JP2019506901A - ヒト人工多能性幹細胞からの皮質ニューロンの分化 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2016年1月27日に出願された米国仮出願番号第62/287,821号、および2017年1月23日に出願された米国仮出願番号第62/449,488号に基づく優先権を主張しており、これら仮出願の各々の内容は、それらの全体が本明細書中に参考として援用され、そしてそれらの各々に基づく優先権が主張される。
本発明は、国立衛生研究所によって授与された補助金番号R01NS072381およびNS084334の下の政府支援でなされた。政府は本発明において特定の権利を有する。
本開示の主題は、ヒト幹細胞から誘導された皮質ニューロンおよびそれらの前駆体、ならびに神経障害の細胞ベースの処置におけるそれらの使用に関する。
過去数年にわたって、ヒト多能性幹細胞(hPSC)を初期神経系統に変換するための方法が開発されてきた。特に効率的な戦略は、分化11日目以内にヒト胚幹細胞(hESC)またはヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)からPAX6+中枢神経系(CNS)神経前駆体への分化を誘発するために、SMADシグナル伝達を阻害する小分子(例えば、二重SMAD阻害)を使用することである1。神経サブタイプの指定は、WNTシグナル伝達などのさらなる小分子標的化経路を使用して、さらに調節され得る。二重SMAD阻害条件下でWNTシグナル伝達を活性化する化合物に時限的に曝露すると、SOX10+神経堤系統が誘導される。それとは対照的に、WNTシグナル伝達の阻害は、FOXG1+前脳前駆体の誘導を増強する2〜4。これらの操作は、定義された神経前駆体細胞集団を効率的に特定するが、機能的ニューロンへのさらなる分化は、数ヶ月まではかからないとしても数週間に及ぶ場合がある、長期にわたるプロセスになっている。ニューロンの運命獲得を加速するための試みでは、線維芽細胞成長因子(FGF)シグナル伝達の強力な阻害剤であるSU54025、およびノッチシグナル伝達をブロックするγ−セクレターゼ阻害剤であるDAPT6の、2種のさらなる小分子の使用が説明された。これらの2種の阻害剤(SD)を、二重SMAD阻害およびWNT活性化と組み合わせて適用すると、標準二重SMAD阻害条件下で神経前駆体細胞を誘導するのに必要な期間1と同じ期間である分化11日目までに、75%の有糸分裂後ニューロンが生じる7。しかし、急速に誘導されたニューロンにおけるBRN3AおよびISL1の同時発現により、これらは、PAX6由来のCNSニューロンではなく、末梢性感覚と定義付けられた7。したがって、感覚運命指定中にニューロンの運命獲得を加速するための戦略が、CNS運命に適応され得るかどうかは、まだ不明である。PAX6由来の皮質ニューロンは、ヒト発生および神経変性CNS障害の分野に関連する。したがって当技術分野では、皮質ニューロンを急速に誘導するための方法および組成物が必要である。
本開示の主題は、例えばin vitro分化によって幹細胞から誘導された、皮質ニューロンおよびそれらの前駆体、例えばその近接前駆体に関する。
4.図面の簡単な説明
本開示の主題は、例えば、ヒト幹細胞を機能的皮質ニューロンにin vitroで分化させることによって、ヒト幹細胞から誘導される皮質ニューロンを調製する方法、およびこのような方法によって生成された細胞に関する。CNS神経変性障害を処置するためのこのような細胞の使用も提供される。
5.1 定義
5.2 幹細胞を分化させる方法
5.3 分化細胞集団を含む組成物
5.4 CNS神経変性障害を予防および/または処置する方法
5.5 キット
本明細書において使用される用語は、一般に、それぞれの用語が使用される本発明の文脈および特定の文脈において、当技術分野におけるそれらの通常の意味を有する。本発明の組成物および方法、ならびにそれらをどのように作成し使用するかについての説明により、実務者に追加の指針を提供するためのある特定の用語を、以下または本明細書の他所で論じる。
本開示の主題は、幹細胞(例えば、ヒト幹細胞)の分化を誘導するためのin vitro方法を提供する。ヒト幹細胞の非限定的な例として、ヒト胚幹細胞(hESC)、ヒト多能性幹細胞(hPSC)、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)、ヒト単為生殖幹細胞、始原胚細胞様の多能性幹細胞、胚盤葉上層幹細胞、Fクラス多能性幹細胞、体細胞幹細胞、がん幹細胞、または系統特異的に分化することができる任意の他の細胞が挙げられる。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、ヒト胚幹細胞(hESC)である。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)である。ある特定の実施形態では、幹細胞は、非ヒト幹細胞である。非ヒト幹細胞の非限定的な例として、非ヒト霊長類幹細胞、げっ歯類幹細胞、イヌ幹細胞、ネコ幹細胞が挙げられる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、多能性幹細胞である。ある特定の実施形態では、幹細胞は、胚幹細胞である。ある特定の実施形態では、幹細胞は、人工多能性幹細胞である。
本開示はまた、本明細書に記載される方法に従って調製された、1種または複数のニューロンマーカー、例えば、皮質ニューロンマーカーを発現するin vitro分化細胞集団またはその前駆体細胞集団を提供する。ある特定の実施形態では、細胞集団の少なくとも約70%(例えば、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも約99%、または少なくとも約99.5%、または少なくとも99.9%)は、1種または複数の皮質ニューロンマーカー、例えば、TBR1、TLE4、DCX、REELIN、CTIP2、SATB2、FOXP2、RGS4、CUX2、BLBP、またはそれらの組合せを発現する。
1種または複数の皮質ニューロンマーカーを発現するin vitro分化細胞(「幹細胞由来の皮質ニューロン」とも呼ばれる)、またはそれらの前駆体は、神経変性障害を予防および/または処置するために使用され得る。本開示の主題は、神経変性障害を予防および/または処置する方法であって、有効量の本開示の幹細胞由来の皮質ニューロンおよびそれらの前駆体を、神経変性障害に罹患している対象に投与するステップを含む方法を提供する。神経変性障害の非限定的な例として、パーキンソン病、アルツハイマー病、および統合失調症が挙げられる。
本開示の主題は、幹細胞の分化を誘導するためのキットを提供する。ある特定の実施形態では、キットは、以下:(a)形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン−ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(b)BMPシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(c)Wntシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(d)FGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(e)ノッチシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、(f)MAPK/ERKキナーゼシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、および(g)本明細書に記載される方法に従って、1種または複数のニューロンマーカー、例えば、皮質ニューロンマーカーを発現する分化細胞集団またはその前駆体細胞集団への幹細胞の分化を誘導するための指示書の1つまたは複数を含む。
本開示の主題は、本開示の主題の例として、限定のためではなく提供される、以下の実施例を参照することにより、より良く理解される。
6.1 実施例1:幹細胞集団を6つのシグナル伝達経路阻害剤と接触させることによって、幹細胞由来の皮質ニューロンを調製する方法。
機能的ニューロンへのヒト多能性幹細胞(hPSC)の変換においては、かなりの進歩が得られている。しかし、ヒトニューロンの指定および機能的成熟のタイミングが長引くことは、依然として、疾患モデリングおよび再生医療におけるhPSC由来の系統の日常的な適用を妨げる重要課題である。本発明者らは、組合せ小分子のスクリーニングを使用して、末梢性感覚ニューロンを急速に誘導するための条件を既に同定した。ここで本発明者らは、CNS運命への到達を加速するアプローチを一般化するための試みにより、皮質ニューロンの急速な誘導について報告する。本発明者らは、グリア共培養の必要なしに、分化13日目までに有糸分裂後皮質ニューロンを誘導し、分化16日目までに機能的電気生理学的特性を誘導するための、6つの経路阻害剤の組合せの使用を実証する。生後マウスの皮質に分化8日目に移植したニューロンは、機能的であり、iDISCOベースの全脳画像化を使用して示される通り、長距離投射を確立する。皮質ニューロン運命への分化の加速は、CNS障害における疾患モデリングおよび細胞治療のためのhPSCベースの戦略を容易にするはずである。
ニューロンの運命獲得を加速するための試みでは、本開示の主題は、線維芽細胞成長因子(FGF)シグナル伝達の強力な阻害剤であるSU5402、およびノッチシグナル伝達をブロックするγ−セクレターゼ阻害剤であるDAPTの、2種のさらなる小分子の使用を提供する6。これらの2種の阻害剤(SD)を、二重SMAD阻害およびWNT活性化と組み合わせて適用すると、標準二重SMAD阻害条件下で神経前駆体細胞を誘導するのに必要な期間1と同じ期間である分化11日目までに、75%の有糸分裂後ニューロンが生じる7。しかし、急速に誘導されたニューロンにおけるBRN3AおよびISL1の同時発現により、これらは、PAX6由来のCNSニューロンではなく、末梢性感覚と定義付けられた7。したがって、感覚運命指定中にニューロンの運命獲得を加速するための戦略がCNS運命に適応され得るかどうかは、まだ不明である。PAX6由来の皮質ニューロンは、ヒト発生の研究のため、ならびにヒトの神経発生性および神経変性CNS障害のモデリングのために、特に興味深い。hPSCから皮質ニューロンを誘導するために信頼できるプロトコールが存在するが、それらの条件は、低層および上層の両方の皮質ニューロンを得るのに30日〜90日の間の分化が必要であり15、30、完全成熟を達成するには、さらにより長期間が必要である。ここで本発明者らは、疾患モデリングおよび再生医療への適用における、hPSC由来のニューロンの日常的な適用を容易にするためにヒト皮質ニューロン運命誘導を大幅に加速する小分子ベースの条件を同定することを目的とする。
神経堤運命に対するCNSの決定における、WNTシグナル伝達の非常に重要な役割を前提として3、8、開示される方法は、皮質ニューロン運命への急速な分化を誘発したWNTシグナル伝達を活性化するのではなく、そのWNTシグナル伝達を阻害する組合せ小分子のアプローチを開発した(図1A)。開示される方法は、GSK3β阻害剤であるCHIR99021(C;WNTアゴニスト)を、タンキラーゼ阻害およびアキシン安定化によって作用するWNTアンタゴニストであるXAV939と交換する9。すべての他の阻害剤(LDN+SB=二重SMAD阻害(LSB)、SU5402およびDAPT)は、前脳ニューロン運命を急速に誘導することを目的とする初期の研究のために、変更せずにそのままにすることができる(LSB+X/S/Dプロトコール、図2A)。急速なニューロン誘導中、CNSからPNS運命への切替えを予想外に誘発した本発明者らの経験を前提として7、開示される方法は、最初に3種の遺伝的hESCレポーター株を使用して、X/S/D条件下で初期外胚葉系統の選択に対する影響を査定した。CNS系統をモニターするために、開示される方法は、新規なPAX6::H2B−GFPレポーター株を確立し、神経堤運命については、開示される方法は、過去に公開されたSOX10::GFPレポーター株を使用し2、7、頭蓋プラコードの同一性については、開示される方法は、新規なSIX1::H2B−GFP株を使用した。TALENベースの遺伝子標的化を使用して、PAX6およびSIX1レポーター株の両方を発生させた。開示される方法は、免疫細胞化学を使用してGFPを対応するタンパク質の発現と同等にすることによって、in vitro分化後のレポーターの忠実性を確証した2、10(図1B)。
時間的フロー分析では、図3Aおよび図4に示される通り、P8S10D条件によってニューロンの運命獲得が劇的に加速され、3i(C+S/D)またはより穏やかなCNS(P1S5D)ニューロンプロトコールと比較して、13日目に著しく高い百分率のニューロン(70%のTUJ1+ニューロン)が生じたことが実証された。遺伝子発現分析では、LSB+X/P/S/D条件において、多能性マーカーOCT4のダウンレギュレーション、ならびに神経マーカーおよびニューロンマーカーPAX6、FOXG1およびDCX、ならびにTBR1(プレプレート、サブプレートおよびVI層)およびREELINを含む初期に生まれた皮質ニューロンのマーカーの誘導が確認された。それとは対照的に、感覚ニューロン(3i)および加速なしのCNSプロトコール(LSB+X)は、それぞれ皮質マーカーおよびニューロンマーカーの誘導の欠如を示した(図3B)。
開示される方法は、急速なCNSニューロン誘導条件下でTBR1+細胞の高効率な誘導を実証するが、修飾小分子タイミングレジメンを使用して上層マーカーを発現するニューロンを誘導する実現可能性を示すこともできる。開示される方法は、ニューロンマーカーの急速な誘導に、反復活動電位を自然発生的に発火させる能力などの、急速なin vitro機能的成熟が並行するかどうかについて、さらに調査することができる。hPSC由来のニューロンの機能的成熟は、分化約50〜100日目に典型的に生じる活動電位の発火により、既に実証されている15。開示される方法は、成熟を査定するために、ニューロンの運命に向かって誘導した細胞を、P1S5DまたはP8S10D条件下で8日間培養し、その後、i)任意の小分子阻害剤を含まない基本培地、ii)DAPTだけを添加した培地、またはiii)DAPTをSU5402、PDおよびCHIR99021(CHIR)(P/S/D/C)と共に添加した培地のいずれかで、さらに8日間培養することができる(図6A)。GSK3β阻害剤CHIRは、P/S/Dで維持された培養物に対して強力な生存促進効果を発揮し、正準WNTシグナル伝達の活性化を誘発することによって、軸索伸張およびシナプス形成を含めたニューロン分化を促進することが既に示されているので16、17、この最終分化ステップに含めた。意外なことに、P/S/D/CHIR下で8日間維持されたP8S10D細胞は(多能性状態から分化16日目)、静止膜電位において、または−10pAの電流注入後に過分極が誘導されたら、一連の活動電位の発火によって特徴付けられる成熟した電気生理学的特性を自然発生的に示した(図6B)。すべての条件下で、記録されたニューロンの70%〜80%は、発火できることが記録され、約20%〜30%のニューロンは、P/S/D/Cを用いたP8S10D細胞で、より成熟した発火パターンを示した(一連のおよそ10回の活動電位発火ピーク)(図6D)。
in vitroデータにより、本発明者らの組合せ小分子プロトコールが、皮質マーカーの発現および機能的電気生理学的特性を有するニューロンを急速に誘導できることが実証される。しかし、長期間生存、軸索投射能力および宿主回路網への統合をより完全に査定するために、in vivo移植研究を実施した。EGFPを構成的に発現するhESCから誘導された分化8日目の未成熟ニューロンを、P2 NOD−SCID IL2Rgc−/−マウスの体性感覚皮質にグラフトした(図9)。
開示される方法は、分化8日目のP1S5D誘導神経細胞が、in vivo生存能および皮質内の広範な軸索投射能を有することを示すことができる。P8S10Dニューロンは、グラフトサイズおよび生存率の全体的な低減を示したが、生存グラフトを有する動物は、1.5ヶ月目に、広範な線維伸張および分枝を示した。P8S10Dグラフトが、P1S5D細胞と比較して、より急速にin vivo成熟するかどうかを決定するには、将来的により詳細な研究が必要である。興味深いことに、任意の加速を伴わない二重SMAD阻害培養物(LSB+XAV)からの8日目の同等のグラフトは、広範なグラフト過成長を示し、ニューロン分化の証拠は最小限であった(図11B)。これらのデータは、初期神経上皮の「ロゼット段階」細胞が、神経上皮細胞の腫瘍様の過成長をもたらすことを示唆する本発明者らの過去の実験結果等と同等である19。また、いくつかのニューロンは、固有の白質に従って軸索を伸ばし、いくつかのニューロンは、ランダム方向に軸索を伸ばすので、グラフト細胞は、軸索路探索の不均一性を示す(図12)。したがって、後期神経前駆体またはニューロン系統へのさらなる分化は、神経過成長の危険性を低減するのに非常に重要である。
hESC株およびhiPSC株の発生
hESC(WA−09、継代32〜60回)を、WiCellから得、継代60回まで維持した。hESC SOX10::GFP細菌人工染色体レポーター株(WA−09;継代40〜70回)を、既に報告されている通り発生させた7。構成的EGFP+hESC株(WA−09;継代35〜60回)を、報告されている通り発生させた24。hiPSCを誘導するために、線維芽細胞を、Michael Sheldon(ラトガース大学)によって寄贈により共有されているプロトコールに従って皮膚パンチ生検を消化することによって調製した。簡潔には、皮膚パンチを、DMEM+10%FBS中コラゲナーゼ(1%)およびディスパーゼ(1単位/ml)の混合物で、組織培養インキュベーター中37℃で16〜18時間消化させた。消化後、上皮層を廃棄し、部分的に消化された皮膚層を、乾燥組織培養皿の表面上で四等分し、撹乱されないように2〜5分間静置して、皿への接着を促した。皮膚層が剥離しないように、DMEM+10%FBSを、ウェルに注意深く添加した。コンフルエント病巣がウェルの約2/3を覆うまで、培養物を3日おきに栄養補給した。コンフルエントに達したら、培養物をトリプシン処理によって継代し、再プログラミングの前に4〜5回継代するために拡張した。人工多能性幹細胞を、オリジナルのCytoTune iPS再プログラミングキット(Life Technologies、A1378002)を使用して、製造業者のプロトコールをいくつか修正して使用して生成した。1mMのバルプロ酸(EMD Millipore)を含有するヒトES培地を2〜9日目に添加した。2〜3週間後、個々のiPSクローンを採取し、iPS株として繁殖させた。所与の個体からの3つのiPSサブコロニーのそれぞれが、本当に非クローン性であったかを検証するために、3つの別個の形質導入から誘導された3つの異なるウェルからコロニーを選択した。各株を10回の継代で繁殖させた後、品質管理アッセイを実施した。先に、OCT4、NANOG、SSEA−3、SSEA−4およびTra−1−81の発現を確認した。すべての多能性マーカーを発現したクローンは、MSKCCのMolecular Cytogenetics Core Facilityによって、正常な核型を有することが検証された。10回の継代後に存在しているSendaiベクターの量を、TaqMan iPSC Sendai検出キット(Life Technologies A13640)を使用して定量し、0.01%未満のSendaiウイルスアンプリコン(Mr04269880_mr)を有するクローンだけを使用した。
PAX6−P2A−H2B−GFPおよびSIX1−P2A−H2B−GFPドナー構築物を、pUC19骨格へのIn−Fusionクローニング(Clontech)を実施することによって発生させた。相同性アームを、ゲノムDNAを使用することによって発生させ、H2B:GFPは、Geoff Wahl(Addgene、プラスミド番号11680)から寄贈されたものであり、Pgk−Puroは、AAVS1 hPgk−PuroR−pAドナープラスミド(Rudolf Jaenischからの寄贈(Addgene、プラスミド番号22072))から増幅させた。TALEヌクレアーゼは、Addgeneによって提供されたTALE−Toolboxを使用して発生させた25。Pax6の終止コドンを標的化する配列は、TGTCCTGTATTGTACCACTおよびTGTATACAAAGGTCCTTGTであり、Six1については、TCTCTGCTCGGCCCCCTCAおよびTTGGGGTCCTAAGTGGGGAであった。簡潔には、ドナープラスミド25μgおよび各TALEN5μgを、10×106個のH9 hESCにヌクレオフェクション処理した(nucleofected)。ヌクレオフェクションの72時間後に、ピューロマイシン選択を適用して、抵抗性クローンを単離した。クローンを増幅し、標的化を確認するゲノムPCRを実施した。使用したすべての陽性クローンは、正常な核型を有していた。
CUX2::CreERT2/AAVS1−CAG::FLEX/tdTomato株を、2つの逐次的なヌクレオフェクションおよび選択サイクルによって、RUES2バックグラウンドで創出した。1回目は、CUX2::CreERT2/FRT−Puro−FRT−TK相同性ドナー2μgを、CUX2開始コドンを標的化するTALENと一緒に、2×106個の初期継代hESCに電気穿孔した(図18)。Amaxaヌクレオフェクター溶液L(Lonza)を使用して、ヌクレオフェクションを行った。Accutase(Innovative Cell Technology)で培養物を処理することによって単細胞を得、それらの細胞を、3日間のヌクレオフェクション後にROCK−阻害剤Y−27632(10μM;Tocris)で維持した。その後、ヌクレオフェクション処理した細胞を、最初の10日間維持したピューロマイシン選択培地で2週間成長させた。無作為統合の陰性選択のために、ガンシクロビル(2μM)も添加した。2週間後、PCR遺伝子型解析、シークエンシング、および核型分析によってさらに特徴付けるために、22のクローンを選択した。あらゆる基準を満たした1つのクローンを拡張し、AAVS1 CAG::FLEX tdTomato/BSD相同性ドナー2μg、AAVS1右および左TALEN(Addgene)それぞれ0.5μg、ならびにpCAG−Flpe(Addgene)2μgを用いて2回目のヌクレオフェクションに晒した。Flpリコンビナーゼを添加して、CUX2遺伝子座の導入遺伝子からFRT−Puro−FRTカセットを切除した。次に、ヌクレオフェクション処理した細胞を、ブラストサイジン選択下で2週間成長させた。その後、PCR遺伝子型解析のために12のクローンを拡張し、FRT−Puro−FRTカセットの切除について確認した。導入遺伝子を担持することが見出されたクローンの中から1つのクローンを核型分析し、さらなる実験のために選択した。遺伝子型解析のために使用したプライマーのリストは、図20に提供されている。
hPSC株を、ゼラチンでコーティングした組織培養プレート上に細胞16,000個/cm2で予めプレーティングしたマウス胚線維芽細胞(MEF;Globalstem)と共に維持した。培地は、DMEM/F12、20%(v/v)ノックアウト血清置換、1mMのL−グルタミン、100μMのMEM非必須アミノ酸および0.1mMのβ−メルカプトエタノール(Life Technologies)を含有していた。無菌濾過後に10ng/mlのFGF2(R&D Systems)を添加した。細胞を毎日栄養補給し、6U/mlのディスパーゼを使用して毎週継代した。神経分化のために、Accutaseを用いて細胞を解離させ、マトリゲルでコーティングしたプレート上に10μMのY−27632を補充して、細胞200,000個/cm2の密度で、報告されている通り1予めプレーティングし、コンフルエントの翌日に分化を開始させた。ノックアウトDMEM820ml、ノックアウト血清置換150ml、1mMのL−グルタミン、100μMのMEM非必須アミノ酸および0.1mMのβ−メルカプトエタノールを含有するKSR培地を使用して、分化を開始させた。LSB+X/P/S/D誘導で使用した阻害剤には、LDN193189(250nM;Stemgent)、SB431542(10μM;Tocris)、XAV939(5μM;Tocris)、PD0325901(P1S5D中1μM、P8S10D中8μM;Tocris)、SU5402(P1S5D中5μM、P8S10D中10μM;Biovision)、DAPT(10μM;Tocris)が含まれていた。論文に記載されている他の誘導で使用されたさらなる阻害剤には、CHIR99021(LSBC中6μM、LSB+C/S/D中3μM;Stemgent)が含まれる。B27補充物を含むN2培地1(N2/B27;Life Technologies)を、8日目のBDNF(20ng/ml;R&D)、ジブチリルcAMP(0.5mM;Sigma−Aldrich)およびアスコルビン酸(0.2mM;Sigma−Aldrich)(BCA)で補充した100%neurobasal/B27/L−Glu含有培地(NB/B27;Life Technologies)に達するまで、4日目から1日おきに増分1/3で増大して添加した。P1S5DおよびP8S10D分化スキームの概要(分化0〜13日目)は、図21に示される詳細な毎日の栄養補給の指示と共に、図2Aに提示されており、0〜13日目のP1S5DおよびP8S10D誘導の段階的プロトコール、ならびに13日目を超える長期間培養について以下に説明される通りである。本発明者らは、13日目までのニューロン収率の一貫した結果をもたらした3つの異なるロットのKSRを試験した。
1.組織培養皿をマトリゲル(354234;BD)でコーティングする:DMEM/F12で1:30希釈し、組織培養皿に適用する。室温に2時間置く。
2.細胞を剥離する:細胞培養物をPBSで1回洗浄し、ほとんどの細胞が剥離されるまで、Accutaseを用いて37℃で0.5〜1時間解離する。
3.細胞を洗浄した後、Y−27632(10μM)で補充したhESC培地に再懸濁し、ゼラチンでコーティングしたプレート上に37℃で1時間プレーティングして、MEFを除去する。
4.細胞懸濁液を収集する。洗浄した後、細胞をY−27632およびFGF2(10ng/ml)で補充したMEF条件培地(完全にコンフルエントなMEF培養物から収集した条件hESC培地)に、細胞200,000個/cm2でプレーティングする。
5.翌日に分化を開始させる(0日目)。ノックアウトDMEM820ml、ノックアウト血清置換150ml、1mMのL−グルタミン、100μMのMEM非必須アミノ酸および0.1mMのβ−メルカプトエタノール(Life Technologies)を含有するKSR培地を使用して、分化を開始させた。P1S5DおよびP8S10D誘導で使用した阻害剤には、LDN193189(250nM;Stemgent)、SB431542(10μM;Tocris)、XAV939(5μM;Tocris)、PD0325901(P1S5D中1μM、P8S10D中8μM;Tocris)、SU5402(P1S5D中5μM、P8S10D中10μM;Biovision)、DAPT(10μM;Tocris)が含まれる。LSB+Xを0〜6日目に添加し、P/S/Dを2〜13日目に添加した。
6.B27補充物を含むN2培地1(N2/B27;Life Technologies)を、4日目から1日おきに増分1/3で増大して添加した:4日目および5日目については、1/3のN2/B27、6日目および7日目については、2/3のN2/B27。8日目から、培地を、B27(NB/B27)、BDNF(20ng/ml;R&D)、cAMP(0.5mM;Sigma−Aldrich)およびアスコルビン酸(0.2mM;Sigma−Aldrich)(BCA)で補充したneurobasalに切り替える。P1S5DおよびP8S10D分化スキームの概要(0〜13日目)は、図2Aに提示されている。
7.深層および上層ニューロンの発生のための13日目を超える長期間培養については、細胞を、ステップ1〜6に記載される通り予めプレーティングし、8日目まで分化させ、次にPO/ラミニン/フィブロネクチンでコーティングした皿上で継代した。これらの皿を、PBSで希釈したポリオルニチン(PO;15μg/ml;Sigma−Aldrich)によって、37℃で24時間処理した。皿を、PBSで洗浄した後、PBSで希釈したマウスラミニンI(1μg/ml;R&D System)およびフィブロネクチン(2μg/ml;Sigma−Aldrich)で、37℃で12時間さらに処理した。ラミニンおよびフィブロネクチンは、使用直前に除去した。
8.8日目の細胞を、Accutaseを用いて37℃で0.5〜1時間解離させた。細胞を洗浄した後、PO/ラミニン/フィブロネクチンでコーティングした皿上に、それぞれNB/B27+BCA中細胞150,000個/cm2(P1S5D群)または細胞300,000個/cm2(P8S10D群)でプレーティングした。
9.培地を3〜4日おきに変え、ニューロンのより良好な付着のために、1μg/mlのラミニンを毎週添加した。
10.次に細胞を、電気生理学的記録、免疫組織化学的検査、およびRNA抽出のために、様々なin vitro時点で査定した。
11.毎日の栄養補給の指示の概要については、図21を参照されたい。
hPSC株(WA−09)を、Essential 8(商標)培地(補充物E8を含む)中、ビトロネクチン(VTN−N;ThermoFisher Scientific)でコーティングした培養プレート内で維持した。細胞を毎日栄養補給し、EDTA溶液を用いて5日おきに継代した。神経誘導のために細胞を解離し、KSRベースの誘導について記載されるものと同じやり方で、E8に予めプレーティングした。細胞がコンフルエントになった翌日に、分化を開始させた。E6でのLSB+X誘導に使用した阻害剤には、10日間の処置についてはLDN193189(100nM)およびSB431542(10μM)が含まれ、3日間の処置についてはXAV939(2μM)が含まれていた。最初の10日間については、E6を使用し、10日目からはN2/B27に切り替えた。誘導を加速するために、細胞を、E6中前述の濃度のLSB+Xで、0日目から3日間処理した。次に3日目から、LDN193189(50nM)、SB431542(5μM)、XAV939(1μM)、PD0325901(0.4μM)、SU5402(2μM)およびDAPT(5μM)をE6に添加した。N2/B27培地を、増分1/3で5日目から1日おきにE6に添加した。N2/B27の阻害剤には、KSR/N2ベースの誘導のP1S5Dと同じ濃度のLSB+X+P/S/Dが含まれる。LSB+Xは、7日目に取り除かれるが、P/S/Dは残存する。9日目から、100%NB/B27+BCAを使用した。NB/B27で使用した阻害剤には、PD0325901(1μM)、SU5402(5μM)およびDAPT(10μM)が含まれる。E6での加速分化スキームの概要(分化0〜13日目)は、図3Kに提示されている。
深層および上層皮質ニューロンの発生のための長期間培養プロトコールは、図21に提示される詳細な毎日の栄養補給の指示と共に、図3Fに模式的に示されている。hPSCを、図2Aに記載される通り、0日目からP1S5DまたはP8S10Dによって誘導し、分化8日目に、Accutase媒介性解離によって37℃で0.5〜1時間継代した。細胞を、予めコーティングした培養皿上に、P1S5D群またはP8S10D群についてそれぞれ細胞150,000個/cm2または細胞300,000個/cm2で再びプレーティングした。皿を予めコーティングするために、PBSで希釈したポリオルニチン(PO;15μg/ml;Sigma−Aldrich)に37℃で24時間曝露し、PBSで3回洗浄した後、培養皿を、PBSで希釈したマウスラミニンI(1μg/ml;R&D System)およびフィブロネクチン(2μg/ml;Sigma−Aldrich)で、37℃で12時間さらに処理した。ラミニンおよびフィブロネクチンは、使用直前に除去した。継代および長期間培養の両方のために使用した培地は、前述の通りNB/B27+BCAであった。培地を3〜4日おきに変え、ニューロンの付着を維持するために、1μg/mlのラミニンを毎週添加した。次に細胞を、電気生理学的記録、免疫組織化学的検査、およびRNA抽出のために、様々なin vitro時点で査定した。図8に示される結果については、継代したP8S10D細胞を、マウス星状膠細胞と共に、または星状膠細胞条件培地の存在下で共培養した。それらの研究のための星状膠細胞の単離および維持は、既に記載されている通りに行った31。条件培地の収集のために、星状膠細胞にNB/B27+BCAを補給し、条件培地を2〜3日おきに収集した。次に、条件培地を、0.22μm膜孔真空フィルタ(Corning)を介して濾過して、細胞の汚染を取り除いた。
EdUを、それぞれ分化の様々な時点(8日目、13日目、18日目、23日目、28日目、33日目)で開始して、48時間窓で培養物に5μMで添加し、細胞を、40日目に4%パラホルムアルデヒドで20分間固定した。EdUを、製造業者の指定に従って、Click−iT EdU画像化キット(Invitrogen)を用いて検出した。EdU標識実験におけるEdU陽性および皮質層マーカー陽性ニューロンの定量、ならびに長期間培養におけるマーカー陽性ニューロンおよび全細胞の定量は、核定量のためのITCNプラグインを含むImageJを、手動計数と組み合わせて使用して行った。2つの独立な細胞培養バッチからの6つの一様無作為に選択された画像フレームを、20倍の対物レンズを使用して捕え、定量のために使用した。同時標識分析(EdU、皮質層マーカー)について適切に解析できなかったクラスターを含有するエリアは、回避した。pH3および切断型カスパーゼ3陽性細胞の定量も、ITCNプラグインを含むImageJを使用して行った。培養プレートごとに、4つの一様無作為に選択された画像フレームを、10倍の対物レンズを使用して捕え、2つの独立な細胞培養バッチから定量するために使用した。すべての定量の結果を、Prism(バージョン6.0、GraphPad)でプロットした。
細胞を、Trizol試薬(Life Technology)で溶解し、−20℃で保存した。全RNAを、フェノール/クロロホルムおよびイソプロパノール沈殿を使用して抽出し、ddH2Oに溶解させた。cDNAを、QuantiTech逆転写キット(Qiagen)を使用して生成した。定量的RT−PCRを、Mastercycler Realplex2(Eppendorf)を使用して実施し、GAPDHを標準化のためのハウスキーピング遺伝子対照として使用した。デルタデルタCtおよび倍率変化を算出し、結果をPrism(バージョン6.0、GraphPad)でプロットした。
細胞を、4%(v/v)パラホルムアルデヒドで20分間固定し、PBSで洗浄し、透過処理し、PBS中0.3%(v/v)Triton X−100と1%(w/v)BSAを使用して1時間ブロックした。免疫細胞化学のために、細胞を、同じブロッキング緩衝液で希釈した一次抗体と共に4℃で一晩インキュベートした。この研究で使用した一次抗体のリストは、表1に提供されている。数回洗浄した後、細胞を、ブロッキング緩衝液で希釈した適切なAlexaFluor二次抗体(1:500;Molecular Probes)およびDAPI(1:1000;Thermo Fisher)と共に室温で1時間インキュベートした。洗浄した後、細胞を、Olympus IX71顕微鏡によって、Hamamatsu ORCA CCDカメラを使用して画像を撮影した。in vivo研究の組織学的分析のために、固定した脳を、ビブラトーム(Leica VT1200S)を使用して厚さ60μmスライスの薄片にし、その後、0.02%NaN3を含むPBS中で1週間まで保存した。免疫細胞化学のために、スライスを透過処理し、PBS中0.3%Triton X−100と1%BSAを使用して2時間ブロックし、同じブロッキング緩衝液で希釈した一次抗体と共に4℃で3〜5日間インキュベートした。二次抗体染色を、細胞に対して同様に実施した。前述と同じ設定のOlympus IX81顕微鏡、またはZ−シリーズによる2μmでの共焦点レーザー走査顕微鏡(Olympus FV1000)のいずれかによって、画像を獲得した。共焦点画像を、浸水レンズ(10倍および40倍)で撮影し、FluoView(Olympus)およびPhotoshop(Adobe Systems)を使用して分析した。
脳を、最新のオンラインプロトコール(http://idisco.info、2015年1月バージョン)に記載されている修正を加えて、iDISCOプロトコールに記載されている通り処理した18。使用した一次抗体は、ニワトリ抗GFP(1:1000;Aves GFP−1020)、およびマウス抗hシナプトフィジン(1:1000;Enzo Life Science)であった。使用した二次抗体は、ロバ抗ニワトリ−Alexa647(1:1000;Jackson Immunoresearch)およびロバ抗マウス−Alexa568(1:1000;Life Technologies)であった。透明化試料を、sCMOSカメラ(Andor Neo)を備えたライトシート顕微鏡(Ultramicroscope II、LaVision Biotec)および作動距離6mmの浸漬キャップを備えた2倍/0.5対物レンズで画像化した。
細胞を、Accutaseを用いて37℃で30分間〜1時間解離させた。洗浄した後、細胞を、ヨウ化プロピジウム(2μg/ml)を含む1倍のPBSに再懸濁し、FACScaliburプラットフォーム(BD Biosciences)によって保存した。GFP+%を、ヨウ化プロピジウム陰性集団内で決定した。細胞内フローサイトメトリーのために、細胞を解離させ、洗浄し、4%(v/v)パラホルムアルデヒドで20分間固定した。次に、固定した細胞を透過処理し、製造業者の指示書に従って、1倍のBD Perm/洗浄緩衝液(BD Biosciences)を使用して染色した。使用したフローサイトメトリーのためのコンジュゲート一次抗体は、Nestin−Alexa647(1:50;BD Pharmingen、番号560341)およびTUJ1−Alexa488(1:50;BD Pharmingen、番号560338)であった。細胞を、FACScaliburを使用して分類した。結果を、FlowJo(バージョン7.6)を使用して分析した。
細胞を、分化8日目に再びプレーティングし、直径35mmのペトリ皿(Falcon)によりニューロン分化培地中で維持した。16日目、23日目、30日目、37日目および40日目に、電気生理学的処理を、プレインキュベーションと共にDMEM培地(Life Technology)中で37℃において2時間実施した後、記録した。EGFP+グラフト細胞のin vivo記録のために、EGFP+H9誘導細胞を移植したNOD−SCID IL2Rgc−/−マウスを、Avertinで麻酔し、断頭した。脳を除去し、350μmの冠状脳スライスを、Vibratome(Leica Microsystems)により、95%O2および5%CO2を発泡させた、120mMの塩化コリン、26mMのNaHCO3、2.6mMのKCl、1.25mMのNaH2PO4、7mMのMgSO4、0.5mMのCaCl2、1.3mMのアスコルビン酸および15mMのD−グルコースを含有する氷冷した塩化コリンベースの切断用溶液中で薄片を作った。スライスを、95%O2および5%CO2を発泡させた、126mMのNaCl、3mMのKCl、1.2mMのNaH2PO4、1.3mMのMgSO4、2.4mMのCaCl2、26mMのNaHCO3および10mMのD−グルコースを含有する人工脳脊髄液(ACSF)に移し、32℃のインターフェイスチャンバ内に回収して少なくとも1時間置き、次に室温で保持した後、ACSFを含有する34℃の記録用チャンバに移した。
すべての手順は、NIHガイドラインに従って実施され、地方のInstitutional Animal Care and Use Committee(IACUC)、Institutional Biosafety Committee(IBC)およびEmbryonic Stem Cell Research Committee(ESCRO)によって承認された。P1S5D細胞を、誘導8日目にAccutaseを用いて解離し、40μmの細胞ストレーナー(Falcon)で濾過した。細胞を1回洗浄し、氷冷したPBSに密度100,000個の細胞/μlで再懸濁し、次に33ゲージの鋭い針を有する10μlシリンジ(Hamilton)によって採取した。合計2μlの細胞を、定位装置およびシリンジを駆動するための電気ポンプ(Boston Scientific)を用いて、P2新生仔NOD−SCID IL2Rgc−/−マウス(Jackson Laboratory)の体性感覚皮質に1μl/1分の速度で注射した。グラフトの1ヶ月後、1.5ヶ月後、3ヶ月後、および6ヶ月後に、完全麻酔下のマウスに、ヘパリン(20単位/ml)を含有するPBSを経心的に灌流した後、4%パラホルムアルデヒド20mlを灌流した。次に、マウス脳を抽出し、4%パラホルムアルデヒドによって一晩後固定した。
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Claims (30)
- 多能性幹細胞を分化させるためのin vitro方法であって、複数の細胞が分化し、1種または複数の皮質ニューロン前駆体マーカーを発現するように、幹細胞集団を、有効濃度の形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン−ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤、ウィングレス(Wnt)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤、MAPK/ERKキナーゼシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、FGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、およびノッチシグナル伝達の1種または複数の阻害剤に曝露するステップを含む、方法。
- 前記幹細胞集団が、前記形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン−ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤への曝露の開始後、少なくとも6日目に、検出可能なレベルのPAX6を発現する、請求項1に記載の方法。
- 前記幹細胞集団が、前記形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン−ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤への曝露の開始後、6日目までに、検出可能なレベルのPAX6を発現する、請求項1に記載の方法。
- 前記幹細胞集団を前記形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン−ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤に曝露した後、少なくとも2日目または3日目に、前記MAPK/ERKキナーゼシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、前記FGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、および前記ノッチシグナル伝達の1種または複数の阻害剤を前記幹細胞集団に曝露する、請求項1に記載の方法。
- 前記幹細胞集団を前記形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン−ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤に曝露した後、2日目または3日目までに、前記MAPK/ERKキナーゼシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、前記FGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、および前記ノッチシグナル伝達の1種または複数の阻害剤を前記幹細胞集団に曝露する、請求項1に記載の方法。
- 前記複数の細胞が、前記形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン−ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤への曝露後、少なくとも13日目に、TUJ1、TBR1、TLE4、DCX、REELIN、CTIP2、SATB2、FOXP2、RGS4、CUX2、BLBP、およびそれらの組合せからなる群から選択される検出可能なレベルのマーカーを発現する、請求項1に記載の方法。
- 前記複数の細胞が、前記形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン−ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤への曝露後、13日目までに、TUJ1、TBR1、TLE4、DCX、REELIN、CTIP2、SATB2、FOXP2、RGS4、CUX2、BLBP、およびそれらの組合せからなる群から選択される検出可能なレベルのマーカーを発現する、請求項1に記載の方法。
- 検出可能なレベルのTUJ1を発現する前記複数の細胞の少なくとも50%が、検出可能なレベルのTBR1、TLE4、またはそれらの組合せも発現する、請求項6または7に記載の方法。
- 前記幹細胞集団が、前記形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン−ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤に曝露された後、少なくとも16日目に、分化した皮質ニューロンの電気生理学的活性を示す、請求項6または7に記載の方法。
- 前記形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン−ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、前記骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤、および前記ウィングレス(Wnt)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤を、前記幹細胞集団に少なくとも6日間曝露する、請求項1に記載の方法。
- 前記形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン−ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、前記骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤、および前記ウィングレス(Wnt)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤を、前記幹細胞集団に6日間まで曝露する、請求項1に記載の方法。
- 前記形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン−ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、前記骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤、および前記ウィングレス(Wnt)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤を、前記幹細胞集団に少なくとも7日間曝露する、請求項1に記載の方法。
- 前記形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン−ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、前記骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤、および前記ウィングレス(Wnt)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤を、前記幹細胞集団に7日間まで曝露する、請求項1に記載の方法。
- 前記TGFβ/アクチビン−ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤が、SB431542、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される化合物を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤が、LDN193189、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される化合物を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ウィングレス(Wnt)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤が、XAV939、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される化合物を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記MAPK/ERKキナーゼシグナル伝達の1種または複数の阻害剤が、PD0325901、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される化合物を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記FGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤が、SU5402、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される化合物を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ノッチシグナル伝達の1種または複数の阻害剤が、γ−セクレターゼ阻害剤を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記γ−セクレターゼ阻害剤が、DAPT、それらの誘導体、またはそれらの混合物を含む、請求項20に記載の方法。
- 前記幹細胞が、ヒト胚幹細胞、ヒト人工多能性幹細胞、ヒト単為生殖幹細胞、始原胚細胞様の多能性幹細胞、胚盤葉上層幹細胞、およびFクラス多能性幹細胞からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞を皮質ニューロンに成熟させるのに好都合な条件に、前記複数の細胞を晒すステップをさらに含み、前記複数の細胞を、BDNF、cAMP、およびアスコルビン酸シグナル伝達を活性化する1種または複数の化合物に曝露するステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 1種または複数の皮質ニューロンマーカーまたはそれらの前駆体を発現する、in vitro分化細胞集団であって、請求項1から22のいずれか一項に記載の方法に従って幹細胞集団から誘導される、in vitro分化細胞集団。
- 請求項23に記載のin vitro分化細胞集団を含む、組成物。
- 対象の神経変性障害を処置する方法であって、有効量の請求項23に記載のin vitro分化細胞集団を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法。
- 前記対象が、神経変性障害を有すると診断を受けたか、またはその危険性がある、請求項25に記載の方法。
- 前記神経変性障害が、パーキンソン病である、請求項26に記載の方法。
- 神経変性障害を処置するための医薬の製造における、請求項23に記載のin vitro分化細胞集団の使用。
- 幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、
(a)形質転換成長因子ベータ(TGFβ)/アクチビン−ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、
(b)BMPシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、
(c)ウィングレス(Wnt)シグナル伝達の1種または複数の阻害剤、
(e)FGFシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、
(e)ノッチシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、
(f)MAPK/ERKキナーゼシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、および
(g)請求項1から22のいずれか一項に記載の1種または複数の皮質ニューロンマーカーを発現する分化細胞集団への前記幹細胞の分化を誘導するための指示書
の1つまたは複数を含む、キット。 - in vitro分化細胞集団を含むキットであって、前記細胞集団が、請求項1から22のいずれか一項に記載の方法に従って分化する、キット。
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