KR101696874B1 - 직접 리프로그래밍을 통한 유도 도파민성 전구세포 제조방법 - Google Patents

직접 리프로그래밍을 통한 유도 도파민성 전구세포 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 성체 세포의 Oct4, Sox2, Klf4, 및 c- Myc 유전자 발현을 유도하는 단계; 및 상기 세포에 SHH(sonic hedgehog) 및 FGF8(fibroblast growth factor 8)을 처리하여 성체 세포로부터 유도 도파민성 전구세포(induced Dopaminergic Progenitor; iDP) 로의 직접 리프로그래밍하는 것을 특징으로 하는, 유도 도파민성 전구세포 제조방법, 및 이를 통해 제조된 유도 도파민성 전구세포를 유효성분으로 포함하는 세포 치료제 및 파킨슨 병 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다. 아울러, 본 발명은 상기 유도 도파민성 전구세포를 배양하여 신경 줄기세포-유사 콜로니(NSC-like colony)를 분리하는 단계; 및 상기 분리된 콜로니를 단일 세포화하고, 신경 세포 분화 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 것인, 중뇌 도파민성 뉴런의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 세포를 이용하여 파킨슨 병 예방 또는 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 유도 도파민성 전구세포 제조방법에 의하여 제조된 전구세포는 도파민성 뉴런으로 분화되는 효율이 기존 방법들에 비하여 현저히 높으며, 환자 체세포를 이용할 수 있어 면역원성 등의 부작용과 윤리적 문제가 없어, 해당 분야에서 널리 사용될 수 있다.

Description

직접 리프로그래밍을 통한 유도 도파민성 전구세포 제조방법{A method for preparation of induced dopaminergic progenitors using direct reprogramming}
본 발명은 성체 세포의 Oct4, Sox2, Klf4, 및 c- Myc 유전자 발현을 유도하는 단계; 및 상기 세포에 SHH(sonic hedgehog) 및 FGF8(fibroblast growth factor 8)을 처리하여 성체 세포로부터 유도 도파민성 전구세포(induced Dopaminergic Progenitor; iDP) 로의 직접 리프로그래밍하는 것을 특징으로 하는, 유도 도파민성 전구세포 제조방법, 및 이를 통해 제조된 유도 도파민성 전구세포를 유효성분으로 포함하는 세포 치료제 및 파킨슨 병 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다. 아울러, 본 발명은 상기 유도 도파민성 전구세포를 배양하여 신경 줄기세포-유사 콜로니(NSC-like colony)를 분리하는 단계; 및 상기 분리된 콜로니를 단일 세포화하고, 신경 세포 분화 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 것인, 중뇌 도파민성 뉴런의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 세포를 이용하여 파킨슨 병 예방 또는 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
도파민계 세포는 포유동물의 뇌에서 중요한 운동 조절, 호르몬 분비 조절, 감정 조절 등에 관여하는 매우 중요한 계이다. 따라서, 도파민 작동성 신경 전달에 있어서의 이상은 여러 가지 신경계의 장애를 일으킨다. 예를 들면, 파킨슨 병은 중뇌 흑질(substantia nigra)의 도파민 생산 뉴런의 특이적인 변성이 원인으로 일어나는 추체외로계(extrapyramidal system)의 신경 변성 질환이다. 파킨슨 병의 치료 방법으로서는 생산되는 도파민량의 저하를 보충하기 위해서 3,4-디히드록시 페닐 알라닌(3,4-dihydroxyphenylalanine), 일명 레보도파(levodopa)를 경구 투여하는 방법이 주로 수행되고 있지만, 효과의 지속성은 좋지 않은 것으로 알려져 있다.
최근의 파킨슨 병 치료 방법은 상실된 도파민 생산 뉴런을 보충하기 위해서, 도파민 생산 뉴런 전구 세포를 포함하는 6 ~9주령의 중절 태아의 중뇌 복측 영역(ventral region)을 이식하는 방법도 시도되고 있다. 그러나, 현재로서는 이 방법은 한 명의 환자를 치료하기 위하여 최소 5~10개의 태아뇌조직이 필요하고 경우에 따라서 치료효과가 전혀 없거나 혹은 과도한 도파민 신경세포 생성으로 인한 부작용이 발생되는 등 윤리적 및 기술적 문제를 가지고 있었다. 특히, 세포 공급 및 윤리적 측면에서의 문제와 감염 오염의 위험성, 이식한 조직의 면역거부반응, 태아 조직이 당분해보다 지방질 대사에 주로 의존하고 있기 때문에 발생하는 낮은 생존률 등의 여러 가지 면에서 문제가 지적되고 있다.
윤리적인 면이나 공급 부족의 문제를 해결하기 위하여, 예를 들면, 돼지의 대뇌 피질, 선(stria) 및 중뇌 세포를 이용하는 방법 등도 제안되고 있다. 이러한 방법은 거부반응을 억제하기 위해 세포 표면상의 항원(MHC 클래스 I항원)을 바꾸는 복잡한 조작이 필요하게 된다. 예를 들어, 이식 거부반응을 해결하는 방법으로는, 세르톨리(Sertoli's) 세포를 동시에 이식하여 국지적으로 면역반응을 억제하는 방법도 제안되고 있다. MHC가 일치하는 친척, 다른 사람의 골수, 골수 은행 및 제대혈 은행 등으로부터 이식 세포를 얻는 일도 가능하지만, 환자 자신의 세포를 이용할 수 있다면, 불필요한 조작 없이 거부 반응의 문제도 해결할 수 있다. 이에 따라, 환자 자신의 세포들로부터 시험관 실험(in vitro)을 통해 제조한 도파민성 뉴런을 이용하는 것이 유망시 되고 있다.
한편, 분화가 완료된 도파민성 뉴런은 환자 내에 정착율이 낮고 지속적인 치료 효과를 기대하기 어렵다. 즉, 손상된 신경 조직을 치료하기 위해서는 뇌기능의 재구축이 필요하게 되고, 주위의 세포와 적절한 링크를 형성하기(네트워크 형성) 위해서 분화가 완료된 세포는 아니면서, 생체 내(in vivo)에서 도파민성 뉴런으로 특이적으로 분화하는 세포를 이식할 필요가 있다. 일반적인 신경 줄기세포를 이식하는 경우에는 상기 기술한 윤리적 문제뿐만 아니라 이식한 줄기 세포가 이종(heterogeneous)의 세포 집단으로 분화할 가능성이 있다는 문제가 있다. 특히, 파킨슨 병의 치료에서는 카테콜아민(catecholamine)을 함유한 뉴런 중에서 도파민 생산 뉴런을 선택적으로 이식하는 것이 필요하다. 지금까지, 파킨슨 병의 치료에 이용하는 것으로 제안되고 있는 이식 세포로는, 선조체(striatum), 인간 태아 신경 유래의 불사화 세포주(immortalized cell line), NT2Z 세포의 유사분열 후 인간 뉴런, 원시 뉴런(primordial neuron) 세포, 도파민 등의 카테콜아민을 생산하도록 외래 유전자에 의해 트랜스펙션(transfection)된 세포, 골수 스트로마(stroma) 세포, 유전자가 조작된 ES 세포 등을 들 수 있다. 그 외, 태아 중뇌 조직 유래의 신경 전구 세포를 FGF-8 및 Shh에 접촉시키는 것으로 형성된 도파민 생산 뉴런 및 NT2 신경세포를 레티노산(retinoic acid)으로 처리함으로써 티로신 수산화 효소(tyrosine hydroxylase)를 발현하게 된 세포를 이용하는 일도 제안되고 있다. 그러나 기존 이식 세포들은 도파민 생산 뉴런 또는 도파민 생산 뉴런으로 분화하는 세포의 비율이 높지 않아 이종성을 가지는 문제점을 가지고 있었다.
특히, 상기의 방법 중에서 만능성 줄기세포 (배아줄기세포 및 유도만능 줄기세포)를 이용하여 환자 특이적인 세포를 만들어 면역거부반응의 문제를 해결하고 필요한 세포를 만들어 세포치료를 통해 치료효과를 기대하는 방법이 최근 대두되었다. 하지만, 만능성 줄기세포의 경우 기본적으로 테라토마 (teratoma)를 형성할 수 있기 때문에, 미분화된 만능성 줄기세포가 이식될 경우 암을 유발할 위험성이 존재한다. 그래서 새롭게 개발된 리프로그래밍 방법이 직접교차분화 (direct reprogramming 또는 transdifferentiation)이다. 직접교차분화를 통해서는 유도만능줄기세포를 거치지 않고 직접 원하는 세포로의 전환이 가능함으로써 유도만능줄기세포가 가지고 있는 암화가능성을 피해갈 수 있다.
직접교차분화의 기술을 통해서 현재 신경줄기세포를 만들 수 있는 것으로 보고가 되었고 (PNAS, 2011 김장환 논문) 이렇게 만들어진 신경줄기세포는 유도신경줄기세포로 불린다. 유도신경줄기세포는 다양한 신경질환의 치료와 연구에 활용될 수 있을 것으로 전망되고 있다.
현 시점에서 파킨슨 병 이식 치료에 있어서의 큰 문제점 중 하나는, 분화 유도시킨 신경 줄기세포 또는 전구세포들이 도파민성 뉴런으로의 분화 효율이 높지 않아, 수많은 세포 형태로 분화한다는 점이다. 신경 회로형성에 있어서의 안전성을 고려하면, 관심 있는 세포 형태를 높은 비율로 분화할 수 있는 세포를 이용하는 것이 바람직하다. 따라서, 이종성을 방지하기 위해서는 최종 분화된 도파민성 뉴런을 이식하는 것이 좋으나, 뇌 내의 이식된 자리에서의 세포 생존 및 알맞게 네트워크를 형성하는 능력을 고려한다면, 자가 재생능을 가지는 전구세포를 사용하는 것이 좋다. 이에 따라, 도파민성 뉴런으로의 분화효율이 높은 도파민성 전구세포를 이용하여 치료 효과의 증대를 기대할 수 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 상기 나열된 문제점을 극복할 수 있도록 환자 자신의 분화된 세포를 도파민성 전구세포로 리프로그래밍하는 과정과 특히 도파민성 뉴런으로 분화가 되는 도파민성 전구세포로의 전환율을 높이는 방법을 연구하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 성체 세포에서 하나 이상의 전능성 인자의 발현을 유도하는 단계; 및 상기 세포에 SHH(sonic hedgehog) 및 FGF8(fibroblast growth factor 8)을 처리하여 성체 세포로부터 유도 도파민성 전구세포(induced Dopaminergic Progenitor; iDP) 로의 직접 리프로그래밍하는 것을 특징으로 하는, 유도 도파민성 전구세포 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 유도 도파민성 전구세포를 배양하여 신경 줄기세포-유사 콜로니(NSC-like colony)를 분리하는 단계; 및 상기 분리된 콜로니를 단일 세포화하고, 신경 세포 분화 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 것인, 중뇌 도파민성 뉴런의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 제조방법에 의하여 제조된 유도 도파민성 전구세포를 유효성분으로 포함하는 세포 치료제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 유도 도파민성 전구세포를 유효성분으로 포함하는, 파킨슨 병 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 유도 도파민성 전구세포를 개체에 이식하는 단계를 포함하는, 파킨슨 병 치료 또는 예방 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 유도 도파민성 전구세포 또는 도파민성 뉴런에 파킨슨 병 예방 또는 치료제 후보 물질을 처리하는 과정을 포함하는, 파킨슨 병 예방 또는 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 a) 성체 세포에서 하나 이상의 전능성 인자의 발현을 유도하는 단계; 및 b) 상기 세포에 SHH(sonic hedgehog) 및 FGF8(fibroblast growth factor 8)을 처리하여 성체 세포로부터 유도 도파민성 전구세포(induced Dopaminergic Progenitor; iDP) 로의 직접 리프로그래밍하는 것을 특징으로 하는, 유도 도파민성 전구세포 제조방법을 제공한다. 상기 Oct4, Sox2, Klf4, 및 c- Myc 유전자는 전능성 인자로도 지칭 될 수 있다.
본 발명의 용어, "직접 리프로그래밍(direct reprogramming)"은 기존의 성체 세포로부터 리프로그래밍 또는 역분화를 일으켜 유도 만능 줄기세포를 제조한 후, 유도 만능 줄기세포로부터 원하는 특정 세포로의 분화를 유도하는 경우에 미분화 세포가 잔류하여 세포를 이식한 후 종양이 생성되거나, 원하는 세포로의 분화 효율이 높지 않은 문제점을 해결하기 위하여, 역분화 과정을 거쳐 유도 만능 줄기세포로 만들지 않고, 직접적인 세포치료를 위한 원하는 체세포로의 직접 전환을 유도하는 기술이다. 즉, 성체 세포를 역분화시키는데 있어 전능성에 이르기까지 역분화시키지 않고 원하는 세포로 분화시킬 수 있을 정도로 역분화시킨 후, 목적 세포로 직접 분화시켜서 직접적으로 생산하는 방법을 직접 리프로그래밍이라고 한다. 본 발명에서는 직접 리프로그래밍은 직접 역분화, 직접 분화, 직접 전환, 직접교차분화, 교차분화 등과 혼용될 수 있다. 본 발명에서 직접 리프로그래밍은 특히 도파민성 전구세포로의 직접 역분화를 의미할 수 있다.
본 발명의 용어, "도파민성 전구세포(dopaminergic progenitor, DP)"는 신경 줄기세포의 일종으로 특히 도파민성 신경세포(dopaminergic neuron)로의 분화율이 높으며 체외에서 증식이 가능한 전구세포의 일종이다. 본 발명에서 도파민성 전구세포는 인위적인 방법을 통하여 생성 또는 제조된 것일 수 있으며, 특히 in vitro 상 처리를 통하여 유도된 도파민성 전구세포(induced DP, iDP)일 수 있다.
본 발명의 용어, "성체 세포"란 분화가 일어난 세포로서, 여러 종류의 세포로 분화할 수 있는 능력을 말하는 다분화능을 완전히 소실하거나 대부분 소실한 상태의 세포를 말한다. 본 발명에서는 분화가 완료된 세포일 수 있으며, 전능성 인자의 발현 수준을 증가시키는 것을 통해 일부 다분화능 또는 전분화능을 회복할 수 있는 대상 세포를 의미할 수 있다. 특히, 섬유아세포일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblasts, MEFs) 및 마우스 꼬리 섬유아세포(mouse tail tip fibroblast, TTFs)에 대해, 본 발명의 유도 도파민성 전구세포 제조방법을 적용하여 그 효과를 확인하였다.
본 발명의 용어, "전능성 인자(pluripotency factor)"란 줄기세포가 줄기세포성(stemness)를 유지하거나 분화된 세포가 줄기세포성을 다시 수득하는 과정인 역분화되는데 중요한 역할을 하는 인자들을 의미한다. 즉, 세포가 자가 재생능, 또는 다분화능을 유지 또는 획득하는데 기능하는 인자들을 의미한다. 상기 인자들은 특히, 이미 분화가 진행된 세포를 다시 전능성 또는 다능성 세포로 리프로그래밍 하는 역할을 할 수 있으며, 본 발명에서는 전능성에 중요하다고 널리 알려진 OSKM 인자, 즉 Oct4, Sox2, Klf4, 및 c- Myc (Yamanaka 인자 또는 OSKM 인자)를 포함할 수 있다. 본 발명에서 전능성 인자는 역분화 인자를 포함하는 개념이며, 이와 혼용될 수 있다.
상기 OSKM 인자는 성숙한 체세포에 상기 Oct4, Sox2, Klf4, 및 c- Myc 유전자를 과발현시키면 배아줄기세포와 유사한 미분화 상태로 되돌아가는 역분화가 일어난다는 것이 2006년 일본 교토대학의 Yamanaka 교수팀에 의하여 밝혀지면서, 분화가 일어난 세포를 미분화 상태로 만드는 역분화 인자 또는 전능성을 회복시켜주는 전능성 인자 등으로 지칭되고 있다. 상기 유전자들은 공지의 데이터 베이스인 NCBI GenBank등에 의해서 서열, 정보 등을 확인할 수 있다.
본 발명에서 "전능성 인자(Oct4, Sox2, Klf4, 및 c- Myc 유전자) 유전자 발현을 유도하는 단계"는 세포 내에 천연적으로 존재하는 전능성 인자, 특히 Oct4, Sox2, Klf4, 및 c- Myc 유전자의 발현 수준을 증가시키는 방법일 수 있고, 유전자 변형, 발현 벡터, 외래 발현 유전자 도입, 발현 유도 효과를 가지는 물질의 처리 등을 통하여 세포 내의 전능성 인자의 발현 수준을 증가시키는 방법일 수도 있으나, 전능성 인자의 발현 수준을 증가시키는 방법인 한 제한되지 않는다. 특히, 원하는 시간 및 조건 하에서 발현을 유도하는 방법일 수 있다.
본 발명에서 분화 세포에 전능성 인자의 발현 수준을 증가시키는 단계는 도파민성 전구세포에 이를 수 있는 다분화능을 재수득할 수 있는 정도의 기간 및 발현 정도로 이루어 질 수 있다. 이는 최소 1일 이상의 기간일 수 있으며, 바람직하게는 3일 이상의 기간일 수 있다. 다만, 전능성 인자의 발현 수준을 증가시키는 단계가 길어질수록 전체 도파민 전구세포 제조기간이 늘어나 적절하지 않을 수 있어, 바람직하게는 1일 내지 6일의 기간 동안 이루어질 수 있으며, 특히 3일 내지 6일의 기간 동안 이루어질 수 있으나, 리프로그래밍 되는 세포가 배아줄기세포와 같은 수준의 전능성을 획득하기 전의 중간 유도체의 상태에 이르는 한 기간이 제한되지는 않는다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 전능성 인자로 OSKM 인자, 즉 Oct4, Sox2, Klf4, 및 c- Myc(Yamanaka 인자)를 이용하였다. 구체적으로는, 독시사이클린 처리시 OSKM 인자를 과발현하도록 형질전환된 iPS 세포(induced pluripotent stem cell)인 NGFP1(Stemgent, USA) 세포를 C57BL/6 마우스의 배반포에 주입하고 대리모 마우스 CD-1(Harlan, USA)에 착상시켜 태아로부터 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblasr)를 수득한 바 있다. 해당 MEF는 독시사이클린을 세포 배양시 첨가하면 상기 OSKM 인자가 발현되게 된다.
본 발명의 용어, "SHH(sonic hedgehog)"는 태아의 발생과정에 중요한 역할을 하는 유전자로 처음 발견이 되어, 특히 4지 발생 등에 중요한 역할을 하는 것이 알려져 있으며, 성체 조직에서는 보통 발견되지 않는 것이 알려져 있다. 본 발명에서 SHH는 추출하거나 재조합 기술을 통하여 대량 수득하거나 상업적으로 구매한 것일 수 있으며, 수득 출처에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "FGF8(Fibroblast growth factor 8)"은 섬유아세포를 자극하여 증식을 유도하는 성장인자의 일종으로, 태아의 뇌신경 발달에 중요한 역할을 하는 것이 알려져 있다. 본 발명에서 FGF8은 추출하거나 재조합 기술을 통하여 대량 수득하거나 상업적으로 구매한 것일 수 있으며, 수득 출처에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 b) 단계는 a) 단계를 거친 세포로부터 도파민성 전구세포를 제조하는 단계로, 6일 내지 10일의 기간일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 7일 내지 9일의 기간일 수 있다. b) 단계의 기간이 너무 짧은 경우에는 도파민성 전구세포로의 리프로그래밍 효율이 낮아질 수 있으며, 너무 긴 경우에는 전구세포가 아닌 도파민성 뉴런으로 바로 분화할 수 있다.
한편, b) 단계에서 처리하는 SHH는 100 내지 400 ng/mL의 농도로 처리될 수 있으며, FGF8은 50 내지 200 ng/mL의 농도로 처리될 수 있으나, 본 발명의 도파민성 뉴런 분화효율이 높은 유도 도파민성 전구세포를 생산할 수 있는 한 해당 농도에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, OSKM 인자를 발현시킨 세포를 어드벤스드 DMEM/F12 및 신경 기본배지(neurobasal medium)의 혼합배지(1:1 혼합)에 유도 인자로써 200 ng/mL SHH(Peprotech, USA) 및 100 ng/mL FGF8b(Peprotech, USA)를 포함하는 RepM-DP 배지로 배양하기 시작하여, 8일 동안 배양하였다. 반면, 대조군으로는 신경 줄기세포(NSC; neural stem cell)로의 리프로그래밍을 유도하였으며, 이를 위해, 6일차의 세포를 상기와 동일한 어드밴스드 DMEM/F12 및 신경 기본배지의 혼합배지(1:1 혼합)에 유도 인자로써 20 ng/mL FGF2, 2 ng/mL FGF4, 및 20 ng/mL EGF를 포함하는 RepM-Neural로 배양하였다.
아울러, 상기 b) 단계는 Jak-stat 신호전달 저해제 및/또는 Wnt 신호전달 작용제를 추가로 처리할 수 있다. 특히, 상기 b) 단계에서 Jak 저해제 JI1; 및 Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, Wnt16b; 베타-카테닌을 증가시키는 물질; 리튬, LiCl, 이가 아연, BIO, SB216763, SB415286, CHIR99021, QS11 수화물, TWS119, 켄폴론, 알스터폴론, 인디루빈-3-옥심, TDZD-8, CT99021 또는 Ro 31-8220 메탄설폰산염인 GSK3 억제제; Axin 억제제, APC 억제제, 노린 및 R-스폰딘 2를 포함하는 Wnt 신호전달 작용제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 추가로 처리할 수 있다.
상기 Jak-stat 신호전달 저해제는 Jak 저해제 1(Jak inhibitor 1, JI1)일 수 있다. 하지만, 개념적으로 전능성 세포를 유지하는데 중요한 신호전달이나, 유도만능 줄기세포의 만능성 확보에 중요한 신호전달을 저해하는 인자 또한 가능하다. 실시예의 Jak-stat 신호전달은 상기한 신호전달에 포함된다.
본 발명에서 용어, “Wnt 신호전달 작용제”란 배아 발생기 동안 세포운명 결정, 구조의 재구성, 극성, 형태, 유착 및 성장, 미분화 세포의 유지와 증식 등과 같은 다양한 과정을 조절하는 Wnt 신호전달계에서 신호전달을 활성화하는 물질을 의미한다 (Logan & Nusse, Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 2004; 20: 781-810). 이때, Wnt 신호전달계는 Wnt에 의해 매개되는 신호를 전달하거나 또는 베타-카테닌에 의해 매개되는 신호를 전달할 수 있는 것인 한, 제한 없이 포함될 수 있다. Wnt 신호전달이란 Wnt 신호전달 활성화를 유발하는 최초 물질인 Wnt와 그 수용체의 결합에 의해 시작되거나 또는 세포 내 Wnt 신호전달의 하위 효과물질인 베타-카테닌 (beta-catenin)의 안정화로 인해 매개되는 일련의 반응을 말한다. Wnt 신호전달 작용제는 다음과 같다.
1) Wnt 단백질의 직접적 첨가: Wnt 신호전달을 유발하는 최초 물질인 Wnt는 분비성 당단백질로 19종류가 알려져 있다: Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, Wnt16b 등이 있다.
2) 베타-카테닌을 증가시키는 물질: 대부분의 세포는 베타-카테닌 증가에 의해 Wnt 신호전달에 반응한다. 즉, 베타-카테닌의 비인산화형 (또는 안정화) 증가는 세포질 내의 베타-카테닌 증가와 세포의 핵 내의 베타-카테닌 유입의 증가를 의미한다.
3) Dishevelled의 인산화 또는 Wnt의 보조수용체인 LRP 꼬리의 인산화시키는 물질:
4) GSK3（glycogen synthase kinase 3: 글루코겐 합성효소 키나제)의 억제제: 리튬 (Li), LiCl, 이가 아연 (bivalent Zn), BIO (6-bromoindirubin-3'-oxime), SB216763, SB415286, QS11 수화물 (QS11 hydrate), TWS119, 켄폴론 (Kenpaullone), 알스터폴론 (alsterpaullone), 인디루빈-3-옥심 (Indirubin-3′-oxime), TDZD-8, CT99021, Ro 31-8220 메탄설폰산염 (Ro 31-8220 methanesulfonate salt) 등이 있다.
5) Axin, APC 등과 같은 Wnt 신호전달계의 음성적 조절자 (negative regulator)를 억제하는 물질이나, RNAi 등이 있다.
6) 노린 (Norrin), R-스포딘 2 (R-spondin2) 등과 같이 Wnt 신호전달계를 활성화시킬 수 있는 단백질: 노린은 Frizzled 4 수용체와 결합하며, R-스포딘 2는 Frizzled 8 및 LRP6와 반응한다.
7) 트랜스펙션 (transfection) 등을 포함하는 유전자 전이 (gene transfer): Wnt 과발현 구성물 또는 베타-카테닌 과발현 구성물을 이용할 수 있다.
바람직한 일 실시태양으로 상기 Wnt 신호전달 작용제는 Wnt 신호전달을 활성화시킬 수 있는 물질은 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, Wnt16b; 베타-카테닌을 증가시키는 물질; 리튬, LiCl, 이가 아연, BIO, SB216763, SB415286, CHIR99021, QS11 수화물, TWS119, 켄폴론, 알스터폴론, 인디루빈-3-옥심, TDZD-8, CT99021 또는 Ro 31-8220 메탄설폰산염인 GSK3 억제제; Axin 억제제, APC 억제제, 노린 또는 R-스폰딘 2일 수 있으며, 특히, CT99021일 수 있다.
본 발명에서 Jak-stat 신호전달 저해제는 자가재생 및 전분화능으로의 리프로그래밍에 중요한 Jak-Stat 신호전달을 저해하여 중간 유도체로 머무르는 세포의 수를 증가시켜, 결국 도파민성 전구세포로 리프로그래밍되는 것을 촉진하는 기능을 할 수 있다. 한편, 본 발명에서 Wnt 신호전달 작용제는 중뇌 도파민성 전구세포로 리프로그래밍을 촉진하는 기능을 할 수 있다.
본 발명의 유도 도파민성 전구세포 제조방법을 통하여 제조된 유도 도파민성 전구세포는 중뇌 특이적 마커를 발현하는 것일 수 있으며, 특히 En1, FoxA2, Pitx3, 또는 Nurr1 등을 발현하는 것일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, Jak 저해제 1(JI1)를 처리하여 Jak-Stat 신호전달의 저해하거나, GSK3β의 특이적 저해제인 CT99021(CT)를 처리하여 Wnt 신호전달을 활성화하였다. 이의 도파민성 세포로의 분화 효율을 확인하기 위해서, En1, Lmx1a, Foxa2, 및/또는 Corin과 같은 도파민 마커 유전자의 발현을 확인하였다. 상기 결과, 상기 JI1 및/또는 CT의 처리를 통하여 도파민 마커 유전자의 발현 비율이 현저하게 증가되는 것을 확인하였으며, 이에 따라 상기 처리를 통하여 도파민성 전구세포의 제조가 촉진됨을 확인하였다.
하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 유도 도파민성 전구세포 제조방법에 따라 제조된 유도 도파민성 전구세포로부터 중뇌 도파민성 뉴런을 제조하는 방법을 제공한다. 구체적으로는, 상기 유도 도파민성 전구세포를 배양하여 신경 줄기세포-유사 콜로니(NSC-like colony)를 분리하는 단계; 및 상기 분리된 콜로니를 단일 세포화하고, 신경 세포 분화 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 것인, 중뇌 도파민성 뉴런의 제조 방법을 제공한다.
상기 살펴본 바와 같이, 본 발명의 유도 도파민성 전구세포는 전구세포임에 따라 신경 줄기세포 유사 콜로니를 형성하며(NSC-like colony), 전구세포임에도 중뇌 마커를 발현하는 특징이 있어, 이를 분리하여 신경 세포 분화 배지에 배양하는 경우에 중뇌 도파민성 뉴런으로 분화되는 효율이 매우 높아 본 발명에서 목적으로 하는 전구세포로의 유연성과 이종성(여러 종류의 세포를 포함하는 특성)이 낮은 장점을 가지고 있다. 상기 유도 도파민성 전구세포로부터 중뇌 도파민성 뉴런으로 분화시키는 제조방법은 당업계에 알려진 일반적인 신경 세포 분화방법이 활용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, SHH 및 FGF8으로 리프로그래밍된 세포의 특성을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 무혈청 조건하에서 리프로그래밍된 iDP와 대조군으로서 iNSC로부터 분화된 동량의 도파민성 뉴런을 비교하였다. 1 내지 2주 간의 연속적인 분화 후, 리프로그래밍된 iDP에서 수득된 TH+(tyrosine hydroxylase 양성)/TUJ1+(Neuron-specific class Ⅲ beta-tubulin 양성) 도파민성 뉴런의 비율(26.9 ± 7.2%)이 iNSC(＜ 3%)에서의 수득된 비율보다 현저히 높음을 확인하였다. 이는 즉, iDP로부터 신경세포로 분화시킬 때 도파민성 뉴런의 비율이 현저히 높아진다는 것을 보여준다. 추후의 확인을 통하여 상기 도파민성 뉴런은 중뇌 특이적인 마커(En1, FoxA2, Pitx3, 및 Nurr1)를 발현함을 확인하였다.
하나의 양태로서, 본 발명은 분화 세포에 전분화 인자의 발현 수준을 증가시키는 단계; 및 상기 세포에 SHH(sonic hedgehog) 및 FGF8(fibroblast growth factor 8)을 처리하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된 유도 도파민성 전구세포를 유효 성분으로 포함하는, 세포 치료제를 제공한다. 본 발명의 세포 치료제는 파킨슨 병(Parkinson's Disease, PD)의 치료 또는 예방 효과가 있는 것일 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 세포 치료제의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 도파민성 전구세포, 분화 세포, 전분화 인자, SHH 및 FGF8는 상기 설명한 바와 동일하다.
본 발명의 용어, "파킨슨 병(Parkinson's Disease, PD)"은 뇌의 흑질(substantia nigra)에 분포하는 도파민성 뉴런이 점차 소실되어 발생하는 질병으로, 신경계의 만성 진행성 퇴행성 질환이다. 파킨슨 병 환자는 60세 이상에서 인구의 약 1%에 달하는 것으로 추정되고 있다. 파킨슨 병의 원인은 아직까지 정확하게 밝혀지지 않았으나, 유전적 요소, 돌연변이에 의한 요소, 단백질 기능 이상 등의 다인성 질환이라는 것이 정설이다. 원인은 정확하게 밝혀지지 않았으나, 결국 중뇌의 도파민성 뉴런의 소실이 일어남에 따라 증세들이 나타난다는 것은 공통적이기 때문에 해당 도파민성 뉴런의 소실을 막는 것, 도파민성 뉴런을 대체하는 것, 도파민성 뉴런의 소실에 따른 현상을 완화하는 것(levodopa) 등의 전략으로 치료하고 있다.
본 발명의 용어, "세포 치료제"는 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA 규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종 세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.
본 발명의 제조방법에 의하여 제조된 유도 도파민성 전구세포는 상기 살펴본 바와 같이 도파민성 뉴런, 특히 중뇌 도파민성 뉴런으로 분화하는 효율이 현저히 높아 기존의 신경 줄기세로부터 분화시키는 방법보다 효율이 높고, 전구세포임에 따라 체외에서 원하는 양만큼 증식시킬 수 있으며, 환자에 이식된 뒤에 주위의 세포와 적절한 링크를 형성하기(네트워크 형성)에 적합하다. 무엇보다 환자 자신의 성체 세포를 활용하기 때문에 면역원성 등의 기술적 문제, 윤리적 문제가 없다는 장점이 있다.
하나의 양태로서, 본 발명은 상기 본 발명의 유도 도파민성 전구세포 또는 도파민성 뉴런을 유효성분으로 포함하는, 파킨슨 병 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다. 특히, 유도 도파민성 전구세포를 포함하는 것일 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"이란 상기 세포의 이식에 의해 파킨슨 병을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료"란 상기 세포의 이식에 의해 파킨슨 병에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다. 파킨슨 병에 의한 증세는 일반적으로 안정떨림, 경직, 운동완만, 및 자세 불안정 등을 포함하며, 이에 동반되는 임상적 증상으로는 자율신경계 증상, 신경정신과적 증상, 인지기능장애, 수면장애, 통증, 피로, 후각장애 등이 있을 수 있다.
상기 약학적 조성물에는 본 발명의 살아있는 세포의 보관, 이식 또는 정착에 도움이 되는 당업계에서 널리 알려지거나 일반적으로 사용되는 물질을 포함할 수 있다. 즉, 이러한 약학적 조성물은 세포에 추가로 생리학적으로 받아들여질 수 있는 매트릭스(matrix) 또는 생리학적으로 받아들여질 수 있는 부형제를 포함할 수 있다. 매트릭스 및/또는 부형제의 유형은 의도된 투여 루트에 따라 당업계에서 적절하다고 여겨지는 것일 수 있다. 이 약학적 조성물은 또한 세포 치료시 함께 사용되는 다른 적합한 부형제 또는 활성 성분을 선택적으로 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 적절한 수의 유도 도파민성 전구세포 또는 도파민성 뉴런을 포함할 수 있다. 특히, 유도 도파민성 전구세포의 경우에는 105 내지 107 세포/회이고, 도파민성 뉴런의 경우에는 106 내지 109 세포/회일 수 있다.
하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 유도 도파민성 전구세포 또는 도파민성 뉴런을 개체에 이식하는 단계를 포함하는, 파킨슨 병 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 유도 도파민성 전구세포, 도파민성 뉴런, 또는 파킨슨 병은 상기 설명한 바와 동일하다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 유도 도파민성 전구세포 또는 도파민성 뉴런에 파킨슨 병 예방 또는 치료제 후보 물질을 처리하는 과정을 포함하는, 파킨슨 병 예방 또는 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 유도 도파민성 전구세포, 도파민성 뉴런, 또는 파킨슨 병은 상기 설명한 바와 동일하다.
본 발명에서 용어 "파킨슨 병 예방 또는 치료제 후보 물질"은 통상적인 선정방식에 따라 파킨슨 병의 예방 또는 치료의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 기타 추출물 또는 천연물, 또는 화합물 등이 될 수 있다.
본 발명의 파킨슨 병 예방 또는 치료제 스크리닝 방법은, 본 발명의 유도 도파민성 전구세포 또는 도파민성 뉴런에 상기 후보 물질들을 처리하여, 후보 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하는 방식으로 고안되었다.
구체적으로는, 본 발명의 유도 도파민성 전구세포 또는 도파민성 뉴런에 상기 파킨슨 병 예방 또는 치료제 후보 물질을 처리한 경우에, 후보 물질을 처리하지 않은 대조군에 비하여, 세포의 증식력이 증가되거나, 세포의 활성이 증가되거나, 각종 스트레스에 대한 생존율이 높아지는 경우, 해당 후보 물질을 파킨슨 병 예방 또는 치료제로 판단하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "대조군"이란 파킨슨 병 예방 또는 치료제 후보 물질을 처리하지 않은 유도 도파민성 전구세포 또는 도파민성 뉴런을 포함하는 군으로, 상기 후보 물질을 처리한 군과 병렬관계에 속하는 세포를 포함하는 군을 의미한다.
이러한 스크리닝 방법에 의하여 선택된 물질은 이후의 파킨슨 병 예방 또는 치료제 개발 과정에서 선도 물질(leading compound)로 작용하게 되며, 선도 물질을 변형시키고 최적화함으로써, 새로운 파킨슨 병의 예방 또는 치료제를 개발할 수 있다.
본 발명의 유도 도파민성 전구세포 제조방법에 의하여 제조된 전구세포는 도파민성 뉴런으로 분화되는 효율이 기존 방법들에 비하여 현저히 높으며, 환자 체세포를 이용할 수 있어 면역원성 등의 부작용과 윤리적 문제가 없어, 해당 분야에서 널리 사용될 수 있다.
도 1a는 리프로그래밍 가능한 마우스 배아 섬유 아세포의 유도 도파민성 전구세포로의 직접 리프로그래밍을 나타내는 개요도이다.
도 1b는 유도 도파민성 전구세포로(iDP)의 직접 리프로그래밍 과정에서 배양 일자에 따른 NSC 유사 콜로니의 생성을 나타내는 명시야 현미경상을 나타내는 도이다(스케일 바=100μm).
도 1c는 도파민성 전구세포로 직접 리프로그래밍하는 중에 주요한 중뇌 도파민성 신경 전구세포의 마커들(Foxa2, Lmx1a, 및 Ngn2)이 유도 신경 줄기세포(iNSC)로 직접 리프로그래밍하는 것과 다르게 발현하는 것을 비교하여 나타내는 유전자 발현 분석 결과 그래프이다.
도 1d는 유도 신경 줄기세포 및 유도 도파민성 전구세포를 최종적으로 분화시킨 세포에 대한 면역세포화학법 분석 결과를 나타내는 도이다. 도파민성 전구세포의 마커인 TH(붉은색)를 발현하는 세포는 iDP에서 분화한 세포에 더 많이 존재한다. 뉴런의 마커인 TUJ1는 녹색으로 나타난다. 스케일 바는 50μm이다.
도 1e는 TUJ1을 발현하는 뉴런에 대해 TH를 발현하는 뉴런의 백분율을 계산하여 나타낸 그래프이다(Mean ± SE, n=6, p＜0.01).
도 2a는 Jak 저해제 1(JI1) 처리에 의하여 증가된 도파민성 마커들의 정량적 PCR 분석 결과를 나타내는 도이다. 도면에 나타낸 모든 값은 EGF를 처리한 iNSC의 발현에 대한 상대적인 발현값으로 나타내었다. 통계적 분석은 Student’s t-test를 이용하여 수행하였다.
도 2b는 JI1을 처리한 배양에서 중뇌 도파민성 마커인 En1가 증가되었음을 보여주는 면역세포화학 분석 결과이다. 스케일 바는 50μm이다.
도 2c는 및 도 2d는 대표적인 도파민성 전구세포(DP) 마커인 Corin의 발현을 측정함으로써 GSK3β 저해제의 최적 처리 시간 및 농도를 확인한 도이다. 저해제는 실험적으로 정해진 날로부터 12일차까지 첨가하였다. 모든 값은 CT를 처리하지 않은 대조군(SF+JI1)에 대한 상대적 발현값으로 나타내었다. 통계적 분석은 Student’s t-test를 이용하여 수행하였다. Mean ± SE; n=3, p<0.01(*), p<0.001(**)
도 2e는 다양한 환경에서 리프로그래밍된 세포로부터 분화한 전체 뉴런(TUJ1+) 중에서 TH+인 뉴런의 백분율을 면역세포화학 분석으로부터 계산해 낸 값을 나타낸 그래프이다. Mean ± SE; n=7-10, p<0.001(**)
도 3a는 마우스 섬유아세포의 iDP로의 직접 리프로그래밍을 위한 최적화된 프로토콜을 나타내는 개요도이다.
도 3b는 CT 및 JI1으로 처리된 iDP로부터 분화된 뉴런에서 TH, Nurr1, Pitx3, Lmx1A, 및 FoxA2와 같은 도파민성 뉴런 마커의 발현을 면역세포화학 분석을 통해 나타낸 도이다.
도 3c는 KCl을 높은 농도로 처리한 경우(HK, High concentration of KCl), 낮은 농도로 처리한 경우(LK, low concentration of KCl)에 비하여 도파민의 분비가 현저히 증가하는 것을 보여주는 도이다.
도 3d는 TTX(tetrodotoxin) 처리 전 후에 단계적 전류 주입법에 의한 막전위 변화와 활동전위(Action potentials, APs)를 측정한 대표도이다.
도 3e는 휴지기 막전위의 세포에서 보여지는 자발적 활동전위를 측정한 도이다.
도 3f는 반발 탈분극(rebound depolarization)을 세포의 막전위 변화를 측정한 도이다.
도 4a는 TTF-iNSC 또는 TTF-iDP로부터 최종적으로 분화된 세포를 면역세포화학법으로 분석하여 나타낸 도이다. 도파민성 전구세포의 마커인 TH(붉은색)를 발현하는 세포는 TTF-iDP에서 분화한 세포에 더 많이 존재한다. 스케일 바는 50μm이다.
도 4b는 전체 뉴런(TUJ1+)에 대해 TH를 발현하는 뉴런의 백분율을 구한 값을 나타내는 도로서, 그 값은 31.7% ± 7.3%이다. 통계적 분석은 Student’s t-test를 를 이용하여 수행하였다. Mean ± SE, p<0.01(*). 스케일바 = 50 μm.
TH+ 뉴런은 Nurr1, Foxa2, Pitx3, 및 En1 도파민성 뉴런 마커(붉은색)를 발현한다. 스케일바 = 50 μm.
도 5는 iDP로 직접 리프로그래밍하는 동안에 뉴런 및 중뇌 도파민성 신경전구세포 마커의 유전자 발현을 분석한 도이다. 모든 값은 0일차에 대한 상대값이다. Mean ± SE; n=3-5.
도 6은 직접 리프로그래밍된 세포의 면역세포화학 분석 결과를 나타낸 도이다. Corin을 발현하는 세포(붉은색)는 Jak 저해제 1 및 CT 99021로 처리된 세포에서 검출이 가능하며 다량으로 존재한다. 스케일바 = 200 μm
도 7은 분화된 세포들 중에서 TH에 양성인 뉴런의 면역세포화학 분석 결과를 나타낸 도이다. TH+(녹색)/TUJ1+(붉은색)인 세포는 리프로그래밍 조건에서 배양된 세포들을 나타내는 이미지에서 확인할 수 있다. 스케일바 = 50 μm.
도 8a는 13일차에 분리 배양한 iDP 콜로니에서 Corin(붉은색)을 면역세포화학법으로 분석한 결과를 나타낸 도이다. Corin 양성 세포는 FGF2를 포함한 배양배지에서 18일차에 증가되었다(도 8a의 A). 또한, Corin(붉은색)과 분열하는 세포 표지인자인 Ki67(녹색)이 함께 동시에 염색되는 것을 확인하였다(도 8a의 B). (도 8a의 A ; 스케일바 = 200 μm, 도 8a의 B ; 스케일바 = 100 μm).
도 8b는 유동 세포분석법(flow cytometry analysis)의 결과로부터 7.26%의 세포가 모두 18일차에 Corin을 발현한다는 것을 나타낸다. Croin을 발현하는 세포군은 분리가 가능하고 다량으로 존재하며, 16.22%를 차지하는 R2군에 해당한다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에서 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것으로 해석되지는 않는다.
한편, 본 실시예에서 입수처가 명기되지 않은 시약들은 모두 Invitrogen (http://www.invitrogen.com)에서 구매한 것들이다.
실시예 1. 마우스 배아 섬유아세포( MEF )의 도파민성 전구세포( DP )로의 직접 리프로그래밍 및 분화 확인
< 실시예 1-1> 마우스 배아 섬유아세포( MEF )의 도파민성 전구세포( DP )로의 직접 리프로그래밍
본 발명의 도파민성 전구세포(DP, dopaminergic neuronal progenitor)로 직접 리프로그래밍하는 방법을 수행하는 데 있어, 직접 리프로그래밍의 대상 세포인 마우스 배아 섬유아세포(MEF, mouse embryonic fibroblast)는 이전 문헌(Kim, J. et al. Direct reprogramming of mouse fibroblasts to neural progenitors. Proc Natl Acad Sci U S A 2011;108:7838-7843)에서 설명한 것과 같이 준비하였다.
구체적으로는, 독시사이클린(Dox, Doxycycline)을 처리하면 Oct4, Sox2, Klf4, 및 c- Myc과 같은 네 종류의 전분화 인자(Yamanaka 인자 또는 OSKM 인자)의 발현이 유도되는 iPS 세포(induced pluripotent stem cell)인 NGFP1(Stemgent, USA) 세포를 C57BL/6 마우스의 배반포에 주입하고 대리모 마우스 CD-1(Harlan, USA)에 착상시켰다. 착상 후, 12.5 내지 13.5일에 상기 대리모 마우스로부터 배아를 분리하여, 머리, 기관, 척수 및 생식기관 등의 내장기관을 제거하고 MEF를 배양한 후 Puromycin을 처리하여 선별한 후 사용하였다.
상기 선별된 MEF 세포를 2 × 104 세포/cm2의 농도로 Matrigel(BD Biosciences, USA)이 코팅된 배양용기에 접종하여, 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS), 1% 비필수 아미노산(NEAA, nonessential amino acid), 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S, Penicillin/Streptomycin)이 함유된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)으로 배양하였다.
도 1a에서 개시된 바와 같이, 세포 분주 후 1일 차에(D1) 10% 넉-아웃 혈청 대체제(knock-out serum replacer), 5% FBS, 1% NEAA, 2 mM GlutaMax(Invitrogen, USA), 및 0.055 mM 베타-메르캅토에탄올(β-mercaptoethanol)이 함유된 넉-아웃 DMEM을 포함하는 리프로그래밍 시작배지로 교체해주고, 해당 배지로 5일차(D5)까지 세포를 배양하였다. 한편, OSKM 인자를 발현시키는 독시사이클린(Dox)은 분주한 날(D0)부터 5일차(D5)까지 배지에 넣어주었다.
분주 후 5일차가 지난 후(D6), 특정 세포(도파민성 전구세포 또는 신경 줄기세포)로의 리프로그래밍을 유도하기 위해, 배지를 달리하여 배양하였다.
먼저, 도파민성 전구세포(DP)로의 리프로그래밍을 유도하기 위하여, 6일차의 세포를 1× N2, 1× B27, 0.05% BSA, 2 mM GlutaMax, 0.11 mM 베타-메르캅토에탄올을 포함하는 어드벤스드 DMEM/F12 및 신경 기본배지(neurobasal medium)의 혼합배지(1:1 혼합)에 유도 인자로써 200 ng/mL SHH(Peprotech, USA) 및 100 ng/mL FGF8b(Peprotech, USA)를 포함하는 RepM-DP 배지로 배양하기 시작하여, 8일 동안 배양하였다. 반면, 대조군으로는 신경 줄기세포(NSC; neural stem cell)로의 리프로그래밍을 유도하였으며, 이를 위해, 6일차의 세포를 상기와 동일한 어드밴스드 DMEM/F12 및 신경 기본배지의 혼합배지(1:1 혼합)에 유도 인자로써 20 ng/mL FGF2(fibroblast growth factor 2), 2 ng/mL FGF4(fibroblast growth factor 4), 및 20 ng/mL EGF(epidermal growth factor)를 포함하는 RepM-Neural로 배양하였다.
상기에서 각각 상이한 배지로 배양한 세포에 대하여, 신경세포 분화를 위하여 신경 줄기세포-유사 콜로니를 선택하고 Accutase(Millipore, http://www.millipore.com)를 이용하여 단일 세포로 분리한 후, 폴리-오르니틴/라미닌으로 코팅된 배양용기 상에 1×N2, 1×B27, 1.0 mM 글루타맥스, 0.11 mM 베타-메르캅토에탄올, 1.0 mM 디부틸일-cAMP(Enzo, http://www.enzolifesciences.com), 0.2 mM 아스코빈산(Sigma), 10 ng/mL BDNF(brain-derived neurotrophic factor; Peprotech), 및 10 ng/mL GDNF(glial cell line-derived neurotrophic factor; Peprotech)를 함유한 DMEM/F12을 포함하는 신경 세포 분화배지로 배양하였다. 매 3 내지 4일 마다 새 배지로 교체해 주었다.
상기와 같이, 본 발명자들은 중뇌 도파민 전구세포(DP)로의 직접 리프로그래밍을 위하여 SHH 및 FGF8을 처리하였다. OSKM 인자들을 유도한지 5일 후에, 세포들은 SHH 및 FGF8의 존재 하에서 추가적으로 배양하였다(도 1a). 대조군으로 유도 신경 줄기세포(iNSC; induced neural stem cell) 생성을 위해, FGF2, EGF, 및 FGF4를 배양 배지에 첨가하였다. SHH 및 FGF8 을 처리한 경우, D0로부터 약 13일 후에 NSC 유사 콜로니가 생성되는 것을 확인하였다(도 1b).
< 실시예 1-2> 정량적 RT -PCR( Quantitative RT - PCR )
상기 실시예 1-1에서 배양한 세포의 Total RNA는 Trizol 용액(Invitrogen)을 이용하여 배양된 세포로부터 추출하였다. 이후, 상기 total RNA에 대하여, 1 ㎍의 total RNA로부터 SuperScript Ⅲ Reverse Transcriptase Kit(Invitrogen) 및 oligo(dT) primers(Invitrogen)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 cDNA를 합성하였다. 정량적 RT-PCR은 Power SYBR Green Master Mix(Takara, http://www.takara.com)를 이용하여 수행되었으며, 7500 Fast Real-Time PCR system (Applied Biosystems, http://www.appliedbiosystems.com)에서 분석하였다. 이에 사용한 프라이머는 하기 표 1과 같다.
유전자 프라이머 방향 서열(5'->3')
CORIN Forward
(서열번호 1)		 AGT GCC TCT CCT CGA GAT CC
Reverse
(서열번호 2)		 CTC TCA AGA CCC TCT TTG GGG
EN1 Forward
(서열번호 3)		 CAA GAC TGA CTC ACA GCA ACC
Reverse
(서열번호 4)		 ACT CCG CCT TGA GTC TCT GC
FOXA2 Forward
(서열번호 5)		 CTG GGA GCC GTG AAG ATG GA
Reverse
(서열번호 6)		 ATT CCA GCG CCC ACA TAG GA
PAX2 Forward
(서열번호 7)		 GGC ATC TGD GAT AAT GAC ACA
Reverse
(서열번호 8)		 GAT CCC GTT GAT GGA GTA GGA
MASH1 Forward
(서열번호 9)		 CCC TGA AAC TGG GTT GAT GT
Reverse
(서열번호 10)		 AAA GGC TGT CCG AGA ACT GA
SOX2 Forward
(서열번호 11)		 TGC CTC TTT AAG ACT AGG GCT G
Reverse
(서열번호 12)		 CGC CGC GAT TGT TGT GAT TA
LMX1A Forward
(서열번호 13)		 GGA CCA TAA GCG ACC CAA AC
Reverse
(서열번호 14)		 CCT GAA CCA CAC GGA CAC TC
MSX1 Forward
(서열번호 15)		 GCC TCT CGG CCA TTT CTC AG
Reverse
(서열번호 16)		 CGG TTG GTC TTG TGC TTG CG
NGN2 Forward
(서열번호 17)		 GCT GTG GGA ATT TCA CCT GT
Reverse
(서열번호 18)		 AAA TTT CCA CGC TTG CAT TC
GAPDH Forward
(서열번호 19)		 TGT TCC TAC CCC CAA TGT GT
Reverse
(서열번호 20)		 TGT GAG GGA GAT GCT CAG TG
< 실시예 1-3> 면역세포화학법
상기 실시예 1-1에서 배양한 세포를 PBS에 녹인 4% 포름알데히드로 10분 동안 처리하여 고정(fixing)한 후에, PBS로 4 회 세척하였다. 상기 고정된 세포는 PBS에 녹인 Triton X-100, 10% FBS, 및 1% BSA 용액으로 실온에서 1 시간 동안 블락킹(blocking) 및 투과 처리(permeablization)하였다. 이후, PBS로 3 회 세척한 후에, 블락킹 용액(10% FBS 및 1% BSA를 포함한 PBS)에 1차 항체를 로 1시간 동안 배양하였다. 사용한 1차 항체는 하기 표 2에 개시하였다. 1차 항체 반응 후에, 세포를 PBS로 3회 세척하고, 2차 항체 anti-mouse Alexa 488-conjugated(1:500, Invitrogen), anti-mouse Alexa 546-conjugated(1:500, Invitrogen), anti-rabbit Alexa 488-conjugated(1:500, Invitrogen), 또는 anti-rabbit Alexa 546-conjugated(1:500, Invitrogen)으로 1% BSA가 포함된 PBS에서 1 시간 동안 실온에서 배양하였다. 형광 이미지는 Axio VertA.1 microscope(Carl Zeiss, http://www.zeiss.com)를 이용하여 수득하였다.
사용한 항체 목록
목적 단백질 회사(cat.No.) 희석비율
TH Sigma (T2928) 1:1000
TH Millipore (AB152) 1:1000
TUJ1 Covance (MMS-435P) 1:500
Nurr1 Santa Cruz (sc-990) 1:1000
Pitx3 Abcam (AB5722) 1:200
EN1 DSHB (4G11-S) 1:100
Lmx1a Millipore (AB10533) 1:1000
FoxA2 Abcam (AB40874) 1:1000
Corin Abnova (PAB12760) 1:500
Ki67 BD (550609) 1:200
본 발명자들은 SHH 및 FGF8을 처리한 경우, D0로부터 약 13일 후에 NSC 유사 콜로니가 생성되는 것을 확인하였고(도 1b), Pax2, Lmx1a, Msx1, Ngn2, Foxa2, Sox2, 및 Corin과 같은 중뇌 도파민성 전구세포의 마커 유전자들이 dox 유도 7일 후, SHH 및 FGF8 첨가 2일 후부터 검출되었다(도 1c, 도 5). 상기 결과는 새롭게 적용된 환경인자 SHH 및 FGF8에 의해 DP로의 세포 분화를 특이적으로 유도할 수 있음을 보여준다.
SHH 및 FGF8으로 리프로그래밍된 세포의 특성을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 무혈청 조건하에서 리프로그래밍된 유도 도파민성 전구세포(iDP, induced dopaminergic progenitor)와 대조군으로서 유도 신경 줄기세포(iNSC, induced neural stem cell)로부터 분화된 동량의 도파민성 뉴런을 비교하였다. 1 내지 2주 간의 연속적인 분화 후, 리프로그래밍된 iDP에서 수득된 TH+(tyrosine hydroxylase 양성)/TUJ1+(Neuron-specific class Ⅲ beta-tubulin 양성) 도파민성 뉴런의 비율(26.9 ± 7.2%)이 iNSC(＜ 3%)에서의 수득된 비율보다 현저히 높음을 확인하였다.
이러한 결과는 SHH 및 FGF8으로 리프로그래밍된 iDP가 iNSC에 비해 도파민성 뉴런을 생성하는 능력이 높다는 것을 나타낸다. 즉, 본 발명자들은 SHH 및 FGF8을 포함한 조건하에서 전분화 인자-매개 직접 리프로그래밍(pluripotency factor-mediated direct reprogramming, PDR) 접근법에 의해 도파민성 뉴런 생성능이 높은 iDP를 수득할 수 있었다.
실시예 2. 도파민성 전구세포 직접 리프로그래밍에서 Jak 저해제 및 Wnt 신호전달 작용제의 역할
본 발명자들은 세포를 유도 도파민성 전구세포(iDP, induced dopaminergic neuronal progenitors)로 리프로그래밍할 수 있었지만, 상기 iDP 세포가 TH+ 뉴런으로 분화하는 효율은 ESC로부터의 분화 효율과 유사한 정도였다. 이에, 전체적인 TH+ 뉴런으로의 분화 효율을 높이기 위해, 먼저 전분화 인자-매개 직접 리프로그래밍 과정에서 심근세포로의 분화를 유도하는 Jak-Stat 신호전달을 Jak 특이적 소분자 저해제를 이용하여 저해하였다.
본 발명자들은 자가재생 및 전분화능으로의 리프로그래밍에 중요한 Jak-Stat 신호전달을 저해함으로써, 중간 단계의 세포 풀이 다분화능 상태로 가는 다른 경로를 차단함으로써 DP로 분화시킬 수 있음을 가정하고 실험을 진행하였다.
실험 결과 예상한 대로, 5일에서 7일차 사이의 일시적으로 Jak 저해제 1(JI1)를 처리한 경우, En1, Lmx1a, Foxa2, 및 Corin과 같은 도파민 마커 유전자의 발현이 비처리군에 비해 현저하게 증가하는 것을 확인하였으며(도 2a), 면역세포화학법을 이용하여, JI1을 처리한 iDP 세포군에서 En1을 발현하는 세포들이 현저히 늘어난 것을 확인할 수 있었다(도 2b). 따라서, 중간 단계의 세포에 대한 Jak-Stat 신호전달의 저해가 도파민성 전구세포로의 직접적인 리프로그래밍에 효과적인 것을 확인할 수 있었다.
다음으로, 본 발명자들은 초기(E9.5-E10.5) 및 후기(E11.5-E12.5) 단계의 중뇌 도파민성 뉴런 발생 및 hESC 또는 iPSC의 도파민성 뉴런으로의 분화에 중요한 인자인 Wnt 신호전달에 관하여 고려하였다. iDP 분화를 촉진하기 위해, GSK3β의 특이적 저해제인 CT99021(CT)를 처리하여 Wnt 신호전달을 활성화하였으며, CT의 최적 처리시간 및 처리농도를 찾기 위한 실험을 진행하였다. 분화 정도는 중뇌 도파민성 뉴런의 주요 마커인 Corin 단백질의 발현 수준으로 확인하였다(도 2c, 도 2d).
상기 실험의 결과, CT를 특정 농도 및 특정한 시간 동안 처리하였을 때, 도파민성 뉴런으로의 분화가 촉진되는 것을 확인하였다. 한편, CT를 처리한 배양에서만 Corin을 발현하는 세포가 검출되었다(도 6). 이에 더불어, 본 발명자들은 iDP 발생에 있어 CT 및 JI1의 조합 처리를 또한 시험해 보았다(도 2e). 그 결과, JI1을 단독으로 처리한 경우 TH+/TUJ1+ 뉴런이 44.3 ± 8.4% 생성된 것에 비하여, CT 및 JI1를 같이 처리하는 경우에 TH+/TUJ1+ 뉴런이 57.2 ± 7.2% 생성되었다(도 2e). 즉, 본 발명의 PDR 과정 중에 JI1 및 GSK3β 저해제의 조합 처리를 통하여 중뇌 특이적 과정이 현저하게 촉진한다는 것을 확인하였다. 게다가, 최대의 리프로그래밍 효율을 얻기 위해서는, CT의 농도 및 처리 시간이 최적화될 필요가 있음을 확인하였다.
상기 JI1 및 CT의 조합 처리를 통하여 iDP 생성 과정을 최적화한 후에(도 3a), 본 발명자들은 iDP로부터 분화된 도파민성 뉴런의 특징들을 분석하였다. 대부분의 TH+ 도파민성 뉴런은 Nurr1, FoxA2, Lmx1a, Pitx3, 및 En1이 동시에 염색되는 것을 확인하였다(도 3b). 이는 본 발명의 분화된 도파민성 뉴런이 중뇌 도파민성 뉴런의 특징을 가지고 있으며, 따라서 파킨슨 병(PD; Parkinson's disease)에 대한 세포 치료에 이용될 수 있는 잠재력을 가지고 있음을 나타낸다. 아울러, 본 발명자들은 이들 Corin을 발현하는 iDP가 실험관 내에서 자가증식(self-renew)을 할 수 있고, 이들 세포가 FGF2 처리에 의하여 효과적으로 유지(maintaining)될 수 있음을 알 수 있었다(도 8a, 도 8b).
실시예 3. 효소연결면역흡착검사( Enzyme - linked immunosorbent assay )를 통한 도파민의 측정
상기 실시예 1 및 2에서 제조한 신경 전구세포로부터 도파민성 뉴런으로 분화를 유도한 후 14일이 지난 후, 기존에 알려진 방식으로 상기 분화된 세포에서의 도파민 분비량을 측정하였다. 구체적으로는, 세포를 24-웰 배양접시에 부착시킨 후, PBS로 세척하였다. 이후에, 농도를 달리한 KCl 용액(낮은 농도 ; 4.5 mM/ 높은 농도 56 mM)을 200 ㎕을 10분간 처리하였다. 이 후, 각 실험군(KCl 낮은 농도 처리군/ KCl 높은 농도 처리군)의 상청액(Supernatants)에서 도파민의 양을 효소연결면역흡착검사 키트(Rocky Mountain Diagnostics, Colorado, USA)를 제조사의 지시에 따라 이용하여, 측정하였다(도 3c).
도 3c에서 확인할 수 있듯이, KCl을 높은 농도로 처리한 경우(HK, High concentration of KCl), 낮은 농도로 처리한 경우(LK, low concentration of KCl)에 비하여 도파민의 분비가 현저히 증가하는 것을 확인하였다.이를 통하여, 도파민성 뉴런으로의 유도가 효율적으로 이루어졌음을 확인하였다.
실시예 4. 전기생리학적 검사( Electrophysiology )
본 발명에 의해 직접리프로그래밍된 도파민성 전구세포를 신경세포로 최종적으로 분화를 시킨 후에, 전-세포 패치클램프 기술(whole-cell patch clamp technique)을 이용한 전기생리학 검사를 수행하였다. 구체적으로는, 세포들을 커버슬립에 분주한 후, 기록용 수중 챔버에 옮겨 지속적으로 산소화된(95% O2, 5% CO2) 인공 뇌척수액(ACSF; artificial cerebrospinal fluid, 124 mM NaCl, 3.0 mM KCl, 1.23 mM NaH2PO4, 2.2 mM CaCl2, 1.2 mM MgCl2, 26 mM NaHCO3, 및 10 mM glucose, pH 7.4)을 관류시켰다. 전-세포 패치 클램프 기록은 유리 파이펫 전극(3-5 MΩ)을 패치전극(Patch electrodes)으로 이용하여 31℃에서 측정하였다.
활동 전위(Action potentials, APs)를 측정하기 위해서, 유리 파이펫을 KOH pH7.4로 완충된 내부 용액(135 mM K-gluconate, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 0.5 mM CaCl2, 5 mM Mg-ATP, 및 0.3 mM Na-GTP)으로 채웠다. 휴지기 막전위는 막을 깨고 실험을 위한 전-세포 형태(Whole-cell configuration)를 형성하자마자 측정한 측정값으로 추정하였다. 활동 전위는 단계적 전류 주입법(단계당 10 pA, 전류 클램프 모드, 500 msec씩)을 통하여 촉발하였다. 역치(Threshold), 진폭(Amplitude), 반진폭너비(half-width), 및 최초 활동 전위의 후과분극(afterhyperpolarization ; AHP)을 분석하였다. 자발적 점화(spontaneous firing)는 0 pA-전류 주입에서 측정하였고, 반발적 활동전위(rebound APs)는 과분극 전류(-20 pA)를 주입하여 유도하였다. 활동 전위를 차단하기 위해서는, 1μM의 테트로도톡신(tetrodotoxin, TTX)를 처리하였다. 패치-클램프 기록은 MultiClamp 700B amplifier 및 Digidata1440(Axon instruments)를 이용하여 수득하였다. 수득된 데이터는 pCLAMP version 10.2(Axon instruments) 및 Mini-Analysis Program(Synaptosoft)를 이용하여 분석하였다. 이를 통하여, 도파민성 뉴런으로의 유도가 효율적으로 이루어졌음을 확인하였다.
실시예 5. 렌티 바이러스 제조 및 마우스 꼬리 말단 섬유아세포( mouse tail tip fibroblasts , TTF ) 의 리프로그래밍
렌티바이러스는 기존에 알려진 방법과 동일한 방법을 사용하여 준비하였다(Kim, J. et al. 2011). 구체적으로는, 5 × 106 개의 293T 세포를 100 mm 플레이트에 분주하고, 37℃에서 하루 동안 배양했다. 상기 배양 후, 8 μg pHAGE2-TetOminiCMV-STEMCCA 또는 FUW-M2rtTA(Addgene, http://www.addgene.org)을 제조사의 지시에 따라 packaging mixture(5 μg psPAX2 및 2.5 μg pMD2.G) (Addgene) 그리고 FuGENE HD transfection reagent(Promega, http://www.promega.com)와 함께 상기 분주한 293T 세포에 형질전환하였다. 형질전환된 세포를 37℃에서 72 시간 배양한 후에, 사용 전에 0.45 μm 필터로 여과하여 상층액을 준비하였다.
한편, 마우스 꼬리 말단 섬유아세포(TTF; mouse tail tip fibroblasts) 세포는 기존에 알려진 방법과 동일한 방법을 사용하여 준비하였다(Kim, J. et al. 2011). 구체적으로는, 마우스의 꼬리 조직을 잘게(0.5 cm 미만) 잘라 젤라틴으로 코팅된 플레이트에서 MEF 배지로 배양하였다. 조직으로부터 이동하여 빠져나온 세포를 새로운 플레이트로 옮기면서 계대배양하여 마우스 꼬리 말단 섬유아세포를 수득하였다.
상기 수득한 세포를 STEMCCA 및 rtTA를 발현하는 바이러스로 형질전환한 후, 세포를 리프로그래밍할 수 있는 MEF로 이용하기 위해 절차에 따라 리프로그래밍하였다.
마지막으로, 본 발명의 Dox에 의한 유도가 가능한 STEMCCA 시스템을 이용하여 마우스 성체 TTF에 본 발명의 iDP로의 직접 리프로그래밍 프로토콜의 적용하여 분화 효율을 측정하였다. 이에, MEF로부터 유도된 iDP를 관찰한 결과, TTF-iNSC로부터 분화시킬 때보다 TTF-iDP로부터 분화시킬 때 TH 발현 뉴런으로의 분화 효율이 높은 것을 확인하였다(도 4a, 도 4b). 또한, 이들 TH 발현 뉴런에서 중뇌 특이적 마커인 En1, FoxA2, Pitx3, 및 Nurr1이 발현하는 것을 확인하였다(도 4c). 따라서, 본 발명의 방법을 이용하여 성체 마우스 섬유아세포를 중뇌 DP로 리프로그래밍할 수 있음을 확인하였다.
실시예 6. 통계적 분석
렌티바이러스 결과는 평균 ±SE로 나타내었으며, Student’s unpaired t-test를 수행하여 p 값이 0.01 또는 0.001 이하인 값을 통계 평가에 유의미한 것으로 평가하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> A method for preparation of induced dopaminergic progenitors using direct reprogramming <130> PA130293KR <160> 20 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CORIN rt-primer forward <400> 1 agtgcctctc ctcgagatcc 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CORIN rt-primer reverse <400> 2 ctctcaagac cctctttggg g 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EN1 rt-primer forward <400> 3 caagactgac tcacagcaac c 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EN1 rt-primer reverse <400> 4 actccgcctt gagtctctgc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXA2 rt-primer forward <400> 5 ctgggagccg tgaagatgga 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXA2 rt-primer reverse <400> 6 attccagcgc ccacatagga 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAX2 rt-primer forward <400> 7 ggcatctgdg ataatgacac a 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAX2 rt-primer reverse <400> 8 gatcccgttg atggagtagg a 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MASH1 rt-primer forward <400> 9 ccctgaaact gggttgatgt 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MASH1 rt-primer reverse <400> 10 aaaggctgtc cgagaactga 20 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX2 rt-primer forward <400> 11 tgcctcttta agactagggc tg 22 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX2 rt-primer reverse <400> 12 cgccgcgatt gttgtgatta 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LMX1A rt-primer forward <400> 13 ggaccataag cgacccaaac 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LMX1A rt-primer reverse <400> 14 cctgaaccac acggacactc 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MSX1 rt-primer forward <400> 15 gcctctcggc catttctcag 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MSX1 rt-primer reverse <400> 16 cggttggtct tgtgcttgcg 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NGN2 rt-primer forward <400> 17 gctgtgggaa tttcacctgt 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NGN2 rt-primer reverse <400> 18 aaatttccac gcttgcattc 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH rt-primer forward <400> 19 tgttcctacc cccaatgtgt 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH rt-primer reverse <400> 20 tgtgagggag atgctcagtg 20

Claims (16)

  1. a) 성체 세포의 하나 이상의 역분화 인자 발현을 유도하는 단계; 및
    b) 상기 a) 단계의 세포에 SHH(sonic hedgehog) 및 FGF8(fibroblast growth factor 8)을 처리하여 성체 세포로부터 유도 도파민성 전구세포(induced Dopaminergic Progenitor; iDP) 로의 직접 리프로그래밍하는 것을 특징으로 하는, 유도 도파민성 전구세포 제조방법으로서,
    상기 유도 도파민성 전구세포는 Pax2, Lmx1a, Msx1, Ngn2, Foxa2, Sox2, 및 Corin 군에서 선택되는 하나 이상의 마커를 발현하는 것인, 유도 도파민성 전구세포 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 역분화 인자는 Oct4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc 유전자를 포함하는 것인, 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 성체 세포는 섬유아세포인 것인, 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 a) 단계는 3일 내지 6일 동안 수행되는 것인, 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 b) 단계는 6일 내지 10일 동안 수행되는 것인, 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 b) 단계에서 SHH은 100 내지 400 ng/mL의 농도로 처리하고, FGF8은 50 내지 200 ng/mL의 농도로 처리하는 것인, 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 b) 단계에서 Jak 저해제인 JI1 및 하기 ⅰ) 내지 ⅵ)의 Wnt 신호전달 작용제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 추가로 처리하는 것인, 제조방법:
    ⅰ) Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11 및 Wnt16b;
    ⅱ) GSK3 억제제인 리튬, LiCl, 이가 아연, BIO, SB216763, SB415286, CHIR99021, QS11 수화물, TWS119, 켄폴론, 알스터폴론, 인디루빈-3-옥심, TDZD-8, CT99021 및 Ro 31-8220 메탄설폰산염;
    ⅲ) Axin 억제제;
    ⅳ) APC 억제제;
    ⅴ) 노린; 및
    ⅵ) R-스폰딘 2.

  8. 제1항에 있어, 상기 성체 세포는 Oct4, Sox2, Klf4, 및 c- Myc 유전자가 발현될 수 있도록 형질전환된 것인, 제조방법.
  9. 제1항에 있어, 상기 유도 도파민성 전구세포는 중뇌 특이적 마커를 발현하는 것인, 제조방법.
  10. 제9항에 있어, 상기 중뇌 특이적 마커는 En1, FoxA2, Pitx3, 또는 Nurr1을 포함하는 것인, 제조방법.
  11. a) 성체 세포의 하나 이상의 역분화 인자 발현을 유도하는 단계;
    b) 상기 a) 단계의 세포에 SHH(sonic hedgehog) 및 FGF8(fibroblast growth factor 8)을 처리하여 성체 세포로부터 유도 도파민성 전구세포(induced Dopaminergic Progenitor; iDP) 로 직접 리프로그래밍하는 단계;
    c) 상기 b) 단계의 유도 도파민성 전구세포를 배양하여 신경 줄기세포-유사 콜로니(NSC-like colony)를 분리하는 단계; 및
    d) 상기 c) 단계의 분리된 콜로니를 단일 세포화하고, 신경 세포 분화 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 중뇌 도파민성 뉴런 제조방법으로서,
    상기 유도 도파민성 전구세포는 Pax2, Lmx1a, Msx1, Ngn2, Foxa2, Sox2, 및 Corin 군에서 선택되는 하나 이상의 마커를 발현하는 것인, 중뇌 도파민성 뉴런 제조방법.
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