KR101903458B1 - 슈반 세포 전구체 (Schwann cell precursor) 및 이로부터 분화된 슈반 세포 (Schwann cell)의 제조 방법 - Google Patents

슈반 세포 전구체 (Schwann cell precursor) 및 이로부터 분화된 슈반 세포 (Schwann cell)의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다능성 줄기 세포로부터 슈반 세포 전구체를 제조하는 방법, 및 상기 제조된 슈반 세포 전구체로부터 슈반 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 또한, 상기 슈반 세포 전구체 및 슈반 세포를 포함하는 신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 세포 치료제 및 이를 제조하는 방법, 다능성 줄기 세포로부터 슈반 세포로의 직접 분화 유도용 조성물, 슈반 세포 전구체로부터 슈반 세포로의 분화용 조성물을 제공한다. 또한, 상기 방법으로 제조된 슈반 세포 전구체 또는 슈반 세포, 및 이를 포함하는 스크리닝용 키트를 제공한다.
본 발명의 다능성 줄기 세포로부터 슈반 세포 전구체를 제조하는 방법으로 신속하고 효율적인 슈반 세포 전구체를 생산할 수 있고, 또한, 상기 슈반 세포 전구체로부터 제조된 슈반 세포는 미엘린 형성능 및 신경 영양 인자 분비능을 가져, 신경 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.

Description

슈반 세포 전구체 (Schwann cell precursor) 및 이로부터 분화된 슈반 세포 (Schwann cell)의 제조 방법 {A method for preparing a Schwann cell precursor and a Schwann cell prepared therefrom}
본 발명은 다능성 줄기 세포로부터 슈반 세포 전구체를 제조하는 방법, 및 상기 제조된 슈반 세포 전구체로부터 슈반 세포를 제조하는 방법에 관한 발명이다. 또한, 상기 슈반 세포 전구체 및 슈반 세포를 포함하는 신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 세포 치료제 및 이를 제조하는 방법에 관한 발명이다. 더 나아가, 다능성 줄기 세포로부터 슈반 세포로의 직접 분화 유도용 조성물 및 슈반 세포 전구체로부터 슈반 세포로의 분화용 조성물에 관한 발명이다.
슈반 세포(Schwann Cell, SC)는 말초 신경계의 기본적인 신경교세포로서, 뉴런을 지지하는 기능을 한다. 말초 신경계 (peripheral nervous system, PNS) 내 신경교세포의 대표적 세포인 슈반 세포는 수초 형성, 신경 자극 전달, 및 다양한 신경 영양 인자 (예를 들어, brain-derived neurotrophic factor (BDNF), glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), nerve growth factor (NGF), 및 neurotrophin-3 (NT-3)) 및 신경의 생존 및 축삭의 성장에 이로운 환경을 제공하는 세포외 기질의 구성을 분비하는 역할을 한다.
자가 유래의 일차 인간 슈반 세포 (human SCs, hSCs)는 질환 모델링, 표현형 약물의 발견, 및 신경 손상의 치료를 위해 매우 유용하지만, 이들의 이용은 한정적인데, 그 이유는 인간 조직으로부터 채취가 매우 어렵고, 낮은 세포 분할 비율 및 in vitro 배양시 시간 경과에 따른 섬유아세포의 오염에 의한 불충분한 세포의 수와 같은 한계에 있다. 또한, 분리 및 순도에 관한 기술적 문제 역시 상기와 같은 한계가 된다.
최근, 신경 능선(neural crest) 유도체를 포함한 인체를 이루는 거의 모든 세포 유형으로 분화할 수 있는 우수한 능력을 가진, 인간 배아 줄기 세포 (human embryonic stem cells, hESCs) 및 인간 유도 만능 줄기 세포 (human induced pluripotent stem cells, hiPSCs)를 포함한 인간 다능성 줄기 세포 (human pluripotent stem cells, hPSCs)가 슈반세포 분화 생산의 중요한 줄기세포 자원으로 많은 주목을 받고 있다.
hPSC로부터 in vitro 분화 프로토콜에 의해 분화 생산 가능한 다분화능 신경능선 줄기세포 [multipotent neural crest stem cells (NCSCs) (multipotent NCSCs)]는 슈반 세포를 포함한 연골세포, 평활근 세포 또는 지방세포와 같은 다수의 세포 유형으로 분화하는 능력을 가진 세포이다. hPSC의 NCSC로의 계통-특이적 분화는 신경 능선 발달의 주요 신호 전달 경로의 약학적 조절에 의해 이루어 질 수 있다. 인간 슈반세포의 생산은 hPSC-유래 NCSCs의 분화 생산을 경유하여 연속적인 슈반세포 계통-특이적 in vitro 분화 배양에 의해 간접적으로 유도될 수 있음이 알려져 있다. 그러나, NCSCs가 다양한 세포 타입으로의 분화 유도 잠재력을 내포하고 있어, 상기와 같은 방법에 의한 시 슈반세포 분화는 여전히 낮은 생산율 및 순도의 문제가 해소되고 있지 않다는 단점이 있다. 또한, 분화 유도 과정이 매우 복잡하고 많은 시간이 소요된다는 문제점과 분화 유도된 슈반 세포의 기능 및 성능 결여 역시 문제가 개선되어야 함이 요구되고 있다.
슈반 세포는 발달 과정 동안, 1) 전구체, 2) 미성숙한 미엘린이 형성되지 않은 슈반 세포, 및 3) 성숙한 수초화된 슈반 세포의 형태 등으로 존재한다.
슈반 세포 전구체 (Schwann cell precursors, SCPs)는 발달의 초기 단계에서 나타나는 신경 능선 세포 및 미성숙한 미엘린 형성 전 슈반 세포 단계 사이에서 구별되어 존재하는 중간 세포 타입이며, 슈반 세포의 직접적인 생산을 위해 적합한 기원인 것으로 여겨진다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 신속하면서도 기존 방법에 비해 생산 효율이 높고, 기능이 개선된 인간 슈반 세포를 제조할 수 있는 방법을 개발하기 위해 노력한 결과, 다능성 줄기 세포로부터 증식 가능한 슈반 세포 전구체로 직접 분화를 유도하고, 상기 슈반 세포 전구체로부터 슈반 세포로의 분화를 유도할 경우, 생체내·외에서 기능성이 향상된 인간 슈반 세포를 단축된 시간 내에, 생산효율이 향상된 조건으로 제조할 수 있음을 확인하였다. 또한, hPSC-SCP로부터 생산된 슈반세포를 생쥐 좌골신경손상 모델 (mouse sciatic nerve injury model)에 이식하였을 때 손상된 신경 기능을 유의하게 회복시킴으로써 신경질환 세포치료제 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 (a) 다능성 줄기 세포 (pluripotent stem cell)를 SB431542, 및 CT99021을 포함하는 배지에서 1차 배양하는 단계; 및 (b) 상기 1차 배양된 세포에 NRG1 (neuregulin-1)을 추가로 첨가한 배지로 2차 배양하는 단계를 포함하는 다능성 줄기세포로부터 슈반 세포 전구체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 방법으로 제조된 슈반 세포 전구체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 제조된 슈반 세포 전구체를 NRG1 (neuregulin-1), 및 포스콜린 (forskolin)을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 다능성 줄기 세포로부터 슈반 세포를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 방법으로 제조된 슈반 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 제조된 슈반 세포 전구체에 NRG1, 포스콜린 (forskolin), 및 약학적으로 허용 가능한 담체와 혼합하는 단계를 포함하는, 슈반 세포 전구체를 포함하는 신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 제조된 슈반 세포를 약학적으로 허용 가능한 담체와 혼합하는 단계를 포함하는, 슈반 세포를 포함하는 신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 SB431542, CT99021, 및 NRG1 (neuregulin-1)을 포함하는 다능성 줄기세포로부터 슈반 세포 전구체로의 직접 분화 유도용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 NRG1, 및 포스콜린 (forskolin)을 포함하는 슈반 세포 전구체로부터 슈반 세포로의 분화용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 NRG1, 포스콜린 (forskolin), 슈반 세포 전구체, 및 슈반 세포를 포함하는 신경 질환 예방 또는 치료용 세포 치료제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 슈반 세포 전구체 또는 상기 슈반 세포를 포함하는 스크리닝용 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한, 본 발명의 하나의 양태는 (a) 다능성 줄기 세포 (pluripotent stem cell)를 SB431542, 및 CT99021을 포함하는 배지에서 1차 배양하는 단계; 및 (b) 상기 1차 배양된 세포에 NRG1 (neuregulin-1)을 추가로 첨가한 배지로 2차 배양하는 단계를 포함하는, 다능성 줄기세포로부터 슈반 세포 전구체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 구체적인 일 양태는 상기 다능성 줄기세포로부터 슈반 세포 전구체를 제조하는 방법은 신경 중간체 (neural intermediate) 단계를 거치지 않는 직접 분화 방법에 의한 것인, 슈반 세포 전구체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 슈반 세포 전구체를 제조하는 방법은 SB431542, 및 CT99021을 포함하는 배지에서 다능성 줄기 세포를 1차 배양한 후, NRG1을 추가로 포함하는 배지에서 2차 배양함으로써, 다능성 줄기 세포로부터 신경 중간체를 거치지 않고, 슈반 세포로 분화될 수 있는 슈반 세포 전구체를 직접 제조할 수 있다.
본 발명의 용어, “다능성 줄기 세포”는 삼배엽 (내배엽, 중배엽, 및 외배엽)의 모든 세포로 분화하는 능력을 갖춘 미분화 줄기 세포를 말한다. 생체외 배양조건에서 미분화성 다능성 줄기세포는 정상핵형을 유지한 상태로 다능성과 자가증식능(자가복제능)을 갖는다. 본 발명에서, 다능성은 전분화능 (pluripotent)과 다분화능 (multipotent)을 모두 포함할 수 있다. 전분화능인 다능성 줄기세포는 배성암세포(EC세포), 배성줄기세포(ES세포), 생식줄기세포(EG세포) 등을 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 다능성 줄기 세포는 인간 유래인 hESC (human embryonic stem cell) 또는 hiPSC (human induced pluripotent stem cell)일 수 있으나, 다능성을 가지는 한, 그 유래종은 이에 제한없이 포함된다.
본 발명의 용어, “슈반 세포 전구체”는 줄기 세포로부터 슈반 세포로 분화되는 과정 중에, 슈반 세포가 거치는 하나의 중간 단계로서, 구체적으로는 신경 능선 세포 (neural crest stem cell, NCSC) 및 미성숙한 미엘린 형성 전 슈반 세포 사이의 중간 단계 세포이다. 상기 슈반 세포 전구체는 분화되어 슈반 세포가 될 수 있다.
본 발명의 용어, “신경 중간체”는 슈반 세포 전구체를 제외한, 줄기 세포로부터 분화되는 중간 세포를 의미하고, 구체적으로는 신경 능선 줄기 세포 (neural crest stem cell, NCSC)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 종래에는 다능성 줄기 세포로부터 분화되는 NCSC를 슈반 세포 생산을 위한 전구세포로 이용하였으나, 시간, 비용, 기능성 측면에서 효율적인 최선의 방법이라고 볼 수 없다. 본 발명에서는 다능성 줄기 세포로부터 NCSC를 거치지 않고, 증식 가능한 슈반 세포 전구체를 직접 제조하였고, 이로부터 고유의 기능이 획득된 슈반 세포를 효율적으로 생산하였다. 상기 슈반 세포 전구체로부터 생산된 슈반 세포는 우수한 신경 재생 효과를 가짐을 확인하였다.
본 발명의 방법은 특정 배지 조성의 조합에 의해 다능성 줄기세포로부터 슈반세포 전구체로 직접 제조할 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 용어, “직접 제조”, 및 “직접 유도” 는 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명의 용어, “직접 제조”, 및 “직접 유도”는 다능성 줄기세포로부터 계통 제한적인 슈반 세포 전구체를 NCSC (neural crest stem cell) 분화 단계 없이 직접 계통-특이적으로 분화 (directed differentiation) 시킬 수 있는 방법을 의미한다. 즉, NCSC 분화 단계를 생략할 수 있는 방법으로, 슈반 세포 분화에 소요되는 전체 시간을 획기적으로 단축하여, 효능 (efficiency)를 증대시키고, 궁극적으로 기능을 증대 시킬 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 양태는 상기 1차 배양은 1일 내지 14일 동안 수행하고, 상기 2차 배양은 10일 내지 150일 동안 수행하는 것인, 슈반 세포 전구체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 실시예에서는 슈반 세포 전구체를 1 내지 14일 간의 1차 배양 후, 2차 배양할 경우, SCP-특이적 마커를 발현하는 것을 확인하였다 (도 14).
구체적으로, 상기 2차 배양은 5일 내지 150일, 더 구체적으로는 10일 내지 150일, 더욱 구체적으로는 10일 내지 100일, 더욱 구체적으로는 10일 내지 50일, 더욱 구체적으로는 10일 내지 30일 또는 15일 이상 동안 수행할 수 있다. 본 발명의 슈반 세포 전구체를 제조할 수 있는 기간은 제한 없이 포함된다.
본 발명의 구체적인 다른 양태는 상기 (a) 단계의 배지는 2 내지 20 μM의 SB431542 및 1 내지 10 μM의 CT99021을 포함하는 것이거나, 상기 (b) 단계의 배지는 20 내지 200 ng/ml의 NRG1을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "SB431542"는 TGF-β(transforming growth factor-β)의 특이적 억제자로서, 하기 화학식 1의 구조를 가진다.
[화학식 1]
Figure 112017007067608-pat00001
구체적으로, 상기 SB431542는 1 내지 100 μM, 더 구체적으로는 1 내지 50 μM, 더 구체적으로는 1 내지 30 μM, 더욱 구체적으로는 2 내지 20 μM의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, “CT99021”은 CHIR-99021 (CT99021)는 GSK-3α/β 억제자로서, CT99021, CHIR99021, CHIR 99021, CHIR-99021 또는 CT-99021으로도 명명될 수 있다. 하기 화학식 2의 구조를 가진다.
[화학식 2]
Figure 112017007067608-pat00002
구체적으로, 상기 CT99021은 1 내지 100 μM, 더 구체적으로는 1 내지 50 μM, 더 구체적으로는 1 내지 10 μM, 더욱 구체적으로는 1 내지 5 μM의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 “NRG1 (neuregulin-1)”은 NRG1 유전자에 의해 암호화되는 단백질로, EGFR 수용체에 작용한다.
구체적으로, 상기 NRG1은 1 내지 1000 ng/ml, 더 구체적으로는 10 내지 500 ng/ml, 더 구체적으로는 20 내지 200 ng/ml, 더욱 구체적으로는 50 내지 100 ng/ml 의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는 인간 다능성 줄기 세포 (hPSC)를 SB431542 (20 μM) 및 CT99021 (3 μM)을 포함하는 배지 neural differentiation medium, NDM)에서 1차 배양한 후, NRG1 (50 ng/ml)를 추가로 포함하는 슈반 세포 전구체 유도 배지 (Schwann cell precursor induction medium, SCPDM)으로 2차 배양하여, hPSC 유래의 슈반 세포 전구체 (SCP)를 생산할 수 있음을 확인하였다 (실시예 1). 특히, 상기 방법으로 제조된 슈반 세포 전구체는 SCP-특이적 마커인 CDH19, MPZ, GAP43, SOX10 등의 발현 수준이 높은 것을 확인하여, 본 발명의 방법에 따라 정상적인 슈반 세포 전구체가 생산되었음을 확인하였다 (실시예 2).
또한, 본 발명의 슈반 세포 전구체를 생산하는 방법은 인간 배아 줄기 세포 (human embryonic stem cell, hESC) 및 인간 유도 만능 줄기 세포 (human induced pluripotent stem cell, hiPSC)에서 모두 효과적으로 슈반 세포 전구체를 생산할 수 있음을 확인하여, 다능성 줄기 세포의 구체적인 유래에 무관하게 사용할 수 있음을 확인하였다. 한편, 상기 방법으로 제조된 슈반 세포 전구체는 신경 중간체인 신경 능선 줄기 세포 (NCSC)와도 구별되는 마커 발현 양상을 나타내어, NCSC와 구별되는 중간 세포임을 확인하였다 (실시예 3).
더 나아가, 본 발명의 다른 일 실시예에서는 상기 SB431542, CT99021, 및 NRG1 중 어느 하나만 생략되더라도 슈반 세포 전구체로의 유도가 불가능한 것을 확인하였으며, 이는 상기 세 물질의 조합이 슈반 세포 전구체의 생산에 필수적임을 시사한다 (실시예 4).
본 발명의 구체적인 다른 양태는, 상기 슈반 세포 전구체가 슈반 세포 또는 멜라노사이트 (melanocyte)로 분화 가능한, 슈반 세포 전구체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 방법으로 제조된 슈반 세포 전구체가 높은 확장성을 가지며, 장기간 유지 될 수 있을 뿐만 아니라, 슈반 세포 및 멜라노사이트로도 분화 가능한 다분화능을 가지는 것을 확인하였다 (실시예 5 내지 6).
본 발명의 구체적인 다른 양태는 상기 방법으로 제조된 슈반 세포 전구체를 제공하는 것이다.
본 발명의 방법으로 제조된 슈반 세포 전구체는 다능성 줄기세포로부터 분화된 최초의 슈반 세포 전구체이며, 상기 슈반 세포 전구체는 슈반세포, 멜라닌 세포 등으로 분화 가능한 다분화능, 높은 증식률(확장성) 및 장기간 유지 가능성을 가진다.
본 발명의 다른 양태는 (a) 다능성 줄기 세포 (pluripotent stem cell)를 SB431542, 및 CT99021을 포함하는 배지에서 1차 배양하는 단계; (b) 상기 1차 배양된 세포에 NRG1 (neuregulin-1)을 추가로 첨가한 배지로 2차 배양하는 단계; (c) 상기 배양된 배지로부터 슈반 세포 전구체를 회수하는 단계; 및 (d) 상기 회수된 슈반 세포 전구체를 NRG1, 포스콜린 (forskolin)을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 다능성 줄기 세포로부터 슈반 세포를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 양태는 상기 방법으로 제조된 슈반 세포를 제공하는 것이다. 본 발명의 방법으로 제조된 슈반세포는 다능성 줄기세포로부터 슈반 세포 전구체를 거쳐 제조된 슈반 세포이며, 슈반 세포-특이 마커 유전자인 S100B, OCT6, MPZ, Krox20, PMP22, NGFR, 및 PLP등에 양성발현을 나타내며, 동시에 BDNF, NGF, GDNF, 및 NT3등을 포함한 신경세포 영양인자를 분비하는 특징을 가진다. 신경 세포와 동시 배양을 할 경우, 신경세포의 축삭을 둘러쌀 수 있는 myelination 기능과 함께, 손상된 신경조직을 재생하는데 탁월한 효과를 가진다.
본 발명의 슈반 세포 제조 방법은 다능성 줄기 세포로부터 2단계 배양을 통해, 슈반 세포 전구체를 회수하고, 상기 슈반 세포 전구체를 NRG1, 레티노산, PDGF-BB, 및 포스콜린을 포함하는 배지에서 배양하여 슈반 세포를 제조하는 방법이다. 본 발명의 방법으로 제조된 슈반 세포는 슈반 세포의 미엘린 형성능 및 신경 영양 인자 분비능을 가져, 손상된 신경을 재생 및 복원할 수 있는 효과를 가진다.
본 발명의 용어, “다능성 줄기 세포”, “슈반 세포 전구체”, “SB431542”, “CT99021”, “NRG1”은 상술한 바와 같다.
본 발명의 용어, “슈반 세포”는 말초 신경계 내 신경교세포로서, 수초 형성, 신경 자극 전달, 신경 영양 인자 분비 등의 역할을 하며, 특히, 신경의 생존 및 축삭의 성장에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, NRG1 (200 ng/ml), 레티노산 (100 nM), PDGF-BB (10 ng/ml), 및 포스콜린 (4μM)을 포함하는, SC 분화 배지 (SC differentiation medium, SCDM) 또는 NRG1 및 포스콜린 (forskolin)로 슈반 세포 전구체를 분화시킴으로써, 슈반 세포를 생산할 수 있음을 확인하였다. 특히, 상기 제조된 슈반 세포는 슈반 세포 마커 (FAP, PLP, PMP22, S100 등)을 발현하며, 신경 영양 인자 (BDNF, GDNF, NGF, NT-3, NT-4, CNPase, CNTF 등)의 발현이 향상됨을 확인하였다 (실시예 7).
본 발명의 구체적인 일 양태는 상기 (d) 단계의 배지는 100 내지 300 ng/ml의 NRG1 및 1 내지 10 μM의 포스콜린을 포함하는 슈반 세포의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 다른 양태는 상기 (d) 단계의 배지는 레티노산 (retinoic acid) 및 PDGF-BB (platelet-derived growth factor-BB)를 추가로 포함하는 슈반 세포의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 다른 양태는 상기 (d) 단계의 배지가 100 내지 300 ng/ml의 NRG1, 50 내지 150 nM의 레티노산, 5 내지 15 ng/ml의 PDGF-BB, 및 1 내지 10 μM의 포스콜린을 포함하는, 슈반 세포의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 슈반 세포 제조를 위한 배지에는 1 내지 1000 ng/ml, 더 구체적으로는 10 내지 500 ng/ml, 더 구체적으로는 100 내지 300 ng/ml의 NRG1이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, “레티노산 (retinoic acid)”은 비타민 A가 체내에서 분해될 때 생성되는 대사 산물이며, C20H28O2의 화학식을 가진다. 대장암 억제, 류머티즘 치료 등의 효과를 가지는 것으로 알려져 있다. 구체적으로, 상기 레티노산은 1 내지 300 nM, 더 구체적으로, 10 내지 200 nM, 더 구체적으로 50 내지 150 nM의 농도로 배지에 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, “PDGF-BB (Platelet-Derived Growth Factor-BB)”는 PDGFB 유전자로부터 암호화되는 PDGFB의 이량체 (homodimer)이다. 구체적으로 상기 PDGF-BB는 1 내지 100 ng/ml, 더 구체적으로, 1 내지 50 ng/ml, 더 구체적으로는 5 내지 15 ng/ml의 농도로 배지에 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, “포스콜린 (forskolin)”은 Indian Coleus plant (Plectranthus barbatus)에서 생산되는 labdane diterpene이다. 구체적으로, 상기 포스콜린은 1 내지 100 μM, 더 구체적으로 1 내지 50 μM, 더 구체적으로는 1 내지 10 μM의 농도로 배지에 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구체적인 일 양태는 상기 슈반 세포는 미엘린 형성능 (myelination) 및 신경 영양 인자 (neurotrophic factor)의 분비능을 가지는 것인, 슈반 세포의 제조 방법을 제공하는 것이다. 구체적으로, 상기 신경 영양 인자는 BDNF, GDNF, NGF, 또는 NT-3일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명의 방법에 따라 제조된 슈반 세포가 미엘린 형성 능 및 신경 영양 인자 (NGF, BDNF, GDNF, NT-3)를 정상적으로 분비하는 것을 확인하였다 (실시예 8).
본 발명의 또 다른 일 양태는 (a) 다능성 줄기 세포 (pluripotent stem cell)를 SB431542, 및 CT99021을 포함하는 배지에서 1차 배양하는 단계; (b) 상기 1차 배양된 세포에 NRG1 (neuregulin-1)을 추가로 첨가한 배지로 2차 배양하는 단계; (c) 상기 배양된 배지로부터 슈반 세포 전구체를 회수하는 단계; (d) 상기 회수된 슈반 세포 전구체를 NRG1, 및 포스콜린 (forskolin)을 포함하는 배지에서 배양하는 단계; (e) 상기 배지로부터 슈반 세포를 회수하는 단계; 및 (f) 상기 회수된 슈반 세포를 약학적으로 허용 가능한 담체와 혼합하는 단계를 포함하는, 슈반 세포를 포함하는 신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 일 양태는 상기 방법으로 제조된 슈반 세포를 포함하는 신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 구체적인 일 양태는 상기 (d) 단계의 배지는 레티노산 (retinoic acid) 및 PDGF-BB (platelet-derived growth factor-BB)를 추가로 포함하는 것인 신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 구체적인 일 양태는 상기 신경 질환은 퇴행성 신경질환, 탈수초 신경질환, 근위축성 측색경화증, 외상성 척수질환 또는 말초신경질환인 것인, 신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 용어, “신경 질환”은 신경계 관련 질환을 의미하며, 형성된 미엘린 (수초) 또는 축삭의 외적, 내적 요인에 따른 손상, 퇴행 또는 기능의 상실, 신경 세포의 손실 또는 손상 등으로 유발 될 수 있는 질환이며, 구체적으로는 퇴행성 신경질환, 탈수초 신경질환, 근위축성 측색경화증, 외상성 척수질환 또는 말초신경질환일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 슈반 세포 제조 방법으로 제조되는 슈반 세포는 미엘린을 형성하고, 다양한 신경 영양 인자를 분비할 수 있어, 손상된 신경의 복원 및 재생을 통해, 상기와 같은 신경 질환을 예방 또는 치료하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 포함되는 슈반 세포는 미엘린 형성능 및 신경 영양 인자 분비능을 가지므로, 신경 재생 및 복원 효과를 통해 신경 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 슈반 세포가 이식된 좌골 신경이 손상된 마우스가 대조군에 비하여 신경 재생 효과가 우수한 것을 확인하였으며 (실시예 9), 이는 본 발명의 방법에 따라 제조된 슈반 세포가 미엘린 형성, 신경 영양 인자 분비 등을 통해 신경 관련 질환에 대해 예방 또는 치료 효과를 가질 수 있음을 뒷받침한다.
본 발명의 용어, “약학적으로 혀용 가능한 담체”는 경구투여시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화 할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 (a) 다능성 줄기 세포 (pluripotent stem cell)를 SB431542, 및 CT99021을 포함하는 배지에서 1차 배양하는 단계; (b) 상기 1차 배양된 세포에 NRG1 (neuregulin-1)을 추가로 첨가한 배지로 2차 배양하는 단계; (c) 상기 배양된 배지로부터 슈반 세포 전구체를 회수하는 단계; 및 (d) 상기 회수된 슈반 세포 전구체에 NRG1, 포스콜린 (forskolin), 및 약학적으로 허용 가능한 담체와 혼합하는 단계를 포함하는, 슈반 세포 전구체를 포함하는 신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 방법으로 제조된 슈반 세포 전구체를 포함하는 신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 구체적인 일 양태는 상기 (d) 단계는 회수된 슈반 세포 전구체에 레티노산 (retinoic acid) 및 PDGF-BB (platelet-derived growth factor-BB)를 추가로 혼합하는 것인 슈반 세포의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 슈반 세포 전구체를 포함하는 신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제조하는 방법은 슈반 세포 전구체, 및 상기 슈반 세포 전구체를 분화시키는데 필요한 다양한 물질을 함께 포함하는 조성물을 제조함으로써, 슈반 세포로의 분화를 유도함으로써, 신경 질환에 대한 예방 또는 치료 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 방법으로 제조된 슈반 세포 전구체 또는 슈반 세포를 포함하는 신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 다양한 경로를 통해 투여될 수 있으며, 특히 세포 치료제의 형태로 투여될 수 있다.
상기 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 비경구 투여, 예를 들어, 복강내 투여, 정맥내 투여(intravenous therapy, i.v), 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 약학적 조성물에 포함되는 슈반 세포 또는 슈반 세포 전구체의 함량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 환자의 연령, 체중, 일반건강상태, 성별 및 식이, 투여경로 등 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 포함하는 것이 중요하다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 방법으로 제조된 약학 조성물을 포함하는 세포 치료제를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 NRG1, 포스콜린 (forskolin), 및 슈반 세포 전구체를 포함하는 신경 질환 예방 또는 치료용 세포 치료제를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 NRG1, 레티노산 (retinoic acid), PDGF-BB, 포스콜린 (forskolin), 및 슈반 세포 전구체를 포함하는 신경 질환 예방 또는 치료용 세포 치료제를 제공한다.
본 발명의 용어, “세포 치료제”는 살아있는 세포를 환자에게 직접 주입할 수 있는 형태의 약물이며, 살아있는 자가세포, 동종세포 또는 이종세포를 체외에서 배양, 증식하거나 선별하는 등 물리적, 화학적 또는 생물학적 방법으로 조작하여 제조하는 의약품에 해당한다.
상기 세포치료제의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 비경구 투여, 예를 들어, 복강내 투여, 정맥내 투여(intravenous therapy, i.v), 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 세포치료제가 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 SB431542, CT99021, 및 NRG1 (neuregulin-1)을 포함하는, 다능성 줄기세포로부터 슈반 세포 전구체로의 직접 분화 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다능성 줄기 세포로부터 슈반 세포 전구체로의 직접 분화 유도용 조성물은 신경 중간체를 거치지 않고, 다능성 줄기 세포로부터 슈반 세포 전구체로 직접 분화를 유도할 수 있는 것으로, 슈반 세포로 분화할 수 있는 슈반 세포 전구체를 다능성 줄기 세포로부터 직접 생산할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 NRG1, 및 포스콜린 (forskolin)을 포함하는 슈반 세포 전구체로부터 슈반 세포로의 분화용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 NRG1, 레티노산 (retinoic acid), PDGF-BB, 및 포스콜린 (forskolin)을 포함하는, 슈반 세포 전구체로부터 슈반 세포로의 분화용 조성물을 제공한다.
본 발명의 슈반 세포 전구체로부터 슈반 세포로의 분화용 조성물은 슈반 세포 전구체로부터 슈반 세포로 분화시킬 수 있는 조성물로서, 상기 조성물로 분화된 슈반 세포는 미엘린 형성능 및 신경 영양 인자 분비능을 가져 신경 재생 및 손상된 신경의 복원 효과를 가져, 신경 관련 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 방법으로 제조된 슈반 세포 전구체를 포함하는 스크리닝용 키트를 제공한다.
상기 스크리닝용 키트는 신경 질환 예방 또는 치료제 스크리닝용 키트 또는 슈반 세포로의 분화 유도 물질 스크리닝용 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이와 같은 키트는 생체외 (ex vivo) 또는 시험관 내 (in vivo) 등에서 자유롭게 실험을 수행할 수 있다.
구체적으로, 상기 키트는 후보 물질을 슈반 세포 전구체에 처리한 후, 상기 슈반 세포 전구체의 특정 유전자 또는 단백질의 발현량을 측정, 비교함으로써 후보 물질을 신경 질환의 예방 또는 치료제 또는 분화 유도 물질로서 선별하는데 이용하는 것일 수 있다.
상기 스크리닝용 키트는 유전자 또는 단백질의 발현량을 측정하는 제제 (안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍, 프로브, 항체, 앱타머, 등)을 추가로 포함할 수 있고, 또한, 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용설명서를 추가로 포함할 수 있다. 사용설명서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 방법으로 제조된 슈반 세포를 포함하는 스크리닝용 키트를 제공한다.
상기 스크리닝용 키트는 신경 질환 예방 또는 치료제 스크리닝용 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 키트는 신경 질환 예방 또는 치료 후보 물질을 슈반 세포 에 처리한 후, 상기 슈반 세포의 특정 유전자 또는 단백질의 발현량을 측정, 비교함으로써 후보 물질을 신경 질환의 예방 또는 치료제로서 선별하는데 이용하는 것일 수 있다.
본 발명의 다능성 줄기 세포로부터 슈반 세포 전구체를 제조하는 방법은 신경 능선 중간체 (neural crest intermediate) 단계를 거치지 않으므로, 신속하고 효율적인 슈반 세포 전구체의 생산이 가능하다. 또한, 상기 슈반 세포 전구체로부터 제조된 슈반 세포는 미엘린 형성능 및 신경 영양 인자 분비능을 가져, 신경 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
도 1은 hPSC의 hSCP로의 직접 분화를 나타낸 도이다. 도 1의 A는 hPSC의 SCP로의 분화를 개략적으로 나타낸 도이다. H9 hESC는 6일간의 신경 분화 배지 (neural differentiation medium, NDM)의 처리로 인해 신경 로제트 (neural rosettes)로 분화하였다. 상기 신경 로제트의 세포는 0일차에 다시 플레이팅하였으며, 슈반 세포 전구체 분화 배지 (Schwann cell precursor differentiation medium, SCPDM)에서 추가적으로 유지하였다. 아래의 도면은 대표적인 명시야 (bright-field) 이미지로서, hSCP로의 분화 과정을 나타낸다. Scale bars는 100 μm이다. 도 1의 B는 hSCP로의 분화 과정 동안 qPCR analysis of NCSC-특이적 마커 (PAX3 ,TWIST ,및 SLUG), NCSC- 및 SCP-특이적 마커 (FOXD3, NGFR, and SOX10), 및 SCP-특이적 마커 (CDH19, GAP43, and MPZ) 의 qPCR 분석 결과를 나타낸 도이다. Mean ± SE (n=3)으로 나타내었다. 도 1의 C는 분화 8일차 및 18일차에서 SOX10 (green) 및 GAP43 (red)에 대한 면역세포화학 염색 결과를 나타낸 도이다. DAPI (blue)는 세포 핵을 염색하기 위해 사용하였다. Scale bars는 100 μm이다. 도 1의 D는 유세포 분석 결과를 나타낸 도이다. 유세포 분석은 SCP의 생성 동안 SOX10을 발현하는 세포의 수를 측정하기 위해 이용되었다. 모든 값은 hESC에 대한 상대 값으로 나타내었다 (day -6).
도 2는 hPSc-SCP의 유전자 어레이 분석 결과를 나타낸 도이다. 도 2의 A는 다능성 세포, 신경 줄기 세포, 신경 능선 세포 (neural crest cell), 슈반 세포 전구체, 슈반 세포, 및 멜라노사이트(melanocyte)에 연관된 유전자의 발현 수준 (fold change)을 H9 hESC-SCPs 및 hiPSC-SCPs 간에 비교하였다. 마이크로어레이 분석은 SCP 분화 후 29일 차에 수행하였다. 모든 값은 분화되지 않은 hESC (day -6)에 대한 상대 값으로 나타내었으며, Mean ± SE (n=4)으로 나타내었다. H9 hESC, hiPSC, hESC-SCP, 및 hiPSC-SCPSCP에서 마커 유전자 (CDH19, GAP43, MPZ, 및 SOX10)의 발현 분석은 qPCR을 이용하여 수행하였다. 도 2의 B는 반-정량 RT-PCR 분석 결과이다. Mean ± SE (n=3)으로 나타내었다. 도2의 C는 각 마커 유전자의 RT-PCR 분석 결과이다.
도 3은 hSCP를 hNCSC와 비교하여, hPSC-SCP의 특성을 확인한 결과를 나타낸 도이다. 도 3의 A는 2 hiPSC 세포주, 2 hESC-NCSC 세포주 (hNCSCs), 및 2 hESC-SCP 세포주 (hSCPs)의 6개 샘플에서 유의미하게 다른 발현 (3,666 significant transcripts (one-way ANOVA, p<0.01))을 보이는 유전자의 집합의 계층적 클러스터링한 결과이다. 히트 맵 (heat map)은 분화되지 않은 hESC에 정규화된 log10 fold change의 상대값을 나타낸다. 도 3의 B는 hESC-NCSCs (hNCSCs) 및 hESC-SCPs (hSCPs)에서 유전자 어레이 분석 결과를 나타낸 도이다. 슈반 세포 및 신경 능선과 연관된 유전자의 발현 수준 (fold change)은 분화되지 않은 hESC (day -6)의 유전자와 비교하여 나타내었다. Mean ± SE (n=3)으로 나타내었다. 도 3의 C는 H9 hESCs, hSCPs 및 hNCSCs에서 SCP 마커 및 NCSC 마커의 qPCR 분석 결과를 나타낸 도이다. 도 3의 D는 hSCPs 및 hNCSCs에서 SOX10 (red), NGFR (red), 및 GAP43 (red)을 이용한 면역세포화학 분석 결과를 나타낸 도이다. 세포의 핵은 DAPI (blue)를 이용하여 염색하였다. Scale bar는 50 μm이다.
도 4는 NRG1, CT 및 SB가 hPSC로부터 hSCP을 생산하는데 필요하다는 것을 확인한 도이다. 도 4의 A는 D0일차에 Nestin (green) 및 ZO1 (red)을 면역세포화학 염색하여 신경 로제트 (neural rosettes)를 나타내는 도이다. H9 hESC를 신경 분화 배지 (neural differentiation medium, NDM)로 6일간 처리하였으며, DAPI (blue)는 세포 핵을 염색하기 위해 사용하였다. Scale bar는 100 μm이다. 도 4의 B는 hPSC (hESCs 및 hiPSCs)로부터 hSCP를 NRG1를 SB431542 (SB) 및 CT99021 (CT)와 조합하여 처리하여 생산한 결과를 나타낸 도이다. 본 발명자들의 분화 조건 하에서, 배지에서 NRG1, SB 또는 CT가 생략되는 경우, hSCP를 생산하는데 실패하였다. 도 4의 C는 NRG1 또는 SB와 같은 화합물이 결여된 분화 배지에서 hESC를 hSCP로 분화시킨 11일차의 명시야 이미지 (bright-field image)이다. Scale bar는 100 μm이다. 도 4의 D는 다양한 농도의 NRG1로 처리하여 hSCP 유도 과정 동안 SCP 마커 (MPZ 및 SOX10)의 qPCR 결과를 나타낸 도이다. 도 4의 E는 hESC로부터 hSCP로의 분화 14일 차의 명시야 이미지이다. 면역 염색 결과는 SOX10-양성 세포의 수는 분화 후 14일차에 NRG1의 농도에 의존한다는 것을 나타낸다. 세포의 핵은 DAPI (blue)로 염색하였다. Scale bar는 100 μm이다. 도 4의 F는 H1 hESCs, H7 hESCs, H1 hESC-SCPs, 및 H7 hESC-SCPs에서 SCP 마커 유전자 (CDH19, MPZ, 및 SOX10)의 발현 분석을 qPCR을 통해 수행한 결과를 나타낸 도이다. Mean ± SE (n=3)으로 나타내었다. 도 4의 G는 분화 24일차에 SOX10 (green) 및 GAP43 (red)을 면역세포화학 염색한 결과를 나타낸다. DAPI (blue)는 세포 핵을 염색하기 위해 사용하였다. Scale bar는 100 μm이다.
도 5는 hSCP가 확장될 수 있고, 장기간의 배양 동안 유지될 수 있을 확인한 결과를 나타낸 도이다. 도 5의 A는 hPSC의 hSCP로의 분화 및 생산되는 세포의 수를 개략적으로 나타낸 도이다. 도 5의 B는 초기 계대 (p1) 및 후기 계대 (p20)의 H9 hESC 유래 hSCP에서 SCP 마커 (CDH19, GAP43, ITGA4 MPZ, NGFR, and SOX10)의 qPCR 분석 결과를 나타낸 도이다. Mean ± SE (n=3)으로 나타내었다. 도 5의 C는 H9 hESC 유래 hSCP (passage 20)에서 SCP 마커인 SOX10 (red), NGFR (red), 및 GAP43 (red)의 면역세포화학 염색 결과를 나타낸 도이다. Ki67 (red)는 세포 증식 마커로 사용되었다. 세포의 핵은 DAPI (blue)로 염색하였다. Scale bar는 50 μm이다. 도 5의 D는 초기 계대 (p1) 및 후기 계대 (p20)의 H9 hESC 유래 hSCP에서의 hSCP 마커 (SOX10, NGFR, MPZ 및 GAP43) 에 대한 유세포 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 hSCP가 자가-증식하며 장기간의 배양 후에도 hSCP 특성을 유지함을 확인한 결과를 나타낸 도이다. 도 6의 A는 H9 hESC 유래 초기-계대 hSCP (p1) 및 후기-계대 hSCPs (p19)의 마이크로어레이 분석 결과를 나타낸 도이다. 히트 맵 (heat map)은 분화되지 않은 hESC의 값에 대한 log10 fold change의 상대값을 나타낸다. 도 6의 B 및 C는 초기 계대 (p5) hSCPs 및 후기 계대 (p25) hSCPs에서 SCP 마커 (CDH19, GAP43, ITGA4, MPZ, NGFR, and SOX10)를 이용하여 각각 qPCR (B), RT-PCR (C) 분석 결과를 나타낸 도이다. Mean ± SE (n=4)으로 나타내었다.
도 7은 hSCP가 슈반 세포로 효율적이고 빠르게 분화할 수 있음을 확인한 도이다. 도 7의 A는 0일차, 4일차, 7일차, 및 20일차에서 hSCP에서 슈반 세포로 분화하는 과정을 보여주는 명시야 이미지이다. Scale bar는 100 μm이다. 도 7의 B는 hSCP-유래 슈반 세포 분화 동안 신경 성장 인자인 BDNF, CNTF, GDNF, NGF, NT-3, 및 NT-4에 대한 qPCR 결과를 나타낸 도이다. Mean ± SE (n=4)으로 나타내었다. 도 7의 C는 슈반 세포 마커인 NGFR (green) 및 S100 (red)을 분화 18일 경과 후 면역 염색한 결과를 나타낸 도이다. 세포의 핵은 DAPI (blue)로 염색하였다. Scale bar는 100 μm이다. 도 7의 D는 H9 hESC-SCP가 멜라노사이트로 분화되었음을 확인한 도이다. 상기 hESC-SCP는 EDN3, FGF2, cAMP, Wnt 및 BMP4 신호 전달 인자를 포함하는 분화 배지를 이용하여 분화되었으며, 상기 분화된 세포는 16일 내에 착색 되었다 (pigmented). 도 7의 E는 SCP 유래 멜라노사이트의 분화 과정 동안 멜라닌 형성 (melanogenesis)에 연관된 유전자인 MITF, TYR, 및TYRP1 의 qPCR 결과를 나타낸 도이다. Mean ± SE (n=3)으로 나타내었다. 도 7의 F는 멜라노사이트 마커인 MITF (red) 및 MelA (red)의 hSCP 유래 멜라노사이트의 면역 세포 화학 분석 결과를 나타낸 도이다. 세포 핵은 DAPI (blue)로 염색하였다. Scale bar는 100 μm이다. 도 7의 G는 왼쪽 튜브의 분화되지 않은 hSCP와 달리, 오른쪽 튜브의 분화된 세포의 세포 펠렛 (pellet)은 완전히 착색되었음을 확인하였음을 나타낸 도이다.
도 8은 hSCP-SC가 이식된 마우스의 재생된 좌골 신경으로 통합되었음을 나타낸 도이다. 도 8의 A는 MBP (red) 및 CASPR (white)을 면역 염색한, H9-hESC-SCP 유래 슈반 세포에 의해 재생되도록 유도된 신경의 종단면이다. 세포의 핵은 DAPI (blue)으로 염색하였다. 대부분의 이식된 GFP 표지된 슈반 세포는 원위 영역에서 관찰되었다. Scale bar는 200 μm이다. 도 8의 B는 MBP가 면역 염색된 세로 부분이다. 높은 배율의 도는 이식된 슈반 세포가 MBP에 양성임을 나타낸다. Scale bar는 200 μm이다.
도 9의 A는 hSCP의 슈반 세포로의 분화를 개략적으로 나타낸 도이다. 아래도면은 hSCP-SC로의 분화 동안 세포의 대표적인 위상 대조 이미지이다. Scale bar는 200 μm이다. 도 9의 B는 H9 hESC-SCP의 hSCP-SC로의 분화 과정 동안 슈반 세포 마커 유전자인 GFAP, PLP, PMP22, 및 S100의qPCR 결과를 나타낸 도이다. Mean ± SE (n=3)으로 나타내었다. 도 9의 C는 분화 10일 경과 후에 수득한 hSCP-유래 슈반 세포에서 신경 영양 인자인 BDNF, GDNF, 및 NGF, 및 슈반 세포 마커 유전자인 MPZ, MBP NGFR, PMP22, S100, 및 SOX10의 qPCR 분석 결과를 나타낸 도이다. GAPDH에 대한 표시된 유전자의 mRNA 발현 수준 비율은 2-dCt로 정의된다. Mean ± SE (n=5)로 나타내었다. 도 9의 D는 분화 10일 후, 슈반 세포 마커 (NGFR (green), S100 (red), EGR2 (green) 및 MPZ (red))에 대한 면역 염색 결과를 나타낸 도이다. 세포의 핵은 DAPI (blue)로 염색하였다. Scale bars는 100 μm이다. 도 9의 E는 hSCP의 유전자 발현 수준을 hSCP-SC 및 일차 인간 슈반 세포의 유전자 발현 수준과 비교하기 위한 마이크로어레이 분석 결과를 나타낸 도이다. 히트 맵 (heat map)은 분화되지 않은 H9 hESC에 대한 log10 fold change의 상대 값을 나타낸다.
도 10은 hSCP-유래 슈반 세포가 미엘린을 형성하고 신경 영양 인자를 분비하는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다. 도 10의 A는 H9 hESC-SCP 유래의 분화된 슈반 세포를 랫트 DRG (rat DRG) 와 함께 28일간 공동 배양하고, MBP (red), TUJ1 (green), 및 인간 핵 (human nuclear, hNU, gray)에 대해 면역 염색한 결과를 나타낸 도이다. 위의 확대된 박스쳐진 영역은 hNU-양성 세포가 MBP와 함께 공동 염색되었음을 나타낸다. 중간의 MPZ-양성 세포를 표시하는 박스 표시된 영역의 수직적 재구성은 뉴로필라멘트 (neurofilament)를 둘러 싸고 있다. 아래의 미엘린 형성하지 않은 슈반 세포의 대부분은 슈반 세포 마커인 S100B이 염색되었다. Zen 소프트웨어를 이용한 2.5D 재건 (reconstruction)을 보여주는 높은 배율의 박스 표시된 영역의 화살표는 정렬된 뉴로필라멘트에 슈반 세포가 존재하는 것을 보여주고 있다. 슬라이스의 두께는 0.34 μm이다. Scale bar는 50 μm이다. 도 10의 B는 슈반 세포에 의해 분비되는 것으로 알려진 신경 영양 인자 BDNF, GDNF, NGF, 및 NT3이 hSCP로부터 hSCP-SC로의 후-분화 (post-differentiation) 18일 경과 후 상당히 증가한 것을 나타내는 도이다. Mean ± SE (n=4)으로 나타내었으며, #는 신경 영양 인자가 검출되지 않았음을, *는 t-테스트를 이용하여 SCP 및 SCP-SC를 비교하여 p<0.01 인 경우를 나타낸다.
도 11은 hSCP-유래 슈반 세포가 in vivo에서 말초 신경의 재생을 촉진하였음을 확인한 도이다. 도 11의 A는 실험 개략도이다. 8주령의 수컷 마우스를 좌골 신경 손상 모델로 이용하였다. 5 μl의 매트리겔 (Matrigel) 또는 매트리겔 및 SCP-SC의 혼합물 (Marigel plus SCP-SCs mixture)을 손상된 부분에 이식하였다 (red circle). 도 11의 B는 손상된 신경 영역에 hSCP 유래 슈반 세포를 이식한 후 좌골 신경 재생의 대표적 이미지이다 (손상 8주후). 도 11의 C는 손상 8주차에 자로 절단된 좌골 신경의 길이를 측정한 결과이다. Mean ± SE (n=6)으로 나타내었다. 도 11의 D는 손상 8주 경과 후, GFP-표지된 hSCP-SC에 의해 재생이 유도된 좌골 신경의 종단면, 및 S100B (red) 및 NF (violet)을 면역 염색한 결과를 나타낸 도이다. 삽도에서 높은 배율의 이미지는 이식된 (grafted) GFP-표지된 슈반 세포가 생존하였으며, S100B로 염색되었음을 나타낸다. Scale bar는 500 μm이다. 도 11의 E는 매트리겔 (대조군) 또는 매트리겔 및 hSCP-SC (Matrigel plus hSCP-SCs)가 이식된 마우스의 발자국 패턴을 대표적으로 나타낸 도이다. 도 11의 F는 hSCP-SC가 이식된 마우스와 대조군의 발자국을 SFI로 정량화한 결과이다. Mean ± SE (n=6)으로 나타내었다. *는 t-테스트를 이용하여 대조군 및 SCP-SC를 비교하여 p<0.01인 경우이다.
도 12는 hPSC로부터 hSCP를 통해 매우 정제된 슈반 세포의 집단을 생성할 수 있음을 확인한 결과이다. 배양 배지의 연속적인 처리에 의해 자가-재생하는 hSCP를 통해 hPSC로부터 매우 균질의 기능적인 슈반 세포를 생성하는 간단한 프로토콜을 도면에 요약하였다.
도 13은 레티노산 및 PDGF-BB를 포함하지 않는, NRG1 및 포스콜린만을 포함하는 SCPDM에서 슈반 세포 전구체를 분화 시킨 결과를 나타낸 도이다. 분화 후 5일과 8일에서 각각 슈반 세포 마커인 S100B (red) 및 PLP (green)을 면역 염색한 결과, 8일만에 슈반 세포로 분화 되었음을 나타낸다.
도 14는 1차 배양액 (NDM)에서 hPSC를 1 내지 14일간 배양한 후, 배지를 SCPDM으로 교체하여 배양한 결과를 나타낸 도이다. hESCs와 iPSCs 로부터 각각 1차배양액 NDM에서 1일, 6일, 14일동안 배양한 후 2차 배양액 SCPDM으로 교체 배양 한후 24일째 세포의 슈반 세포 전구체 마커인 SOX10, NGFR, 및 MPZ의 상대적 발현량을 모두 증가 했음을 보여 준다.
이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 좀 더 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 인간 다능성 줄기 세포 (human pluripotent stem cell, hPSC)로부터 슈반 세포 전구체(Schwann cell precursor, SCP)로의 분화
인간 다능성 줄기 세포 (human pluripotent stem cell, hPSC)로부터 분화되는 신경 능선 줄기 세포 (Neural crest stem cell, NCSC)는 슈반 세포 생산을 위한 유용한 원천으로 여겨졌으나, 직접적인 활용에는 여러 한계가 있었으며, 특히, 간단하면서 신속하고 효율적이면서도 저비용의 제조 방법이 존재하지 않는 것이 가장 큰 문제였다.
본 발명자들은 NCSC 및 슈반 세포의 중간 전구체로서 기능하는, 계통-제한된 슈반 세포 전구체 (SCP)가 hPSC로부터 직접 생산될 수 있는지 여부를 확인하고자 하였다. 상기와 같이 hPSC로부터 SCP가 직접 생산될 경우, NCSC 분화 단계를 생략할 수 있으며, 따라서 SC 분화에 필요한 시간을 절약할 수 있고, 효율성을 향상할 시킬 수 있다.
이를 위해, 인간 신생아 포피 섬유모세포 (human newborn foreskin fibroblasts, catalog number CRL-2097; ATCC) 유래의 H1, H7 및 H9 hESC (WiCell Research Institute), 및 hiPSC를 기존에 공지된 바와 배양하였다. 무지지세포(feeder-free) 배양을 위해, 세포를 mTeSR1 배지 (StemCell Technologies)에서 성장 인자-감소된 매트리겔 (growth factor-reduced Matrigel, BD biosciences)로 코팅된 디쉬 상에서 매일 배지를 교체하면서 성장시켰다.
인간 다능성 줄기세포에서 유래된 슈반 세포 전구체를 수득하기 위해, colonized hPSC를 성장 인자-감소된 매트리겔로 코팅된 배양 디쉬 (growth factor-reduced Matrigel-coated culture dishes)에 다시 플레이팅 하였다. 다음날, 배양 배지를 hPSC 배양 배지에서 SB431542 및 CT99021을 포함하는 수정된 신경 분화 배지 (modified neural differentiation medium, NDM)로 교체하여 중화시켰으며, 6일간 신경 로제트 (neural rosette)를 형성하였다. 구체적으로, 상기 NDM은 1x N2, 1x B27, 0.005% BSA, 2 mM Glutamax, 0.11 mM β-mercaptoethanol, 3 μM CT 99021 (Tocris Biosciences), 20 μM SB431542 (Tocris Biosciences) 을 함유하는 advanced DMEM/F12 및 Neurobasal medium (1:1 혼합)을 포함한다. 상기 SB431542는 transforming growth factor-β (TGF-β)/Activin/Nodal 전달 경로)의 특이적 억제자이며, CT99021는 glycogen synthase kinase-3 (GSK-3)의 특이적 억제자로 알려져 있다.
분화 6일 경과 후, 상기 배지를 50 ng/ml NRG1를 포함하는 신경 유도 배지 (이를 슈반 세포 전구체 유도 배지 (Schwann cell precursor induction medium, SCPDM로 명명한다)로 대체하였으며, 매일 교체하였다. 세포는 80% 밀도 (confluence)에 도달하면 Accutase를 처리하여 분리하였다. 또한 상기 세포를 SCPDM에서 추가적으로 배양함으로써 확장 (expand) 하였다 (D0 to D18, 도 1의 A). 분화 약 18일이 경과한 후, hPSC-유래 SCP가 생성되며, 분화된 SCP가 동질 (homogenous)의 세포군 (cell population)을 형성하였으며 약 30시간의 배가 시간 (doubling time)을 가져 높은 증식능을 가지는 것을 확인하였다 (도 1의 A). hPSC-유래 SCP의 유도 및 유지를 위해 SCPDM을 사용하였다.
실시예 2: 인간 다능성 줄기 세포 (human pluripotent stem cell, hPSC)로부터 분화된 슈반 세포 전구체(Schwann cell precursor, SCP)의 마커 발현 확인
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 제조된 hPSC-유래 SCP가 슈반 세포 전구체로서의 특성을 가지는지 확인하고자 하였다.
구체적으로, 본 발명자들은, 실시간 qPCR 및 면역세포화학법을 이용하여 유도된 SCP의 계통 특이적인 마커의 발현을 확인하고자 하였다.
먼저, 실시간 qPCR은 하기와 같은 방법으로 수행하였다. RNeasy Mini 키트를 제작자의 지시에 따라 이용하여 배양된 세포로부터 총 RNA를 추출하였으며, RNA (2 μg)를 SuperScript?VILOTM cDNA Synthesis 키트를 제작자의 지시에 따라 이용하여 역전사 시켰다 (Thermo Fisher Scientific). 정량적 중합효소 연쇄 반응 (quantitative polymerase chain reaction, qPCR)을 SYBR green과 함께 수행하였으며, 7500 Fast Real-Time PCR system (Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 분석하였다. 사용된 프라이머는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
Gene Sequence (5'-->3') 서열번호
PAX3 정방향 AGC TCG GCG GTG TTT TTA TCA 서열번호 1
역방향 CTG CAC AGG ATC TTG GAG ACG 서열번호 2
TWIST 정방향 GTC CGC AGT CTT ACG AGG AG 서열번호 3
역방향 GCT TGA GGG TCT GAA TCT TGC T 서열번호 4
SOX10 정방향 CCT CAC AGA TCG CCT ACA CC 서열번호 5
역방향 CAT ATA GGA GAA GGC CGA GTA GA 서열번호 6
FOXD3 정방향 GAC GCA GGT TGC GAT AGC C 서열번호 7
역방향 CGC CTC CTT GGG CAA TGT C 서열번호 8
MPZ 정방향 AAG TGC CAA CTA GGT ACG GG 서열번호 9
역방향 CAT AGC ACT GAG CCT CCT CT 서열번호 10
CDH19 정방향 ACA AGC GTC TGT AAC TCT GGG 서열번호 11
역방향 AGC AAA CTT CGT GTT GGA CA 서열번호 12
NGFR 정방향 TGG CCT ACA TAG CCT TCA AGA 서열번호 13
역방향 GAG ATG CCA CTG TCG CTG T 서열번호 14
GAP43 정방향 GGC CGC AAC CAA AAT TCA GG 서열번호 15
역방향 CGG CAG TAG TGG TGC CTT C 서열번호 16
NANOG 정방향 CTC AGC CTC CAG CAG ATG C 서열번호 17
역방향 TAG ATT TCA TTC TCT GGT TCT GG 서열번호 18
GAPDH 정방향 ACA ACT TTG GTA TCG TGG AAG G 서열번호 19
역방향 GCC ATC ACG CCA CAG TTT C 서열번호 20
SLUG 정방향 CGA ACT GGA CAC ACA TAC AGT G 서열번호 21
역방향 CTG AGG ATC TCT GGT TGT GGT 서열번호 22
FABP7 정방향 GCA CAT TCA AGA ACA CGG AGA 서열번호 23
역방향 CAC ATC ACC AAA AGT AAG GGT CA 서열번호 24
S100 정방향 GAC CCT CAT CAA CGT GTT CCA 서열번호 25
역방향 CCA CAA GCA CCA CAT ACT CCT 서열번호 26
SOX17 정방향 GTG GAC CGC ACG GAA TTT G 서열번호 27
역방향 GGA GAT TCA CAC CGG AGT CA 서열번호 28
GFAP 정방향 AGG TCC ATG TGG AGC TTG AC 서열번호 29
역방향 GCC ATT GCC TCA TAC TGC GT 서열번호 30
EGR2 정방향 TCT TCC CAA TGA TCC CAG ACT 서열번호 31
역방향 TTA CGG ATT GTA GAG AGT GGA GT 서열번호 32
NGF 정방향 GGC AGA CCC GCA ACA TTA CT 서열번호 33
역방향 CAC CAC CGA CCT CGA AGT C 서열번호 34
PMP22 정방향 GAT CCT GTC GAT CAT CTT CAG C 서열번호 35
역방향 AGC ACT CAT CAC GCA CAG AC 서열번호 36
PLP 정방향 ACC TAT GCC CTG ACC GTT G 서열번호 37
역방향 TGC TGG GGA AGG CAA TAG ACT 서열번호 38
ITGA4 정방향 AGC CCT AAT GGA GAA CCT TGT 서열번호 39
역방향 CCA GTG GGG AGC TTA TTT TCA T 서열번호 40
BDNF 정방향 CTA CGA GAC CAA GTG CAA TCC 서열번호 41
역방향 AAT CGC CAG CCA ATT CTC TTT 서열번호 42
TYROSINASE 정방향 GCA AAG CAT ACC ATC AGC TCA 서열번호 43
역방향 GCA GTG CAT CCA TTG ACA CAT 서열번호 44
MITF 정방향 CTC ACA GCG TGT ATT TTT CCC A 서열번호 45
역방향 ACT TTC GGA TAT AGT CCA CGG AT 서열번호 46
TYRP1 정방향 CCC TGG ATA TGG CAA AGC G 서열번호 47
역방향 CCT GTC CTA CCC CAA GGA AAG 서열번호 48
그 결과, 2차 분화 단계 약 5일이 경과한 후, NCSC의 마커 유전자인 PAX3, SLUG 및 TWIST, NCSC/SCP의 마커 유전자인 FOXD3, NGFR, 및 SOX10, 및 SCP의 마커 유전자인 CDH19, GAP43, 및 MPZ의 발현이 상당히 증가하였으며, 발현 수준은 각기 다른 시점에서 최고치에 이르렀다 (도 1의 B).
구체적으로, NCSC 마커 유전자인 PAX3 및 TWIST의 발현 수준은 초기 단계에서 일시적으로 증가되었으며, 각각 5일차 및 10일차에 최고치에 이르렀다.
중요한 것은, SCP-특이적 마커 유전자인 CDH19, MPZ, 및 GAP43의 발현 수준은 18일차에서 최고치에 다다른 후, 이어지는 배양 동안 최고 수준을 유지하였다 (도 1의 B).
한편, 본 발명의 SCP 제조 방법의 1차 및 2차 배양 기간을 확인하고자 하였다.
구체적으로, hPSC를 1차 배양액 (NDM)에서 1 내지 14일 동안 배양 후, SCPDM으로 교체하여, 24일 후에 SCP-특이적 마커 유전자인 SOX10, NGFR, 및 MPZ 의 발현을 확인하였다.
그 결과, 마커의 발현 수준이 도 1에 개시된 결과와 크게 다르지 않음을 확인하였다 (도 14). 이로부터 1차 배양을 1 내지 14일간 수행할 수 있음을 확인하였다.
또한, 면역세포화학법 (Immunocytochemistry)은 다음과 같이 수행하였다. 세포는 10분 동안 4% 파라포름알데히드 (paraformaldehyde)로 고정하였다. 상기 고정된 세포는 PBS로 각 10분 동안 네 차례 세척하였다. 이 후, 1시간 동안 실온에서 PBS에 용해된 0.3% Triton X-100, 10% FBS, 및 1% BSA를 이용하여 상기 세포를 블로킹 및 투과시켰다. 상기 세포를 1시간 동안 상온에서 2% BSA를 포함하는 PBS에서 일차 항체와 함께 배양하였다.
일차 항체 반응 후, 상기 세포를 PBS로 세차례 세척하고, Alexa 488-결합된 항-마우스 (Alexa 488-conjugated anti-mouse, 1:500, Thermo Fisher Scientific), Alexa 546-결합된 항-마우스 (Alexa 546-conjugated anti-mouse, 1:500, Thermo Fisher Scientific), Alexa 488-결합된 항-래빗 (Alexa 488-conjugated anti-rabbit, 1:500, Thermo Fisher Scientific), Cy3-결합된 항-랫트 (Cy3-conjugated anti-rat, 1:500, Thermo Fisher Scientific) 또는 Alexa 546-결합된 항-래빗 (Alexa 546-conjugated anti-rabbit, 1:500, Thermo Fisher Scientific) 이차 항체를 포함하는 2% BSA를 함유한 PBS에서 20분간 배양하였다. 형광 이미지는 Axio Vert.A1 현미경 (Carl Zeiss) 및 LSM800 공초점 현미경 (Carl Zeiss)을 이용하여 획득하였다.
그 결과, 병렬적으로 수행된 면역세포화학 분석으로 SC 마커인 SOX10 및 GAP43의 양성 발현을 확인하였다 (도 1의 C).
또한, 세포를 Accutase로 분리하여, PBS에 재현탁하였다. 상기 세포를 PBS에 용해된 4% 포름알데히드로 10분간 고정 한 후, PBS로 세차례 세척 하였다. 상기 고정된 세포를 블라킹하고, PBS에 포함된 0.1% Triton X-100, 10% FBS, 및 1% BSA 를 이용하여 1시간 동안 얼음에서 (on ice) 투과시켰다. 상기 세포는 2% BSA를 포함하는 PBS에서 형광단 (fluorophore)이 결합한 일차 항체 (표 2) 와 함께 10분간 실온에서 배양하였다. 항체 반응 후, 상기 세포는 PBS로 두차례 세척하였으며, BD Accuri C6 (BD Biosciences)를 이용하여 분석하였다.
단백질 회사 (Cat. No.) 희석률
SOX10 Abcam (AB155279) 1:200
SOX10 Bioss (bs-6449R-A488) 1:200
SOX10 R&D (MAB2864) 1:50
NGFR Abcam (AB3125) 1:50
NGFR Bioss (bs-0161R-A647) 1:200
TUJ-1 Covance (MRB-435P) 1:1000
NF Abcam (ab24575) 1:1000
GAP43 Abcam (AB75810) 1:500
GAP43 Bioss (bs-0154R-A647) 1:100
Nestin Abcam (AB290) 1:1000
ZO-1 Thermo Fisher (40-2300) 1:100
GFP Abcam (AB290) 1:1000
MPZ Abcam (AB31851) 1:100
MPZ Abcam (AB39375) 1:100
MPZ Bioss (bs-0337R-A488) 1:100
EGR2 Abcam (AB156765) 1:100
MBP Covance (SMI-94) 1:400
MBP Millipore (MAB386) 1:300
S100b Abcam (AB52642) 1:200
Ki67 BD (550609) 1:50
MITF Santa Cruz (SC56726) 1:100
MelA Abcam (AB140503) 1:100
hNU Millipore(MAB1281) 1:50
그 결과, 결합되지 않은 SOX10 항체 (Abcam)는 항-래빗 Alexa Fluor 488-결합된 이차 항체 (secondary antibody)를 이용하여 검출하였으며,
FACS 분석으로 18일차에서 99% 이상의 세포가 SOX10을 발현하고, 세포의 배양 동안 상기 발현이 계속 유지되는 것을 확인하였다 (도 1의 D).
한편, 본 발명자들은 2차 분화 단계에서 세포의 형태가 가느다란 (slender) 모양으로 길어지는 것을 확인하였다.
실시예 3: 슈반 세포 전구체(Schwann cell precursor, SCP)의 유래에 따른 슈반 세포 전구체의 마커 발현 확인
본 발명자들은 슈반 세포 전구체로의 분화 과정 동안, 슈반 세포 전구체로 유도되는 다능성 줄기 세포인 인간 배아 줄기 세포 (human embryonic stem cell, hESC)및 인간 유도 만능 줄기 세포 (human induced pluripotent stem cell, hiPSC)의 특성을 비교하고자 하였다.
이를 위해, 본 발명자들은 마이크로어레이 분석을 이용하여 hESCs (hESC-SCPs) 및 hiPSCs (hiPSC-SCPs)로부터 분화된 SCP의 유전자 발현을 탐색하고 비교하였다.
RNeasy Mini 키트를 이용하여 총 RNA를 추출하였으며, Cy3를 이용하여 표지하였다. 제작자의 프로토콜에 따라, 상기 표지된 RNA를 Agilent Human GE 4x44K 마이크로어레이 칩 (one-color platform, Agilent)에 혼성화하였다.
세척 후, 상기 칩을 슬라이드 홀더에 두고 Agilent C 스캐너를 이용하여 스캔하였다.
유전자 발현 데이터는 GeneSpring software (Agilent)를 이용하여 처리하였으며, 통계 분석 및 각 샘플의 유의성을 시각화 하기 위해 MeV v.4.9.0 software를 이용하였다.
그 결과, 전체 유전자 발현 프로파일은 hESC-SCPs 및 hiPSC-SCPs에서 유사한 패턴을 나타냈으며, hESCs에서 유래된 SCP 및 hiPSCs에서 유래된 SCP는 모두 주요 다능성 마커 유전자 (pluripotency marker genes)인 POU5F1, KLF4, MYC, ZFP42, SOX2, SOX1, NCSC-관련 유전자 (NCSC-related genes)인 ZIC3, DBP, FOXC1, 및 MSX2의 상대적으로 낮은 발현 수준을 보였으며, SCP 마커 유전자인 ITGA4, NGFR, SOX10, CDH19, DHH, GAP43, 및 MPZ (도 2의 A)의 높은 발현 수준을 나타냈다.
실시간 qPCR (Real-time qPCR, (도 2의 B)) 및 반-정량적인 RT-PCR 분석 (도 2의 C) 결과 역시 마이크로어레이 결과와 일치하였다.
이는 본 발명자들의 hPSC에서 SCP로의 두 단계 분화 방법인 hESCs 및 hiPSCs에 모두 유용한 방법임을 의미한다.
더 나아가, 본 발명자들은 본 발명에 따른 방법으로 제조된 슈반 세포 전구체는 신경 능선 줄기 세포 (neural crest stem cell, NCSC)와도 명확히 구별됨을 확인하였다.
먼저, hPSC로부터 NCSC를 유도하기 위해, 이전에 공지된 방법을 이용하였다.
간략히 설명하면, 분리된 hPSC를 매트리겔-코팅된 배양 디쉬에 플레이팅하고, 다음 날, 배양 배지를 1% Probumin (Millipore), 1% penicillin-streptomycin, 1% L-alanyl-L-glutamine (Cellgro), 1% MEM non-essential amino acids, 0.1% trace elements A (Cellgro), 0.1% trace elements B (Cellgro), 0.1% trace elements C (Cellgro), 0.11 mM β-mercaptoethanol, 10 μg/ml transferrin, 50 μg/ml (+)-sodium l-ascorbate (Sigma), 10 ng/ml NRG1 (Peprotech), 200 ng/ml LONG R3 IGF-I (Sigma), 3 μM BIO (Tocris Biosciences), 20 μM SB431542 (Tocris Biosciences) 및 8 ng/ml FGF2 (Peprotech)을 포함하는 NCSC 유도 배지 (NCSC induction medium, NCSCIM)로 교체하였다. 배양 배지는 매일 교체하였다. NCSC는 NCSCIM 성장 약 20일이 경과한 후 생산되었다. 달리 지칭되지 않는 한, 모든 시약은 Thermo Fisher Scientific에서 구입하였다.
발달 과정에서, SCP는 NCSC 및 미성숙 슈반 세포 사이의 중간 전구체인 것으로 알려져 있다. SCP 및 NCSC의 계통 마커는 분화된 SCP 및 NCSC의 계통 차이를 명확히 나타낸다. 유사하게, 마이크로어레이 분석은 hiPSC 유래 SCP 및 NCSC 간의 계통 특이적 유전자 발현의 구별되는 차이를 나타내었다 (도 3의 A 및 B).
실시간 qPCR 분석에서도, 상기 마이크로어레이 분석 결과와 유사하게, SCP 특이적인 CDH19, SOX10, GAP43, 및 NGFR의 계통 마커 유전자가 SCP에서 높게 발현되는 반면, NCSC 특이적 TWIST 및 SLUG이 NCSC에서는 다량 발현되는 것을 확인하였다 (도 3의 C).
면역세포화학 분석 결과 역시 NCSC가 SOX10 및 NGFR에 양성인 반면, 슈반 세포 전구체 마커인 GAP43에 대해서는 음성임을 확인하였다 (도 3의 D).
실시예 4: SCP로의 분화 유도를 위한 필수 구성 요소
본 발명자들은 상기 실시예의 다능성 줄기 세포의 슈반 세포 전구체로의 분화를 유도하기 위한 필수 구성 요소는 무엇인지 확인하고자 하였다.
hPSC (hESCs 및 hiPSCs)로부터 hSCP를 NRG1를 SB431542 (SB) 및 CT99021 (CT)와 조합하여 처리하여 생산한 결과, 상기 실시예에서 이용된 본 발명자들의 분화 조건 하에서, 배지에서 NRG1, SB 또는 CT가 생략되는 경우, hSCP를 생산하는데 실패하는 것을 확인하였다 (도 4의 B 및 C).
본 발명자들은 NRG1이 2차 분화 단계 동안 SOX-10 양성인 세포군을 양-의존적으로 (dose dependent) 증가시키는 것을 확인하였으며 (도 4의 D 및 E), 이는 hPSC로부터 SCP로 전환되는 세포의 운명을 결정하는데 있어서, NRG1 신호 전달 경로의 활성화가 중요한 역할을 하는 것을 의미한다.
실시예 5: SCP의 높은 확장성 및 장기간 유지 가능성
본 발명자들은 상기 실시예의 방법으로 제조된 슈반 세포 전구체의 확장 가능성을 확인하고자 하였다.
이에, 초기 및 후기 계대의 hPSC 유래 SCP에서 SCP 마커를 qPCR, 및 마이크로어레이로 분석하였다 (도 5).
그 결과, 고농도의 NRG1 (100 ng/ml)의 존재 하에서, hPSC 유래 SCP는 화학적으로 정의된 조건 하에서 계대 간의 큰 형태 변화나 SCP 특성의 상실 없이 35 계대 이상 안정적으로 확장 가능 (expandable)한 것을 확인하였다 (도 5 및 6).
마이크로어레이 분석으로 hESC 및 hiPSC 유래의 SCP의 초기 계대 (p1) 및 후기 계대 (p19)에서 주요 SCP 마커의 발현 패턴이 거의 동일한 것을 확인하였다 (도 6의 A).
또한, qPCR (도 5의 B 및 6의 B) 및 반-정량적 RT-PCR 분석 (도 6의 C) 결과 역시 초기 계대 (p1) 및 후기 계대 (p20) 모두 SCP가 CDH19, GAP43, ITGA4, MPZ, NGFR, 및 SOX10의 마커를 안정적으로 발현하는 것으로 나타났다.
면역세포화학 분석 역시 초기 계대 (도 1의 C) 및 후기 계대 SCP (p20) 모두 증식하는 세포의 마커인 Ki67에 대해 양성이며, SCP 마커 단백질인 GAP43, NGFR, 및 SOX10을 균일하게 발현하는 것을 확인하였다 (도 5의 C).
마이크로어레이, qPCR, 및 면역세포화학 분석은 모두 상술한 바와 동일하게 실험하였다.
한편, 유세포분석(flow cytometric analysis) 결과, 초기 계대 및 후기 계대 SCP 간 유사한 SCP 특이적 마커(SOX10, NGFR, GAP43 및 MPZ) 발현 수준을 나타내었다 (도 5의 D).
이는 배양된 SCP가 화학적으로 정의된 배지에서 자가-재생가능하고, 균질함을 의미한다. hESC 또는 hiPSC로부터 유래되는 SCP는 전통적인 방법에 의해 저온 보관될 수 있으며, 융해 및 재배양 후 회수될 수 있다.
상기와 같은 결과를 종합하면, 본 발명자들이 제공하는 다능성 줄기 세포로부터 슈반 세포 전구체를 유도하는 방법은 화학적으로 정의된 조건하에서, hPSC로부터 균질의 SCP을 생산하는, 추가적인 세포 정제 (cell purification)가 필요 없는 간단한 방법임을 알 수 있다.
즉, 본 발명자들은 SB431542 및 CT99021을 조합하여 처리한 후, NRG1, SB431542, 및 CT99021을 이어서 처리하는, 화합물의 조합을 연속적으로 이용하는, hPSC로부터 균질한 SCP를 생산하는 간단한 방법을 개발하였다. 본 발명에 따른 방법은 세포 분리 및 배지 교체와 같은 별도의 단계를 필요로 하지 않는다.
실시예 6: SCP의 다능성 (multipotent) 확인
한편, 슈반 세포 전구체는 말초신경계에서 SC로만 분화하는, 신경교-제한된 전구세포(glial-restricted progenitors)로 알려져 있으나, 최근의 연구는 상기 세포가 다능성이며 부교감 신경의 뉴런 및 멜라노사이트 (melanocyte)를 포함하는 다양한 세포로 분화할 수 있음을 보고하였다.
이에, 본 발명자들은 hPSC-유래 SCP로 멜라노사이트로를 생산할 수 있는지 여부를 확인하였다.
구체적으로, 기존의 공지된 방법을 적절히 수정하여 SCP의 멜라노사이트로의 분화를 유도하였다 (Chambers et al., 2013).
간략히 말하면, SCP는 매트리겔 코팅된 배양 디쉬 상에서 배양하였다. 다음 날, 상기 배양 배지를 1x N2, 1x B27, 0.005% BSA, 2 mM Glutamax, 0.11 mM -mercaptoethanol, 3 μM CT 99021, 20 ng/ml FGF2 (Peprotech), 0.5 mM dbcAMP (Tocris Biosciences), 25 ng/ml BMP4, 및 100 nM EDN3 (Tocris Biosciences)을 함유하는, advanced DMEM/F12 및 Neurobasal medium (1:1 mix)를 포함하는 멜라노사이트 유도 배지로 교체하였다. 배지는 매일 교체하였다. confluent 세포를 Accutase (Millipore) 처리를 통해 분리하였으며, 1:6에서 계대(passage)하였다.
그 결과, hESC-유래 SCP가 멜라노사이트로 분화하는 동안, 멜라노사이트의 마커 유전자 (TYROSINASE, MITF 및 TYRP)의 발현 수준이 시간 경과에 따라 점진적으로 증가하는 것을 확인하였다 (도 7의 D 및 E). 또한, 분화 16일이 경과한 후, 대부분의 세포가 멜라노사이트 마커 (MITF 및 MelA)에 대해 양성을 나타내고 (도 7의 F), 색을 나타내는 것을 확인하였다 (pigmented, 도 7의 G).
이는 본 발명의 방법에 따라 제조된 SCP가 기존에 공지된 바와 같이, 멜라노사이트로 분화할 수 있는, 다능성 슈반 세포 전구체로서의 특성을 가짐을 확인한 것이다.
실시예 7: SCP에서 슈반 세포로의 효율적인 분화
본 발명자들은 상기 실시예에서 제조된 슈반 세포 전구체로부터, 실제 신경 질환의 예방 및 치료에 사용될 수 있는 슈반 세포로 분화시키고자 하였다.
이에, 본 발명자들은 NRG1 (200 ng/ml), 레티노산 (retinoic acid, 100 nM), PDGF-BB (10 ng/ml) 및 포스콜린 (forskolin, 4 μM)을 포함하는 SC 분화 배지 (SC differentiation medium, SCDM), 또는 NRG1 (200 ng/ml) 및 포스콜린 (forskolin, 4 μM)을 포함하는 SC 분화 배지를 이용하는, hPSC-SCP로부터 SC를 생산하는 최적화된 분화 방법을 개발하였다.
구체적으로, SCP를 슈반 세포로 분화시키기 위해, 상기 SCP를 슈반 세포 분화 배지 (SCDM) 내 매트리겔로 코팅된 플레이트 상에서 배양하였다. 상기 SCDM은 1% FBS, 200 ng/ml NRG1, 4 μM 포스콜린 (Sigma), 100 nM all-trans 레티노산 (retinoic acid, RA, Sigma) 및 10 ng/ml PDGF-BB을 함유하는 DMEM/low glucose을 포함한다.
배양 3일 경과 후, 상기 배양 배지를 1% FBS, 200 ng/ml NRG1, 10 ng/ml PDGF-BB (Thermo Fisher Scientific)를 포함하지만, 포스콜린이나 레티노산을 포함하지 않는 SCDM으로 대체하였다.
다시 2일 경과 후, 상기 배양 배지는 1% FBS, 및 200 ng/ml NRG1을 포함하지만, 포스콜린, 레티노산, 또는 PDGF-BB를 포함하지 않는 SCDM (Schwann cell medium, SCM)으로 교체하였다.
세포는 확장을 위해 SCM 내에 유지하였다. 슈반 세포는 SCM 내 배양 후 2 내지 3일 경과 후 생성되었다. 비교를 위해, 일차 인간 슈반 세포 (primary human Schwann cells)를 ScienCell에서 구입하여 슈반 세포 성장 배지 (Schwann cell growth medium, ScienCell)에서 배양하였다.
상기 NRG1, 레티노산, PDGF-BB 및 포스콜린을 포함하는 SC 분화 배지 (SCDM) 에서 슈반 세포 전구체를 4 내지 8일 동안 분화시킨 결과, hPSC-SCP는 방추형(spindle-like)의 형태로 변화하였으며 (도 9의 A 및 7의 A), FAP, PLP, PMP22, 및 S100와 같은 SC 마커 (도 9의 B) 및 다양한 신경 영양 인자 (BDNF, GDNF, NGF, NT-3, CNPase, NT-4, 및 CNTF) (도 7의 B)의 발현 수준이 상당히 증가하는 것을 확인하였다.
또한, 상기 SCDM 조성물 중에서 레티노산 및 PDGF-BB 를 사용하지 않고, NRG1 및 포스콜린 만을 포함하는 SC 분화 배지에서 슈반 세포 전구체를 8일 동안 분화시킨 결과, 면역세포화학분석을 통해 분화된 SC의 대부분이 SC-계통 특이적 단백질인 S100B 및 PLP2에 양성임을 확인하였다 (도 13).
상기와 같은 SC 특성을 얻는데 평균 소요되는 기간은 약 7일이었으며, 이는 세포의 형태 및 SC 마커의 발현 양상으로 확인하였다.
분화된 SC는 주요 신경 영양 인자 (NGF, BDNF and GDNF) 및 미성숙 SC의 마커 (S100B, NGFR, MPZ, PMP22, OCT6 및 SOX10, 도 9의 C)의 높은 발현 수준을 나타내었다.
또한, 본 발명자들은 면역세포화학분석을 통해 분화된 SC의 대부분이 SC-계통 특이적 단백질인 S100B, NGFR, EGR2, 및 MPZ에 대해 양성임을 확인하였다 (도 9의 D 및 7의 C).
또한, 마이크로어레이 데이터의 히트 맵 (heat map, 6804 유의 전사체, t-test, p<0.01)을 통해, hPSC-SCP-유래 SC 및 일차 인간 SC가 매우 유사한 반면, hESC 또는 hiPSC 유래의 SC는 SCP와 확연히 구별되는 것을 확인하였다 (도 9의 E).
상기와 같은 결과는, 본 발명자들의 NRG1, 레티노산, PDGF-BB 및 포스콜린 을 포함하는 SC 분화 배지 (SCDM)를 이용한, 슈반 세포 전구체로부터 슈반 세포로 분화 시키는 방법을 통해 효율적으로 슈반 세포를 생산 가능함을 보여주는 것이다.
실시예 8: SCP-유래 슈반 세포의 in vitro 기능 확인
본 발명자들은 본 발명의 방법에 따라 분화된 슈반 세포가 신경 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있는 기능을 가지는지 여부를 확인하고자 하였다.
특히, 슈반 세포는 미엘린 형성 및 신경 영양 인자 분비 효과를 가지므로, 이에 대해 확인하고자 하였다.
실시예 8-1: hPSC-SCP-SC의 미엘린 형성능 확인
먼저, 본 발명자들은 in vitro 상에서 hPSC-SCP-SC를 배아 랫트 배근 신경절 (embryonic rat dorsal root ganglion, DRG) 뉴런과 함께 미엘린 형성 촉진 아스코빅 산 (ascorbic acid)의 존재 하에 배양하여 말초 신경계 축삭의 미엘린 형성에 대한 능력을 확인하였다.
구체적으로, 배근 신경절 (DRG) 뉴런을 랫트 새끼의 태아 15일차에서 수득하였다. 랫트의 DRG 뉴런은 MEM에 4 g/L D-glucose (Sigma), 50 ng/ml NGF (Peprotech), 및 15% FBS를 포함하는 DRG 성장 배지에서 poly-D-lysine 및 laminin으로 코팅된 12 mm 커버 슬립 상에 플레이팅하였다. 내재적 비신경세포를 제거하기 위해, 배양물에 10 μM 5-fluoro-2-deoxyuridine (Sigma), 4 g/L D-glucose (Sigma), 50 ng/ml NGF (Peprotech), 1% FBS 및 1x B27을 함유하는 10 μM uridine (Sigma), 및 Neurobasal Medium을 3일간 처리하였다. 이후, 2일간 DRG 성장 배지에서 배양하였다. 상기 단계를 15일간 3차례 반복하였다.
상기, DRG는 슈반 세포와 공동 배양하기 전, Neurobasal Medium에 4 g/L D-glucose (Sigma), 50 ng/ml NGF, 1% FBS, 및 1x B27을 포함하는 DRG 분화 배지에서 유지하였다. 그리고 20,000 또는 25,000 SCP-유래 슈반 세포는 DRG 배양 배지 내 DRG 배양물에 첨가하여, 5 내지 7일간 유지하였다.
다음으로, 50 ng/ml ascorbic acid (Sigma)을 포함하는 DRG 성장 배지를 3주간 처리함으로써 미엘린 형성을 유도하였다. 배지는 매일 교체하였다.
이러한 혼합된 배양액을 미엘린 단편(segment)을 나타내는 MBP (myelin basic protein) 및 TUJ-1 (neuron-specific tubulin)에 대해 면역 염색하였다.
그 결과, 상기의 공동 배양 조건하에서, 미엘린 형성 28일 후, MBP-양성 미엘린 단편의 존재를 확인하였다 (0.75 웰 당 미엘린 단편, n=16). 대부분의 공동 배양된 슈반 세포의 S100B은 면역 염색되었다. 인간 특이적 핵 항체 (human specific nuclear antibody)로 미엘린 형성하는 세포를 표지함으로써 시각화된 것처럼 (도 10의 A), 잔존하는 랫트 슈반 세포는 미엘린을 형성하지 않았다.
미엘린 형성 슈반 세포의 MPZ 면역 반응성은 미엘린을 형성하지 않는 슈반 세포에 비해 매우 큰 것을 확인하였다. 또한, MPZ-양성 세포가 신경 돌기를 둘러싸고 있다.
실시예 8-2: hPSC-SCP-SC의 신경 영양 인자 분비능 확인
슈반 세포의 기능은 축삭의 미엘린 형성뿐만 아니라 축삭의 재생을 위한 영양 인자의 제공에도 있다. 본 발명의 방법에 따라 분화된 슈반 세포가 신경 영양 인자를 분비하는지 여부를 확인하고자 하였다.
이에, 본 발명자들은 상술한 바와 같은 실시간 qPCR 분석을 통해 신경 영양 인자 (BDNF, GDNF, NGF, 및 NT-3)가 hPSC-SCP-SC에서 높게 발현됨을 확인하였다 (도 7의 B).
또한, 본 발명자들은 다음과 같이, 효소면역측정법 (Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA)을 수행하였다.
먼저, 조건 배지 (conditioned medium) 를 얻기 위해, 105 개의 hSCP 세포 및 hSCP-SC 세포를 30 mm 배양 디쉬에 시딩하였다. 48시간 후, 상기 배양된 배양액은 0.22 μm 필터 (Millipore)를 이용하여 필터링하였다. 분비된 신경 영양 인자 (BDNF, GDNF, b-NGF, 및 NT-3)의 농도를 측정하기 위해, 제작자의 프로토콜 (Abcam)에 따라 hSCP 및 hSCP-SC 유래의 조건 배양액에서 ELISA를 수행하였다.
그 결과, hPSC-SCP-SC 배양 배지에서 분비되는 BDNF, GDNF, NGF, 및 NT-3의 수준이 분화되지 않은 SCP의 배양 배지보다 높은 것을 확인하였다 (도 10의 C). 상기 인자들은 말초신경계 및 중추신경계의 축삭 재생에 있어서 중요한 것으로 알려져 있다.
실시예 9: SCP-유래 슈반 세포의 in vivo 기능 확인
본 발명자들은 상기 실시예에서 제조된 슈반 세포가 체내에서 미엘린 형성 및 신경 영양 인자의 분비를 통해 손상된 신경을 복원 및 재생시킬 수 있는지 여부를 확인하고자, GFP로 표지된 SC를 좌골 신경 손상 모델인 마우스에 이식하였다 (도 11의 A).
먼저, 8-주령C57BL/6 수컷 마우스의 좌측 좌골 신경의 중앙 영역을 절단함으로써 손상시켜 2-3 mm 신경 결함을 형성하였다. 상기 세포를 매트리겔 (Matrigel, 2 x 104 cells/μl)에서 희석하고, 1 x 105 세포 (렌티바이러스 감염에 의해 GFP로 표지된 H9 hESC-SCP-유래 SC)를 포함하는 세포 현탁액 5 μl을 신경 결함 부위에 이식 (implant)하였다. 마우스를 PBS 용해된 4% 파라포름알데히드로 경심 관류 시켰다 (transcardially). 좌골 신경은 1시간 동안 후-고정 (post-fixed) 시켰고, 4 °C에서 72시간 동안 PBS 용해된 30% 수크로스에서 냉장 보존하였다. 동결 절편 (cryostat sections, 15 μm)를 글래스 슬라이드에 올려놓고 -20 °C에서 보관하였다.
면역 염색을 위해, 상기 슬라이드를 15분 동안 PBS로 세척하고, 0.3% Triton X-100, 10% FBS, 및 1% BSA를 포함하는 PBS로 실온에서 1시간 동안 블로킹하였다. 일차 항체는 2% BSA를 포함하는 PBS에서 희석하고 밤새 4 °C에서 적용(applied) 하였다. 상기 슬라이드를 PBS로 세척하고 실온에서 45분간 이차 항체로 배양하였다. Axio Vert.A1 현미경 (Carl Zeiss) 및 LSM800 공초점 현미경 (Carl Zeiss)으로 이미지를 얻었다.
그 결과, SC-이식된 마우스 (n=10/10)에서 근위단 (proximal stumps)에서 원위로의 좌골 신경의 재생이 손상 8주가 경과한 뒤에 관찰되었다. 반면, 매트리겔 처리된 (matrigel-treated) 마우스에서는 손상 후 동일한 시점에서 재생이 거의 나타나지 않았다 (n=8/9) (도 11의 B).
특히, 손상 후 8주 뒤에는, 대조군 마우스(6.4 ± 1.4 mm)에서 보다 SCP-SC-이식된 마우스 (9.6 ± 1.8 mm)에서 절단된 좌골 신경이 상당 수준 증가한 것을 확인하였다 (도 11의 C). 몇몇 GFP-표지된-SC가 재생된 좌골 신경 조직의 원위 영역에 통합되었고 (integrated), 대부분의 GFP-표지된 세포의 S100B가 면역 염색되었다 (도 11의 D). 재생된 신경이 슈반 세포에 의해 미엘린 형성되는 반면, MBP와 공동 염색된 GFL-표지 세포는 거의 검출되지 않았다 (도 8). 재생된 축삭은 많은 세포가 원위 영역에서 발견되는 반면, 적은 세포만 근위 영역에서 발견되는 점에서 구별되었다.
또한, 본 발명자들은 상기 실시예에 의해 제조된 슈반 세포의 in vivo에서 기능적 회복을 확인하고자, 마우스의 발자국 및 좌골 신경 기능 지수 (sciatic function index, SFI)을 평가하였다.
상기 SFI는 좌골 신경 손상 후 신경 회복을 평가하는 방법이다 (Inserra et al., 1998). 간략히 말하면, 마우스의 뒷발을 잉크로 칠하고 흰 종이를 덧댄 통로 (80cm 길이, 6cm 폭)를 따라 걷도록 한다. 좌골 신경 손상 후, 2, 3, 4, 6, 및 8주가 경과한 뒤에 발자국을 기록하였다. 기록된 발자국을 스캔하고 자를 이용하여 3가지 파라미터 (PL, 발뒤꿈치로부터 셋째 발가락까지의 거리; TS, 첫째 발가락에서부터 다섯번째 발가락까지의 거리; ITS, 두번째 발가락에서 네번째 발가락까지의 거리)를 측정하였다. 모든 측정은 각 마우스의 손상된 발 (experimental paw, EPL, ETS, 및 EITS) 및 손상되지 않은 발 (NPL, NTS, 및 NITS)에서 이루어 졌다. SFI는 하기 식으로 계산된다.
SFI = -38.3 x (EPL-NPL)/NPL + 109.5 x (ETS-NTS)/NTS + 13.3 x (EITS-NITS)/NITS - 8.8.
동물 실험은 한국생명공학연구원의 동물실험윤리위원회 가이드라인에 따라 수행되었다. 한국생명공학연구원 동물 복지 번호 (KRIBB Animal Welfare Assurance number)는 KRIBB-AEC-11039이다.
그 결과, 본 발명자들은 2, 3, 4, 6, 및 8주차에 이식된 마우스의 발자국 (footprint)으로부터 기능 회복을 확인하였다 (도 11의 F, n=9 또는 10 마우스).
매트리겔 처리된 마우스에 비해, SCP-SCs-이식된 마우스는 현저히 향상된 좌골 기능 지수 (sciatic function index, SFI)을 나타내어, 기능 회복을 나타내었다 (도 11의 G).
이러한 차이는 이식 2주후부터 관찰되었으며, 8주까지 기능의 회복이 매우 높게 나타났다. 8주차에는 대조군 (-93.3 ± 6.3)에 비해, SCP-SC-이식된 그룹의 평균 SFI가 현저한 회복 (-62.9 ± 8.7)을 나타내었다. 이러한 결과는 재현 가능한 결과이며, hPSC-SCP-SC가 기능적이고 신경 재생을 위한 치료 적용에 유용함을 의미하는 것이다.
상기의 결과로부터, 본 발명의 방법에 따라 생산된 슈반 세포가 in vitro 뿐만이 아니라, in vivo에서도 손상된 신경의 회복 및 재생 효과를 가져, 신경 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> A method for preparing a Schwann cell precursor and a Schwann cell prepared therefrom <130> KPA161595-KR <160> 48 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 agctcggcgg tgtttttatc a 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 ctgcacagga tcttggagac g 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 3 gtccgcagtc ttacgaggag 20 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 4 gcttgagggt ctgaatcttg ct 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 5 cctcacagat cgcctacacc 20 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 6 catataggag aaggccgagt aga 23 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 7 gacgcaggtt gcgatagcc 19 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 8 cgcctccttg ggcaatgtc 19 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 9 aagtgccaac taggtacggg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 10 catagcactg agcctcctct 20 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 11 acaagcgtct gtaactctgg g 21 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 12 agcaaacttc gtgttggaca 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 13 tggcctacat agccttcaag a 21 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 14 gagatgccac tgtcgctgt 19 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 15 ggccgcaacc aaaattcagg 20 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 16 cggcagtagt ggtgccttc 19 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 17 ctcagcctcc agcagatgc 19 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 18 tagatttcat tctctggttc tgg 23 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 19 acaactttgg tatcgtggaa gg 22 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 20 gccatcacgc cacagtttc 19 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 21 cgaactggac acacatacag tg 22 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 22 ctgaggatct ctggttgtgg t 21 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 23 gcacattcaa gaacacggag a 21 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 24 cacatcacca aaagtaaggg tca 23 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 25 gaccctcatc aacgtgttcc a 21 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 26 ccacaagcac cacatactcc t 21 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 27 gtggaccgca cggaatttg 19 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 28 ggagattcac accggagtca 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 29 aggtccatgt ggagcttgac 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 30 gccattgcct catactgcgt 20 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 31 tcttcccaat gatcccagac t 21 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 32 ttacggattg tagagagtgg agt 23 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 33 ggcagacccg caacattact 20 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 34 caccaccgac ctcgaagtc 19 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 35 gatcctgtcg atcatcttca gc 22 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 36 agcactcatc acgcacagac 20 <210> 37 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 37 acctatgccc tgaccgttg 19 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 38 tgctggggaa ggcaatagac t 21 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 39 agccctaatg gagaaccttg t 21 <210> 40 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 40 ccagtgggga gcttattttc at 22 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 41 ctacgagacc aagtgcaatc c 21 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 42 aatcgccagc caattctctt t 21 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 43 gcaaagcata ccatcagctc a 21 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 44 gcagtgcatc cattgacaca t 21 <210> 45 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 45 ctcacagcgt gtatttttcc ca 22 <210> 46 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 46 actttcggat atagtccacg gat 23 <210> 47 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 47 ccctggatat ggcaaagcg 19 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 48 cctgtcctac cccaaggaaa g 21

Claims (27)

  1. (a) 다능성 줄기 세포 (pluripotent stem cell)를 SB431542, 및 CT99021을 포함하는 배지에서 1차 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 1차 배양된 세포에 NRG1 (neuregulin-1)을 추가로 첨가한 배지로 2차 배양하는 단계를 포함하는,
    다능성 줄기세포로부터 슈반 세포 전구체를 제조하는 방법으로서,
    상기 다능성 줄기세포로부터 슈반 세포 전구체를 제조하는 방법은 신경 중간체 (neural intermediate) 단계를 거치지 않는 직접 분화 방법에 의한 것인, 슈반 세포 전구체를 제조하는 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 1차 배양은 1일 내지 14일 동안 수행하고, 상기 2차 배양은 10일 내지 150일 동안 수행하는 것인, 슈반 세포 전구체를 제조하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 배지는 2 내지 20 μM의 SB431542 및 1 내지 10 μM의 CT99021을 포함하는 것인, 슈반 세포 전구체를 제조하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 배지는 20 내지 200 ng/ml의 NRG1을 포함하는 것인, 슈반 세포 전구체를 제조하는 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 다능성 줄기 세포는 hESC (human embryonic stem cell) 또는 hiPSC (human induced pluripotent stem cell)인 것인, 슈반 세포 전구체를 제조하는 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 슈반 세포 전구체는 슈반 세포 또는 멜라노사이트 (melanocyte)로 분화 가능한 것인, 슈반 세포 전구체를 제조하는 방법.
  8. 제1항에서 제조된 슈반 세포 전구체를 NRG1, 및 포스콜린 (forskolin)을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는,
    다능성 줄기 세포로부터 슈반 세포를 제조하는 방법으로서,
    상기 슈반 세포 전구체는 다능성 줄기 세포로부터 신경 중간체 (neural intermediate) 단계를 거치지 않는 직접 분화에 의해 제조된 것인, 슈반 세포의 제조 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 배지는 100 내지 300 ng/ml의 NRG1 및 1 내지 10 μM의 포스콜린을 포함하는 것인, 슈반 세포의 제조 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 배지는 레티노산 (retinoic acid), 및 PDGF-BB (platelet-derived growth factor-BB)를 추가로 포함하는 것인, 슈반 세포의 제조 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 배지는 100 내지 300 ng/ml의 NRG1, 50 내지 150 nM의 레티노산, 5 내지 15 ng/ml의 PDGF-BB, 및 1 내지 10 μM의 포스콜린을 포함하는 것인, 슈반 세포의 제조 방법.
  12. 제8항에 있어서,
    상기 슈반 세포는 미엘린 형성능 (myelination) 및 신경 영양 인자 (neurotrophic factor)의 분비능을 가지는 것인, 슈반 세포의 제조 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 신경 영양 인자는 BDNF, GDNF, NGF, 또는 NT-3인 것인, 슈반 세포의 제조 방법.
  14. 제1항에서 제조된 슈반 세포 전구체에 NRG1, 포스콜린 (forskolin), 및 약학적으로 허용 가능한 담체와 혼합하는 단계를 포함하는,
    슈반 세포 전구체를 포함하는 신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제조하는 방법으로서,
    상기 슈반 세포 전구체는 다능성 줄기 세포로부터 신경 중간체 (neural intermediate) 단계를 거치지 않는 직접 분화에 의해 제조된 것인, 신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제조하는 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 슈반 세포 전구체에 레티노산 (retinoic acid), 및 PDGF-BB (platelet-derived growth factor-BB)를 추가로 혼합하는 단계를 포함하는 신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제조하는 방법.
  16. (a) 제1항에서 제조된 슈반 세포 전구체를 NRG1, 및 포스콜린 (forskolin)을 포함하는 배지에서 배양하는 단계;
    (b) 상기 배지로부터 슈반 세포를 회수하는 단계; 및
    (c) 상기 회수된 슈반 세포를 약학적으로 허용 가능한 담체와 혼합하는 단계를 포함하는,
    슈반 세포를 포함하는 신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제조하는 방법으로서,
    상기 슈반 세포 전구체는 다능성 줄기 세포로부터 신경 중간체 (neural intermediate) 단계를 거치지 않는 직접 분화에 의해 제조된 것인, 신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제조하는 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 배지는 레티노산 (retinoic acid), 및 PDGF-BB (platelet-derived growth factor-BB)를 추가로 포함하는 것인, 신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제조하는 방법.
  18. 제14항 또는 제16항에 있어서,
    상기 신경 질환은 퇴행성 신경질환, 탈수초 신경질환, 근위축성 측색경화증, 외상성 척수질환 또는 말초신경질환인 것인, 신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제조하는 방법.
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 제1항의 방법으로 제조된, 다능성 줄기세포로부터 제조된 슈반 세포 전구체 또는 제8항의 방법으로 제조된, 슈반 세포 전구체로부터 분화 유도된 슈반 세포를 포함하는 스크리닝용 키트로서, 상기 키트는
    (ⅰ) 신경 질환 예방 또는 치료제 스크리닝; 또는
    (ⅱ) 슈반 세포로의 분화 유도 물질 스크리닝용인 것인, 스크리닝용 키트.
  27. 삭제
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