CN105392881A - 体细胞基于小分子转化为神经嵴细胞 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种基于化学确定成分的培养基诱导的关联步骤，将体细胞分化成多能神经嵴细胞的方法。神经嵴细胞能够分化成众多细胞类型，如施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞。

Description

体细胞基于小分子转化为神经嵴细胞

发明领域

本申请涉及一种基于化学确定成分培养基诱导的关联步骤，将体细胞分化成多能神经嵴细胞的方法。神经嵴细胞能够分化成众多细胞类型如施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞。

背景

通过异位表达4种关键的发育基因c-myc、Sox2、Oct4和Klf4，使体细胞再编程成经诱导的多潜能干细胞(inducedpluripotentstemcells)的赢得诺贝尔奖的方法是获得能够分化成任何细胞类型的患者特异性多潜能细胞的有力工具(Takahashi和Yamanaka，2006)。最近，不同研究已经报告，细胞类型特异性基因还可以直接将一个体细胞类型转化成另一个体细胞类型，这是一种作为细胞转化或转分化报道的方法(Vierbuchen和Wernig，2011)。这种方法代表一种获得多种确定的细胞用于临床和研究的有前景策略，从而避免潜在致肿瘤的多潜能阶段。

已知的细胞转化或再编程策略的重大缺陷是要求引入异位基因，所述异位基因可能对已转化细胞的稍后应用产生不利的影响。为了允许长期和稳定表达，异位基因经常不得不稳定整合入基因组中。尽管可能紧密控制异位基因表达，但整合的基因可以具有不利的影响。例如，引入原癌基因c-myc增加嵌合动物中肿瘤形成的风险，原因在于c-myc再活化(Okita等人,2007)。通常，基因组的复杂调节装置导致很难预测基因修饰的长期效果。

为了避免再编程方案中基因整合的缺点，新方法通过小分子更换关键再编程基因。Li等人通过将某些基因更换为调节特定信号传导途径的小分子如Wnt或TGF-β，产生IPS细胞(Li等人,2012)。通过基于小分子抑制BMP、TGFβ和GSK3b信号传导，基因介导的成纤维细胞转化成神经元的产率和效率大大增加(Ladewig等人,2012)。与这些结果相符，也已经证明小分子是指导干细胞分化的有价值工具。例如，对骨形态发生蛋白(BMP)和TGF-β信号传导的抑制导致高度有效的干细胞的神经诱导(Chambers等人,2009)。

并没有彻底理解小分子影响细胞命运决策的机理。尽管小分子可能足以诱导分化，但是诱导细胞转化成多能性或另一个体细胞类型仍然需要异位基因表达。这可能归因于以下事实：与干细胞分化成体细胞相比，改变终末分化细胞的表型成为不同的细胞类型是一种非生理学过程。

本文中提供将体细胞转化成多能神经嵴细胞的新方法，所述新方法完全基于小分子处理和确定的培养条件并且不需要通过引入基因来遗传地修饰细胞。

这种新方法利用将体细胞转分化成增殖性神经嵴样阶段的新型多激酶抑制物。神经嵴细胞可以分化成多种细胞类型如施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞。

例如，可以通过将特定培养基组合以基于小分子抑制确定的信号传导途径，诱导神经嵴细胞分化成施旺细胞。神经成熟的施旺细胞代表外周神经系统(PNS)的胶质细胞。施旺细胞执行多种功能，如神经元的免疫保护、养分供应和髓鞘化。施旺细胞功能障碍是外周神经系统的许多神经学病症(例如多发性硬化或髓鞘化疾病)的原因。

重要地，这种新的细胞转化方法不需要表达任何异位基因，而仅基于化学处理。因此，它代表有一种产生患者特异性神经嵴细胞或分化细胞如施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞的有前景方法。

发明概述

本文中提供一种从体细胞产生神经嵴细胞的方法，所述方法包括：

a)在补充有丙戊酸(valproicacid)的培养基中培养体细胞，

b)在补充有N-{(3R,4R)-4-[4-(2-氟-6-羟基-3-甲氧基-苯甲酰基)-苯甲酰氨基]-吖庚烷-3-基}-4-羟基-3,5-二甲基-苯甲酰胺的无血清培养基中培养步骤(a)中获得的细胞。

在一个实施方案中，该方法不包括通过引入基因遗传修饰体细胞或步骤(a)中获得的细胞。

在一个实施方案中，步骤b)包括以悬浮培养法培养细胞。

在一个实施方案中，步骤b)的无血清培养基补充有骨形态发生蛋白(BMP)的抑制物。在一个实施方案中，BMP的抑制物是头蛋白(noggin)。

在一个实施方案中，步骤b)的无血清培养基补充有转化生长因子β(TGFβ)的小分子抑制物。

在一个实施方案中，TGFβ的小分子抑制物是SB431542。

在一个实施方案中，步骤b)的无血清培养基补充有糖原合酶激酶3(GSK3β)的小分子抑制物。

在一个实施方案中，GSK3β的抑制物是3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮。

在一个实施方案中，步骤a)包括将细胞培养2天。

在一个实施方案中，步骤b)包括将细胞培养7天。

在一个实施方案中，体细胞是成纤维细胞。

在一个实施方案中，体细胞是人细胞。

在一个实施方案中，体细胞从患有神经疾病的受试者获得。

在一个实施方案中，提供了通过根据任一个以上实施方案的方法获得的神经嵴细胞。

在一个实施方案中，该方法还包括

c)在适于神经嵴细胞分化成分化细胞的条件下温育步骤b)的产物，所述的分化细胞选自施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞。

在一个实施方案中，提供了通过根据任一个以上实施方案的方法获得的施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞。

在一个实施方案中，提供神经嵴细胞或分化的施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞的生物样本库(biobank)。

在一个实施方案中，使用神经嵴细胞或分化的施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞作为神经疾病的体外模型。

一个实施方案包括治疗性组合物，所述治疗性组合物包含神经嵴细胞或分化的施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞或包含这些细胞的生物样本库。

一个实施方案包括N-{(3R,4R)-4-[4-(2-氟-6-羟基-3-甲氧基-苯甲酰基)-苯甲酰氨基]-吖庚烷-3-基}-4-羟基-3,5-二甲基-苯甲酰胺在从体细胞产生神经嵴细胞的方法中的用途。

一个实施方案包括3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮在从体细胞产生神经嵴细胞的方法中的用途。

以上实施方案的任一个实施方案可以单独或组合地存在。

附图简述

图1：鉴定增强神经干细胞(NSC)增殖并使成纤维细胞能转化为神经球样结构的小分子。A：化合物B以剂量依赖性方式促进ESC-NSC增殖。通过ATP测定法分析增殖并且显示2次实验的均数。B：用化合物B处理的成纤维细胞在悬浮培养时形成球状体样结构。比例尺：200μm。C：化合物B的激酶选择性谱。橙色图标代表受抑制超过80％的激酶。D：通过其他化合物单一或联合抑制化合物B靶(化合物靶在图注中括号内显示)对成纤维细胞的球状体形成没有影响或具有更小影响。图中将增殖速率显示为悬浮培养第3日初始细胞数目(左)和平均球状体直径(右)的倍数变化。条柱显示三次独立实验的均数+/-SD。使用Studentt检验评价数据。*：与DMSO对照相比，p<0.05。+：化合物B与单一抑制物相比，p<0.05。E：使人成纤维细胞转化成经诱导的施旺细胞(iSC)的实验设计的示意图。

图2：人成纤维细胞转化成神经嵴样阶段。A-D：在转化第11日的次生球状体，同时双极细胞从球状体长出并表达早期神经板标志物Sox1和巢蛋白(Nestin)。比例尺：50μm。E：转化的神经嵴细胞(第18日)和成纤维细胞(第0日)的流式细胞术揭示出成纤维细胞标志物CD29下调和神经嵴标志物CD271上调。下半小图显示平均荧光强度(MFI)的定量。条柱显示三次独立实验的均数+/-SD并且使用Studentt检验评价数据。F-I：在转化第18日，细胞已经从球状体迁出并表达神经嵴标志物Snai1、Sox10、FoxD3和AN2。比例尺：100μm。J-M：神经嵴样细胞的非神经分化。在特定分化培养基中的培养导致脂肪细胞(J)、平滑肌细胞(K)和软骨细胞(L、M)的形成。比例尺：50μm(J)，100μm(K).

图3：过渡性前体细胞分化成经诱导的施旺细胞(iSC)。(A-D)iSC表达施旺细胞标记蛋白。比例尺：50μm。(E)转化效率。在第31日时PLP阳性细胞的定量。因背景信号所致少量PLP阳性成纤维细胞。条柱显示均数+/-SD(n＝3)。使用Studentt检验分析数据。(F)来自第0日(成纤维细胞)、第7日(早期tP)、第11日(早期tP)、第18日(晚期tP)、第39日(iSC)时的细胞和原代施旺细胞(pSC)的全转录组表达谱的主成分分析。主成分1(x-轴)占数据集合变异的27.4％并且主成分2(y-轴)占据集合变异的16.5％。每种阶段由衍生自独立实验的至少两个数据点代表。在第39日聚类的转录组学概况显示方案的稳健性。(G)与第0日细胞(成纤维细胞)相比，第39日细胞(iSC)中的基因集合富集图(反应组学/RONET)。红色节点代表iSC富集的基因集合，而蓝色节点代表成纤维细胞富集的基因集合。将节点分组并且根据相关的基因集合按照它们的相似性注释；将共有的基因表示为节点之间的绿线。将功能相关节点的聚类汇总并使用WordCloud注释。分析来自至少两个独立测定法的数据。(H)iSC的全膜片钳分析。在从保持电位Vh＝-80mV起10mV渐增阶式方案中从–70mV至+40mV获得电压依赖性电流。早期内向电流的不存在证实电压依赖性Na⁺通道的缺乏，而外向组分与电压依赖性K⁺通道的存在相符。(I)在iSC中，最大电压依赖性K⁺流比成纤维细胞中显著更高。条柱显示两个独立实验中测量的不同细胞的均数+/-SD(FB：n＝12；iSC：n＝7)。使用Studentt检验分析数据。

图4：与神经元细胞共培养时iSC的功能。(A-C)在POL(A)、在细胞示踪物标记的成纤维细胞(B)和iSC(C)上分别培养NSC衍生的神经元。比例尺：100μm。通过MAP2染色区域(D)、神经突数目(E)和总神经突长度(F)分析，用iSC培养的NSC神经元形成更致密和分支的网络。条柱显示均数+/-SD(n＝3)。使用Studentt检验分析数据。*：p<0.05。(G)iSC与原代大鼠DRG神经元共培养。一些iSC形成通过MB染色(黄色)和神经丝(NF)染色(品红)的共定位检测到的单个有髓鞘片段(箭头)。比例尺：20μm。

图5：表征用于生成iSC的人成纤维细胞。(A-C)人成纤维细胞不表达神经嵴细胞标志物或施旺细胞标志物。(A)成纤维细胞的相差图像。比例尺：50μm。(B)成纤维细胞的流式细胞分析显示初始成纤维细胞群体不含有表达神经嵴标志物CD271的细胞。(C)神经嵴细胞标志物和施旺细胞标志物的免疫染色。胞核用Hoechst染色可视化。比例尺：50μm。(D、E)成纤维细胞培养物和诱导的过渡性前体细胞不含有间充质干细胞(MSC)。通过免疫染色(D)和流式细胞术(E)分析MSC标志物CD146。使用衍生自胚胎干细胞的MSC作为阳性对照。D中的比例尺：50μm。

图6：化合物B处理介导球状体贴壁至层粘连蛋白基材。在POL上铺种两小时后用化合物B或单一化合物B靶的抑制物生成的次生球状体。仅化合物B处理的球状体(上部中间)已经贴壁并开始移行。在对照(DMSO)条件和单一抑制物条件下，漂浮的球状体已经在孔的中心聚集。比例尺：200μm。

图7：(A、B)转化方案不产生神经元，如通过第31日时的阴性Map2染色所示。胞核用Hoechst染色可视化。比例尺：100μm。(C、D)转化过程期间的全基因表达谱。(C)相对于第0日(成纤维细胞)，在第11日(早期tP)、第18日(晚期tP)和第39日(iSC)时差异性表达的基因(在至少1个时间点期间倍数变化>10)的热图。使用平均连锁和欧氏距离，生成总体下调的基因(蓝色)和总体上调基因(红色)的聚类。生物学过程GO术语用于聚类注释。对于每个阶段，分析来自至少两个独立测定法的数据。(D)显示神经营养因子差异性表达的热图。Log2表达比以蓝色表示下调并且以红色表示上调。显示来自至少两个独立实验的数据。

图8：在POL、细胞示踪物标记的成纤维细胞或细胞示踪物标记的iSC上共培养NSC衍生的神经元的时间过程。相差图像和细胞示踪物信号(红色)叠加。可以通过特征性的小的暗色胞体(soma)鉴定NSC-神经元。在第1日，NSC-神经元已经在全部三种表面(A-C)上贴壁。与成纤维细胞的延长共培养导致神经元聚集和差的神经突突起(E、H)。与iSC共培养导致多细胞网络的增殖和形成(F、I)。比例尺：100μm。J：与POL上培育的NSC-神经元相比，与iSC共培养导致NSC-神经元数目增加。在共培养第13日，将神经元鉴定为细胞示踪物阴性细胞。条柱显示三次独立实验的均数+/-SD。使用Studentt检验评价数据。

发明详述

将一个细胞类型直接转化成另一个细胞类型的现行方案经常效率低下。这可能部分地归因于以下事实：许多方案尝试获得有丝分裂后的细胞类型，例如心肌细胞或神经元。因此，转化程序包括降低产率和效率的终止增殖。另外，非分裂性细胞似乎比强迫的表型改变如再编程更不易操作，这可能归因于表观遗传表型的塑性较小。本文中提供了不需要通过引入基因来遗传修饰细胞而将体细胞如成纤维细胞高效转化成施旺细胞(SC)的新型两步骤方案。在第一步骤中，将成纤维细胞再编程为神经嵴细胞(NCC)，它是SC祖细胞的分裂性群体。可以将NCC扩充并且随后在第二步骤中分化为成熟的SC。除施旺细胞之外，NCC还可以产生软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞。

神经嵴细胞是在胚胎发生期间在神经板和非神经外胚层的边界处起源的多能细胞，并且产生多种细胞类型，例如施旺细胞、周围神经元、黑素细胞、平滑肌细胞和软骨。神经嵴具体是受众多信号传导提示如骨形态发生蛋白(BMP)、音猬因子(Shh)、Wnt、成纤维细胞生长因子(Fgf)和Notch调节的高度复杂突起(Stuhlmiller和Garcia-Castro,2012)。另外，神经嵴的指定与神经上皮命运决定密切关联。多潜能干细胞在体外分化成神经细胞经常产生小比例的NCC(Chambers等人,2009)。

本发明的发明人发现，神经诱导性提示物与NCC分类物的组合诱导成纤维细胞中的NCC命运。令人惊讶地，本发明人发现化合物B(N-{(3R,4R)-4-[4-(2-氟-6-羟基-3-甲氧基-苯甲酰基)-苯甲酰氨基]-吖庚烷-3-基}-4-羟基-3,5-二甲基-苯甲酰胺，也称作3,5-二甲基-4-羟基苯甲酸{(3R,4R)-4-[4-(2-氟-6-羟-3-甲氧基-苯甲酰基)-苯甲酰氨基]-吖庚烷-3-基}-酰胺盐酸盐，参见例如WO03/076429)可以诱导体细胞再编程为神经嵴细胞。本发明的发明人显示，这种化合物选择性地促进神经干细胞增殖，而不影响间充质干细胞(图1A)。

本文中提供一种从体细胞产生神经嵴细胞的方法，所述方法包括：

a)在补充有丙戊酸的培养基中培养体细胞，

b)在补充有N-{(3R,4R)-4-[4-(2-氟-6-羟基-3-甲氧基-苯甲酰基)-苯甲酰氨基]-吖庚烷-3-基}-4-羟基-3,5-二甲基-苯甲酰胺的无血清培养基中培养步骤(a)中获得的细胞。

在一个实施方案中，该方法不包括通过引入基因遗传修饰体细胞或步骤(a)中获得的细胞。

步骤a)中适于培养体细胞的培养基是适于培养皿中培育某些体细胞类型的任何已知培养基。例如，在低血清成纤维细胞培养基(例如FibroGro、Millipore)中培育成纤维细胞。

步骤b)中适于培养细胞的培养基是任何无血清培养基，优选地补充有选自碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、脑衍生神经营养因子(BDNF)、肝素、δ样蛋白4(Dll4)、Jagged1、音猬因子(SHH)、成纤维细胞生长因子8(FGF8)的一种或多种生长因子。

如本文所用的术语“体细胞”指形成生物身体的任何细胞，所述细胞不是生殖系细胞(例如精子和卵细胞、以及产生它们的细胞(配子母细胞)和未分化的干细胞。内部器官、皮肤、骨、血液和结缔组织均由体细胞构成。用于本文所述方法中的优选体细胞是成纤维细胞、脂肪细胞或角质形成细胞，并优选地从皮肤活组织检查样品获得。

在一个实施方案中，体细胞是成纤维细胞。本文中可用的成纤维细胞例如是肺成纤维细胞和包皮成纤维细胞。

优选地，用于转化成神经嵴细胞的体细胞是哺乳动物来源的，最优选地是人来源的。所述的人体细胞可以从健康个体或从患者获得。优选地，所述体细胞选自成纤维细胞、脂肪细胞或角质形成细胞。这些供体细胞可以容易地从任何适合的来源获得。本文中优选在不对人体进行侵入性过程情况下允许分离供体细胞的来源。用于分离成纤维细胞的方法是本领域熟知的。成纤维细胞可以从任何适合的来源获得，例如来自多种器官组织或皮肤组织。优选的成纤维细胞是肺成纤维细胞、包皮成纤维细胞和成人皮肤成纤维细胞。在本发明的一个具体实施方案中，所述人成纤维细胞从患者获得，例如通过皮肤活组织检查(例如，用定义的因素进行人体细胞至多能细胞的再编程(Reprogrammingofhumansomaticcellstopluripotencywithdefinedfactors).GeorgeQ.Daley等人,Nature2008；用于从人皮肤的单一冲击活组织检查物分离和系列繁殖角质形成细胞、内皮细胞和成纤维细胞的方法(Amethodfortheisolationandserialpropagationofkeratinocytes,endothelialcells,andfibroblastsfromasinglepunchbiopsyofhumanskin),Normand等人,InVitroCellular&DevelopmentalBiology-Animal,1995))。脂肪细胞和角质形成细胞也可以通过皮肤活组织检查样品或拔除的毛发容易地获得(从皮肤或拔除的毛发中分离和培育人角质形成细胞用于产生诱导的多潜能干细胞,Belmonte等人,NatureProtocols2010)并且也是本发明方法的优选供体细胞。适于转化成神经嵴细胞的其他体细胞是从血液样品获得的白细胞或上皮细胞或从尿样获得的其他细胞。

如本文所用，“神经嵴细胞”指表达至少一种选自Sox10、Snai1、Twist1、Krox20、CD271、FoxD3、AN2的神经标志物的多能细胞子集。在一个实施方案中，通过本文公开的方法获得的神经嵴细胞表达全部的神经标志物Sox10、Snai1、Twist1、Krox20、CD271、FoxD3、AN2。通过本文所述的方法获得的神经嵴细胞也称作“iNCC”：经诱导的神经嵴细胞。神经嵴细胞可以无限地扩充并可以分化成施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞和脂肪细胞。

如本文所用，术语“再编程”指将体细胞转化成分化程度较低的细胞(例如将成纤维细胞、脂肪细胞或角质形成细胞转化为神经嵴细胞)所需要的一个或多个步骤。通过本文公开的方法实现体细胞至神经嵴细胞的再编程。

在一个实施方案中，步骤b)包括以悬浮培养法培养细胞。悬浮培养促进球状体样结构的形成并因此选择发生再编程的细胞。如本文所用的术语“悬浮培养”指如此培养细胞，从而细胞不贴附于固相支持物或培养容器。为了使细胞转换成悬浮培养物，例如将它们通过细胞刮刀从培养容器取出并转移至含有培养基的无菌低黏附平板，所述平板不允许细胞贴附至平板表面。因此，细胞以悬浮方式培养，而不贴附于基质或培养皿底部。

在一个实施方案中，步骤b)的无血清培养基补充有骨形态发生蛋白(BMP)的抑制物。在一个实施方案中，BMP的抑制物是头蛋白(noggin)(同义词：NOG；SYM1；SYNS1)。

在一个实施方案中，步骤b)的无血清培养基补充有转化生长因子β(TGFβ)的小分子抑制物。在一个实施方案中，TGFβ的抑制物是SB431542(参见，例如Laping,NJ；GrygielkoE,MathurA,ButterS,BombergerJ,TweedC,MartinW,FornwaldJ,LehrR,HarlingJ,GasterL,CallahanJF,OlsonBA(2002)."使用TGF-βI型受体激酶活性的新抑制剂SB-431542抑制转化生长因子(TGF)-β1诱导的胞外基质(Inhibitionoftransforminggrowthfactor(TGF)-beta1-inducedextracellularmatrixwithanovelinhibitoroftheTGF-betatypeIreceptorkinaseactivity:SB-431542)".MolecularPharmacology62(1):58–64,例如以Sigma产品编号S4317市售)。

在一个实施方案中，步骤b)的无血清培养基补充有糖原合酶激酶3(GSK3β)的小分子抑制物。在一个实施方案中，GSK3β的抑制物是3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮，本文中也称作“化合物21”或“CP21”；参见例如L.Gong等人；Bioorganic&MedicinalChemistryLetters20(2010),1693-1696。

这些抑制物可以单一或以任何组合方式使用。添加一种或多种这些抑制物是任选的并且改善该过程。用化合物B单独进行再编程/转化成纤维细胞。

在一个实施方案中，步骤b)的无血清培养基补充有BMP、TGFβ和GSK3β的抑制物。在一个实施方案中，步骤b)的无血清培养基补充有头蛋白、CP21和SB431542。在一个实施方案中，步骤b)的无血清培养基补充有0.1-1μg/ml头蛋白、0.1-5μMCP21和1-50μMSB431542。在一个实施方案中，步骤b)的无血清培养基补充有0.5μg/ml头蛋白、1μMCP21和10μMSB431542。

一个实施方案包括在从体细胞产生神经嵴细胞的方法中使用N-{(3R,4R)-4-[4-(2-氟-6-羟基-3-甲氧基-苯甲酰基)-苯甲酰氨基]-吖庚烷-3-基}-4-羟基-3,5-二甲基-苯甲酰胺。

一个实施方案包括在从体细胞产生神经嵴细胞的方法中使用3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮。

在一个实施方案中，步骤a)包括将细胞培养2天。

在一个实施方案中，步骤b)包括将细胞培养7至14天。在一个实施方案中，步骤b)包括将细胞培养7天。在一个实施方案中，步骤b)包括将细胞培养14天。

在一个实施方案中，体细胞是人细胞。

本发明的一个优选方面是一种用于产生患者特异性神经嵴细胞的方法。因此，在一个实施方案中，体细胞从患有神经疾病的受试者获得。

如本文所用的“神经疾病”定义为神经系统的病症，并且包括涉及中枢神经系统(脑、脑干和小脑)、外周神经系统(包括颅神经)和自主神经系统(其部分位于中枢和外周神经系统中)的病症。特别地，神经疾病包括神经嵴细胞或施旺细胞的功能受损、改变或破坏的任何疾病。与施旺细胞有关的神经疾病的例子是脱髓鞘病、多发性硬化、脊髓病、实验性变应性脑脊髓炎(EAE)、急性弥散性脑脊髓炎(ADEM)、感染后或疫苗接种后脑脊髓炎、周围神经病、神经鞘瘤、进行性神经性肌萎缩综合征、吉兰-巴雷综合征、慢性炎症性脱髓鞘性多神经根神经病(CIDP)。

本发明的另一个方面是一种用于从健康个体获得的体细胞中产生神经嵴细胞的方法。

术语“患者特异性神经嵴细胞”指从患者的体细胞获得的神经嵴细胞并且也称作自体神经嵴细胞。如本文所用的“从健康个体获得的神经嵴细胞”指从未疑似患有任何病症或疾病的个体的体细胞获得的神经嵴细胞。

在本发明的另一个方面，提供了通过前述方法中任一种方法产生的神经嵴细胞群体。优选地，神经嵴细胞群体是患者特异的，即源自从患病个体获得的体细胞。在另一个实施方案中，所述细胞群体从健康个体获得。这些神经嵴细胞可以无限扩充。培养是容易的和充分表征的。反复地冷冻和融化神经嵴细胞等分试样是可能的。源自患者的神经嵴细胞代表了研究神经疾病病理生理学的疾病相关性体外模型。将患者的特定体细胞直接转化为神经嵴细胞代表了一项产生患者特异性神经嵴细胞生物样品库的容易获得和可重复的技术。因此，在本发明的又一个优选方面，构思了包含患者特异性神经嵴细胞的生物样本库。在另一个实施方案中，产生了包含从健康个体所获得的不同神经嵴细胞群体的生物样本库。如本文所用的术语“生物样本库”意指从不同个体或物种取得的生物样品文库。标本和相关数据的归档收集意图用于研究目的，旨在对付神经疾病如脱髓鞘病、多发性硬化、脊髓病、实验性变应性脑脊髓炎(EAE)、急性弥散性脑脊髓炎(ADEM)、感染后或疫苗接种后脑脊髓炎、周围神经病、神经鞘瘤、进行性神经性肌萎缩综合征、吉兰-巴雷综合征、慢性炎症性脱髓鞘性多神经根神经病(CIDP)。

在一个实施方案中，该方法还包括

c)在适于神经嵴细胞分化成分化细胞的条件下温育步骤b)的产物，所述的分化细胞选自施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞。

如本文所用，术语“分化”、“分化过程”指将分化程度较低的细胞转化成体细胞(例如将神经嵴细胞转化成施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞和脂肪细胞)的一个或多个步骤。

在一个实施方案中，提供了通过根据任一个以上实施方案的方法获得的施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞。优选地，施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞是患者特异的，即源自从患病个体获得的体细胞。在另一个实施方案中，所述细胞群体从健康个体获得。例如，源自患者的施旺细胞代表了研究神经疾病病理生理学的疾病相关性体外模型。将患者特异的体细胞转化为施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞代表了一项产生患者特异性神经嵴细胞生物样品库的容易获得和可重复的技术。因此，在本发明的又一个优选方面，构思了包含患者特异性施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞的生物样本库。在另一个实施方案中，产生了包含从健康个体所获得的不同施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞群体的生物样本库。如本文所用的术语“生物样本库”意指从不同个体或物种取得的生物样品文库。标本和相关数据的归档收集意图用于研究目的，旨在对付多种疾病，例如神经疾病如脱髓鞘病、多发性硬化、脊髓病、实验性变应性脑脊髓炎(EAE)、急性弥散性脑脊髓炎(ADEM)、感染后或疫苗接种后脑脊髓炎、周围神经病、神经鞘瘤、进行性神经性肌萎缩综合征(Charcot-Marie-Toothdisease)、吉兰-巴雷综合征、慢性炎症性脱髓鞘性多神经根神经病(CIDP)。

在一个优选实施方案中，使用由这种方法获得的神经嵴细胞、分化的施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞作为研究神经疾病病理生理学的体外模型。例如，由本发明方法获得的神经嵴细胞、分化的施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞可以用于筛选逆转、抑制或阻止神经疾病的化合物。另外，它们可以用于筛选逆转、抑制或阻止药物(例如糖尿病药物)的神经副作用的化合物。优选地，由本文所述的本发明方法获得的所述神经嵴细胞、分化的施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞源自患病受试者。

在另一个实施方案中，使用由这种方法获得的神经嵴细胞、分化的施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞筛选并评价用于治疗神经疾病的新靶和化合物。优选地，由这种方法获得的神经嵴细胞、分化的施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞衍生自患有神经疾病的个体。分化来自患病受试者的神经嵴细胞、分化的施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞代表了一个在人类背景范例下早期评价药物安全性的独特机会。在另一个实施方案中，使用由这种方法获得的分化的施旺细胞作为外周神经系统的体外模型。

在另一个方面，本发明提供一种治疗性组合物，其含有由前述任一种方法产生的细胞或含有前述细胞群体的任一群体。优选地，这种治疗性组合物还包含生理相容性溶液，包括例如人工脑脊液或磷酸盐缓冲盐水。所述治疗性组合物可以用来治疗、预防或稳定神经疾病，例如脱髓鞘病、多发性硬化、脊髓病、实验性变应性脑脊髓炎(EAE)、急性弥散性脑脊髓炎(ADEM)、感染后或疫苗接种后脑脊髓炎、周围神经病、神经鞘瘤、进行性神经性肌萎缩综合征、吉兰-巴雷综合征、慢性炎症性脱髓鞘性多神经根神经病(CIDP)。例如，成纤维细胞、角质形成细胞或脂肪细胞可以通过皮肤活组织检查从需要治疗的个体或从健康个体中获得并且通过本发明的方法再编程为神经嵴细胞、分化的施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞。在本发明的一个实施方案中，收获由这种方法获得的神经嵴细胞、分化的施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞并且将其引入个体中以治疗疾病。在另一个实施方案中，由这种方法获得的神经嵴细胞在引入个体前在适于分化为分化的施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞的条件下培养，并且可以用来更换患病或受损的组织或辅助其正常功能。本发明的巨大优点在于，它基本上无限制地供应患者特异性人神经嵴细胞、分化的施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞，或者它基本上无限制地供应来自具有相同HLA型的健康个体的适用于移植的相容性神经嵴细胞、分化的施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞。细胞疗法中自体和/或相容性细胞的使用提供了相对于使用非自体细胞的优势，所述非自体细胞可能受到免疫排斥。相反，自体细胞不可能激发明显的免疫反应。

本发明的另一个实施方案是人神经嵴细胞、分化的施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞的生物样品库用于治疗神经疾病的用途。这些生物样品库优选地包含从具有几种HLA型的患者或健康个体获得的人神经嵴细胞、分化的施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞。移植从健康供体获得的细胞至需要用相容性HLA型治疗的个体避免了正常情况下与异源性型细胞移植相关的突出的排斥反应问题。常规地，通过施用免疫抑制物或抗排斥药物如环孢菌素阻止或减少排斥。然而，这类药物具有明显的不利副作用，例如，免疫抑制、致癌性、肾毒性以及十分昂贵。本发明应当消除或至少大幅减少抗排斥药物如环孢菌素、依木兰、FK-506、糖皮质激素和雷帕霉素及其衍生物的需要。

就本发明的治疗方法而言，向哺乳动物施用神经嵴细胞、分化的施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞不意在限于特定施用模式、剂量或施用频率；本发明构思了全部施用模式，包括足以提供充分阻止或治疗疾病的剂量的肌内、静脉内、关节内、病灶内、皮下或任何其他途径。人神经嵴细胞、分化的施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞可以按单剂量或多剂量施用至哺乳动物。当施用多剂量，剂量可以彼此相隔例如1周、1月、1年或10年。也可以在施用细胞之前、其期间或之后施用一种或多种生长因子、激素、白介素、细胞因子、小分子或其他细胞以进一步使得这些细胞偏向于特定细胞类型。

以上实施方案的任一个实施方案可以单独或组合地存在。

如本文所用的术语“干细胞”指具有自我更新能力的细胞。如本文所用的“未分化的干细胞”指具有分化成种类多样的细胞类型的能力的干细胞。如本文所用，“多潜能干细胞”指能产生多种细胞类型的细胞的干细胞。多潜能干细胞(PSC)包括人胚胎干细胞(hESC)和人经诱导的多潜能干细胞(hiPSC)。人经诱导的多潜能干细胞能衍生自再编程的体细胞，例如通过本领域已知的方法转导4种确定的因子(Sox2、Oct4、Klf4、c-Myc)。

实施例

成纤维细胞培养和iSC转化

SCC058包皮成纤维细胞(Millipore)于37℃和5％CO₂在低血清FibroGro(Millipore)中培养。为了转化，将7300个细胞/cm²接种在含有1mM丙戊酸(VPA，Sigma)的成纤维细胞培养基中。随后，将细胞用1mMVPA和6μg/ml聚凝胺(polybrene)(Millipore)处理2天并随后转移至低黏附平板的NSC培养基中用于形成球状体。NSC培养基由NeuroCultNS-A增殖培养基(StemCellTechnologies)组成，所述增殖培养基补充有青霉素/链霉素、bFGF(20ng/ml)、EGF(20ng/ml)、BDNF(20ng/ml)、肝素(2μg/ml)、Dll4(500ng/ml)、Jagged1(500ng/ml)、SHH(500ng/ml，peprotech)、抗坏血酸(0.2mM，Sigma)、FGF8a(100ng/ml)、10％NSC-CM(由ESC-NSC条件化的培养基)和化合物B(2μM，Roche)。

化合物B已经例如在WO03/076429中描述并且具有以下结构：

熔点温度(℃)：180-183℃

系统命名：

[3R,4R]-N-{4-[4-(2-氟-6-羟-3-甲氧基-苯甲酰基)-苯甲酰氨基]-吖庚烷-3-基}-4-羟-3,5-二甲基-苯甲酰胺盐酸盐

如果不另外指明，则全部生长因子均来自R&DSystems。为了比较其他抑制物的效果，将化合物B分别更换为2μMDorsomorphin、10μMH89(Tocris)、10μMY27632或10μMGSK650394(Tocris)。

在4天后，将球状体用Accutase解离并且将单细胞接种在低黏附平板中补充有抑制物混合物的NSC培养基中，所述抑制物混合物包含500ng/ml头蛋白(peprotech)、10μMSB431452(Tocris)和1μMCP21(Roche)。

CP21是一种新的高度选择性GSK3β抑制物：系统命名：3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮；描述于以下文献中：L.Gong等人；Bioorganic&MedicinalChemistryLetters20(2010),1693-1696。

3天后，将次生球状体接种在聚鸟氨酸-层粘连蛋白(POL)包被的培养皿上。在贴壁后(24小时)，将培养基更换为分化培养基，所述分化培养基包含N2B27(1:1DMEM/F12和Neurobasal连同β-巯基乙醇(50μM)、无维生素A的B27补充物(1:50，Invitrogen)，和补充有抗生素的N2补充物(1:100，Invitrogen)、BDNF(20ng/ml)、GDNF(20ng/ml)、层粘连蛋白(1μg/ml)、抗坏血酸(0.2mM)和双丁酰-cAMP(0.5mM，Sigma)。每隔1日，更换50％培养基。对于分化的第一个7天，向培养基补充抑制物混合物。

对于神经嵴样细胞的脂肪细胞分化和平滑肌细胞分化，将次生球状体作为球状体或单个细胞铺种在生长因子减量的基质胶上。在24小时后，将培养基更换成脂肪生成性分化培养基，所述分化培养基含有DMEM、7.5％敲除血清替代物(KOSR，Invitrogen)、0.5％非必需氨基酸、1％青霉素和链霉素、0.1μM地塞米松、10μg/ml胰岛素(Sigma)和0.5μM罗格列酮。每隔1日更换培养基。在4周后，细胞用4％PFA固定并用油红或抗SMA分别染色。对于软骨生成，通过离心收集次生球状体并且作为沉淀物在补充有谷氨酰胺、丙酮酸、抗生素、NEAA、10％FCS和10ng/mlTGFβ的DMEM高葡萄糖中培养。在4周后，将沉淀物用4％PFA固定并通过阿辛蓝染色法分析。

使用双重SMAD抑制方案，如先前所述生成胚胎干细胞衍生的神经干细胞(ESC-NSC)(Chambers等人,2009)。将NSC于37℃，5％CO₂在POL包被的平板上在补充有bFGF(10ng/ml)、EGF(10ng/ml)、BDNF(20ng/ml)的N2B27中培养。

为了鉴定化合物B，将NSC在POL包被的平板上于N2B27中以21000个细胞/cm²接种。在细胞贴壁后(4小时)，以所示浓度添加化合物。用DMSO处理阴性对照细胞。将细胞温育4天并且随后使用试剂盒(Promega)根据制造商的说明书测定ATP的量。

对于iSC/NSC-神经元共培养，将NSC在分化培养基中培养13天。用Accutase解离NSC-神经元并且随后将其以120000个NSC-神经元/12孔接种在分化培养基中仅POL，成纤维细胞或iSC上。成纤维细胞和iSC已经事先用CFSE细胞示踪物(Invitrogen，10μM，20分钟)标记。每隔1日，更换50％培养基。在共培养第13日，将细胞用4％PFA固定。

激酶选择性概况分析

使用来自Caliper(PerkinElmer)的ProfilerPro激酶试剂盒，根据制造商的说明书进行激酶选择性概况分析。

染色

对于全部免疫荧光染色，将细胞用4％PFA固定15分钟。用10％驴血清封闭后，将细胞用第一抗体染色过夜。随后，洗涤细胞并用与Alexa488、555和647缀合的第二抗体染色(MolecularProbes)。将胞核用Hoechst(MolecularProbes)染色。第一抗体是抗Sox1(Santacruz，1:250)、抗巢蛋白(Millipore，1:500)、抗Sox10(Santacruz，1:200)、抗Snai1(Santacruz，1:100)、抗FoxD3(Santacruz，1:100)、抗AN2(Miltenyi，1:20)、抗Plp(abcam，1:75)、抗GalC(Millipore，1:100)、抗S100B(abcam，1:20)、抗MBP(Sigma，1:100)、抗ABCA2(santacruz，1:200)、抗Map2ab(Sigma，1:800)、抗GFAP(DAKO，1:500)、髓鞘染液(MolecularProbes)和抗SMA(Dako，1:100)。使用Zeiss倒置显微镜对细胞成像并使用ImageJ软件分析图像。使用Operetta成像系统和Harmony图像分析软件(PerkinElmer)进行Plp染色和Map2染色的定量。

对于油红染色，将细胞用4％PFA固定15分钟。用PBS洗涤后，将细胞在室温在油红染色液(60％异丙醇中0.21％油红)中温育1小时。随后，用PBS洗涤细胞3-5次并分析。

对于软骨生成的阿辛蓝染色，将细胞沉淀物用4％PFA固定30分钟。随后将沉淀物用PBS洗涤3次并在室温在阿辛蓝染色液中温育过夜。将沉淀物脱色(室温20分钟，3次)，转移至PBS并分析。

流式细胞术

在第18日，将细胞用Accutase解离并随后在条件培养基中在37℃，5％CO₂温育2小时以允许表面抗原再表达。将细胞在4℃在含有第一抗体抗CD29-PE(BDBioscience)，抗CD271-APC(Miltenyi)或相应同种型对照(BDBioscience)的MACS运行缓冲液(Miltenyi)中染色10分钟，用PBS洗涤，并且随后用2％PFA固定1小时并在4℃贮存于PBS中。使用BDFACSCantor进行流式细胞术，并且用FlowJo软件分析数据。

全基因组基因表达分析

为了提取总RNA，使用FastPrep-24仪(MPBiomedicals)和具有DNA酶处理的QiagenmiRNeasy微量试剂盒(Qiagen)，将细胞在预填充有1.4mm陶瓷珠和QIAzol裂解试剂的管中匀浆。在Agilent2100bioanalyzer(AgilentTechnologies)上使用微流体芯片分析法，进行RNA质量评估并定量。在BiomekFXp工作站(BeckmanCoulter)上，将10ng总RNA使用NuGenOvationPicoWTA系统V2逆转录，随后片段化并用NuGenEncore生物素模块(NuGENTechnologies)进行3’-生物素标记。将4.4μg片段化的cDNA在AffymetrixHG-U133_plus_2微阵列上在45℃和65转/分钟杂交16小时，随后洗涤，染色并且在GeneChipFluidics450工作站和GeneChipScanner3000(Affymetrix)上扫描。对Affymetrix探针强度进行稳健多阵列分析(RMA)，用分位数归一化进行背景校正及进行中位数优化探针集合汇总，如Partek基因组6.6软件套装(Partek)中所述执行。使用Partek和NetAffyx(Affymetrix)确定探针集合的基因名称。基于博德研究所(BROADInstitute)算法，将基因集合富集分析应用于数据。使用基于基因集合的GO术语和反应组学/RONET鉴定生物学过程和信号传导途径。Cytoscape插入式富集图用来可视化通过显著性阈值的GSEA结果(p-值<0.005，错误发现率<0.1)。使用TibcoSpotfire3.1.0(TibcoSoftware)生成基因表达热图。

结果

显示化合物B选择性促进神经干细胞增殖，而不影响间充质干细胞(图1A)。为了分析化合物B在成纤维细胞中诱导NC祖细胞阶段的能力，进行球状体形成测定法。这种测定法已经在多种研究中用于鉴定和选择来自多种组织的具有干细胞特征的细胞(Dontu等人,2003；Seaberg等人,2004；Toma等人,2001；Tropepe，2000)。化合物B处理导致球状体大小和总细胞数目显著增加(图1B)。激酶概况分析(图1C)将化合物B鉴定为有效的多激酶抑制物，其主要靶为AMPK、PKA、MSK1、SGK1、ROCK2和PKGa(抑制作用超过80％)。为了检验当化合物B处理时增加的球状体形成能力是否由抑制这些靶之一或其组合介导，测试特定单一激酶抑制物对球状体形成的影响。仅化合物B处理导致悬浮培养的总细胞数目显著增加。另外，当化合物B处理时，平均球状体大小也最大(图1D)。有趣地，单一激酶抑制物的组合不导致细胞数目增加，因为与对照相比，化合物B和球状体大小甚至略微地缩减。

基于球状体形成作为初始步骤，建立了在成纤维细胞中诱导NCC表型的优化方案(图1E)。简言之，用HDAC抑制物VPA处理，接着通过在确定的神经干细胞培养基中用化合物B处理，诱导NCC命运。将所产生的细胞以悬浮培养扩充一代并且额外地用BMP、TGF-β和GSK3β信号传导的抑制物、已知增强成纤维细胞的神经性转化并允许多潜能干细胞向神经嵴分化的抑制物混合物处理(Ladewig等人,2012；Menendez等人,2011)。随后，将NCC球状体铺种在聚鸟氨酸-层粘连蛋白包被的平板上并转移至分化培养基。在铺种后2小时以内观察到球状体贴壁并且细胞不久开始从球状体移出。与之相反，当已经使用特定单一激酶抑制物生成球状体时，球状体贴壁遭受高度破坏并且未观察到或仅观察到不良的细胞移行(图6)。在NC生理发育期间，层粘连蛋白代表介导NC细胞移行和存活的关键ECM组分之一(Bronner-Fraser,1986；Desban等人,2006)。因此，在层粘连蛋白基材上快速贴壁并移行的能力表示化合物B处理的细胞已经采用了某些NCC特征。

球状体贴壁后24小时，细胞染色呈Sox1和巢蛋白阳性，所述Sox1和巢蛋白是神经上皮和神经嵴的标志物。1周后(第18日)，检测到神经嵴特异性标志物p75、Sox10、FoxD3、Snai1和An2，表明向NCC表型进一步转化。另外，丢失成纤维细胞身份由成纤维细胞表面标志物CD29下调指示。由于NCC特征在于它们能够产生多种不同细胞类型，所以我们检验了转换的细胞产生从NC衍生的非神经细胞类型的能力。在特定分化培养基中培养时，转化的细胞产生脂肪细胞(由油红染色鉴定)、软骨(由阿辛蓝染色鉴定)和SMA阳性平滑肌细胞，证实它们的多能分化能力。总之，这些结果表明化合物B处理与确定的培养条件组合足以在人成纤维细胞中诱导神经嵴细胞样命运。我们将这些细胞命名为经诱导的神经嵴细胞或iNCC。

接下来，我们想要诱导iNCC分化为成熟的施旺细胞。因此，在标准神经分化培养基中培养细胞3-4周。作为iNCC在第一代初始增殖阶段后，细胞数目减少约50％并且随后保持相同的细胞数目直至实验结束(图3)。在3-4周后，细胞显示具有大的星状胞体(soma)和众多长凸起部分的胶质细胞的典型形态。超过60％的细胞呈施旺细胞标志物Plp染色阳性(图3)。另外，细胞表达施旺细胞标记蛋白Krox20、S100b、GFAP和GalC(图3)。不能检测到Map2阳性细胞，表明培养物中不存在神经元(图7)。未处理的成纤维细胞对全部标志物染色均为阴性(图5)。因此，可以得出结论：iNCC进一步分化成施旺细胞。我们将这些细胞命名为经诱导的施旺细胞或iSC。

为了分析iSC的电生理特征，进行全膜片钳记录。iSC不能够产生动作电位，但是去极化时展示非常高的K⁺流，表明存在电压依赖性K⁺通道(胶质细胞的共同特征)。与成纤维细胞相比时，K+流显著更高，从而证实转化过程(图3)

在体内，施旺细胞执行众多功能以支持神经元祖细胞和神经元生长、分化和存活。另外，它们的凸起部分形成隔绝一个轴突与另一个轴突的髓鞘。为了检验iSC是否能够支持神经元分化和存活，进行共培养实验。诱导衍生自胚胎干细胞的人神经干细胞以分化成神经元(NSC-神经元)。在13天后，将NSC-神经元解离并铺种在聚鸟氨酸、细胞示踪物标记的成纤维细胞或iSC上。NSC-神经元在全部三个条件下均良好贴壁。铺种在POL上的NSC-神经元继续分化并形成神经突网络。然而，在与iSC共培养的第一周中，可以观察到NSC-神经元大量增加，这表明NSC-神经元的增殖增加或细胞死亡减少。在持续共培养时，iSC和NSC-神经元形成致密的多细胞网络。相反，铺种在成纤维细胞上的NSC-神经元不增殖并且以仅可见少数神经突的致密团簇聚集(图8)。在共培养第13日的Map2染色证实，与iSC一起培养的NSC-神经元形成比单独培育的或与成纤维细胞培育的NSC-神经元更大和更分支的神经突网络(图4)。图像定量揭示，与单独培育的NSC-神经元相比，Map2阳性区域以及神经突的数目和总长度在共培养的iSC/NSC-神经元中显著增加(图4)。另外，当细胞与iSC共培养时，神经元总数也增加(图8J)。这表明，iSC积极地影响神经元存活和分化。另外，与成纤维细胞共培养导致神经突数目和长度的显著减少，从而证实iSC的有益作用真实地归因于它们的细胞表型，而不归因于其起源细胞类型。

有趣地，我们偶尔检测到其中Map2阳性神经突和细胞示踪物标记的iSC凸起部分共定位的区域，这表示正在进行的髓鞘化过程(图4)。

总之，iSC明显支持神经元分化和存活，并且能够形成髓鞘，尽管频率低。因此，可以得出结论：至iSC的转化过程还包括采用生理性施旺细胞的功能特征。

讨论

近年来，报告体细胞再编程或转分化的多项研究已经显示，甚至在终末分化细胞中，仍可以激活某种可塑性并且转变成其他不相关的细胞类型仍是可能的。这创造了新机会以获得对门诊或研究有意义的不可获得或仅非常难以获得的细胞，例如神经细胞类型。然而，目前的细胞转化方案通常需要异位表达定义的基因。这导致再编程细胞的基因修饰，这些基因修饰可能以不利或出乎意料的方式影响后续应用。

这里，我们提出了一种将人成纤维细胞通过神经嵴阶段转分化为成熟施旺细胞的新方案。重要地，这项策略不依赖异位基因表达，而完全基于对定义的信号传导途径进行化学修饰。我们引入一种新的多激酶抑制物，即，化合物B，所述抑制物与确定成分的培养基条件和BMP、TGF-β和GSK3β的抑制物组合时能够使成纤维细胞转化为神经嵴细胞阶段。这些NCC随后可以进一步分化为成熟的施旺细胞。

化合物B诱导向NCC表型转化的第一步骤，其中通过球状体形成能力、悬浮培养增殖和球状体贴附至层粘连蛋白，评价所述NCC表型。激酶概况分析确定AMPK、MSK1、PKA、ROCK2、PKGa和SGK1为化合物B的主要靶。对这些信号传导途径的几项研究引出关于转化过程机理性调节作用的假设。因此，SGK1参与细胞应激反应并且其上调与神经变性病中细胞死亡的发生相关(Schoenebeck等人,2005)。在我们的方案中，SGK1抑制作用可能因此增强向神经命运转化的细胞存活。AMPK作为关键的细胞能量传感器发挥作用。通过阻止向再编程必需的糖酵解代谢转变，AMPK激活作用抑制IPS生成(Vazquez-Martin等人,2012)。这种代谢屏障还可能在将细胞从含血清的成纤维细胞培养基转移至无血清神经培养基的目前转化方案中至关重要。化合物B介导的AMPK抑制作用可能阻止细胞对代谢应激反应，因此允许持续的糖酵解，从而提供转化过程所要求的能量。

化合物B的另一个靶是Rho相关的激酶ROCK2。几项研究已经显示，这种激酶参与解离介导的细胞死亡。抑制该激酶保护人胚胎干细胞在亚克隆期间免于凋亡或改善人iPS细胞生成(Watanabe等人,2007；Yu等人,2011)。在这种转化策略中，可能要求抑制Rock以阻止悬浮培养时细胞死亡并引起球状体形成。这种设想得到以下事实支持：Rock2抑制物H89和Y27142还引起球状体大小增加，尽管程度与化合物B不同。另外，总细胞数目仅在化合物B处理时才增加，表明抑制Rock足以引起球状体形成，但是不引起细胞增殖。有趣地，抑制Rock在来自多种组织的正常细胞和肿瘤细胞中激发增殖性干细胞样表型(Liu等人,2012b；Terunuma等人,2010)。另外，抑制Rock信号传导促进神经嵴细胞移行(Groysman等人,2008)并具有神经保护作用(Ding等人,2009)。因此，除了其影响球状体形成外，抑制Rock可能增强采用迁移的神经嵴细胞的多种特征并促进这些细胞存活。

总之，化合物B以两种方式影响成纤维细胞的转化。首先，通过阻止应激诱导的细胞死亡，它使得细胞能转变为可再编程状态，允许球状体形成并提供所要求的代谢状态。第二，它增强神经嵴特征的采用，这潜在地还由NC特定的已知生长因子如Shh、FGF和Notch-配体Jagged和Dll4的存在介导。

除化合物B处理外，本文提出的方案包括基于小分子对TGFβ、BMP和GSK3β信号传导的抑制。已知对这些途径的调节指导胚胎干细胞向神经上皮命运和/或神经嵴命运分化(Chambers等人,2009；Menendez等人,2011)。与化合物B处理组合，Tgf-β、BMP和GSK3β应当因此增强向神经嵴的转化。在体内指定神经嵴后，BMP和TGF-β信号传导促进神经嵴细胞向间充质细胞类型的非神经分化(Chung等人,2009；John等人,2011；Shah等人,1996)。因此，在我们的方案中，抑制这些途径还起到以下目的：抑制这些非神经细胞的形成有助于施旺细胞形成。

然而，由化学处理诱导并造成向施旺细胞转化的确切机制仍难以阐明。由于强迫的细胞转分化是人为诱导的过程并且因此是非生理过程，因此相当难以将它与来自细胞命运决定的体内生理过程(如分化)的数据比较。这不仅对于本文提出的基于小分子的转化是如此，对于通过异位基因过量表达实现的转分化或再编程也是如此。强迫的基因表达和小分子处理这两者均导致其组合造成细胞身份改变的关键信号传导途径的激活或阻遏。与基于基因的方案相反，小分子处理不导致细胞的基因修饰。另外，并且或许甚至更重要，用化学化合物处理允许更严密地控制途径调节，例如通过改变化合物的浓度控制途径调节，而控制基因表达水平要难得多。

施旺细胞在外周神经系统发育、稳态和疾病中发挥重要作用(Bhatheja和Field,2006)。因此迄今，人施旺细胞可以从多潜能干细胞衍生(Liu等人,2012a)或作为原代细胞从外周神经组织衍生(Casella等人,1996)。尽管后者方案仅产生有限数量的细胞，但是使用多潜能干细胞与伦理制约因素、潜在致瘤性和–在IPS细胞的情况下–引入异位基因相关。成纤维细胞向iSC的化学转化代表一个不涉及多潜能阶段或基因修饰的施旺细胞新来源。能假设iSC源自成纤维细胞培养物中罕见干细胞群体的分化，而非源自真实的转化过程。实际上，已经显示可以从啮齿类和人获得所谓皮肤衍生的前体细胞(Toma等人,2001；Toma等人,2005)。这些前体细胞显示NC干细胞特性并且也可以分化成施旺细胞(Fernandes等人,2004；McKenzie等人,2006)。但是，在转化过程伊始，细胞数目在四天内增加超过2.5倍。为了达到这种增殖速率，初始培养物中干细胞的比例将不得不是约30％，这远高于皮肤中这个群体的已报道频率(约1％)(Hunt等人,2008)。因此，可以得出结论，iSC确实源自朝另一个细胞表型转化的成纤维细胞。通过胶质细胞形态、表达多种施旺细胞标志物、电生理学和在体外有效支持神经元分化和存活的能力，证实已转化细胞的施旺细胞身份。另外，iSC似乎能够在体外为神经元生成髓鞘，尽管频率低。然而，这可能归因于NSC衍生的神经元亚型，并且可能需要髓鞘化期间在体内存在额外的信号，以实现相同的体外结果。

总之，我们的工作提供了一种通过纯粹化学处理并且在不作基因修饰的情况下产生患者特异性人施旺细胞的有前景的新系统。这些细胞能代表在体外分析施旺细胞功能或病理生理学或在神经元-施旺细胞共培养系统中开发细胞相互作用模型的有用工具。

参考文献

Bhatheja,K.和Field,J.(2006).施旺细胞:来源和在轴突维持和再生中的作用(Schwanncells:originsandroleinaxonalmaintenanceandregeneration).IntJBiochemCellBiol38,1995-1999.

Bronner-Fraser,M.(1986).体内针对纤连蛋白和层粘连蛋白的受体的抗体干扰颅神经嵴发育(Anantibodytoareceptorforfibronectinandlamininperturbscranialneuralcrestdevelopmentinvivo).DevBiol117,528-536.

Casella,G.T.,Bunge,R.P.和Wood,P.M.(1996).用于从成熟的外周神经收获人施旺细胞和体外扩充的改进方法(ImprovedmethodforharvestinghumanSchwanncellsfrommatureperipheralnerveandexpansioninvitro).Glia17,327-338.

Chambers,S.M.,Fasano,C.A.,Papapetrou,E.P.,Tomishima,M.,Sadelain,M.和Studer,L.(2009).通过双重抑制SMAD信号传导进行人ES和iPS细胞的高效神经转化(HighlyefficientneuralconversionofhumanESandiPScellsbydualinhibitionofSMADsignaling).NatBiotechnol27,275-280.

Chung,I.H.,Yamaza,T.,Zhao,H.,Choung,P.H.,Shi,S.和Chai,Y.(2009).游走后的颅神经嵴细胞的干细胞特性和它们在齿槽骨再生和牙发育中的应用(Stemcellpropertyofpostmigratorycranialneuralcrestcellsandtheirutilityinalveolarboneregenerationandtoothdevelopment).StemCells27,866-877.

Desban,N.,Lissitzky,J.C.,Rousselle,P.和Duband,J.L.(2006).α1β1-整联蛋白与不同层粘连蛋白-1结构域的结合奏响了神经嵴细胞通过独立的信号传导途径的扩散、迁移和存活(alpha1beta1-integrinengagementtodistinctlaminin-1domainsorchestratesspreading,migrationandsurvivalofneuralcrestcellsthroughindependentsignalingpathways).JCellSci119,3206-3218.

Ding,J.,Yu,J.Z.,Li,Q.Y.,Wang,X.,Lu,C.Z.和Xiao,B.G.(2009).Rho激酶抑制物Fasudil部分通过星形胶质细胞衍生的G-CSF诱导神经保护和神经形成(RhokinaseinhibitorFasudilinducesneuroprotectionandneurogenesispartiallythroughastrocyte-derivedG-CSF).BrainBehavImmun23,1083-1088.

Dontu,G.,Abdallah,W.M.,Foley,J.M.,Jackson,K.W.,Clarke,M.F.,Kawamura,M.J.和Wicha,M.S.(2003).人乳腺干细胞/祖先细胞的体外增殖和转录谱(Invitropropagationandtranscriptionalprofilingofhumanmammarystem/progenitorcells).GenesDev17,1253-1270.

Fernandes,K.J.,McKenzie,I.A.,Mill,P.,Smith,K.M.,Akhavan,M.,Barnabe-Heider,F.,Biernaskie,J.,Junek,A.,Kobayashi,N.R.,Toma,J.G.等人(2004).多能成人皮肤衍生的前体细胞的皮凹(Adermalnicheformultipotentadultskin-derivedprecursorcells).NatCellBiol6,1082-1093.

Groysman,M.,Shoval,I.和Kalcheim,C.(2008).在神经嵴细胞分层中rho和rho相关激酶信号传导的负调节作用(Anegativemodulatoryroleforrhoandrho-associatedkinasesignalingindelaminationofneuralcrestcells).NeuralDev3,27.

Hunt,D.P.,Morris,P.N.,Sterling,J.,Anderson,J.A.,Joannides,A.,Jahoda,C.,Compston,A.和Chandran,S.(2008).成人皮肤的毛囊皮肤乳头中前体细胞的具有神经元和神经胶质潜力的高富集凹(Ahighlyenrichednicheofprecursorcellswithneuronalandglialpotentialwithinthehairfollicledermalpapillaofadultskin).StemCells26,163-172.

John,N.,Cinelli,P.,Wegner,M.和Sommer,L.(2011).转化生长因子β介导的Sox10抑制控制神经嵴干细胞中间充质祖先细胞的产生(Transforminggrowthfactorbeta-mediatedSox10suppressioncontrolsmesenchymalprogenitorgenerationinneuralcreststemcells).StemCells29,689-699.

Ladewig,J.,Mertens,J.,Kesavan,J.,Doerr,J.,Poppe,D.,Glaue,F.,Herms,S.,Wernet,P.,Kogler,G.,Muller,F.J.等人(2012).小分子使得人成纤维细胞能高效地神经元转化(Smallmoleculesenablehighlyefficientneuronalconversionofhumanfibroblasts).NatMethods9,575-578.

Li,W.,Jiang,K.和Ding,S.(2012).简洁的综述：控制细胞命运和功能的一种化学方法(Concisereview:Achemicalapproachtocontrolcellfateandfunction).StemCells30,61-68.

Liu,Q.,Spusta,S.C.,Mi,R.,Lassiter,R.N.,Stark,M.R.,Hoke,A.,Rao,M.S.和Zeng,X.(2012a).衍生自人ESCs的人神经嵴干细胞和经诱导的多潜能干细胞：诱导、维持和分化为有功能的施旺细胞(HumanneuralcreststemcellsderivedfromhumanESCsandinducedpluripotentstemcells:induction,maintenanceanddifferentiationintofunctionalschwanncells).StemCellsTranslMed1,266-278.

Liu,X.,Ory,V.,Chapman,S.,Yuan,H.,Albanese,C.,Kallakury,B.,Timofeeva,O.A.,Nealon,C.,Dakic,A.,Simic,V.等人(2012b).ROCK抑制物和饲养细胞诱导上皮细胞的条件化再编程(ROCKinhibitorandfeedercellsinducetheconditionalreprogrammingofepithelialcells).AmJPathol180,599-607.

McKenzie,I.A.,Biernaskie,J.,Toma,J.G.,Midha,R.和Miller,F.D.(2006).对多受损的和脱髓鞘的神经系统，皮肤衍生的前体细胞产生髓鞘化施旺细胞(Skin-derivedprecursorsgeneratemyelinatingSchwanncellsfortheinjuredanddysmyelinatednervoussystem).JNeurosci26,6651-6660.

Menendez,L.,Yatskievych,T.A.,Antin,P.B.和Dalton,S.(2011).Wnt信号传导和Smad途径阻挡指导人多潜能干细胞分化为多能神经嵴细胞(WntsignalingandaSmadpathwayblockadedirectthedifferentiationofhumanpluripotentstemcellstomultipotentneuralcrestcells).ProcNatlAcadSciUSA108,19240-19245.

Okita,K.,Ichisaka,T.和Yamanaka,S.(2007).产生有种系能力的经诱导的多潜能干细胞(Generationofgermline-competentinducedpluripotentstemcells).Nature448,313-317.

Schoenebeck,B.,Bader,V.,Zhu,X.R.,Schmitz,B.,Lubbert,H.和Stichel,C.C.(2005).Sgk1是在神经变性疾病中的细胞存活应答(Sgk1,acellsurvivalresponseinneurodegenerativediseases).MolCellNeurosci30,249-264.

Seaberg,R.M.,Smukler,S.R.,Kieffer,T.J.,Enikolopov,G.,Asghar,Z.,Wheeler,M.B.,Korbutt,G.和vanderKooy,D.(2004).克隆鉴定来自成年小鼠胰腺的多能前体，其产生神经的和胰腺的细胞系(Clonalidentificationofmultipotentprecursorsfromadultmousepancreasthatgenerateneuralandpancreaticlineages).NatBiotechnol22,1115-1124.

Shah,N.M.,Groves,A.K.和Anderson,D.J.(1996).备选的神经嵴细胞命运被TGFβ超家族成员有益地促进(AlternativeneuralcrestcellfatesareinstructivelypromotedbyTGFbetasuperfamilymembers).Cell85,331-343.

Stuhlmiller,T.J.和Garcia-Castro,M.I.(2012).指导神经嵴诱导的信号传导途径的当前观点(Currentperspectivesofthesignalingpathwaysdirectingneuralcrestinduction).CellMolLifeSci69,3715-3737.

Takahashi,K.和Yamanaka,S.(2006).从小鼠胚胎和成人成纤维细胞通过定义的因素诱导多潜能干细胞(Inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors).Cell126,663-676.

Terunuma,A.,Limgala,R.P.,Park,C.J.,Choudhary,I.和Vogel,J.C.(2010).使用Rho相关蛋白激酶抑制物Y-27632，从人组织样本有效获得上皮干细胞(EfficientprocurementofepithelialstemcellsfromhumantissuespecimensusingaRho-associatedproteinkinaseinhibitorY-27632).TissueEngPartA16,1363-1368.

Toma,J.G.,Akhavan,M.,Fernandes,K.J.,Barnabe-Heider,F.,Sadikot,A.,Kaplan,D.R.和Miller,F.D.(2001).从哺乳动物皮肤的真皮中分离多能成人干细胞(Isolationofmultipotentadultstemcellsfromthedermisofmammalianskin).NatCellBiol3,778-784.

Toma,J.G.,McKenzie,I.A.,Bagli,D.和Miller,F.D.(2005).来自人皮肤的多能皮肤衍生的前体细胞的分离和表征(Isolationandcharacterizationofmultipotentskin-derivedprecursorsfromhumanskin).StemCells23,727-737.

Tropepe,V.(2000).成人哺乳动物眼中的视网膜干细胞(RetinalStemCellsintheAdultMammalianEye).Science287,2032-2036.

Vazquez-Martin,A.,Vellon,L.,Quiros,P.M.,Cufi,S.,RuizdeGalarreta,E.,Oliveras-Ferraros,C.,Martin,A.G.,Martin-Castillo,B.,Lopez-Otin,C.和Menendez,J.A.(2012).AMP活化的蛋白激酶(AMPK)的活化提供了将体细胞再编程为干细胞的代谢屏障(ActivationofAMP-activatedproteinkinase(AMPK)providesametabolicbarriertoreprogrammingsomaticcellsintostemcells).CellCycle11,974-989.

Vierbuchen,T.和Wernig,M.(2011).定向谱系转化：非天然的但是有用的？(Directlineageconversions:unnaturalbutuseful？)NatBiotechnol29,892-907.

Watanabe,K.,Ueno,M.,Kamiya,D.,Nishiyama,A.,Matsumura,M.,Wataya,T.,Takahashi,J.B.,Nishikawa,S.,Muguruma,K.和Sasai,Y.(2007).ROCK抑制物允许分离的人胚胎干细胞的存活(AROCKinhibitorpermitssurvivalofdissociatedhumanembryonicstemcells).NatBiotechnol25,681-686.

Yu,J.,Chau,K.F.,Vodyanik,M.A.,Jiang,J.和Jiang,Y.(2011).使用小分子的无饲养细胞的有效游离再编程(Efficientfeeder-freeepisomalreprogrammingwithsmallmolecules).PLoSOne6,e17557.

Claims (23)

1.从体细胞产生神经嵴细胞的方法，包括：

a)在补充有丙戊酸的培养基中培养体细胞，

b)在补充有N-{(3R,4R)-4-[4-(2-氟-6-羟基-3-甲氧基-苯甲酰基)-苯甲酰氨基]-吖庚烷-3-基}-4-羟基-3,5-二甲基-苯甲酰胺的无血清培养基中培养步骤(a)中获得的细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中方法不包括通过引入基因遗传修饰体细胞或步骤(a)中获得的细胞。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤b)包括以悬浮培养法培养细胞。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中步骤b)的无血清培养基补充有骨形态发生蛋白(BMP)的抑制物。

5.根据权利要求4所述的方法，其中BMP的抑制物是头蛋白。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中步骤b)的无血清培养基补充有转化生长因子β(TGFβ)的小分子抑制物。

7.根据权利要求6所述的方法，其中TGFβ的小分子抑制物是SB431542。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中步骤b)的无血清培养基补充有糖原合酶激酶3(GSK3β)的小分子抑制物。

9.根据权利要求8所述的方法，其中GSK3β的抑制物是3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中步骤a)包括将细胞培养2天。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中步骤b)包括将细胞培养7天。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中体细胞是成纤维细胞。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中体细胞是人细胞。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中体细胞是从患有神经疾病的受试者获得的。

15.神经嵴细胞，其是通过前述权利要求中任一项所述的方法获得的。

16.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，还包括

c)在适于神经嵴细胞分化成分化细胞的条件下温育步骤b)的产物，所述的分化细胞选自施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞。

17.施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞，其是通过权利要求16所述的方法获得的。

18.根据权利要求15所述的神经嵴细胞或根据权利要求17所述的分化的施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞的生物样本库。

19.根据权利要求15或17所述的细胞的用途或根据权利要求18所述的生物样本库的用途，用作神经疾病的体外模型。

20.治疗性组合物，其包含根据权利要求15或17所述的细胞或根据权利要求18所述的生物样本库。

21.N-{(3R,4R)-4-[4-(2-氟-6-羟基-3-甲氧基-苯甲酰基)-苯甲酰氨基]-吖庚烷-3-基}-4-羟基-3,5-二甲基-苯甲酰胺的用途，用在从体细胞产生神经嵴细胞的方法中。

22.3-(3-氨基-苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮的用途，用在从体细胞产生神经嵴细胞的方法中。

23.基本上如本文所述的方法和用途。