JP2023011944A - ヒト人工多能性幹細胞からの皮質ニューロンの分化 - Google Patents
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Abstract
【課題】ヒト人工多能性幹細胞からの皮質ニューロンの分化の提供。【解決手段】本開示の主題は、皮質ニューロンへのヒト幹細胞の分化を誘導するin vitro方法、およびこのような方法によって発生した皮質ニューロンを提供する。本開示の主題はまた、神経変性CNS障害を処置するための、このような皮質ニューロンの使用を提供する。この方法は、幹細胞集団を、有効濃度の形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤などを含む阻害剤に曝露するステップを含み得る。【選択図】なし
Description
関連出願への相互参照
本出願は、2016年1月27日に出願された米国仮出願番号第62/287,821号、および2017年1月23日に出願された米国仮出願番号第62/449,488号に基づく優先権を主張しており、これら仮出願の各々の内容は、それらの全体が本明細書中に参考として援用され、そしてそれらの各々に基づく優先権が主張される。
本出願は、2016年1月27日に出願された米国仮出願番号第62/287,821号、および2017年1月23日に出願された米国仮出願番号第62/449,488号に基づく優先権を主張しており、これら仮出願の各々の内容は、それらの全体が本明細書中に参考として援用され、そしてそれらの各々に基づく優先権が主張される。
補助金情報
本発明は、国立衛生研究所によって授与された補助金番号R01NS072381およびNS084334の下の政府支援でなされた。政府は本発明において特定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所によって授与された補助金番号R01NS072381およびNS084334の下の政府支援でなされた。政府は本発明において特定の権利を有する。
1.緒言
本開示の主題は、ヒト幹細胞から誘導された皮質ニューロンおよびそれらの前駆体、ならびに神経障害の細胞ベースの処置におけるそれらの使用に関する。
本開示の主題は、ヒト幹細胞から誘導された皮質ニューロンおよびそれらの前駆体、ならびに神経障害の細胞ベースの処置におけるそれらの使用に関する。
2.発明の背景
過去数年にわたって、ヒト多能性幹細胞(hPSC)を初期神経系統に変換するための方法が開発されてきた。特に効率的な戦略は、分化11日目以内にヒト胚幹細胞(hESC)またはヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)からPAX6+中枢神経系(CNS)神経前駆体への分化を誘発するために、SMADシグナル伝達を阻害する小分子(例えば、二重SMAD阻害)を使用することである1。神経サブタイプの指定は、WNTシグナル伝達などのさらなる小分子標的化経路を使用して、さらに調節され得る。二重SMAD阻害条件下でWNTシグナル伝達を活性化する化合物に時限的に曝露すると、SOX10+神経堤系統が誘導される。それとは対照的に、WNTシグナル伝達の阻害は、FOXG1+前脳前駆体の誘導を増強する2~4。これらの操作は、定義された神経前駆体細胞集団を効率的に特定するが、機能的ニューロンへのさらなる分化は、数ヶ月まではかからないとしても数週間に及ぶ場合がある、長期にわたるプロセスになっている。ニューロンの運命獲得を加速するための試みでは、線維芽細胞成長因子(FGF)シグナル伝達の強力な阻害剤であるSU54025、およびノッチシグナル伝達をブロックするγ-セクレターゼ阻害剤であるDAPT6の、2種のさらなる小分子の使用が説明された。これらの2種の阻害剤(SD)を、二重SMAD阻害およびWNT活性化と組み合わせて適用すると、標準二重SMAD阻害条件下で神経前駆体細胞を誘導するのに必要な期間1と同じ期間である分化11日目までに、75%の有糸分裂後ニューロンが生じる7。しかし、急速に誘導されたニューロンにおけるBRN3AおよびISL1の同時発現により、これらは、PAX6由来のCNSニューロンではなく、末梢性感覚と定義付けられた7。したがって、感覚運命指定中にニューロンの運命獲得を加速するための戦略が、CNS運命に適応され得るかどうかは、まだ不明である。PAX6由来の皮質ニューロンは、ヒト発生および神経変性CNS障害の分野に関連する。したがって当技術分野では、皮質ニューロンを急速に誘導するための方法および組成物が必要である。
過去数年にわたって、ヒト多能性幹細胞(hPSC)を初期神経系統に変換するための方法が開発されてきた。特に効率的な戦略は、分化11日目以内にヒト胚幹細胞(hESC)またはヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)からPAX6+中枢神経系(CNS)神経前駆体への分化を誘発するために、SMADシグナル伝達を阻害する小分子(例えば、二重SMAD阻害)を使用することである1。神経サブタイプの指定は、WNTシグナル伝達などのさらなる小分子標的化経路を使用して、さらに調節され得る。二重SMAD阻害条件下でWNTシグナル伝達を活性化する化合物に時限的に曝露すると、SOX10+神経堤系統が誘導される。それとは対照的に、WNTシグナル伝達の阻害は、FOXG1+前脳前駆体の誘導を増強する2~4。これらの操作は、定義された神経前駆体細胞集団を効率的に特定するが、機能的ニューロンへのさらなる分化は、数ヶ月まではかからないとしても数週間に及ぶ場合がある、長期にわたるプロセスになっている。ニューロンの運命獲得を加速するための試みでは、線維芽細胞成長因子(FGF)シグナル伝達の強力な阻害剤であるSU54025、およびノッチシグナル伝達をブロックするγ-セクレターゼ阻害剤であるDAPT6の、2種のさらなる小分子の使用が説明された。これらの2種の阻害剤(SD)を、二重SMAD阻害およびWNT活性化と組み合わせて適用すると、標準二重SMAD阻害条件下で神経前駆体細胞を誘導するのに必要な期間1と同じ期間である分化11日目までに、75%の有糸分裂後ニューロンが生じる7。しかし、急速に誘導されたニューロンにおけるBRN3AおよびISL1の同時発現により、これらは、PAX6由来のCNSニューロンではなく、末梢性感覚と定義付けられた7。したがって、感覚運命指定中にニューロンの運命獲得を加速するための戦略が、CNS運命に適応され得るかどうかは、まだ不明である。PAX6由来の皮質ニューロンは、ヒト発生および神経変性CNS障害の分野に関連する。したがって当技術分野では、皮質ニューロンを急速に誘導するための方法および組成物が必要である。
3.発明の概要
本開示の主題は、例えばin vitro分化によって幹細胞から誘導された、皮質ニューロンおよびそれらの前駆体、例えばその近接前駆体に関する。
本開示の主題は、例えばin vitro分化によって幹細胞から誘導された、皮質ニューロンおよびそれらの前駆体、例えばその近接前駆体に関する。
本発明は、MAPK/ERKキナーゼの阻害が、(i)形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(ii)骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(iii)Wntシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(iv)FGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、および(v)ノッチシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と接触させた幹細胞からの皮質ニューロンの分化を加速するという発見に少なくとも部分的に基づく。
ある特定の実施形態では、皮質ニューロン(およびその近接前駆体)へのヒト幹細胞の分化を誘導するためのin vitro方法は、ヒト幹細胞集団を、(i)有効量の形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(ii)有効量の骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤、および(iii)有効量のウィングレス(Wnt)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤と接触させるステップを含み、細胞は、有効量の阻害剤と、少なくとも4日間、少なくとも5日間、少なくとも6日間、少なくとも7日間、少なくとも8日間、少なくとも9日間、少なくとも10日間、または4日間まで、5日間まで、6日間まで、7日間まで、8日間まで、9日間までもしくは10日間まで接触させる。
ある特定の実施形態では、この方法はさらに、細胞を、(iv)有効量のMAPK/ERKキナーゼシグナル伝達(MEKとしても公知)の1種または複数の阻害剤、(v)有効量のFGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、および(vi)有効量のノッチシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、細胞は、(iv)、(v)および/または(vi)と、少なくとも4日間、少なくとも5日間、少なくとも6日間、少なくとも7日間、少なくとも8日間、少なくとも9日間、少なくとも10日間、少なくとも11日間、少なくとも12日間、少なくとも13日間、少なくとも14日間、または少なくとも4日間まで、5日間まで、6日間まで、7日間まで、8日間まで、9日間まで、10日間まで、11日間まで、12日間まで、13日間までもしくは14日間まで接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、細胞を有効量のTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と最初に接触させた後、少なくとも2日目(または少なくとも48時間目)に、有効量の(iv)、(v)および/または(vi)と最初に接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞は、細胞を有効量の(i)、(ii)および(iii)阻害剤と最初に接触させた後、約1日目、約2日目、約3日目、約4日目、約5日目、または約6日目に、有効量の(iv)、(v)および/または(vi)阻害剤と最初に接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、細胞を有効量の(i)、(ii)および(iii)阻害剤と最初に接触させた後、約24時間目、約48時間目、約72時間目、約96時間目、約120時間目、または約144時間目に、有効量の(iv)、(v)および/または(vi)阻害剤と最初に接触させる。
ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、有効量の阻害剤(i)~(iii)と、少なくとも約2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間または10日間接触させ、有効量の阻害剤(iv)~(vi)と、少なくとも約2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間または10日間接触させ、次に、有効量のノッチシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、有効量のFGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、有効量のMAPK/ERKシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、および/または有効量のWntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子と、少なくとも約2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間または10日間さらに接触させる。
ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、阻害剤(i)~(iii)と、少なくとも約2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間または10日間接触させ、有効量の阻害剤(iv)~(vi)と、少なくとも約2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間または10日間接触させ、次に、ノッチシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と、少なくとも約2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間または10日間さらに接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞は、細胞が検出可能なレベルのPAX6を発現するようになる期間にわたって、有効濃度の(i)~(vi)と接触させる。ある特定の実施形態では、前記期間は、細胞を有効濃度の阻害剤(i)、すなわち、TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と最初に接触させた後、約6日間である。
ある特定の実施形態では、細胞は、細胞が検出可能なレベルのTUJ1を発現するようになる期間にわたって、有効濃度の(i)~(vi)と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、細胞の少なくとも30%が、検出可能なレベルのTUJ1を発現するようになる期間にわたって、有効濃度の(i)~(vi)と接触させる。ある特定の実施形態では、前記期間は、細胞を有効濃度の阻害剤(i)、すなわち、TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と最初に接触させた後、約13日間である。ある特定の実施形態では、細胞はさらに、TBR1および/またはTLE4を同時発現する。
ある特定の実施形態では、細胞は、細胞が検出可能なレベルのTUJ1、ならびにTBR1および/またはTLE4の一方または両方を発現するようになる期間にわたって、有効濃度の(i)~(vi)と接触させる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って接触させた細胞は、検出可能なレベルのTUJ1を発現し、細胞の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%またはそれよりも多くは、検出可能なレベルのTBR1、TLE4、またはそれらの組合せも発現する。
ある特定の実施形態では、細胞は、細胞が検出可能なレベルの皮質ニューロンマーカーを発現するようになる期間にわたって、有効濃度の(i)~(vi)と接触させる。ある特定の実施形態では、皮質ニューロンマーカーは、TBR1、TLE4、DCX、REELIN、CTIP2、SATB2、FOXP2、RGS4、CUX2、BLBPおよびそれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、細胞は、有効濃度の阻害剤(i)、すなわち、TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と最初に接触させた後、少なくとも4日後、5日後、6日後、7日後、8日後、9日後、10日後、11日後、12日後、13日後、14日後、15日後、20日後、25日後、30日後、33日後またはより後に、検出可能なレベルの皮質ニューロンマーカーを発現する。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って調製された細胞は、有効濃度の(i)、すなわち、形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と接触させた後、少なくとも16日目に、分化した皮質ニューロンの電気生理学的活性を示す。
ある特定の実施形態では、皮質ニューロンおよびそれらの前駆体へのヒト幹細胞の分化を誘導するためのin vitro方法は、ヒト幹細胞集団を、有効濃度の(i)形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(ii)骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(iii)Wntシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(iv)MAPK/ERKキナーゼシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(v)FGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、および(vi)ノッチシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、細胞は、細胞を(i)、(ii)および(iii)と接触させた後、少なくとも2日目または少なくとも3日目に、(iv)、(v)および(vi)と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、有効濃度の(i)、すなわち、TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と最初に接触させた後、少なくとも4日間~20日間の間、または少なくとも6日間~16日間の間、少なくとも約8日間~14日間の間、または少なくとも約10日間~12日間の間、培養する。
ある特定の実施形態では、この方法は、(a)ヒト多能性幹細胞を、有効濃度の(i)形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(ii)骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(iii)Wntシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と最初に接触させるステップと、(b)前記細胞を、有効濃度の(i)形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(ii)骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(iii)Wntシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と共に、少なくとも約6日間または7日間培養するステップと、(c)前記細胞を、(a)の後少なくとも約2日目または3日目に、有効濃度の(iv)MAPK/ERKキナーゼシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(v)FGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、および(vi)ノッチシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と最初に接触させるステップと、(d)前記細胞を、少なくとも約10日間もしくは11日間、または前記細胞の少なくとも20%がTUJ1を発現するまで、有効濃度の(iv)MAPK/ERKキナーゼシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(v)FGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、および(vi)ノッチシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と共に培養するステップとを含む。
ある特定の実施形態では、この方法は、前記分化細胞を皮質ニューロン集団に成熟させるのに好都合な条件に、前記分化細胞集団を晒すステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、成熟させるのに好都合な前記条件は、適切な細胞培養培地中で前記分化細胞集団を培養するステップを含む。ある特定の実施形態では、成熟させるのに好都合な前記条件は、前記分化細胞集団を、皮質ニューロンへの前記前駆体の成熟を増強する1種または複数の分子と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、成熟を増強する前記1種または複数の分子は、脳由来神経栄養因子(BDNF)、cAMP、およびアスコルビン酸シグナル伝達の活性化因子からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、細胞は、有効濃度の(i)、すなわち、TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と最初に接触させた後、少なくとも5日目、6日目、7日目、8日目、9日目、10日目もしくは12日目に、または5日目まで、6日目まで、7日目まで、8日目まで、9日目まで、10日目までもしくは12日目まで、前記成熟因子と接触させる。
本開示はまた、本明細書に記載される方法に従って調製された、1種または複数のニューロンマーカー、例えば、皮質ニューロンマーカーを発現するin vitro分化細胞集団またはその前駆体細胞集団を提供する。ある特定の実施形態では、細胞集団の少なくとも約70%(例えば、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも約99%、または少なくとも約99.5%)は、1種または複数の皮質ニューロンマーカーを発現し、細胞集団の約15%未満(例えば、約10%未満、約5%未満、約4%未満、約3%未満、約2%未満、約1%未満、約0.5%未満、または約0.1%未満)は、幹細胞マーカー(例えば、OCT4、NANOG、SOX2、LIN28、SSEA4および/またはSSEA3)、グリア細胞マーカー(例えば、GFAP、AQP4、および/またはOLIG2)、網膜細胞マーカー(例えば、CHX10)、末梢性感覚ニューロン(例えば、BRN3A、および/またはISL1)、神経堤前駆体(例えば、SOX10)、または頭蓋プラコード前駆体(例えば、SIX1)からなる群から選択される1種または複数のマーカーを発現する。
ある特定の実施形態では、分化細胞集団は、ヒト幹細胞集団から誘導される。本開示の主題はさらに、このような分化細胞集団を含む組成物を提供する。
さらに、本開示の主題は、幹細胞の分化を誘導するためのキットを提供する。ある特定の実施形態では、キットは、以下:(a)形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(b)BMPシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(c)Wntシグナル伝達の1種または複数の阻害剤(d)FGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(e)ノッチシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(f)MAPK/ERKキナーゼシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、および(g)1種または複数のニューロンマーカー、例えば、皮質ニューロンマーカーを発現する分化細胞集団またはその前駆体細胞集団への幹細胞の分化を誘導するための指示書の1つまたは複数を含む。
本開示の主題はまた、1種または複数のニューロンマーカー、例えば、皮質ニューロンマーカーを発現する分化細胞集団またはその前駆体細胞集団を含むキットを提供し、細胞は、本明細書に記載される方法に従って調製される。
ある特定の実施形態では、前記ヒト幹細胞は、ヒト胚幹細胞、ヒト人工多能性幹細胞、ヒト単為生殖幹細胞、始原胚細胞様の多能性幹細胞、胚盤葉上層幹細胞、およびFクラス多能性幹細胞からなる群から選択される。
本開示の主題はさらに、対象の神経変性障害を処置する方法を提供する。ある特定の実施形態では、この方法は、本明細書に記載される有効量の分化細胞集団を、神経変性障害に罹患している対象に投与するステップを含む。
本開示の主題はさらに、対象の神経変性障害を処置するための、本明細書に記載される分化細胞集団を提供する。
本開示の主題はさらに、神経変性障害を処置するための医薬の製造における、本明細書に記載される分化細胞集団の使用を提供する。
ある特定の実施形態では、神経変性障害は、パーキンソン病、アルツハイマー病、または統合失調症である。
4.図面の簡単な説明
4.図面の簡単な説明
5.詳細な説明
本開示の主題は、例えば、ヒト幹細胞を機能的皮質ニューロンにin vitroで分化させることによって、ヒト幹細胞から誘導される皮質ニューロンを調製する方法、およびこのような方法によって生成された細胞に関する。CNS神経変性障害を処置するためのこのような細胞の使用も提供される。
本開示の主題は、例えば、ヒト幹細胞を機能的皮質ニューロンにin vitroで分化させることによって、ヒト幹細胞から誘導される皮質ニューロンを調製する方法、およびこのような方法によって生成された細胞に関する。CNS神経変性障害を処置するためのこのような細胞の使用も提供される。
本開示を、制限することなく明らかにする目的で、詳細な説明を、以下の小区分に分ける。
5.1 定義
5.2 幹細胞を分化させる方法
5.3 分化細胞集団を含む組成物
5.4 CNS神経変性障害を予防および/または処置する方法
5.5 キット
5.1 定義
5.2 幹細胞を分化させる方法
5.3 分化細胞集団を含む組成物
5.4 CNS神経変性障害を予防および/または処置する方法
5.5 キット
5.1 定義
本明細書において使用される用語は、一般に、それぞれの用語が使用される本発明の文脈および特定の文脈において、当技術分野におけるそれらの通常の意味を有する。本発明の組成物および方法、ならびにそれらをどのように作成し使用するかについての説明により、実務者に追加の指針を提供するためのある特定の用語を、以下または本明細書の他所で論じる。
本明細書において使用される用語は、一般に、それぞれの用語が使用される本発明の文脈および特定の文脈において、当技術分野におけるそれらの通常の意味を有する。本発明の組成物および方法、ならびにそれらをどのように作成し使用するかについての説明により、実務者に追加の指針を提供するためのある特定の用語を、以下または本明細書の他所で論じる。
「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差範囲内であることを意味し、この範囲は、部分的に、値がどのように測定または決定されるか、すなわち測定系の限界に応じて決まる。例えば、「約」は、当技術分野の実施に従って、標準偏差の3倍以内または3倍超を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の20%まで、例えば10%まで、5%まで、または1%までの範囲を意味し得る。あるいは、特に生物系またはプロセスに関して、この用語は、値のある指標以内、例えば5倍以内または2倍以内であることを意味し得る。
本明細書で使用される、「シグナル伝達タンパク質」に関する「シグナル伝達」という用語は、膜受容体タンパク質とのリガンドの結合または他の刺激によって活性化されるか、またはその他の方式で影響を受けるタンパク質を指す。シグナル伝達タンパク質の例として、SMAD、ベータ-カテニン(catnin)を含むウィングレス(Wnt)複合体タンパク質、NOTCH、形質転換成長因子ベータ(TGFβ)、アクチビン、ノーダルおよびグリコーゲン合成酵素キナーゼ3β(GSK3P)タンパク質、FGFおよびMAPK/ERK(MEK)タンパク質が挙げられるが、それらに限定されない。多くの細胞表面受容体または内部受容体タンパク質については、リガンドと受容体の相互反応は、細胞の応答に直結しない。リガンドによって活性化された受容体は、最初に、細胞内の他のタンパク質と相互反応することができ、その後、細胞の挙動に対するリガンドの最終的な生理的効果が生じる。しばしば、相互反応する一連のいくつかの細胞タンパク質の挙動が、受容体の活性化または阻害後に変わる。受容体の活性化によって誘導された一連の細胞変化の全体は、シグナル伝達機構またはシグナル伝達経路と呼ばれる。
本明細書で使用される「シグナル」という用語は、細胞の構造および機能の変化を制御する、内部および外部の因子を指す。それらは、化学的または物理的性質であり得る。
本明細書で使用される「リガンド」という用語は、受容体に結合する分子およびタンパク質、例えば、形質転換成長因子-ベータ(TFGβ)、アクチビン、ノーダル、骨形成タンパク質(BMP)等を指す。
本明細書で使用される「阻害剤」は、分子または経路のシグナル伝達機能を妨害する(例えば、低減、低下、抑制、排除、またはブロックする)、化合物または分子(例えば、小分子、ペプチド、ペプチド模倣薬、天然化合物、siRNA、アンチセンス核酸、アプタマー、または抗体)を指す。阻害剤は、命名されたタンパク質(シグナル伝達分子、命名されたシグナル伝達分子に関与する任意の分子、命名された関連分子、例えばグリコーゲン合成酵素キナーゼ3β(GSK3β))(例えば、それらに限定されるものではないが、本明細書に記載されるシグナル伝達分子を含む)の任意の活性を変化させる、任意の化合物または分子であり得る。一例として、SMADシグナル伝達の阻害剤は、例えば、SMADと直接接触し、SMAD mRNAと接触し、SMADのコンフォメーション変化を引き起こし、SMADタンパク質レベルを低下させ、またはシグナル伝達パートナーとのSMADとの相互反応を妨害し、SMAD標的遺伝子の発現に影響を及ぼすことによって機能し得る。また阻害剤には、上流シグナル伝達分子(例えば、細胞外ドメイン内)を遮断することによってSMAD生物活性を間接的に調節する分子が含まれる。SMADシグナル伝達阻害剤分子および効果の例として、骨形成タンパク質を封鎖し、ALK受容体1、2、3および6の活性化を阻害し、したがって下流SMAD活性化を防止するノギンが挙げられる。同じく、コーディン、ケルベロス、フォリスタチンも同様に、SMADシグナル伝達の細胞外活性化因子を封鎖する。膜貫通タンパク質であるBambiも、細胞外TGFβシグナル伝達分子を封鎖する疑似受容体として作用する。アクチビン、ノーダル、TGFβ、およびBMPをブロックする抗体は、SMADシグナル伝達等の細胞外活性化因子を中和するための使用を企図される。先の例は、SMADシグナル伝達阻害に関するが、他のシグナル伝達分子を阻害するために、同様または類似の機構を使用することができる。阻害剤の例として、SMADシグナル伝達阻害のためのLDN193189(LDN)およびSB431542(SB)(LSB)、Wnt阻害のためのXAV939(X)、FGFシグナル伝達阻害のためのSU5402(S)、ノッチシグナル伝達阻害のためのDAPT(D)、およびMAPK/ERK(MEK)シグナル伝達阻害のためのPD0325901(P)が挙げられるが、それらに限定されない。
阻害剤は、命名された分子の阻害を引き起こす命名されたシグナル伝達分子から上流にある分子に結合し、影響を及ぼすことによって誘導される阻害に加えて、競合的阻害(別の公知の結合化合物の結合を排除または低減するような方式で、活性部位に結合する)およびアロステリック阻害(タンパク質の活性部位との化合物の結合を妨害するような方式で、タンパク質コンフォメーションを変化させる方式でタンパク質に結合する)に関して説明される。阻害剤は、実際にシグナル伝達標的と接触することによって、シグナル伝達標的またはシグナル伝達標的経路を阻害する「直接的阻害剤」であり得る。
本明細書で使用される「活性化因子」は、分子または経路のシグナル伝達機能、例えば、Wntシグナル伝達の活性化を増大し、誘導し、刺激し、活性化し、容易にし、または増強する化合物を指す。
本明細書で使用される「誘導体」という用語は、類似のコア構造を有する化合物を指す。
本明細書で使用される「細胞の集団」または「細胞集団」という用語は、少なくとも2個の細胞の群を指す。非限定的な例では、細胞集団は、少なくとも約10個、少なくとも約100個、少なくとも約200個、少なくとも約300個、少なくとも約400個、少なくとも約500個、少なくとも約600個、少なくとも約700個、少なくとも約800個、少なくとも約900個、少なくとも約1000個の細胞、少なくとも約5,000個の細胞または少なくとも約10,000個の細胞または少なくとも約100,000個の細胞または少なくとも約1,000,000個の細胞を含み得る。集団は、1種の細胞型を含む純粋な集団、例えば皮質ニューロン前駆体の集団、または未分化幹細胞の集団であり得る。あるいは、集団は、1種を超える細胞型、例えば混合細胞集団を含み得る。
本明細書で使用される「幹細胞」という用語は、培養で無期限に分裂し、指定された細胞を生じる能力を有する細胞を指す。ヒト幹細胞は、ヒト由来の幹細胞を指す。
本明細書で使用される「胚幹細胞」という用語は、培養による長期間にわたる分化なしに分裂することができ、3つの一次胚葉の細胞および組織に発達することが公知の、着床前段階の胚から誘導される一次(未分化)細胞を指す。ヒト胚幹細胞は、ヒト由来の胚幹細胞を指す。本明細書で使用される「ヒト胚幹細胞」または「hESC」という用語は、培養による長期間にわたる分化なしに分裂することができ、3つの一次胚葉の細胞および組織に発達することが公知の、胚盤胞段階を含む初期段階のヒト胚から誘導されるタイプの多能性幹細胞を指す。
本明細書で使用される「胚幹細胞株」という用語は、数日間、数ヶ月間から数年間まで、分化なしに増殖を可能にするin vitro条件下で培養された、胚幹細胞集団を指す。例えば、「胚幹細胞」は、培養による長期間にわたる分化なしに分裂することができ、3つの一次胚葉の細胞および組織に発達することが公知の、着床前段階の胚から誘導される一次(未分化)細胞を指すことができる。ヒト胚幹細胞は、ヒト由来の胚幹細胞を指す。本明細書で使用される「ヒト胚幹細胞」または「hESC」という用語は、培養による長期間にわたる分化なしに分裂することができ、3つの一次胚葉の細胞および組織に発達することが公知の、胚盤胞段階を含む初期段階のヒト胚から誘導されるタイプの多能性幹細胞を指す。
本明細書で使用される「多能性(pluripotent)」という用語は、内胚葉、中胚葉、お
よび外胚葉を含む、生物の3種の発達上の胚葉に発達する能力を指す。
よび外胚葉を含む、生物の3種の発達上の胚葉に発達する能力を指す。
本明細書で使用される「人工多能性幹細胞」または「iPSC」という用語は、ある特定の胚性遺伝子(例えば、OCT4、SOX2、およびKLF4導入遺伝子)が、体細胞、例えばCI 4、C72等に導入されることによって形成された、胚幹細胞に類似したタイプの多能性幹細胞を指す(例えば、参照によって本明細書に組み込まれる、TakahashiおよびYamanaka、Cell 126巻、663~676頁(2006年)を参照されたい)
。
。
本明細書で使用される「体細胞」という用語は、配偶子(卵または精子)以外の体内の任意の細胞を指し、時に「成体」細胞と呼ばれる。
本明細書で使用される「体細胞(成体)幹細胞」という用語は、自己再生(実験室中)および分化の両方について能力が制限されている、多くの臓器および分化した組織に見出される相対的に稀な未分化細胞を指す。このような細胞は、それらの分化能が異なっているが、通常は起源臓器の細胞型に限定される。
本明細書で使用される「ニューロン」という用語は、神経系の主要な機能単位である神経細胞を指す。ニューロンは、細胞体、ならびにその突起である軸索および1つまたは複数の樹状突起からなる。ニューロンは、シナプスで神経伝達物質を放出することによって、他のニューロンまたは細胞に情報を伝送する。
本明細書で使用される「増殖」という用語は、細胞数の増加を指す。
本明細書で使用される「未分化」という用語は、指定された細胞型にまだ発達していない細胞を指す。
本明細書で使用される「分化」という用語は、指定されていない胚性細胞が、心臓、肝臓または筋細胞などの指定された細胞の特質を獲得するプロセスを指す。分化は、通常は細胞表面に埋め込まれたタンパク質を伴うシグナル伝達経路を介して、細胞遺伝子と細胞外側の物理的および化学的条件との相互反応によって制御される。
本明細書で使用される「定方向性分化」という用語は、腸ニューロン前駆体などの特定の(例えば所望の)細胞型への分化を誘導するための、幹細胞の培養条件の操作を指す。
幹細胞に関して本明細書で使用される「定方向性分化」という用語は、多能性状態から、より成熟したまたは指定された細胞の運命(例えば、皮質ニューロン等)への幹細胞の移行を促進するための、小分子、成長因子タンパク質、および他の成長条件の使用を指す。
細胞に関して本明細書で使用される「分化を誘導する」という用語は、デフォルト細胞型(遺伝子型および/または表現型)から非デフォルト細胞型(遺伝子型および/または表現型)への変化を指す。したがって、「幹細胞の分化を誘導する」は、幹細胞(例えば、ヒト幹細胞)を、幹細胞とは異なる特徴、例えば遺伝子型(例えば、遺伝子分析、例えばマイクロアレイによって決定される遺伝子発現の変化)および/または表現型(例えば、タンパク質、例えばTUJI、DCX、TBR1、REELIN、およびFOXG1の発現の変化)を有する子孫細胞に分裂するように誘導することを指す。
本明細書で使用される「細胞培養」という用語は、研究または医療処置のための人工培地におけるin vitroでの細胞の成長を指す。
本明細書で使用される「培養培地」という用語は、培養容器、例えばペトリプレート、マルチウェルプレート等の細胞を被覆し、細胞に栄養を与え、細胞を補助するための栄養分を含有する液体を指す。また培養培地は、細胞内の所望の変化をもたらすために添加される成長因子を含み得る。
本明細書で使用される、細胞を化合物(例えば、1種または複数の阻害剤、活性化因子、および/または誘導因子)と「接触させる」という用語は、細胞を化合物に曝露すること、例えば化合物を、細胞に触れさせる位置に置くことを指す。接触は、任意の適切な方法を使用して遂行され得る。例えば接触は、化合物を、細胞を入れた管に添加することによって遂行され得る。また接触は、化合物を、細胞を含む培養培地に添加することによって遂行され得る。化合物のそれぞれ(例えば、阻害剤、活性化因子、および本明細書に開示される迷走神経堤パターン形成を誘導する分子)は、細胞を含む培養培地に、溶液(例えば、濃縮溶液)として添加され得る。あるいはまたはさらには、化合物(例えば、阻害剤、活性化因子、および本明細書に開示される迷走神経堤パターン形成を誘導する分子)ならびに細胞は、配合された細胞培養培地中に存在し得る。
有効量とは、所望の効果をもたらす量である。
本明細書で使用される「in vitro」という用語は、人工環境、および人工環境内で生じるプロセスまたは反応を指す。in vitro環境は、試験管および細胞培養物によって例示されるが、それらに限定されない。
本明細書で使用される「in vivo」という用語は、自然環境(例えば、動物または細胞)、および自然環境内で生じるプロセスまたは反応、例えば胚発達、細胞分化、神経管形成等を指す。
遺伝子またはタンパク質に関して本明細書で使用される「発現する」という用語は、マイクロアレイアッセイ、抗体染色アッセイなどのアッセイを使用して観察され得るmRNAまたはタンパク質を作製すること指す。
本明細書で使用される「マーカー」または「細胞マーカー」という用語は、特定の細胞または細胞型を特定する遺伝子またはタンパク質を指す。細胞のためのマーカーは、1種のマーカーに限定することができず、複数のマーカーは、マーカーの指定の群によって、ある細胞または細胞型を別の細胞または細胞型から同定することができるように、マーカーの「パターン」を指すことができる。
本明細書で使用される「から誘導された」または「から確立された」または「から分化した」という用語は、本明細書で開示される任意の細胞に関する場合、細胞系、組織中の親細胞(例えば、解離された胚、または体液)から、任意の操作、例えばそれらに限定されるものではないが、単細胞単離、in vitro培養、例えばタンパク質、化学物質、放射線、ウイルスによる感染を使用する処置および/または変異誘発、DNA配列、例えばモルフォゲン等を用いるトランスフェクション、培養した親細胞に含有されている任意の細胞の選択(例えば連続培養による)を使用して得られた(例えば、単離された、精製された等)細胞を指す。誘導された細胞は、成長因子、サイトカイン、サイトカイン処置の選択された進行、接着性、接着性の欠如、分類手順等に対する応答に関して、混合集団から選択され得る。
本明細書の「個体」または「対象」は、ヒトまたは非ヒト動物、例えば哺乳動物などの脊椎動物である。哺乳動物には、ヒト、霊長類、家畜動物、スポーツ用動物、げっ歯類およびペットが含まれるが、それらに限定されない。非ヒト動物対象の非限定的な例として、マウス、ラット、ハムスターおよびモルモットなどのげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、ならびに非ヒト霊長類、例えば類人猿およびサルが挙げられる。
本明細書で使用される「疾患」という用語は、細胞、組織または臓器の正常な機能を損なうまたは妨害する任意の状態または障害を指す。
本明細書で使用される「処置する」または「処置」という用語は、処置を受ける個体または細胞の疾患過程を変えるための臨床的な介入を指し、この処置は、予防のために、または臨床病理の過程中のいずれかに実施され得る。処置の治療効果には、疾患の発生または再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的結果の縮小、転移の予防、疾患進行速度の低下、病状の回復または緩和、および寛解または予後の改善が含まれるが、それらに限定されない。疾患または障害の進行を予防することによって、処置は、影響を受けているもしくは診断を受けた対象、または障害を有することが疑われる対象の障害に起因する悪化を予防することができ、障害の危険性がある、または障害を有すると疑われる対象の障害または障害の症候の発症を予防することもできる。
5.2 幹細胞を分化させる方法
本開示の主題は、幹細胞(例えば、ヒト幹細胞)の分化を誘導するためのin vitro方法を提供する。ヒト幹細胞の非限定的な例として、ヒト胚幹細胞(hESC)、ヒト多能性幹細胞(hPSC)、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)、ヒト単為生殖幹細胞、始原胚細胞様の多能性幹細胞、胚盤葉上層幹細胞、Fクラス多能性幹細胞、体細胞幹細胞、がん幹細胞、または系統特異的に分化することができる任意の他の細胞が挙げられる。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、ヒト胚幹細胞(hESC)である。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)である。ある特定の実施形態では、幹細胞は、非ヒト幹細胞である。非ヒト幹細胞の非限定的な例として、非ヒト霊長類幹細胞、げっ歯類幹細胞、イヌ幹細胞、ネコ幹細胞が挙げられる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、多能性幹細胞である。ある特定の実施形態では、幹細胞は、胚幹細胞である。ある特定の実施形態では、幹細胞は、人工多能性幹細胞である。
本開示の主題は、幹細胞(例えば、ヒト幹細胞)の分化を誘導するためのin vitro方法を提供する。ヒト幹細胞の非限定的な例として、ヒト胚幹細胞(hESC)、ヒト多能性幹細胞(hPSC)、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)、ヒト単為生殖幹細胞、始原胚細胞様の多能性幹細胞、胚盤葉上層幹細胞、Fクラス多能性幹細胞、体細胞幹細胞、がん幹細胞、または系統特異的に分化することができる任意の他の細胞が挙げられる。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、ヒト胚幹細胞(hESC)である。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)である。ある特定の実施形態では、幹細胞は、非ヒト幹細胞である。非ヒト幹細胞の非限定的な例として、非ヒト霊長類幹細胞、げっ歯類幹細胞、イヌ幹細胞、ネコ幹細胞が挙げられる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、多能性幹細胞である。ある特定の実施形態では、幹細胞は、胚幹細胞である。ある特定の実施形態では、幹細胞は、人工多能性幹細胞である。
本発明は、幹細胞を、皮質ニューロンまたはそれらの前駆体に分化させる方法を開示する。いかなる理論にも限定するものではないが、本発明は、幹細胞をMAPK/ERKキナーゼの阻害剤と接触させることによって、形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤、Wntシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、FGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、およびノッチシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と接触している幹細胞からの皮質ニューロンの分化を加速することを開示する。
ある特定の実施形態では、リガンドに関する「Wnt」または「ウィングレス」は、Wnt受容体、例えばFrizzledおよびLRPDerailed/RYK受容体ファミリーの受容体と相互反応することができる分泌タンパク質(例えばヒトのIntl(インテグレーション1))の群を指す。
ある特定の実施形態では、シグナル伝達経路に関する「Wnt」または「ウィングレス」という用語は、β-カテニンが媒介するまたは媒介しない、WntファミリーリガンドおよびWntファミリー受容体、例えばFrizzledおよびLRPDerailed/RYK受容体から構成されたシグナル経路を指す。ある特定の実施形態では、Wntシグナル伝達経路は、β-カテニンによる媒介、例えばWNT4/β-カテニンを含む。
ある特定の実施形態では、本開示の分化方法は、幹細胞集団を、形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と接触させ、それによってSmall Mothers Against Decapentaplegic(SMAD)シグナル伝達を阻害するステップを含む。ある特定の実施形態では、TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の阻害剤は、TGFβ、骨形成タンパク質(BMP)、ノーダル、およびアクチビンを含むリガンドを中和するか、または受容体および下流エフェクターをブロックすることによって、それらのシグナル経路をブロックする。TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の阻害剤の非限定的な例は、あらゆる目的でそれらの全体が参照によって組み込まれる、WO/2010/096496、WO/2011/149762、WO/2013/067362、WO/2014/176606、WO/2015/077648、Chambersら、Nature Biotechnology 27
巻、275~280頁(2009年)、およびChambersら、Nature biotechnology 3
0巻、715~720頁(2012年)に開示されている。ある特定の実施形態では、TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤は、SB431542、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である。「SB431542」は、CAS番号301836-41-9、分子式C22H18N4O3、および名称4-[4-(1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)-5-(2-ピリジニル)-1H-イミダゾール-2-イル]-ベンズアミドを有する分子を指す。例えば、以下の構造を参照されたい。
巻、275~280頁(2009年)、およびChambersら、Nature biotechnology 3
0巻、715~720頁(2012年)に開示されている。ある特定の実施形態では、TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤は、SB431542、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である。「SB431542」は、CAS番号301836-41-9、分子式C22H18N4O3、および名称4-[4-(1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)-5-(2-ピリジニル)-1H-イミダゾール-2-イル]-ベンズアミドを有する分子を指す。例えば、以下の構造を参照されたい。
本開示の分化方法は、さらに、幹細胞をBMPシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と接触させ、それによってSmall Mothers Against Decapentaplegic(SMAD)シグナル伝達を阻害するステップをさらに含む。BMPシグナル伝達の阻害剤の非限定的な例は、あらゆる目的でそれらの全体が参照によって組み込まれる、WO/2010/096496、WO/2011/149762、WO/2013/067362、WO/2014/176606、WO/2015/077648、Chambersら、Nature Biotechnology 27巻、275~280頁(2009年)、お
よびChambersら、Nature biotechnology 30巻、715~720頁(2012年)に
開示されている。ある特定の実施形態では、SMADシグナル伝達の1種または複数の阻害剤は、LDN193189、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である。「LDN193189」は、化学式C25H22N6の小分子DM-3189、IUPAC名4-(6-(4-(ピペラジン-1-イル)フェニル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-3-イル)キノリンを指す。LDN193189は、SMADシグナル伝達阻害剤として機能することができる。LDN193189はまた、ALK2、ALK3、およびALK6、タンパク質チロシンキナーゼ(PTK)の非常に強力な小分子阻害剤であり、I型TGFβ受容体のALK1およびALK3ファミリーのメンバーのシグナル伝達を阻害して、骨形成タンパク質(BMP)BMP2、BMP4、BMP6、BMP7、およびアクチビンサイトカインシグナルを含む複数の生物学的シグナルの伝送を阻害し、その後、Smad1、Smad5、およびSmad8のSMADリン酸化を阻害する(参照によって本明細書に組み込まれる、Yuら(2008年)Nat Med 14巻:1363~1369頁;Cunyら(2008年)Bioorg. Med. Chem. Lett.
18巻:4388~4392頁)。ある特定の実施形態では、LDN193189は、以下の構造を有する。
よびChambersら、Nature biotechnology 30巻、715~720頁(2012年)に
開示されている。ある特定の実施形態では、SMADシグナル伝達の1種または複数の阻害剤は、LDN193189、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である。「LDN193189」は、化学式C25H22N6の小分子DM-3189、IUPAC名4-(6-(4-(ピペラジン-1-イル)フェニル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-3-イル)キノリンを指す。LDN193189は、SMADシグナル伝達阻害剤として機能することができる。LDN193189はまた、ALK2、ALK3、およびALK6、タンパク質チロシンキナーゼ(PTK)の非常に強力な小分子阻害剤であり、I型TGFβ受容体のALK1およびALK3ファミリーのメンバーのシグナル伝達を阻害して、骨形成タンパク質(BMP)BMP2、BMP4、BMP6、BMP7、およびアクチビンサイトカインシグナルを含む複数の生物学的シグナルの伝送を阻害し、その後、Smad1、Smad5、およびSmad8のSMADリン酸化を阻害する(参照によって本明細書に組み込まれる、Yuら(2008年)Nat Med 14巻:1363~1369頁;Cunyら(2008年)Bioorg. Med. Chem. Lett.
18巻:4388~4392頁)。ある特定の実施形態では、LDN193189は、以下の構造を有する。
本発明はさらに、幹細胞集団を皮質ニューロンまたはそれらの前駆体に分化させる方法であって、細胞を、Wntシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、例えば、それに限定されるものではないが、XAV399、タンキラーゼ阻害剤(Huangら、Nature 461
巻、614~620頁(2009年))、Dickkopf(Dkk)タンパク質、分泌Frizzled関連タンパク質(sFRP)、IWR(Chenら、Nature Chemical Biology 5巻(2号):100~107頁(2009年);Kulakら、Molecular and Cellular Biology、4巻;35号(14):2425~35頁(2015年))、2,4
-ジアミノ-キナゾリン(Chenら、Bioorganic & medicinal chemistry letters、1巻;19号(17):4980~3頁(2009年))、IWP(Chenら、Nat Chem Biol. 2009年2月;5巻(2号):100~7頁)、LGK974、C59(Proffittら、Cancer Res. 2013年1月15日;73巻(2号):502~7頁)、Ant1.4Br/Ant1.4Cl(Morrellら、PLoS One. 2008年8月13日;3巻(8号):e2930頁)、ニクロサミド(Chenら、Biochemistry. 2009年11月3
日;48巻(43号):10267~74頁)、アピクラレンおよびバフィロマイシン(Cruciatら、Science. 2010年1月22日;327巻(5964号):459~63
頁)、G007-LKおよびG244-LM(Lauら、Cancer Res. 2013年5月1
5日;73巻(10号):3132~44頁)、ピルビニウム(Thorneら、Nat Chem Biol. 2010年11月;6巻(11号):829~36頁)、NSC668036(Shanら、Biochemistry. 2005年11月29日;44巻(47号):15495~50
3頁)、ケルセチン(Parkら、Biochem Biophys Res Commun. 2005年3月4日;328巻(1号):227~34頁)、ICG-001(Emamiら、Proc Natl Acad Sci U S A. 2004年8月24日;101巻(34号):12682~7頁)、PKF115-584(Lepourceletら、Cancer Cell. 2004年1月;5巻(1号):91~102頁)、BC2059(Fiskusら、Leukemia. 2015年1月;29巻(6号
):1267~78頁)、Shizokaol D(Tangら、PLoS One. 2016年3月24日;11巻(3号):e0152012頁)、およびそれらの誘導体と接触させる方法を提供する。
巻、614~620頁(2009年))、Dickkopf(Dkk)タンパク質、分泌Frizzled関連タンパク質(sFRP)、IWR(Chenら、Nature Chemical Biology 5巻(2号):100~107頁(2009年);Kulakら、Molecular and Cellular Biology、4巻;35号(14):2425~35頁(2015年))、2,4
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):1267~78頁)、Shizokaol D(Tangら、PLoS One. 2016年3月24日;11巻(3号):e0152012頁)、およびそれらの誘導体と接触させる方法を提供する。
ある特定の実施形態では、XAV399は、化学式C14H11F3N2OSを有する、3,5,7,8-テトラヒドロ-2-[4-(トリフルオロメチル)フェニル]-4H-チオピラノ[4,3-d]ピリミジン-4-オンである。ある特定の実施形態では、XAV399は、以下の構造を有する。
ある特定の実施形態では、幹細胞集団は、有効量のTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、有効量のBMPシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、および有効量のWntシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と接触させ、細胞は、阻害剤と、少なくとも約4日間、少なくとも約5日間、少なくとも約6日間、少なくとも約7日間、少なくとも約8日間、少なくとも約9日間、少なくとも約10日間、少なくとも約11日間、少なくとも約12日間、少なくとも約13日間、少なくとも約14日間、少なくとも約15日間、少なくとも約16日間、少なくとも約17日間、少なくとも約18日間、少なくとも約19日間、少なくとも約20日間またはそれよりも長期間接触させ、皮質ニューロンまたはそれらの前駆体の1種または複数のマーカーを発現する細胞集団を生成するのに有効な濃度の前記化合物と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞は、有効量の阻害剤と、約4日間まで、約5日間まで、約6日間まで、約7日間まで、約8日間まで、約9日間まで、約10日間まで、約11日間まで、約12日間まで、約13日間まで、約14日間まで、約15日間まで、約16日間まで、約17日間まで、約18日間まで、約19日間まで、約20日間またはそれよりも長期間接触させ、皮質ニューロンまたはそれらの前駆体の1種または複数のマーカーを発現する細胞集団を生成するのに有効な濃度の前記化合物と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞は、有効量の阻害剤と、約4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、15日間、16日間、17日間、18日間、19日間、20日間またはそれよりも長期間接触させ、皮質ニューロンまたはそれらの前駆体の1種または複数のマーカーを発現する細胞集団を生成するのに有効な濃度の前記化合物と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞をTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と接触させる日は、0日目に相当し、細胞を、阻害剤と、0日目~6日目の間、または0日目~7日目の間にわたって接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞は、約1~20μMの間、約2~18μMの間、約4~16μMの間、約6~14μMの間、約8~12μMの間、または約10μMの濃度の形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞は、約1~18μMの間、約1~16μMの間、約1~14μMの間、約1~12μMの間、約1~10μMの間、約1~8μMの間、約1~6μMの間、約1~4μMの間、または約1~2μMの間の濃度の形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞は、約2~20μMの間、約4~20μMの間、約6~20μMの間、約8~20μMの間、約10~20μMの間、約12~20μMの間、約14~20μMの間、約16~20μMの間、または約18~20μMの間の濃度の形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞は、約10~500nMの間、約25~475nMの間、約50~450nMの間、約100~400nMの間、約150~350nMの間、約200~300nMの間、または約250nM、または約100nM、または約50nMの濃度のBMPシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞は、約10~475nMの間、約10~450nMの間、約10~400nMの間、約10~350nMの間、約10~300nMの間、約10~250nMの間、約10~200nMの間、約10~150nMの間、約10~100nMの間、または約10~50nMの間の濃度のBMPシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞は、約25~500nMの間、約50~500nMの間、約100~500nMの間、約150~500nMの間、約200~500nMの間、約250~500nMの間、約300~500nMの間、約350~500nMの間、約400~500nMの間、または約450~500nMの間の濃度のBMPシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞は、約0.1~10μMの間、約0.5~8μMの間、約1~6μMの間、約2~5.5μMの間、または約5μM、または約2μM、または約1μMの濃度のWntシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞は、約0.1~8μMの間、約0.1~6μMの間、約0.1~4μMの間、約0.1~2μMの間、約0.1~1μMの間、または約0.1~0.5μMの間の濃度のWntシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞は、約0.5~10μMの間、約1~10μMの間、約2~0μMの間、約4~10μMの間、約6~10μMの間、または約8~10μMの間の濃度のWntシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、幹細胞は、有効量のFGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、例えば、SU5402(Sunら、Journal of medicinal chemistry 42巻、5120~5130頁(1999年);Patersonら、Br. J. Haematol. 124巻、595頁(2004年);Tanakaら、Nature 435巻:172頁(2005年))、PD173074(N-[2-[[4-(ジエチルアミノ)ブチル]アミノ]-6-(3,5-ジメトキシフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン-7-イル]-N’-(1,1-ジメチルエチル)尿素;Bansalら、J.Neurosci.Res.、2003年;74巻:486頁
)、FIIN1塩酸塩(N-(3-((3-(2,6-ジクロロ-3,5-ジメトキシフェニル)-7-(4-(ジエチルアミノ)ブチルアミノ)-2-オキソ-3,4-ジヒドロピリミド[4,5-d]ピリミジン-1(2H)-イル)メチル)フェニル)アクリルアミド;Zhou、Chem.Biol.、2010年;17巻:285頁)、SU6668(5-[1,2-ジヒドロ-2-オキソ-3H-インドール-3-イリデン)メチル]-2,4-ジメチル-1H-ピロール-3-プロパン酸;Yamamotoら、Cancer Res. 2008年12月1日;68巻(23号):9754~62頁)、PD166285二塩酸塩(6-(2,6-ジクロロフェニル)-2-[[4-[2-(ジエチルアミノ)エトキシ]フェニル]アミノ]-8-メチルピリド[2,3-d]ピリミジン-7(8H)-オン二塩酸塩;Panekら、J Pharmacol Exp Ther. 1997年12月;283巻(3号):1433
~44頁)、PD161570(N-[6-(2,6-ジクロロフェニル)-2-[[4-(ジエチルアミノ)ブチル]アミノ]ピリド[2,3-d]ピリミジン-7-イル]-N’-(1,1-ジメチルエチル)尿素;Hambyら、J Med Chem. 1997年7月18日;40巻(15号):2296~303頁)、AP24534(3-(2-イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-3-イルエチニル)-4-メチル-N-[4-[(4-メチル-1-ピペラジニル)メチル]-3-(トリフルオロメチル)フェニル]-ベンズアミド;Huangら、J.Med.Chem.、2010年;53巻:4701頁)、またはそれらの誘導体とさらに接触させる。
)、FIIN1塩酸塩(N-(3-((3-(2,6-ジクロロ-3,5-ジメトキシフェニル)-7-(4-(ジエチルアミノ)ブチルアミノ)-2-オキソ-3,4-ジヒドロピリミド[4,5-d]ピリミジン-1(2H)-イル)メチル)フェニル)アクリルアミド;Zhou、Chem.Biol.、2010年;17巻:285頁)、SU6668(5-[1,2-ジヒドロ-2-オキソ-3H-インドール-3-イリデン)メチル]-2,4-ジメチル-1H-ピロール-3-プロパン酸;Yamamotoら、Cancer Res. 2008年12月1日;68巻(23号):9754~62頁)、PD166285二塩酸塩(6-(2,6-ジクロロフェニル)-2-[[4-[2-(ジエチルアミノ)エトキシ]フェニル]アミノ]-8-メチルピリド[2,3-d]ピリミジン-7(8H)-オン二塩酸塩;Panekら、J Pharmacol Exp Ther. 1997年12月;283巻(3号):1433
~44頁)、PD161570(N-[6-(2,6-ジクロロフェニル)-2-[[4-(ジエチルアミノ)ブチル]アミノ]ピリド[2,3-d]ピリミジン-7-イル]-N’-(1,1-ジメチルエチル)尿素;Hambyら、J Med Chem. 1997年7月18日;40巻(15号):2296~303頁)、AP24534(3-(2-イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-3-イルエチニル)-4-メチル-N-[4-[(4-メチル-1-ピペラジニル)メチル]-3-(トリフルオロメチル)フェニル]-ベンズアミド;Huangら、J.Med.Chem.、2010年;53巻:4701頁)、またはそれらの誘導体とさらに接触させる。
ある特定の実施形態では、用語「SU5402」は、化学式C17H16N2O3および化学名:2-[(1,2-ジヒドロ-2-オキソ-3H-インドール-3-イリデン)メチル]-4-メチル-1H-ピロール-3-プロパン酸を有する小分子を指す。ある特定の実施形態では、SU5402は、以下の構造を有する。
ある特定の実施形態では、幹細胞は、有効量のノッチシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、例えば、DAPT(Doveyら、Journal of neurochemistry 76巻、173~181頁(2001年))、Begacestat(5-クロロ-N-[(1S)-3,3,3-トリフルオロ-1-(ヒドロキシメチル)-2-(トリフルオロメチル)プロピル]-2-チオフェンスルホンアミド;Mayerら、J.Med.Chem. 51巻:7348頁(2008年))、DBZ(N-[(1S)-2-[[(7S)-6,7-ジヒドロ-5-メチル-6-オキソ-5H-ジベンゾ[b,d]アゼピン-7-イル]アミノ]-1-メチル-2-オキソエチル]-3,5-ジフルオロベンゼンアセトアミド;van Esら、Nature 435巻:959頁(2005年))、BMS299897(2-[(1R)-1-
[[(4-クロロフェニル)スルホニル](2,5-ジフルオロフェニル)アミノ]エチル-5-フルオロベンゼンブタン酸;Goldsteinら、J.Pharmacol.Exp.Ther. 323巻:102頁(2007年))、Compound W(3,5-ビス(4-ニトロフェノキシ)安息香酸;Okochiら、J.Biol.Chem. 281巻:7890頁(2006年))、Flurizan((R)-2-フルオロ-α-メチル[1,1’-ビフェニル]-4-酢酸;Eriksenら、J.Clin.Invest. 112巻:440頁(2003年))、L-685,4
58((5S)-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-6-フェニル-(4R)-ヒドロキシ-(2R)-ベンジルヘキサノイル)-L-ロイシル-L-フェニルアラニンアミド;Shearmanら、Biochemistry 39巻:8698頁(2000年))、JLK6(7-アミノ-4-クロロ-3-メトキシ-1H-2-ベンゾピラン;Petitら、Nat.Cell.Biol. 3巻:507頁(2001年))、MRK560(N-[cis-4-[(4-
クロロフェニル)スルホニル]-4-(2,5-ジフルオロフェニル)シクロヘキシル]-1,1,1-トリフルオロメタンスルホンアミド;Bestら、J.Pharm.Exp.Ther. 31
7巻:786頁(2006年))、PF3084014臭化水素酸塩((2S)-2-[[(2S)-6,8-ジフルオロ-1,2,3,4-テトラヒドロ-2-ナフタレニル]アミノ]-N-[1-[2-[(2,2-ジメチルプロピル)アミノ]-1,1-ジメチルエチル]-1H-イミダゾール-4-イル]ペンタンアミド二臭化水素酸塩;Lanzら、J.Pharmacol.Exp.Ther. 334巻:269頁(2010年))、またはそれらの誘導体
とさらに接触させる。
[[(4-クロロフェニル)スルホニル](2,5-ジフルオロフェニル)アミノ]エチル-5-フルオロベンゼンブタン酸;Goldsteinら、J.Pharmacol.Exp.Ther. 323巻:102頁(2007年))、Compound W(3,5-ビス(4-ニトロフェノキシ)安息香酸;Okochiら、J.Biol.Chem. 281巻:7890頁(2006年))、Flurizan((R)-2-フルオロ-α-メチル[1,1’-ビフェニル]-4-酢酸;Eriksenら、J.Clin.Invest. 112巻:440頁(2003年))、L-685,4
58((5S)-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-6-フェニル-(4R)-ヒドロキシ-(2R)-ベンジルヘキサノイル)-L-ロイシル-L-フェニルアラニンアミド;Shearmanら、Biochemistry 39巻:8698頁(2000年))、JLK6(7-アミノ-4-クロロ-3-メトキシ-1H-2-ベンゾピラン;Petitら、Nat.Cell.Biol. 3巻:507頁(2001年))、MRK560(N-[cis-4-[(4-
クロロフェニル)スルホニル]-4-(2,5-ジフルオロフェニル)シクロヘキシル]-1,1,1-トリフルオロメタンスルホンアミド;Bestら、J.Pharm.Exp.Ther. 31
7巻:786頁(2006年))、PF3084014臭化水素酸塩((2S)-2-[[(2S)-6,8-ジフルオロ-1,2,3,4-テトラヒドロ-2-ナフタレニル]アミノ]-N-[1-[2-[(2,2-ジメチルプロピル)アミノ]-1,1-ジメチルエチル]-1H-イミダゾール-4-イル]ペンタンアミド二臭化水素酸塩;Lanzら、J.Pharmacol.Exp.Ther. 334巻:269頁(2010年))、またはそれらの誘導体
とさらに接触させる。
ある特定の実施形態では、用語「DAPT」は、ノッチを阻害するγ-セクレターゼ阻害剤の一例を指し、この阻害剤は、ジペプチド性γ-セクレターゼに特異的な阻害剤と説明され、それ以外では、N-[(3,5-ジフルオロフェニル)アセチル]-L-アラニル-2-フェニル]グリシン-1,1-ジメチルエチルエステル;LY-374973、N--[N-(3,5-ジフルオロフェナセチル)-L-アラニル]-S-フェニルグリシンt-ブチルエステル;N--[N-(3,5-ジフルオロフェナセチル)-L-アラニル]-S-フェニルグリシンt-ブチルエステルとして公知であり、化学式C23H26F2N2O4を有する。DAPT誘導体の一例は、光で活性化可能なDAPT誘導体である、DAP-BpB(N--[N-(3,5-ジフルオロフェナセチル)-L-アラニル]-(S)-フェニルグリシン-4-(4-(8-ビオチンアミド)オクチルアミノ)ベンゾイル)ベンジル)メチルアミド)である。ある特定の実施形態では、DAPTは、以下の構造を有する。
ある特定の実施形態では、幹細胞は、有効量のMAPK/ERKキナーゼの1種または複数の阻害剤、例えば、PD198306(Ciruelaら、British Journal of Pharmacology 138巻(5号):751~6頁(2003年);Pelletierら、Arthritis & Rheumatism、48巻:1582~1593頁(2003年))、PD0325901(N-[(2R)-2,3-ジヒドロキシプロポキシ]-3,4-ジフルオロ-2-[(2-フルオロ-4-ヨードフェニル)アミノ]-ベンズアミド;Barrettら、Bioorganic & medicinal chemistry letters 18巻、6501~6504頁(2008年))、1
0Z-ヒメニアルジシン((4Z)-4-(2-アミノ-1,5-ジヒドロ-5-オキソ-4H-イミダゾール-4-イリデン)-2-ブロモ-4,5,6,7-テトラヒドロピロロ[2,3-c]アゼピン-8(1H)-オン;Bretonら、J.Pharmacol.Exp.Ther.
282巻:459頁(1997年))、PD184352(2-[(2-クロロ-4-ヨードフェニル)アミノ]-N-シクロプロピルメトキシ)-3,4-ジフルオロベンズアミド;Allenら、Semin.Oncol. 30巻:105頁(2003年))、PD198306
(N-(シクロプロピルメトキシ)-3,4,5-トリフルオロ-2-[(4-ヨード-2-メチルフェニル)アミノ]-ベンズアミド;Pelletierら、Arthrit.Rheumat. 48
巻:1582頁(2003年))、PD334581(N-[5-[3,4-ジフルオロ-2-[(2-フルオロ-4-ヨードフェニル)アミノ]フェニル]-1,3,4-オキサジアゾール-2-イル]-4-モルホリンエタンアミン;Ohrenら、Nat.Struct.Mol.Biol. 11巻:1192頁(2004年))、PD98059(2-(2-アミノ-3-
メトキシフェニル)-4H-1-ベンゾピラン-4-オン;Dudleyら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 92巻:7686頁(1995年))、SL327(α-[アミノ[(4-
アミノフェニル)チオ]メチレン]-2-(トリフルオロメチル)ベンゼンアセトニトリル;Wangら、J.Pharmacol.Exp.Ther. 304巻:172頁(2003年))、U102
4(ビス[アミノ(メチルチオ)メチレン]ブタンジニトリル;Favataら、J.Biol.Chem.
273巻:18623頁(1998年))、U0126(1,4-ジアミノ-2,3-ジシアノ-1,4-ビス[2-アミノフェニルチオ]ブタジエン;Favataら、J.Biol.Chem. 273巻:18623頁(1998年))、アルクチゲニン((3R,4R)-4-[(3,4-ジメトキシフェニル)メチル]ジヒドロ-3-[(4-ヒドロキシ-3-メトキシフェニル)メチル]-2(3H)-フラノン;Jangら、J.Neurosci.Res. 68巻
:233頁(2002年))、BIX02189((3Z)-3-[[[3-[(ジメチルアミノ)メチル]フェニル]アミノ]フェニルメチレン]-2,3-ジヒドロ-N,N-ジメチル-2-オキソ-1H-インドール-6-カルボキサミド;Tatakeら、Biochem.Biophys.Res.Comm. 377巻:120頁(2008年))、またはそれらの誘導体と接
触させる。
0Z-ヒメニアルジシン((4Z)-4-(2-アミノ-1,5-ジヒドロ-5-オキソ-4H-イミダゾール-4-イリデン)-2-ブロモ-4,5,6,7-テトラヒドロピロロ[2,3-c]アゼピン-8(1H)-オン;Bretonら、J.Pharmacol.Exp.Ther.
282巻:459頁(1997年))、PD184352(2-[(2-クロロ-4-ヨードフェニル)アミノ]-N-シクロプロピルメトキシ)-3,4-ジフルオロベンズアミド;Allenら、Semin.Oncol. 30巻:105頁(2003年))、PD198306
(N-(シクロプロピルメトキシ)-3,4,5-トリフルオロ-2-[(4-ヨード-2-メチルフェニル)アミノ]-ベンズアミド;Pelletierら、Arthrit.Rheumat. 48
巻:1582頁(2003年))、PD334581(N-[5-[3,4-ジフルオロ-2-[(2-フルオロ-4-ヨードフェニル)アミノ]フェニル]-1,3,4-オキサジアゾール-2-イル]-4-モルホリンエタンアミン;Ohrenら、Nat.Struct.Mol.Biol. 11巻:1192頁(2004年))、PD98059(2-(2-アミノ-3-
メトキシフェニル)-4H-1-ベンゾピラン-4-オン;Dudleyら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 92巻:7686頁(1995年))、SL327(α-[アミノ[(4-
アミノフェニル)チオ]メチレン]-2-(トリフルオロメチル)ベンゼンアセトニトリル;Wangら、J.Pharmacol.Exp.Ther. 304巻:172頁(2003年))、U102
4(ビス[アミノ(メチルチオ)メチレン]ブタンジニトリル;Favataら、J.Biol.Chem.
273巻:18623頁(1998年))、U0126(1,4-ジアミノ-2,3-ジシアノ-1,4-ビス[2-アミノフェニルチオ]ブタジエン;Favataら、J.Biol.Chem. 273巻:18623頁(1998年))、アルクチゲニン((3R,4R)-4-[(3,4-ジメトキシフェニル)メチル]ジヒドロ-3-[(4-ヒドロキシ-3-メトキシフェニル)メチル]-2(3H)-フラノン;Jangら、J.Neurosci.Res. 68巻
:233頁(2002年))、BIX02189((3Z)-3-[[[3-[(ジメチルアミノ)メチル]フェニル]アミノ]フェニルメチレン]-2,3-ジヒドロ-N,N-ジメチル-2-オキソ-1H-インドール-6-カルボキサミド;Tatakeら、Biochem.Biophys.Res.Comm. 377巻:120頁(2008年))、またはそれらの誘導体と接
触させる。
ある特定の実施形態では、用語「PD0325901」は、化学式C16H14F3IN2O4および化学名N-(2,3-ジヒドロキシ-プロポキシ)-3,4-ジフルオロ-2-(2-フルオロ-4-ヨード-フェニルアミノ)-ベンズアミドを有する小分子を指す。ある特定の実施形態では、PD0325901は、以下の構造を有する。
ある特定の実施形態では、有効量の阻害剤は、細胞と、少なくとも約4日間、少なくとも約5日間、少なくとも約6日間、少なくとも約7日間、少なくとも約8日間、少なくとも約9日間、少なくとも約10日間、少なくとも約11日間、少なくとも約12日間、少なくとも約13日間、少なくとも約14日間、少なくとも約15日間、少なくとも約16日間、少なくとも約17日間、少なくとも約18日間、少なくとも約19日間、少なくとも約20日間またはそれよりも長期間接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞は、有効量のFGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、ノッチシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、およびMAPK/ERKキナーゼの1種または複数の阻害剤と、4日間まで、5日間まで、6日間まで、7日間まで、8日間まで、9日間まで、10日間まで、11日間まで、12日間まで、13日間まで、14日間まで、15日間まで、16日間まで、17日間まで、18日間まで、19日間まで、20日間までまたはそれよりも長期間まで接触させる。
ある特定の実施形態では、有効量のFGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、ノッチシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、およびMAPK/ERKキナーゼの1種または複数の阻害剤は、細胞を有効量のTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、BMPシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、および/またはWntシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と最初に接触させた後、少なくとも約1日目、少なくとも約2日目、少なくとも約3日目、少なくとも約4日目または少なくとも約5日目に、ヒト幹細胞と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、細胞を有効量の(i)、(ii)および(iii)阻害剤と最初に接触させた後、約24時間目、約48時間目、約72時間目、約96時間目、約120時間目、または約144時間目に、有効量の(iv)、(v)および/または(vi)阻害剤と最初に接触させる。
ある特定の実施形態では、有効量のFGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、ノッチシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、およびMAPK/ERKキナーゼの1種または複数の阻害剤は、細胞を有効量のTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、BMPシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、および/またはWntシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と最初に接触させた後、約1日目まで、2日目まで、3日目まで、4日目までまたは5日目まで、ヒト幹細胞と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞は、有効量のFGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、ノッチシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、およびMAPK/ERKキナーゼの1種または複数の阻害剤と、約4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、15日間、16日間、17日間、18日間、19日間、20日間またはそれよりも長期間接触させ、皮質ニューロンまたはそれらの前駆体の1種または複数のマーカーを発現する細胞集団を生成するのに有効な濃度の前記化合物と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞は、約1~20μMの間、約2~18μMの間、約4~16μMの間、約6~14μMの間、約8~12μMの間、または約10μM、または約5μMの濃度のノッチシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞は、約2~20μMの間、約4~20μMの間、約6~20μMの間、約8~20μMの間、約10~20μMの間、約12~20μMの間、約14~20μMの間、約16~20μMの間、または約18~20μMの間の濃度のノッチシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞は、約1~18μMの間、約1~16μMの間、約1~14μMの間、約1~12μMの間、約1~10μMの間、約1~8μMの間、約1~6μMの間、約1~4μMの間、または約1~2μMの間の濃度のノッチシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞は、約0.5~20μMの間、約1~18μMの間、約2~16μMの間、約4~14μMの間、約6~12μMの間、約8~10μMの間、または約2μM、または約5μM、または約10μMの濃度のFGFシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞は、約0.5~18μMの間、約0.5~16μMの間、約0.5~14μMの間、約0.5~12μMの間、約0.5~10μMの間、約0.5~8μMの間、約0.5~6μMの間、約0.5~4μMの間、約0.5~2μMの間、約0.5~1μMの間の濃度のFGFシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞は、約1~20μMの間、約2~20μMの間、約4~20μMの間、約6~20μMの間、約8~20μMの間、約10~20μMの間、約12~20μMの間、約14~20μMの間、約16~20μMの間、または約18~20μMの間の濃度のFGFシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞は、約0.01~20μMの間、約0.1~18μMの間、約1~16μMの間、約2~14μMの間、約3~12μMの間、約4~10μMの間、約5~約8μMの間、または約0.4μM、または約1μM、または約8μMの濃度のMAPK/ERKキナーゼシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞は、約0.01~18μMの間、約0.01~16μMの間、約0.01~14μMの間、約0.01~12μMの間、約0.01~10μMの間、約0.01~8μMの間、約0.01~6μMの間、約0.01~4μMの間、約0.01~2μMの間、約0.01~1μMの間の濃度のMAPK/ERKキナーゼシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、細胞は、約0.1~20μMの間、約1~20μMの間、約2~20μMの間、約4~20μMの間、約6~20μMの間、約8~20μMの間、約10~20μMの間、約12~20μMの間、約14~20μMの間、約16~20μMの間、または約18~20μMの間の濃度のMAPK/ERKキナーゼシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
ある特定の実施形態では、本開示は、ヒト幹細胞を皮質ニューロンまたはそれらの前駆体に分化させる方法であって、細胞を、(i)有効量のTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の阻害剤(例えば、10μM)、(ii)有効量のBMPシグナル伝達の阻害剤(例えば、250nM)、(iii)有効量のWntシグナル伝達の阻害剤(例えば、5μM)、(iv)有効量のノッチシグナル伝達の阻害剤(例えば、10μM)、(v)有効量のFGFシグナル伝達の阻害剤(例えば、5μMまたは10μM)、および(vi)有効量のMAPK/ERKシグナル伝達の阻害剤(例えば、1μMまたは8μM)と接触させる方法を提供する。ある特定の実施形態では、(iv)、(v)および(vi)は、細胞を有効量の(i)と最初に接触させた後、少なくとも2日目に細胞と接触させる。
ある特定の実施形態では、本開示は、ヒト幹細胞を皮質ニューロンまたはそれらの前駆体に分化させる方法であって、細胞を、(i)有効量のTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の阻害剤(例えば、10μM)、(ii)有効量のBMPシグナル伝達の阻害剤(例えば、100nM)、(iii)有効量のWntシグナル伝達の阻害剤(例えば、2μM)、(iv)有効量のノッチシグナル伝達の阻害剤(例えば、5μM)、(v)有効量のFGFシグナル伝達の阻害剤(例えば、2μM)、および(vi)有効量のMAPK/ERKシグナル伝達の阻害剤(例えば、0.4μM)と接触させる方法を提供する。ある特定の実施形態では、(iv)、(v)および(vi)は、細胞を有効量の(i)と最初に接触させた後、少なくとも3日目に細胞と接触させる。
ある特定の実施形態では、阻害剤(i)、(ii)および(iii)の濃度は、細胞に少なくとも1日間、2日間、3日間、4日間、5日間もしくは6日間、または1日間まで、2日間まで、3日間まで、4日間まで、5日間までもしくは6日間まで接触させた後、約10%、20%、30%、40%、50%、60%または70%低減される。
ある特定の実施形態では、この方法は、前記細胞を皮質ニューロン集団に成熟させるのに好都合な条件に、前記分化細胞集団を晒すステップをさらに含み、細胞を、脳由来神経栄養因子(BDNF)、cAMP、およびアスコルビン酸シグナル伝達の有効濃度の1種または複数の活性化因子と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、細胞は、細胞を有効濃度の(i)、すなわち、TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と最初に接触させた後、少なくとも約5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間もしくは12日間、または約5日間まで、6日間まで、7日間まで、8日間まで、9日間まで、10日間まで、11日間までもしくは12日間まで、前記成熟化合物と接触させる。
ある特定の実施形態では、成熟させるのに好都合な条件は、適切な細胞培養培地中で細胞を培養することを含む。ある特定の実施形態では、適切な細胞培養培地は、neurobasal(NB)培地を含む。ある特定の実施形態では、適切な細胞培養培地は、L-グルタミン、およびB27(例えば、Life Technologies製)を補充したNB培地である。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って接触させた細胞は、有効量のTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の阻害剤と最初に接触させた後、少なくとも約4日目、5日目、6日目、7日目もしくは8日目もしくはより後に、または約4日目まで、5日目まで、6日目まで、7日目までもしくは8日目までもしくはより後までに、検出可能なレベルのPAX6(対合ボックス6)を発現する。
ある特定の実施形態では、細胞は、細胞が検出可能なレベルのPAX6を発現するようになる期間にわたって、有効濃度の(i)~(vi)と接触させる。ある特定の実施形態では、前記期間は、細胞を有効濃度の阻害剤(i)、すなわち、TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と最初に接触させた後、約4日間、5日間、6日間、7日間または8日間である。
ある特定の実施形態では、PAX6の発現は、細胞集団の少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%またはそれよりも多い細胞において検出可能である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って接触させた細胞は、TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の阻害剤と最初に接触させた後、約6日目に、検出可能なレベルのPAX6を発現する。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って接触させた細胞は、TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の阻害剤と最初に接触させた後、少なくとも約10日目、11日目、12日目、13日目、14日目、15日目もしくは16日目もしくはより後に、または約10日目まで、11日目まで、12日目まで、13日目まで、14日目まで、15日目までもしくは16日目までもしくはより後までに、検出可能なレベルのTUJ1(クラスIIIベータ-チューブリン)、FOXG1(フォークヘッドボックスG1)、および/またはDCX(ダブルコルチン)を発現する。
ある特定の実施形態では、細胞は、細胞が検出可能なレベルのTUJ1、FOXG1、および/またはDCXを発現するようになる期間にわたって、有効濃度の(i)~(vi)と接触させる。ある特定の実施形態では、前記期間は、細胞を有効濃度の阻害剤(i)、すなわち、TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と最初に接触させた後、約10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、15日間または16日間である。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って接触させた細胞は、有効量のTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の阻害剤と最初に接触させた後、約13日目に、検出可能なレベルのTUJ1を発現する。
ある特定の実施形態では、TUJ1の発現は、細胞集団の少なくとも約5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%またはそれよりも多い細胞において検出可能である。ある特定の実施形態では、細胞は、TBR1(T-box、brain 1)および/またはTLE4(split 4のトランスデューシン様エンハンサー)をさらに同時発現する。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って接触させた細胞は、検出可能なレベルのTUJ1を発現し、細胞の少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%またはそれよりも多くは、検出可能なレベルのTBR1、TLE4、またはそれらの組合せも発現する。
ある特定の実施形態では、細胞は、細胞が検出可能なレベルのTUJ1ならびにTBR1および/またはTLE4の一方または両方を発現するようになる期間にわたって、有効濃度の(i)~(vi)と接触させる。
ある特定の実施形態では、検出可能なレベルのPAX6、TUJ1、FOXG1、DCX、TBR1、TLE4、またはそれらの任意の組合せを発現する前記細胞は、近接皮質ニューロン前駆体である。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って接触させた細胞は、有効量のTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の阻害剤と最初に接触させた後、少なくとも約4日目、5日目、6日目、7日目、8日目、9日目、10日目、11日目、12日目、13日目、14日目、15日目、20日目、25日目、30日目、33日目に、もしくはより後に、または約4日目まで、5日目まで、6日目まで、7日目まで、8日目まで、9日目まで、10日目まで、11日目まで、12日目まで、13日目まで、14日目まで、15日目まで、20日目まで、25日目まで、30日目まで、33日目までに、もしくはより後までに、TBR1(T-box、brain 1)、TLE4(split
4のトランスデューシン様エンハンサー)、DCX(ダブルコルチン)、RELN(リーリン)、CTIP2(B細胞リンパ腫/白血病11B)、SATB2(SATBホメオボックス2)、FOXP2(フォークヘッドボックスタンパク質P2)、RGS4(Gタンパク質シグナル伝達4の調節物質)、CUX2(cut様ホメオボックス2)、BLBP(脳脂質結合タンパク質)、およびそれらの組合せからなる群から選択される検出可能なレベルの皮質ニューロンマーカーを発現する。
4のトランスデューシン様エンハンサー)、DCX(ダブルコルチン)、RELN(リーリン)、CTIP2(B細胞リンパ腫/白血病11B)、SATB2(SATBホメオボックス2)、FOXP2(フォークヘッドボックスタンパク質P2)、RGS4(Gタンパク質シグナル伝達4の調節物質)、CUX2(cut様ホメオボックス2)、BLBP(脳脂質結合タンパク質)、およびそれらの組合せからなる群から選択される検出可能なレベルの皮質ニューロンマーカーを発現する。
ある特定の実施形態では、TBR1、TLE4、DCX、REELIN、CTIP2、SATB2、FOXP2、RGS4、CUX2、および/またはBLBPの発現は、細胞集団の少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%またはそれよりも多い細胞において検出可能である。ある特定の実施形態では、細胞は、検出可能なレベルのTUJ1も発現する。
本開示の主題はまた、本明細書に記載される方法によって生成されたin vitro分化細胞集団、およびこのようなin vitro分化細胞を含む組成物を提供する。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って調製された細胞は、有効量のTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の阻害剤と接触させた後、少なくとも約6日目、7日目、8日目、9日目、10日目、11日目、12日目、13日目、14日目、15日目、16日目、17日目、18日目、19日目、20日目もしくはより後に、または約6日目まで、7日目まで、8日目まで、9日目まで、10日目まで、11日目まで、12日目まで、13日目まで、14日目まで、15日目まで、16日目まで、17日目まで、18日目まで、19日目まで、20日目までもしくはより後までに、成熟した分化した皮質ニューロンの電気生理学的特性を示す。
ある特定の実施形態では、幹細胞は、有効量の阻害剤(i)~(iii)と、少なくとも約2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間または10日間またはそれよりも長期間接触させ、有効量の阻害剤(iv)~(vi)と、少なくとも約2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間または10日間またはそれよりも長期間接触させ、次に、有効量のWntシグナル伝達の活性化因子、例えば、GSK3β阻害剤、例えばCHIR99021(WO2011/149762;およびCalderら、J Neurosci. 2015年8月19日;35巻(33号):11462~81頁)、有効量のMAPK/ERKキナーゼの阻害剤、有効量のノッチシグナル伝達の阻害剤、および/または有効量のFGFシグナル伝達の阻害剤と、少なくとも約2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間または10日間またはそれよりも長期間さらに接触させる。
ある特定の実施形態では、この方法は、(a)ヒト多能性幹細胞を、有効濃度の(i)形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(ii)骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(iii)Wntシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と最初に接触させるステップと、(b)前記細胞を、有効濃度の(i)形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(ii)骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(iii)Wntシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と共に、少なくとも約6日間または7日間培養するステップと、(c)前記細胞を、(a)の後少なくとも約2日目または3日目に、有効濃度の(iv)MAPK/ERKキナーゼシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(v)FGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、および(vi)ノッチシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と最初に接触させるステップと、(d)前記細胞を、少なくとも約10日間もしくは11日間、または前記細胞の少なくとも20%がTUJ1を発現するまで、有効濃度の(iv)MAPK/ERKキナーゼシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(v)FGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、および(vi)ノッチシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と共に培養するステップとを含む。
ある特定の実施形態では、幹細胞は、有効量の阻害剤(i)~(iii)と、少なくとも約2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間または10日間またはそれよりも長期間接触させ、有効量の阻害剤(iv)~(vi)と、少なくとも約2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間または10日間またはそれよりも長期間接触させ、次に、有効量のノッチシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と、少なくとも約2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間または10日間またはそれよりも長期間さらに接触させる。
ある特定の実施形態では、前述の阻害剤、活性化因子および分子は、幹細胞を含む細胞培養培地に添加される。適切な細胞培養培地には、Knockout(登録商標)血清置換(「KSR」)培地、N2培地、およびEssential 8(登録商標)/Essential 6(登録商標)(「E8/E6」)培地、およびNeurobasal(NB)培地(例えば、N2およびB-27(登録商標)補充物を補充したNB培地)が含まれるが、それらに限定されない。KSR培地、N2培地、E8/E6培地およびNB培地は、商業的に利用可能である。
KSR培地は、未分化hESC細胞を培養で成長させ、維持するために最適化された、定義された無血清配合物である。KSR培地の構成成分は、WO2011/149762に開示されている。ある特定の実施形態では、KSR培地は、ノックアウトDMEM、ノックアウト血清置換、L-グルタミン、Pen/Strep、MEM、およびβ-メルカプトエタノールを含む。
E8/E6培地は、ヒト多能性幹細胞の成長および拡大増殖を支持する、フィーダーを含まないおよび異種成分を含まない培地である。E8/E6培地は、体細胞再プログラムを支持することが証明されている。さらに、E8/E6培地は、PSC培養の特注培地の配合のためのベースとして使用され得る。E8/E6培地の一例は、その全体が参照によって組み込まれる、Chenら、Nat Methods. 2011年5月;8巻(5号):424~
9頁に記載されている。E8/E6培地の一例は、その全体が参照によって組み込まれる、WO15/077648に開示されている。ある特定の実施形態では、E8/E6細胞培養培地は、DMEM/F12、アスコルビン酸、セレニウム(selenum)、インスリン
、NaHCO3、トランスフェリン、FGF2およびTGFβを含む。ある特定の実施形態では、E6培地は、FGF2およびTGFβを含まない。E8/E6培地は、活性なBMPまたはWnt成分を含まないという点で、KSR培地とは異なる。したがって、ある特定の実施形態では、本開示の幹細胞集団を培養して、皮質ニューロン集団に分化させるためにE8/E6培地が使用される場合、BMPの1種または複数の阻害剤は、E8/E6培地に添加される必要はない。
9頁に記載されている。E8/E6培地の一例は、その全体が参照によって組み込まれる、WO15/077648に開示されている。ある特定の実施形態では、E8/E6細胞培養培地は、DMEM/F12、アスコルビン酸、セレニウム(selenum)、インスリン
、NaHCO3、トランスフェリン、FGF2およびTGFβを含む。ある特定の実施形態では、E6培地は、FGF2およびTGFβを含まない。E8/E6培地は、活性なBMPまたはWnt成分を含まないという点で、KSR培地とは異なる。したがって、ある特定の実施形態では、本開示の幹細胞集団を培養して、皮質ニューロン集団に分化させるためにE8/E6培地が使用される場合、BMPの1種または複数の阻害剤は、E8/E6培地に添加される必要はない。
N2補充物は、未分化神経幹細胞および前駆細胞を培養で拡大増殖させるために使用される、化学的に定義された、動物質を含まない補充物である。N2補充物は、DMEM/F12培地と使用されることを意図される。N2培地の構成成分は、WO2011/149762に開示されている。ある特定の実施形態では、N2培地は、グルコース、重炭酸ナトリウム、プトレシン、プロゲステロン、亜セレン酸ナトリウム、トランスフェリン、およびインスリンを補充したDMEM/F12培地を含む。
ある特定の実施形態では、幹細胞は、最初にKSR培地またはE6培地中で培養され、この培地は、幹細胞と、前述の阻害剤および活性化因子の少なくとも1つとの初期接触後、約1日目、約2日目、約3日目、約4日目、約5日目、約6日目、約7日目、約8日目、約9日目、約10日目、約11日目または約12日目から、増量したN2/B27培地で徐々に置き換えられる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、最初にKSR培地中で培養され、この培地は、幹細胞と、前述の阻害剤および活性化因子の少なくとも1つとの初期接触後、約4日目(例えば、幹細胞とTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤との初期接触後、4日目)から、増量したN2/B27培地で徐々に置き換えられる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、最初にE6培地中で培養され、この培地は、幹細胞と、前述の阻害剤および活性化因子の少なくとも1つとの初期接触後、約5日目(例えば、幹細胞とTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤との初期接触後、5日目)から、増量したN2/B27培地で徐々に置き換えられる。
分化した皮質ニューロンまたはそれらの前駆体は、例えば細胞培養培地中で分化した後、精製され得る。本明細書で使用される「精製された」、「精製する」、「精製」、「単離された」、「単離する」および「単離」という用語は、試料から、少なくとも1種の汚染物質の量を低減することを指す。例えば、所望の細胞型は、望ましくない細胞型の量の対応する低減によって、少なくとも10%、少なくとも30%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、もしくは少なくとも99.9%、またはそれよりも多く精製される。「精製する」という用語は、試料から、ある特定の細胞(例えば、望ましくない細胞)を除去することを指すことができる。非皮質ニューロン細胞またはそれらの前駆体の除去または選択によって、試料中の所望の細胞のパーセンテージが増大する。ある特定の実施形態では、細胞は、混合細胞集団を、少なくとも1種の皮質ニューロンマーカーを発現する細胞に分類することによって精製される。ある特定の実施形態では、細胞は、混合細胞集団を、少なくとも1種の腸皮質ニューロンマーカー、例えば、TBR1、TLE4、DCX、REELIN、CTIP2、SATB2、FOXP2、RGS4、CUX2、BLBP、またはそれらの組合せを発現する細胞に分類することによって精製される。
5.3.分化細胞集団を含む組成物
本開示はまた、本明細書に記載される方法に従って調製された、1種または複数のニューロンマーカー、例えば、皮質ニューロンマーカーを発現するin vitro分化細胞集団またはその前駆体細胞集団を提供する。ある特定の実施形態では、細胞集団の少なくとも約70%(例えば、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも約99%、または少なくとも約99.5%、または少なくとも99.9%)は、1種または複数の皮質ニューロンマーカー、例えば、TBR1、TLE4、DCX、REELIN、CTIP2、SATB2、FOXP2、RGS4、CUX2、BLBP、またはそれらの組合せを発現する。
本開示はまた、本明細書に記載される方法に従って調製された、1種または複数のニューロンマーカー、例えば、皮質ニューロンマーカーを発現するin vitro分化細胞集団またはその前駆体細胞集団を提供する。ある特定の実施形態では、細胞集団の少なくとも約70%(例えば、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも約99%、または少なくとも約99.5%、または少なくとも99.9%)は、1種または複数の皮質ニューロンマーカー、例えば、TBR1、TLE4、DCX、REELIN、CTIP2、SATB2、FOXP2、RGS4、CUX2、BLBP、またはそれらの組合せを発現する。
ある特定の実施形態では、細胞集団の約15%未満(例えば、約10%未満、約5%未満、約4%未満、約3%未満、約2%未満、約1%未満、約0.5%未満、または約0.1%未満)は、幹細胞マーカー(例えば、OCT4(オクタマー結合転写因子4)、NANOG(Nanogホメオボックス)、SOX2(SRY-Box 2)、LIN28(Lin-28ホモログA)、SSEA4(段階特異的胚抗原-4)および/またはSSEA3(段階特異的胚抗原-3)、グリア細胞マーカー(例えば、GFAP(グリア線維性酸性タンパク質)、AQP4(アクアポリン4)、および/またはOLIG2(オリゴデンドロサイト系統転写因子2))、網膜細胞マーカー(例えば、CHX10(視覚系ホメオボックス2))、末梢性感覚ニューロン(例えば、BRN3A(脳特異的ホメオボックス/POUドメインタンパク質3A)、および/またはISL1(ISL LIMホメオボックス1))、神経堤前駆体(例えば、SOX10(SRY-Box 10))、または頭蓋プラコード前駆体(例えば、SIX1(SIXホメオボックス1))からなる群から選択される1種または複数のマーカーを発現する。
ある特定の実施形態では、分化細胞集団は、ヒト幹細胞集団から誘導される。本開示の主題はさらに、このような分化細胞集団を含む組成物を提供する。
ある特定の実施形態では、組成物は、約1×104~約1×1010個、約1×104~約1×105個、約1×105~約1×109個、約1×105~約1×106個、約1×105~約1×107個、約1×106~約1×107個、約1×106~約1×108個、約1×107~約1×108個、約1×108~約1×109個、約1×108~約1×1010個、または約1×109~約1×1010個の、本開示の幹細胞由来の細胞集団を含む。
ある特定の非限定的な実施形態では、組成物は、生体適合性のある足場またはマトリックス、例えば、細胞が対象にインプラントまたはグラフトされると組織再生を容易にする、生体適合性のある三次元足場をさらに含む。ある特定の非限定的な実施形態では、生体適合性のある足場は、細胞外マトリックス材料、合成ポリマー、サイトカイン、コラーゲン、ポリペプチドもしくはタンパク質、フィブロネクチン、ラミニン、ケラチン、フィブリン、フィブリノゲン、ヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、アガロースもしくはゼラチンを含む多糖類、および/またはヒドロゲルを含む。(例えば、それぞれの内容全体が参照によって組み込まれる、米国特許出願第2015/0159135号、同第2011/0296542号、同第2009/0123433号、および同第2008/0268019号を参照されたい)。
ある特定の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体、添加剤、賦形剤またはそれらの組合せを含む医薬組成物である。組成物は、本明細書に記載されるCNS神経変性障害を予防および/または処置するために使用され得る。
5.4 CNS神経変性障害を予防および/または処置する方法
1種または複数の皮質ニューロンマーカーを発現するin vitro分化細胞(「幹細胞由来の皮質ニューロン」とも呼ばれる)、またはそれらの前駆体は、神経変性障害を予防および/または処置するために使用され得る。本開示の主題は、神経変性障害を予防および/または処置する方法であって、有効量の本開示の幹細胞由来の皮質ニューロンおよびそれらの前駆体を、神経変性障害に罹患している対象に投与するステップを含む方法を提供する。神経変性障害の非限定的な例として、パーキンソン病、アルツハイマー病、および統合失調症が挙げられる。
1種または複数の皮質ニューロンマーカーを発現するin vitro分化細胞(「幹細胞由来の皮質ニューロン」とも呼ばれる)、またはそれらの前駆体は、神経変性障害を予防および/または処置するために使用され得る。本開示の主題は、神経変性障害を予防および/または処置する方法であって、有効量の本開示の幹細胞由来の皮質ニューロンおよびそれらの前駆体を、神経変性障害に罹患している対象に投与するステップを含む方法を提供する。神経変性障害の非限定的な例として、パーキンソン病、アルツハイマー病、および統合失調症が挙げられる。
本開示の幹細胞由来の皮質ニューロンおよびそれらの前駆体は、神経変性障害を処置または予防するために、対象に全身的にまたは直接的に投与され得る。ある特定の実施形態では、本開示の幹細胞由来の皮質ニューロンおよびそれらの前駆体は、目的の臓器(例えば、中枢神経系(CNS))に直接的に注射される。
本開示の幹細胞由来の皮質ニューロンおよびそれらの前駆体は、任意の生理的に許容される媒体により投与され得る。本開示の幹細胞由来の細胞および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も提供される。本開示の幹細胞由来の皮質ニューロンおよびそれらの前駆体、ならびにそれらを含む医薬組成物は、局所注射、同所(OT)注射、全身注射、静脈内注射、または非経口投与を介して投与され得る。ある特定の実施形態では、本開示の幹細胞由来の皮質ニューロンおよびそれらの前駆体は、神経変性障害に罹患している対象に、同所(OT)注射を介して投与される。
本開示の幹細胞由来の皮質ニューロンおよびそれらの前駆体、ならびにそれらを含む医薬組成物は、好都合には、無菌液体調製物、例えば等張水溶液、懸濁液、乳濁液、分散液、または粘性組成物として提供することができ、これらは、選択されたpHに緩衝され得る。液体調製物は、普通は、ゲル、他の粘性組成物、および固体組成物よりも容易に調製される。さらに、液体組成物は、特に注射によって投与するのに、いくらかより好都合である。他方では、粘性組成物は、特定の組織とより長期間接触させるのに適した粘度範囲内で製剤化され得る。液体または粘性組成物は、担体を含むことができ、この担体は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等)および適切なそれらの混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。注射可能な滅菌溶液剤は、本開示の主題の組成物、例えば本開示の幹細胞由来の前駆体を含む組成物を、所望に応じて様々な量のその他の成分と共に、必要量の適切な溶媒に組み込むことによって調製され得る。このような組成物は、例えば滅菌水、生理食塩水、グルコース、ブドウ糖などの、適切な担体、賦形剤、または添加剤の混合物で存在し得る。また組成物は、凍結乾燥させることができる。組成物は、所望の投与経路および調製物に応じて、湿潤剤、分散化剤、または乳化剤(例えば、メチルセルロース)、pH緩衝剤、ゲル化添加物質または増粘添加物質、保存剤、香味剤、着色剤などの補助物質を含有し得る。過度の実験方法なしに適切な調製物を調製するために、参照によって本明細書に組み込まれる「REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE」、第17版、1985年などの標準書を参考にすることができる。
抗菌性保存剤、抗酸化剤、キレート剤、および緩衝液を含めた、組成物の安定性および無菌性を増強する様々な添加物質を添加することができる。微生物作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等によって確保され得る。注射可能な医薬形態の持続的吸収は、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム(alum inurn)およびゼラチンを使用することによっても
たらされ得る。しかし、本開示の主題によれば、使用される任意の媒体、賦形剤、または添加物質は、本開示の幹細胞由来の皮質ニューロンおよびそれらの前駆体と適合しなければならない。
たらされ得る。しかし、本開示の主題によれば、使用される任意の媒体、賦形剤、または添加物質は、本開示の幹細胞由来の皮質ニューロンおよびそれらの前駆体と適合しなければならない。
組成物の粘度は、所望に応じて薬学的に許容される増粘剤を使用して、選択されたレベルに維持され得る。メチルセルロースは、容易に、経済的に利用可能であり、取り扱いが容易であるため使用され得る。他の適切な増粘剤には、例えば、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマー等が含まれる。増粘剤の濃度は、選択される薬剤に応じて決まり得る。重要な点は、選択された粘度を達成する量を使用することである。明らかに、適切な担体および他の添加物質の選択は、正確な投与経路、および特定の剤形、例えば液体剤形の性質(例えば、組成物を、溶液、懸濁液、ゲルまたは別の液体形態、例えば持続放出形態または液体充填形態のいずれに製剤化すべきか)に応じて決まる。
当業者は、組成物の構成成分が、化学的に不活性であるように選択されるべきであり、本開示の幹細胞由来の皮質ニューロンおよびそれらの前駆体の生存率または有効性に影響を及ぼさないことを認識されよう。このことは、当業者にとって、化学的および薬学的原理の問題にならず、または問題は、標準書を参照することによってもしくは簡単な実験によって(過度の実験方法を伴わない)、本開示および本明細書に引用される文献から容易に回避され得る。
本開示の幹細胞由来の皮質ニューロンおよびそれらの前駆体の治療上の使用に関する1つの考察は、最適な効果を達成するのに必要な細胞の量である。最適な効果には、神経変性障害に罹患している対象のCNS領域への生着、および/または対象のCNS機能の改善が含まれるが、それらに限定されない。
「有効量」(または「治療有効量」)は、処置時に有益なまたは所望の臨床的な結果に影響を及ぼすのに十分な量である。有効量は、1回または複数の用量で対象に投与され得る。処置に関して、有効量とは、神経変性障害の進行を緩和し、回復させ、安定化し、逆行させ、もしくは緩徐するか、またはそうでなければ神経変性障害の病理学的結果を低減するのに十分な量である。有効量は、一般に、個々の場合に応じて医師によって決定され、当業者の知識の範囲内である。典型的に、有効量を達成するのに適した投与量を決定する場合には、複数の因子が考慮される。これらの因子には、対象の年齢、性別および体重、処置を受ける状態、状態の重症度、ならびに投与される細胞の形態および有効濃度が含まれる。
ある特定の実施形態では、本開示の幹細胞由来の皮質ニューロンおよびそれらの前駆体の有効量は、神経変性障害に罹患している対象のCNS領域に生着するのに十分な量である。ある特定の実施形態では、本開示の幹細胞由来の皮質ニューロンおよびそれらの前駆体の有効量は、神経変性障害に罹患している対象のCNSの機能を改善するのに十分な量であり、例えば、改善された機能は、正常なヒトのCNSの機能の約1%、約5%、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約98%、約99%または約100%であり得る。
投与される細胞の量は、処置を受ける対象ごとに変わる。ある特定の実施形態では、約1×104~約1×1010個、約1×104~約1×105個、約1×105~約1×109個、約1×105~約1×106個、約1×105~約1×107個、約1×106~約1×107個、約1×106~約1×108個、約1×107~約1×108個、約1×108~約1×109個、約1×108~約1×1010個、または約1×109~約1×1010個の、本開示の幹細胞由来の細胞が投与される。
5.5 キット
本開示の主題は、幹細胞の分化を誘導するためのキットを提供する。ある特定の実施形態では、キットは、以下:(a)形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(b)BMPシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(c)Wntシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(d)FGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(e)ノッチシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(f)MAPK/ERKキナーゼシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、および(g)本明細書に記載される方法に従って、1種または複数のニューロンマーカー、例えば、皮質ニューロンマーカーを発現する分化細胞集団またはその前駆体細胞集団への幹細胞の分化を誘導するための指示書の1つまたは複数を含む。
本開示の主題は、幹細胞の分化を誘導するためのキットを提供する。ある特定の実施形態では、キットは、以下:(a)形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(b)BMPシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(c)Wntシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(d)FGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(e)ノッチシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(f)MAPK/ERKキナーゼシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、および(g)本明細書に記載される方法に従って、1種または複数のニューロンマーカー、例えば、皮質ニューロンマーカーを発現する分化細胞集団またはその前駆体細胞集団への幹細胞の分化を誘導するための指示書の1つまたは複数を含む。
本開示の主題はまた、1種または複数のニューロンマーカー、例えば、皮質ニューロンマーカーを発現する分化細胞集団またはその前駆体細胞集団を含むキットであって、細胞が、本明細書に記載される方法に従って調製されるキットを提供する。ある特定の実施形態では、細胞は、医薬組成物に含まれる。
6.実施例
本開示の主題は、本開示の主題の例として、限定のためではなく提供される、以下の実施例を参照することにより、より良く理解される。
本開示の主題は、本開示の主題の例として、限定のためではなく提供される、以下の実施例を参照することにより、より良く理解される。
(実施例1)
6.1 実施例1:幹細胞集団を6つのシグナル伝達経路阻害剤と接触させることによって、幹細胞由来の皮質ニューロンを調製する方法。
6.1 実施例1:幹細胞集団を6つのシグナル伝達経路阻害剤と接触させることによって、幹細胞由来の皮質ニューロンを調製する方法。
要約
機能的ニューロンへのヒト多能性幹細胞(hPSC)の変換においては、かなりの進歩が得られている。しかし、ヒトニューロンの指定および機能的成熟のタイミングが長引くことは、依然として、疾患モデリングおよび再生医療におけるhPSC由来の系統の日常的な適用を妨げる重要課題である。本発明者らは、組合せ小分子のスクリーニングを使用して、末梢性感覚ニューロンを急速に誘導するための条件を既に同定した。ここで本発明者らは、CNS運命への到達を加速するアプローチを一般化するための試みにより、皮質ニューロンの急速な誘導について報告する。本発明者らは、グリア共培養の必要なしに、分化13日目までに有糸分裂後皮質ニューロンを誘導し、分化16日目までに機能的電気生理学的特性を誘導するための、6つの経路阻害剤の組合せの使用を実証する。生後マウスの皮質に分化8日目に移植したニューロンは、機能的であり、iDISCOベースの全脳画像化を使用して示される通り、長距離投射を確立する。皮質ニューロン運命への分化の加速は、CNS障害における疾患モデリングおよび細胞治療のためのhPSCベースの戦略を容易にするはずである。
機能的ニューロンへのヒト多能性幹細胞(hPSC)の変換においては、かなりの進歩が得られている。しかし、ヒトニューロンの指定および機能的成熟のタイミングが長引くことは、依然として、疾患モデリングおよび再生医療におけるhPSC由来の系統の日常的な適用を妨げる重要課題である。本発明者らは、組合せ小分子のスクリーニングを使用して、末梢性感覚ニューロンを急速に誘導するための条件を既に同定した。ここで本発明者らは、CNS運命への到達を加速するアプローチを一般化するための試みにより、皮質ニューロンの急速な誘導について報告する。本発明者らは、グリア共培養の必要なしに、分化13日目までに有糸分裂後皮質ニューロンを誘導し、分化16日目までに機能的電気生理学的特性を誘導するための、6つの経路阻害剤の組合せの使用を実証する。生後マウスの皮質に分化8日目に移植したニューロンは、機能的であり、iDISCOベースの全脳画像化を使用して示される通り、長距離投射を確立する。皮質ニューロン運命への分化の加速は、CNS障害における疾患モデリングおよび細胞治療のためのhPSCベースの戦略を容易にするはずである。
結果
ニューロンの運命獲得を加速するための試みでは、本開示の主題は、線維芽細胞成長因子(FGF)シグナル伝達の強力な阻害剤であるSU5402、およびノッチシグナル伝達をブロックするγ-セクレターゼ阻害剤であるDAPTの、2種のさらなる小分子の使用を提供する6。これらの2種の阻害剤(SD)を、二重SMAD阻害およびWNT活性化と組み合わせて適用すると、標準二重SMAD阻害条件下で神経前駆体細胞を誘導するのに必要な期間1と同じ期間である分化11日目までに、75%の有糸分裂後ニューロンが生じる7。しかし、急速に誘導されたニューロンにおけるBRN3AおよびISL1の同時発現により、これらは、PAX6由来のCNSニューロンではなく、末梢性感覚と定義付けられた7。したがって、感覚運命指定中にニューロンの運命獲得を加速するための戦略がCNS運命に適応され得るかどうかは、まだ不明である。PAX6由来の皮質ニューロンは、ヒト発生の研究のため、ならびにヒトの神経発生性および神経変性CNS障害のモデリングのために、特に興味深い。hPSCから皮質ニューロンを誘導するために信頼できるプロトコールが存在するが、それらの条件は、低層および上層の両方の皮質ニューロンを得るのに30日~90日の間の分化が必要であり15、30、完全成熟を達成するには、さらにより長期間が必要である。ここで本発明者らは、疾患モデリングおよび再生医療への適用における、hPSC由来のニューロンの日常的な適用を容易にするためにヒト皮質ニューロン運命誘導を大幅に加速する小分子ベースの条件を同定することを目的とする。
ニューロンの運命獲得を加速するための試みでは、本開示の主題は、線維芽細胞成長因子(FGF)シグナル伝達の強力な阻害剤であるSU5402、およびノッチシグナル伝達をブロックするγ-セクレターゼ阻害剤であるDAPTの、2種のさらなる小分子の使用を提供する6。これらの2種の阻害剤(SD)を、二重SMAD阻害およびWNT活性化と組み合わせて適用すると、標準二重SMAD阻害条件下で神経前駆体細胞を誘導するのに必要な期間1と同じ期間である分化11日目までに、75%の有糸分裂後ニューロンが生じる7。しかし、急速に誘導されたニューロンにおけるBRN3AおよびISL1の同時発現により、これらは、PAX6由来のCNSニューロンではなく、末梢性感覚と定義付けられた7。したがって、感覚運命指定中にニューロンの運命獲得を加速するための戦略がCNS運命に適応され得るかどうかは、まだ不明である。PAX6由来の皮質ニューロンは、ヒト発生の研究のため、ならびにヒトの神経発生性および神経変性CNS障害のモデリングのために、特に興味深い。hPSCから皮質ニューロンを誘導するために信頼できるプロトコールが存在するが、それらの条件は、低層および上層の両方の皮質ニューロンを得るのに30日~90日の間の分化が必要であり15、30、完全成熟を達成するには、さらにより長期間が必要である。ここで本発明者らは、疾患モデリングおよび再生医療への適用における、hPSC由来のニューロンの日常的な適用を容易にするためにヒト皮質ニューロン運命誘導を大幅に加速する小分子ベースの条件を同定することを目的とする。
CNSニューロン分化を加速するプロトコールの開発
神経堤運命に対するCNSの決定における、WNTシグナル伝達の非常に重要な役割を前提として3、8、開示される方法は、皮質ニューロン運命への急速な分化を誘発したWNTシグナル伝達を活性化するのではなく、そのWNTシグナル伝達を阻害する組合せ小分子のアプローチを開発した(図1A)。開示される方法は、GSK3β阻害剤であるCHIR99021(C;WNTアゴニスト)を、タンキラーゼ阻害およびアキシン安定化によって作用するWNTアンタゴニストであるXAV939と交換する9。すべての他の阻害剤(LDN+SB=二重SMAD阻害(LSB)、SU5402およびDAPT)は、前脳ニューロン運命を急速に誘導することを目的とする初期の研究のために、変更せずにそのままにすることができる(LSB+X/S/Dプロトコール、図2A)。急速なニューロン誘導中、CNSからPNS運命への切替えを予想外に誘発した本発明者らの経験を前提として7、開示される方法は、最初に3種の遺伝的hESCレポーター株を使用して、X/S/D条件下で初期外胚葉系統の選択に対する影響を査定した。CNS系統をモニターするために、開示される方法は、新規なPAX6::H2B-GFPレポーター株を確立し、神経堤運命については、開示される方法は、過去に公開されたSOX10::GFPレポーター株を使用し2、7、頭蓋プラコードの同一性については、開示される方法は、新規なSIX1::H2B-GFP株を使用した。TALENベースの遺伝子標的化を使用して、PAX6およびSIX1レポーター株の両方を発生させた。開示される方法は、免疫細胞化学を使用してGFPを対応するタンパク質の発現と同等にすることによって、in vitro分化後のレポーターの忠実性を確証した2、10(図1B)。
神経堤運命に対するCNSの決定における、WNTシグナル伝達の非常に重要な役割を前提として3、8、開示される方法は、皮質ニューロン運命への急速な分化を誘発したWNTシグナル伝達を活性化するのではなく、そのWNTシグナル伝達を阻害する組合せ小分子のアプローチを開発した(図1A)。開示される方法は、GSK3β阻害剤であるCHIR99021(C;WNTアゴニスト)を、タンキラーゼ阻害およびアキシン安定化によって作用するWNTアンタゴニストであるXAV939と交換する9。すべての他の阻害剤(LDN+SB=二重SMAD阻害(LSB)、SU5402およびDAPT)は、前脳ニューロン運命を急速に誘導することを目的とする初期の研究のために、変更せずにそのままにすることができる(LSB+X/S/Dプロトコール、図2A)。急速なニューロン誘導中、CNSからPNS運命への切替えを予想外に誘発した本発明者らの経験を前提として7、開示される方法は、最初に3種の遺伝的hESCレポーター株を使用して、X/S/D条件下で初期外胚葉系統の選択に対する影響を査定した。CNS系統をモニターするために、開示される方法は、新規なPAX6::H2B-GFPレポーター株を確立し、神経堤運命については、開示される方法は、過去に公開されたSOX10::GFPレポーター株を使用し2、7、頭蓋プラコードの同一性については、開示される方法は、新規なSIX1::H2B-GFP株を使用した。TALENベースの遺伝子標的化を使用して、PAX6およびSIX1レポーター株の両方を発生させた。開示される方法は、免疫細胞化学を使用してGFPを対応するタンパク質の発現と同等にすることによって、in vitro分化後のレポーターの忠実性を確証した2、10(図1B)。
開示される方法はまた、図1Cに示される通り、X/S/D条件下で外胚葉の運命選択を査定した。過去の研究と一致して、LSBおよびLSB+Xは共に、SOX10+またはSIX1+汚染物質が非常に少ない、PAX6+細胞のほぼ均一な集団(>95%)を生じた。それとは対照的に、LSB+CまたはLSB+C/S/D(3iまたはPNS感覚ニューロンプロトコールとも呼ばれる7)は、少量のPAX6+しか生じなかったが、神経堤誘導におけるWNTシグナル伝達のための重要な役割と適合する多数のSOX10+神経堤前駆体を生じた7。重要なことに、本発明者らの急速なCNSニューロンプロトコール候補であるLSB+X/S/Dは、早くも分化6日目には、ほぼ純粋な(>98%)PAX6+細胞集団を生じた。これは、LSBおよびLSBXよりも著しく急速であり、hPSCの既存の多能性においてFGF阻害が果たす役割と適合している。得られたデータは、図1Cに示される通り、CNS同一性、ならびにSU5402およびDAPTへの曝露後の神経誘導タイミングの加速を実証している。
開示される方法はまた、LSB+X/S/Dが、感覚ニューロン運命指定中に3iプロトコール7(LSB+C/S/D)について報告されたものに匹敵する効率で、推定上のCNSニューロンを誘導できるかどうかについて査定した。β-IIIチューブリン(TUJ1)について細胞内フローサイトメトリーを使用すると、汎ニューロンマーカーLSB+CおよびLSB+Xは、13日目までにTUJ1+ニューロンがほとんどなかったが、3i条件(LSB+C/S/D)では、40%のTUJ1+細胞が得られた。それとは対照的に、新規なLSB+X/S/D条件では、図1D~1Fに示される通り、わずか10%のTUJ1+ニューロンを生じた。これらのデータは、SU5402およびDAPTの存在下でWNTシグナル伝達が阻害されると、CNS系統ニューロンが生じるが、中程度の効果しかないことを示している。
ニューロンの変換効率を向上させる試みでは、開示される方法は、LSB+Xにおいて候補小分子のスクリーニングを実施する。開示される方法は、神経前駆体細胞増殖、例えばSHH(シクロパミン、Cur-61414、プルモルファミン)、PI3KおよびPDGFR(LY-294002、イマチニブ)、MYC/ブロモドメインタンパク質(JQ1)、レチノイドシグナル伝達(オール-トランスレチノイン酸)、TGFβ活性化(IDE-1)、HMG-CoAレダクターゼ阻害(ロバスタチン)およびニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ阻害(P7C3)に関与する分子標的化シグナル伝達経路、ならびにERKシグナル伝達(PD0325901)を含むFGF受容体活性化の下流のシグナル伝達経路を選択することができる。マウスにおけるERK1/2の阻害によって、皮質発生中の早期のニューロン分化が引き起こされ12、ERK阻害は、hPSCにおける全体的なニューロン分化を増強するための戦略として、既に提案されている13。ほとんどの条件は、ニューロンの運命獲得の著しい改善をもたらさなかった(データ示さず)。
しかし、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(MAPK/ERKキナーゼまたはMEK)の、経口で生体利用可能な強力な阻害剤であるPD0325901は8、TUJ1+の収率%を>50%まで強化することができ、これは、高濃度で使用した場合の3i感覚ニューロンプロトコールに匹敵する値である(図1G、上パネル)。しかし、高い百分率のTUJ1+細胞は、全細胞数の低収率と相関しており、毒性を示唆した(図1G、下パネル)。ニューロン誘導効率と全体的な細胞毒性の平衡を保つ試みでは、より低いPD濃度をSU曝露と組み合わせると、全ニューロン収率が増大した。DAPTを用いる追加の処理は、全体的なニューロン収率に負の影響を及ぼさなかったが、いくつかの条件を用いたニューロン誘導の効率はさらに増大して、分化13日目には>50%のTUJ1+細胞を達成した。これらのデータによって、LSB+X+P/S/Dは、皮質ニューロンの急速な誘導の有望な候補条件として定義付けられる。収率の低下が、急速な細胞周期からの脱出に起因するか、または直接的な毒性に起因するかを理解するために、本発明者らは、ホスホ-ヒストン3(pH3)および切断型カスパーゼ3(CC3)を、それぞれ細胞増殖および細胞死のマーカーとして測定した。PD0325901およびSU5402の両方への曝露によって、早くもP/S処理の24時間後に細胞増殖が低減されたが、細胞死は、高用量のSU5402で初めて観察されており(図15A~F)、このことは、前駆体細胞の増殖制限が、急速なニューロン分化応答において非常に重要な因子であることを暗示している。高百分率のニューロンをもたらし、毒性をごく低レベルに抑える2つの濃度には、i)P(1μM)S(5μM)=P1S5D条件、およびii)P(8μM)S(10μM)=P8S10D条件が含まれる(図1Hおよび1I)。
CNSおよび皮質ニューロン同一性の表現型分析
時間的フロー分析では、図3Aおよび図4に示される通り、P8S10D条件によってニューロンの運命獲得が劇的に加速され、3i(C+S/D)またはより穏やかなCNS(P1S5D)ニューロンプロトコールと比較して、13日目に著しく高い百分率のニューロン(70%のTUJ1+ニューロン)が生じたことが実証された。遺伝子発現分析では、LSB+X/P/S/D条件において、多能性マーカーOCT4のダウンレギュレーション、ならびに神経マーカーおよびニューロンマーカーPAX6、FOXG1およびDCX、ならびにTBR1(プレプレート、サブプレートおよびVI層)およびREELINを含む初期に生まれた皮質ニューロンのマーカーの誘導が確認された。それとは対照的に、感覚ニューロン(3i)および加速なしのCNSプロトコール(LSB+X)は、それぞれ皮質マーカーおよびニューロンマーカーの誘導の欠如を示した(図3B)。
時間的フロー分析では、図3Aおよび図4に示される通り、P8S10D条件によってニューロンの運命獲得が劇的に加速され、3i(C+S/D)またはより穏やかなCNS(P1S5D)ニューロンプロトコールと比較して、13日目に著しく高い百分率のニューロン(70%のTUJ1+ニューロン)が生じたことが実証された。遺伝子発現分析では、LSB+X/P/S/D条件において、多能性マーカーOCT4のダウンレギュレーション、ならびに神経マーカーおよびニューロンマーカーPAX6、FOXG1およびDCX、ならびにTBR1(プレプレート、サブプレートおよびVI層)およびREELINを含む初期に生まれた皮質ニューロンのマーカーの誘導が確認された。それとは対照的に、感覚ニューロン(3i)および加速なしのCNSプロトコール(LSB+X)は、それぞれ皮質マーカーおよびニューロンマーカーの誘導の欠如を示した(図3B)。
P8S10D条件下で前脳マーカーFOXG1の誘導が制限されることを前提として、FOXG1発現に対する各小分子の影響(図5Aおよび5B)を試験した。それらのデータは、特に、神経誘導中のPDへの曝露によって、FOXG1誘導効率が低下したことを示した。しかし、P1S5D条件およびP8S10D条件下の両方で、VI層皮質ニューロンマーカーTBR1+の高効率の誘導が観察され、13日目にすべてのTUJ1+細胞の50%超において同時発現し(図3C~3E)、これは、VI層マーカーTLE4の発現と類似していた(図16A)。TBR1およびTLE4に対して陰性であった残部を同定するために、本発明者らは、13日目の追加のマーカーのパネルをスクリーニングした(図19、図16B)。驚くべきことに、15%~20%のニューロンがBRN3Aを発現したが、ごくわずかなニューロンが、ISL1を発現しており、これは、汚染性BRN3A+CNS系統の存在を示唆している(図19、図16C~D)。BRN3AおよびGSX2の両方の発現に基づくと(図16B)、これらの非皮質ニューロンは、初期視床系統に相当し得る(www.gensat.org;http://developingmouse.brain-map.org)。TUJ1
陰性画分の特徴付けによって、皮質前駆体細胞の同一性と一致して、TBR2、BLBPおよびCUX2に対して陽性の細胞の存在が示された(図19、図16A~B)。本発明者らはさらに、LSB+X/P/S/D条件において、他の前側CNSおよび皮質前駆細胞およびニューロンマーカーのアップレギュレーションを観察した(LSB+Xと比較)(図16B)。しかし、本発明者らは、腹側前脳、皮質介在ニューロンまたは他のGABA作動性ニューロン運命の発現を検出しなかった(図19、図16B)。
陰性画分の特徴付けによって、皮質前駆体細胞の同一性と一致して、TBR2、BLBPおよびCUX2に対して陽性の細胞の存在が示された(図19、図16A~B)。本発明者らはさらに、LSB+X/P/S/D条件において、他の前側CNSおよび皮質前駆細胞およびニューロンマーカーのアップレギュレーションを観察した(LSB+Xと比較)(図16B)。しかし、本発明者らは、腹側前脳、皮質介在ニューロンまたは他のGABA作動性ニューロン運命の発現を検出しなかった(図19、図16B)。
LSB+X/P/S/D条件が、複数の株にわたって強固であるかどうかを決定するために、本発明者らは、2人の健康な個体から誘導した6種の独立なhiPSC株を試験した。分化13日目までに、すべての株がTBR1+/TUJ1+ニューロンについて富化され、WA09 hESC株から得られた形態と類似の形態を示した(図2Bおよび2C)。ニューロンの百分率の定量によって、WA09について観察されたものと類似の効率が示されたが、複数の株の間でいくらかのばらつきがあった(図2D)。加速プロトコールをGMP適合培養条件に移すための試みでは、プロトコールを、Essential 6(商標)培地(E6)ベースの誘導プラットフォームにさらに適応させた(図3K)。本発明者らは、分化13日目までに、効率的なPAX6誘導、および高度に富化されたTBR1+有糸分裂後ニューロン集団の発生の加速を観察した(図2H)。したがって、急速な誘導戦略は、hiPSC株にわたって適用され、GMP適合培養条件に適応させることができる。
皮質投射ニューロンは、インサイドアウト方式で生成される14。分化13日目までのTBR1およびREELINのアップレギュレーションは、最も早く生まれた皮質深部層ニューロンを発生させる潜在的な偏向を示唆した。しかし、FGF-ERKおよびノッチ阻害がない状態でP1S5DまたはP8S10D培養物をさらに維持することによって(13~55日目)(図3F)、FOXP2(V~VI層)、CTIP2(V層)、SATB2(II~III層、V層)、RGS4(II~III層、V層)(図3、図17)などの、より広い範囲の皮質層を代表するマーカーを発現するニューロンを発生させることができ、タモキシフェン誘導性CUX2レポーターhESC株を使用することによってモニターされた、上層CUX2+(II~IV層)ニューロンを発生させることができた(図18A~D)。P1S5DまたはP8S10Dで処理した細胞は、加速なしのプロトコールを使用した55日目と比較して、早くも33日目に成熟形態を有するCUX2+有糸分裂後ニューロンを生成し始めた(図18E~G)。皮質神経発生は、著しく加速されるが、GFAP、AQP4またはOLIG2などのグリアマーカーのアップレギュレーションは観察されなかった。同様に、CHX10などのレチナール運命マーカーの誘導もなかった(図17)。TBR1+、CTIP2+およびSATB2+ニューロンの定量によって(図3H)、in vitro由来のニューロンは、in vivo皮質形成と一致するマーカー発現の時間的順序に従い得ることが示唆された。in vitroでのニューロンサブタイプ誘導の特定のタイミングにさらに取り組むために、本発明者らは、誕生日決定実験を実施した(図3F)。層に特異的なマーカーを用いるEdU同時標識では、細胞誕生の連続波が示された(図3I~J)。したがって、本発明者らのデータは、VI層の高効率な誘導を実証しており、修飾小分子タイミングレジメンを使用して上層ニューロンの誘導を加速する実現可能性を示している。
多くの細胞は、33日目までにVI層マーカーTBR1、FOXP2およびTLE4を発現し、V層マーカーCTIP2、ならびにII~V層マーカーSATB2を、細胞の10%超において発現し始めるが、これは、hPSCからの皮質ニューロン誘導について現在公開されているプロトコールと比較して、最も早い発現である。図3Gに示される通り、誘導の33日目までに、P1S5D培養によって、深層TBR1+およびFOXP2+のニューロン(V~VI層)、CTIP2+(V層)およびSATB2+脳梁ニューロン(II~V層)が生じる。また、図3Gに示される通り、ERKおよびノッチ阻害がない状態でP1S5DまたはP8S10D培養物をさらに維持することによって(誘導の55日目まで)、CTIP2+およびSATB2+などの上層マーカーを発現するニューロンを効率的に生成することができた(それぞれ、およそ60%および20%のTUJ1+ニューロン)。
培養を継続すると、図3Hに定量される通り、45日目および55日目に上層に属するより多くのニューロンが富化される。異なる層のニューロンについて誕生のタイミングに取り組むために、開示される方法は、EdUパルス標識を実施し(図3Iおよび3J)、それによって、初期に生まれた細胞集団がVI層のTBR1+ニューロンであることが実証されるが、これは皮質形成の固有の時間的機序と一致する。
ニューロン機能の急速な誘導
開示される方法は、急速なCNSニューロン誘導条件下でTBR1+細胞の高効率な誘導を実証するが、修飾小分子タイミングレジメンを使用して上層マーカーを発現するニューロンを誘導する実現可能性を示すこともできる。開示される方法は、ニューロンマーカーの急速な誘導に、反復活動電位を自然発生的に発火させる能力などの、急速なin vitro機能的成熟が並行するかどうかについて、さらに調査することができる。hPSC由来のニューロンの機能的成熟は、分化約50~100日目に典型的に生じる活動電位の発火により、既に実証されている15。開示される方法は、成熟を査定するために、ニューロンの運命に向かって誘導した細胞を、P1S5DまたはP8S10D条件下で8日間培養し、その後、i)任意の小分子阻害剤を含まない基本培地、ii)DAPTだけを添加した培地、またはiii)DAPTをSU5402、PDおよびCHIR99021(CHIR)(P/S/D/C)と共に添加した培地のいずれかで、さらに8日間培養することができる(図6A)。GSK3β阻害剤CHIRは、P/S/Dで維持された培養物に対して強力な生存促進効果を発揮し、正準WNTシグナル伝達の活性化を誘発することによって、軸索伸張およびシナプス形成を含めたニューロン分化を促進することが既に示されているので16、17、この最終分化ステップに含めた。意外なことに、P/S/D/CHIR下で8日間維持されたP8S10D細胞は(多能性状態から分化16日目)、静止膜電位において、または-10pAの電流注入後に過分極が誘導されたら、一連の活動電位の発火によって特徴付けられる成熟した電気生理学的特性を自然発生的に示した(図6B)。すべての条件下で、記録されたニューロンの70%~80%は、発火できることが記録され、約20%~30%のニューロンは、P/S/D/Cを用いたP8S10D細胞で、より成熟した発火パターンを示した(一連のおよそ10回の活動電位発火ピーク)(図6D)。
開示される方法は、急速なCNSニューロン誘導条件下でTBR1+細胞の高効率な誘導を実証するが、修飾小分子タイミングレジメンを使用して上層マーカーを発現するニューロンを誘導する実現可能性を示すこともできる。開示される方法は、ニューロンマーカーの急速な誘導に、反復活動電位を自然発生的に発火させる能力などの、急速なin vitro機能的成熟が並行するかどうかについて、さらに調査することができる。hPSC由来のニューロンの機能的成熟は、分化約50~100日目に典型的に生じる活動電位の発火により、既に実証されている15。開示される方法は、成熟を査定するために、ニューロンの運命に向かって誘導した細胞を、P1S5DまたはP8S10D条件下で8日間培養し、その後、i)任意の小分子阻害剤を含まない基本培地、ii)DAPTだけを添加した培地、またはiii)DAPTをSU5402、PDおよびCHIR99021(CHIR)(P/S/D/C)と共に添加した培地のいずれかで、さらに8日間培養することができる(図6A)。GSK3β阻害剤CHIRは、P/S/Dで維持された培養物に対して強力な生存促進効果を発揮し、正準WNTシグナル伝達の活性化を誘発することによって、軸索伸張およびシナプス形成を含めたニューロン分化を促進することが既に示されているので16、17、この最終分化ステップに含めた。意外なことに、P/S/D/CHIR下で8日間維持されたP8S10D細胞は(多能性状態から分化16日目)、静止膜電位において、または-10pAの電流注入後に過分極が誘導されたら、一連の活動電位の発火によって特徴付けられる成熟した電気生理学的特性を自然発生的に示した(図6B)。すべての条件下で、記録されたニューロンの70%~80%は、発火できることが記録され、約20%~30%のニューロンは、P/S/D/Cを用いたP8S10D細胞で、より成熟した発火パターンを示した(一連のおよそ10回の活動電位発火ピーク)(図6D)。
P1S5DニューロンおよびP8S10Dニューロンの両方で査定されたニューロン成熟の追加のパラメーターには、静止膜電位、初期発火の活動電位半値幅および上昇率(Tau)、入力抵抗、ならびに最大発火周波数が含まれる(図6Cおよび6D)。P/S/D/CHIR中で細胞を維持することによって、最も成熟したニューロン特性が得られたが、最も穏やかな条件(任意の小分子阻害剤を含まない基本培地中、P1S5Dで処理した細胞)でも、37日目までに成熟した発火パターンのニューロンが生じ(図7A~7C)、この期間は、過去のほとんどのhPSC由来の皮質ニューロン分化プロトコールにおける期間よりも著しく速い。
強固な電位依存性ナトリウムチャネル応答も観察され、テトロドトキシン(TTX)によってブロックされた(図6E)。さらに細胞は、自発的興奮性シナプス後電流(sEPSC)を示したが、sEPSCは、特異的なAMPA受容体アンタゴニストであるNBQXによって阻害され(図6F)、このことは、機能的興奮性シナプスが形成されたことを示している。機能的成熟データは、任意の星状膠細胞共培養がない状態で得られたが、マウス星状膠細胞(8日目)へのP8S10D培養物の再プレーティング、または星状膠細胞の条件培地中の培養によって(図8A~8C)、全体的なニューロンの生存が改善され、入力抵抗が低下し、形態複雑性が増強されたニューロンが得られた(図8D~8F)。さらに本発明者らは、星状膠細胞の添加によって、ニューロンの成熟がさらに加速され得るか、または維持が促進され得るかどうかについて試験した。実際、DAPTの存在下で、マウス星状膠細胞でまたは星状膠細胞条件培地中でP8S10D誘導ニューロンを培養することによって(図8A~C)、全体的なニューロンの生存が改善され、急速に誘導されたニューロンを、70日から90日を超えて長期間維持することができた(図8G)。星状膠細胞での培養によって、入力抵抗が低下し、形態複雑性が増強されたニューロンがさらに得られたが、このことは、ニューロンの成熟度の増大を示している(図8E~G)。
iDISCOベースの全脳分析を使用するhPSC由来のニューロンのin vivo分析
in vitroデータにより、本発明者らの組合せ小分子プロトコールが、皮質マーカーの発現および機能的電気生理学的特性を有するニューロンを急速に誘導できることが実証される。しかし、長期間生存、軸索投射能力および宿主回路網への統合をより完全に査定するために、in vivo移植研究を実施した。EGFPを構成的に発現するhESCから誘導された分化8日目の未成熟ニューロンを、P2 NOD-SCID IL2Rgc-/-マウスの体性感覚皮質にグラフトした(図9)。
in vitroデータにより、本発明者らの組合せ小分子プロトコールが、皮質マーカーの発現および機能的電気生理学的特性を有するニューロンを急速に誘導できることが実証される。しかし、長期間生存、軸索投射能力および宿主回路網への統合をより完全に査定するために、in vivo移植研究を実施した。EGFPを構成的に発現するhESCから誘導された分化8日目の未成熟ニューロンを、P2 NOD-SCID IL2Rgc-/-マウスの体性感覚皮質にグラフトした(図9)。
グラフトした動物の脳を、グラフト1~6ヶ月後に収集し、iDISCO18透明化およびホールマウント免疫組織化学的検査プロトコールに従って、全脳免疫蛍光画像化に晒した(図10A)。ほとんどの移植研究を、本発明者らの研究で試験した最終時点である移植後6ヶ月目まで強固なin vivo生存を示したP1S5Dパラダイムを使用して行った。P8S10Dニューロンは、より可変的なin vivo生存を示し、移植1ヶ月後に動物のサブセットだけで生着および軸索投射の証拠があった(図11A)。LSB+X条件からの同等の8日目の細胞は、広範なグラフト過成長を示し、ニューロン分化またはグラフト統合の証拠は最小限であった(図11B)。これらのデータは、初期神経上皮の「ロゼット段階」細胞が、腫瘍様の過成長をもたらすことを示唆する過去の結果を思い起こさせるものである22。したがって、後期神経前駆体またはニューロンへの神経上皮細胞の分化は、神経過成長の危険性を低減するのに非常に重要である。
グラフトの1ヶ月後および1.5ヶ月後の、P1S5Dニューロンをグラフトした脳の詳細な分析によって、グラフトコアおよびニューロン投射を可視化することができた(図10C)。1ヶ月後、GFP+グラフト細胞は、すべての皮質層にわたって、広範な脱束化(defasciculated)投射を発生させた(図10B)。いくつかの長い高密度束も、一貫して皮質層VIに見られた。投射のほとんどは、前頭前野の運動皮質および前頭皮質で終端するが、多くの軸索は、脳梁を介して同側性海馬および対側性皮質にも辿っていた(図10C)。非常に低密度のグラフト由来の線維が、線条体において観察されたが、これは、グラフトニューロンが、標的化外套下(subpallial)領域ではなく皮質領域にわたる投射を好んだことを示唆している。本発明者らは、自己蛍光を使用して宿主軸索経路を位置付けて(図12A)、グラフト由来の線維束の大部分が、内在性路に従ったことを観察した(図12C)。しかし、いくつかの線維は、宿主下行路の外側に投射した(図12B)。
移植後1.5ヶ月までに、グラフト由来の軸索線維束の大部分は、ごく限られた終末分枝を伴って進行する経路探索に特徴的なパターンである成長円錐を思い起こさせる、直線軌道および拡大末端構造に従った(図10D、左パネル)。それとは対照的に、移植後3ヶ月までおよび最も顕著には6ヶ月目に(図10D、中央パネルおよび右パネル)、同等の標的エリアにおいて広範なヒト軸索終末分枝が存在した(図10D、左パネルに対する中央パネル)。広範な分枝と同時に、ヒトシナプトフィジン陽性構造の高密度ネットワークが観察されたが、これは、宿主海馬などのいくつかの標的エリアのGFP+線維と共存していた(図10D、右下パネル)。グラフトニューロンは、単極、双極、多極および錐体の形状の様々な形態を示した(図12D)。iDISCOベースの分析は、全般的な前脳マーカーFOXG1、ならびに層特異的マーカー、例えばREELIN、SATB2およびCTIP2の発現を含む、ヒト細胞におけるin vivo皮質マーカー発現を確認した従来の免疫組織化学的分析を用いて補完した(図10E)。さらに、電気生理学によってin vivo機能の予備的な証拠が得られた(図13)。グラフトニューロンにおけるSATB2+の発現は、iDISCOベースの研究における交連軸索投射の存在と同等の交連ニューロン同一性と適合する(図10D)。このデータは、分化8日目のP1S5D誘導神経細胞が、in vivo生存能および皮質内の広範な軸索投射能を有することを示した。P8S10D誘導ニューロンは、グラフトサイズおよび生存率の全体的な低減を示したが、生存グラフトを有する動物は、1.5ヶ月目に、既に広範な線維伸張および分枝を示した。
考察
開示される方法は、分化8日目のP1S5D誘導神経細胞が、in vivo生存能および皮質内の広範な軸索投射能を有することを示すことができる。P8S10Dニューロンは、グラフトサイズおよび生存率の全体的な低減を示したが、生存グラフトを有する動物は、1.5ヶ月目に、広範な線維伸張および分枝を示した。P8S10Dグラフトが、P1S5D細胞と比較して、より急速にin vivo成熟するかどうかを決定するには、将来的により詳細な研究が必要である。興味深いことに、任意の加速を伴わない二重SMAD阻害培養物(LSB+XAV)からの8日目の同等のグラフトは、広範なグラフト過成長を示し、ニューロン分化の証拠は最小限であった(図11B)。これらのデータは、初期神経上皮の「ロゼット段階」細胞が、神経上皮細胞の腫瘍様の過成長をもたらすことを示唆する本発明者らの過去の実験結果等と同等である19。また、いくつかのニューロンは、固有の白質に従って軸索を伸ばし、いくつかのニューロンは、ランダム方向に軸索を伸ばすので、グラフト細胞は、軸索路探索の不均一性を示す(図12)。したがって、後期神経前駆体またはニューロン系統へのさらなる分化は、神経過成長の危険性を低減するのに非常に重要である。
開示される方法は、分化8日目のP1S5D誘導神経細胞が、in vivo生存能および皮質内の広範な軸索投射能を有することを示すことができる。P8S10Dニューロンは、グラフトサイズおよび生存率の全体的な低減を示したが、生存グラフトを有する動物は、1.5ヶ月目に、広範な線維伸張および分枝を示した。P8S10Dグラフトが、P1S5D細胞と比較して、より急速にin vivo成熟するかどうかを決定するには、将来的により詳細な研究が必要である。興味深いことに、任意の加速を伴わない二重SMAD阻害培養物(LSB+XAV)からの8日目の同等のグラフトは、広範なグラフト過成長を示し、ニューロン分化の証拠は最小限であった(図11B)。これらのデータは、初期神経上皮の「ロゼット段階」細胞が、神経上皮細胞の腫瘍様の過成長をもたらすことを示唆する本発明者らの過去の実験結果等と同等である19。また、いくつかのニューロンは、固有の白質に従って軸索を伸ばし、いくつかのニューロンは、ランダム方向に軸索を伸ばすので、グラフト細胞は、軸索路探索の不均一性を示す(図12)。したがって、後期神経前駆体またはニューロン系統へのさらなる分化は、神経過成長の危険性を低減するのに非常に重要である。
開示される方法は、hPSC由来のグラフト生存、軸索投射および宿主神経支配を位置付けるために、iDISCOを最初に適用する。iDISCOデータは、GFPのため、ならびにヒトシナプトフィジンなどのヒト特異的マーカーの発現のために、全脳免疫組織化学的検査および画像化を含む。しかしこの技術は、グラフト生物学の特定の態様をモニターするための、ほとんどの任意のヒト特異的マーカーを用いる使用に適しているはずである。将来的な研究では、選択的皮質エリアおよび層同一性を有するこのような細胞の定義されたhPSC由来の皮質系統の位置付け領域に特異的な投射にiDISCOを適用することは、特に興味深いものになるかもしれない20。このアッセイは、関連系統であるが別個の投射パターンを有するニューロン、例えばA10(腹側被蓋野)同一性に対してA9(黒質)の中脳ドーパミンニューロンを定義し、同所位22に対して異所位21に位置するニューロンの末端投射パターンを位置付けるためのツールとして働くこともできた。
開示される方法は、分化16日目までに成熟した電気生理学的特性を有し、生後マウス皮質においてin vivo生着能および長距離投射能を有する皮質ニューロンをもたらすことができる急速誘導プロトコールを提供する(図14)。本発明の実施形態によれば、感覚ニューロン誘導7および新しい皮質ニューロン誘導の例に従って、他のニューロンサブタイプのために類似の加速戦略を開発することができる。このような急速な定方向性分化プロトコールは、疾患モデリング、薬物発見または細胞治療に関連する特異的ニューロンを得るのにかかる時間および費用を、著しく低減することができる。現在のP1S5DまたはP8S10D条件下で誘導された皮質ニューロンは、皮質深層に偏向する。
約2週間の分化で機能的ニューロンを発生させる時間枠は、NGN2ベースの分化などのhPSCの転写因子ベースのニューロン誘導を使用する場合に達成される速度に匹敵する23。しかし、小分子を介する定方向性分化は、特異的ニューロンを発生させるための柔軟性を拡大することができ、遺伝的修飾の必要をなくす。最後に、この研究は、in vitroでhPSCからのヒト系統の多様性を再構築する能力の増大と共に、疾患モデリングおよび再生医療においてiPSC由来のニューロンの全潜在能力を活用する道のりの、分化および成熟のタイミングを独立なパラメーターとして調節するための一歩となる。
方法
hESC株およびhiPSC株の発生
hESC(WA-09、継代32~60回)を、WiCellから得、継代60回まで維持した。hESC SOX10::GFP細菌人工染色体レポーター株(WA-09;継代40~70回)を、既に報告されている通り発生させた7。構成的EGFP+hESC株(WA-09;継代35~60回)を、報告されている通り発生させた24。hiPSCを誘導するために、線維芽細胞を、Michael Sheldon(ラトガース大学)によって寄贈により共有されているプロトコールに従って皮膚パンチ生検を消化することによって調製した。簡潔には、皮膚パンチを、DMEM+10%FBS中コラゲナーゼ(1%)およびディスパーゼ(1単位/ml)の混合物で、組織培養インキュベーター中37℃で16~18時間消化させた。消化後、上皮層を廃棄し、部分的に消化された皮膚層を、乾燥組織培養皿の表面上で四等分し、撹乱されないように2~5分間静置して、皿への接着を促した。皮膚層が剥離しないように、DMEM+10%FBSを、ウェルに注意深く添加した。コンフルエント病巣がウェルの約2/3を覆うまで、培養物を3日おきに栄養補給した。コンフルエントに達したら、培養物をトリプシン処理によって継代し、再プログラミングの前に4~5回継代するために拡張した。人工多能性幹細胞を、オリジナルのCytoTune iPS再プログラミングキット(Life Technologies、A1378002)を使用して、製造業者のプロトコールをいくつか修正して使用して生成した。1mMのバルプロ酸(EMD Millipore)を含有するヒトES培地を2~9日目に添加した。2~3週間後、個々のiPSクローンを採取し、iPS株として繁殖させた。所与の個体からの3つのiPSサブコロニーのそれぞれが、本当に非クローン性であったかを検証するために、3つの別個の形質導入から誘導された3つの異なるウェルからコロニーを選択した。各株を10回の継代で繁殖させた後、品質管理アッセイを実施した。先に、OCT4、NANOG、SSEA-3、SSEA-4およびTra-1-81の発現を確認した。すべての多能性マーカーを発現したクローンは、MSKCCのMolecular Cytogenetics Core Facilityによって、正常な核型を有することが検証された。10回の継代後に存在しているSendaiベクターの量を、TaqMan iPSC Sendai検出キット(Life Technologies A13640)を使用して定量し、0.01%未満のSendaiウイルスアンプリコン(Mr04269880_mr)を有するクローンだけを使用した。
hESC株およびhiPSC株の発生
hESC(WA-09、継代32~60回)を、WiCellから得、継代60回まで維持した。hESC SOX10::GFP細菌人工染色体レポーター株(WA-09;継代40~70回)を、既に報告されている通り発生させた7。構成的EGFP+hESC株(WA-09;継代35~60回)を、報告されている通り発生させた24。hiPSCを誘導するために、線維芽細胞を、Michael Sheldon(ラトガース大学)によって寄贈により共有されているプロトコールに従って皮膚パンチ生検を消化することによって調製した。簡潔には、皮膚パンチを、DMEM+10%FBS中コラゲナーゼ(1%)およびディスパーゼ(1単位/ml)の混合物で、組織培養インキュベーター中37℃で16~18時間消化させた。消化後、上皮層を廃棄し、部分的に消化された皮膚層を、乾燥組織培養皿の表面上で四等分し、撹乱されないように2~5分間静置して、皿への接着を促した。皮膚層が剥離しないように、DMEM+10%FBSを、ウェルに注意深く添加した。コンフルエント病巣がウェルの約2/3を覆うまで、培養物を3日おきに栄養補給した。コンフルエントに達したら、培養物をトリプシン処理によって継代し、再プログラミングの前に4~5回継代するために拡張した。人工多能性幹細胞を、オリジナルのCytoTune iPS再プログラミングキット(Life Technologies、A1378002)を使用して、製造業者のプロトコールをいくつか修正して使用して生成した。1mMのバルプロ酸(EMD Millipore)を含有するヒトES培地を2~9日目に添加した。2~3週間後、個々のiPSクローンを採取し、iPS株として繁殖させた。所与の個体からの3つのiPSサブコロニーのそれぞれが、本当に非クローン性であったかを検証するために、3つの別個の形質導入から誘導された3つの異なるウェルからコロニーを選択した。各株を10回の継代で繁殖させた後、品質管理アッセイを実施した。先に、OCT4、NANOG、SSEA-3、SSEA-4およびTra-1-81の発現を確認した。すべての多能性マーカーを発現したクローンは、MSKCCのMolecular Cytogenetics Core Facilityによって、正常な核型を有することが検証された。10回の継代後に存在しているSendaiベクターの量を、TaqMan iPSC Sendai検出キット(Life Technologies A13640)を使用して定量し、0.01%未満のSendaiウイルスアンプリコン(Mr04269880_mr)を有するクローンだけを使用した。
PAX6::H2B-GFPおよびSIX1::H2B-GFP株の発生(継代40~65回)
PAX6-P2A-H2B-GFPおよびSIX1-P2A-H2B-GFPドナー構築物を、pUC19骨格へのIn-Fusionクローニング(Clontech)を実施することによって発生させた。相同性アームを、ゲノムDNAを使用することによって発生させ、H2B:GFPは、Geoff Wahl(Addgene、プラスミド番号11680)から寄贈されたものであり、Pgk-Puroは、AAVS1 hPgk-PuroR-pAドナープラスミド(Rudolf Jaenischからの寄贈(Addgene、プラスミド番号22072))から増幅させた。TALEヌクレアーゼは、Addgeneによって提供されたTALE-Toolboxを使用して発生させた25。Pax6の終止コドンを標的化する配列は、TGTCCTGTATTGTACCACTおよびTGTATACAAAGGTCCTTGTであり、Six1については、TCTCTGCTCGGCCCCCTCAおよびTTGGGGTCCTAAGTGGGGAであった。簡潔には、ドナープラスミド25μgおよび各TALEN5μgを、10×106個のH9 hESCにヌクレオフェクション処理した(nucleofected)。ヌクレオフェクションの72時間後に、ピューロマイシン選択を適用して、抵抗性クローンを単離した。クローンを増幅し、標的化を確認するゲノムPCRを実施した。使用したすべての陽性クローンは、正常な核型を有していた。
PAX6-P2A-H2B-GFPおよびSIX1-P2A-H2B-GFPドナー構築物を、pUC19骨格へのIn-Fusionクローニング(Clontech)を実施することによって発生させた。相同性アームを、ゲノムDNAを使用することによって発生させ、H2B:GFPは、Geoff Wahl(Addgene、プラスミド番号11680)から寄贈されたものであり、Pgk-Puroは、AAVS1 hPgk-PuroR-pAドナープラスミド(Rudolf Jaenischからの寄贈(Addgene、プラスミド番号22072))から増幅させた。TALEヌクレアーゼは、Addgeneによって提供されたTALE-Toolboxを使用して発生させた25。Pax6の終止コドンを標的化する配列は、TGTCCTGTATTGTACCACTおよびTGTATACAAAGGTCCTTGTであり、Six1については、TCTCTGCTCGGCCCCCTCAおよびTTGGGGTCCTAAGTGGGGAであった。簡潔には、ドナープラスミド25μgおよび各TALEN5μgを、10×106個のH9 hESCにヌクレオフェクション処理した(nucleofected)。ヌクレオフェクションの72時間後に、ピューロマイシン選択を適用して、抵抗性クローンを単離した。クローンを増幅し、標的化を確認するゲノムPCRを実施した。使用したすべての陽性クローンは、正常な核型を有していた。
遺伝子導入CUX2条件的レポーター株の発生
CUX2::CreERT2/AAVS1-CAG::FLEX/tdTomato株を、2つの逐次的なヌクレオフェクションおよび選択サイクルによって、RUES2バックグラウンドで創出した。1回目は、CUX2::CreERT2/FRT-Puro-FRT-TK相同性ドナー2μgを、CUX2開始コドンを標的化するTALENと一緒に、2×106個の初期継代hESCに電気穿孔した(図18)。Amaxaヌクレオフェクター溶液L(Lonza)を使用して、ヌクレオフェクションを行った。Accutase(Innovative Cell Technology)で培養物を処理することによって単細胞を得、それらの細胞を、3日間のヌクレオフェクション後にROCK-阻害剤Y-27632(10μM;Tocris)で維持した。その後、ヌクレオフェクション処理した細胞を、最初の10日間維持したピューロマイシン選択培地で2週間成長させた。無作為統合の陰性選択のために、ガンシクロビル(2μM)も添加した。2週間後、PCR遺伝子型解析、シークエンシング、および核型分析によってさらに特徴付けるために、22のクローンを選択した。あらゆる基準を満たした1つのクローンを拡張し、AAVS1 CAG::FLEX tdTomato/BSD相同性ドナー2μg、AAVS1右および左TALEN(Addgene)それぞれ0.5μg、ならびにpCAG-Flpe(Addgene)2μgを用いて2回目のヌクレオフェクションに晒した。Flpリコンビナーゼを添加して、CUX2遺伝子座の導入遺伝子からFRT-Puro-FRTカセットを切除した。次に、ヌクレオフェクション処理した細胞を、ブラストサイジン選択下で2週間成長させた。その後、PCR遺伝子型解析のために12のクローンを拡張し、FRT-Puro-FRTカセットの切除について確認した。導入遺伝子を担持することが見出されたクローンの中から1つのクローンを核型分析し、さらなる実験のために選択した。遺伝子型解析のために使用したプライマーのリストは、図20に提供されている。
CUX2::CreERT2/AAVS1-CAG::FLEX/tdTomato株を、2つの逐次的なヌクレオフェクションおよび選択サイクルによって、RUES2バックグラウンドで創出した。1回目は、CUX2::CreERT2/FRT-Puro-FRT-TK相同性ドナー2μgを、CUX2開始コドンを標的化するTALENと一緒に、2×106個の初期継代hESCに電気穿孔した(図18)。Amaxaヌクレオフェクター溶液L(Lonza)を使用して、ヌクレオフェクションを行った。Accutase(Innovative Cell Technology)で培養物を処理することによって単細胞を得、それらの細胞を、3日間のヌクレオフェクション後にROCK-阻害剤Y-27632(10μM;Tocris)で維持した。その後、ヌクレオフェクション処理した細胞を、最初の10日間維持したピューロマイシン選択培地で2週間成長させた。無作為統合の陰性選択のために、ガンシクロビル(2μM)も添加した。2週間後、PCR遺伝子型解析、シークエンシング、および核型分析によってさらに特徴付けるために、22のクローンを選択した。あらゆる基準を満たした1つのクローンを拡張し、AAVS1 CAG::FLEX tdTomato/BSD相同性ドナー2μg、AAVS1右および左TALEN(Addgene)それぞれ0.5μg、ならびにpCAG-Flpe(Addgene)2μgを用いて2回目のヌクレオフェクションに晒した。Flpリコンビナーゼを添加して、CUX2遺伝子座の導入遺伝子からFRT-Puro-FRTカセットを切除した。次に、ヌクレオフェクション処理した細胞を、ブラストサイジン選択下で2週間成長させた。その後、PCR遺伝子型解析のために12のクローンを拡張し、FRT-Puro-FRTカセットの切除について確認した。導入遺伝子を担持することが見出されたクローンの中から1つのクローンを核型分析し、さらなる実験のために選択した。遺伝子型解析のために使用したプライマーのリストは、図20に提供されている。
未分化細胞の培養およびニューロン誘導(分化0~13日目)
hPSC株を、ゼラチンでコーティングした組織培養プレート上に細胞16,000個/cm2で予めプレーティングしたマウス胚線維芽細胞(MEF;Globalstem)と共に維持した。培地は、DMEM/F12、20%(v/v)ノックアウト血清置換、1mMのL-グルタミン、100μMのMEM非必須アミノ酸および0.1mMのβ-メルカプトエタノール(Life Technologies)を含有していた。無菌濾過後に10ng/mlのFGF2(R&D Systems)を添加した。細胞を毎日栄養補給し、6U/mlのディスパーゼを使用して毎週継代した。神経分化のために、Accutaseを用いて細胞を解離させ、マトリゲルでコーティングしたプレート上に10μMのY-27632を補充して、細胞200,000個/cm2の密度で、報告されている通り1予めプレーティングし、コンフルエントの翌日に分化を開始させた。ノックアウトDMEM820ml、ノックアウト血清置換150ml、1mMのL-グルタミン、100μMのMEM非必須アミノ酸および0.1mMのβ-メルカプトエタノールを含有するKSR培地を使用して、分化を開始させた。LSB+X/P/S/D誘導で使用した阻害剤には、LDN193189(250nM;Stemgent)、SB431542(10μM;Tocris)、XAV939(5μM;Tocris)、PD0325901(P1S5D中1μM、P8S10D中8μM;Tocris)、SU5402(P1S5D中5μM、P8S10D中10μM;Biovision)、DAPT(10μM;Tocris)が含まれていた。論文に記載されている他の誘導で使用されたさらなる阻害剤には、CHIR99021(LSBC中6μM、LSB+C/S/D中3μM;Stemgent)が含まれる。B27補充物を含むN2培地1(N2/B27;Life Technologies)を、8日目のBDNF(20ng/ml;R&D)、ジブチリルcAMP(0.5mM;Sigma-Aldrich)およびアスコルビン酸(0.2mM;Sigma-Aldrich)(BCA)で補充した100%neurobasal/B27/L-Glu含有培地(NB/B27;Life Technologies)に達するまで、4日目から1日おきに増分1/3で増大して添加した。P1S5DおよびP8S10D分化スキームの概要(分化0~13日目)は、図21に示される詳細な毎日の栄養補給の指示と共に、図2Aに提示されており、0~13日目のP1S5DおよびP8S10D誘導の段階的プロトコール、ならびに13日目を超える長期間培養について以下に説明される通りである。本発明者らは、13日目までのニューロン収率の一貫した結果をもたらした3つの異なるロットのKSRを試験した。
hPSC株を、ゼラチンでコーティングした組織培養プレート上に細胞16,000個/cm2で予めプレーティングしたマウス胚線維芽細胞(MEF;Globalstem)と共に維持した。培地は、DMEM/F12、20%(v/v)ノックアウト血清置換、1mMのL-グルタミン、100μMのMEM非必須アミノ酸および0.1mMのβ-メルカプトエタノール(Life Technologies)を含有していた。無菌濾過後に10ng/mlのFGF2(R&D Systems)を添加した。細胞を毎日栄養補給し、6U/mlのディスパーゼを使用して毎週継代した。神経分化のために、Accutaseを用いて細胞を解離させ、マトリゲルでコーティングしたプレート上に10μMのY-27632を補充して、細胞200,000個/cm2の密度で、報告されている通り1予めプレーティングし、コンフルエントの翌日に分化を開始させた。ノックアウトDMEM820ml、ノックアウト血清置換150ml、1mMのL-グルタミン、100μMのMEM非必須アミノ酸および0.1mMのβ-メルカプトエタノールを含有するKSR培地を使用して、分化を開始させた。LSB+X/P/S/D誘導で使用した阻害剤には、LDN193189(250nM;Stemgent)、SB431542(10μM;Tocris)、XAV939(5μM;Tocris)、PD0325901(P1S5D中1μM、P8S10D中8μM;Tocris)、SU5402(P1S5D中5μM、P8S10D中10μM;Biovision)、DAPT(10μM;Tocris)が含まれていた。論文に記載されている他の誘導で使用されたさらなる阻害剤には、CHIR99021(LSBC中6μM、LSB+C/S/D中3μM;Stemgent)が含まれる。B27補充物を含むN2培地1(N2/B27;Life Technologies)を、8日目のBDNF(20ng/ml;R&D)、ジブチリルcAMP(0.5mM;Sigma-Aldrich)およびアスコルビン酸(0.2mM;Sigma-Aldrich)(BCA)で補充した100%neurobasal/B27/L-Glu含有培地(NB/B27;Life Technologies)に達するまで、4日目から1日おきに増分1/3で増大して添加した。P1S5DおよびP8S10D分化スキームの概要(分化0~13日目)は、図21に示される詳細な毎日の栄養補給の指示と共に、図2Aに提示されており、0~13日目のP1S5DおよびP8S10D誘導の段階的プロトコール、ならびに13日目を超える長期間培養について以下に説明される通りである。本発明者らは、13日目までのニューロン収率の一貫した結果をもたらした3つの異なるロットのKSRを試験した。
0~13日目のP1S5DおよびP8S10D誘導の段階的プロトコール、ならびに13日目を超える長期間培養
1.組織培養皿をマトリゲル(354234;BD)でコーティングする:DMEM/F12で1:30希釈し、組織培養皿に適用する。室温に2時間置く。
2.細胞を剥離する:細胞培養物をPBSで1回洗浄し、ほとんどの細胞が剥離されるまで、Accutaseを用いて37℃で0.5~1時間解離する。
3.細胞を洗浄した後、Y-27632(10μM)で補充したhESC培地に再懸濁し、ゼラチンでコーティングしたプレート上に37℃で1時間プレーティングして、MEFを除去する。
4.細胞懸濁液を収集する。洗浄した後、細胞をY-27632およびFGF2(10ng/ml)で補充したMEF条件培地(完全にコンフルエントなMEF培養物から収集した条件hESC培地)に、細胞200,000個/cm2でプレーティングする。
5.翌日に分化を開始させる(0日目)。ノックアウトDMEM820ml、ノックアウト血清置換150ml、1mMのL-グルタミン、100μMのMEM非必須アミノ酸および0.1mMのβ-メルカプトエタノール(Life Technologies)を含有するKSR培地を使用して、分化を開始させた。P1S5DおよびP8S10D誘導で使用した阻害剤には、LDN193189(250nM;Stemgent)、SB431542(10μM;Tocris)、XAV939(5μM;Tocris)、PD0325901(P1S5D中1μM、P8S10D中8μM;Tocris)、SU5402(P1S5D中5μM、P8S10D中10μM;Biovision)、DAPT(10μM;Tocris)が含まれる。LSB+Xを0~6日目に添加し、P/S/Dを2~13日目に添加した。
6.B27補充物を含むN2培地1(N2/B27;Life Technologies)を、4日目から1日おきに増分1/3で増大して添加した:4日目および5日目については、1/3のN2/B27、6日目および7日目については、2/3のN2/B27。8日目から、培地を、B27(NB/B27)、BDNF(20ng/ml;R&D)、cAMP(0.5mM;Sigma-Aldrich)およびアスコルビン酸(0.2mM;Sigma-Aldrich)(BCA)で補充したneurobasalに切り替える。P1S5DおよびP8S10D分化スキームの概要(0~13日目)は、図2Aに提示されている。
7.深層および上層ニューロンの発生のための13日目を超える長期間培養については、細胞を、ステップ1~6に記載される通り予めプレーティングし、8日目まで分化させ、次にPO/ラミニン/フィブロネクチンでコーティングした皿上で継代した。これらの皿を、PBSで希釈したポリオルニチン(PO;15μg/ml;Sigma-Aldrich)によって、37℃で24時間処理した。皿を、PBSで洗浄した後、PBSで希釈したマウスラミニンI(1μg/ml;R&D System)およびフィブロネクチン(2μg/ml;Sigma-Aldrich)で、37℃で12時間さらに処理した。ラミニンおよびフィブロネクチンは、使用直前に除去した。
8.8日目の細胞を、Accutaseを用いて37℃で0.5~1時間解離させた。細胞を洗浄した後、PO/ラミニン/フィブロネクチンでコーティングした皿上に、それぞれNB/B27+BCA中細胞150,000個/cm2(P1S5D群)または細胞300,000個/cm2(P8S10D群)でプレーティングした。
9.培地を3~4日おきに変え、ニューロンのより良好な付着のために、1μg/mlのラミニンを毎週添加した。
10.次に細胞を、電気生理学的記録、免疫組織化学的検査、およびRNA抽出のために、様々なin vitro時点で査定した。
11.毎日の栄養補給の指示の概要については、図21を参照されたい。
1.組織培養皿をマトリゲル(354234;BD)でコーティングする:DMEM/F12で1:30希釈し、組織培養皿に適用する。室温に2時間置く。
2.細胞を剥離する:細胞培養物をPBSで1回洗浄し、ほとんどの細胞が剥離されるまで、Accutaseを用いて37℃で0.5~1時間解離する。
3.細胞を洗浄した後、Y-27632(10μM)で補充したhESC培地に再懸濁し、ゼラチンでコーティングしたプレート上に37℃で1時間プレーティングして、MEFを除去する。
4.細胞懸濁液を収集する。洗浄した後、細胞をY-27632およびFGF2(10ng/ml)で補充したMEF条件培地(完全にコンフルエントなMEF培養物から収集した条件hESC培地)に、細胞200,000個/cm2でプレーティングする。
5.翌日に分化を開始させる(0日目)。ノックアウトDMEM820ml、ノックアウト血清置換150ml、1mMのL-グルタミン、100μMのMEM非必須アミノ酸および0.1mMのβ-メルカプトエタノール(Life Technologies)を含有するKSR培地を使用して、分化を開始させた。P1S5DおよびP8S10D誘導で使用した阻害剤には、LDN193189(250nM;Stemgent)、SB431542(10μM;Tocris)、XAV939(5μM;Tocris)、PD0325901(P1S5D中1μM、P8S10D中8μM;Tocris)、SU5402(P1S5D中5μM、P8S10D中10μM;Biovision)、DAPT(10μM;Tocris)が含まれる。LSB+Xを0~6日目に添加し、P/S/Dを2~13日目に添加した。
6.B27補充物を含むN2培地1(N2/B27;Life Technologies)を、4日目から1日おきに増分1/3で増大して添加した:4日目および5日目については、1/3のN2/B27、6日目および7日目については、2/3のN2/B27。8日目から、培地を、B27(NB/B27)、BDNF(20ng/ml;R&D)、cAMP(0.5mM;Sigma-Aldrich)およびアスコルビン酸(0.2mM;Sigma-Aldrich)(BCA)で補充したneurobasalに切り替える。P1S5DおよびP8S10D分化スキームの概要(0~13日目)は、図2Aに提示されている。
7.深層および上層ニューロンの発生のための13日目を超える長期間培養については、細胞を、ステップ1~6に記載される通り予めプレーティングし、8日目まで分化させ、次にPO/ラミニン/フィブロネクチンでコーティングした皿上で継代した。これらの皿を、PBSで希釈したポリオルニチン(PO;15μg/ml;Sigma-Aldrich)によって、37℃で24時間処理した。皿を、PBSで洗浄した後、PBSで希釈したマウスラミニンI(1μg/ml;R&D System)およびフィブロネクチン(2μg/ml;Sigma-Aldrich)で、37℃で12時間さらに処理した。ラミニンおよびフィブロネクチンは、使用直前に除去した。
8.8日目の細胞を、Accutaseを用いて37℃で0.5~1時間解離させた。細胞を洗浄した後、PO/ラミニン/フィブロネクチンでコーティングした皿上に、それぞれNB/B27+BCA中細胞150,000個/cm2(P1S5D群)または細胞300,000個/cm2(P8S10D群)でプレーティングした。
9.培地を3~4日おきに変え、ニューロンのより良好な付着のために、1μg/mlのラミニンを毎週添加した。
10.次に細胞を、電気生理学的記録、免疫組織化学的検査、およびRNA抽出のために、様々なin vitro時点で査定した。
11.毎日の栄養補給の指示の概要については、図21を参照されたい。
Essential 6(商標)培地(E6)での急速なニューロン分化
hPSC株(WA-09)を、Essential 8(商標)培地(補充物E8を含む)中、ビトロネクチン(VTN-N;ThermoFisher Scientific)でコーティングした培養プレート内で維持した。細胞を毎日栄養補給し、EDTA溶液を用いて5日おきに継代した。神経誘導のために細胞を解離し、KSRベースの誘導について記載されるものと同じやり方で、E8に予めプレーティングした。細胞がコンフルエントになった翌日に、分化を開始させた。E6でのLSB+X誘導に使用した阻害剤には、10日間の処置についてはLDN193189(100nM)およびSB431542(10μM)が含まれ、3日間の処置についてはXAV939(2μM)が含まれていた。最初の10日間については、E6を使用し、10日目からはN2/B27に切り替えた。誘導を加速するために、細胞を、E6中前述の濃度のLSB+Xで、0日目から3日間処理した。次に3日目から、LDN193189(50nM)、SB431542(5μM)、XAV939(1μM)、PD0325901(0.4μM)、SU5402(2μM)およびDAPT(5μM)をE6に添加した。N2/B27培地を、増分1/3で5日目から1日おきにE6に添加した。N2/B27の阻害剤には、KSR/N2ベースの誘導のP1S5Dと同じ濃度のLSB+X+P/S/Dが含まれる。LSB+Xは、7日目に取り除かれるが、P/S/Dは残存する。9日目から、100%NB/B27+BCAを使用した。NB/B27で使用した阻害剤には、PD0325901(1μM)、SU5402(5μM)およびDAPT(10μM)が含まれる。E6での加速分化スキームの概要(分化0~13日目)は、図3Kに提示されている。
hPSC株(WA-09)を、Essential 8(商標)培地(補充物E8を含む)中、ビトロネクチン(VTN-N;ThermoFisher Scientific)でコーティングした培養プレート内で維持した。細胞を毎日栄養補給し、EDTA溶液を用いて5日おきに継代した。神経誘導のために細胞を解離し、KSRベースの誘導について記載されるものと同じやり方で、E8に予めプレーティングした。細胞がコンフルエントになった翌日に、分化を開始させた。E6でのLSB+X誘導に使用した阻害剤には、10日間の処置についてはLDN193189(100nM)およびSB431542(10μM)が含まれ、3日間の処置についてはXAV939(2μM)が含まれていた。最初の10日間については、E6を使用し、10日目からはN2/B27に切り替えた。誘導を加速するために、細胞を、E6中前述の濃度のLSB+Xで、0日目から3日間処理した。次に3日目から、LDN193189(50nM)、SB431542(5μM)、XAV939(1μM)、PD0325901(0.4μM)、SU5402(2μM)およびDAPT(5μM)をE6に添加した。N2/B27培地を、増分1/3で5日目から1日おきにE6に添加した。N2/B27の阻害剤には、KSR/N2ベースの誘導のP1S5Dと同じ濃度のLSB+X+P/S/Dが含まれる。LSB+Xは、7日目に取り除かれるが、P/S/Dは残存する。9日目から、100%NB/B27+BCAを使用した。NB/B27で使用した阻害剤には、PD0325901(1μM)、SU5402(5μM)およびDAPT(10μM)が含まれる。E6での加速分化スキームの概要(分化0~13日目)は、図3Kに提示されている。
深層および上層ニューロンの発生のための13日目を超える長期間培養
深層および上層皮質ニューロンの発生のための長期間培養プロトコールは、図21に提示される詳細な毎日の栄養補給の指示と共に、図3Fに模式的に示されている。hPSCを、図2Aに記載される通り、0日目からP1S5DまたはP8S10Dによって誘導し、分化8日目に、Accutase媒介性解離によって37℃で0.5~1時間継代した。細胞を、予めコーティングした培養皿上に、P1S5D群またはP8S10D群についてそれぞれ細胞150,000個/cm2または細胞300,000個/cm2で再びプレーティングした。皿を予めコーティングするために、PBSで希釈したポリオルニチン(PO;15μg/ml;Sigma-Aldrich)に37℃で24時間曝露し、PBSで3回洗浄した後、培養皿を、PBSで希釈したマウスラミニンI(1μg/ml;R&D System)およびフィブロネクチン(2μg/ml;Sigma-Aldrich)で、37℃で12時間さらに処理した。ラミニンおよびフィブロネクチンは、使用直前に除去した。継代および長期間培養の両方のために使用した培地は、前述の通りNB/B27+BCAであった。培地を3~4日おきに変え、ニューロンの付着を維持するために、1μg/mlのラミニンを毎週添加した。次に細胞を、電気生理学的記録、免疫組織化学的検査、およびRNA抽出のために、様々なin vitro時点で査定した。図8に示される結果については、継代したP8S10D細胞を、マウス星状膠細胞と共に、または星状膠細胞条件培地の存在下で共培養した。それらの研究のための星状膠細胞の単離および維持は、既に記載されている通りに行った31。条件培地の収集のために、星状膠細胞にNB/B27+BCAを補給し、条件培地を2~3日おきに収集した。次に、条件培地を、0.22μm膜孔真空フィルタ(Corning)を介して濾過して、細胞の汚染を取り除いた。
深層および上層皮質ニューロンの発生のための長期間培養プロトコールは、図21に提示される詳細な毎日の栄養補給の指示と共に、図3Fに模式的に示されている。hPSCを、図2Aに記載される通り、0日目からP1S5DまたはP8S10Dによって誘導し、分化8日目に、Accutase媒介性解離によって37℃で0.5~1時間継代した。細胞を、予めコーティングした培養皿上に、P1S5D群またはP8S10D群についてそれぞれ細胞150,000個/cm2または細胞300,000個/cm2で再びプレーティングした。皿を予めコーティングするために、PBSで希釈したポリオルニチン(PO;15μg/ml;Sigma-Aldrich)に37℃で24時間曝露し、PBSで3回洗浄した後、培養皿を、PBSで希釈したマウスラミニンI(1μg/ml;R&D System)およびフィブロネクチン(2μg/ml;Sigma-Aldrich)で、37℃で12時間さらに処理した。ラミニンおよびフィブロネクチンは、使用直前に除去した。継代および長期間培養の両方のために使用した培地は、前述の通りNB/B27+BCAであった。培地を3~4日おきに変え、ニューロンの付着を維持するために、1μg/mlのラミニンを毎週添加した。次に細胞を、電気生理学的記録、免疫組織化学的検査、およびRNA抽出のために、様々なin vitro時点で査定した。図8に示される結果については、継代したP8S10D細胞を、マウス星状膠細胞と共に、または星状膠細胞条件培地の存在下で共培養した。それらの研究のための星状膠細胞の単離および維持は、既に記載されている通りに行った31。条件培地の収集のために、星状膠細胞にNB/B27+BCAを補給し、条件培地を2~3日おきに収集した。次に、条件培地を、0.22μm膜孔真空フィルタ(Corning)を介して濾過して、細胞の汚染を取り除いた。
細胞のEdU標識および定量
EdUを、それぞれ分化の様々な時点(8日目、13日目、18日目、23日目、28日目、33日目)で開始して、48時間窓で培養物に5μMで添加し、細胞を、40日目に4%パラホルムアルデヒドで20分間固定した。EdUを、製造業者の指定に従って、Click-iT EdU画像化キット(Invitrogen)を用いて検出した。EdU標識実験におけるEdU陽性および皮質層マーカー陽性ニューロンの定量、ならびに長期間培養におけるマーカー陽性ニューロンおよび全細胞の定量は、核定量のためのITCNプラグインを含むImageJを、手動計数と組み合わせて使用して行った。2つの独立な細胞培養バッチからの6つの一様無作為に選択された画像フレームを、20倍の対物レンズを使用して捕え、定量のために使用した。同時標識分析(EdU、皮質層マーカー)について適切に解析できなかったクラスターを含有するエリアは、回避した。pH3および切断型カスパーゼ3陽性細胞の定量も、ITCNプラグインを含むImageJを使用して行った。培養プレートごとに、4つの一様無作為に選択された画像フレームを、10倍の対物レンズを使用して捕え、2つの独立な細胞培養バッチから定量するために使用した。すべての定量の結果を、Prism(バージョン6.0、GraphPad)でプロットした。
EdUを、それぞれ分化の様々な時点(8日目、13日目、18日目、23日目、28日目、33日目)で開始して、48時間窓で培養物に5μMで添加し、細胞を、40日目に4%パラホルムアルデヒドで20分間固定した。EdUを、製造業者の指定に従って、Click-iT EdU画像化キット(Invitrogen)を用いて検出した。EdU標識実験におけるEdU陽性および皮質層マーカー陽性ニューロンの定量、ならびに長期間培養におけるマーカー陽性ニューロンおよび全細胞の定量は、核定量のためのITCNプラグインを含むImageJを、手動計数と組み合わせて使用して行った。2つの独立な細胞培養バッチからの6つの一様無作為に選択された画像フレームを、20倍の対物レンズを使用して捕え、定量のために使用した。同時標識分析(EdU、皮質層マーカー)について適切に解析できなかったクラスターを含有するエリアは、回避した。pH3および切断型カスパーゼ3陽性細胞の定量も、ITCNプラグインを含むImageJを使用して行った。培養プレートごとに、4つの一様無作為に選択された画像フレームを、10倍の対物レンズを使用して捕え、2つの独立な細胞培養バッチから定量するために使用した。すべての定量の結果を、Prism(バージョン6.0、GraphPad)でプロットした。
RNA抽出およびqRT-PCR
細胞を、Trizol試薬(Life Technology)で溶解し、-20℃で保存した。全RNAを、フェノール/クロロホルムおよびイソプロパノール沈殿を使用して抽出し、ddH2Oに溶解させた。cDNAを、QuantiTech逆転写キット(Qiagen)を使用して生成した。定量的RT-PCRを、Mastercycler
Realplex2(Eppendorf)を使用して実施し、GAPDHを標準化のためのハウスキーピング遺伝子対照として使用した。デルタデルタCtおよび倍率変化を算出し、結果をPrism(バージョン6.0、GraphPad)でプロットした。
細胞を、Trizol試薬(Life Technology)で溶解し、-20℃で保存した。全RNAを、フェノール/クロロホルムおよびイソプロパノール沈殿を使用して抽出し、ddH2Oに溶解させた。cDNAを、QuantiTech逆転写キット(Qiagen)を使用して生成した。定量的RT-PCRを、Mastercycler
Realplex2(Eppendorf)を使用して実施し、GAPDHを標準化のためのハウスキーピング遺伝子対照として使用した。デルタデルタCtおよび倍率変化を算出し、結果をPrism(バージョン6.0、GraphPad)でプロットした。
免疫細胞化学
細胞を、4%(v/v)パラホルムアルデヒドで20分間固定し、PBSで洗浄し、透過処理し、PBS中0.3%(v/v)Triton X-100と1%(w/v)BSAを使用して1時間ブロックした。免疫細胞化学のために、細胞を、同じブロッキング緩衝液で希釈した一次抗体と共に4℃で一晩インキュベートした。この研究で使用した一次抗体のリストは、表1に提供されている。数回洗浄した後、細胞を、ブロッキング緩衝液で希釈した適切なAlexaFluor二次抗体(1:500;Molecular Probes)およびDAPI(1:1000;Thermo Fisher)と共に室温で1時間インキュベートした。洗浄した後、細胞を、Olympus IX71顕微鏡によって、Hamamatsu ORCA CCDカメラを使用して画像を撮影した。in
vivo研究の組織学的分析のために、固定した脳を、ビブラトーム(Leica VT1200S)を使用して厚さ60μmスライスの薄片にし、その後、0.02%NaN3を含むPBS中で1週間まで保存した。免疫細胞化学のために、スライスを透過処理し、PBS中0.3%Triton X-100と1%BSAを使用して2時間ブロックし、同じブロッキング緩衝液で希釈した一次抗体と共に4℃で3~5日間インキュベートした。二次抗体染色を、細胞に対して同様に実施した。前述と同じ設定のOlympus IX81顕微鏡、またはZ-シリーズによる2μmでの共焦点レーザー走査顕微鏡(Olympus FV1000)のいずれかによって、画像を獲得した。共焦点画像を、浸水レンズ(10倍および40倍)で撮影し、FluoView(Olympus)およびPhotoshop(Adobe Systems)を使用して分析した。
細胞を、4%(v/v)パラホルムアルデヒドで20分間固定し、PBSで洗浄し、透過処理し、PBS中0.3%(v/v)Triton X-100と1%(w/v)BSAを使用して1時間ブロックした。免疫細胞化学のために、細胞を、同じブロッキング緩衝液で希釈した一次抗体と共に4℃で一晩インキュベートした。この研究で使用した一次抗体のリストは、表1に提供されている。数回洗浄した後、細胞を、ブロッキング緩衝液で希釈した適切なAlexaFluor二次抗体(1:500;Molecular Probes)およびDAPI(1:1000;Thermo Fisher)と共に室温で1時間インキュベートした。洗浄した後、細胞を、Olympus IX71顕微鏡によって、Hamamatsu ORCA CCDカメラを使用して画像を撮影した。in
vivo研究の組織学的分析のために、固定した脳を、ビブラトーム(Leica VT1200S)を使用して厚さ60μmスライスの薄片にし、その後、0.02%NaN3を含むPBS中で1週間まで保存した。免疫細胞化学のために、スライスを透過処理し、PBS中0.3%Triton X-100と1%BSAを使用して2時間ブロックし、同じブロッキング緩衝液で希釈した一次抗体と共に4℃で3~5日間インキュベートした。二次抗体染色を、細胞に対して同様に実施した。前述と同じ設定のOlympus IX81顕微鏡、またはZ-シリーズによる2μmでの共焦点レーザー走査顕微鏡(Olympus FV1000)のいずれかによって、画像を獲得した。共焦点画像を、浸水レンズ(10倍および40倍)で撮影し、FluoView(Olympus)およびPhotoshop(Adobe Systems)を使用して分析した。
iDISCO全脳免疫蛍光および画像化
脳を、最新のオンラインプロトコール(http://idisco.info、2015年1月バージョン)に記載されている修正を加えて、iDISCOプロトコールに記載されている通り処理した18。使用した一次抗体は、ニワトリ抗GFP(1:1000;Aves GFP-1020)、およびマウス抗hシナプトフィジン(1:1000;Enzo Life Science)であった。使用した二次抗体は、ロバ抗ニワトリ-Alexa647(1:1000;Jackson Immunoresearch)およびロバ抗マウス-Alexa568(1:1000;Life Technologies)であった。透明化試料を、sCMOSカメラ(Andor Neo)を備えたライトシート顕微鏡(Ultramicroscope II、LaVision Biotec)および作動距離6mmの浸漬キャップを備えた2倍/0.5対物レンズで画像化した。
脳を、最新のオンラインプロトコール(http://idisco.info、2015年1月バージョン)に記載されている修正を加えて、iDISCOプロトコールに記載されている通り処理した18。使用した一次抗体は、ニワトリ抗GFP(1:1000;Aves GFP-1020)、およびマウス抗hシナプトフィジン(1:1000;Enzo Life Science)であった。使用した二次抗体は、ロバ抗ニワトリ-Alexa647(1:1000;Jackson Immunoresearch)およびロバ抗マウス-Alexa568(1:1000;Life Technologies)であった。透明化試料を、sCMOSカメラ(Andor Neo)を備えたライトシート顕微鏡(Ultramicroscope II、LaVision Biotec)および作動距離6mmの浸漬キャップを備えた2倍/0.5対物レンズで画像化した。
フローサイトメトリー
細胞を、Accutaseを用いて37℃で30分間~1時間解離させた。洗浄した後、細胞を、ヨウ化プロピジウム(2μg/ml)を含む1倍のPBSに再懸濁し、FACScaliburプラットフォーム(BD Biosciences)によって保存した。GFP+%を、ヨウ化プロピジウム陰性集団内で決定した。細胞内フローサイトメトリーのために、細胞を解離させ、洗浄し、4%(v/v)パラホルムアルデヒドで20分間固定した。次に、固定した細胞を透過処理し、製造業者の指示書に従って、1倍のBD Perm/洗浄緩衝液(BD Biosciences)を使用して染色した。使用したフローサイトメトリーのためのコンジュゲート一次抗体は、Nestin-Alexa647(1:50;BD Pharmingen、番号560341)およびTUJ1-Alexa488(1:50;BD Pharmingen、番号560338)であった。細胞を、FACScaliburを使用して分類した。結果を、FlowJo(バージョン7.6)を使用して分析した。
細胞を、Accutaseを用いて37℃で30分間~1時間解離させた。洗浄した後、細胞を、ヨウ化プロピジウム(2μg/ml)を含む1倍のPBSに再懸濁し、FACScaliburプラットフォーム(BD Biosciences)によって保存した。GFP+%を、ヨウ化プロピジウム陰性集団内で決定した。細胞内フローサイトメトリーのために、細胞を解離させ、洗浄し、4%(v/v)パラホルムアルデヒドで20分間固定した。次に、固定した細胞を透過処理し、製造業者の指示書に従って、1倍のBD Perm/洗浄緩衝液(BD Biosciences)を使用して染色した。使用したフローサイトメトリーのためのコンジュゲート一次抗体は、Nestin-Alexa647(1:50;BD Pharmingen、番号560341)およびTUJ1-Alexa488(1:50;BD Pharmingen、番号560338)であった。細胞を、FACScaliburを使用して分類した。結果を、FlowJo(バージョン7.6)を使用して分析した。
電気生理学
細胞を、分化8日目に再びプレーティングし、直径35mmのペトリ皿(Falcon)によりニューロン分化培地中で維持した。16日目、23日目、30日目、37日目および40日目に、電気生理学的処理を、プレインキュベーションと共にDMEM培地(Life Technology)中で37℃において2時間実施した後、記録した。EGFP+グラフト細胞のin vivo記録のために、EGFP+H9誘導細胞を移植したNOD-SCID IL2Rgc-/-マウスを、Avertinで麻酔し、断頭した。脳を除去し、350μmの冠状脳スライスを、Vibratome(Leica Microsystems)により、95%O2および5%CO2を発泡させた、120mMの塩化コリン、26mMのNaHCO3、2.6mMのKCl、1.25mMのNaH2PO4、7mMのMgSO4、0.5mMのCaCl2、1.3mMのアスコルビン酸および15mMのD-グルコースを含有する氷冷した塩化コリンベースの切断用溶液中で薄片を作った。スライスを、95%O2および5%CO2を発泡させた、126mMのNaCl、3mMのKCl、1.2mMのNaH2PO4、1.3mMのMgSO4、2.4mMのCaCl2、26mMのNaHCO3および10mMのD-グルコースを含有する人工脳脊髄液(ACSF)に移し、32℃のインターフェイスチャンバ内に回収して少なくとも1時間置き、次に室温で保持した後、ACSFを含有する34℃の記録用チャンバに移した。
細胞を、分化8日目に再びプレーティングし、直径35mmのペトリ皿(Falcon)によりニューロン分化培地中で維持した。16日目、23日目、30日目、37日目および40日目に、電気生理学的処理を、プレインキュベーションと共にDMEM培地(Life Technology)中で37℃において2時間実施した後、記録した。EGFP+グラフト細胞のin vivo記録のために、EGFP+H9誘導細胞を移植したNOD-SCID IL2Rgc-/-マウスを、Avertinで麻酔し、断頭した。脳を除去し、350μmの冠状脳スライスを、Vibratome(Leica Microsystems)により、95%O2および5%CO2を発泡させた、120mMの塩化コリン、26mMのNaHCO3、2.6mMのKCl、1.25mMのNaH2PO4、7mMのMgSO4、0.5mMのCaCl2、1.3mMのアスコルビン酸および15mMのD-グルコースを含有する氷冷した塩化コリンベースの切断用溶液中で薄片を作った。スライスを、95%O2および5%CO2を発泡させた、126mMのNaCl、3mMのKCl、1.2mMのNaH2PO4、1.3mMのMgSO4、2.4mMのCaCl2、26mMのNaHCO3および10mMのD-グルコースを含有する人工脳脊髄液(ACSF)に移し、32℃のインターフェイスチャンバ内に回収して少なくとも1時間置き、次に室温で保持した後、ACSFを含有する34℃の記録用チャンバに移した。
落射蛍光照明、CCDカメラ、および2つの浸水レンズ(10倍および60倍)を備えた赤外DIC顕微鏡(Olympus BX51)を使用して視覚化し、in vitroで記録用電極をEGFP+グラフト細胞およびH9誘導ニューロンに向けた。ガラス製記録用電極(7~9MΩの抵抗性)を、126mMのグルコン酸カリウム、2mMのKCl、2mMのMgCl2、0.2mMのEGTA、10mMのHEPES、4mMのNa2ATP、0.4mMのNa2GTPおよび0.5%ニューロビオチン(Invitrogen)(pH7.25および295mOsm/kg)からなる細胞内溶液で充填した。記録データを、Multiclamp 700B増幅器およびpCLAMP10ソフトウェア(Molecular Devices)を使用して収集した。発火事象を拾得し、発火の反応速度を、Clampfit10.2を使用して分析した。小過分極電流注入(-5pA)パルス点における細胞の入力抵抗を、定常に達した後、オームの法則によって膜電位変化から得た。自発性PSCを、ミニ分析プログラム(Synaptosoft Inc.)を使用して分析した。
新生仔マウスへの移植
すべての手順は、NIHガイドラインに従って実施され、地方のInstitutional Animal Care and Use Committee(IACUC)、Institutional Biosafety Committee(IBC)およびEmbryonic Stem Cell Research Committee(ESCRO)によって承認された。P1S5D細胞を、誘導8日目にAccutaseを用いて解離し、40μmの細胞ストレーナー(Falcon)で濾過した。細胞を1回洗浄し、氷冷したPBSに密度100,000個の細胞/μlで再懸濁し、次に33ゲージの鋭い針を有する10μlシリンジ(Hamilton)によって採取した。合計2μlの細胞を、定位装置およびシリンジを駆動するための電気ポンプ(Boston Scientific)を用いて、P2新生仔NOD-SCID IL2Rgc-/-マウス(Jackson Laboratory)の体性感覚皮質に1μl/1分の速度で注射した。グラフトの1ヶ月後、1.5ヶ月後、3ヶ月後、および6ヶ月後に、完全麻酔下のマウスに、ヘパリン(20単位/ml)を含有するPBSを経心的に灌流した後、4%パラホルムアルデヒド20mlを灌流した。次に、マウス脳を抽出し、4%パラホルムアルデヒドによって一晩後固定した。
すべての手順は、NIHガイドラインに従って実施され、地方のInstitutional Animal Care and Use Committee(IACUC)、Institutional Biosafety Committee(IBC)およびEmbryonic Stem Cell Research Committee(ESCRO)によって承認された。P1S5D細胞を、誘導8日目にAccutaseを用いて解離し、40μmの細胞ストレーナー(Falcon)で濾過した。細胞を1回洗浄し、氷冷したPBSに密度100,000個の細胞/μlで再懸濁し、次に33ゲージの鋭い針を有する10μlシリンジ(Hamilton)によって採取した。合計2μlの細胞を、定位装置およびシリンジを駆動するための電気ポンプ(Boston Scientific)を用いて、P2新生仔NOD-SCID IL2Rgc-/-マウス(Jackson Laboratory)の体性感覚皮質に1μl/1分の速度で注射した。グラフトの1ヶ月後、1.5ヶ月後、3ヶ月後、および6ヶ月後に、完全麻酔下のマウスに、ヘパリン(20単位/ml)を含有するPBSを経心的に灌流した後、4%パラホルムアルデヒド20mlを灌流した。次に、マウス脳を抽出し、4%パラホルムアルデヒドによって一晩後固定した。
参考文献:
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cells toward trophectoderm. Stem Cells Dev 20, 1889-1900 (2011).
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26. Kaech, S. & Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc 1, 2406-2415 (2006).
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35. Maury, Y. et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature biotechnology 33, 89-96 (2015).
36. Borghese, L. et al. Inhibition of notch signaling in human embryonic stem cell-derived neural stem cells delays G1/S phase transition and accelerates neuronal differentiation in vitro and in vivo. Stem Cells 28, 955-964 (2010).
37. Gao, P., Sultan, K.T., Zhang, X.J. & Shi, S.H. Lineage-dependent circuit assembly in the neocortex. Development 140, 2645-2655 (2013).
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rat model of Parkinson's disease. Cell Stem Cell 15, 653-665 (2014).23. Zhang, Y. et al. Rapid single-step induction of functional neurons
from human pluripotent stem cells. Neuron 78, 785-798 (2013).
24. Hoya-Arias, R., Tomishima, M., Perna, F., Voza, F. & Nimer, S.D.
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26. Kaech, S. & Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc 1, 2406-2415 (2006).
27. Hoya-Arias, R., Tomishima, M., Perna, F., Voza, F. & Nimer, S.D.
L3MBTL1 deficiency directs the differentiation of human embryonic stem
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28. Sanjana, N.E. et al. A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. Nat Protoc 7, 171-192 (2012).
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34. Du, Z.W. et al. Generation and expansion of highly pure motor neuron progenitors from human pluripotent stem cells. Nat Commun 6, 6626
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35. Maury, Y. et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature biotechnology 33, 89-96 (2015).
36. Borghese, L. et al. Inhibition of notch signaling in human embryonic stem cell-derived neural stem cells delays G1/S phase transition and accelerates neuronal differentiation in vitro and in vivo. Stem Cells 28, 955-964 (2010).
37. Gao, P., Sultan, K.T., Zhang, X.J. & Shi, S.H. Lineage-dependent circuit assembly in the neocortex. Development 140, 2645-2655 (2013).
本開示の主題およびその利点を詳細に記載してきたが、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書では様々な変更、置換および修正が行われ得ることを理解されたい。さらに、本願の範囲は、本明細書に記載されるプロセス、機械、製造、ならびに物質の組成、手段、方法およびステップの特定の実施形態に限定されることを意図されない。当業者は、本開示の主題、プロセス、機械、製造、物質の組成、手段、方法またはステップの開示から容易に理解される通り、本明細書に記載される対応する実施形態と実質的に同じ機能を果たすか、または実質的に同じ結果を達成する、既存のまたは開発される今後のものは、本開示の主題に従って利用され得る。したがって、添付の特許請求の範囲は、それらの範囲内に、このようなプロセス、機械、製造、物質の組成、手段、方法またはステップの範囲内を含むことが意図される。
特許文書、特許出願、刊行物、生成物の説明およびプロトコールが、本願を通して引用されているが、それらの開示は、あらゆる目的でそれらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
多能性幹細胞を分化させるためのin vitro方法であって、複数の細胞が分化し、1種または複数の皮質ニューロン前駆体マーカーを発現するように、幹細胞集団を、有効濃度の形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤、ウィングレス(Wnt)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤、MAPK/ERKキナーゼシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、FGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、およびノッチシグナル伝達の1種または複数の阻害剤に曝露するステップを含む、方法。
(項目2)
前記幹細胞集団が、前記形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤への曝露の開始後、少なくとも6日目に、検出可能なレベルのPAX6を発現する、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記幹細胞集団が、前記形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤への曝露の開始後、6日目までに、検出可能なレベルのPAX6を発現する、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記幹細胞集団を前記形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤に曝露した後、少なくとも2日目または3日目に、前記MAPK/ERKキナーゼシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、前記FGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、および前記ノッチシグナル伝達の1種または複数の阻害剤を前記幹細胞集団に曝露する、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記幹細胞集団を前記形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤に曝露した後、2日目または3日目までに、前記MAPK/ERKキナーゼシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、前記FGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、および前記ノッチシグナル伝達の1種または複数の阻害剤を前記幹細胞集団に曝露する、項目1に記載の方法。
(項目6)
前記複数の細胞が、前記形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤への曝露後、少なくとも13日目に、TUJ1、TBR1、TLE4、DCX、REELIN、CTIP2、SATB2、FOXP2、RGS4、CUX2、BLBP、およびそれらの組合せからなる群から選択される検出可能なレベルのマーカーを発現する、項目1に記載の方法。
(項目7)
前記複数の細胞が、前記形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤への曝露後、13日目までに、TUJ1、TBR1、TLE4、DCX、REELIN、CTIP2、SATB2、FOXP2、RGS4、CUX2、BLBP、およびそれらの組合せからなる群から選択される検出可能なレベルのマーカーを発現する、項目1に記載の方法。
(項目8)
検出可能なレベルのTUJ1を発現する前記複数の細胞の少なくとも50%が、検出可能なレベルのTBR1、TLE4、またはそれらの組合せも発現する、項目6または7に記載の方法。
(項目9)
前記幹細胞集団が、前記形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤に曝露された後、少なくとも16日目に、分化した皮質ニューロンの電気生理学的活性を示す、項目6または7に記載の方法。
(項目10)
前記形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、前記骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤、および前記ウィングレス(Wnt)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤を、前記幹細胞集団に少なくとも6日間曝露する、項目1に記載の方法。
(項目11)
前記形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、前記骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤、および前記ウィングレス(Wnt)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤を、前記幹細胞集団に6日間まで曝露する、項目1に記載の方法。
(項目12)
前記形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、前記骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤、および前記ウィングレス(Wnt)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤を、前記幹細胞集団に少なくとも7日間曝露する、項目1に記載の方法。
(項目13)
前記形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、前記骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤、および前記ウィングレス(Wnt)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤を、前記幹細胞集団に7日間まで曝露する、項目1に記載の方法。
(項目14)
前記TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤が、SB431542、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される化合物を含む、項目1に記載の方法。
(項目15)
前記骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤が、LDN193189、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される化合物を含む、項目1に記載の方法。
(項目16)
前記ウィングレス(Wnt)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤が、XAV939、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される化合物を含む、項目1に記載の方法。
(項目17)
前記MAPK/ERKキナーゼシグナル伝達の1種または複数の阻害剤が、PD0325901、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される化合物を含む、項目1に記載の方法。
(項目18)
前記FGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤が、SU5402、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される化合物を含む、項目1に記載の方法。
(項目19)
前記ノッチシグナル伝達の1種または複数の阻害剤が、γ-セクレターゼ阻害剤を含む、項目1に記載の方法。
(項目20)
前記γ-セクレターゼ阻害剤が、DAPT、それらの誘導体、またはそれらの混合物を含む、項目20に記載の方法。
(項目21)
前記幹細胞が、ヒト胚幹細胞、ヒト人工多能性幹細胞、ヒト単為生殖幹細胞、始原胚細胞様の多能性幹細胞、胚盤葉上層幹細胞、およびFクラス多能性幹細胞からなる群から選択される、項目1に記載の方法。
(項目22)
前記細胞を皮質ニューロンに成熟させるのに好都合な条件に、前記複数の細胞を晒すステップをさらに含み、前記複数の細胞を、BDNF、cAMP、およびアスコルビン酸シグナル伝達を活性化する1種または複数の化合物に曝露するステップを含む、項目1に記載の方法。
(項目23)
1種または複数の皮質ニューロンマーカーまたはそれらの前駆体を発現する、in vitro分化細胞集団であって、項目1から22のいずれか一項に記載の方法に従って幹細胞集団から誘導される、in vitro分化細胞集団。
(項目24)
項目23に記載のin vitro分化細胞集団を含む、組成物。
(項目25)
対象の神経変性障害を処置する方法であって、有効量の項目23に記載のin vitro分化細胞集団を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法。
(項目26)
前記対象が、神経変性障害を有すると診断を受けたか、またはその危険性がある、項目25に記載の方法。
(項目27)
前記神経変性障害が、パーキンソン病である、項目26に記載の方法。
(項目28)
神経変性障害を処置するための医薬の製造における、項目23に記載のin vitro分化細胞集団の使用。
(項目29)
幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、
(a)形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、
(b)BMPシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、
(c)ウィングレス(Wnt)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤、
(e)FGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、
(e)ノッチシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、
(f)MAPK/ERKキナーゼシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、および
(g)項目1から22のいずれか一項に記載の1種または複数の皮質ニューロンマーカーを発現する分化細胞集団への前記幹細胞の分化を誘導するための指示書
の1つまたは複数を含む、キット。
(項目30)
in vitro分化細胞集団を含むキットであって、前記細胞集団が、項目1から22のいずれか一項に記載の方法に従って分化する、キット。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
多能性幹細胞を分化させるためのin vitro方法であって、複数の細胞が分化し、1種または複数の皮質ニューロン前駆体マーカーを発現するように、幹細胞集団を、有効濃度の形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤、ウィングレス(Wnt)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤、MAPK/ERKキナーゼシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、FGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、およびノッチシグナル伝達の1種または複数の阻害剤に曝露するステップを含む、方法。
(項目2)
前記幹細胞集団が、前記形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤への曝露の開始後、少なくとも6日目に、検出可能なレベルのPAX6を発現する、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記幹細胞集団が、前記形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤への曝露の開始後、6日目までに、検出可能なレベルのPAX6を発現する、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記幹細胞集団を前記形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤に曝露した後、少なくとも2日目または3日目に、前記MAPK/ERKキナーゼシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、前記FGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、および前記ノッチシグナル伝達の1種または複数の阻害剤を前記幹細胞集団に曝露する、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記幹細胞集団を前記形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤に曝露した後、2日目または3日目までに、前記MAPK/ERKキナーゼシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、前記FGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、および前記ノッチシグナル伝達の1種または複数の阻害剤を前記幹細胞集団に曝露する、項目1に記載の方法。
(項目6)
前記複数の細胞が、前記形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤への曝露後、少なくとも13日目に、TUJ1、TBR1、TLE4、DCX、REELIN、CTIP2、SATB2、FOXP2、RGS4、CUX2、BLBP、およびそれらの組合せからなる群から選択される検出可能なレベルのマーカーを発現する、項目1に記載の方法。
(項目7)
前記複数の細胞が、前記形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤への曝露後、13日目までに、TUJ1、TBR1、TLE4、DCX、REELIN、CTIP2、SATB2、FOXP2、RGS4、CUX2、BLBP、およびそれらの組合せからなる群から選択される検出可能なレベルのマーカーを発現する、項目1に記載の方法。
(項目8)
検出可能なレベルのTUJ1を発現する前記複数の細胞の少なくとも50%が、検出可能なレベルのTBR1、TLE4、またはそれらの組合せも発現する、項目6または7に記載の方法。
(項目9)
前記幹細胞集団が、前記形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤に曝露された後、少なくとも16日目に、分化した皮質ニューロンの電気生理学的活性を示す、項目6または7に記載の方法。
(項目10)
前記形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、前記骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤、および前記ウィングレス(Wnt)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤を、前記幹細胞集団に少なくとも6日間曝露する、項目1に記載の方法。
(項目11)
前記形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、前記骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤、および前記ウィングレス(Wnt)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤を、前記幹細胞集団に6日間まで曝露する、項目1に記載の方法。
(項目12)
前記形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、前記骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤、および前記ウィングレス(Wnt)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤を、前記幹細胞集団に少なくとも7日間曝露する、項目1に記載の方法。
(項目13)
前記形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、前記骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤、および前記ウィングレス(Wnt)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤を、前記幹細胞集団に7日間まで曝露する、項目1に記載の方法。
(項目14)
前記TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤が、SB431542、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される化合物を含む、項目1に記載の方法。
(項目15)
前記骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤が、LDN193189、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される化合物を含む、項目1に記載の方法。
(項目16)
前記ウィングレス(Wnt)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤が、XAV939、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される化合物を含む、項目1に記載の方法。
(項目17)
前記MAPK/ERKキナーゼシグナル伝達の1種または複数の阻害剤が、PD0325901、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される化合物を含む、項目1に記載の方法。
(項目18)
前記FGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤が、SU5402、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される化合物を含む、項目1に記載の方法。
(項目19)
前記ノッチシグナル伝達の1種または複数の阻害剤が、γ-セクレターゼ阻害剤を含む、項目1に記載の方法。
(項目20)
前記γ-セクレターゼ阻害剤が、DAPT、それらの誘導体、またはそれらの混合物を含む、項目20に記載の方法。
(項目21)
前記幹細胞が、ヒト胚幹細胞、ヒト人工多能性幹細胞、ヒト単為生殖幹細胞、始原胚細胞様の多能性幹細胞、胚盤葉上層幹細胞、およびFクラス多能性幹細胞からなる群から選択される、項目1に記載の方法。
(項目22)
前記細胞を皮質ニューロンに成熟させるのに好都合な条件に、前記複数の細胞を晒すステップをさらに含み、前記複数の細胞を、BDNF、cAMP、およびアスコルビン酸シグナル伝達を活性化する1種または複数の化合物に曝露するステップを含む、項目1に記載の方法。
(項目23)
1種または複数の皮質ニューロンマーカーまたはそれらの前駆体を発現する、in vitro分化細胞集団であって、項目1から22のいずれか一項に記載の方法に従って幹細胞集団から誘導される、in vitro分化細胞集団。
(項目24)
項目23に記載のin vitro分化細胞集団を含む、組成物。
(項目25)
対象の神経変性障害を処置する方法であって、有効量の項目23に記載のin vitro分化細胞集団を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法。
(項目26)
前記対象が、神経変性障害を有すると診断を受けたか、またはその危険性がある、項目25に記載の方法。
(項目27)
前記神経変性障害が、パーキンソン病である、項目26に記載の方法。
(項目28)
神経変性障害を処置するための医薬の製造における、項目23に記載のin vitro分化細胞集団の使用。
(項目29)
幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、
(a)形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、
(b)BMPシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、
(c)ウィングレス(Wnt)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤、
(e)FGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、
(e)ノッチシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、
(f)MAPK/ERKキナーゼシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、および
(g)項目1から22のいずれか一項に記載の1種または複数の皮質ニューロンマーカーを発現する分化細胞集団への前記幹細胞の分化を誘導するための指示書
の1つまたは複数を含む、キット。
(項目30)
in vitro分化細胞集団を含むキットであって、前記細胞集団が、項目1から22のいずれか一項に記載の方法に従って分化する、キット。
Claims (1)
- 明細書に記載の発明。
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