に記載の細胞群。 ３５．細胞の異種移植受容体に感染または疾患を伝播できる生物または物質を本 質的に含まないブタから単離される、ブタの神経細胞。 ３６．寄生虫、細菌、マイコプラズマおよびウイルスから成る群から選択される 少なくとも１つの生物を本質的に含まないブタから単離される、請求の範囲第３ ５項に記載のブタの神経細胞。 ３７．中脳細胞である、請求の範囲第３５項に記載のブタの神経細胞。 ３８．胎児の腹側中脳細胞である、請求の範囲第３７項に記載のブタの 神経細胞。 ３９．少なくとも約１％−約５％のブタの腹側中脳細胞がチロシンヒドロキシラ ーゼを生成する、ブタの腹側中脳細胞を含んで成る細胞培養物。 ４０．ブタの腹側中脳細胞が胎児のブタの腹側中脳細胞である、請求の範囲第３ ９項に記載の細胞培養物。 ４１．少なくとも約３０％−約５０％の細胞が、腹側中脳細胞を含んで成る、請 求の範囲第３９項に記載の細胞培養物。 ４２．血管新生因子、神経栄養因子、抗アポトーシス因子、抗酸化剤および一酸 化窒素の生成を抑制する薬剤から成る群から選択される少なくとも１つの薬剤ま たは因子をさらに含んで成る、請求の範囲第３９項に記載の細胞培養物。 ４３．異種移植個体に移植した時、ドパミンを生成する、単離されたブタの腹側 中脳細胞。 ４４．未修飾状態で、異種移植個体中の細胞に対する免疫応答を刺激できる少な くとも１つの抗原を細胞表面上に有し、ここで細胞表面上の抗原は異種移植個体 中に導入された時に細胞の拒絶を抑制するように変化させられているブタの中脳 細胞を、異種移植個体の脳内の神経変性領域に導入することを含んで成る、異種 移植個体中の脳内の神経変性による神経的欠乏を処置する方法。 ４５．中脳細胞が胎児の腹側中脳細胞である、請求の範囲第４４項に記載の方法 。 ４６．神経変性領域が黒質内である、請求の範囲第４４項に記載の方法。 ４７．個体がパーキンソン病を患っているヒトである、請求の範囲第４６項に記 載の方法。 ４８．ブタの中脳細胞を個体に導入する前に、細胞表面上の抗原を変化させて個 体に導入された時に細胞の拒絶を抑制するために、個体中の細胞に対する免疫応 答を刺激できる細胞表面上の少なくとも１つの抗原に結合する少なくとも１つの 分子と接触させる、請求の範囲第４４項に記載の方法。 ４９．変化させられているブタの神経細胞表面上の抗原がＭＨＣクラスＩ抗原で ある、請求の範囲第４８項に記載の方法。 ５０．ブタの神経細胞を個体に導入する前に、細胞表面上のＭＨＣクラスＩ抗原 と結合するが、補体を活性化せず、細胞の溶解を誘導もしない、少なくとも１つ の抗−ＭＨＣクラスＩ抗体、またはその断片または誘導体と接触させる、請求の 範囲第４９項に記載の方法。 ５１．抗−ＭＨＣクラスＩ抗体が、抗−ＭＨＣクラスＩ F(ab')₂断片である、請 求の範囲第５０項に記載の方法。 ５２．抗−ＭＨＣクラスＩ F(ab')₂断片が、モノクローナル抗体PT85のF(ab')₂ 断片である、請求の範囲第５１項に記載の方法。 ５３．免疫抑制剤を個体に投与することをさらに含んで成る、請求の範囲第４４ 項に記載の方法。 ５４．個体に感染または疾患を伝播できる生物または物質を本質的に含まないブ タから得たブタの神経細胞を、個体の脳内の神経変性領域に導入することを含ん で成る、異種移植個体の脳内の神経変性による神経的欠乏を処置する方法。 ５５．神経変性領域が中脳内である、請求の範囲第５４項に記載の方法。 ５６．中脳の神経変性が黒質内で起こる、請求の範囲第５５項に記載の方法。 ５７．ブタの神経細胞が、胎児の腹側中脳細胞である、請求の範囲第５４項に記 載の方法。 ５８．腹側中脳細胞が妊娠の約２０日から３０日の間の胎児のブタから得られる 、請求の範囲第５７項に記載の方法。 ５９．腹側中脳細胞が妊娠の約２４日から２８日の間の胎児のブタから得られる 、請求の範囲第５８項に記載の方法。 ６０．腹側中脳細胞が妊娠の約２６日から２８日の間の胎児のブタから得られる 、請求の範囲第５９項に記載の方法。 ６１．腹側中脳細胞が妊娠の約２７日のブタから得られる、請求の範囲第６０項 に記載の方法。 ６２．個体が、パーキンソン病気を患っているヒトである、請求の範囲第６１項 に記載の方法。 ６３．血管新生因子、神経栄養因子、抗アポトーシス因子、抗酸化剤および一酸 化窒素の生成を抑制する薬剤から成る群から選択される少なくとも１つの薬剤ま たは因子を投与することをさらに含んで成る、請求の範囲第６２項に記載の方法 。 ６４．血管新生因子が、血管内皮増殖因子、血小板由来増殖因子、繊維芽細胞増 殖因子、および上皮増殖因子から成る群から選択される、請求の範囲第６３項に 記載の方法。 ６５．神経栄養因子が、グリア細胞系−由来増殖因子、脳−由来神経栄養因子、 毛様体神経栄養因子、ミッドカイン、インスリン−様増殖因子ＩおよびII、イン スリン、繊維芽細胞増殖因子、ニューロトロフィン-３、ニューロトロフィン-4/ 5、トランスフォーミング増殖因子β、FK506およびシクロスポリンＡから成る群 から選択される、請求の範囲第６ ３項に記載の方法。 ６６．抗アポトーシス因子が、bcl-2遺伝子産物、bcl-xL遺伝子産物、bcl-Xβ遺 伝子産物、crmA遺伝子産物、神経成長因子、血小板由来増殖因子、スーパーオキ シドジスムターゼ、カタラーゼおよびN-アセチルシステインから成る群から選択 される、請求の範囲第６３項に記載の方法。 ６７．酸化防止剤が、スーパーオキシドジスムターゼ、グルタチオンペルオキシ ダーゼ、N-アセチルシステイン、ラザロイド、ビタミンＣ、ビタミンＥおよびベ ータカロチンから成る群から選択される、請求の範囲第６３項に記載の方法。 ６８．一酸化窒素の生成を抑制する薬剤が、ガングリオシド、FK506、シクロス ポリンＡおよびスーパーオキシドジスムターゼから成る群から選択される、請求 の範囲第６３項に記載の方法。 ６９．ブタの幹細胞に由来する、請求の範囲第１項に記載のブタの中脳細胞。 ７０．ブタの中脳細胞がブタの幹細胞に由来する、請求の範囲第２０項に記載の 組成物。 ７１．ブタの幹細胞に由来する、請求の範囲第３５項に記載のブタの神経細胞。 ７２．ブタの中脳細胞がブタの幹細胞に由来する、請求の範囲第４４項に記載の 方法。 ７３．ブタの中脳細胞がブタの幹細胞に由来する、請求の範囲第５４項に記載の 方法。