KR20190035600A - 인간 다능성 줄기 세포로부터 피질 뉴런의 분화 - Google Patents

인간 다능성 줄기 세포로부터 피질 뉴런의 분화 Download PDF

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Abstract

본원에 개시되는 요지 사안은 인간 줄기 세포의 피질 뉴런으로의 시험관내 분화 유도 방법 및 이러한 방법에 의해 생성되는 피질 뉴런을 제공한다. 본원에 개시되는 요지 사안은 또한 신경퇴행성 CNS 장애의 치료를 위한 이러한 피질 뉴런의 용도를 제공한다.

Description

인간 다능성 줄기 세포로부터 피질 뉴런의 분화
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2016년 1월 27일에 출원된 미국 가출원 제62/287,821호 및 2017년 1월 23일에 출원된 미국 가출원 제62/449,488호를 우선권으로 청구하며, 그 각각의 내용은 이의 전문이 본원에 참조로 포함되고, 그 각각이 우선권으로 청구된다.
연구비 정보
본 발명은 미국 국립 위생 연구소(the National Institutes of Health)에서 수여하는 연구비 번호 R01NS072381 및 NS084334 하에 정부 지원으로 수행되었다. 정부는 본 발명에 있어서 일정 권리를 갖는다.
1. 개요
본원에 개시되는 요지 사안은 인간 줄기 세포로부터 유도된 피질 뉴런, 및 이의 전구체, 및 신경학적 장애의 세포-기반 치료에서의 이의 용도에 관한 것이다.
2. 발명의 배경
지난 수 년 간, 인간 다능성 줄기 세포(hPSC)를 초기 신경 계통으로 전환하기 위한 방법이 개발되었다. 특히 효율적인 전략은 분화 11일 내에 인간 배아 줄기 세포(hESC) 또는 인간 유도된 다능성 줄기 세포(hiPSC)의 PAX6+ 중추 신경계(CNS) 신경 전구체로의 분화를 유발하는 SMAD 신호전달을 저해하는 소분자(예컨대, 이중 SMAD 저해)의 사용이다1. 신경 서브타입 특화는 WNT 신호전달과 같은 경로를 표적화하는 추가적인 소분자를 사용하여 추가 조정될 수 있다. 이중-SMAD 저해 조건 하에 WNT 신호전달을 활성화하는 화합물에 대한 적시 노출은 SOX10+ 신경 능선 계통을 유도한다. 대조적으로, WNT 신호전달의 저해는 FOXG1+ 앞뇌 전구체의 유도를 강화한다2-4. 이러한 조작은 정의된 신경 전구체 세포 집단을 효율적으로 특화하는 반면, 기능적 뉴런으로의 추가 분화는 수 개월이 아니면 수 주에 걸쳐 연장될 수 있는 장시간 공정이었다. 뉴런 운명 획득을 가속화하려는 시도에서, 2개의 추가적인 소분자: 섬유아세포 성장 인자(FGF) 신호전달의 강력한 저해제인 SU54025 및 Notch 신호전달을 차단하는 γ-시크리타제 저해제인 DAPT6의 사용이 기재되었다. 이중 SMAD 저해를 이용한 이러한 2개 저해제(SD) 및 WNT 활성화의 조합 적용은 분화 11일경에 75%의 유사분열-후 뉴런을 산출하며, 동일한 시기가 표준 이중-SMAD 저해 조건 하에 신경 전구체 세포 유도를 위해 요구되었다1. 그러나, 이러한 신속히-유도된 뉴런에서 BRN3A 및 ISL1의 공동-발현은 이들을 PAX6-유도된 CNS 뉴런이 아닌 말초 감각 뉴런으로 정의하였다7. 따라서, 감각 운명 특화 동안 뉴런 운명 획득을 가속화하기 위한 전략이 CNS 운명에 대해서 적용될 수 있는지 여부는 불명확하게 남아 있었다. PAX6-유도된 피질 뉴런은 인간 발달 및 및 신경퇴행성 CNS 장애 영역에 관련된다. 따라서, 피질 뉴런의 신속한 유도 방법 및 조성물에 대한 필요성이 당분야에 존재한다.
3. 발명의 요약
본원에 개시되는 요지 사안은, 예컨대 시험관내 분화에 의해, 줄기 세포로부터 유도된 피질 뉴런, 및 이의 전구체, 예를 들어 이의 인접 전구체에 관한 것이다.
본 발명은 적어도 부분적으로, MAPK/ERK 키나제의 저해가 (i) 하나 이상의 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/Activin-Nodal 신호전달의 저해제; (ii) 하나 이상의 뼈 형태형성 단백질(BMP) 신호전달의 저해제; (iii) 하나 이상의 Wnt 신호전달의 저해제; (iv) 하나 이상의 FGF 신호전달의 저해제; 및 (v) 하나 이상의 Notch 신호전달의 저해제와 접촉시킨 줄기 세포로부터 피질 뉴런의 분화를 가속화한다는 발견에 기반한다.
소정 구현예에서, 인간 줄기 세포의 피질 뉴런(및 이의 인접 전구체)으로의 시험관내 분화 유도 방법은 인간 줄기 세포의 집단을 (i) 유효량의 하나 이상의 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/Activin-Nodal 신호전달의 저해제, (ii) 유효량의 하나 이상의 뼈 형태형성 단백질(BMP) 신호전달의 저해제, 및 (iii) 유효량의 하나 이상의 wingless(Wnt) 신호전달의 저해제와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 세포는 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 적어도 10일; 또는 최대 4일 동안, 최대 5일 동안, 최대 6일 동안, 최대 7일 동안, 최대 8일 동안, 최대 9일, 또는 최대 10일 동안 유효량의 저해제와 접촉된다.
소정 구현예에서, 방법은 세포를 (iv) 유효량의 하나 이상의 MAPK/ERK 키나제 신호전달(또한 MEK로 알려져 있음)의 저해제, (v) 유효량의 하나 이상의 FGF 신호전달의 저해제, 및 (vi) 유효량의 하나 이상의 Notch 신호전달의 저해제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 소정 구현예에서, 세포는 (iv), (v) 및/또는 (vi)와 적어도 4일 동안, 적어도 5일 동안, 적어도 6일 동안, 적어도 7일 동안, 적어도 8일 동안, 적어도 9일 동안, 적어도 10일 동안, 적어도 11일 동안, 적어도 12일 동안, 적어도 13일 동안, 적어도 14일 동안, 또는 적어도 최대 4일, 최대 5일, 최대 6일, 최대 7일, 최대 8일, 최대 9일, 최대 10일, 최대 11일, 최대 12일, 최대 13일 또는 최대 14일 동안 접촉된다. 소정 구현예에서, 세포가 유효량의 하나 이상의 TGFβ/Activin-Nodal 신호전달의 저해제와 최초 접촉된 적어도 2일(또는 적어도 48시간) 후, 세포는 유효량의 (iv), (v) 및/또는 (vi) 저해제와 최초 접촉된다.
소정 구현예에서, 세포가 유효량의 (i), (ii) 및 (iii) 저해제와 최초 접촉된 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 또는 약 6일 후 세포는 유효량(들)의 (iv), (v) 및/또는 (vi) 저해제와 최초 접촉된다. 소정 구현예에서, 세포가 유효량의 (i), (ii) 및 (iii) 저해제와 최초 접촉된 약 24시간, 약 48시간, 약 72시간, 약 96시간, 약 120시간, 또는 약 144시간 후 세포는 유효량(들)의 (iv), (v) 및/또는 (vi) 저해제와 최초 접촉된다.
소정 구현예에서, 인간 줄기 세포는 유효량의 저해제 (i) 내지 (iii)과 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 동안 접촉되고, 유효량의 저해제 (iv) 내지 (vi)와 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 동안 접촉된 후, 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 동안 유효량의 하나 이상의 Notch 신호전달의 저해제; 유효량의 하나 이상의 FGF 신호전달의 저해제; 유효량의 하나 이상의 MAPK/ERK 신호전달의 저해제; 및/또는 유효량의 하나 이상의 Wnt 신호전달의 활성화제와 추가 접촉된다.
소정 구현예에서, 인간 줄기 세포는 저해제 (i) 내지 (iii)과 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 동안 접촉되며, 유효량의 저해제 (iv) 내지 (vi)과 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 동안 접촉된 후, 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 동안 하나 이상의 Notch 신호전달의 저해제와 추가 접촉된다.
소정 구현예에서, 세포가 검출 가능한 수준의 PAX6을 발현하는 시기 동안 세포는 유효 농도의 (i) 내지 (vi)과 접촉된다. 소정 구현예에서, 상기 시기는 세포가 유효 농도의 저해제 (i), 즉, 하나 이상의 TGFβ/Activin-Nodal 신호전달의 저해제와 최초 접촉된 약 6일 후이다.
소정 구현예에서, 세포가 검출 가능한 수준의 TUJ1을 발현하는 시기 동안 세포는 유효 농도의 (i) 내지 (vi)과 접촉된다. 소정 구현예에서, 적어도 30%의 세포가 검출 가능한 수준의 TUJ1을 발현하는 시기 동안 세포는 유효 농도의 (i) 내지 (vi)과 접촉된다. 소정 구현예에서, 상기 시기는 세포가 유효 농도의 저해제 (i), 즉, 하나 이상의 TGFβ/Activin-Nodal 신호전달의 저해제와 최초 접촉된 약 13일 후이다. 소정 구현예에서, 세포는 TBR1 및/또는 TLE4를 추가로 공동 발현한다.
소정 구현예에서, 세포가 검출 가능한 수준의 TUJ1 및 TBR1 및/또는 TLE4 중 하나 또는 둘 다를 발현하는 시기 동안 세포는 유효 농도의 (i) 내지 (vi)과 접촉된다.
소정 구현예에서, 본원에 기재되는 방법에 따라 접촉되는 세포는 검출 가능한 수준의 TUJ1을 발현하며, 여기서 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상의 세포는 또한 검출 가능한 수준의 TBR1, TLE4, 또는 이의 조합을 발현한다.
소정 구현예에서, 세포가 검출 가능한 수준의 피질 뉴런 마커를 발현하는 시기 동안 세포는 유효 농도의 (i) 내지 (vi)과 접촉된다. 소정 구현예에서, 피질 뉴런 마커는 TBR1, TLE4, DCX, REELIN, CTIP2, SATB2, FOXP2, RGS4, CUX2, BLBP 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 세포는 유효 농도의 저해제 (i), 즉, 하나 이상의 TGFβ/Activin-Nodal 신호전달의 저해제와 최초 접촉된 후 적어도 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 20일, 25일, 30일, 33일 이상 후에 검출 가능한 수준의 피질 뉴런 마커를 발현한다.
소정 구현예에서, 본원에 기재되는 방법에 따라 제조되는 세포는 유효 농도의 (i), 즉, 하나 이상의 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/Activin-Nodal 신호전달의 저해제와 접촉된 적어도 16일 후 분화된 피질 뉴런의 전기생리적 활성을 나타낸다.
소정 구현예에서, 인간 줄기 세포의 피질 뉴런 및 이의 전구체로의 시험관내 분화 유도 방법은 인간 줄기 세포의 집단을 유효 농도의 (i) 하나 이상의 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/Activin-Nodal 신호전달의 저해제, (ii) 하나 이상의 뼈 형태형성 단백질(BMP) 신호전달의 저해제, (iii) 하나 이상의 Wnt 신호전달의 저해제, (iv) 하나 이상의 MAPK/ERK 키나제 신호전달의 저해제, (v) 하나 이상의 FGF 신호전달의 저해제, 및 (vi) 하나 이상의 Notch 신호전달의 저해제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 소정 구현예에서, 세포가 (i), (ii) 및 (iii)와 접촉된 적어도 2일 또는 적어도 3일 후 세포는 (iv), (v) 및 (vi)과 접촉된다. 소정 구현예에서, 세포는 유효 농도의 (i), 즉, 하나 이상의 TGFβ/Activin-Nodal 신호전달의 저해제와 최초 접촉된 후 적어도 4일 내지 20일, 또는 적어도 6일 내지 16일, 적어도 약 8일 내지 14일, 또는 적어도 약 10일 내지 12일 동안 배양된다.
소정 구현예에서, 방법은 (a) 인간 다능성 줄기 세포를 유효 농도의 (i) 하나 이상의 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/Activin-Nodal 신호전달의 저해제, (ii) 하나 이상의 뼈 형태형성 단백질(BMP) 신호전달의 저해제, (iii) 하나 이상의 Wnt 신호전달의 저해제와 최초 접촉시키는 단계; (b) 상기 세포를 적어도 약 6일 또는 7일 동안, 유효 농도의 (i) 하나 이상의 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/Activin-Nodal 신호전달의 저해제, (ii) 하나 이상의 뼈 형태형성 단백질(BMP) 신호전달의 저해제, (iii) 하나 이상의 Wnt 신호전달의 저해제와 배양하는 단계; (c) 상기 세포를 (a)의 적어도 약 2일 또는 3일 후, 유효 농도의 (iv) 하나 이상의 MAPK/ERK 키나제 신호전달의 저해제, (v) 하나 이상의 FGF 신호전달의 저해제, 및 (vi) 하나 이상의 Notch 신호전달의 저해제와 최초 접촉시키는 단계; 및 (d) 상기 세포를 적어도 약 10일 또는 11일 동안 또는 적어도 20%의 상기 세포가 TUJ1을 발현할 때까지, 유효 농도의 (iv) 하나 이상의 MAPK/ERK 키나제 신호전달의 저해제, (v) 하나 이상의 FGF 신호전달의 저해제, 및 (vi) 하나 이상의 Notch 신호전달의 저해제와 배양하는 단계를 포함한다.
소정 구현예에서, 방법은 추가로 상기 분화된 세포의 집단을 상기 분화된 세포의 피질 뉴런 집단으로의 성숙을 선호하는 조건으로 처리하는 단계를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 성숙을 선호하는 조건은 상기 분화된 세포의 집단을 적합한 세포 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 성숙을 선호하는 조건은 상기 분화된 세포의 집단을 상기 전구체의 피질 뉴런으로의 성숙을 강화하는 하나 이상의 분자와 접촉시키는 단계를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 성숙을 강화하는 하나 이상의 분자는 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF)의 활성화제, cAMP, 및 아스코르브산 신호전달로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 세포는 유효 농도의 (i), 즉, 하나 이상의 TGFβ/Activin-Nodal 신호전달의 저해제와 최초 접촉된 적어도, 또는 최대, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일 또는 12일 후 상기 성숙 인자와 접촉된다.
본 발명의 개시는 또한 본원에 기재되는 방법에 따라 제조되는 하나 이상의 뉴런 마커, 예를 들어, 피질 뉴런 마커를 발현하는 시험관내 분화된 세포, 또는 이의 전구체 세포의 집단을 제공한다. 소정 구현예에서, 적어도 약 70%(예컨대, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 99.5%)의 세포의 집단은 하나 이상의 피질 뉴런 마커를 발현하며, 약 15% 미만(예컨대, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 약 1% 미만, 약 0.5% 미만, 또는 약 0.1% 미만)의 세포의 집단은 줄기 세포 마커(예컨대, OCT4, NANOG, SOX2, LIN28, SSEA4 및/또는 SSEA3), 아교 세포 마커(예컨대, GFAP, AQP4, 및/또는 OLIG2), 망막 세포 마커(예컨대, CHX10), 말초 감각 뉴런(예컨대, BRN3A, 및/또는 ISL1), 신경 능선 전구체(예컨대, SOX10), 또는 두개 원판 전구체(예컨대, SIX1)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 발현한다.
소정 구현예에서, 분화된 세포 집단은 인간 줄기 세포의 집단으로부터 유도된다. 본원에 개시되는 요지 사안은 추가로 이러한 분화된 세포 집단을 포함하는 조성물을 제공한다.
또한, 본원에 개시되는 요지 사안은 줄기 세포의 분화를 유도하기 위한 키트를 제공한다. 소정 구현예에서, 키트는 다음 중 하나 이상을 포함한다: (a) 하나 이상의 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/Activin-Nodal 신호전달의 저해제, (b) 하나 이상의 BMP 신호전달의 저해제, (c) 하나 이상의 Wnt 신호전달의 저해제 (d) 하나 이상의 FGF 신호전달의 저해제, (e) 하나 이상의 Notch 신호전달의 저해제, (f) 하나 이상의 MAPK/ERK 키나제 신호전달의 저해제, 및 (g) 줄기 세포의 하나 이상의 뉴런 마커, 예를 들어, 피질 뉴런 마커를 발현하는 분화된 세포, 또는 이의 전구체 세포의 집단으로 분화를 유도하기 위한 설명서.
본원에 개시되는 요지 사안은 또한 하나 이상의 뉴런 마커, 예를 들어, 피질 뉴런 마커를 발현하는 분화된 세포, 또는 이의 전구체 세포의 집단을 포함하는 키트를 제공하며, 여기서 세포는 본원에 기재되는 방법에 따라 제조된다.
소정 구현예에서, 상기 인간 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포, 인간 유도된 다능성 줄기 세포, 인간 단성생식 줄기 세포, 원시 생식 세포-유사 다능성 줄기 세포, 외배엽 줄기 세포, 및 F-클래스 다능성 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에 개시되는 요지 사안은 추가로 대상체에서 신경퇴행성 장애의 치료 방법을 제공한다. 소정 구현예에서, 방법은 본원에서 기재되는 유효량의 분화된 세포 집단을 신경퇴행성 장애를 앓는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
본원에 개시되는 요지 사안은 추가로 대상체에서 신경퇴행성 장애를 치료하기 위한 본원에 기재되는 분화된 세포 집단을 제공한다.
본원에 개시되는 요지 사안은 추가로 신경퇴행성 장애를 치료하기 위한 약제의 제조에서 본원에 기재되는 분화된 세포 집단의 용도를 제공한다.
소정 구현예에서, 신경퇴행성 장애는 파킨슨병, 알츠하이머병, 또는 정신분열병이다.
4. 도면의 간략한 설명
도 1a~1i는 조합 소분자-기반 프로토콜을 사용하여 인간 다능성 줄기 세포로부터 피질 뉴런의 신속한 유도를 나타내는 일러스트레이션, 이미지 및 그래프를 보여준다. 도 1a는 신경 능선 대 앞뇌 운명 및 신경 전구체 대 가속화된 뉴런 운명을 생성하기 위한 경로 조작의 도식적 일러스트레이션이다. SOX10+ 신경 능선 전구체, PAX6+ CNS 전구체 및 BRN3A/ISL1+ 감각 뉴런의 유도를 위한 프로토콜이 보고된 반면, 본 발명은 피질 뉴런의 신속한 유도를 위한 전략에 집중한다. 도 1b는 매칭되는 단백질 마커로의 공동-표지화를 평가함으로써 PAX6::H2B-GFP, SOX10::GFP 및 SIX1::H2B-GFP hESC-기반 리포터 세포주의 검증을 도시하는 이미지를 보여준다. 도 1c는 다양한 프로토콜 하에 CNS(PAX6::H2B-GFP, 왼쪽), NC(SOX10::GFP, 가운데) 및 원판(SIX1::H2B-GFP, 오른쪽) 유도의 경시적인 정량 분석 그래프를 보여준다(LSB = 이중 SMAD 저해; XAV = XAV939, 탄키라제(tankyrase) 저해제(WNT-i); CHIR = CHIR99021, GSK3β-저해(WNT-활성화). S = SU5402, FGFR 저해제; D = DAPT, γ-시크리타제 저해제(Notch-i). 각각의 조건 및 세포주 당 세포 배양의 N = 3개 독립 배치. 도 1d는 CNS 대 NC 기반 hPSC 분화 동안 CNS 전구체 마커 PAX6, 신경 능선 전구체 마커 SOX10 및 뉴런 마커 TUJ1에 대한 면역세포화학 이미지를 보여준다. 도 1e는 뉴런 운명 획득을 가속화하기 위해 S/D 노출과 조합된 CNS 및 NC 기반 hPSC 분화의 면역조직화학 이미지를 보여준다. 도 1f는 세포내 흐름에 의한 분화 13일차에 도 1d 및 1e로부터 TUJ1 데이터의 정량을 나타내는 그래프이다. 도 1d 및 1e에서의 데이터는 조건 및 세포주 당 3 또는 5개 독립 실험에서 유도된다. 검은색 점은 독립 실험으로부터의 값을 나타낸다. 왼쪽으로부터 오른쪽으로, N = 3, 3, 5, 3. Welch 교정을 포함하여 페어링되지 않은 t 시험(2-테일화)을 사용하여 통계분석을 수행하였다. XAV 대 XAV+S/D: t=9.510 dF=2.160, P=0.0084. CHIR+S/D 대 XAV+S/D: t=13.40, df=4.718, P<0.0001. 도 1g는 세포내 유세포 측정에 의한 NESTIN+ 및 TUJ1+ 세포 백분율의 정량에 기반한 P 및 S 단일 및 조합 용량 반응 분석 그래프(상부), 및 cm2 당 배양에서의 총 뉴런의 산정치를 보여준다(P1S5D 및 P8S10D 조건 하에 0일차에 플레이트-접종된 모든 hPSC에 있어서, 13일차에 약 0.7 및 0.2 뉴런이 각각 수득되었음). P = PD0325901, ERK/MEK 저해제. P, S, D 뒤의 숫자는 각각의 μM 농도를 나타낸다. 각각의 열은 스크리닝되는 마커 당 N = 2의 기술적 반복을 나타낸다. 도 1h는 13일경 P1S5D 및 P8S10D 배양에서 PAX6/TUJ1에 대한 면역세포화학 이미지를 보여준다. 도 1i는 13일차에 세포내 유세포 측정에 의한 TUJ1+ 세포의 정량을 나타내는 그래프를 보여준다. 검은색 점은 독립 실험으로부터의 값을 나타낸다. 왼쪽에서 오른쪽으로, N = 4, 5, 5, 4. Welch 교정을 포함하여 페어링되지 않은 t 시험(2-테일화)을 사용하여 통계분석을 수행하였다. XAV+P(1)/D 대 XAV+P(1)/S(5)/D: t=4.057, dF=6.045, P=0.0066. XAV+P(1)/S(5) 대 XAV+P(1)/S(5)/D: t=20.62, dF=4.880, P<0.0001. XAV+P(1)/S(5)/D 대 XAV+P(8)/S(10)/D: t=13.26, dF=6.397, P<0.0001. 축적 막대: 100 ㎛(b), 200 ㎛(d, e, h). 오차 막대는 s. e. m.을 나타낸다. ** P<0.01, **** P<0.0001.
도 2a~2d는 hESC 및 hiPSC 세포주에서 신속한 피질 뉴런 유도를 나타내는 일러스트레이션, 이미지 및 그래프를 보여준다. 도 2a는 P/S/D 프로토콜의 시험관내 분화 방식을 나타내는 일러스트레이션을 보여준다. hPSC를 50 ng/ml FGF2 및 10 μM ROCK-저해제 Y-27632가 보충된 hESC 배지에서 200,000/㎠로 분화 1일 전에 플레이트-접종하였다. 소분자를 이중-SMAD 저해(LDN193189, SB431542) 및 XAV939 처리(LSBX)의 존재 하에 첨가한다. PD0325901, SU5402 및 DAPT(P/S/D)의 적용을 위한 최적 시점을 나타낸다. 도 2b 및 2c는 13일차에 TBR1/TUJ1 발현의 면역형광에 의한 hiPSC 세포주 상에서 (b) P1S5D 및 (c) P8S10D 프로토콜의 검증을 나타내는 이미지를 보여준다. 도 2d는 시험된 다양한 hiPSC 세포주에 대해 세포내 유세포 측정에 의한 13일차의 뉴런 유도 효율의 정량을 나타내는 그래프를 보여준다. 세포주 1.1, 1.2, 1.3에 대해 세포 배양 N = 3개 독립 배치, 및 세포주 7.1, 7.2 및 7.4에 대해 N = 1. 축적 막대: 50 ㎛. 오차 막대는 s. e. m.을 나타낸다.
도 3a~3l은 분화 13일경 hPSC 유도된 뉴런의 일시적 및 표현형 특징분석 그래프 및 이미지를 보여준다. 도 3a는 13일차에 각 군 간 평균 차이를 비교하기 위한 Welch 교정을 포함하여 페어링되지 않은 t 시험(2-테일화), 세포내 유세포 측정(세포 배양의 N = 4개 독립 배치)에 의한 뉴런 유도 효율의 경시적인 분석을 나타내는 그래프를 보여준다. LSBX 대 P1S5D: t=20.79 dF=3.042, P=0.0002. 3i 대 P1S5D: t=0.8277 dF=5.013, P=0.4455, N.S.. P1S5D 대 P8S10D: t=12.79 dF=5.994, P<0.0001. 도 3b는 분화 5, 8 11, 13일차에 경시적인 qRT-PCR 분석 그래프를 보여준다. OCT4(POU5F1): 인간 다능성 마커; PAX6: 등쪽 피질 선조체 마커; FOXG1: 앞뇌 마커; DCX: 범-뉴런 마커; TBR1: 평판-앞, 평판-하 및 피질 VI층 뉴런 마커; REELIN: 피층 I층(Cajal-Retzius 세포) 뉴런 마커. FC: 배율 변화. 세포 배양의 N = 3개 독립 배치. 도 3c는 13일차에 면역형광에 의한 TBR1/TUJ1 발현을 나타내는 이미지를 보여준다. 도 3d 및 3e는 (d) 총 세포 중 TBR1+ 세포 백분율(t=3.151, dF=7.820, P=0.0140, 2-테일화), 또는 (e) TUJ1+ 뉴런 중 백분율(t=1.094, dF=9.997, P=0.2994, 2-테일화, N.S.)의 정량을 나타내는 그래프를 보여준다. 검은색 점은 세포 배양의 3개 독립 배치로부터 6개의 150 ㎛ × 150 ㎛ 면적의 균일한 무작위 선택 정량으로부터의 값을 나타낸다. Welch 교정을 포함하여 페어링되지 않은 t 시험을 사용하여 통계분석을 수행하였다. 도 3f는 13일 이후 장기 배양 프로토콜의 일러스트레이션을 보여준다. 8일 이전 시험관내 분화는 도 2a에 기재된 것과 동일하다. 장기 배양을 위해, P1S5D 및 P8S10D 세포를 이후 저해제 첨가 없이 NB/B27+BCA 배지에서 각각 150,000/㎠ 및 300,000/㎠으로 분화 8일차에 계대배양하였다. 세포를 다양한 시점에 고정하고 면역세포화학 또는 RNA 추출 및 qRT-PCR 분석을 위해 가공하였다. 도 3g는 P1S5D 및 P8S10D 세포의 장기 유지가 구별되는 피질층 운명을 이루는 뉴런을 생성하였음을 나타낸다: FOXP2(V~VI층), TLE4(VI층), CTIP2(V층), SATB2(II~III층, V층), RGS4(II~III층, V층), CUX2(피질 선조체 및 II~IV층). 도 3h는 P1S5D 분화를 사용하여 총 세포 집단에서 TBR1+, CTIP2+ 및 SATB2+ 세포의 정량을 나타내는 그래프를 보여준다. N = 세포 배양의 2개 독립 배치로부터 20X 대물렌즈를 사용하여 포획된 6개의 무작위 선택된 사진 프레임의 정량. 도 3i는 P1S5D 분화 40일차에 마커 양성 세포 중 양성인 EdU의 백분율 정량을 나타내는 그래프를 보여준다. EdU를 다양한 분화 시점(x-축에 나타냄)에 48 hr 동안 배양에 첨가하고 배양을 40일차에 고정하였다. 유색 점은 세포 배양의 2개 독립 배치로부터의 개별 사진 프레임의 정량 결과 값을 나타낸다. 왼쪽에서 오른쪽으로, N = 3,4,4; 0,0,0; 3,4,3; 3,3,4; 3,5,1; 1,3,4. 축적 막대: 50 ㎛. 오차 막대는 s. e. m.을 나타낸다. 도 3j는 P1S5D 분화 40일차에 EdU와 TBR1 및 CTIP2의 공동-표지화를 나타내는 대표 이미지를 보여준다. 도 3k는 E6 배지에서 P/S/D를 사용하여 가속화된 뉴런 분화 프로토콜의 대안적 방식을 보여준다. 도 3l은 13일차에 PAX6/TUJ1 및 TBR1/TUJ1 발현의 면역세포화학에 의한 E6에서의 P/S/D 프로토콜의 검증을 보여준다. 축적 막대: 50 ㎛, 도 3l의 왼쪽 및 중간 패널에서의 100 ㎛ 제외. 오차 막대는 s. e. m.을 나타낸다. ** P<0.01, *** P<0.001, **** P<0.0001. N.S.: 유의미하지 않음.
도 4는 다양한 배양 프로토콜에 있어서 TUJ1에 대한 세포내 흐름 분석을 나타내는 그래프를 보여준다. 각각의 그래프는 13일차에 TUJ1+ 뉴런 집단의 세포내 유세포 측정의 관문화를 보여준다(파란색: TUJ1 염색. 빨간색: 이소형 대조군).
도 5a~5b는 FOXG1 발현에 있어서 세포 신호전달에서의 다양한 소분자-기반 조작의 영향을 나타내는 이미지 및 그래프를 나타낸다. 도 5a는 13일차에 FOXG1/TUJ1 공동-발현에 대한 면역세포화학 이미지를 보여준다. 도 5b는 P1S5D 조건 하에, 그러나 각각의 소분자 인자 중 하나의 체계적 제거 후 qRT-PCR에 의한 FOXG1 전사체 발현 수준의 정량을 나타내는 그래프를 보여준다. 세포 배양의 N = 3개 독립 배치. 축적 막대: 100 ㎛. 오차 막대는 s. e. m.을 나타낸다.
도 6a~6f는 가속화된 유도가 시험관내 성숙한 전기생리적 특성을 갖는 hPSC-유도된 피질 뉴런을 산출함을 나타내는 일러스트레이션 및 그래프를 보여준다. 도 6a는 뉴런 유도 및 뉴런의 유지를 위한 6개의 상이한 처리 조건의 도식적 일러스트레이션을 보여준다. 최대 8일의 시험관내 분화 프로토콜은 도 2a에 기재된 바와 동일하다. 이어서 P1S5D 및 P8S10D 세포를 NB/B27+BCA 중 8일차에 각각 150,000/㎠ 및 300,000/㎠로 계대배양하였다. 두 계대배양된 P1S5D 및 P8S10D 세포를 3개 조건: 저해제 비함유(+비함유), DAPT 함유(+D), 및 PD0315901(1 uM), SU5402(5 uM), DAPT, CHIR99021(3 uM) 함유(+PSDC)에서 추가 유지하여, 총 6개의 상이한 세포 처리를 생성하였다. 도 6b는 6개 분화 조건을 나타내는 세포로부터 분화 16일차에 대표적인 활동 전위 점화 추적 그래프를 나타낸다. 도 6c 16일차에 자가-점화 전기생리적 특성의 정량(전류 주입 없음). 검은색 점은 개별 세포의 값을 나타낸다. 왼쪽에서 오른쪽으로, 4개 독립 세포 배양의 배치로부터의 N = 15, 18, 11, 16, 17, 12. PSDC: P(1)S(5)D+CHIR. 도 6d는 전류 주입 없이 및 -10 pA 전류 주입으로 분화 16일차에 나타낸 점화 빈도를 갖는 세포 백분율 정량을 보여준다. -10 pA 전류의 주입은 유발 점화를 야기하였고 더 큰 비율의 세포가 높은 점화 빈도를 채택할 수 있게 하였다. 왼쪽에서 오른쪽으로, 4개의 독립 세포 배양의 배치로부터의 N = 15, 18, 11, 16, 17, 12. PSDC: P(1 μM) S(5 μM) D+CHIR. 도 6e는 전-세포 패치 클램프에 의해 37일차에 P1S5D+비함유 뉴런의 전압-의존적 나트륨 채널 반응을 나타내는 그래프를 보여주며, 이는 나트륨 채널을 특이적으로 차단하는 테트로도톡신(TTX)에 의해 차단될 수 있다. 내부세트: 나트륨 채널 전류를 야기하기 위해 사용되는 프로토콜. 도 6f는 기능적 시냅스 형성을 시사하는 40일차에 P1S5D+비함유 조건 하에 기록되는 자연적 흥분 시냅스 후 전류(sEPSC)를 나타내는 그래프를 보여준다. sEPSC는 AMPA 수용체를 선택적으로 차단하는 NBQX에 의해 차단될 수 있어서 흥분성 시냅스 전류를 시사한다. 오차 막대는 s. e. m.을 나타낸다.
도 7a~7c는 소분자 인자의 부재 하에 유지되는 P1S5D 배양에 대한 전기생리적 파라미터를 요약하는 일러스트레이션 및 그래프를 보여준다. 도 7a는 추가 분화 시 성숙 수준을 증가시키기 위한 P1S5D+비함유 처리의 도식적 일러스트레이션이다. 도 7b는 추가 분화 시 성숙 수준을 증가시키기 위해 도 7b 및 7c에서 분석된 P1S5D+비함유 처리를 예시한다. 도 7b는 또한 37일까지 P1S5D+비함유 처리의 분석을 나타내는 그래프를 보여준다. 도 7c는 37일까지 P1S5D+비함유 조건의 전기생리적 특성의 경시적 정량 분석을 나타내는 그래프를 보여준다. 시간이 경과함에 따라, 휴지막 전위가 과분극화되었으며, 입력 저항이 감소되었고, Na+-채널 전류가 증가되었고, 활동 전위 역치가 감소되었고, 최대 점화 빈도가 증가되었다. 각 군 평균 간에 통계적으로 유의차가 존재하는지를 결정하기 위해 먼저 일반 원-웨이 ANOVA를 사용하여 통계분석을 수행하였다: F=0.3222, P=0.8093, R 2 =0.0248(REM); F=7.554, P=0.0023, R 2 =0.5862(절반-폭); F=0.7654, P=0.5209, R 2 =0.0560(상승 타우); F=4.88, P=0.006, R 2 =0.2891(입력 저항); F=7.364, P=0.0005, R 2 =0.3676(빈도). 이어서, Dunnett의 다중 비교 시험을 사용하여 16일까지 각 군의 평균 값을 비교하였다. 유의미한 비교만 그래프에 표시하였다. 오차 막대는 s. e. m.을 나타낸다. * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001.
도 8a~8g는 hPSC-유도된 뉴런과 별아교세포 또는 별아교세포 컨디셔닝된 배지의 공동-배양에 관한 일러스트레이션, 이미지 및 그래프를 보여준다. 도 8a는 별아교세포 공동-배양 또는 컨디셔닝된 배지를 이용한 P8S10D+D 뉴런의 장기 유지의 도식적 일러스트레이션이다. 도 8b는 25일 및 35일차에 별아교세포 또는 컨디셔닝된 배지와 공동-배양된 P8S10D+D 뉴런의 명 시야 이미지를 보여준다. 도 8c는 -30 내지 +100 pA의 신체 전류 주입에 의해 유발된, 25일 및 35일차에 별아교세포 또는 컨디셔닝된 배지와 공동-배양된 P8S10D+D 뉴런의 활동 전위 점화의 대표적 추적을 나타내는 그래프를 보여준다. 도 8d는 수동 막 전위 및 활동 전위 특성의 정량 분석을 나타내는 그래프를 보여준다. 도 8e는 별아교세포 공동-배양을 이용한 P8S10D+D 뉴런의 MAP2ab 염색 이미지를 보여주며, 이는 배양에서 경시적으로 가지돌기 분기화의 증가된 복잡성을 나타낸다. 도 8f는 컨디셔닝된 배지 단독과 함께 배양된 뉴런에 비해, 별아교세포와 공동-배양된 P8S10D+D 뉴런의 36일차의 sholl 분석을 나타내는 그래프를 보여준다. 축적 막대: 50 ㎛. 오차 막대는 s. e. m.을 나타낸다. *** P<0.001. 도 8g는 90일차에 별아교세포와 공동-배양된 P8S10D+D 뉴런의 명 시야 이미지를 보여준다. 25, 35일차에 별아교세포와의 배양 및 25, 35일차에 컨디셔닝된 배지에서의 배양에 대해 기록된 N = 15, 23, 7, 5 세포.
도 9는 신생 마우스 내로의 PSD 처리된 세포 이식의 도식적 일러스트레이션을 보여준다.
도 10a~10e는 iDISCO18-기반 전체 실장 뇌 조영에 의해 평가되는 신생 마우스 뇌로 이식되는 P1S5D를 사용하여 광범위한 축삭 돌출 및 hPSC-유도된 뉴런의 통합을 나타내는 이미지를 보여준다. 도 10a는 1.5개월차의 이식편(Graft) 코어 및 그 피질 돌출의 등쪽 시야를 보여준다. 도 10b는 앞뇌 면역조직화학 및 광-편(light-sheet) 현미경에 의한 조영을 사용하여 이식-후 1~6개월차의 이식된 뇌의 분석을 보여준다. 1.5개월차의 이식편 코어 및 그 피질 돌출의 등쪽 시야. 도 10c는 이식편 코어 형태 및 주요 돌출 영역(이마 피질 및 뇌량)을 나타내는 돌기(100 ㎛ 두께)를 보여준다. 점선: 중간선, 화살표: 뇌량에서의 미주 세로 돌출. 도 10d는 1.5, 3 및 6개월차의 이식편 돌출의 형태를 나타내는 반뇌의 iDISCO 기반 조영을 보여준다. 상부 패널: 이식편 코어 및 그 주요 피질 돌출을 나타내는 반뇌의 시야. 중앙 패널: 상자표시된 영역으로부터의 섬유 형태의 상세사항, 및 경시적인 이의 증가된 분기화를 나타내는 돌출(100 ㎛ 두께). 하부 패널: 해마에서 GFP와 공동-표지된 h시냅토피신을 나타내는 돌출(100 ㎛ 두께). hSyn 신호는 1.5개월차에 부재하였고, 3개월차에 매우 희미했으나, 6개월차에는 매우 높았다. 도 10e는 인간 특이적 세포질 마커(SC121) 또는 GFP 발현에 의해 확인되는 이식편 유도된 뉴런의 피질 정체성 마커에 대한 면역조직화학 분석을 보여준다. 약 60%의 이식된 세포는 TBR1을 발현하였고, 약 50%는 CTIP2를 발현하였고(모든 CTIP2+ 세포의 절반 초과가 TBR1을 공동-발현하였음), 약 30%가 SATB2를 발현하였다. 분석된 1, 1.5 및 3개월에 대해 N = 5마리 동물, 및 분석된 6개월에 대해 2마리 동물. 축적 막대: 500 ㎛(b, c, d, 상부 및 중간 패널), 50 ㎛(d, 하부 패널 및 e).
도 11a~11b는 이식 후 1개월차에 P8S10D 및 LSB+XAV 이식편의 iDISCO 기반 앞뇌 면역형광 분석 이미지를 보여준다. 도 11a는 GFP에 대해 염색된 P8S10D 이식된 반뇌의 이미지를 보여준다(전체 시야 및 이마 피질 영역의 상세사항). P8S10D 이식편은 신생 마우스 피질로의 이식 후 일관되지 않은 생존을 나타내었다. 그러나, 생존 이식편을 갖는 동물은 피질 영역에 걸쳐 장섬유 돌출을 나타내었다. 축삭이 없는 GFP+ 세포는 이식편 외부에서 풍부하게 검출되었다(상자표시된 영역). 도 11b는 GFP에 대해 염색된 LSB+X 이식된 반뇌의 이미지를 보여준다. 전체 시야(바깥쪽 및 등쪽) 및 이식편 경계의 상세사항(상자표시된 영역). LSB+X 이식편은 숙주 뇌에서 대량 과성장을 나타내어 매우 제한된 뉴런 분화 및 성숙의 증거를 갖는 종양-유사 구조를 생성하였다. 소수의 단섬유 트랙만 이식편 경계에서 볼 수 있다(상자표시된 영역). 분석된 P8S10D 조건에 대해 N = 2마리 동물, 및 LSB+XAV 조건에 대해 4마리 동물. 축적 막대: 500 ㎛.
도 12a~12d는 이식 후 1.5개월차에 P1S5D 이식된 뉴런의 궤도 및 형태의 이미지를 보여준다. 도 12a는 성체 마우스 뇌의 랜드마크가 조직 자가형광에 의해 드러날 수 있음을 나타내는 이미지를 보여준다. iDISCO 가공 후 성체 마우스 뇌의 중심에서 촬영된 광학 섹션의 100 ㎛ 두께 최대 돌출은 내인성 형광의 488 ㎚ 레이저 여기로부터의 주요 미엘린화 트랙을 나타낸다. 도 12b는 주요 경로를 따르지 않은 이식된 뉴런으로부터의 축삭의 예를 나타내는 이미지를 보여준다. GFP에 대해 염색된, 출생 시 이식된 전체 iDISCO 처리된 1.5월령 마우스 뇌의 최대 돌출, 100 ㎛ 두께. 줄무늬체에서, 피질에서 이식된 뉴런으로부터 내려오는 GFP+ 축삭은 주로 주요 하강 트랙의 외부에서 나타난다. 피질에서, GFP+ 축삭의 큰 번들이 미주 위치에서 관찰된다. 도 12c는 주요 경로를 따라 이식된 뉴런으로부터 축삭의 예를 나타내는 이미지를 보여준다. GFP에 대해 염색된, 출생 시 이식된 iDISCO 처리된 1.5월령 마우스 뇌. 해마에서, CA3에 존재하는 이식된 뉴런(화살표)은 격막을 향해 가장자리 트랙을 따라 나오는 축삭이다. 피질에서, 뇌량 축삭을 따라 반구를 교차하는 이식된 뉴런. 도 12d는 이식된 뇌에서 나타난 소수 형태의 이미지를 보여준다: 대부분의 뉴런은 이식편 코어에 압축되어 있고, 이에 따라 이의 가지돌기 형태가 차폐된다. 그러나, 소수의 GFP+ 뉴런은 이식편 코어 외부에서 확인되며, 다양한 형태를 나타낸다. N=3, 축적 막대는 1 ㎜(a), 500 ㎛(b, c) 및 200 ㎛(d)이다.
도 13a~13d는 생체내 P1S5D 이식된 뉴런의 전기생리를 나타내는 이미지 및 다이어그램을 보여준다. 도 13a 및 13b는 활동 전위 및 점화 패턴의 기록뿐만 아니라 각각 일반적이지 않은 성숙 특성을 갖는, P10(도 13a) 및 P30(도 13b) 각각에서의 GFP+ 이식편으로부터의 sEPSC를 나타낸다. 도 13c 및 13d는 이식편에서 대부분의 GFP+ 세포가 P15 및 P45에서 기록된 도 13c에서의 대표적 활동 전위 및 도 13d에서의 sEPSC에 의해 예시되는 보다 미성숙한 점화 패턴을 나타내었다. 분석된 P1S5D 조건에 대해 N = 4마리 동물, 및 분석된 P8S10D 조건에 대해 1마리 동물.
도 14는 신속한 피질 뉴런 유도 패러다임의 요약이다. LSB에 의한 이중 SMAD 저해는 트로프엑토덤(trophectoderm), 중-내배엽, 및 CNS 운명을 촉진하는 비-신경 외배엽 세포 운명을 저해한다. XAV939는 전방 CNS 정체성을 촉진하는 반면, SU5402/PD0325901은 다능성으로부터 신경외배엽 운명을 향한 통과를 가속화한다. 매우 일시적인 전방 신경외배엽 전구체 상태는 DAPT 및 SU5402/PD0325901의 존재 하에 유사분열-후 피질 운명을 향해 지정된다. 미성숙 피질 뉴런은 분화 16일경 시험관내 기능적 성숙성을 획득할 수 있고, 신생 마우스 숙주 뇌로 이식된 8일차 뉴런은 광범위한 축삭 돌출 및 피질에서의 통합을 나타낸다.
도 15a~15g는 P/S/D 처리 시 증식 및 생활성의 투여량-의존적 반응을 나타낸다. (a) P/S/D 처리 1일 후(분화 3일차) 총 세포 중 인산-히스톤 3(pH3)을 발현하는 유사분열 세포의 백분율. (b) P/S/D 처리 1일 후(분화 3일차) 총 세포 중 절단된 카스파제 3(CC3)을 발현하는 아폽토시스성 세포의 백분율. a, b에서 점선 상자에 강조한 조건은 S 농도가 증가하는 순서로 정렬된 P1 투여군이다. a, b에 있어서, 세포 배양의 2개 독립 배치 각각으로부터 무작위 선택된 사진 프레임 N = 4. 분화 3일차에 LSB+X를 함유하는 각각의 투여량을 비교하기 위해 Dunnett 다중 비교 시험을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. LSB+X와 유의미하게 상이한 비교만 그래프에 표시한다. (c) P의 농도가 증가하는 순서 또는 (d) S의 농도가 증가하는 순서에 따라 a에 그룹화된 결과의 요약. (e) P의 농도가 증가하는 순서 또는 (f) S의 농도가 증가하는 순서에 따라 b에 그룹화된 결과의 요약. c~f에 대해, 각각의 P의 투여량을 P 비함유 군과 비교하기 위해(c, e) 및 각각의 S의 투여량을 S 투여량 비함유 군과 비교하기 위해(d, f) Dunnett 다중 비교 시험을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. (g) c~f에 나타낸 다양한 투여량 군에 대한 명명. 검은색 점은 개별 사진 프레임의 정량으로부터의 값을 나타낸다. 오차 막대는 s. e. m.을 나타낸다. * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001, **** P<0.0001.
도 16a~16d는 분화 13일차에 추가적인 운명 마커의 특징분석을 나타낸다. (a) P1S5D 및 P8S10D 유도 둘 다에서 분화 13일차에 유사분열-후 뉴런에서 VI층 마커 TLE4의 발현, 및 선조체에서 CUX2 발현. (b) 상이한 뇌 영역 및 운명을 나타내는 TBR1 이외 마커의 13일차의 mRNA 발현의 정량. 세포 배양의 N = 3개 독립 배치. 피질 선조체 마커 OTX2, ZNF521, BRN2 및 COUPTF1, V층 피질 뉴런 마커 CTIP2, 및 소포 글루타메이트 수송체 VGLUT1이 LSB+X에 비해 상향조절된다. (c) 13일차에 P1S5D 및 P8S10D 배양 둘 다에서 BRN3A+ 및 ISL1+ 세포의 발현. (d) 13일차에 BRN3A+ 세포의 정량. 축적 막대: 50 ㎛. 오차 막대는 s. e. m.을 나타낸다.
도 17은 13일 이후 장기 배양의 분자적 특징분석을 나타낸다. LSB+X 처리된 배양 대비 P1S5D 및 P8S10D 처리된 배양(도 3f)에서 mRNA 발현의 정량. RGS4: 피질 II~III층, V층 마커. CHX10: 망막 마커. GFAP, AQP4: 별아교세포 마커. OLIG2: 희소돌기아교세포 전구체 마커. LSB+X 세포의 장기 배양을 위해, 세포에 소분자 저해제를 재첨가하지 않고 N2 배지에서 유지하였다. 세포 배양의 N = 3개 독립 배치. 오차 막대는 s. e. m.을 나타낸다.
도 18a~18g는 CUX2-CreERT2 조건적 리포터 hPSC 세포주의 생성 및 P1S5D 및 P8S10D 처리된 세포 둘 다에서 CUX2+ 뉴런의 조기 생성을 나타낸다. (a) CUX2 제1 엑손을 표적화하는 상동성 공여체의 설계. 설계 카세트를 트랜스제닉 생성(transgenesis) 후 Flp 재조합효소의 발현 시 절제하였다. 표적화를 확인하기 위한 프라이머 서열의 위치를 나타낸다. (b) 표적화된 대립유전자의 도식적 일러스트레이션. 트랜스제닉 세포주는 CUX2 유전자위로부터의 CreERT2 및 AAVS1 safe harbor 유전자위에서 CAG 프로모터 하의 FLEX-tdTomato 조건적 리포터를 발현한다. 4OHT의 존재 하에 CUX2의 발현은 리포터 유전자위에서의 재조합 및 tdTomato 발현을 유도한다. (c) 표적화된 트랜스제닉 생성의 PCR 확인. 레인 1~2는 CUX2 게놈 유전자위에서 5' 및 3' CreERT2 삽입을 각각 확인시켜 주는 반면, 레인 3~4는 AAVS1 게놈 유전자위에서 5' 및 3' CAG-FLEX/tdTomato 삽입을 각각 확인시켜 준다. (d) CUX2 유전자위에서의 게놈 DNA 서열분석은 한 개 대립유전자 및 야생형 비-표적화 대립유전자의 성공적인 표적화를 확인시켜 준다. (e) 4OHT 유도 후 배양 70일차에 tdTomato 양성 유사분열-후 뉴런(i). 더 고배율 하에 전형적인 피라미드형 형태 및 긴 돌출이 관찰될 수 있다(ii). (f) 성숙 형태를 갖는 CUX2+ 뉴런이 분화 33일차에 P1S5D 및 P8S10D 배양에서 관찰되었다. (g) 33일차의 피라미드형 형태는 P1S5D 및 P8S10D 뉴런의 피질 돌출 뉴런 정체성을 제시한다. e(i)에서의 축적 막대는 100 ㎛를 나타내는 반면, 다른 곳에서의 축적 막대는 50 ㎛를 나타낸다.
도 19는 P1S5D 및 P8S10D 분화 13일차에 특징적인 세포(TBR1+ 뉴런 이외)에 대한 체크리스트를 나타낸다.
도 20은 CUX2 리포터 세포주 유전형분석을 위해 사용된 프라이머를 나타낸다.
도 21은 P1S5D 및 P8S10D 세포에 대한 1일 배양 프로토콜의 요약을 나타낸다.
5. 상세한 설명
본원에 개시되는 요지 사안은, 예컨대 인간 줄기 세포의 기능적 피질 뉴런으로의 시험관내 분화에 의해, 인간 줄기 세포로부터 유도된 피질 뉴런의 제조 방법, 및 이러한 방법에 의해 생성되는 세포에 관한 것이다. 또한 CNS 신경퇴행성 장애의 치료를 위한 이러한 세포의 용도를 제공한다.
개시의 명확성 목적을 위해 그리고 비제한적으로, 상세한 설명은 다음 하위섹션으로 구분된다:
5.1 정의;
5.2 줄기 세포의 분화 방법;
5.3 분화된 세포 집단을 포함하는 조성물;
5.4 CNS 신경퇴행성 장애의 예방 및/또는 치료 방법; 및
5.5 키트
5.1 정의
본 명세서에서 사용되는 용어는 일반적으로 본 발명의 맥락 내에서 그리고 각각의 용어가 사용되는 특정 맥락에서, 당분야에서의 이의 일반 의미를 갖는다. 소정 용어가 아래에서, 또는 명세서의 다른 곳에서 논의되어, 실시자에게 본 발명의 조성물 및 방법 그리고 이를 어떻게 제조하고 이용하는지에 대한 추가 설명서를 제공한다.
용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해 결정되는 특정 값에 대해 허용 가능한 오차 범위 내를 의미하며, 이는 부분적으로 그 값이 어떻게 측정되거나 결정되는지, 즉, 측정 시스템의 한계에 의존할 것이다. 예를 들어, "약"은 당분야에서의 관례에 따라, 3 또는 3 초과의 표준 편차 내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 최대 20%, 예컨대, 최대 10%, 최대 5%, 또는 최대 1% 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 공정에 대해, 이 용어는 크기의 10배 내, 예컨대 값의 5배 내, 또는 2배 내를 의미할 수 있다.
"신호 전달 단백질"에 대해 본원에서 사용되는 용어 "신호전달"은 막 수용체 단백질에 대한 리간드 결합 또는 일부 다른 자극에 의해 활성화되거나 달리 영향받는 단백질을 나타낸다. 신호 전달 단백질의 예에는 비제한적으로 SMAD, 베타-카트닌(catnin)을 포함하는 wingless(Wnt) 복합체 단백질, NOTCH, 전환 성장 인자 베타(TGFβ), Activin, Nodal 및 글리코겐 합성효소 키나제 3β(GSK3P) 단백질, FGF 및 MAPK/ERK(MEK) 단백질이 포함된다. 여러 세포 표면 수용체 또는 내부 수용체 단백질에 있어서, 리간드-수용체 상호작용은 세포의 반응에 직접 연관되지 않는다. 리간드 활성화된 수용체는 세포의 거동에 대한 리간드의 궁극적인 생리적 효과가 생성되기 전에 먼저 세포 내의 다른 단백질과 상호작용할 수 있다. 종종, 몇몇 상호작용 세포 단백질 사슬의 거동이 수용체 활성화 또는 저해 후 변경된다. 수용체 활성화에 의해 유도되는 전체 세포 변화 세트가 신호 전달 기전 또는 신호전달 경로로 불린다.
본원에서 사용되는 용어 "신호"는 세포 구조 및 기능에서의 변화를 제어하는 내부 및 외부 인자를 나타낸다. 이들은 성질이 화학적이거나 물리적일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "리간드"는 수용체에 결합하는 분자 및 단백질, 예컨대, 전환 성장 인자-베타(TFGβ), Activin, Nodal, 뼈 형태형성 단백질(BMP) 등을 나타낸다.
본원에서 사용되는 "저해제"는 분자 또는 경로의 신호전달 기능을 방해하는(예컨대, 줄이는, 감소시키는, 억제하는, 제거하는, 또는 차단하는) 화합물 또는 분자(예컨대, 소분자, 펩타이드, 펩타이드 모사체, 천연 화합물, siRNA, 안티-센스 핵산, 앱타머, 또는 항체)를 나타낸다. 저해제는 명명되는 단백질(신호전달 분자, 명명되는 신호전달 분자에 관여되는 임의의 분자, 명명되는 연관된 분자, 예컨대 글리코겐 합성효소 키나제 3β(GSK3β))(예컨대, 비제한적으로, 본원에 기재되는 신호전달 분자 포함)의 임의의 활성을 변화시키는 임의의 화합물 또는 분자일 수 있다. 하나의 예에 있어서, SMAD 신호전달의 저해제는, 예를 들어, SMAD와의 직접 접촉, SMAD mRNA와의 접촉, SMAD의 입체형태 변화 유도, SMAD 단백질 수준의 감소, 또는 신호전달 파트너와 SMAD 상호전달의 방해, 및 SMAD 표적 유전자의 발현에 대한 영향을 통해 기능할 수 있다. 저해제에는 또한 상류 신호전달 분자(예컨대, 세포외 도메인 내)를 방해하여 SMAD 생물학적 활성을 간접적으로 조절하는 분자가 포함된다. SMAD 신호전달 저해제 분자 및 효과의 예에는 뼈 형태형성 단백질을 격리하여, ALK 수용체 1, 2, 3, 및 6의 활성화를 저해함으로써 하류 SMAD 활성화를 예방하는 Noggin이 포함된다. 마찬가지로, Chordin, Cerberus, Follistatin은 유사하게 SMAD 신호전달의 세포외 활성화제를 격리한다. 막통과 단백질인 Bambi는 또한, 세포외 TGFβ 신호전달 분자를 격리하기 위한 위-수용체로서 작용한다. activin, nodal, TGFβ, 및 BMP를 차단하는 항체가 SMAD 신호전달 등의 세포외 활성화제를 중화시키는 용도를 위해 고려된다. 상기 예는 SMAD 신호전달 저해에 관한 것이지만, 유사하거나 비슷한 기전이 다른 신호전달 분자를 저해하기 위해 사용될 수 있다. 저해제의 예에는 비제한적으로 SMAD 신호전달 저해를 위한 LDN193189(LDN) 및 SB431542(SB)(LSB), Wnt 저해를 위한 XAV939(X), FGF 신호전달 저해를 위한 SU5402(S), Notch 신호전달 저해를 위한 DAPT(D), 및 MAPK/ERK(MEK) 신호전달 저해를 위한 PD0325901(P)이 포함된다.
저해제는 명명되는 신호전달 분자에 대한 결합에 의해 유도되고 이로부터의 상류 분자에 대한 영향을 미쳐서 다시 명명되는 분자의 저해를 유도하는 저해에 부가하여, 경쟁적 저해(또 다른 공지된 결합 화합물의 결합을 제외하거나 줄이는 방식으로 활성 부위에 결합함) 및 알로스테릭 저해(단백질의 활성 부위에 대한 화합물의 결합을 방해하는 방식으로 단백질 입체형태를 변화시키는 방식으로 단백질에 결합함)의 관점에서 기재된다. 저해제는 신호전달 표적으로의 실제 접촉에 의해 신호전달 표적 또는 신호전달 표적 경로를 저해하는 "직접적 저해제"일 수 있다.
본원에서 사용되는 "활성화제"는 분자의 신호전달 기능 또는 경로, 예컨대, Wnt 신호전달의 활성화를 증가시키거나, 유도하거나, 자극하거나, 활성화하거나, 촉진하거나, 강화하는 화합물을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "유도체"는 유사한 코어 구조를 갖는 화학적 화합물을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "세포의 집단" 또는 "세포 집단"은 적어도 2개 세포의 그룹을 나타낸다. 비제한적인 예에서, 세포 집단에는 적어도 약 10개, 적어도 약 100개, 적어도 약 200개, 적어도 약 300개, 적어도 약 400개, 적어도 약 500개, 적어도 약 600개, 적어도 약 700개, 적어도 약 800개, 적어도 약 900개, 적어도 약 1000개 세포, 적어도 약 5,000개 세포 또는 적어도 약 10,000개 세포 또는 적어도 약 100,000개 세포 또는 적어도 약 1,000,000개 세포가 포함될 수 있다. 집단은 1개 세포 유형을 포함하는 순수한 집단, 예컨대 피질 뉴런 전구체의 집단, 또는 분화되지 않은 줄기 세포의 집단일 수 있다. 대안적으로, 집단은 1개를 초과하는 세포 유형을 포함할 수 있다, 예를 들어 혼합 세포 집단일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "줄기 세포"는 배양에서 무한한 기간 동안 분열하고 특화된 세포를 생성하는 능력을 갖는 세포를 나타낸다. 인간 줄기 세포는 인간으로부터 유도되는 줄기 세포를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "배아 줄기 세포"는 배양에서 연장된 기간 동안 분화하지 않고 분열할 수 있는, 착상-전 단계 배아로부터 유도되는 원시(분화되지 않은) 세포를 나타내며, 3개 주요 배엽층의 세포 및 조직으로 발달하는 것으로 알려져 있다. 인간 배아 줄기 세포는 인간으로부터 유도되는 배아 줄기 세포를 나타낸다. 본원에서 사용되는 용어 "인간 배아 줄기 세포" 또는 "hESC"는 배양에서 연장된 기간 동안 분화하지 않고 분열할 수 있는, 최대 주머니배 단계를 포함하는, 초기 단계 인간 배아로부터 유도된 다능성 줄기 세포 유형을 나타내며, 3개 주요 배엽층의 세포 및 조직으로 발달하는 것으로 알려져 있다.
본원에서 사용되는 용어 "배아 줄기 세포주"는 최대 수 일, 수 개월 내지 수 년 동안 분화 없이 증식을 허용하는 시험관내 조건 하에 배양된 배아 줄기 세포의 집단을 나타낸다. 예를 들어, "배아 줄기 세포"는 배양에서 연장된 기간 동안 분화하지 않고 분열할 수 있는, 착상-전 단계 배아로부터 유도되는 원시(분화되지 않은) 세포를 나타낼 수 있고, 3개 주요 배엽층의 세포 및 조직으로 발달하는 것으로 알려져 있다. 인간 배아 줄기 세포는 인간으로부터 유도되는 배아 줄기 세포를 나타낸다. 본원에서 사용되는 용어 "인간 배아 줄기 세포" 또는 "hESC"는 배양에서 연장된 기간 동안 분화하지 않고 분열할 수 있는, 최대 주머니배 단계를 포함하는, 초기 단계 인간 배아로부터 유도된 다능성 줄기 세포 유형을 나타내며, 3개 주요 배엽층의 세포 및 조직으로 발달하는 것으로 알려져 있다.
본원에서 사용되는 용어 "다능성"은 내배엽, 중배엽, 및 외배엽을 포함하는 유기체의 3개 발달 배엽층으로 발달하는 능력을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "유도된 다능성 줄기 세포" 또는 "iPSC"는 소정 배아 유전자(예컨대, OCT4, SOX2, 및 KLF4 트랜스유전자)(예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 문헌[Takahashi and Yamanaka Cell 126, 663-676 (2006)] 참고)의 체세포, 예를 들어, CI 4, C72 등으로의 도입에 의해 형성되는, 배아 줄기 세포와 유사한 다능성 줄기 세포 유형을 나타난다.
본원에서 사용되는 용어 "체세포"는 배우체(난자 또는 정자) 이외의 체내의 임의의 세포를 나타낸다; 때때로 "성체" 세포로 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "신체(성체) 줄기 세포"는 자가 재생(실험실에서) 및 분화에 대해 제한된 능력을 갖고 여러 기관 및 분화된 조직에서 확인되는 비교적 드분 분화되지 않은 세포를 나타낸다. 이러한 세포는 이의 분화능이 다양하지만, 보통 기원 기관에서의 세포 유형으로 제한된다.
본원에서 사용되는 용어 "뉴런"은 신경계의 주요 기능적 단위인 신경 세포를 나타낸다. 뉴런은 세포체 및 그 돌출-축삭 및 하나 이상의 가지돌기로 구성된다. 뉴런은 시냅스에서 신경전달물질을 방출함으로써 다른 뉴런 또는 세포에 정보를 전달한다.
본원에서 사용되는 용어 "증식"은 세포수의 증가를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "분화되지 않은"은 아직 특화된 세포 유형으로 발달하지 않은 세포를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "분화"는 특화되지 않은 배아 세포가 특화된 세포, 예컨대 심장, 간, 또는 근육 세포의 특성을 획득하는 공정을 나타낸다. 분화는 보통 세포 표면에 포매된 단백질이 관여되는 신호전달 경로를 통해, 세포 외부의 물리적 및 화학적 조건과 세포 유전자의 상호작용에 의해 제어된다.
본원에서 사용되는 용어 "지정된 분화"는 특정한(예를 들어, 요망되는) 세포 유형, 예컨대 장 뉴런 전구체로 분화하도록 유도하기 위한 줄기 세포 배양 조건의 조작을 나타낸다.
줄기 세포에 대해 본원에서 사용되는 용어 "지정된 분화"는 줄기 세포의 다능성 상태로부터 보다 성숙하거나 특화된 세포 운명(예컨대 피질 뉴런 등)으로의 전이를 촉진하기 위한 소분자, 성장 인자 단백질, 및 다른 성장 조건의 사용을 나타낸다.
세포에 대해 본원에서 사용되는 용어 "분화 유도"는 디폴트 세포 유형(유전형 및/또는 표현형)의 비-디폴트 세포 유형(유전형 및/또는 표현형)으로의 변화를 나타낸다. 따라서, "줄기 세포에서의 분화 유도"는 줄기 세포(예컨대, 인간 줄기 세포)가 줄기 세포와 상이한 특징, 예컨대 유전형(예컨대, 유전적 분석, 예컨대 마이크로어레이에 의해 결정되는 유전자 발현에서의 변화) 및/또는 표현형(예컨대, 단백질, 예컨대 TUJI, DCX, TBR1, REELIN, 및 FOXG1의 발현에서의 변화)을 갖는 자손 세포로의 분열 유도를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "세포 배양"은 연구 또는 의학적 치료를 위한 인공 배지에서 시험관내 세포 성장을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "배양 배지"는 배양 용기, 예컨대 페트리 플레이트, 다중-웰 플레이트 등에서 세포를 덮는 액체를 나타내며, 세포에 영양을 공급하고 이를 지지하는 영양소를 함유한다. 배양 배지에는 또한 세포에서 요망되는 변화를 생성하기 위해 첨가되는 성장 인자가 포함될 수 있다.
세포와 화합물(예컨대, 하나 이상의 저해제, 활성화제, 및/또는 유도제)의 본원에서 사용되는 용어 "접촉"은 세포의 화합물로의 노출, 예를 들어, 화합물이 세포와 접촉하도록 허용할 위치로의 화합물 배치를 나타낸다. 접촉은 임의의 적합한 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 접촉은 세포 튜브에 화합물을 첨가함으로써 달성될 수 있다. 접촉은 또한 세포를 포함하는 배양 배지에 화합물을 첨가함으로써 달성될 수 있다. 각각의 화합물(예컨대, 저해제, 활성화제, 및 본원에 개시되는 미주 신경능선 패턴화를 유도하는 분자)은 용액(예컨대, 농축된 용액)으로서 세포를 포함하는 배양 배지에 첨가될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 화합물(예컨대, 저해제, 활성화제, 및 본원에 개시되는 미주 신경능선 패턴화를 유도하는 분자)뿐만 아니라 세포가 제형화된 세포 배양 배지에 존재할 수 있다.
유효량은 요망되는 효과를 생성하는 양이다.
본원에서 사용되는 용어 "시험관내"는 인공 환경 및 인공 환경 내에서 일어나는 공정 또는 반응을 나타낸다. 시험관내 환경으로, 비제한적으로 시험관 및 세포 배양이 예시된다.
본원에서 사용되는 용어 "생체내"는 자연 환경(예컨대, 동물 또는 세포) 및 자연 환경 내에서 일어난 공정 또는 반응, 예컨대 배아 발달, 세포 분화, 신경관 형성 등을 나타낸다.
유전자 또는 단백질에 대해 본원에서 사용되는 용어 "발현"은 검정, 예컨대 마이크로어레이 검정, 항체 염색 검정 등을 사용해서 관찰될 수 있는 mRNA 또는 단백질의 제조를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "마커" 또는 "세포 마커"는 특정한 세포 또는 세포 유형을 확인시켜 주는 유전자 또는 단백질을 나타낸다. 세포에 대한 마커는 하나의 마커로 제한되지 않을 수 있고, 마커는 명명된 마커군이 하나의 세포 또는 세포 유형을 또 다른 세포 또는 세포 유형으로부터 확인시켜 줄 수 있도록 하는 마커의 "패턴"을 나타낼 수 있다.
본원에서 개시되는 임의의 세포에 대해 수행되는 본원에서 사용되는 용어 "로부터 유도된" 또는 "로부터 확립된" 또는 "로부터 분화된"은 세포주, 조직(예컨대 비제한적으로 단세포 단리, 시험관내 배양, 예를 들어 단백질, 화학물질, 방사선, 바이러스로의 감염, DNA 서열, 예컨대 형태원 등으로의 전달감염, 배양된 모체 세포에 함유되는 임의의 세포의 선택(예컨대 연속 배양에 의해)을 사용하는 처리 및/또는 돌연변이화와 같은 임의의 조작을 사용하여 해리된 배아 또는 조직) 내 모체 세포로부터 수득된(예컨대 단리된, 정제된 등) 세포를 나타낸다. 유도된 세포는 성장 인자, 사이토카인, 사이토카인 처리의 선택된 진행, 접착제, 접착제의 부재, 정렬 절차 등에 대한 반응에 의해 혼합된 집단으로부터 선택될 수 있다.
본원에서 "개체" 또는 "대상체"는 척추동물, 예컨대 인간 또는 비-인간 동물, 예를 들어, 포유류이다. 포유류에는 비제한적으로 인간, 영장류, 농장 동물, 스포츠 동물, 설치류 및 애완동물이 포함된다. 비-인간 동물 대상체의 비제한적 예에는 설치류, 예컨대 마우스, 래트, 햄스터, 및 기니아픽; 토끼; 개; 고양이; 양; 돼지; 염소; 소; 말; 및 비-인간 영장류, 예컨대 유인원 및 원숭이가 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "질환"은 세포, 조직, 또는 기관의 정상 기능에 손상을 입히거나 이를 방해하는 임의의 병태 또는 장애를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "치료하다" 또는 "치료"는 치료받는 개체 또는 세포의 질환 경과를 변경시키려는 시도의 임상적 개입을 나타내며, 예방을 위해 또는 임상 병리의 경과 동안 수행될 수 있다. 치료의 치료적 효과에는 비제한적으로 질환의 발생 또는 재발 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리적 결과의 약화, 전이 예방, 질환 진행의 속도 감소, 질환 상태의 경감 또는 호전, 및 관해 또는 개선된 예후가 포함된다. 질환 또는 장애의 진행을 예방함으로써, 치료는 이환 또는 진단 대상체 또는 장애를 갖는 것으로 추정되는 대상체에서 장애로 인한 악화를 예방할 수 있지만, 또한 치료는 장애에 대한 위험에 처하거나 장애를 갖는 것으로 추정되는 대상체에서 장애의 개시 또는 장애의 증상을 예방할 수 있다.
5.2 줄기 세포의 분화 방법
본원에 개시되는 요지 사안은 줄기 세포(예컨대, 인간 줄기 세포)의 시험관내 분화 유도 방법을 제공한다. 인간 줄기 세포의 비제한적 예에는 인간 배아 줄기 세포(hESC), 인간 다능성 줄기 세포(hPSC), 인간 유도된 다능성 줄기 세포(hiPSC), 인간 단성생식 줄기 세포, 원시 생식 세포-유사 다능성 줄기 세포, 외배엽 줄기 세포, F-클래스 다능성 줄기 세포, 신체 줄기 세포, 암 줄기 세포, 또는 계통 특이적 분화가 가능한 임의의 다른 세포가 포함된다. 소정 구현예에서, 인간 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포(hESC)이다. 소정 구현예에서, 인간 줄기 세포는 인간 유도된 다능성 줄기 세포(hiPSC)이다. 소정 구현예에서, 줄기 세포는 비-인간 줄기 세포이다. 비-인간 줄기 세포의 비제한적 예는 비-인간 영장류 줄기 세포, 설치류 줄기 세포, 개 줄기 세포, 고양이 줄기 세포이다. 소정 구현예에서, 줄기 세포는 다능성 줄기 세포이다. 소정 구현예에서, 줄기 세포는 배아 줄기 세포이다. 소정 구현예에서, 줄기 세포는 유도된 다능성 줄기 세포이다.
본 발명은 줄기 세포의 피질 뉴런, 또는 이의 전구체로의 분화 방법을 개시한다. 임의의 이론에 구애받고자 하지 않고, 본 발명은 줄기 세포와 MAPK/ERK 키나제의 저해제의 접촉이 하나 이상의 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/Activin-Nodal 신호전달의 저해제; 하나 이상의 뼈 형태형성 단백질(BMP) 신호전달의 저해제; 하나 이상의 Wnt 신호전달의 저해제; 하나 이상의 FGF 신호전달의 저해제; 및 하나 이상의 Notch 신호전달의 저해제와 접촉된 줄기 세포로부터 피질 뉴런의 분화를 가속화함을 개시한다.
소정 구현예에서, 리간드에 대한 "Wnt" 또는 "wingless"는 Wnt 수용체, 예컨대 Frizzled 및 LRPDerailed/RYK 수용체 패밀리의 수용체와 상호작용할 수 있는 분비된 단백질 그룹(예컨대 인간에서 Intl(integration 1))을 나타낸다.
소정 구현예에서, 신호전달 경로에 대한 용어 "Wnt" 또는 "wingless"는 β-카테닌과 함께 또는 이것이 없이 매개되는, Wnt 패밀리 리간드 및 Wnt 패밀리 수용체, 예컨대 Frizzled 및 LRPDerailed/RYK 수용체로 이루어진 신호 경로를 나타낸다. 소정 구현예에서, Wnt 신호전달 경로에는 β-카테닌, 예컨대 WNT 4/β-카테닌에 의한 매개가 포함된다.
소정 구현예에서, 본원에 개시되는 분화 방법은 줄기 세포의 집단을 하나 이상의 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/Activin-Nodal 신호전달의 저해제와 접촉시킴으로써, Small Mothers Against Decapentaplegic(SMAD) 신호전달을 저해하는 단계를 포함한다. 소정 구현예에서, TGFβ/Activin-Nodal 신호전달의 저해제는 TGFβ, 뼈 형태형성 단백질(BMP), Nodal, 및 activin을 포함하는 리간드를 중화하거나, 수용체 및 하류 효과기의 차단을 통해 이의 신호 경로를 차단한다. TGFβ/Activin-Nodal 신호전달의 저해제의 비제한적 예는 WO/2010/096496, WO/2011/149762, WO/2013/067362, WO/2014/176606, WO/2015/077648, 문헌[Chambers et al., Nature Biotechnology 27, 275-280(2009), 및 Chambers et al., Nature biotechnology 30, 715-720 (2012)]에 개시되며, 이의 전문이 모든 목적을 위한 참조로 포함된다. 소정 구현예에서, 하나 이상의 TGFβ/Activin-Nodal 신호전달의 저해제는 SB431542, 이의 유도체, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 소분자이다. "SB431542"는 번호 CAS 301836-41-9, 분자식 C22H18N4O3, 및 명칭 4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]-벤즈아마이드를 갖는 분자를 나타내며, 예를 들어, 아래의 구조를 참고한다:
Figure pct00001
본원에 개시되는 분화 방법은 추가로 줄기 세포를 하나 이상의 BMP 신호전달의 저해제와 접촉시킴으로써, Small Mothers Against Decapentaplegic(SMAD) 신호전달을 저해하는 단계를 포함한다. BMP 신호전달의 저해제의 비제한적 예는 WO/2010/096496, WO/2011/149762, WO/2013/067362, WO/2014/176606, WO/2015/077648, 문헌[Chambers et al., Nature Biotechnology 27, 275-280 (2009), 및 Chambers et al., Nature biotechnology 30, 715-720 (2012)]에 개시되며, 이의 전문이 모든 목적을 위한 참조로 포함된다. 소정 구현예에서, 하나 이상의 SMAD 신호전달의 저해제는 LDN193189, 이의 유도체, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 소분자이다. "LDN193189"는 화학식 C25H22N6을 갖는 소분자 DM-3189, IUPAC 명칭 4-(6-(4-(피페라진-1-일)페닐)피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일)퀴놀린을 나타낸다. LDN193189는 SMAD 신호전달 저해제로서 기능할 수 있다. LDN193189는 또한 ALK2, ALK3, 및 ALK6, 단백질 티로신 키나제(PTK)의 매우 강력한 소분자 저해제로, I형 TGFβ 수용체의 ALK1 및 ALK3 패밀리의 구성원의 신호전달을 저해하며, 뼈 형태형성 단백질(BMP) BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, 및 Activin 사이토카인 신호 및 후속적으로 Smad1, Smad5, 및 Smad8의 SMAD 인산화를 포함하는 여러 생물학적 신호의 전달을 저해한다(Yu et al. (2008) Nat Med 14:1363-1369; Cuny et al. (2008) Bioorg. Med. Chem. Lett. 18: 4388-4392, 본원에 참조로 포함됨). 소정 구현예에서, LDN193189는 다음 구조를 갖는다:
Figure pct00002
본 발명은 추가로 줄기 세포의 집단의 피질 뉴런 또는 이의 전구체로의 분화 방법을 제공하며, 여기서 세포는 하나 이상의 Wnt 신호전달의 저해제, 예를 들어, 비제한적으로 XAV399, 탄키라제 저해제(Huang et al. Nature 461, 614-620 (2009)), Dickkopf(Dkk) 단백질, 분비된 Frizzled-Related 단백질(sFRP), IWR(Chen et al. Nature Chemical Biology 5(2): 100-107 (2009); Kulak et al., Molecular and Cellular Biology, 4;35(14):2425-35 (2015)), 2,4-디아미노-퀴나졸린(Chen et al., Bioorganic & medicinal chemistry letters, 1;19(17):4980-3 (2009)), IWP(Chen et al., Nat Chem Biol. 2009 Feb;5(2):100-7), LGK974, C59(Proffitt et al., Cancer Res. 2013 Jan 15;73(2):502-7), Ant1.4Br/Ant 1.4Cl(Morrell et al., PLoS One. 2008 Aug 13;3(8):e2930), 니클로스아마이드(Niclosamide)(Chen et al., Biochemistry. 2009 Nov 3;48(43):10267-74), 아피쿨라렌(apicularen) 및 바필로마이신(bafilomycin)(Cruciat et al., Science. 2010 Jan 22;327(5964):459-63), G007-LK 및 G244-LM(Lau et al., Cancer Res. 2013 May 15;73(10):3132-44), 피르비늄(pyrvinium)(Thorne et al., Nat Chem Biol. 2010 Nov;6(11):829-36), NSC668036(Shan et al., Biochemistry. 2005 Nov 29;44(47):15495-503), 퀘르세틴(Quercetin)(Park et al., Biochem Biophys Res Commun. 2005 Mar 4;328(1):227-34), ICG-001(Emami et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Aug 24;101(34):12682-7), PKF115-584(Lepourcelet et al., Cancer Cell. 2004 Jan;5(1):91-102), BC2059(Fiskus et al., Leukemia. 2015 Jun;29(6):1267-78), 시조카올(Shizokaol) D(Tang et al., PLoS One. 2016 Mar 24;11(3):e0152012), 및 이의 유도체와 접촉된다.
소정 구현예에서, XAV399는 화학식 C14H11F3N2OS를 갖는, 3,5,7,8-테트라하이드로-2-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-4H-티오피라노[4,3-d]피리미딘-4-온이다. 소정 구현예에서, XAV399는 다음 구조를 갖는다:
Figure pct00003
소정 구현예에서, 줄기 세포의 집단은 유효량의 하나 이상의 TGFβ/Activin-Nodal 신호전달의 저해제, 유효량의 하나 이상의 BMP 신호전달의 저해제, 및 유효량의 하나 이상의 Wnt 신호전달의 저해제와 접촉되며, 여기서 세포는 저해제에 적어도 약 4일, 적어도 약 5일, 적어도 약 6일, 적어도 약 7일, 적어도 약 8일, 적어도 약 9일, 적어도 약 10일, 적어도 약 11일, 적어도 약 12일, 적어도 약 13일, 적어도 약 14일, 적어도 약 15일, 적어도 약 16일, 적어도 약 17일, 적어도 약 18일, 적어도 약 19일, 적어도 약 20일 이상 동안 접촉되고, 세포는 하나 이상의 피질 뉴런 또는 이의 전구체의 마커를 발현하는 세포의 집단을 생성하기 위한 유효 농도의 상기 화합물과 접촉된다.
소정 구현예에서, 세포는 유효량의 저해제와 최대 약 4일, 최대 약 5일, 최대 약 6일, 최대 약 7일, 최대 약 8일, 최대 약 9일, 최대 약 10일, 최대 약 11일, 최대 약 12일, 최대 약 13일, 최대 약 14일, 최대 약 15일, 최대 약 16일, 최대 약 17일, 최대 약 18일, 최대 약 19일, 최대 약 20일 이상 동안 접촉되며, 여기서 세포는 하나 이상의 피질 뉴런 또는 이의 전구체의 마커를 발현하는 세포의 집단을 생성하기 위한 유효 농도의 상기 화합물과 접촉된다.
소정 구현예에서, 세포는 유효량의 저해제와 약 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일 이상 동안 접촉되며, 여기서 세포는 하나 이상의 피질 뉴런 또는 이의 전구체의 마커를 발현하는 세포의 집단을 생성하기 위한 유효 농도의 상기 화합물과 접촉된다.
소정 구현예에서, 세포가 하나 이상의 TGFβ/Activin-Nodal 신호전달의 저해제와 접촉되는 날은 0일에 해당하며, 세포는 저해제에 0일 내지 6일, 또는 0일 내지 7일 동안 접촉된다.
소정 구현예에서, 세포는 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/Activin-Nodal 신호전달의 저해제와 약 1 내지 20 μM, 약 2 내지 18 μM, 약 4 내지 16 μM, 약 6 내지 14 μM, 약 8 내지 12 μM, 또는 약 10 μM의 농도로 접촉된다.
소정 구현예에서, 세포는 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/Activin-Nodal 신호전달의 저해제와 약 1 내지 18 μM, 약 1 내지 16 μM, 약 1 내지 14 μM, 약 1 내지 12 μM, 약 1 내지 10 μM, 약 1 내지 8 μM, 약 1 내지 6 μM, 약 1 내지 4 μM, 또는 약 1 내지 2 μM의 농도로 접촉된다.
소정 구현예에서, 세포는 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/Activin-Nodal 신호전달의 저해제와 약 2 내지 20 μM, 약 4 내지 20 μM, 약 6 내지 20 μM, 약 8 내지 20 μM, 약 10 내지 20 μM, 약 12 내지 20 μM, 약 14 내지 20 μM, 약 16 내지 20 μM, 또는 약 18 내지 20 μM의 농도로 접촉된다.
소정 구현예에서, 세포는 BMP 신호전달의 저해제와 약 10 내지 500 nM, 약 25 내지 475 nM, 약 50 내지 450 nM, 약 100 내지 400 nM, 약 150 내지 350 nM, 약 200 내지 300 nM, 또는 약 250 ㎚ 또는 약 100 nM, 또는 약 50 nM의 농도로 접촉된다.
소정 구현예에서, 세포는 BMP 신호전달의 저해제와 약 10 내지 475 nM, 약 10 내지 450 nM, 약 10 내지 400 nM, 약 10 내지 350 nM, 약 10 내지 300 nM, 약 10 내지 250 nM, 약 10 내지 200 nM, 약 10 내지 150 nM, 약 10 내지 100 nM, 또는 약 10 내지 50 nM의 농도로 접촉된다.
소정 구현예에서, 세포는 BMP 신호전달의 저해제와 약 25 내지 500 nM, 약 50 내지 500 nM, 약 100 내지 500 nM, 약 150 내지 500 nM, 약 200 내지 500 nM, 약 250 내지 500 nM, 약 300 내지 500 nM, 약 350 내지 500 nM, 약 400 내지 500 nM, 또는 약 450 내지 500 nM의 농도로 접촉된다.
소정 구현예에서, 세포는 Wnt 신호전달의 저해제와 약 0.1 내지 10 μM, 약 0.5 내지 8 μM, 약 1 내지 6 μM, 약 2 내지 5.5 μM, 또는 약 5 μM, 또는 약 2 μM, 또는 약 1 μM의 농도로 접촉된다.
소정 구현예에서, 세포는 Wnt 신호전달의 저해제와 약 0.1 내지 8 μM, 약 0.1 내지 6 μM, 약 0.1 내지 4 μM, 약 0.1 내지 2 μM, 약 0.1 내지 1 μM, 또는 약 0.1 내지 0.5 μM의 농도로 접촉된다.
소정 구현예에서, 세포는 Wnt 신호전달의 저해제와 약 0.5 내지 10 μM, 약 1 내지 10 μM, 약 2 내지 0 μM, 약 4 내지 10 μM, 약 6 내지 10 μM, 또는 약 8 내지 10 μM의 농도로 접촉된다.
소정 구현예에서, 줄기 세포는 추가로 유효량의 하나 이상의 FGF 신호전달의 저해제, 예를 들어, SU5402(Sun et al., Journal of medicinal chemistry 42, 5120-5130 (1999); Paterson et al. Br. J. Haematol. 124 595 (2004); Tanaka et al., Nature 435:172 (2005)), PD 173074(N-[2-[[4-(디에틸아미노)부틸]아미노]-6-(3,5-디메톡시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘-7-일]-N'-(1,1-디메틸에틸)우레아; Bansal et al., J.Neurosci.Res., 2003;74:486), FIIN 1 하이드로클로라이드(N-(3-((3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-7-(4-(디에틸아미노)부틸아미노)-2-옥소-3,4-디하이드로피리미도[4,5-d]피리미딘-1(2H)-일)메틸)페닐)아크릴아마이드; Zhou, Chem.Biol., 2010;17:285), SU6668(5-[1,2-디하이드로-2-옥소-3H-인돌-3-일리덴)메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-프로판산; Yamamoto et al., Cancer Res. 2008 Dec 1;68(23):9754-62), PD 166285 디하이드로클로라이드(6-(2,6-디클로로페닐)-2-[[4-[2-(디에틸아미노)에톡시]페닐]아미노]-8-메틸피리도[2,3-d]피리미딘-7(8H)-온 디하이드로클로라이드; Panek et al., J Pharmacol Exp Ther. 1997 Dec;283(3):1433-44), PD 161570(N-[6-(2,6-디클로로페닐)-2-[[4-(디에틸아미노)부틸]아미노]피리도[2,3-d]피리미딘-7-일]-N'-(1,1-디메틸에틸)우레아; Hamby et al., J Med Chem. 1997 Jul 18;40(15):2296-303), AP 24534(3-(2-이미다조[1,2-b]피리다진-3-일에티닐)-4-메틸-N-[4-[(4-메틸-1-피페라지닐)메틸]-3-(트리플루오로메틸)페닐]-벤즈아마이드; Huang et al., J.Med.Chem., 2010;53:4701), 또는 이의 유도체와 접촉된다.
소정 구현예에서, 용어 "SU5402"는 화학식 C17H16N2O3 및 화학명: 2-[(1,2-디하이드로-2-옥소-3H-인돌-3-일리덴)메틸]-4-메틸-1H-피롤-3-프로판산을 갖는 소분자를 나타낸다. 소정 구현예에서, SU5402는 다음 구조를 갖는다:
Figure pct00004
소정 구현예에서, 줄기 세포는 추가로 유효량의 하나 이상의 Notch 신호전달의 저해제, 예를 들어, DAPT(Dovey et al., Journal of neurochemistry 76, 173-181(2001)), 베가세스타트(Begacestat)(5-클로로-N-[(1S)-3,3,3-트리플루오로-1-(하이드록시메틸)-2-(트리플루오로메틸)프로필]-2-티오펜설폰아마이드; Mayer et al., J.Med.Chem. 51:7348 (2008)), DBZ(N-[(1S)-2-[[(7S)-6,7-디하이드로-5-메틸-6-옥소-5H-디벤즈[b,d]아제핀-7-일]아미노]-1-메틸-2-옥소에틸]-3,5-디플루오로벤젠아세트아마이드; van Es et al., Nature 435:959 (2005)), BMS 299897(2-[(1R)-1-[[(4-클로로페닐)설포닐](2,5-디플루오로페닐)아미노]에틸-5-플루오로벤젠부탄산; Goldstein et al., J.Pharmacol.Exp.Ther. 323:102 (2007)), 화합물 W(3,5-비스(4-니트로페녹시)벤조산; Okochi et al., J.Biol.Chem. 281:7890 (2006)), 플루리잔(Flurizan)((R)-2-플루오로-α-메틸[1,1'-바이페닐]-4-아세트산; Eriksen et al., J.Clin.Invest. 112:440 (2003)), L-685,458((5S)-(tert-부톡시카보닐아미노)-6-페닐-(4R)-하이드록시-(2R)-벤질헥사노일)-L-류시-L-페닐알라닌아마이드; Shearman et al., Biochemistry 39:8698(2000)), JLK 6(7-아미노-4-클로로-3-메톡시-1H-2-벤조피란; Petit et al., Nat.Cell.Biol. 3:507(2001)), MRK 560(N-[시스-4-[(4-클로로페닐)설포닐]-4-(2,5-디플루오로페닐)사이클로헥실]-1,1,1-트리플루오로메탄설폰아마이드; Best et al., J.Pharm.Exp.Ther. 317:786(2006)), PF 3084014 하이드로브로마이드((2S)-2-[[(2S)-6,8-디플루오로-1,2,3,4-테트라하이드로-2-나프탈레닐]아미노]-N-[1-[2-[(2,2-디메틸프로필)아미노]-1,1-디메틸에틸]-1H-이미다졸-4-일]펜탄아마이드 디하이드로브로마이드; Lanz et al., J.Pharmacol.Exp.Ther. 334:269 (2010)), 또는 이의 유도체와 접촉된다.
소정 구현예에서, 용어 "DAPT"는 C23H26F2N2O4의 화학식을 가지며, 다르게는 N-[(3,5-디플루오로페닐)아세틸]-L-알라닐-2-페닐]글리신-1,1-디메틸 에틸 에스테르; LY-374973, N--[N-(3,5-디플루오로펜아세틸)-L-알라닐]-S-페닐글리신 t-부틸 에스테르; N--[N-(3,5-디플루오로펜아세틸)-L-알라닐]-S-페닐글리신 t-부틸 에스테르로 알려져 있는 디펩타이드성 γ-시크리타제-특이적 저해제로 기재되는, NOTCH를 저해하는 γ-시크리타제 저해제의 일례를 나타낸다. DAPT 유도체의 일례는, 광활성화 가능한 DAPT 유도체, DAP-BpB(N--[N-(3,5-디플루오로펜아세틸)-L-알라닐]-(S)-페닐글리신-4-(4-(8-바이오틴아마이도)옥틸아미노)벤조일)벤질)메틸아마이드)이다. 소정 구현예에서, DAPT는 다음 구조를 갖는다:
Figure pct00005
소정 구현예에서, 줄기 세포는 추가로 유효량의 하나 이상의 MAPK/ERK 키나제의 저해제, 예를 들어, PD198306(Ciruela et al., British Journal of Pharmacology 138(5):751-6(2003); Pelletier et al., Arthritis & Rheumatism, 48: 1582-1593(2003)), PD0325901(N-[(2R)-2,3-디하이드록시프로폭시]-3,4-디플루오로-2-[(2-플루오로-4-요오도페닐)아미노]-벤즈아마이드; Barrett et al., Bioorganic & medicinal chemistry letters 18, 6501-6504 (2008)), 10Z-하이메니알디신(Hymenialdisine)((4Z)-4-(2-아미노-1,5-디하이드로-5-옥소-4H-이미다졸-4-일리덴)-2-브로모-4,5,6,7-테트라하이드로피롤로[2,3-c]아제핀-8(1H)-온; Breton et al., J.Pharmacol.Exp.Ther. 282:459 (1997)), PD 184352(2-[(2-클로로-4-요오도페닐)아미노]-N-사이클로프로필메톡시)-3,4-디플루오로벤즈아마이드; Allen et al., Semin.Oncol. 30:105 (2003)), PD 198306(N-(사이클로프로필메톡시)-3,4,5-트리플루오로-2-[(4-요오도-2-메틸페닐)아미노]-벤즈아마이드; Pelletier et al., Arthrit.Rheumat. 48:1582 (2003)), PD 334581(N-[5-[3,4-디플루오로-2-[(2-플루오로-4-요오도페닐)아미노]페닐]-1,3,4-옥사디아졸-2-일]-4-모르폴린에탄아민; Ohren et al., Nat.Struct.Mol.Biol. 11:1192 (2004)), PD 98059(2-(2-아미노-3-메톡시페닐)-4H-1-벤조피란-4-온; Dudley et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 92:7686 (1995)), SL 327(α-[아미노[(4-아미노페닐)티오]메틸렌]-2-(트리플루오로메틸)벤젠아세토니트릴; Wang et al., J.Pharmacol.Exp.Ther. 304:172 (2003)), U1024(비스[아미노(메틸티오)메틸렌]부탄디니트릴; Favata et al., J.Biol.Chem. 273:18623(1998)), U0126(1,4-디아미노-2,3-디시아노-1,4-비스[2-아미노페닐티오]부탄디엔; Favata et al., J.Biol.Chem. 273:18623(1998)), 아크티게닌(Arctigenin)((3R,4R)-4-[(3,4-디메톡시페닐)메틸]디하이드로-3-[(4-하이드록시-3-메톡시페닐)메틸]-2(3H)-푸라논; Jang et al. J.Neurosci.Res. 68:233 (2002)), BIX 02189((3Z)-3-[[[3-[(디메틸아미노)메틸]페닐]아미노]페닐메틸렌]-2,3-디하이드로-N,N-디메틸-2-옥소-1H-인돌-6-카복사마이드; Tatake et al., Biochem.Biophys.Res.Comm. 377:120 (2008)), 또는 이의 유도체와 접촉된다.
소정 구현예에서, 용어 "PD0325901"은 화학식 C16H14F3IN2O4 및 화학명 N-(2,3-디하이드록시-프로폭시)-3,4-디플루오로-2-(2-플루오로-4-요오도-페닐아미노)-벤즈아마이드를 갖는 소분자를 나타낸다. 소정 구현예에서, PD0325901은 다음 구조를 갖는다:
Figure pct00006
소정 구현예에서, 유효량의 저해제는 세포에 적어도 약 4일, 적어도 약 5일, 적어도 약 6일, 적어도 약 7일, 적어도 약 8일, 적어도 약 9일, 적어도 약 10일, 적어도 약 11일, 적어도 약 12일, 적어도 약 13일, 적어도 약 14일, 적어도 약 15일, 적어도 약 16일, 적어도 약 17일, 적어도 약 18일, 적어도 약 19일, 적어도 약 20일 이상 동안 접촉된다.
소정 구현예에서, 세포는 유효량의 하나 이상의 FGF 신호전달의 저해제, 하나 이상의 Notch 신호전달의 저해제, 및 하나 이상의 MAPK/ERK 키나제의 저해제에 최대 4일, 최대 5일, 최대 6일, 최대 7일, 최대 8일, 최대 9일, 최대 10일, 최대 11일, 최대 12일, 최대 13일, 최대 14일, 최대 15일, 최대 16일, 최대 17일, 최대 18일, 최대 19일, 최대 20일 이상 동안 접촉된다.
소정 구현예에서, 세포가 유효량의 하나 이상의 TGFβ/Activin-Nodal 신호전달의 저해제, 하나 이상의 BMP 신호전달의 저해제, 및/또는 하나 이상의 Wnt 신호전달의 저해제에 최초 접촉된 후, 적어도 약 1일, 적어도 약 2일, 적어도 약 3일, 적어도 약 4일 또는 적어도 약 5일 후 유효량의 하나 이상의 FGF 신호전달의 저해제, 하나 이상의 Notch 신호전달의 저해제, 및 하나 이상의 MAPK/ERK 키나제의 저해제가 인간 줄기 세포에 접촉된다. 소정 구현예에서, 세포가 유효량의 (i), (ii) 및 (iii) 저해제와 최초 접촉된 약 24시간, 약 48시간, 약 72시간, 약 96시간, 약 120시간, 또는 약 144시간 후 세포는 유효량(들)의 (iv), (v) 및/또는 (vi) 저해제와 최초 접촉된다.
소정 구현예에서, 세포가 유효량의 하나 이상의 TGFβ/Activin-Nodal 신호전달의 저해제, 하나 이상의 BMP 신호전달의 저해제, 및/또는 하나 이상의 Wnt 신호전달의 저해제와 최초 접촉된 최대 약 1일, 2일, 3일, 4일 또는 5일 후 유효량의 하나 이상의 FGF 신호전달의 저해제, 하나 이상의 Notch 신호전달의 저해제, 및 하나 이상의 MAPK/ERK 키나제의 저해제가 인간 줄기 세포에 접촉된다.
소정 구현예에서, 세포는 유효량의 하나 이상의 FGF 신호전달의 저해제, 하나 이상의 Notch 신호전달의 저해제, 및 하나 이상의 MAPK/ERK 키나제의 저해제에 약 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일 이상 동안 접촉되며, 여기서 세포는 하나 이상의 피질 뉴런 또는 이의 전구체의 마커를 발현하는 세포의 집단을 생성하기 위한 유효 농도의 상기 화합물과 접촉된다.
소정 구현예에서, 세포는 Notch 신호전달의 저해제와 약 1 내지 20 μM, 약 2 내지 18 μM, 약 4 내지 16 μM, 약 6 내지 14 μM, 약 8 내지 12 μM, 또는 약 10 μM, 또는 약 5 μM의 농도로 접촉된다.
소정 구현예에서, 세포는 Notch 신호전달의 저해제와 약 2 내지 20 μM, 약 4 내지 20 μM, 약 6 내지 20 μM, 약 8 내지 20 μM, 약 10 내지 20 μM, 약 12 내지 20 μM, 약 14 내지 20 μM, 약 16 내지 20 μM, 또는 약 18 내지 20 μM의 농도로 접촉된다.
소정 구현예에서, 세포는 Notch 신호전달의 저해제와 약 1 내지 18 μM, 약 1 내지 16 μM, 약 1 내지 14 μM, 약 1 내지 12 μM, 약 1 내지 10 μM, 약 1 내지 8 μM, 약 1 내지 6 μM, 약 1 내지 4 μM, 또는 약 1 내지 2 μM의 농도로 접촉된다.
소정 구현예에서, 세포는 FGF 신호전달의 저해제와 약 0.5 내지 20 μM, 약 1 내지 18 μM, 약 2 내지 16 μM, 약 4 내지 14 μM, 약 6 내지 12 μM, 약 8 내지 10 μM, 또는 약 2 μM, 또는 약 5 μM, 또는 약 10 μM의 농도로 접촉된다.
소정 구현예에서, 세포는 FGF 신호전달의 저해제와 약 0.5 내지 18 μM, 약 0.5 내지 16 μM, 약 0.5 내지 14 μM, 약 0.5 내지 12 μM, 약 0.5 내지 10 μM, 약 0.5 내지 8 μM, 약 0.5 내지 6 μM, 약 0.5 내지 4 μM, 약 0.5 내지 2 μM, 약 0.5 내지 1 μM의 농도로 접촉된다.
소정 구현예에서, 세포는 FGF 신호전달의 저해제와 약 1 내지 20 μM, 약 2 내지 20 μM, 약 4 내지 20 μM, 약 6 내지 20 μM, 약 8 내지 20 μM, 약 10 내지 20 μM, 약 12 내지 20 μM, 약 14 내지 20 μM, 약 16 내지 20 μM, 또는 약 18 내지 20 μM의 농도로 접촉된다.
소정 구현예에서, 세포는 MAPK/ERK 키나제 신호전달의 저해제와 약 0.01 내지 20 μM, 약 0.1 내지 18 μM, 약 1 내지 16 μM, 약 2 내지 14 μM, 약 3 내지 12 μM, 약 4 내지 10 μM, 약 5 내지 약 8 μM, 또는 약 0.4 μM, 또는 약 1 μM, 또는 약 8 μM의 농도로 접촉된다.
소정 구현예에서, 세포는 MAPK/ERK 키나제 신호전달의 저해제와 약 0.01 내지 18 μM, 약 0.01 내지 16 μM, 약 0.01 내지 14 μM, 약 0.01 내지 12 μM, 약 0.01 내지 10 μM, 약 0.01 내지 8 μM, 약 0.01 내지 6 μM, 약 0.01 내지 4 μM, 약 0.01 내지 2 μM, 약 0.01 내지 1 μM의 농도로 접촉된다.
소정 구현예에서, 세포는 MAPK/ERK 키나제 신호전달의 저해제와 약 0.1 내지 20 μM, 약 1 내지 20 μM, 약 2 내지 20 μM, 약 4 내지 20 μM, 약 6 내지 20 μM, 약 8 내지 20 μM, 약 10 내지 20 μM, 약 12 내지 20 μM, 약 14 내지 20 μM, 약 16 내지 20 μM, 또는 약 18 내지 20 μM의 농도로 접촉된다.
소정 구현예에서, 본 발명의 개시는 인간 줄기 세포의 피질 뉴런, 또는 이의 전구체로의 분화 방법을 제공하며, 여기서 세포는 (i) 유효량의 TGFβ/Activin-Nodal 신호전달의 저해제(예컨대, 10 μM), (ii) 유효량의 BMP 신호전달의 저해제(예컨대, 250 nM), (iii) 유효량의 Wnt 신호전달의 저해제(예컨대, 5 μM), (iv) 유효량의 Notch 신호전달의 저해제(예컨대, 10 μM), (v) 유효량의 FGF 신호전달의 저해제(예컨대, 5 또는 10 μM), 및 (vi) 유효량의 MAPK/ERK 신호전달의 저해제(예컨대, 1 또는 8 μM)와 접촉된다. 소정 구현예에서, 세포가 유효량의 (i)와 최초 접촉된 적어도 2일 후 (iv), (v) 및 (vi)은 세포에 접촉된다.
소정 구현예에서, 본 발명의 개시는 인간 줄기 세포의 피질 뉴런, 또는 이의 전구체로의 분화 방법을 제공하며, 여기서 세포는 (i) 유효량의 TGFβ/Activin-Nodal 신호전달의 저해제(예컨대, 10 μM), (ii) 유효량의 BMP 신호전달의 저해제(예컨대, 100 nM), (iii) 유효량의 Wnt 신호전달의 저해제(예컨대, 2 μM), (iv) 유효량의 Notch 신호전달의 저해제(예컨대, 5 μM), (v) 유효량의 FGF 신호전달의 저해제(예컨대, 2 μM), 및 (vi) 유효량의 MAPK/ERK 신호전달의 저해제(예컨대, 0.4 μM)와 접촉된다. 소정 구현예에서, 세포가 유효량의 (i)와 최초 접촉된 적어도 3일 후 (iv), (v) 및 (vi)은 세포에 접촉된다.
소정 구현예에서, 저해제 (i), (ii) 및 (iii)의 농도는 적어도, 또는 최대, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 또는 6일 동안 세포와 접촉 후 약 10, 20, 30, 40, 50, 60 또는 70%만큼 감소된다.
소정 구현예에서, 방법은 추가로 세포를 유효 농도의 하나 이상의 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF), cAMP, 및 아스코르브산 신호전달의 활성화제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 분화된 세포의 집단을 상기 세포의 피질 뉴런의 집단으로의 성숙을 선호하는 조건으로 처리하는 단계를 포함한다. 소정 구현예에서, 세포가 유효 농도의 (i), 즉 하나 이상의 TGFβ/Activin-Nodal 신호전달의 저해제와 최초 접촉된 적어도, 또는 최대 약 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일 또는 12일 후 세포는 상기 성숙 화합물과 접촉된다.
소정 구현예에서, 성숙을 선호하는 조건은 적합한 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 소정 구현예에서, 적합한 세포 배양 배지는 신경기본(NB) 배지를 포함한다. 소정 구현예에서, 적합한 세포 배양 배지는 L-글루타민, 및 B27(예컨대, Life Technologies 공급)이 보충된 NB 배지이다.
소정 구현예에서, 본원에 기재되는 방법에 따라 접촉되는 세포는 유효량의 TGFβ/Activin-Nodal 신호전달의 저해제와 최초 접촉된 적어도, 또는 최대, 약 4일, 5일, 6일, 7일 또는 8일 이상 후 검출 가능한 수준의 PAX6(paired box 6)을 발현한다.
소정 구현예에서, 세포는 세포가 검출 가능한 수준의 PAX6을 발현하는 시기 동안 유효 농도의 (i) 내지 (vi)과 접촉된다. 소정 구현예에서, 상기 시기는 세포가 유효 농도의 저해제 (i), 즉, 하나 이상의 TGFβ/Activin-Nodal 신호전달의 저해제와 최초 접촉된 약 4일, 5일, 6일, 7일 또는 8일 후이다.
소정 구현예에서, PAX6의 발현은 세포 집단의 세포의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 이상에서 검출 가능하다. 소정 구현예에서, 본원에 기재되는 방법에 따라 접촉되는 세포는 TGFβ/Activin-Nodal 신호전달의 저해제와 최초 접촉된 약 6일 후 검출 가능한 수준의 PAX6을 발현한다.
소정 구현예에서, 본원에 기재되는 방법에 따라 접촉되는 세포는 TGFβ/Activin-Nodal 신호전달의 저해제와 최초 접촉된 적어도, 또는 최대, 약 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일 또는 16일 이상 후 검출 가능한 수준의 TUJ1(클래스 III 베타-튜불린), FOXG1(Forkhead Box G1), 및/또는 DCX(doublecortin)를 발현한다.
소정 구현예에서, 세포가 검출 가능한 수준의 TUJ1, FOXG1, 및/또는 DCX를 발현하는 시기 동안 세포는 유효 농도의 (i) 내지 (vi)과 접촉된다. 소정 구현예에서, 상기 시기는 세포가 유효 농도의 저해제 (i), 즉, 하나 이상의 TGFβ/Activin-Nodal 신호전달의 저해제와 최초 접촉된 약 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일 또는 16일 후이다.
소정 구현예에서, 본원에 기재되는 방법에 따라 접촉되는 세포는 유효량의 TGFβ/Activin-Nodal 신호전달의 저해제와 최초 접촉된 약 13일 후 검출 가능한 수준의 TUJ1을 발현한다.
소정 구현예에서, TUJ1의 발현은 세포 집단의 세포의 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 이상에서 검출 가능하다. 소정 구현예에서, 세포는 추가로 TBR1(T-박스, 뇌 1) 및/또는 TLE4(split 4의 transducin 유사 인핸서)를 공동 발현한다.
소정 구현예에서, 본원에 기재되는 방법에 따라 접촉되는 세포는 검출 가능한 수준의 TUJ1을 발현하며, 여기서 세포의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상은 또한 검출 가능한 수준의 TBR1, TLE4, 또는 이의 조합을 발현한다.
소정 구현예에서, 세포가 검출 가능한 수준의 TUJ1 및 TBR1 및/또는 TLE4 중 하나 또는 둘 다를 발현하는 시기 동안 세포는 유효 농도의 (i) 내지 (vi)과 접촉된다.
소정 구현예에서, 검출 가능한 수준의 PAX6, TUJ1, FOXG1, DCX, TBR1, TLE4, 또는 이의 임의의 조합을 발현하는 상기 세포는 인접 피질 뉴런 전구체이다.
소정 구현예에서 본원에 기재되는 방법에 따라 접촉되는 세포는 유효량의 TGFβ/Activin-Nodal 신호전달의 저해제와 최초 접촉된 후 적어도, 또는 최대, 약 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 20일, 25일, 30일, 33일 이상 후 TBR1(T-박스, 뇌 1), TLE4(split 4의 transducin 유사 인핸서), DCX(doublecortin), RELN(reelin), CTIP2(B-세포 림프종/백혈병 11B), SATB2(SATB 호메오박스 2), FOXP2(forkhead 박스 단백질 P2), RGS4(G 단백질 신호전달 4의 조절제), CUX2(cut 유사 호메오박스 2), BLBP(뇌 지질 결합 단백질), 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 검출 가능한 수준의 피질 뉴런 마커를 발현한다.
소정 구현예에서, TBR1, TLE4, DCX, REELIN, CTIP2, SATB2, FOXP2, RGS4, CUX2, 및/또는 BLBP의 발현은 세포 집단의 세포의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상에서 검출 가능하다. 소정 구현예에서, 세포는 또한 검출 가능한 수준의 TUJ1을 발현한다.
본원에 개시되는 요지 사안은 또한 본원에서 기재되는 방법에 의해 생성되는 시험관내 분화된 세포의 집단, 및 이러한 시험관내 분화된 세포를 포함하는 조성물을 제공한다.
소정 구현예에서, 본원에 기재되는 방법에 따라 제조되는 세포는 유효량의 TGFβ/Activin-Nodal 신호전달의 저해제와 접촉된 후 적어도, 또는 최대, 약 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일 이상 후 성숙한 분화된 피질 뉴런의 전기생리적 특성을 나타낸다.
소정 구현예에서, 줄기 세포는 유효량의 저해제 (i) 내지 (iii)과 적어도 약 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 또는 10일 이상 동안 접촉되고 유효량의 저해제 (iv) 내지 (vi)과 적어도 약 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 또는 10일 이상 동안 접촉되고, 이어서 추가로 적어도 약 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 또는 10일 이상 동안 유효량의 Wnt 신호전달의 활성화제, 예를 들어, GSK3β 저해제, 예컨대 CHIR99021(WO2011/149762; 및 Calder et al., J Neurosci. 2015 Aug 19;35(33):11462-81); 유효량의 MAPK/ERK 키나제의 저해제; 유효량의 Notch 신호전달의 저해제; 및/또는 유효량의 FGF 신호전달의 저해제와 접촉된다.
소정 구현예에서, 방법은 (a) 인간 다능성 줄기 세포를 유효 농도의 (i) 하나 이상의 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/Activin-Nodal 신호전달의 저해제, (ii) 하나 이상의 뼈 형태형성 단백질(BMP) 신호전달의 저해제, (iii) 하나 이상의 Wnt 신호전달의 저해제와 최초 접촉시키는 단계; (b) 상기 세포를 적어도 약 6일 또는 7일 동안 유효 농도의 (i) 하나 이상의 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/Activin-Nodal 신호전달의 저해제, (ii) 하나 이상의 뼈 형태형성 단백질(BMP) 신호전달의 저해제, (iii) 하나 이상의 Wnt 신호전달의 저해제와 배양하는 단계; (c) 상기 세포를 (a)의 적어도 약 2일 또는 3일 후, 유효 농도의 (iv) 하나 이상의 MAPK/ERK 키나제 신호전달의 저해제, (v) 하나 이상의 FGF 신호전달의 저해제, 및 (vi) 하나 이상의 Notch 신호전달의 저해제와 최초 접촉시키는 단계; 및 (d) 상기 세포를 적어도 약 10일 또는 11일 또는 상기 세포의 적어도 20%가 TUJ1을 발현할 때까지 유효 농도의 (iv) 하나 이상의 MAPK/ERK 키나제 신호전달의 저해제, (v) 하나 이상의 FGF 신호전달의 저해제, 및 (vi) 하나 이상의 Notch 신호전달의 저해제와 배양하는 단계를 포함한다.
소정 구현예에서, 줄기 세포는 유효량의 저해제 (i) 내지 (iii)과 적어도 약 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 또는 10일 이상 동안 접촉되고, 유효량의 저해제 (iv) 내지 (vi)과 적어도 약 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 또는 10일 이상 동안 접촉되고, 이어서 추가로 적어도 약 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 또는 10일 이상 동안 유효량의 하나 이상의 Notch 신호전달의 저해제와 접촉된다.
소정 구현예에서, 상술된 저해제, 활성화제 및 분자는 줄기 세포를 포함하는 세포 배양 배지에 첨가된다. 적합한 세포 배양 배지에는 비제한적으로 Knockout® 혈청 대체(rum Replacement, "KSR") 배지, N2 배지, 및 Essential 8®/Essential 6®("E8/E6") 배지, 및 신경기본(NB) 배지(예컨대, N2 및 B-27® 보충물질로 보충된 NB 배지)가 포함된다. KSR 배지, N2 배지, E8/E6 배지 및 NB 배지는 상업적으로 이용 가능하다.
KSR 배지는 배양에서 분화되지 않은 hESC를 성장시키고 유지하기 위해 최적화된, 정의된, 무혈청 제형물이다. KSR 배지의 성분은 WO2011/149762에 개시되어 있다. 소정 구현예에서, KSR 배지는 Knockout DMEM, Knockout 혈청 대체물질, L-글루타민, Pen/Strep, MEM, 및 β-머캅토에탄올을 포함한다.
E8/E6 배지는 인간 다능성 줄기 세포의 성장 및 증식을 지지하는 영양세포-비함유 및 생체이물(xeno)-비함유 배지이다. E8/E6 배지는 체세포 재프로그래밍을 지지하는 것으로 증명되었다. 또한, E8/E6 배지는 PSC의 배양을 위한 맞춤 배지의 제형화를 위한 기재로서 사용될 수 있다. E8/E6 배지의 일례는 문헌[Chen et al., Nat Methods. 2011 May;8(5):424-9]에 기재되어 있으며, 이 전문이 참조로 포함된다. E8/E6 배지의 일례는 WO15/077648에 개시되어 있으며, 이 전문이 참조로 포함된다. 소정 구현예에서, E8/E6 세포 배양 배지는 DMEM/F12, 아스코르브산, 셀레늄, 인슐린, NaHCO3, 트랜스페린, FGF2 및 TGFβ를 포함한다. 소정 구현예에서, E6 배지에는 FGF2 및 TGFβ가 포함되지 않는다. E8/E6 배지는 E8/E6 배지에 활성 BMP 또는 Wnt 구성성분이 포함되지 않는다는 점에서 KSR 배지와 상이하다. 따라서, 소정 구현예에서, E8/E6 배지가 본원에 개시되는 줄기 세포의 집단을 배양하여 피질 뉴런의 집단으로 분화시키기 위해 사용되는 경우, 하나 이상의 BMP의 저해제가 E8/E6 배지에 첨가될 것이 요구되지 않는다.
N2 보충물질은 배양에서 분화되지 않은 신경 줄기 및 선조체 세포의 증식을 위해 사용되는, 화학적으로 정의된, 동물성 물질-비함유 보충물질이다. N2 보충물질은 DMEM/F12 배지와 사용하기 위한 것이다. N2 배지의 성분은 WO2011/149762에 개시되어 있다. 소정 구현예에서, N2 배지는 글루코스, 나트륨 바이카보네이트, 푸트레신, 프로게스테론, 나트륨 셀레나이트, 트랜스페린, 및 인슐린이 보충된 DMEM/F12 배지를 포함한다.
소정 구현예에서, 줄기 세포는 KSR 배지, 또는 E6 배지에서 최초 배양되며, 이는 줄기 세포와 적어도 하나의 상술된 저해제, 및 활성화제의 최초 접촉 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일 또는 약 12일 후부터 증가하는 양의 N2/B27 배지로 점차 대체된다. 소정 구현예에서, 줄기 세포는 KSR 배지에서 최초 배양되며, 이는 줄기 세포와 적어도 하나의 상술된 저해제, 및 활성화제의 최초 접촉 약 4일 후(예컨대, 줄기 세포와 하나 이상의 TGFβ/Activin-Nodal 신호전달의 저해제의 최초 접촉 4일 후)부터 증가하는 양의 N2/B27 배지로 점차 대체된다. 소정 구현예에서, 줄기 세포는 E6 배지에서 최초 배양되며, 이는 줄기 세포와 적어도 하나의 상술된 저해제, 및 활성화제의 최초 접촉 약 5일 후(예컨대, 줄기 세포와 하나 이상의 TGFβ/Activin-Nodal 신호전달의 저해제의 최초 접촉 5일 후)부터 증가하는 양의 N2/B27 배지로 점차 대체된다.
분화된 피질 뉴런, 또는 이의 전구체는 분화 후, 예컨대, 세포 배양 배지에서 정제될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "정제된", "정제하다", "정제", "단리된", "단리하다" 및 "단리"는 샘플로부터 적어도 하나의 오염물질의 양 감소를 나타낸다. 예를 들어, 요망되는 세포 유형은 적어도 10% 만큼, 적어도 30% 만큼, 적어도 50% 만큼, 적어도 75% 만큼, 적어도 90% 만큼, 적어도 95% 만큼, 적어도 99% 만큼, 적어도 99.5% 만큼, 또는 적어도 99.9% 이상 만큼 정제되며, 바람직하지 못한 세포 유형의 양이 대응해서 감소된다. 용어 "정제하다"는 샘플로부터 소정 세포(예컨대, 바람직하지 못한 세포)의 제거를 나타낼 수 있다. 비-피질 뉴런 세포, 또는 이의 전구체의 제거 또는 선택은 샘플에서 요망되는 세포의 백분율 증가를 일으킨다. 소정 구현예에서, 세포는 혼합된 세포 집단을 적어도 하나의 피질 뉴런 마커를 발현하는 세포로 정렬함으로써 정제된다. 소정 구현예에서, 세포는 혼합된 세포 집단을 적어도 하나의 장 피질 뉴런 마커, 예컨대, TBR1, TLE4, DCX, REELIN, CTIP2, SATB2, FOXP2, RGS4, CUX2, BLBP, 또는 이의 조합을 발현하는 세포로 정렬함으로써 정제된다.
5.3. 분화된 세포 집단을 포함하는 조성물
본 발명의 개시는 또한 본원에서 기재되는 방법에 따라 제조되는, 하나 이상의 뉴런 마커, 예를 들어, 피질 뉴런 마커를 발현하는 시험관내 분화된 세포, 또는 이의 전구체 세포의 집단을 제공한다. 소정 구현예에서, 적어도 약 70%(예컨대, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 99.5%, 또는 적어도 99.9%)의 세포의 집단은 하나 이상의 피질 뉴런 마커, 예를 들어, TBR1, TLE4, DCX, REELIN, CTIP2, SATB2, FOXP2, RGS4, CUX2, BLBP, 또는 이의 조합을 발현한다.
소정 구현예에서, 약 15% 미만(예컨대, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 약 1% 미만, 약 0.5% 미만, 또는 약 0.1% 미만)의 세포의 집단은 줄기 세포 마커(예컨대, OCT4(팔량체-결합 전사 인자 4), NANOG(Nanog 호메오박스), SOX2(SRY-박스 2), LIN28(Lin-28 상동체 A), SSEA4(단계-특이적 배아 항원-4) 및/또는 SSEA3(단계-특이적 배아 항-3), 아교 세포 마커(예컨대, GFAP(아교세포 섬유 산성 단백질), AQP4(Aquaporin 4), 및/또는 OLIG2(희소돌기아교세포 계통 전사 인자 2)), 망막 세포 마커(예컨대, CHX10(시각계 호메오박스 2)), 말초 감각 뉴런(예컨대, BRN3A(뇌-특이적 호메오박스/POU 도메인 단백질 3A), 및/또는 ISL1(ISL LIM 호메오박스 1)), 신경 능선 전구체(예컨대, SOX10(SRY-박스 10)), 또는 두개 원판 전구체(예컨대, SIX1(SIX 호메오박스 1))로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 발현한다.
소정 구현예에서, 분화된 세포 집단은 인간 줄기 세포의 집단으로부터 유도된다. 본원에 개시되는 요지 사안은 추가로 이러한 분화된 세포 집단을 포함하는 조성물을 제공한다.
소정 구현예에서, 조성물은 약 1 × 104 내지 약 1 × 1010개, 약 1 × 104 내지 약 1 × 105개, 약 1 × 105 내지 약 1 × 109개, 약 1 × 105 내지 약 1 × 106개, 약 1 × 105 내지 약 1 × 107개, 약 1 × 106 내지 약 1 × 107개, 약 1 × 106 내지 약 1 × 108개, 약 1 × 107 내지 약 1 × 108개, 약 1 × 108 내지 약 1 × 109개, 약 1 × 108 내지 약 1 × 1010개, 또는 약 1 × 109 내지 약 1 × 1010개의 본원에 개시되는 줄기-세포-유도된 세포의 집단을 포함한다.
비제한적인 소정 구현예에서, 조성물은 추가로 생체적합성 스캐폴드 또는 매트릭스, 예를 들어, 세포가 대상체에 임플란트 또는 이식되는 경우 조직 재생을 촉진하는 생체적합성 3차원 스캐폴드를 포함한다. 비제한적인 소정 구현예에서, 생체적합성 스캐폴드는 세포외 매트릭스 물질, 합성 중합체, 사이토카인, 콜라겐, 폴리펩타이드 또는 단백질, 파이브로넥틴, 라미닌, 케라틴, 피브린, 피브리노겐, 히알루론산, 헤파린 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 아가로스 또는 젤라틴을 포함하는 다당류, 및/또는 하이드로겔을 포함한다(예컨대, 그 각각의 내용의 전문이 참조로 포함되는, U.S. 공개 제2015/0159135호, 제2011/0296542호, 제2009/0123433호, 및 제2008/0268019호 참고).
소정 구현예에서, 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 희석제 또는 이의 조합을 포함하는 약학 조성물이다. 조성물은 본원에 기재되는 바와 같이, CNS 신경퇴행성 장애의 예방 및/또는 치료를 위해 사용될 수 있다.
5.4 CNS 신경퇴행성 장애의 예방 및/또는 치료 방법
하나 이상의 피질 뉴런 마커(또한 "줄기-세포-유도된 피질 뉴런"으로 나타냄), 또는 이의 전구체를 발현하는 시험관내 분화된 세포는 신경퇴행성 장애의 예방 및/또는 치료를 위해 사용될 수 있다. 본원에 개시되는 요지 사안은 유효량의 본원에 개시되는 줄기-세포-유도된 피질 뉴런, 및 이의 전구체를 신경퇴행성 장애를 앓는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 장애의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 신경퇴행성 장애의 비제한적인 예에는 파킨슨병, 알츠하이머병, 및 정신분열병이 포함된다.
본원에 개시되는 줄기-세포-유도된 피질 뉴런, 및 이의 전구체는 신경퇴행성 장애의 치료 또는 예방을 위해 대상체에 전신으로 또는 직접 투여되거나 제공될 수 있다. 소정 구현예에서, 본원에 개시되는 줄기-세포-유도된 피질 뉴런, 및 이의 전구체는 관심 기관(예컨대, 중추 신경계(CNS)) 내로 직접 주사된다.
본원에 개시되는 줄기-세포-유도된 피질 뉴런, 및 이의 전구체는 임의의 생리적으로 허용 가능한 비히클에서 투여될 수 있다. 본원에 개시되는 줄기-세포-유도된 세포 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물이 또한 제공된다. 본원에 개시되는 줄기-세포-유도된 피질 뉴런, 및 이의 전구체, 및 이를 포함하는 약학 조성물은 국소 주사, 정위(OT) 주사, 전신 주사, 정맥내 주사, 또는 비경구 투여를 통해 투여될 수 있다. 소정 구현예에서, 본원에 개시되는 줄기-세포-유도된 피질 뉴런, 및 이의 전구체는 정위(OT) 주사를 통해 신경퇴행성 장애를 앓는 대상체에 투여된다.
본원에 개시되는 줄기-세포-유도된 피질 뉴런, 및 이의 전구체, 그리고 이를 포함하는 약학 조성물은 멸균 액체 제조물, 예컨대 등장성 수용액, 현탁액, 에멀젼, 분산액, 또는 점성 조성물로서 편리하게 제공될 수 있으며, 이는 선택된 pH까지 완충될 수 있다. 액체 제조물은 보통 겔, 다른 점성 조성물, 및 고체 조성물보다 제조하기 더 쉽다. 또한, 액체 조성물은 특히 주사에 의해, 투여하기 다소 더 편리하다. 반면에, 점성 조성물은 특정 조직과 더 긴 접촉 기간을 제공하기 위해 적절한 점도 범위 내로 제형화될 수 있다. 액체 또는 점성 조성물은 담체를 포함할 수 있고, 이는 예를 들어, 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 멸균 주사 용액은 본원에 개시되는 요지 사안의 조성물, 예컨대 본원에 개시되는 줄기-세포-유도된 전구체를 포함하는 조성물을 요망되는 바에 따라, 다양한 양의 다른 구성성분과 함께 요구되는 양의 적절한 용매에 혼입시켜 제조될 수 있다. 이러한 조성물은 적합한 담체, 희석제, 또는 부형제, 예컨대 멸균수, 생리 식염수, 글루코스, 덱스트로스 등과의 혼합물일 수 있다. 조성물은 또한 동결건조될 수 있다. 조성물은 보조 물질, 예컨대 수화제, 분산제, 또는 유화제(예컨대, 메틸셀룰로스), pH 완충제, 겔화제 또는 점도 강화 첨가제, 보존제, 풍미제, 착색제 등을 요망되는 투여 및 제조 경로에 따라 함유할 수 있다. 본원에 참조로 포함되는 표준 교과서[예컨대 "REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE", 17th edition, 1985]는 과도한 실험 없이 적합한 제조물을 제조하기 위해 참조될 수 있다.
항균 보존제, 항산화제, 킬레이트화제, 및 완충제를 포함하는, 조성물의 안정성 및 멸균성을 강화하는 다양한 첨가제가 첨가될 수 있다. 미생물의 작용 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등에 의해 확보될 수 있다. 주사 약학 형태의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용으로 야기될 수 있다. 그러나 본원에 개시되는 요지 사안에 따르면, 사용되는 임의의 비히클, 희석제, 또는 첨가제는 본원에 개시되는 줄기-세포-유도된 피질 뉴런, 및 이의 전구체와 상용성이어야 할 것이다.
요망되는 경우, 조성물의 점도는 약학적으로 허용 가능한 증점제를 사용하여 선택된 수준에서 유지될 수 있다. 메틸셀룰로스는 쉽고 경제적으로 이용 가능하며, 작업하기 용이하므로 사용될 수 있다. 다른 적합한 증점제에는, 예를 들어, 잔탄 검, 카복시메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 셀룰로스, 카보머 등이 포함된다. 증점제의 농도는 선택되는 제제에 의존할 수 있다. 중요한 점은 선택된 점도를 달성할 양을 사용하는 것이다. 명백하게는, 적합한 담체 및 다른 첨가제의 선택은 정확한 투여 경로 및 특정한 투여량 형태, 예컨대 액체 투여량 형태의 성질에 의존할 것이다(예컨대, 조성물이 용액, 현탁액, 겔 또는 또 다른 액체 형태, 예컨대 경시 방출 형태 또는 액체-충전 형태로 제형화될 것인지 여부).
당업자는 조성물의 성분이 화학적으로 불활성이도록 선택되어야 하며, 본원에 개시되는 줄기-세포-유도된 피질 뉴런, 및 이의 전구체의 생활성 또는 유효성에 영향을 미치지 않을 것임을 인식할 것이다. 이는 화학 및 약학 이론의 당업자에게 문제를 일으키지 않을 것이거나, 문제는 표준 참고서에 대한 참조에 의해 또는 상기 개시 및 본원에서 인용되는 문헌으로부터 단순한 실험에 의해(과도한 실험이 관여되지 않고) 회피될 수 있다.
본원에 개시되는 줄기-세포-유도된 피질 뉴런, 및 이의 전구체의 치료적 용도에 관한 하나의 고려사항은 최적 효과를 달성하기 위해 필요한 세포의 양이다. 최적 효과에는 비제한적으로 신경퇴행성 장애를 앓는 대상체의 CNS 영역의 재증식 및/또는 대상체의 CNS의 개선된 기능이 포함된다.
"유효량"(또는 "치료적 유효량")은 치료 시 유익하거나 요망되는 임상 결과에 영향을 미치기 충분한 양이다. 유효량은 하나 이상의 용량으로 대상체에 투여될 수 있다. 치료의 관점에서, 유효량은 신경퇴행성 장애의 진행을 완화시키거나, 경감시키거나, 안정화하거나, 역전시키거나, 늦추기에, 또는 다르게는 신경퇴행성 장애의 병리적 결과를 감소시키기 충분한 양이다. 유효량은 일반적으로 사례 별 기준으로 의사에 의해 결정되며, 당업자의 기술 범위 내이다. 몇몇 요인이 전형적으로 유효량을 달성하기에 적절한 투여량을 결정할 때 고려된다. 이러한 요인에는 대상체의 연령, 성별 및 체중, 치료받는 병태, 병태의 중증도 및 투여되는 세포의 형태 및 유효 농도가 포함된다.
소정 구현예에서, 유효량의 본원에 개시되는 줄기-세포-유도된 피질 뉴런, 및 이의 전구체는 신경퇴행성 장애를 앓는 대상체의 CNS 영역에 재증식하기 충분한 양이다. 소정 구현예에서, 유효량의 본원에 개시되는 줄기-세포-유도된 피질 뉴런, 및 이의 전구체는 신경퇴행성 장애를 앓는 대상체의 CNS의 기능을 개선하기에 충분한 양이며, 예컨대, 개선된 기능은 일반인의 CNS의 기능의 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100%일 수 있다.
투여될 세포의 양은 치료받는 대상체에 대해 변할 것이다. 소정 구현예에서, 약 1 × 104 내지 약 1 × 1010개, 약 1 × 104 내지 약 1 × 105개, 약 1 × 105 내지 약 1 × 109개, 약 1 × 105 내지 약 1 × 106개, 약 1 × 105 내지 약 1 × 107개, 약 1 × 106 내지 약 1 × 107개, 약 1 × 106 내지 약 1 × 108개, 약 1 × 107 내지 약 1 × 108개, 약 1 × 108 내지 약 1 × 109개, 약 1 × 108 내지 약 1 × 1010개, 또는 약 1 × 109 내지 약 1 × 1010개의 본원에 개시되는 줄기-세포-유도된 세포.
5.5 키트
본원에 개시되는 요지 사안은 줄기 세포의 분화를 유도하기 위한 키트를 제공한다. 소정 구현예에서, 키트는 다음 중 하나 이상을 포함한다: (a) 하나 이상의 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/Activin-Nodal 신호전달의 저해제, (b) 하나 이상의 BMP 신호전달의 저해제, (c) 하나 이상의 Wnt 신호전달의 저해제 (d) 하나 이상의 FGF 신호전달의 저해제, (e) 하나 이상의 Notch 신호전달의 저해제, (f) 하나 이상의 MAPK/ERK 키나제 신호전달의 저해제, 및 (g) 본원에 기재되는 방법에 따라, 줄기 세포의 하나 이상의 뉴런 마커, 예를 들어, 피질 뉴런 마커를 발현하는 분화된 세포, 또는 이의 전구체 세포의 집단으로의 분화를 유도하기 위한 설명서.
본원에 개시된 요지 사안은 또한 하나 이상의 뉴런 마커, 예를 들어, 피질 뉴런 마커를 발현하는 분화된 세포, 또는 이의 전구체 세포의 집단을 포함하는 키트를 제공하며, 여기서 세포는 본원에 기재되는 방법에 따라 제조된다. 소정 구현예에서, 세포는 약학 조성물에 포함된다.
6. 실시예
본원에 개시되는 요지 사안은 제한으로서가 아니라 본원에 개시되는 요지 사안의 예시로서 제공되는, 다음 실시예를 참조하여 더욱 잘 이해될 것이다.
6.1 실시예 1: 줄기 세포의 집단과 6개 신호 전달 경로의 저해제의 접촉에 의한 줄기 세포-유도된 피질 뉴런의 제조 방법.
요약
인간 다능성 줄기 세포(hPSC)를 기능적 뉴런으로 전환시키는 데 있어 상당한 진전이 있었다. 그러나, 인간 뉴런 특화 및 기능적 성숙의 연장된 시점은 질환 모델링 및 재생 의약에서 hPSC-유도된 계통의 일상 적용을 방해하는 주요한 난제로 남아있다. 조합 소분자 스크리닝을 사용하여, 본 발명자들은 이전에 말초 감각 뉴런의 신속한 유도를 위한 조건을 확인하였다. 본원에서는 CNS 운명에 대해 가속화된 액세스를 위한 접근을 일반화하는 시도에서 피질 뉴런의 신속한 유도를 보고한다. 본 발명자들은 13일경 유사분열 후 피질 뉴런을 유도하기 위한 6개 경로 저해제의 조합 사용 및 아교세포 공동-배양이 필요 없는 분화 16일경 기능적 전기생리적 특성을 실증한다. 생후 마우스 피질 내로 분화 8일차에 이식된 뉴런은 iDISCO-기반 앞뇌 조영을 사용하여 예시된 바와 같이 기능적이며 장거리 돌출을 확립한다. 피질 뉴런 운명으로의 가속화된 분화는 CNS 장애에서 질환 모델링 및 세포 치료법을 위한 hPSC-기반 전략을 촉진하게 된다.
결과
뉴런 운명 획득을 가속화하기 위한 시도에서, 개시된 요지 사안은 2개의 추가적인 소분자: 섬유아세포 성장 인자(FGF) 신호전달의 강력한 저해제인 SU5402 및 Notch 신호전달을 차단하는 γ-시크리타제 저해제인 DAPT의 사용을 제공한다6. 이러한 두 저해제(SD)와 이중 SMAD 저해 및 WNT 활성화의 조합 적용은 표준 이중-SMAD 저해 조건 하에 신경 전구체 세포 유도를 위해 요구되는 것과 동일한 시기인1 분화 11일경 75%의 유사분열-후 뉴런을 산출한다7. 그러나, 이러한 신속히-유도된 뉴런에서 BRN3A 및 ISL1의 공동-발현은 이들을 PAX6-유도된 CNS 뉴런보다는 말초 감각 뉴런으로 정의하였다7. 따라서, 감각 운명 특화 동안 뉴런 운명 획득을 가속화하는 전략이 CNS 운명에 대해 적용될 수 있는지 여부가 불명확하게 남았다. PAX6-유도된 피질 뉴런은 인간 발달에서의 연구를 위해 그리고 인간 신경발달 및 신경퇴행성 CNS 장애의 모델링을 위해 특히 관심의 대상이다. hPSC로부터 피질 뉴런을 유도하기 위해 신뢰할 수 있는 프로토콜이 존재하지만, 이러한 조건은 하층 및 상층 피질 뉴런을 모두 산출하기 위해 hPSC로부터 30~90일의 분화15,30 및 완전 성숙을 달성하기 위해 보다 연장된 시기를 요구한다. 여기서 본 발명자들은 질환 모델링 및 재생 의약을 위한 적용에서 hPSC-유도된 뉴런의 일상 적용을 촉진하기 위해 인간 피질 뉴런 운명 유도를 크게 가속화하는 소분자 기반 조건을 확인하는 것을 목표로 한다.
가속화된 CNS 뉴런 분화 프로토콜의 개발
CNS 대 신경 능선 운명의 결정에서 WNT 신호전달의 중추적 역할에 기반하여3,8, 개시된 방법은 피질 뉴런 운명으로의 신속한 분화를 야기한 WNT 신호전달을 활성화하기보다 저해하는 조합 소분자 접근을 개발하였다(도 1a). 개시된 방법은 GSK3β 저해제 CHIR99021(C; WNT 작용제)을 탄키라제 저해 및 액신의 안정화를 통해 작용하는 WNT 길항제 XAV939로 교환한다9. 모든 다른 저해제(LDN + SB = 이중 SMAD 저해(LSB), SU5402 및 DAPT)는 앞뇌 뉴런 운명의 신속한 유도에서 목표가 된 이들 초기 연구에 대해 변화되지 않고 유지될 수 있다(LSB+X/S/D 프로토콜, 도 2a). 신속한 뉴런 유도 동안 CNS의 PNS 운명 스위치로의 예상치 못한 야기에서의 본 발명자들의 경험에 기반하여7, 개시된 방법은 먼저 3개의 유전적 hESC 리포터 세포주를 사용하여 X/S/D 조건 하에 조기 외배엽 계통 선택에 대한 영향을 평가하였다. CNS 계통을 모니터링하기 위해, 개시된 방법은 신규한 PAX6::H2B-GFP 리포터 세포주를 확립하고, 신경 능선 운명에 대해서는 개시된 방법은 이전에 공개된 SOX10::GFP 리포터 세포주를 사용하였고2,7 두개 원판 정체성에 대해서는 개시된 방법은 신규한 SIX1::H2B-GFP 세포주를 사용하였다. PAX6 및 SIX1 리포터 세포주를 둘 다 TALEN-기반 유전자 표적화를 사용하여 생성하였다. 개시된 방법은 면역세포화학을 사용하여 GFP를 대응하는 단백질 발현과 매칭시킴으로써 시험관내 분화 후 리포터의 충실성을 검증하였다2,10(도 1b).
개시된 방법은 또한 도 1c에 예시된 바와 같이, X/S/D 조건 하에 외배엽 운명 선택을 평가하였다. 이전 작업과 일관되게, LSB 및 LSB+X는 둘 다 매우 적은 SOX10+ 또는 SIX1+ 오염물질을 포함하며 거의 균일한 PAX6+ 세포의 집단(95% 초과)을 생성하였다. 대조적으로, LSB+C 또는 LSB+C/S/D(3i 또는 PNS 감각 뉴런 프로토콜로도 나타냄7)는 신경 능선 유도에서 WNT 신호전달에 대한 중요한 역할에 적합한, 매우 소수의 PAX6+를, 그러나 다수의 SOX10+ 신경 능선 전구체를 생성하였다7. 중요하게는, 본 발명자들의 신속 CNS 뉴런의 후보 프로토콜 LSB+X/S/D는 분화 6일만큼 일찍 PAX6+ 세포의 거의 순수한 집단(98% 초과)을 생성하였다. 이는 hPSC에서 기존 다능성에서의 FGF 저해에 대한 역할에 적합하며, LSB 및 LSBX보다 유의미하게 더 빠르다11. 생성되는 데이터는 도 1c에 예시된 바와 같이, SU5402 및 DAPT에 대한 노출 후 CNS 정체성 및 가속화된 시점의 신경 유도를 실증한다.
개시된 방법은 또한 LSB+X/S/D가 감각 뉴런 운명 특화 동안 3i 프로토콜7(LSB+C/S/D)에 대해 보호된 것들과 필적하는 효율로 추정 CNS 뉴런을 유도할 수 있는지 여부를 평가하였다. 범-뉴런 마커, β-III 튜불린(TUJ1)에 대한 세포내 유세포 측정을 사용하여, LSB+C 및 LSB+X는 13일경 TUJ1+ 뉴런이 거의 없었던 반면, 3i 조건(LSB + C/S/D)은 40% TUJ1+ 세포를 생성하였다. 대조적으로, 신규한 LSB+X/S/D 조건은 도 1d~1f에 예시된 바와 같이 10% TUJ1+ 뉴런만 생성하였다. 이들 데이터는 SU5402 및 DAPT의 존재 하에 WNT 신호전달의 저해가 CNS 계통 뉴런을 산출하지만 중등도 효율로만 산출함을 시사한다.
뉴런 전환 효율을 강화하기 위한 시도에서, 개시된 방법은 LSB+X에서 후보 소분자 스크리닝을 수행한다. 개시되는 방법은 신경 전구체 세포 증식에 관여되는 신호전달 경로를 표적화하는 분자, 예컨대 SHH(사이클로파민(Cyclopamine), Cur-61414, 푸르모르파민(Purmorphamine)), PI3K 및 PDGFR(LY-294002, 이마티닙(Imatinib)), MYC/브로모도메인 단백질(JQ1), 레티노이드 신호전달(모두-트랜스인 레티노산), TGFβ 활성화(IDE-1), HMG-CoA 환원효소 저해(로바스타틴(Lovastatin)) 및 니코틴아마이드 포스포리보실트랜스퍼라제 저해(P7C3)뿐만 아니라 ERK 신호전달(PD0325901)을 포함하는 FGF 수용체 활성화의 신호전달 경로 하류를 선택할 수 있다. 마우스에서 ERK1/2의 저해는 피질 발달 동안 조기 뉴런 분화를 유도하며12 ERK 저해는 이전에 hPSC에서 전반적인 뉴런 분화를 강화하기 위한 전략으로서 제안되었다13. 대부분의 조건은 뉴런 운명 획득에서 유의미한 개선을 산출하지 않았다(데이터는 나타내지 않음).
그러나, 미토겐-활성화된 단백질 키나제(MAPK/ERK 키나제 또는 MEK)에 대한 경구 생체-이용 가능한, 강력한 저해제인 PD03259018는 고동도로 사용되는 경우, 3i 감각 뉴런 프로토콜에 필적하는 값인 50% 초과까지 TUJ1+%의 수율을 향상시킬 수 있었다(도 1g, 상부 패널). 그러나, 높은 백분율의 TUJ1+ 세포는 저수율의 총 세포수와 연관되어, 독성을 제시하였다(도 1g, 하부 패널). 뉴런 유도 효율 및 전반적인 세포 독성의 밸런스를 맞추려는 시도에서 더 낮은 PD 농도가 SU 노출과 조합된 경우, 증가된 총 뉴런 수율이 수득되었다. DAPT로의 추가적인 처리는 전반적인 뉴런 수율에 부정적인 영향을 미치지 않았으나 분화 13일차에 50% 초과 TUJ1+ 세포를 달성하는 몇몇 조건으로 뉴런 유효 효율을 추가 증가시켰다. 이들 데이터는 LSB+X+P/S/D를 피질 뉴런의 신속한 유도를 위한 유망한 후보 조건으로서 정의한다. 감소된 수율이 신속한 세포 주기 퇴장 또는 직접적인 독성에 기인하는지 여부를 이해하기 위해, 본 발명자들은 각각 세포 증식 및 사멸의 마커로서 포스포-히스톤 3(pH3)을 측정하였고, 카스파제 3(CC3)을 절단하였다. PD0325901 및 SU5402 둘 다에 대한 노출은 P/S 처리 후 24 hr만큼 일찍 세포 증식을 감소시켰으나, 세포사는 고용량의 SU5402에서만 관찰되어(도 15a~f), 전구체 세포 증식의 제한을 신속한 뉴런 분화 반응에서의 주요 요인으로서 시사하였다. 낮은 수준의 독성만을 갖는 높은 백분율의 뉴런을 산출한 2개 농도에는 i) P(1 μM) S(5 μM) = P1S5D 조건 및 ii) P(8 μM) S(10 μM) = P8S10D 조건(도 1h 및 1i)이 포함된다.
CNS의 표현형 분석 및 피질 뉴런 정체성
경시적인 흐름 분석은 P8S10D 조건이 도 3a 및 도 4에 예시된 바와 같이 3i(C+S/D) 또는 더 약한 CNS(P1S5D) 뉴런 프로토콜에 비해 13일차에 유의미하게 더 높은 백분율의 뉴런(TUJ1+ 뉴런 70%)을 가지며 뉴런 운명 획득의 극적인 가속화를 일으킴을 실증하였다. 유전자 발현 분석은 LSB+X/P/S/D 조건에서 다능성 마커 OCT4의 하향조절 및 신경 및 뉴런 마커 PAX6, FOXG1 및 DCX뿐만 TBR1(평판-전, 평판-하 및 VI층) 및 REELIN을 포함하는 조기 출생 피질 뉴런의 마커의 유도를 확인시켜 주었다. 대조적으로, 감각 뉴런(3i) 및 가속화를 포함하지 않는 CNS 프로토콜(LSB+X)은 각각 피질 및 뉴런 마커 유도의 부재를 나타내었다(도 3b).
P8S10D 조건 하에 앞뇌 마커 FOXG1의 제한된 유도에 기반하여, FOXG1 발현에 대한 각각의 소분자의 영향(도 5a 및 5b)을 시험하였다. 이들 데이터는 특히 신경 유도 동안 PD로의 노출이 FOXG1 유도의 효율을 감소시킴을 나타내었다. 그러나, VI층 피질 뉴런 마커 TBR1+의 고효율 유도는 VI층 마커 TLE1와 유사한 발현을 가지며(도 16a) 13일차에 모든 TUJ1+ 세포의 50% 초과에서 공동-발현을 가짐을 관찰하였다(도 3c~3e). TBR1 및 TLE4에 대해 음성인 나머지 세포를 확인하기 위해, 본 발명자들은 13일차에 추가적인 마커 패널을 스크리닝하였다(도 19, 도 16b). 놀랍게도, 15%~20%의 뉴런은 BRN3A를 발현하였으나 매우 소수의 뉴런만 ISL1을 발현하여, 오염시키는 BRN3A+ CNS 계통의 존재를 제시하였다(도 19, 도 16c~d). BRN3A 및 GSX2 둘 다의 발현에 기반하여(도 16b) 이들 비-피질 뉴런은 초기 시상 계통에 해당할 수 있다(www.gensat.org; http://developingmouse.brain-map.org). TUJ1-음성 분획의 특징분석은 피질 전구체 세포 정체성과 일관되는, TBR2, BLBP 및 CUX2에 대해 양성인 세포의 존재를 나타내었다(도 19, 도 16a~b). 본 발명자들은 추가로 LSB+X/P/S/D 조건에서 다른 전방 CNS 및 피질 선조체 및 뉴런 마커의 상향조절을 나타내었다(LSB+X 대비)(도 16b). 그러나, 본 발명자들은 배쪽 전뇌, 피질 개재뉴런 또는 다른 GABA성 뉴런 운명의 발현은 검출하지 못했다(도 19, 도 16b).
LSB+X/P/S/D 조건이 여러 세포주에 걸쳐 강력한지 여부를 결정하기 위해, 본 발명자들은 2명의 건강한 개체로부터 유도된 6개의 독립 hiPSC 세포주를 시험하였다. 분화 13일경, 모든 세포주는 TBR1+/TUJ1+ 뉴런으로 농축되었고 WA09 hESC 세포주로부터 수득된 것과 유사한 형태를 나타내었다(도 2b 및 2c). 뉴런 백분율의 정량은 WA09에 대해 관찰된 것과 유사한 효율을 나타내었으나, 세포주에 걸쳐 일부 가변성이 존재하였다(도 2d). 가속화된 프로토콜을 GMP-호환성 배양 조건으로 반영하려는 시도에서, 이 프로토콜을 추가로 Essential 6™ 배지(E6)-기반 유도 플랫폼에 적용하였다(도 3k). 본 발명자들은 효율적인 PAX6 유도 및 분화 13일 경 고도로 농축된 TBR1+ 유사분열-후 뉴런의 집단의 가속화된 생성을 관찰하였다(도 2h). 따라서, 신속한 유도 전략이 hiPSC 세포주에 걸쳐 적용되고 GMP-호환성 배양 조건에 적용될 수 있다.
피질 돌출 뉴런을 내외 전도 방식으로 생성하였다14. 분화 13일경 TBR1 및 REELIN의 상향-조절은 가장 초기 출생 심부 피질층 뉴런의 생성에 대해 잠재적인 편향을 제시하였다. 그러나, FGF-ERK 및 Notch 저해의 부재 하에 P1S5D 또는 P8S10D 배양의 추가 유지(13~55일)(도 3f)는 더 넓은 범위한 피질층을 나타내는 마커, 예컨대 FOXP2(V~VI층), CTIP2(V층), SATB2(II~III층, V층), RGS4(II-III층, V층)(도 3, 도 17)를 발현하는 뉴런의 생성뿐만 아니라 타목시펜-유도성 CUX2 리포터 hESC 세포주를 사용하여 모니터링되는 상층 CUX2+(II~IV층) 뉴런의 생성을 구현하였다(도 18a~d). P1S5D 또는 P8S10D 처리된 세포는 가속화 없는 프로토콜을 사용하는 55일에 비해, 33일만큼 빨리 성숙 형태를 갖는 CUX2+ 유사분열-후 뉴런을 생성하기 시작했다(도 18e~g). 피질 신경발생은 상당히 가속화되지만, 아교세포 마커, 예컨대 GFAP, AQP4 또는 OLIG2의 상향조절은 관찰되지 않았다. 유사하게, 망막 운명 마커, 예컨대 CHX10의 유도는 없었다(도 17). TBR1+, CTIP2+ 및 SATB2+ 뉴런의 정량(도 3h)은 시험관내-유도된 뉴런이 생체내 피질발생과 일관되는 경시적인 마커 발현 순서를 따를 수 있음을 제시하였다. 시험관내 뉴런 서브타입 유도의 특정 시점을 추가로 설명하기 위해, 본 발명자들은 출생일 작성 실험을 수행하였다(도 3f). 층-특이적 마커와 EdU의 공동-표지화는 연속적인 세포 출생 파동을 나타내었다(도 3i~j). 따라서, 본 발명자들의 데이터는 VI층의 고도로 효율적인 유도를 실증하며 변형된 소분자 시점 요법을 사용하는 상층 뉴런의 가속화된 유도의 타당성을 시사한다.
여러 세포는 33일경에 VI층 마커 TBR1, FOXP2 및 TLE4를 발현하며, 10%를 초과하는 세포에서 V층 마커 CTIP2뿐만 아니라 II~V층 마커 SATB2를 발현하기 시작하고, 이는 hPSC로부터의 피질 뉴런 유도에 대해 현재 공개된 프로토콜에 비해 가장 빠른 발현이다. 유도 33일경 도 3g에 나타낸 바와 같이, P1S5D 배양은 심부 층 TBR1+ 및 FOXP2+(V~VI층), CTIP2+(V층)의 뉴런 및 SATB2+ 뇌량 뉴런(II~V층)을 생성한다. 또한, 도 3g가 나타내듯이, ERK 및 Notch 저해의 부재 하에 P1S5D 또는 P8S10D 배양의 추가 유지(유도 55일까지)는 상층 마커, 예컨대 CTIP2+ 및 SATB2+를 발현하는 뉴런의 효율적인 생성을 구현하였다(각각 TUJ1+ 뉴런의 대략 60% 및 20%).
배양은 도 3h에서 정량되는 바와 같이, 45일 및 55일에 상층에 속하는 더 많은 뉴런으로 농축되기 시작한다. 상이한 층의 뉴런에 대한 출생 시점을 확인하기 위해, 개시된 방법은 EdU 펄스 표지화를 수행하며(도 3i 및 3j), 이는 피질발생의 내재적 경시적 기전과 일관되어, 조기 출생 세포 집단이 VI층 TBR1+ 뉴런임을 실증한다.
뉴런 기능의 신속한 유도
개시되는 방법은 신속한 CNS 뉴런 유도 조건 하에 TBR1+ 세포의 매우 효율적인 유도를 실증하지만, 또한 변형된 소분자 시점 요법을 사용하는 상층 마커를 발현하는 뉴런 유도의 타당성을 시사할 수 있다. 개시되는 방법은 추가로 뉴런 마커의 신속한 유도가 반복 활동 전위를 자연적으로 점화하는 능력과 같은 신속한 시험관내 기능적 성숙과 병행하는지 여부를 조사할 수 있다. hPSC-유도된 뉴런의 기능적 성숙은 분화 약 50~100일차에 전형적으로 일어나는 활동 전위의 점화와 함께 이전에 실증되었다15. 성숙을 평가하기 위해, 개시된 방법은 P1S5D 또는 P8S10D 조건 하에 8일 동안에 이어 i) 임의의 소분자 저해제를 함유하지 않는 기본 배지, ii) DAPT 단독 첨가 또는 iii) DAPT와 SU5402, PD 및 CHIR99021(CHIR)의 첨가(P/S/D/C)(도 6a) 중 어느 하나에서 추가적인 8일 동안 뉴런 운명으로 유도된 세포를 배양할 수 있다. GSK3β 저해제 CHIR은 이것이 P/S/D에서 유지되는 배양 상에 강력한 생존-촉진 효과를 발휘하였고 이전에 정규 WNT 신호전달의 활성화를 야기함으로써 축삭 성장 및 시냅스 형성을 포함하는 뉴런 분화를 촉진하는 것으로 나타났으므로16,17 상기 마지막 분화 단계를 위해 포함시켰다. 특히, 8일(다능성 상태로부터 분화 16일) 동안 P/S/D/CHIR 하에 유지된 P8S10D 세포는 휴지막 전위에서 또는 -10 pA 전류 주입 후 유도된 과분극 시 자연적으로 활동 전위열의 점화를 특징으로 하는 성숙한 전기생리적 특성을 나타내었다(도 6b). 모든 조건에서, P/S/D/C를 이용하여 P8S10D 세포에서, 기록된 뉴런의 70%~80%가 점화할 수 있었고, 약 20%~30% 뉴런은 보다 성숙한 점화 패턴을 나타내었다(약 10개의 활동 전위 점화 피크의 열)(도 6d).
P1S5D 및 P8S10D 뉴런 둘 다에서 평가된 뉴런 성숙의 추가적인 파라미터에는 휴지막 전위, 활동 전위 절반-폭 및 초기 점화의 상승 속도(타우), 입력 저항 및 최대 점화 빈도가 포함된다(도 6c 및 6d). P/S/D/CHIR에서의 세포 유지는 대부분의 성숙한 뉴런 특성을 생성하였으나, 가장 약한 조건(임의의 소분자 저해제를 함유하지 않는 기본 배지에서 P1S5D 처리된 세포)으로도 대부분의 이전 hPSC-유도된 피질 뉴런 분화 프로토콜보다 상당히 더 빠른 시기인 37일경 성숙한 점화 패턴을 갖는 뉴런을 생성하였다(도 7a~7c).
강력한 전압-의존적 나트륨 채널 반응이 또한 관찰되었고 테트로도톡신(TTX)에 의해 차단되었다(도 6e). 또한, 세포는 특이적인 AMPA 수용체 길항제인 NBQX에 의해 저해된 자연적 흥분 시냅스후 전류(sEPSC)를 나타내어(도 6f), 기능적인 흥분성 시냅스의 형성을 시사하였다. 기능적 성숙 데이터는 임의의 별아교세포 공동-배양의 부재 하에 수득되었으나, 마우스 별아교세포 상 P8S10D 배양의 재플레이트-접종(8일) 또는 별아교세포 컨디셔닝된 배지에서의 배양(도 8a~8c)은 전반적인 뉴런 생존을 개선하였고, 입력 저항이 감소되고 형태적 복잡성이 강화된 뉴런을 산출하였다(도 8d~8f). 추가적으로, 본 발명자들은 별아교세포의 첨가가 추가로 뉴런의 성숙을 가속화하거나 유지를 촉진할지 여부를 시험하였다. 실제로, 마우스 별아교세포 상에서 또는 DAPT의 존재 하에 별아교세포 컨디셔닝된 배지에서 P8S10D 유도된 뉴런의 배양(도 8a~c)은 전반적인 뉴런 생존을 개선하였고, 70일부터 90일을 넘도록 신속히 유도된 뉴런의 장기 유지를 구현하였다(도 8g). 별아교세포 상의 배양은 추가로 입력 저항이 감소되고 형태적 복잡성이 강화된 뉴런을 산출하여, 증가된 뉴런 성숙을 시사하였다(도 8e~g).
iDISCO-기반 앞뇌 분석을 사용하는 hPSC-유도된 뉴런의 생체내 분석
시험관내 데이터는 본 발명자들의 조합 소분자 프로토콜이 피질 마커 발현 및 기능적 전기생리적 특성을 갖는 뉴런을 신속히 유도할 수 있음을 실증한다. 그러나, 장기 생존, 축삭 돌출 및 숙주 회로 내로의 통합에 대한 능력을 보다 자세히 평가하기 위해, 생체내 이식 연구를 수행하였다. EGFP를 구성적으로 발현하는 hESC로부터 유도된 분화 8일차의 미성숙 뉴런을 P2 NOD-SCID IL2Rgc -/- 마우스의 몸감각 피질 내에 이식하였다(도 9).
이식된 동물의 뇌를 이식 1~6개월 후 수집하고 iDISCO18 세정 및 전체 실장 면역조직화학 프로토콜에 따라 앞뇌 면역형광 조영을 거쳤다(도 10a). 대부분의 이식 연구는 이식 최대 6개월 후 강력한 생체내 생존을 나타낸 P1S5D 패러다임을 사용하여 수행하였고, 그 마지막 시점을 본 연구에서 시험하였다. P8S10D 뉴런은 이식 1개월 후 동물의 하위세트에서만 이식 및 축삭 돌출의 증거를 가지며 보다 가변적인 생체내 생존을 나타내었다(도 11a). LSB+X 조건으로부터 매칭되는 8일차 세포는 뉴런 분화 또는 이식편 통합의 최소 증거를 가지며 광범위한 이식편 과성장을 나타내었다(도 11b). 이들 데이터는 이전 결과를 연상시켜, 조기 신경상피 '로제트-단계' 세포가 종양-유사 과성장을 생성함을 제시한다22. 따라서, 후기-단계 신경 전구체 또는 뉴런으로의 신경상피 세포의 분화가 신경 과성장의 위험을 감소시키는 데 있어서 중추적이다.
이식 1개월 및 1.5개월 후 P1S5D 뉴런이 이식된 뇌의 상세 분석은 이식편 코어 및 뉴런 돌출의 가시화를 허용하였다(도 10c). 1개월 후, GFP+ 이식된 세포에는 모든 피질층에 걸쳐 광범위한 탈군생화된 돌출이 발달하였다(도 10b). 소수의 길고 밀도가 높은 번들이 또한 피질 VI층에서 일관되게 나타났다. 대부분의 돌출은 이마-전 운동 피질 및 이마 피질에서 종료되었으나, 다수의 축삭이 또한 같은쪽 해마 및 반대쪽 피질에서 뇌량을 통해 추적되었다(도 10c). 매우 드문 이식편-유도된 섬유가 줄무늬체에서 관찰되어 이식된 뉴런이 뇌 하부 영역을 표적화하기보다 피질 영역에 걸쳐 돌출되는 것을 선호함을 제시하였다. 숙주 축삭 경로를 맵핑하기 위해 자가 형광을 사용하여(도 12a), 본 발명자들은 대부분의 이식편-유도된 섬유 번들이 내인성 트랙을 따름을 관찰하였다(도 12c). 그러나, 일부 섬유는 숙주 하강 트랙 밖으로 돌출되었다(도 12b).
이식 후 1.5개월경, 대부분의 이식편-유도된 축삭 섬유 번들은 직선 궤도 및 진행중인 경로 탐색의 특징적인 패턴인 성장 콘을 연상시키는 확대된 말단 구조를 따랐고, 제한된 말단 분기만을 가졌다(도 10d, 왼쪽 패널). 대조적으로, 이식 3개월경 및 가장 현저하게는 6개월 후(도 10d, 중간 및 오른쪽 패널), 매칭되는 표적 영역에 인간 축삭의 광범위한 말단 분기가 존재하였다(도 10d, 중간 대 왼쪽 패널). 광범위한 분기와 동시에, 인간 시냅토피신 양성 구조의 조밀한 네트워크가 관찰되었고, 이는 몇몇 표적 영역, 예컨대 숙주 해마에서 GFP+ 섬유와 공동-편재되었다(도 10d, 하부 오른쪽 패널). 이식된 뉴런은 단극성, 이극성, 다극성 및 피라미트형 형태를 갖는 다양한 형태를 나타내었다(도 12d). iDISCO 기반 분석을 일반 앞뇌 마커 FOXG1 및 층 특이적 마커, 예컨대 REELIN, SATB2 및 CTIP2의 발현을 포함하는 인간 세포에서 생체내 피질 마커 발현을 확인시켜 주는 통상적인 면역조직화학 분석으로 보완하였다(도 10e). 또한, 전기생리에 의한 생체내 기능의 예비 증거를 수득하였다(도 13). 이식된 뉴런에서 SATB2+의 발현은 iDISCO-기반 연구에서 맞교차 축삭 돌출의 존재와 매칭되는 맞교차 뉴런 정체성과 호환된다(도 10d). 이 데이터는 분화 8일차에 P1S5D 유도된 신경 세포가 생체내 생존할 수 있고 피질 내에서 광범위한 축삭 돌출을 형성할 수 있음을 시사하였다. P8S10D 유도된 뉴런이 전반적인 감소된 이식편 크기 및 생활성을 나타내었으나, 생존 이식편을 갖는 동물은 1.5개월차에 이미 광범위한 섬유 성장 및 분기를 나타내었다.
논의
개시되는 방법은 분화 8일차에 P1S5D 유도된 신경 세포가 생체내 생존할 수 있고 피질 내에 광범위한 축삭 돌출을 형성할 수 있음을 시사할 수 있다. P8S10D 뉴런은 전반적인 감소된 이식편 크기 및 생활성을 나타내었으나, 생존 이식편을 갖는 동물은 1.5개월차에 광범위한 섬유 성장 및 분기를 나타내었다. P8S10D 이식편이 P1S5D 세포에 비해 보다 신속한 생체내 성숙을 겪는지 여부를 결정하기 위해 향후 보다 상세한 연구가 요구될 것이다. 흥미롭게도, 임의의 가속화의 부재 하에 이중 SMAD 저해 배양(LSB + XAV)으로부터의 매칭되는 8일차 이식편은 뉴런 분화의 최소 증거를 가지며 광범위한 이식편 과성장을 나타내었다(도 11b). 이들 데이터는 조기 신경상피 "로제트-단계" 세포가 신경상피 세포의 종양-유사 과성장을 일으킴을 제시하는 본 실험실 및 다른 연구자로부터의 이전 결과와 매칭된다19. 일부 뉴런은 내재적인 백질을 따라 축삭을 연장하고, 일부 뉴런은 무작위 방향을 향해 축삭을 연장하므로, 이식된 세포는 또한 축삭 경로 탐색에서 이종성을 나타낸다(도 12). 따라서, 후기 단계 신경 전구체 또는 뉴런 계통을 향한 추가 분화는 신경 과성장의 위험을 감소시키는 데 중추적이다.
개시되는 방법은 hPSC-유도된 이식편 생존, 축삭 돌출 및 숙주 신경분포의 맵핑을 위한 iDISCO의 최초 적용을 나타낸다. iDISCO 데이터에는 앞뇌 면역조직화학 및 GFP에 대한 조영뿐만 아니라 인간 특이적 마커, 예컨대 인간 시냅토피신의 발현에 대한 조영이 포함된다. 그러나, 이 기술은 이식편 생물학의 특정 양태를 모니터링하기 위해 대부분의 임의의 인간 특이적 마커와 함께 사용하기에 적합해야 한다. 향후 연구에서는, 선택적 피질 영역 및 층 정체성을 갖는 이러한 세포로 정의된 hPSC-유도된 피질 계통의 영역-특이적 돌출을 맵핑하기 위해 iDISCO를 적용하는 것이 특히 흥미로울 수 있다20. 본 검정은 또한 관련된 계통의, 그러나 구별되는 돌출 패턴의 뉴런, 예컨대 A9(흑질) 대 A10(배쪽 피개 영역) 정체성의 중뇌 도파민 뉴런을 정의하고, 이소성21 대 정위 위치22에 배치된 뉴런의 말단 돌출 패턴을 맵핑하기 위한 도구로서 작용할 수 있다.
개시되는 방법은 분화 16일경 성숙한 전기생리적 특성을 갖고 생체내 이식 및 생후 마우스 피질 내 장-거리 돌출이 가능한 피질 뉴런을 산출할 수 있는 신속한 유도 프로토콜을 제공한다(도 14). 본 발명의 구현예에 따르면, 감각 뉴런 유도7 및 현재 피질 뉴런 유도의 예를 따라 다른 뉴런 서브타입에 대해 유사한 가속화 전략이 개발될 수 있다. 이러한 신속한 지정된 분화 프로토콜은 질환 모델링, 약물 탐색 또는 세포 치료법에 관련된 특정 뉴런을 수득하기 위한 시간 및 비용을 상당히 감소시킬 수 있다. 현재 P1S5D 또는 P8S10D 조건 하에 유도된 피질 뉴런은 더 심부 피질층을 향해 편향된다.
분화 약 2주내에 기능적 뉴런을 생성하는 시간 프레임은 NGN2-기반 분화와 같은 hPSC의 전사 인자 기반 뉴런 유도를 사용하는 경우 달성된 속도에 필적한다23. 그러나, 소분자를 통한 지정된 분화는 특정 뉴런을 생성하기 위해 더 큰 유연성을 제공하고 유전적 변형의 필요성을 배제할 수 있다. 마지막으로, 시험관내 hPSC로부터 인간 계통 다양성을 재생성하는 능력의 증가로, 상기 연구는 길 위의 독립 파라미터로서 분화 및 성숙 시점을 질환 모델링 및 재생 의약에서 iPSC-유도된 뉴런의 완전한 가능성을 이용하도록 조정하는 한 단계이다.
방법
hESC 세포주 및 hiPSC 세포주 생성
hESC(WA-09, 32~60계대)를 Wi세포로부터 수득하여 최대 60계대 유지하였다. hESC SOX10::GFP 박테리아 인공 염색체 리포터 세포주(WA-09; 40~70계대)를 이전에 보고된 바와 같이 생성하였다7. 구성적 EGFP+ hESC 세포주(WA-09; 35~60계대)를 보고된 바와 같이 생성하였다24. hiPSC 유도를 위해, Michael Sheldon(Rutgers University)에 의해 일반적으로 공유된 프로토콜을 따라 피부 펀치 생검을 소화시켜 섬유아세포를 제조하였다. 간략하게, 피부 펀치를 조직 배양 인큐베이터에서 37℃에서 16~18 hr 동안 DMEM+10% FBS 중 콜라게나제(1%) 및 디스파제(1 단위/ml)의 혼합물 중에 소화시켰다. 소화 후, 표피층을 폐기하고, 부분 소화된 진피층을 건조 조직 배양 디쉬 표면 상에 4분할하고 2~5분 동안 교란하지 않고 방치하여 디쉬로의 부착을 도모하였다. 진피층을 탈착시키지 않도록 DMEM+10% FBS를 웰에 조심스럽게 첨가하였다. 웰의 약 2/3를 융합성 초점이 덮을 때까지 3일마다 배양에 영양공급하였다. 융합성이 되면, 배양을 트립신 처리에 의해 계대배양하고 4~5계대 동안 증식시킨 후 재프로그래밍하였다. 몇몇 변형을 포함하여 제조업체의 프로토콜을 사용해서 원래 CytoTune iPS 재프로그래밍 키트(Life Technologies, A1378002)를 사용해서 유도된 다능성 줄기 세포를 제조하였다. 1 mM 발프로산(EMD Millipore)을 함유하는 인간 ES 배지를 2~9일부터 첨가하였다. 2~3주 후, 개별 iPS 클론을 피킹하여 iPS 세포주로 증식시켰다. 주어진 개체로부터 3개의 iPS 서브클론 각각이 실제로 비-클론성임을 확인하기 위해, 3개의 별도 형질도입으로부터 유도된 3개의 상이한 웰로부터의 콜로니를 선택하였다. 각각의 세포주를 10계대 동안 증식시킨 후 품질 제어 검정을 수행하였다. OCT4, NANOG, SSEA-3, SSEA-4 및 Tra-1-81의 발현을 미리 확인하였다. 모든 다능성 마커를 발현하는 클론은 MSKCC의 분자 세포유전학 코어 시설(Molecular Cytogenetics Core Facility)에 의해 정상 핵형을 갖는 것으로 확인되었다. 10계대배양 후 존재하는 센다이 바이러스의 양을 TaqMan iPSC 센다이 검출 키트(Life Technologies A13640)를 사용하여 정량하였고, 0.01% 미만의 센다이 바이러스 앰플리콘(Mr04269880_mr)을 갖는 클론만을 사용하였다.
PAX6::H2B-GFP 및 SIX1::H2B-GFP 세포주(40~65계대)의 생성
pUC19 골격 내로 In-Fusion 클로닝(Clontech)을 수행하여 PAX6-P2A-H2B-GFP 및 SIX1-P2A-H2B-GFP 공여체 구축물을 생성하였다. 상동성 팔을 게놈 DNA를 사용하여 생성하였고, H2B:GFP는 Geoff Wahl로부터 선물받았으며(Addgene, 플라스미드 #11680), Pgk-Puro는 AAVS1 hPgk-PuroR-pA 공여체 플라스미드(Rudolf Jaenisch로부터의 선물(Addgene, 플라스미드 #22072))로부터 증폭하였다. Addgene에 의해 제공받은 TALE-Toolbox를 사용하여 TALE 뉴클레아제를 생성하였다25. Pax6의 정지 코돈을 표적화하는 서열은 TGTCCTGTATTGTACCACT 및 TGTATACAAAGGTCCTTGT였으며, Six1에 대해서는 TCTCTGCTCGGCCCCCTCA 및 TTGGGGTCCTAAGTGGGGA였다. 간략하게, 25 ㎍의 공여체 플라스미드 및 5 ㎍의 각각의 TALEN을 10 × 106 H9 hESC 내로 핵감염시켰다. 핵감염 72 hr 후 퓨로마이신 선택을 적용하여 내성 클론을 단리하였다. 클론을 증폭하고 표적화를 확인하는 게놈 PCR을 수행하였다. 사용된 모든 양성 클론은 정상 핵형을 가졌다.
트랜스제닉 CUX2 조건적 리포터 세포주의 생성
2회의 순차적 핵감염 및 선택 사이클에 의해 RUES2 배경에서 CUX2::CreER T2 /AAVS1-CAG::FLEX/tdTomato 세포주를 생성하였다. 첫 번째 사이클에서, 2 ㎍의 CUX2::CreER T2 /FRT-Puro-FRT-TK 상동성 공여체를 CUX2 개시 코돈을 표적화하는 TALEN과 함께 2 × 106 조기 계대 hESC 내로 전기천공하였다(도 18). Amaxa 핵감염 용액 L(Lonza)을 사용하여 핵감염을 수행하였다. 아큐타제(Innovative Cell Technology)로 배양을 처리하여 단세포를 수득하고, 세포를 3일 동안 핵감염 후 ROCK-저해제 Y-27632(10 μM; Tocris) 중에 유지하였다. 이후 핵감염된 세포를 처음 10일 동안 유지된 퓨로마이신 선택 배지에서 2주 동안 성장시켰다. 갱사이클로비어(2 μM)를 또한 무작위 통합의 음성 선택을 위해 첨가하였다. 2주 후, 22개 클론을 PCR 유전형분석, 서열분석, 및 핵형분석에 의해 추가 특징분석을 위해 선택하였다. 모든 기준을 충족한 1개 클론을 증식시키고 2 ㎍의 AAVS1 CAG::FLEX tdTomato/BSD 상동성 공여체, 0.5 ㎍의 각각의 AAVS1 오른쪽 및 왼쪽 TALEN(Addgene), 및 2 ㎍ pCAG-Flpe(Addgene)로 두 번째 라운드의 핵감염을 거쳤다. Flp 재조합효소를 첨가하여 CUX2 유전자위 내 트랜스유전자로부터 FRT-Puro-FRT 카세트를 절제하였다. 이어서 핵감염된 세포를 블라스티시딘 선택에서 2주 동안 성장시켰다. 이후 12개 클론을 PCR 유전형분석을 위해 증식시키고 FRT-Puro-FRT 카세트의 절제를 확인하였다. 트랜스유전자를 수반하는 것으로 확인된 클론 중, 1개 클론을 핵형분석하고, 추가 실험을 위해 선택하였다. 유전형 분석을 위해 사용된 프라이머 목록을 도 20에 제공한다.
분화되지 않은 세포의 배양 및 뉴런 유도(분화 0~13일)
hPSC 세포주를 젤라틴-코팅된 조직 배양 플레이트 상에서 16,000개 세포/㎠로 사전-플레이트-접종된 마우스 배아 섬유아세포(MEF; Globalstem)와 함께 유지하였다. 배지는 DMEM/F12, 20%(v/v) Knockout 혈청 대체물질, 1 mM L-글루타민, 100 μM MEM 비필수 아미노산 및 0.1 mM β-머캅토에탄올(Life Technologies)을 함유하였다. 10 ng/ml FGF2(R&D Systems)를 멸균 여과 후 첨가하였다. 세포에 매일 영양공급하고 6 U/ml 디스파제를 사용하여 매주 계대배양하였다. 신경 분화를 위해, 세포를 아큐타제로 해리시키고 매트리겔 코팅된 플레이트 상에서 10 μM Y-27632가 보충된 200,000개 세포/㎠의 밀도로 보고된 바와 같이 사전-플레이트-접종하고1, 융합성이 된 다음 날 분화를 시작하였다. 820 ml의 Knockout DMEM, 150 ml Knockout 혈청 대체물질, 1 mM L-글루타민, 100 μM MEM 비필수 아미노산 및 0.1 mM β-머캅토에탄올을 함유한 KSR 배지를 사용하여 분화를 시작하였다. LSB+X/P/S/D 유도에서 사용된 저해제에는 LDN193189(250 nM; Stemgent), SB431542(10 μM; Tocris), XAV939(5 μM; Tocris), PD0325901(P1S5D에서 1 μM, P8S10D에서 8 μM; Tocris), SU5402(P1S5D에서 5 μM, P8S10D에서 10 μM; Biovision), DAPT(10 μM; Tocris)가 포함되었다. 논문에 기재된 다른 유도에서 사용된 더 많은 저해제에는 CHIR99021(LSBC에서 6 μM, LSB+C/S/D에서 3 μM; Stemgent)이 포함된다. B27 보충물질을 함유하는 N2 배지1(N2/B27; Life Technologies)를 8일차에 BDNF(20 ng/ml; R&D), 디부티릴 cAMP(0.5 mM; Sigma-Aldrich) 및 아스코르브산(0.2 mM; Sigma-Aldrich)(BCA)이 보충된 100% 신경기본/B27/L-Glu 함유 배지(NB/B27; Life Technologies)에 도달할 때까지 4일부터 2일마다 1/3 증분씩 증가시켜 첨가하였다. P1S5D 및 P8S10D 분화 방식의 개요(분화 0~13일)를 도 2a에 나타내며, 상세한 1일 영양공급 지침은 도 21에 나타내고 0~13일, 및 13일 이후 장기 배양에서 P1S5D 및 P8S10D 유도의 단계별 프로토콜에서 아래에 기재된 바와 같다. 본 발명자들은 13일경 뉴런 수율에서 일관된 결과를 제공한 3개의 상이한 KSR 로트를 시험하였다.
0~13일 및 13일 이후 장기 배양에서 P1S5D 및 P8S10D 유도의 단계별 프로토콜
1. 조직 배양 디쉬를 매트리겔(354234; BD)로 코팅한다: DMEM/F12 중 1:30으로 희석하고 조직 배양 디쉬에 도포한다. 실온에서 2 hr 동안 방치한다.
2. 세포를 탈착한다: 세포 배양물을 PBS로 1회 세척하고, 대부분의 세포가 탈착될 때까지 0.5~1 hr 동안 37℃에서 아큐타제로 해리시킨다.
3. 세척 후, 세포를 Y-27632(10 μM)가 보충된 hESC 배지에 재현탁하고, 1 hr 동안 37℃에서 젤라틴-코팅된 플레이트 상에 플레이트-접종하여 MEF를 제거한다.
4. 세포 현탁액을 수집한다. 세척 후, 세포를 200,000개 세포/㎠로 Y-27632 및 FGF2(10 ng/ml)가 보충된 MEF 컨디셔닝된 배지(완전 융합성 MEF 배양으로부터 수집된 컨디셔닝된 hESC 배지)에 세포를 플레이트-접종한다.
5. 다음 날(0일) 분화를 시작한다. 820 ml의 Knockout DMEM, 150 ml Knockout 혈청 대체물질, 1 mM L-글루타민, 100 μM MEM 비필수 아미노산 및 0.1 mM β-머캅토에탄올(Life Technologies)을 함유하는 KSR 배지를 사용하여 분화를 시작하였다. P1S5D 및 P8S10D 유도에서 사용된 저해제에는 LDN193189(250 nM; Stemgent), SB431542(10 μM; Tocris), XAV939(5 μM; Tocris), PD0325901(P1S5D에서 1 μM, P8S10D에서 8 μM; Tocris), SU5402(P1S5D에서 5 μM, P8S10D에서 10 μM; Biovision), DAPT(10 μM; Tocris)가 포함된다. LSB+X를 0~6일부터 첨가하고, P/S/D를 2~13일부터 첨가하였다.
6. B27 보충물질을 함유하는 N2 배지1(N2/B27; Life Technologies)를 4일부터 2일마다 1/3 증분씩: 4 및 5일 동안 1/3 N2/B27, 6 및 7일 동안 2/3 N2/B27로 증가시키며 첨가하였다. 8일부터 시작해서, 배지를 B27(NB/B27), BDNF(20 ng/ml; R&D), cAMP(0.5 mM; Sigma-Aldrich) 및 아스코르브산(0.2 mM; Sigma-Aldrich)(BCA)이 보충된 신경기본 배지로 교체한다. P1S5D 및 P8S10D 분화 방식의 개요(0~13일)를 도 2a에 나타낸다.
7. 심부층 및 상부층 뉴런의 생성을 위한 13일 이후 장기 배양을 위해, 세포를 사전-플레이트-접종하고 8일까지 단계 1~6에 기재된 바와 같이 분화시킨 후, PO/라미닌/파이브로넥틴 코팅된 디쉬 상으로 계대배양하였다. 이들 디쉬를 37℃에서 24 hr 동안 PBS에 희석된 폴리오르니틴(PO; 15 ㎍/ml; Sigma-Aldrich)으로 처리하였다. PBS로 세척 후, 디쉬를 추가로 37℃에서 12 hr 동안 PBS에 희석된 마우스 라미닌 I(1 ㎍/ml; R&D system) 및 파이브로넥틴(2 ㎍/ml; Sigma-Aldrich)으로 처리하였다. 라미닌 및 파이브로넥틴을 사용 직후 제거하였다.
8. 8일차 세포를 0.5~1 hr 동안 37℃에서 아큐타제로 해리시켰다. 세척 후, 세포를 NB/B27+BCA에서, 각각 150,000개 세포/㎠(P1S5D 군) 또는 300,000개 세포/㎠(P8S10D 군)로 PO/라미닌/파이브로넥틴 코팅된 디쉬 상에 플레이트-접종하였다.
9. 배지를 3~4일마다 교환하고 1 ㎍/ml 라미닌을 더 우수한 뉴런 부착을 위해 매주 첨가하였다.
10. 이어서 세포를 전리생리적 기록, 면역조직화학, 및 RNA 추출을 위해 다양한 시험관내 시점에 평가하였다.
11. 1일의 영양공급 지침의 요약에 대해서는 도 21을 참고한다.
Essential 6™ 배지(E6)에서의 신속 뉴런 분화
hPSC 세포주(WA-09)를 Essential 8TM 배지(보충물질 E8 함유)에서 비트로넥틴(VTN-N; ThermoFisher Scientific) 코팅된 배양 플레이트에서 유지하였다. 세포에 매일 영양공급하고, EDTA 용액으로 5일마다 계대배양하였다. 신경 유도를 위해, 세포를 해리시키고 KSR 기반 유도에 대해 기재된 바와 동일한 방식으로 E8에 사전-플레이트-접종하였다. 분화를 세포가 융합성이 된 다음 날 시작하였다. E6에서 LSB+X 유도에 사용된 저해제에는 10일 처리를 위해 LDN193189(100 nM) 및 SB431542(10 μM), 및 3일 처리를 위해 XAV939(2 μM)가 포함되었다. E6을 처음 10일 동안 사용하였고, 10일차에 시작해서 N2/B27로 교체하였다. 가속화된 유도를 위해, 세포를 3일 동안 0일부터 E6에서 상기 농도로 LSB+X로 처리하였다. 이어서 3일부터 시작해서, LDN193189(50 nM), SB431542(5 μM), XAV939(1 μM), PD0325901(0.4 μM), SU5402(2 μM) 및 DAPT(5 μM)를 E6 내로 첨가하였다. N2/B27 배지를 2일마다 1/3 증분씩, 5일부터 1/3(v/v)로 E6에 첨가하였다. N2/B27 내 저해제에는 KSR/N2 기반 유도에서 P1S5D와 동일한 농도로 LSB+X+P/S/D가 포함되었다. P/S/D를 유지하면서 LSB+X를 7일부터 인출하였다. 100% NB/B27+BCA를 9일부터 사용하였다. NB/B27에서 사용된 저해제에는 PD0325901(1 μM), SU5402(5 μM) 및 DAPT(10 μM)가 포함된다. E6에서 가속화된 분화 방식의 개요(분화 0~13일)를 도 3k에 나타낸다.
심부층 및 상부층 뉴런의 생성을 위한 13일 이후 장기 배양
심부층 및 상부층 피질 뉴런의 생성을 위한 장기 배양 프로토콜을 도 3f에 도식적으로 예시하며, 상세한 1일 영양공급 지침을 도 21에 나타낸다. hPSC를 도 2a에 기재된 바와 같이 0일부터 P1S5D 또는 P8S10D에 의해 유도하고, 분화 8일차에 37℃에서 0.5~1 hr 동안 아큐타제-매개된 해리에 의해 계대배양하였다. 세포를 사전-코팅된 배양 디쉬 상으로 각각 P1S5D 또는 P8S10D에 대해 150,000개 세포/㎠ 또는 300,000개 세포/㎠로 재플레이트-접종하였다. 사전-코팅을 위해, 디쉬를 37℃에서 24 hr 동안 PBS에 희석된 폴리오르니틴(PO; 15 ㎍/ml; Sigma-Aldrich)에 노출시켰다; PBS로 3회 세척 후, 배양 디쉬를 추가로 37℃에서 12 hr 동안 PBS에 희석된 마우스 라미닌 I(1 ㎍/ml; R&D system) 및 파이브로넥틴(2 ㎍/ml; Sigma-Aldrich)으로 처리하였다. 라미닌 및 파이브로넥틴을 사용 직전에 제거하였다. 계대배양 및 장기 배양 둘 다를 위해 사용된 배지는 상술된 바와 같은 NB/B27+BCA였다. 배지를 3~4일마다 교환하고 1 ㎍/ml 라미닌을 뉴런의 부착 유지를 위해 매주 첨가하였다. 이어서 세포를 전기생리적 기록, 면역세포화학, 및 RNA 추출을 위한 다양한 시험관내 시점에 평가하였다. 도 8에 나타낸 결과를 위해, 계대배양된 P8S10D 세포를 마우스 별아교세포와 또는 별아교세포 컨디셔닝된 배지의 존재 하에 공동-배양하였다. 이러한 연구를 위한 별아교세포의 단리 및 유지를 전술된 바와 같이 수행하였다31. 컨디셔닝된 배지 수집을 위해, 별아교세포에 NB/B27+BCA로 영양공급하고, 컨디셔닝된 배지를 2~3일마다 수집하였다. 이어서 컨디셔닝된 배지를 0.22 ㎛ 막 포어 진공 필터(Corning)를 통해 여과하여 세포 오염을 제거하였다.
EdU 표지화 및 세포의 정량
EdU를 각각 다양한 분화 시점(8일, 13일, 18일, 23일, 28일, 33일)에 시작하는 48 hr 윈도우에 대해 5 μM로 배양에 첨가하고, 세포를 20분 동안 4% 파라포름알데하이드로 40일차에 고정하였다. EdU를 제조업체의 사양에 따라 Click-iT EdU 조영 키트(Invitrogen)로 검출하였다. EdU 표지화 실험에서 EdU 양성 및 피질층 마커 양성 뉴런의 정량, 및 장기 배양에서 마커 양성 뉴런 및 총 세포의 정량을 핵 정량을 위한 ITCN 플러그인을 포함하는 ImageJ를 사용하여 수행하고, 수동 계수와 조합하였다. 세포 배양의 2개 독립 배치로부터 6개의 균일한 무작위 선택된 이미지 프레임을 20X 대물렌즈를 사용하여 포착하고 정량을 위해 사용하였다. 공동-표지화 분석(EdU, 피질층 마커)을 위해 적절히 분해될 수 없는 클러스터 함유 영역을 배제하였다. pH3의 정량 및 절단된 카스파제 3 양성 세포를 또한 ITCN 플러그인을 포함하는 ImageJ를 사용하여 수행하였다. 배양 플레이트 당, 4개의 균일한 무작위 선택된 이미지 프레임을 10X 대물렌즈로 포착하고 세포 배양의 2개 독립 배치로부터 정량을 위해 사용하였다. 모든 정량 결과를 Prism(version 6.0, GraphPad)에 도시하였다.
RNA 추출 및 qRT-PCR
세포를 Trizol 시약(Life Technology)으로 용해시키고 -20℃에 보관하였다. 총 RNA를 페놀/클로로포름 및 이소프로판올 침전을 사용하여 추출하고 ddH2O 중에 용해시켰다. QuantiTech 역전사 키트(Qiagen)를 사용하여 cDNA를 제조하였다. 정량적 RT-PCR을 Mastercycler Realplex2(Eppendorf)를 사용하여 수행하고, GAPDH를 정상화를 위한 하우스키핑 유전자 대조군으로서 사용하였다. 델타 델타 Ct 및 배율 변화를 계산하고, 결과를 Prism(version 6.0, GraphPad)에 도시하였다.
면역세포화학
세포를 20분 동안 4%(v/v) 파라포름알데하이드로 고정하고, PBS로 세척하고, 1 hr 동안 1%(w/v) BSA 함유 PBS 중 0.3%(v/v) Triton X-100을 사용하여 투과화하고 차단하였다. 면역세포화학을 위해, 세포를 하룻밤 동안 4℃에서 동일한 차단 완충액에서 희석된 일차 항체와 인큐베이션하였다. 상기 연구에서 사용된 일차 항체의 목록을 표 1로서 제공한다. 수 회 세척 후, 세포를 실온에서 1 hr 동안 차단 완충액에 희석된 적절한 AlexaFluor 이차 항체(1:500; Molecular Probes) 및 DAPI(1:1000; Thermo Fisher)와 인큐베이션하였다. 세척 후, 세포를 Hamamatsu ORCA CCD 카메라를 사용하여 Olympus IX71 현미경에 의해 이미지를 촬영하였다. 생체내 연구의 조직학적 분석을 위해, 고정된 뇌를 바이브레이톰(Leica VT1200S)을 사용하여 60 ㎛ 두께 슬라이스로 섹션처리하고, 이후 0.02% NaN3 함유 PBS에 최대 1주 동안 보관하였다. 면역세포화학을 위해, 슬라이스를 투과화하고, 2 hr 동안 1% BSA 함유 PBS 중 0.3% Triton X-100을 사용하여 차단하고, 4℃에서 3~5일 동안 동일한 차단 완충액에 희석된 일차 항체와 인큐베이션하였다. 이차 항체 염색을 세포 상에서 동일하게 수행하였다. 상기와 동일한 설정을 갖는 Olympus IX81 현미경, 또는 공초점 레이저 주사 현미경(Olympus FV1000)에 의해 Z-시리즈로 2 ㎛에서 이미지를 획득하였다. 수침 렌즈(10X 및 40X) 하에 공초점 이미지를 촬영하고 FluoView(Olympus) 및 Photoshop(Adobe Systems)을 사용하여 분석하였다.
검증 정보를 포함하는 일차 항체의 목록
항체 공급원 종 희석도 카탈로그 번호 참조 Pubmed ID/검증
BLBP Chemicon 토끼 1:2000 AB9558 PMID: 18983967, 23395372
BRN2 Santa Cruz 염소 1:500 Sc-6029 PMID: 26043730, 23459943, 22566684, http://1degreebio.org/reagents/product/184322/?qid=1498191
BRN3A Chemicon 마우스 1:200 MAB1585 PMID: 22750882
칼레티닌(Calretini)/CALB2 Swant 마우스 1:1000 6B3 PMID: 23642365, 18716623
칼바인딘(Calbindin)/CALB1 Swant 마우스 1:1000 300 PMID: 23642365, 21725324
절단된 카스파제 3 Cell Signaling 토끼 1:100 9661 https://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/cleaved-caspase-3-asp175-A ntibody /9661 , http://www.biocompare.com/9776- antibodies /154962-Cleaved-Caspase3-Asp175-Antibody/
CTIP2 Abcam 래트 1:500 ab18465 PMID: 18983967, 23395372, 23642365
CUX1 Santa Cruz 토끼 1:100 Sc-13024 PMID: 18983967, 26752160, 25788693, 25404384
CUX2 Abcam 토끼 1:200 ab130395 http://www.abcam.com/cux2-antibody-ab130395.html
EMX2 Chemicon 토끼 1:100 AB5730 PMID: 12644247
FOXG1/BF1 Stem Culture 토끼 1:1000 NC-FAB (공급이 중단됨). 대안적 항체: Cat# M227; Takara(Clontech)
FOXP2 Abcam 토끼 1:1000 ab16046 PMID: 23395372
GABA Sigma-Aldrich 토끼 1:500 A2052 http://1degreebio.org/reagents/product/828949/?qid=1498385
GAD65/67 Chemicon 토끼 1:500 AB1511 https://www.labome.com/product/EMD-Millipore/AB1511.html
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iDISCO 앞뇌 면역형광 및 조영
뇌를 업데이트된 온라인 프로토콜(http://idisco.info, 2015년 1월 버전)에 기재된 변형을 포함하여, iDISCO 프로토콜에 기재된 바와 같이 처리하였다18. 사용된 일차 항체는 닭 항-GFP(1:1000; Aves GFP-1020), 및 마우스 항-h시냅토피신(1:1000; Enzo Life Science)이었다. 사용된 이차 항체는 당나귀 항-닭-Alexa647(1:1000; Jackson Immunoresearch) 및 당나귀 항-마우스-Alexa568(1:1000; Life Technologies)이었다. 세정된 샘플을 sCMOS 카메라(Andor Neo)가 장착된 광편 현미경(Ultramicroscope II, LaVision Biotec) 및 6 ㎜ 작업 거리 침지 캡이 장착된 2X/0.5 대물 렌즈 상에서 조영하였다.
유세포 측정
세포를 37℃에서 30분 내지 1 hr 동안 아큐타제로 해리시켰다. 세척 후, 세포를 프로피디움 요오다이드(2 ㎍/ml) 함유 1X PBS 중에 재현탁하고, FACScalibur 플랫폼(BD Biosciences)에 의해 정렬하였다. GFP+%를 프로피디움 요오다이드 음성 집단 내에서 결정하였다. 세포내 유세포 측정을 위해, 세포를 해리시키고 세척하고, 20분 동안 4%(v/v) 파라포름알데하이드로 고정하였다. 이어서 고정된 세포를 투과화하고 제조업체의 설명서에 따라 1x BD Perm/Wash 완충액(BD Biosciences)을 사용하여 염색하였다. 사용된 유세포 측정을 위한 일차 콘주게이션된 항체는 Nestin-Alexa647(1:50; BD Pharmingen, #560341) 및 TUJ1-Alexa488(1:50; BD Pharmingen, #560338)이었다. 세포를 FACScalibur를 사용하여 정렬하였다. 결과를 FlowJo(Version 7.6)를 사용하여 분석하였다.
전기생리학
세포를 분화 8일차에 재플레이트-접종하고 뉴런 분화 배지에서 35 ㎜ 지름 페트리 디쉬(Falcon) 상에서 유지하였다. 16일, 23일, 30일, 37일 및 40일에, 기록 전 2 hr 동안 37℃에서 DMEM 배지(Life Technology)에 사전-인큐베이션하고 전기생리를 수행하였다. EGFP+ 이식된 세포의 생체내 기록을 위해, EGFP+ H9 유도된 세포가 이식된 NOD-SCID IL2Rgc -/- 마우스를 아베르틴으로 마취하고 목을 베었다. 뇌를 제거하고 350 ㎛ 관상 뇌 슬라이스를 120 mM 콜린 클로라이드, 26 mM NaHCO3, 2.6 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 7 mM MgSO4, 0.5 mM CaCl2, 1.3 mM 아스코르브산 및 15 mM D-글루코스를 함유하고 95% O2 및 5% CO2가 버블링된 빙냉 콜린 클로라이드-기반 절단 용액에서 바이브레이톰(Leica Microsystems) 상에서 섹션처리하였다. 슬라이스를 126 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.2 mM NaH2PO4, 1.3 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 및 10 mM D-글루코스를 함유하고 95% O2 및 5% CO2가 버블링된 인공 뇌척수액(ACSF) 내로 옮기고 적어도 1 hr 동안 32℃에서 계면 챔버에서 회수한 후, 실온에서 유지한 뒤 34℃에서 ACSF 함유 기록 챔버로 옮겼다.
에피플루오레슨스(epifluorescence) 조명, CCD 카메라, 2개의 수침 렌즈(Х10 및 Х60)가 장착된 적외선-DIC 현미경(Olympus BX51)을 사용하여 EGFP+ 이식된 세포 및 시험관내 H9 유도된 뉴런에 대한 기록 전극을 가시화하고 표적화하였다. 유리 기록 전극(7~9 MΩ 저항)을 126 mM 칼륨-글루코네이트, 2 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0.2 mM EGTA, 10 mM HEPES, 4 mM Na2ATP, 0.4 mM Na2GTP 및 0.5% 뉴로바이오틴(Invitrogen)(pH 7.25 및 295 mOsm/㎏)으로 구성된 세포내 용액으로 충전하였다. 기록 데이터를 Multiclamp 700B 증폭기 및 pCLAMP10 소프트웨어(Molecular Devices)를 사용하여 수집하였다. 점화 이벤트를 픽업하여 점화의 동역학을 Clampfit10.2를 사용하여 분석하였다. 작은 과분극 전류 주입(-5 pA) 펄스 지점에서 세포의 입력 저항을 평탄부에 도달한 후 막 전위 변화로부터 옴의 법칙으로 제공하였다. 자연적-PSC를 mini Analysis 프로그램(Synaptosoft Inc.)을 사용하여 분석하였다.
신생 마우스 내로의 이식
모든 절차를 NIH 가이드라인에 따라 수행하였고, 현지 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC), 기관 생물안전성 위원회(IBC) 및 배아 줄기 세포 연구 위원회(ESCRO)에 의해 승인받았다. P1S5D 세포를 유도 8일차에 아큐타제로 해리시키고, 40 ㎛ 세포 여과기(Falcon)로 여과하였다. 세포를 1회 세척하고 100,000개 세포/㎕의 밀도로 빙냉 PBS에 재현탁한 후, 33-게이지 첨부 바늘을 갖는 10 ㎕ 주사기(Hamilton)로 취하였다. 주사기를 구동하기 위해 정전기적 장치 및 전기 펌프(Boston Scientific)의 보조로 P2 신생 NOD-SCID IL2Rgc -/- 마우스(Jackson Laboratory)의 몸감각 피질 내로 총 2 ㎕ 세포를 1 ㎕/1 분의 속도로 주사하였다. 완전 마취된 마우스에 이식 1개월, 1.5개월, 3개월, 및 6개월 후 헤파린 함유 PBS(20 단위/ml), 이어서 20 ml의 4% 파라포름알데하이드로 경심장 관류하였다. 이어서 마우스 뇌를 추출하고 하룻밤 동안 4% 파라포름알데하이드에 의해 후-고정하였다.
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본원에 개시되는 요지 사안 및 그 장점이 상세히 기재되었으나, 다양한 변화, 치환 및 변경이 첨부되는 청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 정신 및 범위에서 벗어나지 않고 본원에서 수행될 수 있음이 이해되어야 한다. 또한, 본 출원의 범위는 명세서에 기재되는 공정, 기계, 제조, 및 대상 조성, 수단, 방법 및 단계의 특정 구현예로 제한되고자 하는 것이 아니다. 당업자가 본원에 개시되는 요지 사안의 개시로부터 쉽게 이해할 바와 같이, 현재 존재하거나 본원에 기재되는 해당 구현예와 실질적으로 동일한 기능을 수행하거나 실질적으로 동일한 결과를 달성하는 이후 개발될 공정, 기계, 제조, 대상 조성, 수단, 방법, 또는 단계는 본원에 개시되는 요지 사안에 따라 이용될 수 있다. 따라서, 첨부되는 청구범위는 이의 범위 내에 이러한 공정, 기계, 제조, 대상 조성, 수단, 방법, 또는 단계를 포함하려는 것이다.
특허, 특허 출원, 공보, 제품 설명 및 프로토콜이 본 출원에 걸쳐 인용되며, 그 개시는 모든 목적을 위해 이의 전문이 참조로 본원에 포함된다.
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Claims (30)

  1. 복수의 세포가 분화하여 하나 이상의 피질 뉴런 전구체 마커를 발현하도록, 줄기 세포의 집단을 유효 농도의 하나 이상의 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/Activin-Nodal 신호전달의 저해제, 하나 이상의 뼈 형태형성 단백질(BMP) 신호전달의 저해제, 하나 이상의 wingless(Wnt) 신호전달의 저해제, 하나 이상의 MAPK/ERK 키나제 신호전달의 저해제, 하나 이상의 FGF 신호전달의 저해제 및 하나 이상의 Notch 신호전달의 저해제에 노출시키는 단계를 포함하는 다능성 줄기 세포의 시험관내 분화 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 줄기 세포의 집단은 상기 하나 이상의 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/Activin-Nodal 신호전달의 저해제에 대한 최초 노출의 적어도 6일 후 검출 가능한 수준의 PAX6을 발현하는 방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 줄기 세포의 집단은 상기 하나 이상의 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/Activin-Nodal 신호전달의 저해제에 대한 최초 노출의 최대 6일 후 검출 가능한 수준의 PAX6을 발현하는 방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 줄기 세포의 집단은 상기 하나 이상의 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/Activin-Nodal 신호전달의 저해제에 노출된 적어도 2일 또는 3일 후 상기 하나 이상의 MAPK/ERK 키나제 신호전달의 저해제, 하나 이상의 FGF 신호전달의 저해제 및 하나 이상의 Notch 신호전달의 저해제가 줄기 세포의 집단에 노출되는 방법.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 줄기 세포의 집단은 상기 하나 이상의 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/Activin-Nodal 신호전달의 저해제에 노출된 최대 2일 또는 3일 후 상기 하나 이상의 MAPK/ERK 키나제 신호전달의 저해제, 하나 이상의 FGF 신호전달의 저해제 및 하나 이상의 Notch 신호전달의 저해제가 줄기 세포의 집단에 노출되는 방법.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 복수의 세포는 상기 하나 이상의 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/Activin-Nodal 신호전달의 저해제에 대한 노출 적어도 13일 후 TUJ1, TBR1, TLE4, DCX, REELIN, CTIP2, SATB2, FOXP2, RGS4, CUX2, BLBP 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 검출 가능한 수준의 마커를 발현하는 방법.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 복수의 세포는 상기 하나 이상의 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/Activin-Nodal 신호전달의 저해제에 대한 노출 최대 13일 후 TUJ1, TBR1, TLE4, DCX, REELIN, CTIP2, SATB2, FOXP2, RGS4, CUX2, BLBP 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 검출 가능한 수준의 마커를 발현하는 방법.
  8. 청구항 6 또는 청구항 7에 있어서,
    검출 가능한 수준의 TUJ1을 발현하는 적어도 50%의 복수의 세포가 또한 검출 가능한 수준의 TBR1, TLE4, 또는 이의 조합을 발현하는 방법.
  9. 청구항 6 또는 청구항 7에 있어서,
    상기 줄기 세포의 집단은 상기 하나 이상의 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/Activin-Nodal 신호전달의 저해제에 노출된 적어도 16일 후 분화된 피질 뉴런의 전기생리적 활성을 나타내는 방법.
  10. 청구항 1에 있어서,
    상기 하나 이상의 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/Activin-Nodal 신호전달의 저해제, 하나 이상의 뼈 형태형성 단백질(BMP) 신호전달의 저해제 및 하나 이상의 wingless(Wnt) 신호전달의 저해제는 적어도 6일 동안 상기 줄기 세포의 집단에 노출되는 방법.
  11. 청구항 1에 있어서,
    상기 하나 이상의 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/Activin-Nodal 신호전달의 저해제, 하나 이상의 뼈 형태형성 단백질(BMP) 신호전달의 저해제 및 하나 이상의 wingless(Wnt) 신호전달의 저해제는 최대 6일 동안 상기 줄기 세포의 집단에 노출되는 방법.
  12. 청구항 1에 있어서,
    상기 하나 이상의 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/Activin-Nodal 신호전달의 저해제, 하나 이상의 뼈 형태형성 단백질(BMP) 신호전달의 저해제 및 하나 이상의 wingless(Wnt) 신호전달의 저해제는 적어도 7일 동안 상기 줄기 세포의 집단에 노출되는 방법.
  13. 청구항 1에 있어서,
    상기 하나 이상의 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/Activin-Nodal 신호전달의 저해제, 하나 이상의 뼈 형태형성 단백질(BMP) 신호전달의 저해제 및 하나 이상의 wingless(Wnt) 신호전달의 저해제는 최대 7일 동안 상기 줄기 세포의 집단에 노출되는 방법.
  14. 청구항 1에 있어서,
    상기 하나 이상의 TGFβ/Activin-Nodal 신호전달의 저해제는 SB431542, 이의 유도체 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물을 포함하는 방법.
  15. 청구항 1에 있어서,
    상기 하나 이상의 뼈 형태형성 단백질(BMP) 신호전달의 저해제는 LDN193189, 이의 유도체 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물을 포함하는 방법.
  16. 청구항 1에 있어서,
    상기 하나 이상의 wingless(Wnt) 신호전달의 저해제는 XAV939, 이의 유도체 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물을 포함하는 방법.
  17. 청구항 1에 있어서,
    상기 하나 이상의 MAPK/ERK 키나제 신호전달의 저해제는 PD0325901, 이의 유도체 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물을 포함하는 방법.
  18. 청구항 1에 있어서,
    상기 하나 이상의 FGF 신호전달의 저해제는 SU5402, 이의 유도체 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물을 포함하는 방법.
  19. 청구항 1에 있어서,
    상기 하나 이상의 Notch 신호전달의 저해제는 γ-시크리타제 저해제를 포함하는 방법.
  20. 청구항 20에 있어서,
    상기 γ-시크리타제 저해제는 DAPT, 이의 유도체, 또는 이의 혼합물을 포함하는 방법.
  21. 청구항 1에 있어서,
    상기 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포, 인간 유도된 다능성 줄기 세포, 인간 단성생식 줄기 세포, 원시 생식 세포-유사 다능성 줄기 세포, 외배엽 줄기 세포 및 F-클래스 다능성 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  22. 청구항 1에 있어서,
    상기 방법은 복수의 세포를 BDNF, cAMP 및 아스코르브산 신호전달을 활성화하는 하나 이상의 화합물에 노출시키는 단계를 포함하는, 복수의 세포를 세포의 피질 뉴런으로의 성숙을 선호하는 조건으로 처리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  23. 하나 이상의 피질 뉴런 마커를 발현하는 시험관내 분화된 세포, 또는 이의 전구체의 집단으로서, 상기 분화된 세포 집단은 청구항 1 내지 청구항 22 중 어느 한 항의 방법에 따라 줄기 세포의 집단으로부터 유도되는 집단.
  24. 청구항 23에 따른 시험관내 분화된 세포의 집단을 포함하는 조성물.
  25. 청구항 23에 따른 유효량의 시험관내 분화된 세포의 집단을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 신경퇴행성 장애를 치료하는 방법.
  26. 청구항 25에 있어서,
    상기 대상체는 신경퇴행성 장애로 진단받았거나 그럴 위험이 있는 방법.
  27. 청구항 26에 있어서,
    상기 신경퇴행성 장애는 파킨슨병인 방법.
  28. 신경퇴행성 장애의 치료를 위한 약제의 제조에서의 청구항 23에 따른 시험관내 분화된 세포의 집단의 용도.
  29. 다음 중 하나 이상을 포함하는, 줄기 세포의 분화를 유도하기 위한 키트:
    (a) 하나 이상의 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/Activin-Nodal 신호전달의 저해제,
    (b) 하나 이상의 BMP 신호전달의 저해제;
    (c) 하나 이상의 wingless(Wnt) 신호전달의 저해제;
    (e) 하나 이상의 FGF 신호전달의 저해제;
    (e) 하나 이상의 Notch 신호전달의 저해제;
    (f) 하나 이상의 MAPK/ERK 키나제 신호전달의 저해제; 및
    (g) 청구항 1 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 피질 뉴런 마커를 발현하는 분화된 세포의 집단으로 줄기 세포의 분화를 유도하기 위한 설명서.
  30. 시험관내 분화된 세포의 집단을 포함하는 키트로서, 상기 세포의 집단은 청구항 1 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 분화되는 키트.
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