JP2022090133A - 幹細胞由来シュワン細胞 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2016年11月14日に出願された米国出願番号第62/421,816号に基づく優先権を主張しており、そしてその内容は、本明細書中にその全体が参考として本明細書によって援用され、そしてその内容の各々に優先権が主張される。
本明細書に開示される主題は、幹細胞(例えば、ヒト幹細胞)から誘導されたシュワン細胞前駆体およびシュワン細胞、ならびに末梢神経系(PNS)および/もしくは中枢神経系(「CNS」)の再生、ミエリン損傷の予防および/もしくは修復、ならびに/または末梢神経障害(例えば、糖尿病性末梢神経障害)の予防および/もしくは処置における細胞に基づく処置のためのその使用に関する。
シュワン細胞(SC)は、末梢神経系(PNS)のグリアであり、PNS機能にとって重要である。これらは、神経堤(NC)からシュワン細胞前駆体(SCP)中間体を介して発生する。SCは、PNSの機能的調節、維持および修復において重要な役割を果たし、傷害後に神経修復を促進する優れた能力を示す(Jessenら、2015年;Lavdasら、2008年)。SC欠損は、広範なヒト障害、例えば、神経鞘腫症、シャルコー・マリー・トゥース病、ギラン・バレー症候群、および糖尿病性末梢神経障害(DPN)を含む種々の他の末梢神経障害に関与する。
、2007年)が罹患する末梢神経障害の主要原因である。これは、生活の質の低減ならびに罹患率および死亡率の増加を引き起こす主要な健康上の問題を提示する(La Fontaineら、2014年)。米国におけるDPNに関連する医療費は、2001年には1年間に46億~137億ドルと推定され、増加し続けている(Gordoisら、2003年)。DP
Nの症状は多様であるが、感覚機能不全および疼痛ならびに自律神経およびENSの合併症が含まれる。
ら生じるが、感覚ニューロンまたはグリアがDPNの病理発生において重要な役割を果たすかどうかは不明である。そのような機構を詳細に調べることは、疾患表現型に対する非細胞自立因子の複雑な寄与を考慮すれば、現在の動物モデルでは非常に難しい。
本明細書に開示される主題は、例えばin vitro分化によって幹細胞(例えば、ヒト幹細胞)から誘導したシュワン細胞前駆体およびシュワン細胞、ならびに前記細胞を作製および使用する方法に関する。
vitro方法を提供する。
vitro方法を提供する。ある特定の実施形態では、幹細胞の集団の分化を誘導するin vitro方法は、幹細胞集団をTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤、およびWntシグナル伝達の1種または複数の活性化因子と接触させるステップ、ならびに細胞を1種または複数のFGF活性化因子とさらに接触させるステップを含み、1種または複数のFGF活性化因子と細胞との最初の接触は、幹細胞集団とTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤との最初の接触から約20日以内である。
vitroの分化した細胞の集団も提供する。ある特定の実施形態では、分化した細胞の集団は、本明細書に記載されるin vitro分化方法によって、1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する分化した細胞の集団から誘導される。
幹細胞の集団を、TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤および1種または複数のWnt活性化因子と接触させるステップ、ならびに
前記細胞を1種または複数のFGF活性化因子と少なくとも約3日間にわたってさらに接触させるステップ
の後に幹細胞の集団から誘導される、in vitroの分化した細胞の集団を提供する。
(a)分化したシュワン細胞前駆体の先述の集団;
(b)分化したシュワン細胞前駆体の先述の集団を含む組成物;
(c)シュワン細胞の先述の集団;および
(d)シュワン細胞の先述の集団を含む組成物
のうちの1つを投与するステップを含む、方法を提供する。
TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤
1種または複数のWnt活性化因子、および
1種または複数のFGF活性化因子
を含む、キットを提供する。
(a)分化したシュワン細胞前駆体の先述の集団;
(b)分化したシュワン細胞前駆体の先述の集団を含む組成物;
(c)シュワン細胞の先述の集団;および
(d)シュワン細胞の先述の集団を含む組成物
のうちの1つを投与するステップを含む、方法を提供する。
(a)分化したシュワン細胞前駆体の先述の集団;
(b)分化したシュワン細胞前駆体の先述の集団を含む組成物;
(c)シュワン細胞の先述の集団;および
(d)シュワン細胞の先述の集団を含む組成物
のうちの1つを投与するステップを含む、方法を提供する。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される:
(項目1)
幹細胞の分化を誘導するin vitro方法であって、幹細胞の集団をTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と接触させるステップ、および前記細胞を1種または複数のWnt活性化因子と接触させるステップ、ならびに1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する分化した細胞の集団を産生するために、前記細胞を1種または複数のFGF活性化因子と少なくとも約3日間にわたってさらに接触させるステップを含む、in vitro方法。
(項目2)
前記細胞を前記1種または複数のFGF活性化因子と約14日間にわたって接触させるステップを含む、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記細胞と前記1種または複数のFGF活性化因子との最初の接触が、前記幹細胞とTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤との最初の接触から約20日以内である、項目1または2に記載の方法。
(項目4)
前記細胞と前記1種または複数のFGF活性化因子との最初の接触が、前記幹細胞とTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の前記1種または複数の1種または複数の阻害剤との最初の接触から約10日後と約15日後との間である、項目3に記載の方法。
(項目5)
前記細胞と前記1種または複数のFGF活性化因子との最初の接触が、前記幹細胞とTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の前記1種または複数の1種または複数の阻害剤との最初の接触から約11日後である、項目4に記載の方法。
(項目6)
前記細胞を1種または複数のSC分化誘導剤と接触させるステップをさらに含む、項目1から5のいずれか一項に記載の方法。
(項目7)
1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する分化した細胞の集団を産生するために、前記細胞を前記1種または複数のSC分化誘導剤と少なくとも約3日間にわたって接触させるステップを含む、項目6に記載の方法。
(項目8)
前記細胞を前記1種または複数のSC分化誘導剤と約14日間にわたって接触させるステップを含む、項目7に記載の方法。
(項目9)
前記細胞と前記1種または複数のSC分化誘導剤との最初の接触が、前記幹細胞とTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤との最初の接触から約10日後と約15日後との間である、項目6から8のいずれか一項に記載の方法。(項目10)
前記細胞を前記1種または複数のFGF活性化因子および前記1種または複数のSC分化誘導剤と同時に接触させるステップを含む、項目6から9のいずれか一項に記載の方法。
(項目11)
幹細胞の前記集団が、前記幹細胞とTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤との最初の接触から約25日後またはそれ以降に、前記1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する分化した細胞の集団へと分化する、項目1から10のいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
前記幹細胞を1種または複数のSMAD阻害剤と接触させるステップをさらに含む、項目1から11のいずれか一項に記載の方法。
(項目13)
前記幹細胞をTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤および前記1種または複数のSMAD阻害剤と同時に接触させるステップを含む、項目12に記載の方法。
(項目14)
前記細胞と前記1種または複数のWnt活性化因子との最初の接触が、前記幹細胞とTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤との最初の接触から約4日以内である、項目1から13のいずれか一項に記載の方法。
(項目15)
前記細胞とWntシグナル伝達の前記1種または複数の活性化因子との最初の接触が、前記幹細胞とTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤との最初の接触から約2日後である、項目14に記載の方法。
(項目16)
前記細胞とWntシグナル伝達の前記1種または複数の活性化因子との最初の接触が、前記幹細胞とTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤との最初の接触と同じ日である、項目14に記載の方法。
(項目17)
TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤が、SB431542、その誘導体、およびその混合物からなる群から選択される低分子である、項目1から16のいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤がSB431542である、項目17に記載の方法。
(項目19)
前記1種または複数のSMAD阻害剤が、LDN193189、その誘導体、およびその混合物からなる群から選択される低分子である、項目12から18のいずれか一項に記載の方法。
(項目20)
前記1種または複数のSMAD阻害剤がLDN193189である、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記1種または複数のWnt活性化因子が、Wntシグナル伝達の活性化に関してグリコーゲンシンターゼキナーゼ3β(GSK3β)を低下させる、項目1から20のいずれか一項に記載の方法。
(項目22)
前記1種または複数のWnt活性化因子が、CHIR99021、Wnt-1、WNT3A、Wnt4、Wnt5a、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される低分子である、項目21に記載の方法。
(項目23)
前記1種または複数のWnt活性化因子がCHIR99021である、項目22に記載の方法。
(項目24)
前記1種または複数のSC分化誘導剤が、ニューレグリン、LIF、CNTF、フォルスコリン、TGFβ、およびFBSからなる群から選択される、項目6から23のいずれか一項に記載の方法。
(項目25)
前記1種または複数のSC分化誘導剤がNRG1である、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記1種または複数のFGF活性化因子が、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF7、FGF8、FGF10、FGF18、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される、項目1から25のいずれか一項に記載の方法。
(項目27)
前記1種または複数のFGF活性化因子がFGF2である、項目26に記載の方法。
(項目28)
前記1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーが、SOX10、GAP43、BLBP、MPZ、Dhh、P75NTR、CD49D、TFAP2、CDH19、CD44、ERBB3、POU3F1、GFAP、CALCB、GRP116、TSPYL5、ITPKA、SLC17A6、SYPL2、LOC100128252、ANGPTL7、LOC728978、ZNF502、SLC16A6、LPL、SLC30A2、およびSLC10A4からなる群から選択される、項目1から27のいずれか一項に記載の方法。
(項目29)
前記幹細胞がヒト幹細胞である、項目1から28のいずれか一項に記載の方法。
(項目30)
前記ヒト幹細胞が、ヒト胚性幹細胞、ヒト誘導多能性幹細胞、ヒト単為生殖幹細胞、始原胚細胞様多能性幹細胞、エピブラスト幹細胞、Fクラス多能性幹細胞からなる群から選択される、項目29に記載の方法。
(項目31)
分化した細胞の前記集団を、前記分化した細胞のシュワン細胞の集団への成熟化を支持する条件に供するステップを含む、項目1から30のいずれか一項に記載の方法。
(項目32)
前記分化した細胞のシュワン細胞の前記集団への成熟化を支持する前記条件が、前記分化した細胞を1種または複数のFGF活性化因子および1種または複数のシュワン細胞分化誘導剤と接触させることを含む、項目31に記載の方法。
(項目33)
分化したSC前駆体細胞の集団を、前記1種または複数のFGF活性化因子および前記1種または複数のシュワン細胞分化誘導剤と少なくとも約3日間にわたって接触させるステップを含む、項目32に記載の方法。
(項目34)
分化したSC前駆体細胞の前記集団を、前記1種または複数のFGF活性化因子および前記1種または複数のシュワン細胞分化誘導剤と約10日間にわたって接触させるステップを含む、項目33に記載の方法。
(項目35)
分化したSC前駆体細胞の前記集団を、前記1種または複数のFGF活性化因子および前記1種または複数のシュワン細胞分化誘導剤と約35日間にわたって接触させるステップを含む、項目33に記載の方法。
(項目36)
分化したSC前駆体細胞の前記集団を、1種または複数のSC分化増強剤と接触させるステップをさらに含む、項目31から35のいずれか一項に記載の方法。
(項目37)
分化したSC前駆体細胞の前記集団を、前記1種または複数のSC分化増強剤と少なくとも約3日間にわたって接触させるステップを含む、項目36に記載の方法。
(項目38)
分化したSC前駆体細胞の前記集団を、前記1種または複数のSC分化増強剤と約10日間にわたって接触させるステップを含む、項目37に記載の方法。
(項目39)
分化したSC前駆体細胞の前記集団を、前記1種または複数のSC分化増強剤と約35日間にわたって接触させるステップを含む、項目37に記載の方法。
(項目40)
分化したSC前駆体細胞の前記集団を、前記1種または複数のFGF活性化因子、前記1種または複数のシュワン細胞分化誘導剤、および前記1種または複数のSC分化増強剤と同時に接触させるステップを含む、項目36から39のいずれか一項に記載の方法。
(項目41)
前記分化した細胞のシュワン細胞の前記集団への成熟化を支持する前記条件が、前記分化した細胞を1種または複数のSC分化増強剤とさらに接触させることを含む、項目31から40のいずれか一項に記載の方法。
(項目42)
前記1種または複数のSC分化増強剤が、環状アデノシン一リン酸(cAMP)、フォルスコリン、LIF、およびCNTFからなる群から選択される、項目36から41のいずれか一項に記載の方法。
(項目43)
前記1種または複数のSC分化増強剤がcAMPである、項目42に記載の方法。
(項目44)
分化した細胞の前記集団を3Dスフェロイドへと凝集させるステップ;ならびに前記3Dスフェロイドを、前記1種または複数のFGF活性化因子および前記1種または複数のシュワン細胞分化誘導剤と接触させステップを含む、項目1から44のいずれか一項に記載の方法。
(項目45)
前記3Dスフェロイドを接着培養で培養するステップをさらに含む、項目44に記載の方法。
(項目46)
シュワン細胞の前記集団が、1つまたは複数のシュワン細胞マーカーを発現する、項目31から45のいずれか一項に記載の方法。
(項目47)
前記1つまたは複数のシュワン細胞マーカーが、LRRTM4、CDH1、FABP7、BDNF、UNCB5、SOSTDC1、OLIG1、PLAT、KCNJ10、SHH、NTN1、GDNF、ERBB3、GAP43、SOX10、S100、GFAP、POU3F1、PMP22、MBP、AQP4、MPZ、NGFR、NFATC4、MOG、IFNG、MAL、NTF3、TGFB1、CD9、CD81、CD44、CD98、CD49E、CD49D、TYRP1、ENTHD1、NT5E、HTR2B、NOV、IL8、SLC16A6、CDKN2A、PLP2、S100A6、AQP9、およびCDH19からなる群から選択される1つまたは複数のシュワン細胞マーカーである、項目46に記載の方法。
(項目48)
1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現するin vitroの分化した細胞の集団であって、前記分化した細胞の集団が
幹細胞の集団を、TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤および1種または複数のWnt活性化因子と接触させるステップ、ならびに
幹細胞の前記集団を1種または複数のFGF活性化因子と少なくとも約3日間にわたってさらに接触させるステップ
の後に幹細胞の集団から誘導される、in vitroの分化した細胞の集団。
(項目49)
前記細胞を前記1種または複数のFGF活性化因子と約14日間にわたって接触させる、項目48に記載の分化した細胞の集団。
(項目50)
前記細胞と前記1種または複数のFGF活性化因子との最初の接触が、前記幹細胞とTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の前記1種または複数の1種または複数の阻害剤との最初の接触から約20日以内である、項目48または49に記載の分化した細胞の集団。
(項目51)
細胞と前記1種または複数のFGF活性化因子との最初の接触が、前記幹細胞とTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の前記1種または複数の1種または複数の阻害剤との最初の接触から約10日後と約15日後との間である、項目49に記載の分化した細胞の集団。
(項目52)
前記細胞と前記1種または複数のFGF活性化因子との最初の接触が、前記幹細胞とTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の前記1種または複数の1種または複数の阻害剤との最初の接触から約11日後である、項目49に記載の分化した細胞の集団。
(項目53)
前記細胞を、1種または複数のSC分化誘導剤とさらに接触させる、項目48から52のいずれか一項に記載の分化した細胞の集団。
(項目54)
前記細胞を、前記1種または複数のSC分化誘導剤と少なくとも約3日間にわたってさらに接触させる、項目53に記載の分化した細胞の集団。
(項目55)
前記細胞と前記1種または複数のSC分化誘導剤との最初の接触が、前記幹細胞とTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の前記1種または複数の1種または複数の阻害剤との最初の接触から約10日後と約15日後との間である、項目53または54に記載の分化した細胞の集団。
(項目56)
前記細胞を、前記1種または複数のWnt活性化因子、前記1種または複数のFGF活性化因子、および前記1種または複数のSC分化誘導剤と同時にさらに接触させる、項目53から55のいずれか一項に記載の分化した細胞の集団。
(項目57)
幹細胞の前記集団が、前記幹細胞とTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤との最初の接触から約25日後またはそれ以降に、前記1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する分化した細胞の集団へと分化する、項目48から56のいずれか一項に記載の分化した細胞の集団。
(項目58)
幹細胞の前記集団を、1種または複数のSMAD阻害剤とさらに接触させる、項目48から57のいずれか一項に記載の分化した細胞の集団。
(項目59)
幹細胞の前記集団を、TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤および前記1種または複数のSMAD阻害剤と同時に接触させる、項目58に記載の分化した細胞の集団。
(項目60)
前記細胞とシグナル伝達の前記1種または複数のWnt活性化因子との最初の接触が、前記幹細胞とTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤との最初の接触から約4日以内である、項目48から59のいずれか一項に記載の分化した細胞の集団。
(項目61)
細胞とシグナル伝達の前記1種または複数のWnt活性化因子との最初の接触が、前記幹細胞とTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤との最初の接触から約2日後である、項目60に記載の分化した細胞の集団。
(項目62)
細胞とシグナル伝達の前記1種または複数のWnt活性化因子との最初の接触が、前記幹細胞とTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤との最初の接触と同じ日である、項目60に記載の分化した細胞の集団。
(項目63)
TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤が、SB431542、その誘導体、およびその混合物からなる群から選択される低分子である、項目48から63のいずれか一項に記載の分化した細胞の集団。
(項目64)
TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤がSB431542である、項目63に記載の分化した細胞の集団。
(項目65)
前記1種または複数のSMAD阻害剤が、LDN193189、その誘導体、およびその混合物からなる群から選択される低分子である、項目58から64のいずれか一項に記載の分化した細胞の集団。
(項目66)
前記1種または複数のSMAD阻害剤がLDN193189である、項目65に記載の分化した細胞の集団。
(項目67)
前記1種または複数のWnt活性化因子が、Wntシグナル伝達の活性化に関してグリコーゲンシンターゼキナーゼ3β(GSK3β)を低下させる、項目48から66のいずれか一項に記載の分化した細胞の集団。
(項目68)
前記1種または複数のWnt活性化因子が、CHIR99021、Wnt-1、WNT3A、Wnt4、Wnt5a、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される低分子である、項目67に記載の分化した細胞の集団。
(項目69)
前記1種または複数のWnt活性化因子がCHIR99021である、項目68に記載の分化した細胞の集団。
(項目70)
前記1種または複数のSC分化誘導剤が、ニューレグリン、LIF、CNTF、フォルスコリン、TGFβ、およびFBSからなる群から選択される、項目53から69のいずれか一項に記載の分化した細胞の集団。
(項目71)
前記1種または複数のSC分化誘導剤がNRG1である、項目70に記載の分化した細胞の集団。
(項目72)
前記1種または複数のFGF活性化因子が、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF7、FGF8、FGF10、FGF18、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される、項目48から71のいずれか一項に記載の分化した細胞の集団。
(項目73)
前記1種のFGF活性化因子がFGF2である、項目72に記載の分化した細胞の集団。
(項目74)
前記1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーが、SOX10、GAP43、BLBP、MPZ、Dhh、P75NTR、CD49D、TFAP2、CDH19、CD44、ERBB3、POU3F1、GFAP、CALCB、GRP116、TSPYL5、ITPKA、SLC17A6、SYPL2、LOC100128252、ANGPTL7、LOC728978、ZNF502、SLC16A6、LPL、SLC30A2、およびSLC10A4からなる群から選択される、項目48から73のいずれか一項に記載の分化した細胞の集団。
(項目75)
前記幹細胞がヒト幹細胞である、項目48から74のいずれか一項に記載の分化した細胞の集団。
(項目76)
前記ヒト幹細胞が、ヒト多能性幹細胞である、項目75に記載の分化した細胞の集団。(項目77)
前記ヒト幹細胞が、ヒト胚性幹細胞、ヒト誘導多能性幹細胞、ヒト単為生殖幹細胞、始原胚細胞様多能性幹細胞、エピブラスト幹細胞およびFクラス多能性幹細胞からなる群から選択される、項目75に記載の分化した細胞の集団。
(項目78)
1つまたは複数のシュワン細胞マーカーを発現するin vitroの分化した細胞の集団であって、前記分化した細胞の集団が、1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する細胞の集団を、1種または複数のFGF活性化因子および1種または複数のシュワン細胞分化誘導剤と接触させた後に、1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する項目48から77のいずれか一項に記載の細胞の集団から誘導される、in
vitroの分化した細胞の集団。
(項目79)
前記分化した細胞の集団が、1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する項目48から77のいずれか一項に記載の細胞の集団を、1種または複数のSC分化増強剤とさらに接触させた後に、1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する細胞の前記集団から誘導される、項目78に記載の分化した細胞の集団。
(項目80)
前記1種または複数のSC分化増強剤が、環状アデノシン一リン酸(cAMP)、フォルスコリン、LIF、およびCNTFからなる群から選択される、項目78または79に記載の分化した細胞の集団。
(項目81)
前記1種または複数のSC分化増強剤がcAMPである、項目80に記載の分化した細胞の集団。
(項目82)
1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する項目48から77のいずれか一項に記載の細胞の前記集団を、前記1種または複数のFGF活性化因子および前記1種または複数のシュワン細胞分化誘導剤と少なくとも約3日間にわたって接触させる、項目78から81のいずれか一項に記載の分化した細胞の集団。
(項目83)
1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する項目48から77のいずれか一項に記載の細胞の前記集団を、前記1種または複数のFGF活性化因子および前記1種または複数のシュワン細胞分化誘導剤と約10日間にわたって接触させる、項目82に記載の分化した細胞の集団。
(項目84)
1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する項目48から77のいずれか一項に記載の細胞の前記集団を、前記1種または複数のFGF活性化因子および前記1種または複数のシュワン細胞分化誘導剤と約35日間にわたって接触させる、項目82に記載の分化した細胞の集団。
(項目85)
1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する項目48から77のいずれか一項に記載の細胞の前記集団を、前記1種または複数のSC分化増強剤と少なくとも約3日間にわたって接触させる、項目78から84のいずれか一項に記載の分化した細胞の集団。
(項目86)
1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する項目48から77のいずれか一項に記載の細胞の前記集団を、前記1種または複数のSC分化増強剤と約10日間にわたって接触させる、項目85に記載の分化した細胞の集団。
(項目87)
1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する項目48から77のいずれか一項に記載の細胞の前記集団を、前記1種または複数のSC分化増強剤と約35日間にわたって接触させる、項目85に記載の分化した細胞の集団。
(項目88)
前記1つまたは複数のシュワン細胞マーカーが、LRRTM4、CDH1、FABP7、BDNF、UNCB5、SOSTDC1、OLIG1、PLAT、KCNJ10、SHH、NTN1、GDNF、ERBB3、GAP43、SOX10、S100、GFAP、POU3F1、PMP22、MBP、AQP4、MPZ、NGFR、NFATC4、MOG、IFNG、MAL、NTF3、TGFB1、CD9、CD81、CD44、CD98、CD49E、CD49D、TYRP1、ENTHD1、NT5E、HTR2B、NOV、IL8、SLC16A6、CDKN2A、PLP2、S100A6、AQP9、およびCDH19からなる群から選択される1つまたは複数のシュワン細胞マーカーである、項目77から87のいずれか一項に記載の分化した細胞の集団。
(項目89)
項目48から77のいずれか一項に記載の分化したシュワン細胞前駆体の集団を含む組成物。
(項目90)
項目78から88のいずれか一項に記載のシュワン細胞の集団を含む組成物。
(項目91)
対象におけるシュワン細胞関連障害を予防および/または処置する方法であって、シュワン細胞関連障害に罹患している対象に有効量の以下:(a)項目48から77のいずれか一項に記載の分化したシュワン細胞前駆体の集団;(b)項目48から77のいずれか一項に記載の分化したシュワン細胞前駆体の集団を含む組成物;(c)項目78から88のいずれか一項に記載のシュワン細胞の集団;および(d)項目78から88のいずれか一項に記載のシュワン細胞の集団を含む組成物のうちの1つを投与するステップを含む、方法。
(項目92)
前記シュワン細胞関連障害が末梢神経障害である、項目91に記載の方法。
(項目93)
前記末梢神経障害が糖尿病性末梢神経障害である、項目91または92に記載の方法。(項目94)
対象におけるシュワン細胞関連障害を予防および/または処置するための項目48から77のいずれか一項に記載の分化したシュワン細胞前駆体の集団。
(項目95)
前記シュワン細胞関連障害が末梢神経障害である、項目94に記載の分化したシュワン細胞前駆体の集団。
(項目96)
前記末梢神経障害が糖尿病性末梢神経障害である、項目95に記載の分化したシュワン細胞前駆体の集団。
(項目97)
対象におけるシュワン細胞関連障害を予防および/または処置するための項目48から77のいずれか一項に記載の分化したシュワン細胞前駆体の集団を含む組成物。
(項目98)
前記シュワン細胞関連障害が末梢神経障害である、項目97に記載の組成物。
(項目99)
前記末梢神経障害が、糖尿病性末梢神経障害である、項目98に記載の組成物。
(項目100)
対象におけるシュワン細胞関連障害を予防および/または処置するための項目78から88のいずれか一項に記載のシュワン細胞の集団。
(項目101)
前記シュワン細胞関連障害が末梢神経障害である、項目100に記載のシュワン細胞の集団。
(項目102)
前記末梢神経障害が糖尿病性末梢神経障害である、項目101に記載のシュワン細胞の集団。
(項目103)
対象におけるシュワン細胞関連障害を予防および/または処置するための項目78から88のいずれか一項に記載のシュワン細胞の集団を含む組成物。
(項目104)
前記シュワン細胞関連障害が末梢神経障害である、項目103に記載の組成物。
(項目105)
前記末梢神経障害が、糖尿病性末梢神経障害である、項目104に記載の組成物。
(項目106)
シュワン細胞関連障害を予防および/または処置するための医薬の製造における項目48から77のいずれか一項に記載の分化したシュワン細胞前駆体の集団の使用。
(項目107)
前記シュワン細胞関連障害が末梢神経障害である、項目106に記載の使用。
(項目108)
前記末梢神経障害が糖尿病性末梢神経障害である、項目107に記載の使用。
(項目109)
シュワン細胞関連障害を予防および/または処置するための医薬の製造における項目48から77のいずれか一項に記載の分化したシュワン細胞前駆体の集団を含む組成物の使用。
(項目110)
前記シュワン細胞関連障害が末梢神経障害である、項目109に記載の使用。
(項目111)
前記末梢神経障害が糖尿病性末梢神経障害である、項目110に記載の使用。
(項目112)
シュワン細胞関連障害を予防および/または処置するための医薬の製造における項目78から88のいずれか一項に記載のシュワン細胞の集団の使用。
(項目113)
前記シュワン細胞関連障害が末梢神経障害である、項目112に記載の使用。
(項目114)
前記末梢神経障害が糖尿病性末梢神経障害である、項目113に記載の使用。
(項目115)
シュワン細胞関連障害を予防および/または処置するための医薬の製造における項目78から88のいずれか一項に記載のシュワン細胞の集団を含む組成物の使用。
(項目116)
前記シュワン細胞関連障害が末梢神経障害である、項目115に記載の使用。
(項目117)
前記末梢神経障害が糖尿病性末梢神経障害である、項目116に記載の使用。
(項目118)
幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、
TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤
1種または複数のWnt活性化因子、および
1種または複数のFGF活性化因子を含む、キット。
(項目119)
前記幹細胞の、1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する分化した細胞の集団への分化を誘導するための説明書を含み、前記説明書が、前記細胞を前記1種または複数のFGF活性化因子と少なくとも約3日間にわたって接触させるステップを含む、項目118に記載のキット。
(項目120)
前記説明書が、前記細胞を、前記1種または複数のFGF活性化因子と約14日間にわたって接触させるステップを含む、項目119に記載のキット。
(項目121)
前記説明書が、前記細胞と前記1種または複数のWnt活性化因子との最初の接触から約20日以内に、前記細胞を前記1種または複数の1種または複数のFGF活性化因子と最初に接触させるステップを含む、項目119から120のいずれか一項に記載のキット。
(項目122)
前記細胞と前記1種または複数の1種または複数のFGF活性化因子との最初の接触が、前記細胞と前記1種または複数のWnt活性化因子との最初の接触から約10日後と約15日後との間である、項目121に記載のキット。
(項目123)
前記細胞と、前記1種または複数のFGF活性化因子との最初の接触が、前記細胞と、前記1種または複数のWnt活性化因子との最初の接触から11日後である、項目1202に記載のキット。
(項目124)
1種または複数のSC分化誘導剤をさらに含む、項目118から123のいずれか一項に記載のキット。
(項目125)
前記説明書が、前記細胞を前記1種または複数のSC分化誘導剤と少なくとも約3日間にわたってさらに接触させるステップを含む、項目124に記載のキット。
(項目126)
前記説明書が、前記細胞を前記1種または複数のSC分化誘導剤と約14日間にわたってさらに接触させるステップを含む、項目125に記載のキット。
(項目127)
前記細胞と前記1種または複数の1種または複数のSC分化誘導剤との最初の接触が、前記細胞と前記1種または複数のWnt活性化因子との最初の接触から約10日後と約15日後との間である、項目124から126のいずれか一項に記載のキット。
(項目128)
前記説明書が、前記細胞を前記1種または複数のFGF活性化因子および前記1種または複数のSC分化誘導剤と同時に接触させるステップを含む、項目124から127のいずれか一項に記載のキット。
(項目129)
1種または複数のSMAD阻害剤をさらに含む、項目118から128のいずれか一項に記載のキット。
(項目130)
前記説明書が、前記幹細胞をTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤および前記1種または複数のSMAD阻害剤と接触させるステップをさらに含む、項目129に記載のキット。
(項目131)
前記説明書が、前記幹細胞をTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤および前記1種または複数のSMAD阻害剤と同時に接触させるステップを含む、項目130に記載のキット。
(項目132)
前記説明書が、前記幹細胞とTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤との最初の接触から約4日以内に、前記細胞を前記1種または複数のWnt活性化因子と最初に接触させるステップを含む、項目118から131のいずれか一項に記載のキット。
(項目133)
前記説明書が、前記幹細胞とTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤との最初の接触から約2日後に、前記細胞を前記1種または複数のWnt活性化因子と最初に接触させるステップを含む、項目132に記載のキット。
(項目134)
前記説明書が、前記細胞と前記1種または複数のWnt活性化因子との最初の接触と同じ日に、前記幹細胞をTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤と最初に接触させるステップを含む、項目132に記載のキット。
(項目135)
TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤が、SB431542、その誘導体、およびその混合物からなる群から選択される低分子である、項目118から134のいずれか一項に記載のキット。
(項目136)
TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤がSB431542である、項目135に記載のキット。
(項目137)
前記1種または複数のSMAD阻害剤が、LDN193189、その誘導体、およびその混合物からなる群から選択される低分子である、項目129から136のいずれか一項に記載のキット。
(項目138)
前記1種または複数のSMAD阻害剤がLDN193189である、項目137に記載のキット。
(項目139)
前記1種または複数のWnt活性化因子が、Wntシグナル伝達の活性化に関してグリコーゲンシンターゼキナーゼ3β(GSK3β)を低下させる、項目118から138のいずれか一項に記載のキット。
(項目140)
前記1種または複数のWnt活性化因子が、CHIR99021、Wnt-1、WNT3A、Wnt4、Wnt5a、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される低分子である、項目139に記載のキット。
(項目141)
前記1種または複数のWnt活性化因子がCHIR99021である、項目140に記載のキット。
(項目142)
前記1種または複数のSC分化誘導剤が、ニューレグリン、LIF、CNTF、フォルスコリン、TGFβ、およびFBSからなる群から選択される、項目124から141のいずれか一項に記載のキット。
(項目143)
前記1種または複数のSC分化誘導剤がNRG1である、項目142に記載のキット。(項目144)
前記1種または複数のFGF活性化因子が、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF7、FGF8、FGF10、FGF18、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される、項目118から143のいずれか一項に記載のキット。
(項目145)
前記1種のFGF活性化因子がFGF2である、項目144に記載のキット。
(項目146)
1種または複数のSC分化増強剤、および前記分化した細胞のシュワン細胞の集団への成熟化を誘導するための説明書をさらに含む、項目118から145のいずれか一項に記載のキット。
(項目147)
前記1種または複数のSC分化増強剤が、環状アデノシン一リン酸(cAMP)、フォルスコリン、LIF、およびCNTFからなる群から選択される、項目146に記載のキット。
(項目148)
前記1種または複数のSC分化増強剤がcAMPである、項目147に記載のキット。(項目149)
前記分化した細胞のシュワン細胞の集団への成熟化を誘導するための前記説明書が、前記分化した細胞を、前記1種または複数のFGF活性化因子および前記1種または複数のシュワン細胞分化誘導剤と接触させるステップを含む、項目146から148のいずれか一項に記載のキット。
(項目150)
前記分化した細胞のシュワン細胞の集団への成熟化を誘導するための前記説明書が、分化したSC前駆体細胞の前記集団を、前記1種または複数のFGF活性化因子および前記1種または複数のシュワン細胞分化誘導剤と少なくとも約3日間にわたって接触させるステップを含む、項目149に記載のキット。
(項目151)
前記分化した細胞のシュワン細胞の集団への成熟化を誘導するための前記説明書が、分化したSC前駆体細胞の前記集団を、前記1種または複数のFGF活性化因子および前記1種または複数のシュワン細胞分化誘導剤と約10日間にわたって接触させるステップを含む、項目149に記載のキット。
(項目152)
前記分化した細胞のシュワン細胞の集団への成熟化を誘導するための前記説明書が、分化したSC前駆体細胞の前記集団を、前記1種または複数のFGF活性化因子および前記1種または複数のシュワン細胞分化誘導剤と約35日間にわたって接触させるステップを含む、項目150に記載のキット。
(項目153)
前記分化した細胞のシュワン細胞の集団への成熟化を誘導するための前記説明書が、分化したSC前駆体細胞の前記集団を、前記1種または複数のSC分化増強剤と接触させるステップをさらに含む、項目146から151のいずれか一項に記載のキット。
(項目154)
前記分化した細胞のシュワン細胞の集団への成熟化を誘導するための前記説明書が、分化したSC前駆体細胞の前記集団を、前記1種または複数のSC分化増強剤と少なくとも約3日間にわたって接触させるステップをさらに含む、項目153に記載のキット。
(項目155)
前記分化した細胞のシュワン細胞の集団への成熟化を誘導するための前記説明書が、分化したSC前駆体細胞の前記集団を、前記1種または複数のSC分化増強剤と約14日間にわたって接触させるステップをさらに含む、項目154に記載のキット。
(項目156)
前記分化した細胞のシュワン細胞の集団への成熟化を誘導するための前記説明書が、分化したSC前駆体細胞の前記集団を、前記1種または複数のSC分化増強剤と約35日間にわたって接触させるステップをさらに含む、項目154に記載のキット。
(項目157)
前記分化した細胞のシュワン細胞の集団への成熟化を誘導するための前記説明書が、分化したSC前駆体細胞の前記集団を、前記1種または複数のFGF活性化因子、前記1種または複数のシュワン細胞分化誘導剤、および前記1種または複数のSC分化増強剤と同時に接触させるステップを含む、項目153から156のいずれか一項に記載のキット。(項目158)
幹細胞の分化を誘導するin vitro方法であって、幹細胞の集団を、TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と接触させるステップ、および前記細胞を1種または複数のWnt活性化因子と接触させるステップ、および幹細胞の前記集団を1種または複数のFGF活性化因子と少なくとも約3日間、約3日間と約20日間との間、約10日間と約20日間との間、または約10日間と約15日間との間、さらに接触させて、1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する分化した細胞の集団を産生するステップを含み、前記1種または複数のFGF活性化因子と前記細胞との最初の接触が、前記幹細胞とTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤との最初の接触から約10日以内である、in vitro方法。(項目159)
前記細胞と、前記1種または複数のWnt活性化因子との最初の接触が、前記幹細胞とTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤との最初の接触から約4日以内である、項目158に記載の方法。
(項目160)
1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する分化した細胞の集団を産生するために、前記細胞を、1種または複数のSC分化誘導剤と少なくとも約3日間、約3日間と約20日間との間、約10日間と約20日間との間、または約10日間と約15日間との間、さらに接触させる、ステップをさらに含み、前記1種または複数のSC分化誘導剤と前記細胞との最初の接触が、前記幹細胞とTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤との最初の接触から約10日以内である、項目158または159に記載の方法。
(項目161)
1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する分化した細胞の集団を産生するために、前記細胞を、1種または複数のSC分化誘導剤および1種または複数のFGF活性化因子と同時に少なくとも約3日間、約3日間と約20日間との間、約10日間と約20日間との間、または約10日間と約15日間との間、さらに接触させるステップをさらに含み、前記1種または複数のSC分化誘導剤および1種または複数のFGF活性化因子と前記細胞との最初の接触が、前記幹細胞と、TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤との最初の接触から約10日以内である、項目160に記載の方法。
(項目162)
1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現するin vitroの分化した細胞の集団であって、前記分化した細胞の集団が、幹細胞の集団をTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と接触させるステップ、前記細胞を1種または複数のWnt活性化因子と接触させるステップ、および前記細胞を1種または複数のFGF活性化因子と少なくとも約3日間、約3日間と約20日間との間、約10日間と約20日間との間、または約10日間と約15日間との間、さらに接触させるステップの後に幹細胞の集団から誘導され、前記1種または複数のSC分化誘導剤および前記1種または複数のFGF活性化因子と前記細胞との最初の接触が、前記幹細胞とTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤との最初の接触から約20日以内である、in vitroの分化した細胞の集団。
(項目163)
前記細胞と前記1種または複数のWnt活性化因子との最初の接触が、前記幹細胞とTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤との最初の接触から約4日以内である、項目162に記載の分化した細胞の集団。
(項目164)
前記細胞を、1種または複数のSC分化誘導剤と少なくとも約3日間、約3日間と約20日間との間、約10日間と約20日間との間、または約10日間と約15日間との間、さらに接触させるステップをさらに含み、前記1種または複数のSC分化誘導剤と前記細胞との最初の接触が、前記幹細胞とTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤との最初の接触から約10日以内である、項目162または163に記載の分化した細胞の集団。
(項目165)
前記細胞を、1種または複数のSC分化誘導剤および1種または複数のFGF活性化因子と同時に少なくとも約3日間、約3日間と約20日間との間、約10日間と約20日間との間、または約10日間と約15日間との間、さらに接触させるステップをさらに含み、前記1種または複数のSC分化誘導剤および1種または複数のFGF活性化因子と前記細胞との最初の接触が、前記幹細胞とTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤との最初の接触から約10日以内である、項目164に記載の方法。
(項目166)
1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する細胞の集団を産生するために、神経堤系列細胞の分化を誘導するin vitro方法であって、1つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞の集団を、1種または複数のWnt活性化因子および1種または複数のFGF活性化因子と接触させるステップを含む、in vitro方法。(項目167)
1つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞の前記集団を、前記1種または複数のWnt活性化因子および1種または複数のFGF活性化因子と少なくとも約3日間接触させるステップを含む、項目166に記載の方法。
(項目168)
1つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞の前記集団を、前記1種または複数のWnt活性化因子および1種または複数のFGF活性化因子と最長約30日間にわたって接触させるステップを含む、項目166または167に記載の方法。
(項目169)
1つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞の前記集団を、前記1種または複数のWnt活性化因子および1種または複数のFGF活性化因子と約5日間と約15日間との間、接触させるステップを含む、項目166から168のいずれか一項に記載の方法。
(項目170)
1つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞の前記集団を、前記1種または複数のWnt活性化因子および1種または複数のFGF活性化因子と約14日間にわたって接触させるステップを含む、項目169に記載の方法。
(項目171)
1つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞の前記集団を、1種または複数のSC分化誘導剤と接触させるステップをさらに含む、項目166から170のいずれか一項に記載の方法。
(項目172)
1つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞の前記集団を、前記1種または複数のSC分化誘導剤と少なくとも約3日間にわたって接触させるステップをさらに含む、項目171に記載の方法。
(項目173)
1つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞の前記集団を、前記1種または複数のSC分化誘導剤と最長約30日間にわたって接触させるステップをさらに含む、項目171または172に記載の方法。
(項目174)
1つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞の前記集団を、前記1種または複数のSC分化誘導剤と約14日間にわたって接触させるステップをさらに含む、項目171から173のいずれか一項に記載の方法。
(項目175)
1つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞の前記集団を、前記1種または複数のFGF活性化因子および1種または複数のSC分化誘導剤と同時に接触させるステップをさらに含む、項目171から174のいずれか一項に記載の方法。
(項目176)
前記1種または複数のWnt活性化因子が、Wntシグナル伝達の活性化に関してグリコーゲンシンターゼキナーゼ3β(GSK3β)を低下させる、項目166から175のいずれか一項に記載の方法。
(項目177)
前記1種または複数のWnt活性化因子が、CHIR99021、Wnt-1、WNT3A、Wnt4、Wnt5a、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される低分子である、項目176に記載の方法。
(項目178)
前記1種または複数のWnt活性化因子がCHIR99021である、項目177に記載の方法。
(項目179)
前記1種または複数のSC分化誘導剤が、ニューレグリン、LIF、CNTF、フォルスコリン、TGFβ、およびFBSからなる群から選択される、項目171から178のいずれか一項に記載の方法。
(項目180)
前記1種または複数のSC分化誘導剤がNRG1である、項目179に記載の方法。
(項目181)
前記1種または複数のFGF活性化因子が、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF7、FGF8、FGF10、FGF18、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される、項目166から180のいずれか一項に記載の方法。
(項目182)
前記1種または複数のFGF活性化因子がFGF2である、項目181に記載の方法。
(項目183)
前記1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーが、SOX10、GAP43、BLBP、MPZ、Dhh、P75NTR、CD49D、TFAP2、CDH19、CD44、ERBB3、POU3F1、GFAP、CALCB、GRP116、TSPYL5、ITPKA、SLC17A6、SYPL2、LOC100128252、ANGPTL7、LOC728978、ZNF502、SLC16A6、LPL、SLC30A2、およびSLC10A4からなる群から選択される、項目166から182のいずれか一項に記載の方法。
(項目184)
1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する細胞の前記集団を、前記細胞のシュワン細胞の集団への成熟化を支持する条件に供するステップを含む、項目166から183のいずれか一項に記載の方法。
(項目185)
前記条件が、1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する細胞の前記集団を、1種または複数のFGF活性化因子および1種または複数のシュワン細胞分化誘導剤と接触させることを含む、項目184に記載の方法。
(項目186)
1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する細胞の前記集団を、前記1種または複数のFGF活性化因子および前記1種または複数のシュワン細胞分化誘導剤と少なくとも約3日間にわたって接触させるステップを含む、項目185に記載の方法。
(項目187)
1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する細胞の前記集団を、前記1種または複数のFGF活性化因子および前記1種または複数のシュワン細胞分化誘導剤と約10日間にわたって接触させるステップを含む、項目186に記載の方法。
(項目188)
1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する細胞の前記集団を、前記1種または複数のFGF活性化因子および前記1種または複数のシュワン細胞分化誘導剤と約35日間にわたって接触させるステップを含む、項目186に記載の方法。
(項目189)
前記条件が、1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する細胞の前記集団を、1種または複数のSC分化増強剤と接触させることをさらに含む、項目184から188のいずれか一項に記載の方法。
(項目190)
1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する細胞の前記集団を、前記1種または複数のSC分化増強剤と少なくとも約3日間にわたってさらに接触させるステップを含む、項目189に記載の方法。
(項目191)
1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する細胞の前記集団を、前記1種または複数のSC分化増強剤と少なくとも約10日間にわたってさらに接触させるステップを含む、項目190に記載の方法。
(項目192)
1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する細胞の前記集団を、前記1種または複数のSC分化増強剤と少なくとも約35日間にわたってさらに接触させるステップを含む、項目191に記載の方法。
(項目193)
1つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞の前記集団を、前記1種または複数のFGF活性化因子および前記1種または複数のSC分化増強剤と同時に接触させるステップを含む、項目189から192のいずれか一項に記載の方法。
(項目194)
前記1種または複数のSC分化増強剤が、環状アデノシン一リン酸(cAMP)、フォルスコリン、LIF、およびCNTFからなる群から選択される、項目189から193のいずれか一項に記載の方法。
(項目195)
前記1種または複数のSC分化増強剤がcAMPである、項目194に記載の方法。
(項目196)
シュワン細胞の前記集団が、1つまたは複数のシュワン細胞マーカーを発現する、項目184から195のいずれか一項に記載の方法。
(項目197)
前記1つまたは複数のシュワン細胞マーカーが、LRRTM4、CDH1、FABP7、BDNF、UNCB5、SOSTDC1、OLIG1、PLAT、KCNJ10、SHH、NTN1、GDNF、ERBB3、GAP43、SOX10、S100、GFAP、POU3F1、PMP22、MBP、AQP4、MPZ、NGFR、NFATC4、MOG、IFNG、MAL、NTF3、TGFB1、CD9、CD81、CD44、CD98、CD49E、CD49D、TYRP1、ENTHD1、NT5E、HTR2B、NOV、IL8、SLC16A6、CDKN2A、PLP2、S100A6、AQP9、およびCDH19からなる群から選択されるシュワン細胞マーカーからなる群から選択される、項目196に記載の方法。
(項目198)
前記神経堤系列マーカーが、SOX10、p75、HNK1、CD49D、ERBB3、TFAP2、SNAIL、およびSLUGからなる群から選択される、項目166から197のいずれか一項に記載の方法。
(項目199)
1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現するin vitroの分化した細胞の集団であって、前記分化した細胞の集団が、1つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞の集団を、1種または複数のWnt活性化因子、1種または複数のFGF活性化因子と少なくとも約3日間、最長約30日間、または約5日間と約15日間との間、接触させた後に神経堤系列細胞の集団から誘導される、in vitroの分化した細胞の集団。
(項目200)
1つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞の前記集団を、前記1種または複数のWnt活性化因子および1種または複数のFGF活性化因子と14日間にわたって接触させる、項目199に記載の分化した細胞の集団。
(項目201)
1つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞の前記集団を、1種または複数のSC分化誘導剤とさらに接触させる、項目199または200に記載の分化した細胞の集団。
(項目202)
1つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞の前記集団を、1種または複数のSC分化誘導剤と少なくとも約3日間、最長約30日間、または約5日間と約15日間との間、さらに接触させる、項目201に記載の分化した細胞の集団。
(項目203)
1つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞の前記集団を、1種または複数のSC分化誘導剤と約14日間にわたってさらに接触させる、項目202に記載の分化した細胞の集団。
(項目204)
1つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞の前記集団を、1種または複数のWnt活性化因子、1種または複数のFGF活性化因子、および1種または複数のSC分化誘導剤と同時に接触させる、項目199から203のいずれか一項に記載の分化した細胞の集団。
(項目205)
前記1種または複数のWnt活性化因子がWntシグナル伝達を活性化するためにグリコーゲンシンターゼキナーゼ3β(GSK3β)を低下させる、項目199から204のいずれか一項に記載の分化した細胞の集団。
(項目206)
前記1種または複数のWnt活性化因子が、CHIR99021、Wnt-1、WNT3A、Wnt4、Wnt5a、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される低分子である、項目205に記載の分化した細胞の集団。
(項目207)
前記1種または複数のWnt活性化因子がCHIR99021である、項目206に記載の分化した細胞の集団。
(項目208)
前記1種または複数のSC分化誘導剤が、ニューレグリン、LIF、CNTF、フォルスコリン、TGFβ、およびFBSからなる群から選択される、項目201から207のいずれか一項に記載の分化した細胞の集団。
(項目209)
前記1種または複数のSC分化誘導剤がNRG1である、項目208に記載の分化した細胞の集団。
(項目210)
前記1種または複数のFGF活性化因子が、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF7、FGF8、FGF10、FGF18、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される、項目199から209のいずれか一項に記載の分化した細胞の集団。
(項目211)
前記1種のFGF活性化因子がFGF2である、項目210に記載の分化した細胞の集団。
(項目212)
前記1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーが、SOX10、GAP43、BLBP、MPZ、Dhh、P75NTR、CD49D、TFAP2、CDH19、CD44、ERBB3、POU3F1、GFAP、CALCB、GRP116、TSPYL5、ITPKA、SLC17A6、SYPL2、LOC100128252、ANGPTL7、LOC728978、ZNF502、SLC16A6、LPL、SLC30A2、およびSLC10A4からなる群から選択される、項目199から211のいずれか一項に記載の分化した細胞の集団。
(項目213)
前記神経堤系列マーカーが、SOX10、p75、HNK1、CD49D、ERBB3、TFAP2、SNAIL、およびSLUGからなる群から選択される、項目199から212のいずれか一項に記載の分化した細胞の集団。
(項目214)
幹細胞の分化を誘導するin vitro方法であって、幹細胞の集団を1つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞の集団にin vitroで分化させるステップ、および1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する細胞の集団を産生するために、分化した細胞を、1種または複数のWnt活性化因子および1種または複数のFGF活性化因子と接触させるステップを含む、in vitro方法。
(項目215)
1つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞の前記集団を、前記1種または複数のWnt活性化因子、1種または複数のFGF活性化因子と少なくとも約3日間にわたって接触させるステップを含む、項目214に記載の方法。
(項目216)
1つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞の前記集団を、前記1種または複数のWnt活性化因子、1種または複数のFGF活性化因子と最長約30日間にわたって接触させるステップを含む、項目215に記載の方法。
(項目217)
前記分化した細胞を、前記1種または複数のWnt活性化因子、1種または複数のFGF活性化因子と約5日と約15日間との間、または約10日間と15日間との間、接触させるステップを含む、項目216に記載の方法。
(項目218)
1つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞の前記集団を、前記1種または複数のWnt活性化因子および1種または複数のFGF活性化因子と約14日間にわたって接触させるステップを含む、項目217に記載の方法。
(項目219)
1つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞の前記集団を、1種または複数のSC分化誘導剤と接触させるステップをさらに含む、項目214から218のいずれか一項に記載の方法。
(項目220)
1つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞の前記集団を、1種または複数のSC分化誘導剤と少なくとも約3日間にわたって接触させるステップをさらに含む、項目219に記載の方法。
(項目221)
1つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞の前記集団を、1種または複数のSC分化誘導剤と最長約30日間にわたって接触させるステップをさらに含む、項目220に記載の方法。
(項目222)
1つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞の前記集団を、1種または複数のSC分化誘導剤と約14日間にわたって接触させるステップをさらに含む、項目221に記載の方法。
(項目223)
1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する細胞の集団を産生するために、1つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞の前記集団を、1種または複数のWnt活性化因子、1種または複数のFGF活性化因子、および1種または複数のSC分化誘導剤と同時に接触させるステップを含む、項目214から222のいずれか一項に記載の方法。
(項目224)
前記1種または複数のWnt活性化因子が、Wntシグナル伝達を活性化するためにグリコーゲンシンターゼキナーゼ3β(GSK3β)を低下させる、項目214から223のいずれか一項に記載の方法。
(項目225)
前記1種または複数のWnt活性化因子が、CHIR99021、Wnt-1、WNT3A、Wnt4、Wnt5a、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される低分子である、項目224に記載の方法。
(項目226)
前記1種または複数のWnt活性化因子がCHIR99021である、項目225に記載の方法。
(項目227)
前記1種または複数のSC分化誘導剤が、ニューレグリン、LIF、CNTF、フォルスコリン、TGFβ、およびFBSからなる群から選択される、項目219から226のいずれか一項に記載の方法。
(項目228)
前記1種または複数のSC分化誘導剤がNRG1である、項目227に記載の方法。
(項目229)
前記1種または複数のFGF活性化因子が、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF7、FGF8、FGF10、FGF18、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される、項目214から228のいずれか一項に記載の方法。
(項目230)
前記1種または複数のFGF活性化因子がFGF2である、229に記載の方法。
(項目231)
前記1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーが、SOX10、GAP43、BLBP、MPZ、Dhh、P75NTR、CD49D、TFAP2、CDH19、CD44、ERBB3、POU3F1、GFAP、CALCB、GRP116、TSPYL5、ITPKA、SLC17A6、SYPL2、LOC100128252、ANGPTL7、LOC728978、ZNF502、SLC16A6、LPL、SLC30A2、およびSLC10A4からなる群から選択される、項目214から230のいずれか一項に記載の方法。
(項目232)
1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する細胞の前記集団を、前記細胞のシュワン細胞の集団への成熟化を支持する条件に供するステップを含む、項目214から231のいずれか一項に記載の方法。
(項目233)
前記条件が、1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する細胞の前記集団を、1種または複数のFGF活性化因子および1種または複数のシュワン細胞分化誘導剤と接触させることを含む、項目232に記載の方法。
(項目234)
1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する細胞の前記集団を、前記1種または複数のFGF活性化因子および前記1種または複数のシュワン細胞分化誘導剤と少なくとも約3日間にわたって接触させるステップを含む、項目233に記載の方法。
(項目235)
1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する細胞の前記集団を、前記1種または複数のFGF活性化因子および前記1種または複数のシュワン細胞分化誘導剤と約10日間にわたって接触させるステップを含む、項目234に記載の方法。
(項目236)
1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する細胞の前記集団を、前記1種または複数のFGF活性化因子および前記1種または複数のシュワン細胞分化誘導剤と約35日間にわたって接触させるステップを含む、項目234に記載の方法。
(項目237)
前記条件が、1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する細胞の前記集団を、1種または複数のSC分化増強剤とさらに接触させることを含む、項目232から236のいずれか一項に記載の方法。
(項目238)
前記条件が、1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する細胞の前記集団を、1種または複数のSC分化増強剤と少なくとも約3日間にわたってさらに接触させることを含む、項目237に記載の方法。
(項目239)
前記条件が、1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する細胞の前記集団を1種または複数のSC分化増強剤と約10日間にわたってさらに接触させることを含む、項目238に記載の方法。
(項目240)
前記条件が、1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する細胞の前記集団を1種または複数のSC分化増強剤と約35日間にわたってさらに接触させることを含む、項目238に記載の方法。
(項目241)
前記条件が、1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する細胞の前記集団を、前記1種または複数のFGF活性化因子、前記1種または複数のシュワン細胞分化誘導剤、および前記1種または複数のSC分化増強剤と同時に接触させることを含む、項目237から240のいずれか一項に記載の方法。
(項目242)
前記1種または複数のSC分化増強剤が、環状アデノシン一リン酸(cAMP)、フォルスコリン、LIF、およびCNTFからなる群から選択される、項目237から241のいずれか一項に記載の方法。
(項目243)
前記1種または複数のSC分化増強剤がcAMPである、項目242に記載の方法。
(項目244)
シュワン細胞の前記集団が1つまたは複数のシュワン細胞マーカーを発現する、項目232から243のいずれか一項に記載の方法。
(項目245)
前記1つまたは複数のシュワン細胞マーカーが、LRRTM4、CDH1、FABP7、BDNF、UNCB5、SOSTDC1、OLIG1、PLAT、KCNJ10、SHH、NTN1、GDNF、NGFR、NFATC4、MOG、IFNG、MAL、NTF3、TGFB1、SOX10、S100、GFAP、POU3F1、PMP22、MBP、AQP4、MPZ、GFAP、ERBB3、CD9、CD81、CD44、CD98、CD49E、CD49D、TYRP1、ENTHD1、NT5E、HTR2B、NOV、IL8、SLC16A6、CDKN2A、PLP2、S100A6、AQP9、およびCDH19からなる群から選択される、項目244に記載の方法。
(項目246)
前記幹細胞集団の、1つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞の集団へのin vitro分化が、SMADシグナル伝達を阻害するステップおよびWntシグナル伝達を活性化するステップを含む、項目213から245のいずれか一項に記載の方法。(項目247)
前記幹細胞集団の、1つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞の集団へのin vitro分化が、前記幹細胞をTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と接触させるステップ、および前記細胞を1種または複数のWnt活性化因子と接触させるステップを含む、項目214から246のいずれか一項に記載の方法。
(項目248)
幹細胞の前記集団を1種または複数のSMAD阻害剤と接触させるステップをさらに含む、項目247に記載の方法。
(項目249)
前記幹細胞を、TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤および前記1種または複数のSMAD阻害剤と同時に接触させるステップを含む、項目248に記載の方法。
(項目250)
前記細胞と前記1種または複数のWnt活性化因子との最初の接触が、幹細胞の前記集団とTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤との最初の接触から約4日以内である、項目247から249のいずれか一項に記載の方法。
(項目251)
前記細胞とWntシグナル伝達の前記1種または複数の活性化因子との最初の接触が、幹細胞とTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤との最初の接触から約2日後である、項目250に記載の方法。
(項目252)
TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤が、SB431542、その誘導体、およびその混合物からなる群から選択される低分子である、項目247から251のいずれか一項に記載の方法。
(項目253)
TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の前記1種または複数の阻害剤がSB431542である、項目252に記載の方法。
(項目254)
前記1種または複数のSMAD阻害剤が、LDN193189、その誘導体、およびその混合物からなる群から選択される低分子である、項目248から253のいずれか一項に記載の方法。
(項目255)
前記1種または複数のSMAD阻害剤がLDN193189である、項目254に記載の方法。
(項目256)
前記神経堤系列マーカーが、SOX10、p75、HNK1、CD49D、ERBB3、TFAP2、SNAIL、およびSLUGからなる群から選択される、項目214から255のいずれか一項に記載の方法。
(項目257)
対象におけるPNSおよび/またはCNSを再生する方法であって、対象に有効量の以下:
(a)項目48から77および197から211のいずれか一項に記載の分化したシュワン細胞前駆体の集団;
(b)項目48から77および199から213のいずれか一項に記載の分化したシュワン細胞前駆体の集団を含む組成物;
(c)項目78から88のいずれか一項に記載のシュワン細胞の集団;および
(d)項目78から88のいずれか一項に記載のシュワン細胞の集団を含む組成物
のうちの1つを投与するステップを含む、方法。
(項目258)
対象におけるPNSおよび/またはCNSを再生するための、項目48から77および199から213のいずれか一項に記載の分化したシュワン細胞前駆体の集団。
(項目259)
対象におけるPNSおよび/またはCNSを再生するための、項目48から77および199から213のいずれか一項に記載の分化したシュワン細胞前駆体の集団を含む組成物。
(項目260)
対象におけるPNSおよび/またはCNSを再生するための、項目78から88のいずれか一項に記載のシュワン細胞の集団。
(項目261)
対象におけるPNSおよび/またはCNSを再生するための、項目78から88のいずれか一項に記載のシュワン細胞の集団を含む組成物。
(項目262)
PNSおよび/またはCNSを再生するための医薬の製造における、項目48から77および199から213のいずれか一項に記載の分化したシュワン細胞前駆体の集団の使用。
(項目263)
PNSおよび/またはCNSを再生するための医薬の製造における、項目48から77および199から213のいずれか一項に記載の分化したシュワン細胞前駆体の集団を含む組成物の使用。
(項目264)
PNSおよび/またはCNSを再生するための医薬の製造における、項目78から88のいずれか一項に記載のシュワン細胞の集団の使用。
(項目265)
PNSおよび/またはCNSを再生するための医薬の製造における、項目78から88のいずれか一項に記載のシュワン細胞の集団を含む組成物の使用。
(項目266)
対象におけるミエリン損傷を予防および/または処置する方法であって、対象に有効量の以下:
(a)項目48から77および199から213のいずれか一項に記載の分化したシュワン細胞前駆体の集団;
(b)項目48から77および199から213のいずれか一項に記載の分化したシュワン細胞前駆体の集団を含む組成物;
(c)項目78から88のいずれか一項に記載のシュワン細胞の集団;および
(d)項目78から88のいずれか一項に記載のシュワン細胞の集団を含む組成物
のうちの1つを投与するステップを含む、方法。
(項目267)
対象におけるミエリン損傷を予防および/または処置するための、項目48から77および199から213のいずれか一項に記載の分化したシュワン細胞前駆体の集団。
(項目268)
対象におけるミエリン損傷を予防および/または処置するための、項目48から77および199から213のいずれか一項に記載の分化したシュワン細胞前駆体の集団を含む組成物。
(項目269)
対象におけるミエリン損傷を予防および/または処置するための、項目78から88のいずれか一項に記載のシュワン細胞の集団。
(項目270)
対象におけるミエリン損傷を予防および/または処置するための、項目78から88のいずれか一項に記載のシュワン細胞の集団を含む組成物。
(項目271)
ミエリン損傷を予防および/または処置するための医薬の製造における、項目48から77および199から213のいずれか一項に記載の分化したシュワン細胞前駆体の集団の使用。
(項目272)
ミエリン損傷を予防および/または処置するための医薬の製造における、項目48から77および199から213のいずれか一項に記載の分化したシュワン細胞前駆体の集団を含む組成物の使用。
(項目273)
ミエリン損傷を予防および/または処置するための医薬の製造における、項目78から88のいずれか一項に記載のシュワン細胞の集団の使用。
(項目274)
ミエリン損傷を予防および/または処置するための医薬の製造における、項目78から88のいずれか一項に記載のシュワン細胞の集団を含む組成物の使用。
(項目275)
in vitroの分化した細胞の集団を含む組成物であって、細胞の前記集団の少なくとも約50%が1つまたは複数のSC前駆体マーカーを発現し、細胞の前記集団の約25%未満が、幹細胞マーカー、CNSマーカー、神経細胞マーカー、および間葉前駆体マーカーからなる群から選択される1つまたは複数のマーカーを発現する、組成物。
(項目276)
前記1つまたは複数のSC前駆体マーカーが、SOX10、GAP43、BLBP、MPZ、Dhh、P75NTR、CD49D、TFAP2、CDH19、CD44、ERBB3、POU3F1、GFAP、CALCB、GRP116、TSPYL5、ITPKA、SLC17A6、SYPL2、LOC100128252、ANGPTL7、LOC728978、ZNF502、SLC16A6、LPL、SLC30A2、およびSLC10A4からなる群から選択される、項目275に記載の組成物。
(項目277)
前記幹細胞マーカーが、OCT4、NANOG、SSEA4、およびSSEA3からなる群から選択される、項目275または276に記載の組成物。
(項目278)
前記CNSマーカーが、PAX6、NESTIN、およびSOX1からなる群から選択される、項目275から277のいずれか一項に記載の組成物。
(項目279)
前記神経細胞マーカーが、TUJ1、MAP2、NFH、BRN3A、ISL1、TH、ASCL1、CHAT、PHOX2B、PHOX2A、TRKA、TRKB、およびTRKCからなる群から選択される、項目275から278のいずれか一項に記載の組成物。
(項目280)
前記間葉前駆体マーカーが、SMAおよびCD73からなる群から選択される、項目275から279のいずれか一項に記載の組成物。
(項目281)
in vitroの分化した細胞の集団を含む組成物であって、細胞の前記集団の少なくとも約50%が1つまたは複数のSCマーカーを発現し、細胞の約25%未満が、SC前駆体マーカー、幹細胞マーカー、CNSマーカー、神経細胞マーカー、および間葉前駆体マーカーからなる群から選択される1つまたは複数のマーカーを発現する、組成物。
(項目282)
前記1つまたは複数のSCマーカーが、LRRTM4、CDH1、FABP7、BDNF、UNCB5、SOSTDC1、OLIG1、PLAT、KCNJ10、SHH、NTN1、GDNF、SOX10、S100、GFAP、POU3F1、PMP22、MBP、AQP4、MPZ、GFAP、ERBB3、CD9、CD81、CD44、CD98、CD49E、CD49D、NGFR、NFATC4、MOG、IFNG、MAL、NTF3、TGFB1、TYRP1、ENTHD1、NT5E、HTR2B、NOV、IL8、SLC16A6、CDKN2A、PLP2、S100A6、AQP9、およびCDH19からなる群から選択される、項目281に記載の組成物。
(項目283)
前記SC前駆体マーカーが、SOX10、GAP43、BLBP、MPZ、Dhh、P75NTR、CD49D、TFAP2、CDH19、CD44、ERBB3、POU3F1、GFAP、CALCB、GRP116、TSPYL5、ITPKA、SLC17A6、SYPL2、LOC100128252、ANGPTL7、LOC728978、ZNF502、SLC16A6、LPL、SLC30A2、およびSLC10A4からなる群から選択される、項目281または282に記載の組成物。
(項目284)
前記幹細胞マーカーが、OCT4、NANOG、SSEA4、およびSSEA3からなる群から選択される、項目281から283のいずれか一項に記載の組成物。
(項目285)
前記CNSマーカーが、PAX6、NESTIN、およびSOX1からなる群から選択される、項目281から284のいずれか一項に記載の組成物。
(項目286)
前記神経細胞マーカーが、TUJ1、MAP2、NFH、BRN3A、ISL1、TH、ASCL1、CHAT、PHOX2B、PHOX2A、TRKA、TRKB、およびTRKCからなる群から選択される、項目281から285のいずれか一項に記載の組成物。
(項目287)
前記間葉前駆体マーカーが、SMAおよびCD73からなる群から選択される、項目281から286のいずれか一項に記載の組成物。
4.図面の簡単な説明
本明細書に開示される主題は、幹細胞(例えば、ヒト幹細胞)の、in vitroでシュワン細胞(「SC」)へとさらに誘導することができる1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する細胞(すなわち、シュワン細胞前駆体「SC前駆体」)への分化を誘導するin vitro方法、そのような方法によって産生された細胞(SC前駆体およびSC)、およびそのような細胞を含む組成物に関する。PNSおよび/もしくはCNSの再生のため、ミエリン損傷の予防および/もしくは処置のため、ならびに/またはシュワン細胞関連障害、例えば末梢神経障害(例えば、糖尿病性末梢神経障害)の予防および/もしくは処置のための、ならびにPNSおよび/もしくはCNSの再生、ミエリン損傷の予防および/もしくは処置、および/またはシュワン細胞関連障害、例えば末梢神経障害(例えば、糖尿病性末梢神経障害)の予防および/もしくは処置に適した化合物をスクリーニングするためのそのような細胞の使用も提供される。
1.定義
2.幹細胞を分化させる方法
3.シュワン細胞前駆体およびシュワン細胞を含む組成物
4.処置方法
5.キット
本明細書で使用される用語は一般に、本発明の文脈内で、各用語が使用される具体的な文脈において、当該分野におけるその通常の意味を有する。ある特定の用語は、本発明の組成物および方法ならびにそれらをどのように作製および使用するかを記述するにあたり実務者にさらなるガイダンスを提供するために、以下または本明細書の他の箇所で議論される。
シグナル伝達分子を隔離する偽受容体として作用する。アクチビン、ノーダル、TGFbおよびBMPを遮断する抗体は、SMADシグナル伝達の細胞外活性化因子を中和するためなどの使用について企図される。阻害剤は、指定された分子の阻害を次に引き起こす、指定されたシグナル伝達分子から上流の分子に結合しそれに影響を与えることによって誘導される阻害に加えて、競合的阻害(別の公知の結合化合物の結合を除外または低減させる様式で活性部位に結合する)およびアロステリック阻害(そのタンパク質の活性部位への化合物の結合を妨害する様式でタンパク質コンフォメーションを変化させる様式でタンパク質に結合する)の観点から記載される。阻害剤は、シグナル伝達標的を実際に接触させることによってシグナル伝達標的またはシグナル伝達標的経路を阻害する「直接的阻害剤」であり得る。
)の導入によって形成される、胚性幹細胞と類似の多能性幹細胞の1つの型を指す。
限定的な例には、げっ歯類、例えば、マウス、ラット、ハムスターおよびモルモット;ウサギ;イヌ;ネコ;ヒツジ;ブタ;ヤギ;ウシ;ウマ;ならびに非ヒト霊長類、例えば、類人猿およびサルが含まれる。
本明細書に開示される主題は、シュワン細胞は、幹細胞(例えば、ヒト幹細胞))の分化を誘導するためのin vitroでの方法を提供する。ある特定の実施形態では、幹細胞はヒト幹細胞である。ヒト幹細胞の非限定的な例には、ヒト胚性幹細胞(hESC)、ヒト多能性幹細胞(hPSC)、ヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)、ヒト単為生殖幹細胞、始原胚細胞様多能性幹細胞、エピブラスト幹細胞、Fクラス多能性幹細胞、体性幹細胞、がん幹細胞、または系列特異的分化が可能な任意の他の細胞が含まれる。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞はヒト多能性幹細胞である。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞はヒト胚性幹細胞(hESC)である。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞はヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)である。ある特定の実施形態では、幹細胞は、哺乳動物幹細胞、霊長類幹細胞、またはげっ歯類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ウシ、ヒツジなど由来の幹細胞が含まれるがこれらに限定されない非ヒト幹細胞である。
2015年12月23日出願の米国特許仮出願番号62/387,468号)。
ない、神経堤系列細胞への幹細胞のin vitro分化のための任意の適切な方法が、本明細書に開示される方法の第1の相において使用され得る。ある特定の実施形態では、幹細胞の集団を神経堤系列細胞の集団へとin vitroで分化させ、神経堤系列細胞の集団をSC前駆体の集団へとin vitroで分化させ、SC前駆体の集団をSCの集団へとin vitroでさらに誘導する。
ある特定の実施形態では、1つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞への幹細胞の分化をin vitroで誘導する方法は、幹細胞(例えば、ヒト幹細胞)の集団を、トランスフォーミング増殖因子ベータ(TGFβ)/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の阻害剤は、TGFβ、骨形成タンパク質(BMP)、ノーダルおよびアクチビンを含むリガンドを中和し、または受容体および下流のエフェクターを遮断することを介して、そのシグナル経路を遮断する。TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の阻害剤の非限定的な例は、その全体が参照によって組み込まれる、WO2011/149762、Chambers(2009年)およびChambers(2012年)に開示されている。ある特定の実施形態では、TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤は、SB431542、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である。ある特定の実施形態では、TGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤はSB431542である。
を参照のこと。
を有する小分子DM-3189、IUPAC名4-(6-(4-(ピペラジン-1-イル)フェニル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-3-イル)キノリンを指す。
こと。本明細書で使用される場合、用語「グリコーゲンシンターゼキナーゼ3β阻害剤」とは、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3β酵素を阻害する化合物を指す。例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるDobleら、J Cell Sci. 2003年;116巻:1175~1186頁を参照のこと。
を有する、IUPAC名6-(2-(4-(2,4-ジクロロフェニル)-5-(4-メチル-1H-イミダゾール-2-イル)ピリミジン-2-イルアミノ)エチルアミノ)ニコチノニトリルを指す。
神経堤系列細胞をシュワン細胞前駆体に直接分化させるための、本明細書に開示される分化方法は、細胞(例えば、1つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞、例えば、幹細胞の集団をTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤および任意選択で1種または複数のSMAD阻害剤と接触させるステップ、ならびに細胞を1種または複数のWnt活性化因子とさらに接触させるステップの後に分化した細胞)を、本明細書に記載される1種または複数のWnt活性化因子およびFGFシグナル伝達の1種または複数の活性化因子(「FGF活性化因子」)と接触させて、SC前駆体の集団、例えば1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する細胞を産生するステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、細胞(例えば、1つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞、例えば、幹細胞の集団をTGFβ/アクチビン-ノーダルシグナル伝達の1種または複数の阻害剤および任意選択で1種または複数のSMAD阻害剤と接触させるステップ、ならびに細胞を1種または複数のWnt活性化因子とさらに接触させるステップの後に分化した細胞)を、シュワン細胞の分化を誘導する1種または複数の分子(「SC分化誘導剤」)と接触させて、SC前駆体の集団、例えば1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する細胞を産生するステップを含む。
の混合物が含まれる。ある特定の実施形態では、細胞は、SHHには曝露されない。
シュワン細胞前駆体は、シュワン細胞へとin vitroでさらに誘導され得る。分化したSC前駆体は、SC前駆体のシュワン細胞の集団への成熟化を支持する条件に供され得る。シュワン細胞は、ミエリン形成性シュワン細胞または非ミエリン形成性シュワン細胞であり得る。
ある特定の実施形態では、上記阻害剤、活性化因子、誘導剤および増強剤は、細胞、例えば、幹細胞、1つもしくは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞、1つもしくは複数のSC前駆体マーカーを発現する細胞、1つもしくは複数のSCマーカーを発現する細胞、またはそれらの組合せを含む細胞培養培地に添加される。適切な細胞培養培地には、Knockout(登録商標)Serum Replacement(「KSR」)培地、N2培地、Essential 8(登録商標)/Essential 6(登録商標)(「E8/E6」)培地およびNeurobasal(NB)培地(例えば、N2およびB-27(登録商標)Supplementを補充したNB培地)が含まれるがこれらに限定されない。KSR培地、N2培地、E8/E6培地およびNB培地は、市販されている。ある特定の実施形態では、1つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞への幹細胞のin vitro分化のための培地は、KSR培地、N2培地、およびそれらの組合せからなる群から選択される培地である。ある特定の実施形態では、1つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞への幹細胞のin vitro分化のための培地は、E8/E6培地である。ある特定の実施形態では、1つまたは複数のSC前駆体マーカーを発現する細胞への、1つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞のin vitro誘導のための培地は、NB培地である。ある特定の実施形態では、1つまたは複数のSCマーカーを発現する細胞への、1つまたは複数のSC前駆体マーカーを発現する細胞のin vitro誘導のための培地は、NB培地である。
されている。一例のE8/E6培地は、その全体が参照によって組み込まれるWO15/077648に開示されている。ある特定の実施形態では、E8/E6細胞培養培地は、DMEM/F12、アスコルビン酸、セレン、インスリン、NaHCO3、トランスフェリン、FGF2およびTGFβを含む。E8/E6培地は、E8/E6培地が活性なBMPもWnt成分も含まないという点で、KSR培地とは異なる。従って、ある特定の実施形態では、幹細胞を培養するためにE8/E6培地が使用される場合、1種または複数のSMAD阻害剤(例えば、BMPを阻害するもの)がE8/E6培地に添加される必要はない。
分化したSC前駆体は、1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する。シュワン細胞前駆体マーカーの非限定的な例には、SOX10、GAP43、BLBP、ミエリンタンパク質ゼロ(MPZ)、Dhh、P75NTR、CD49D、TFAP2、CDH19、CD44、ERBB3、POU3F1、グリア線維酸性タンパク質(GFAP)、CALCB、GRP116、TSPYL5、ITPKA、SLC17A6、SYPL2、LOC100128252、ANGPTL7、LOC728978、ZNF502、SLC16A6、LPL、SLC30A2、SLC10A4、ならびに表1~4に列挙される遺伝子が含まれる。
本明細書に開示される主題は、本明細書に記載されるin vitro分化方法によって産生された分化したSC前駆体の集団を含む組成物を提供する。さらに、本明細書に開示される主題は、本明細書に記載されるin vitroの分化したSC前駆体から成熟したSCの集団を含む組成物を提供する。
in vitroの分化したSC前駆体およびSCを、末梢神経系(以降、「PNS」)の再生のために使用することができる。in vitroの分化したSC前駆体およびSCはまた、中枢神経系(以降、「CNS」)の再生のためにも使用することができる。さらに、in vitroの分化したSC前駆体およびSCは、ミエリン損傷の予防および/または処置/修復のために使用することができる。ミエリンは、PNSミエリンまたはCNSミエリンであり得る。
)。しかし、移植されたSCが再生された軸索のミエリン形成に直接寄与するか否か、またはその作用が栄養支援を通して主に媒介されるか否かは明白ではない。これらの移植パラダイムにおける主要な障害は、SCを大規模に得ること、および損傷領域における移植後のその遊走能が限定されることである(KocsisおよびWaxman、2007年)。
おける神経損傷を予防するための治療を合理的に設計するためには、基礎となる代謝および細胞機構のより良い理解が必要である。
ある特定の実施形態では、方法は、それを必要とする対象に有効量の以下の1種または複数を投与するステップを含む:
(a)本明細書に記載される分化したシュワン細胞前駆体の集団;
(b)そのような分化したシュワン細胞前駆体を含む組成物;
(c)本明細書に記載されるシュワン細胞の集団;および
(d)そのようなシュワン細胞を含む組成物。
の使用によってもたらされ得る。しかし、本開示の主題によれば、使用される任意のビヒクル、希釈剤または添加物は、本明細書に開示される幹細胞から誘導されたSC前駆体または成熟したSCまたはそれを含む組成物と適合性でなければならない。
本明細書に開示される主題は、神経堤系列細胞のSC前駆体への分化を誘導するためのキットを提供する。ある特定の実施形態では、キットは、本明細書に記載される1種または複数のWnt活性化因子、1種または複数のFGF活性化因子、および任意選択で1種または複数のSC分化誘導剤を含む。ある特定の実施形態では、キットは、神経堤系列細胞(例えば、1つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞)の、SC前駆体(例えば、1つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する細胞)への分化を誘導するための説明書をさらに含む。ある特定の実施形態では、説明書は、神経堤系列細胞を1種または複数のWnt活性化因子、1種または複数のFGF活性化因子、および任意選択で1種または複数のSC分化誘導剤と少なくとも約3日間、少なくとも約4日間、少なくとも約5日間、少なくとも約6日間、少なくとも約7日間、少なくとも約8日間、少なくとも約9日間、少なくとも約10日間、少なくとも約11日間、少なくとも約12日間、少なくとも約13日間、少なくとも約14日間、少なくとも約15日間、少なくとも約16日間、少なくとも約17日間、少なくとも約18日間、少なくとも約19日間、または少なくとも約20日間にわたって接触させて、SC前駆体を産生するステップを含む。ある特定の実施形態では、説明書は、神経堤系列細胞を1種または複数のWnt活性化因子、1種または複数のFGF活性化因子、および任意選択で1種または複数のSC分化誘導剤と少なくとも約10日間にわたって接触させて、SC前駆体を産生するステップを含む。ある特定の実施形態では、説明書は、神経堤系列細胞を1種または複数のWnt活性化因子、1種または複数のFGF活性化因子、および任意選択で1種または複数のSC分化誘導剤と最長約15日間、最長約16日間、最長約17日間、最長約18日間、最長約19日間、最長約20日間、最長約21日間、最長約22日間、最長約23日間、最長約24日間、最長約25日間、最長約26日間、最長約27日間、最長約28日間、最長約29日間、または最長約30日間にわたって接触させて、SC前駆体を産生するステップを含む。ある特定の実施形態では、説明書は、神経堤系列細胞を1種または複数のWnt活性化因子、1種または複数のFGF活性化因子、および任意選択で1種または複数のSC分化誘導剤と約3日間と約5日間との間、約5日間と約10日間との間、約10日間と約15日間との間、約15日間と約20日間との間、約20日間と約25日間との間、または約25日間と約30日間との間、接触させて、SC前駆体を産生するステップを含む。ある特定の実施形態では、説明書は、神経堤系列細胞を1種または複数のWnt活性化因子、1種または複数のFGF活性化因子、および任意選択で1種または複数のSC分化誘導剤と約10日間と約15日間との間、接触させて、SC前駆体を産生するステップを含む。ある特定の実施形態では、説明書は、神経堤系列細胞を1種または複数のWnt活性化因子、1種または複数のFGF活性化因子、および任意選択で1種または複数のSC分化誘導剤と約3日間、約4日間、約5日間、約6日間、約7日間、約8日間、約9日間、約10日間、約11日間、約12日間、約13日間、約14日間、約15日間、約16日間、約17日間、約18日間、約19日間、約20日間、約21日間、約22日間、約23日間、約24日間、約25日間、約26日間、約27日間、約28日間、約29日間、または約30日間にわたって接触させて、SC前駆体を産生するステップを含む。ある特定の実施形態では、説明書は、神経堤系列細胞を1種または複数のWnt活性化因子、1種または複数のFGF活性化因子、および任意選択で1種または複数のSC分化誘導剤と14日間にわたって接触させて、SC前駆体を産生するステップを含む。ある特定の実施形態では、説明書は、神経堤系列細胞を1種または複数のWnt活性化因子、1種または複数のFGF活性化因子、および任意選択で1種または複数のSC分化誘導剤と15日間にわたって接触させて、SC前駆体を産生するステップを含む。
概要
本発明者らは、ヒト幹細胞(例えば、hPSC)から誘導されたシュワン細胞前駆体およびシュワン細胞の非常に効率的な生成および見込みのある単離方法を開発した。幹細胞由来SCは、in vitroでhESC由来感覚ニューロンに対してミエリン形成することができ、hESC由来運動ニューロンの成熟化を加速することができた。幹細胞由来SCはまた、in vivoでのPNS損傷のラットモデルにおいて効率的に定着することができた。ラットの損傷した座骨神経に移植された幹細胞由来SCは、再生しつつある宿主軸索のミエリン形成に寄与し、新たにミエリン形成された線維における適切なイオンチャネル局在化を促進した。
未分化ヒト胚性幹細胞(hESC)の培養
hESC系統H9(WA-09)および誘導体(SOX10::GFP;SYN::ChR2-YFP;SYN::YFP;PHOX2B:GFP;EF1::RFP EDNRB-/-)ならびに2つの独立したhiPSC系統(健康および家族性自律神経異常症、センダイベースのOMSK(Cytotune))を、hESCを含むKSR(Life Technologies、10828-028)培地中のマウス胚性線維芽細胞(MEF、Global Stem、Rockville、MD)上で維持した(Chambersら、2009年)。細胞を、1ヶ月間隔でマイコプラズマ試験に供し、STRを、この研究の開始時にプロファイルして、細胞の種類を確認した。
hESCを、10nM FGF2(R&D Systems、233-FB-001MG/CF)を含むhESC培地中で、マトリゲル(BD Biosciences、354234)コーティングしたディッシュ上にプレートした(105細胞/cm2)。分化を、LDN193189(100nM、Stemgent、Cambridge、MA)およびSB431542(10μM、Tocris、Ellisville、MI)を含むknockout serum replacement(KSR)培地(KO DMEM+15%KSR、L-グルタミン(Life Technologies、25030-081)、NEAA(Life Technologies、11140-050))中で開始させた。KSR培地を、以前に記載されたように(Chambersら、2009年)、4日目~10日目に、漸増量のN2培地で漸進的に置き換えた。頭蓋NC(CNC)誘導のために、細胞を、2日目~11日目に、LDNおよびSBに加えて3μM CHIR99021(Tocris Bioscience、4423)で処理する。CNS前駆体対照細胞は、以前に記載されたように(Chambersら、2009年)、0日目~11日目のLDNおよびSBによる処理によって生成した。実施例を通じて、0日目は、培地を、hESC培地からLDNおよびSB含有培地に切り替える日であった。本文および図面中の分化の日数は、多能性段階(0日目)以降の日数を指す。
IFのために、細胞を、4%パラホルムアルデヒド(PFA、Affymetrix-USB、19943)で20分間固定し、次いで、1%ウシ血清アルブミン(BSA、Thermo Scientific、23209)および0.3%triton X-100(Sigma、T8787)を使用して、ブロッキングおよび透過処理した。次いで、細胞を、一次抗体溶液中で4℃(セルシウス)で一晩インキュベートし、フルオロフォアコンジュゲートした二次抗体でRTで1時間染色し、次いで、染色された細胞を、DAPI(1ng/ml、Sigma、D9542-5MG)と共にインキュベートし、数回洗浄し、その後イメージングした。フローサイトメトリー分析のために、細胞を、Accutase(Innovative Cell Technologies、AT104)を用いて解離させ、BD Cytofix/Cytoperm(BD Bioscience、554722)溶液を使用して固定および透過処理し、次いで、BD Perm/Wash緩衝剤(BD Bioscience、554723)を製造業者の使用説明書に従って使用して、洗浄、ブロッキングおよび透過処理した。次いで、細胞を、一次(4℃で一晩)および二次(室温で30分間)抗体で染色し、フローサイトメーター(FlowJo software)を使用して分析する。一次抗体および希釈のリストは表5に提供される。
特異的表面抗原についてのスクリーニングを、分化の80日目にhESC-SCに対して、BD Lyoplate library(登録商標)(BD、560747)を使用して実施した。細胞を、96ウェルプレート中にプレートし(10,000細胞/ウェル)、製造業者の使用説明書に従って、一次および二次抗体で染色した。染色された細胞を、プレート全体イメージングおよび定量化のために固定した。総GFAPのうちの二重陽性細胞のパーセンテージを、各抗体について定量化した。上位ヒット(>60%二重陽性)を、フローサイトメトリーをさらに使用して検証した。
RNA配列決定のために、総RNAを、RNeasy RNA精製キット(Qiagen、74106)を使用して抽出した。qRT-PCRアッセイのために、総RNA試料を、Superscript II Reverse Transcriptase(Life Technologies、18064-014)を使用してcDNAに逆転写した。qRT-PCR反応を、QuantiTect SYBR Green PCRミックス(Qiagen、204148)を使用して設定した。各データポイントは、3つの独立した生物学的反復を示す。RNA-seq読み取りを、TopHat v2.0を使用して、ヒト参照ゲノム(hg19)にマッピングした。TopHatを、カバー範囲検索に対する例外を伴って、デフォルトパラメーターで実行した。次いで、アラインメントを、HTSeqを使用して定量化し、差示的遺伝子発現を、頭蓋神経堤試料に対して標準化したDESeqを使用して計算した。
SCの生存度をモニタリングするために、細胞を、CytoTox 96細胞毒性アッセイキット(Promega、G1780)を使用してLDH活性についてアッセイした。簡潔に述べると、細胞を、30,000細胞/cm2で96ウェルプレート中にプレートする。上清および細胞溶解物を、24時間後に収集し、プレートリーダー(490nm吸光度)を使用してLDH活性についてアッセイした。生存度を、溶解物のLDHシグナルを総LDHシグナル(溶解物+上清から)で除算することによって計算した。細胞を、アッセイの間、PO/LM/FNコーティングしたディッシュ上でシュワン細胞培地(Sciencell、1701)中で培養した。
MN-SC同時培養物を、既に記載されているように(Barreto-ChangおよびDolmetsch、2009年)培養後40日目および70日目にカルシウムイメージングに供した。簡単に説明すると、細胞を、5μMのFluo-4(Life Technologies)と共に37℃で30分間インキュベートした後、イメージングした。カバーガラスをFCS2イメージングチャンバー(Bioptechs)に載せ、細胞を、既に記載したように0.1重量/容積%のBSAを添加した通常のタイロード食塩水溶液によって灌流した。活性化するために、細胞を、グルタメート(50または100μM)を含むタイロード液によって灌流した。画像を、40×1.3開口数の油浸対物レンズ(Zeiss)を備えたAxiovert 200M倒立顕微鏡を使用して340nmおよび380nmの波長で5秒毎に画像を獲得した。Metamorphソフトウェア(Molecular Devices)を使用して、比率計測分析を行った。
全ての手順は、NIHのガイドラインに従って実施され、地域の施設内動物飼育使用委員会(Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC))によって承認された。ラットをイソフルランガスの麻酔下に置き、両方の座骨神経を座骨切痕より下で露出し、Dumont #5鉗子を使用して同じ位置で30秒間2回挫滅した。その後直ちに、3×104個のhES細胞/μlシュワン細胞の細胞浮遊液の約3~4μlを、ガラスマイクロピペットで挫滅部位に対して近位および遠位に注射することを通して移植した。生存期間は、2~8週間の範囲であった。免疫組織化学用のラットを0.1M PBS中の4%パラホルムアルデヒドの心臓内灌流によって固定した。座骨神経を、挫滅病変および移植の2、3、4、8週間後にラットから切断した。切断後、座骨神経を0.1M PBS中の30%スクロースに一晩入れて凍結切片のためにOCTブロックにそれらを胞埋するか、または神経周膜を除去してそれらを冷0.1Mリン酸緩衝液(pH7.4)中で裂くことによって調製した。一部の神経を灌流後に裂いて免疫染色し、個々の軸索を調べた。挫滅部位に対して遠位の再生した軸索を分析した。
データは、平均±SEMとして示され、少なくとも3回の独立した実験から導出した。反復(n)に関するデータは、図の説明中に与えられる。統計分析を、スチューデントt検定(2つの群を比較する)、またはダネット検定(複数の群を対照に対して比較する)を用いるANOVAを使用して実施した。正規性について検定するために、十分な数の反復を有するデータについて、生データの分布を、正規分布で近似した(コルモゴロフ-スミルノフ正規性検定)。生存度分析を、ログランク(マンテル-コックス)検定を使用して実施した。一次ヒットについてのZ-スコアを、Z=(x-μ)/σとして計算した。Xは、移動スコア値であり、全てのヒット化合物について3である。μは、平均移動スコア値であり、σは、全ての化合物およびDMSO対照についての標準偏差である。
hESCからのSC系列の誘導および前向き単離
DPNにおける感覚神経損傷の細胞型特異的機構を精査するために、ヒト感覚ニューロンおよびSCをhPSCから生成した。hESCからの感覚ニューロンの誘導のための方法は、Caiら、2016年;Chambersら、2012年に記載されているが、SCの誘導は
、依然として理解が進んでいない。従って、DPNのhESCモデルを樹立することを目指した第1のステップとして、hESCをSCへと分化させるための有効な戦略を樹立した。
)。より最近の研究は、hPSCからのSC様細胞の誘導について報告したが、SOX10などの重要な系列マーカーの発現を示さず、機能的ミエリン形成を実証できなかった(Liuら、2012年;Zieglerら、2011年)。胚発生の間に、SCは、段階的プロセスでSOX10+NC細胞から生じると考えられた。マウスおよびニワトリ胚における研究に基づくと、NCは、発達中の神経においてニューロンの束と関連するSC前駆体を最初に生じる。関連するニューロンは、NRG1を発現し、それらのERBB3受容体を活性化することによって、SC前駆体の生存およびさらなる分化を促進する(NewbernおよびBirchmeier、2010年)。マウス発生のE13.5までに、SC前駆体は、SOX10
の発現を維持しつつ、GFAP、S100およびPOU3F1などの系列マーカーを上方調節する未熟なSCを生じる。ミエリン形成性運命および非ミエリン形成性運命へのSCの最終分化は、誕生後まで継続する(Jessenら、2015年)。
コールは種々のNC由来系列を生じるが、SOX10発現のレベルは一般に低い。対照的に、WNTシグナル伝達の活性化因子へのタイミングをとった曝露に基づく、より方向付けられたNCの誘導プロトコールは、分化の11日目までに、細胞の大部分においてSOX10のロバストな誘導を示す(Fattahiら、2016年;Menendezら、2011年;Micaら、2013年)。さらなる培養により、これらのhESC由来NC細胞は、SOX1
0+メラニン細胞へと方向付けられ得るが(Micaら、2013年)、SOX10-の間充織およびニューロン前駆体もまた生じる(Micaら、2013年)。SOX10発現は、発生を通じてSC系列において保持される重要なマーカーであるので、本発明者らは、グリア運命に向けてそれらを指示する前に、培養物中でSOX10+前駆体を維持するための条件を樹立することに最初に焦点を当てた。本発明者らは、EGF、FGF、WNT、Notch、TGFβ、BMP、NRGおよびエンドセリン3シグナル伝達のモジュレーターの存在下で、2Dまたは3DのNC培養物中のSOX10+細胞のパーセンテージを決定した。FGF2およびNRG1処理に加えた、3D凝集ステップとCHIR99021によるWntシグナル伝達の活性化との組合せは、SOX10発現の維持(図4A)ならびに25日目までのS100および他の初期SCマーカーの誘導(図1A~1C)を生じた。この段階で、さらに10日間にわたるFGF2、NRG1およびcAMPによる25日目培養物前駆体の処理は、GFAP、POU3F1、PMP22、MBP、AQP4、MPZなどのいくつかのSCマーカーのロバストな誘導、ならびにとりわけGDNF、ERBB3およびGAP43が含まれる、ニューロンの相互作用および支持に関与する遺伝子の上方調節を促進する(図1A~1D)。より長期の培養は、GFAP+細胞の富化を生じ、S100、MBPおよびGFAPの発現(図1E、1Fおよび1I)に基づいて、60~90日目までにSCのほぼ均質な集団を生じた(図4B)。これらのhESC由来集団は、S100、MBPおよびGFAPを発現するSCの高いパーセンテージを維持したまま、さらに数週間にわたって増殖できる(図1E、1Fおよび1I)。
のNCまたは25日目のSCP細胞では発現されない(図5C)唯一のマーカーであることが明らかになった。精製された細胞のRNA配列決定により、25日目のhESC由来SCPは、初期NC細胞と密接に関連するが、50日目、および特に100日目のSCは、初代成体ヒトSCと密接に整合する遺伝子発現パターンを示すことが実証された(図1G)。遺伝子発現データにより、25日目および100日目の細胞を11日目のNCと比較することによって、新規候補SCPおよびSCマーカーもまた得られた(図1H)。各系列についての上位200の富化された転写物のリストは、表1~4に提供される。
グリアの重要な機能は、ニューロンと相互作用してその機能を調節し、ミエリンを産生することである。本発明者らは、hESC由来感覚ニューロン(Chambersら、2012年)と既に報告された方法(Calderら、2015年)を使用して生成した運動ニューロンとの同時培養を確立することによって、hESC-SCにおけるその能力を試験した(図2A)。60日目のRFP標識hESC-SCを、50日目のGFP標識hESC感覚ニューロンと混合し、同時培養の開始後72時間モニターした。SCは、神経線維と密に会合して整列し、このことはそれらが、軸索膜上に発現されるシグナル伝達の合図に適切に応答するために必要な受容体を有することを示している(図2B)。
年;Bunge、1994年;Webberら、2011年)。SCの移植は、脊髄挫傷モデルなど
のいくつかの実験系において神経再生を増強することが証明されており(Lavdasら、2008年;Rodriguesら、2012年;WiliamsおよびBunge、2012年;KocsisおよびBunge、2014年);自家SCがSCI患者において現在試験中である(NCT01739023;NCT02354625)。そのような細胞治療アプローチにおける主な障害は、表現型的に安定な初代SCを大規模で得ることには限界があることである。hESCは、これらの再生応用のためにヒトSCの無限の代替供給源を提供する。hESC-SCの再生能の評価に向けての最初のステップとして、本発明者らは、座骨神経損傷のラットモデルに移植後にこれらの細胞が生存して定着することができるか否かを調べた。
SCは、末梢神経の発生、機能および修復において重要な役割を果たす。しかし、それらの発生および機能は、初代組織から実行可能な数でそれらを得ることにおける限界に起因して、ヒトではあまり理解されていない。他の研究者が、P75+/HNK1+NC前駆体の長期維持後のhPSC由来のシュワン様細胞を以前に報告しているが(Leeら、2007年)、これらの研究は、低い誘導効率、および数ヶ月間のin vitro培養、長引く分化、限定的なSC成熟化、およびミエリン形成データの欠如という限界を有する(Leeら、2007年;Liuら、2012年;Zieglerら、2011年)。他の研究者によ
るヒトSCを誘導するための試みもまた、低い収量、限定的な表現型の特徴付け、およびin vitroまたはin vivoミエリン形成の欠如を生じた(Liら、2015年;Micaら、2013年)。ヒトSCの十分特徴付けられた純粋な集団の生成のための高度に効率的なアプローチを樹立したが、これは、将来の徹底的な発生研究、および疾患モデル化などの橋渡し適用、ならびに細胞治療のためのお膳立てとなる。
マーカーとしてのCD98の同定は、かかる研究のための強力なツールを提示する。本明細書に示すデータに基づき、SC媒介ニューロン成熟化およびミエリン形成に関する試験は、他の重点領域であるべきである。PNS病理のモデル化は特に関心の対象となり得る。培養hESC由来シュワン細胞の驚くべき特色は、シュワン細胞であることを確認するだけでなく、多能性由来細胞が成体シュワン細胞の発現パターンと整合することを示唆する、それらの遺伝子発現パターンである。これは、胎児段階のマーカーを発現するニューロンなどの、ほとんどの他のin vitro誘導されたhPSC系列とは対照的である(Studerら、2015年)。自家SCは、PNSおよびCNS障害の両方を標的とする再生医療での応用に関して現在試験中である(Lavdasら、2008年;Rodriguesら、20
12年)。移植のデータは、外傷性神経損傷モデルにおけるhESC-SCの強力な定着を証明する。本明細書に示す結果は、脊髄損傷を含む再生医療におけるhESC-SCの応用に関して確固たる基礎を築く。
ヒトSCの大規模産生および成体損傷神経におけるその定着能は、再生医療におけるその応用の基礎を確立する。
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