KR102288424B1 - 직접 리프로그래밍을 통한 유도 도파민성 신경세포 전구체의 제조방법 - Google Patents

직접 리프로그래밍을 통한 유도 도파민성 신경세포 전구체의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102288424B1
KR102288424B1 KR1020200121802A KR20200121802A KR102288424B1 KR 102288424 B1 KR102288424 B1 KR 102288424B1 KR 1020200121802 A KR1020200121802 A KR 1020200121802A KR 20200121802 A KR20200121802 A KR 20200121802A KR 102288424 B1 KR102288424 B1 KR 102288424B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
induced
precursor
hidps
dopaminergic neuronal
cells
Prior art date
Application number
KR1020200121802A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20210034535A (ko
Inventor
김장환
이민형
손미영
전영주
백아름
이영전
서진철
정초록
Original Assignee
한국생명공학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국생명공학연구원 filed Critical 한국생명공학연구원
Publication of KR20210034535A publication Critical patent/KR20210034535A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102288424B1 publication Critical patent/KR102288424B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5058—Neurological cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5073—Stem cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/119—Other fibroblast growth factors, e.g. FGF-4, FGF-8, FGF-10
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/41—Hedgehog proteins; Cyclopamine (inhibitor)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/602—Sox-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/603—Oct-3/4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/604—Klf-4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/606—Transcription factors c-Myc
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/11—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells
    • C12N2506/115—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells from monocytes, from macrophages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1307—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from adult fibroblasts
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2835—Movement disorders, e.g. Parkinson, Huntington, Tourette

Abstract

본 발명은 성체세포로부터 직접 리프로그래밍을 통하여 유도 도파민성 신경세포 전구체를 제조하는 방법과 이를 통하여 제조된 유도 도파민성 신경세포 전구체 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 의해 제조된 유도 도파민성 신경세포 전구체는 성체세포로부터 직접 리프로그래밍 되므로 종양원성의 위험 없이 생체 내 이식이 가능하며, 증식능 및 도파민성 신경세포로의 분화능이 우수하여 파킨슨병의 세포 치료제로서 유용하게 활용될 것이다.

Description

직접 리프로그래밍을 통한 유도 도파민성 신경세포 전구체의 제조방법{METHOD FOR PRODUCING INDUCED DOPAMINEGERIC NEURONAL PROGENITORS BY DIRECT REPROGRAMMING}
본 발명은 성체세포로부터 직접 리프로그래밍을 통하여 유도 도파민성 신경세포 전구체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 이를 통하여 제조된 유도 도파민성 신경세포 전구체 및 이의 용도에 관한 것이다.
파킨슨병(Parkinson's disease, PD)은 중뇌의 흑질 치밀부에서 도파민성 신경세포(DNs)의 손실로 인해 발생하며, 이는 운동 활성의 점진적인 악화를 초래한다. 현재, PD 환자에 대한 처치의 주요 과정은 도파민 농도를 높이는 약물과 뇌심부의 신경세포를 직접 자극하는 전기 장치를 사용한 증상 완화이다. 이러한 접근법은 PD의 운동 증상을 완화시키는 데 효과적이지만, PD의 악화를 멈출 수 없다는 한계가 있다.
최근에, 새로운 PD 치료 방법으로서 도파민-분비 세포의 이식을 위하여 인간 태아 중뇌를 사용하는 세포 치환 요법이 보고되었다. 특히, 이 요법은 일부 환자에서 약물 섭취를 중단하더라도 운동 증상을 개선하고, 비-운동 증상은 18년 이상 동안 악화되지 않았다. 게다가, 이식 수용자(recipient)의 사후(postmortem) 조직 분석에서 공여자-유래 DNs는 이식 후 최대 24년 동안 선조체(striatum)에서 넓은 신경 분포를 유지하고 있었다. 이러한 결과는 이식 수용자의 뇌에서 공여자-유래 기능적인 DNs의 장기간 생존이 PD 치료의 긍정적인 결과와 관련이 있음을 입증하였다.
그러나, 증상이 심각한 PD 환자를 대상으로 수행한 이중-블라인드 연구에서는 일시적이고 경미한 임상적 효과만이 나타났다. 면역 억제제 투여 중단 후 생존 세포 수가 적은 것이 확인되었으며, 이는 이식한 조직의 면역 거부 반응으로 인한 것이며, 임상 실험 실패의 주된 원인으로 예상된다. 더욱이, 일부 수용자들에서는 이식-유발성 운동 이상증(graft-induced dyskinesia)이 발생하였고, 이들의 뇌는 이식편에서 세로토닌성 신경세포가 포함되어 있었다. 또한, 태아 조직 사용과 관련된 윤리적 문제와 한정적인 세포의 양이라는 기술적인 문제를 가지고 있었다. 따라서, PD 세포 치료 요법의 효과를 개선하기 위하여, 균질하고 면역원성이 낮은 DNs을 수득하기 위한 새로운 방법이 요구된다.
리프로그래밍(Reprogramming) 기술은 체세포의 세포 운명을 유도 만능 줄기세포(iPSCs)로 전환할 수 있는 기술이다. 인간 iPSCs(hiPSCs)는 모든 세포 유형으로 분화할 수 있는 능력과 무제한 자기 재생 특성을 고려할 때 자가 세포 치료에 적합한 세포 공급원이다.
PD의 치료를 위한 만능 줄기세포-유래 도파민성 신경세포 전구체(PSC-DPs)를 사용한 전-임상 실험에서 이식편은 양호한 생존능을 나타냈고, 설치류 및 비-인간 영장류 PD 모델에서 도파민-분비 세포로서 효과적으로 기능하였다. 이러한 명백한 효능에도 불구하고, 미분화된 PSC가 분화된 세포에 잔존할 수 있다는 가능성이 있으며, 이로 인한 종양원성의 잠재성 때문에 PSC-유래 도파민성 신경세포(PSC-DNs)의 임상적인 사용에서 안전성의 문제가 남아있다. 또한, PSC로부터 분화된 DPs는 증식 능력이 제한적이고 반복적인 계대배양 동안에 DNs로의 분화능이 점차 사라지는 것으로 보고되었다. 따라서, 성공적인 PD 치료를 위해서는 보다 안전하고 안정적으로 증식 가능한 새로운 세포가 요구된다.
한편, 직접 리프로그래밍(Direct Reprogramming) 기술은 세포 운명 전환을 위한 다른 방법으로, 표적 세포 특이성 및/또는 만능 인자의 이소성(ectopic) 발현에 의해 수행될 수 있다. 흥미롭게도, 적어도 하나의 만능 인자를 사용한 직접 리프로그래밍은 증식 가능한 줄기/전구 세포를 생성할 수 있는 것으로 보고되었다. 중요하게는, 만능 세포-특이적 인자-매개 직접 리프로그래밍(Pluripotent cell-specific factor-mediated Direct Reprogramming, PDR) 방법에 의해 리프로그래밍된 세포가 종양을 형성하지 않는다는 것이 명백해지고 있다. 추가로, 인간 유도 신경 줄기 세포(hiNSCs)는 안정적인 증식 능력, 냉동 저장 동안에 증식 및 분화의 변화없이 장기간 보관의 가능 및 분화 과정의 용이함의 이점이 있다. 따라서, PDR은 PSC-DPs의 제한된 증식 및 안정성 문제를 극복할 것으로 기대된다.
이전에, 본 발명자들은 PDR 방법으로 마우스 유도 도파민성 신경세포 전구체(miDPs)를 성공적으로 제조하였다(대한민국 공개특허 10-2015-0015294). 이에, 본 발명자들은 만능 인자의 도입 및 이어서 중뇌-특이적 신호전달 활성화에 의해 인간 성체세포가 인간 iDPs(hiDPs)로 직접 리프로그래밍되는지를 실험하였다.
본 발명의 목적은 직접 리프로그래밍을 통하여 성체세포로부터 연속적인 계대배양이 가능하고, 도파민성 신경세포로의 분화능이 우수하며, 생체 내에서 종양원성의 위험이 없는 유도 도파민성 신경세포 전구체를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 방법으로부터 제조된 유도 도파민성 신경세포 전구체를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 만능 줄기세포 유래 도파민성 신경세포 전구체와 구별되는 유도 도파민성 신경세포 전구체를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 파킨슨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 파킨슨병 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 유도 도파민성 신경세포 전구체 제조용 혼합물 또는 배지 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 도파민성 신경세포를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) 성체세포에 Oct4, Sox2, Klf4 및 Myc로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 도입하는 단계; b) 상기 세포를 EGF 및 FGF2를 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및 c) 상기 세포를 FGF8, SHH, Wnt 신호전달 작용제 및 TGF-β 억제제를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 유도 도파민성 신경세포 전구체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 제조방법으로 제조된 유도 도파민성 신경세포 전구체를 제공한다.
본 발명은 또한, (i) CORIN, FOXA2 및 LMX1A로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자가 만능 줄기세포 유래 도파민성 신경세포 전구체와 비교하여 감소된 발현을 나타내거나, (ii) EN1, PAX2, PAX5, PAX8 및 SPRY1로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자가 만능 줄기세포 유래 도파민성 신경세포 전구체와 비교하여 증가된 발현을 나타내거나, 또는 (iii) 상기 (i)의 감소된 발현 및 (ii)의 증가된 발현을 나타내는, 유도 도파민성 신경세포 전구체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 유도 도파민성 신경세포 전구체를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 유도 도파민성 신경세포 전구체에 파킨슨병 예방 또는 치료제 후보 물질을 처리하는 단계를 포함하는, 파킨슨병 예방 또는 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 유도 도파민성 신경세포 전구체를 포함하는 파킨슨병 예방 또는 치료제의 스크리닝을 위한 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, Oct4, Sox2, Klf4 및 Myc로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 도입된 인간 성체세포, EGF 및 FGF2를 포함하는 유도 도파민성 신경세포 전구체 제조용 혼합물을 제공한다.
본 발명은 또한, 유도 도파민성 신경세포 전구체, FGF8, SHH, Wnt 신호전달 작용제 및 TGF-β 억제제를 포함하는 혼합물을 제공한다.
본 발명은 또한, EGF, FGF2, Wnt 신호전달 작용제 및 TGF-β 억제제를 포함하는 유도 도파민성 신경세포 전구체 제조용 배지 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, FGF8, SHH, Wnt 신호전달 작용제 및 TGF-β 억제제를 포함하는 유도 도파민성 신경세포 전구체 제조 또는 유지용 배지 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 유도 도파민성 신경세포 전구체를 신경세포 분화 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 도파민성 신경세포의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 의해 제조된 유도 도파민성 신경세포 전구체는 환자의 성체세포를 이용하므로 면역 거부 반응, 운동 이상증 등의 부작용이 발생할 우려가 적으며, 윤리적인 문제가 없다. 또한, 연속적인 계대배양을 통한 안정적인 증식이 가능하고, 직접 리프로그래밍에 의하므로 종양원성의 위험 없이 생체 내 이식이 가능하며, 신경세포로의 분화능이 우수하여 파킨슨병의 세포 치료 요법에 유용하다.
도 1은 hiDP 직접 리프로그래밍 프로토콜 개발을 위한 인자들의 조합을 나타낸 개략도이다.
도 2는 도 1에 표시된 각각의 조건으로 hiDP 직접 리프로그래밍한 결과의 대표적인 명시야 이미지이다. 명시야 이미지는 SeV 형질도입후 22일째에 수득하였다.
도 3은 hiDP 직접 리프로그래밍의 초기 단계(d1-d8)에서, 표시된 인자들의 상이한 조합에서 만들어진 신경 콜로니-유사 형태의 콜로니 수를 정량분석한 결과이다.
도 4는 hiDP 직접 리프로그래밍의 후기 단계(d8-d21)에서, 표시된 인자들의 상이한 조합에서 만들어진 신경 콜로니-유사 형태의 콜로니 수를 정량분석한 결과이다.
도 5는 hiDP 직접 리프로그래밍 배지 중 200 ng/㎖ 또는 800 ng/㎖ SHH 농도에서의 FOXA2, SHH 및 LMX1A의 발현량을 측정한 결과이다.
도 6은 hiDP 직접 리프로그래밍 프로토콜을 나타내는 개략도 및 표시된 날의 대표적인 명시야 이미지이다. EF4C는 EGF, FGF2, CHIR99021, A83-01, 2-포스포-L-아스코르브산 및 NaB를 처리한 것을 의미하고, SF3C는 SHH, FGF8, CHIR99021, A83-01 및 2-포스포-L-아스코르브산을 처리한 것을 의미한다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에서 수득한 hiNSC와 hiDP에서 중뇌 기저판 특이적 마커인 CORIN의 발현에 대하여 면역세포화학염색법으로 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에서 수득한 hiNSC와 hiDP에서 중뇌 DP 특이적 마커들(CORIN, FOXA2, LMX1A, EN1)의 발현량을 비교하기 위하여 qRT-PCR을 수행한 결과이다. GAPDH의 Ct 값을 사용하여 dCt 값을 계산하였다.
도 9는 중뇌 특이적 마커인 EN1과 후뇌 특이적 마커인 HOXB1에 대한 면역세포화학염색을 통하여 본 발명의 일 실시예에서 수득한 hiDP의 국부적인 동일성을 확인한 결과이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에서 수득한 hiDP의 연속적인 계대배양 동안에 전체 세포의 수를 카운트한 결과이다. 데이터는 시작 세포 수에 대한 배수 변화의 로그 값을 나타낸다.
도 11은 중간 및 후기 계대배양된 hiDP에서 CORIN, Ki-67, PAX2, PAX5, FOXA2, LMX1A 및 PAX6의 발현 여부를 면역세포화학염색을 통하여 확인한 결과이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에서 수득한 hiDP에서 CORIN 및 FOXA2에 대하여 유세포 분석한 결과이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에서 수득한 hiDP 및 PSC-DP를 TOM20에 대하여 면역세포화학염색한 결과이다(상부). 하부는 형광 이미지를 Image J의 골격화 기능에 의해 변형한 결과이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에서 수득한 hiDP 및 PSC-DP의 골격화된 이미지로부터 세포 당 미토콘드리아 수를 정량분석한 결과이다. 박스 플롯 중의 각 점은 하나의 세포의 값을 나타낸다. 수평 막대는 중간 값을 나타낸다. **는 Student's t-test를 사용하여 P<0.01을 나타낸다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에서 수득한 hiDP 및 PSC-DP의 미토콘드리아 당 분지 수를 정량분석한 결과이다. 데이터는 모든 미토콘드리아 내에 존재하는 분지의 수를 나타낸다.
도 16은 DEG 분석 결과를 열 지도에 의해 시각화한 도면이다.
도 17은 PCA 플롯 분석을 통하여 출발 세포, 중간기 세포 및 최종 세포의 상이한 유전자 발현 프로파일을 나타내는 결과이다.
도 18은 모 섬유아세포(Fb)와 본 발명의 일 실시예에서 수득한 hiDP간의 어노테이션 클러스터링 분석을 수행하기 위하여 DEG를 사용한 결과이다.
도 19는 hiDP 직접 리프로그래밍 동안의 유전자 발현 수준을 "유사분열 세포 주기" GO term에서 열 지도 분석으로 시각화한 결과이다.
도 20은 전사체 프로파일의 산포도 분석을 통하여 본 발명의 일 실시예에서 수득한 hiDP는 Fb와 매우 구별되는 것임을 나타내는 도면이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에서 수득한 hiDP의 품질을 비교하기 위하여 수행한 상관도 분석 결과이다. IAP 분류의 유무에 따른 ESC 유래 DP의 전사체 프로파일을 대조군으로 사용하였다.
도 22는 hiDP 직접 리프로그래밍 동안 분석한 유전자의 H3K4me3 및 H3K27ac에 대한 열 지도 결과이다. 유전자 목록은 Fb로부터 프로모터 영역에서 H3K4me3 마크를 획득하는 유전자들이다.
도 23은 hiDP 직접 리프로그래밍 동안에 마이크로어레이 분석을 통해 유전자 발현 수준 변화를 나타내는 도면이다. 유전자 목록은 도 22의 유전자 목록에서 마이크로어레이 유전자 목록에는 존재하지 않는 유전자를 제외한 것이다.
도 24는 Fb로부터 프로모터 영역에서 H3K4me3 마크를 획득한 유전자들의 GO 생물학적 과정을 분석한 결과이다.
도 25 및 도 26은 hiDP 직접 리프로그래밍 동안 "중뇌 발달" 및 "신경계 발달"의 GO term에 속한 전체 유전자들의 H3K4me3 및 H3K27ac 마크의 변화를 나타낸다. 박스 안의 검은색 굵은 선은 중간값을 나타낸다. ChIP-seq 신호는 리드(read) 수를 나타낸다.
도 27은 hiDP 직접 리프로그래밍 동안에 대표적인 중뇌 도파민성 계통 유전자들의 후성적 변화를 나타내는 도면이다.
도 28은 hiDP 직접 리프로그래밍 동안 H3K4me3 및 H3K27ac의 열 지도 분석 결과이다. Fb로부터 프로모터 영역에서 H3K4me3 마크를 상실한 유전자에 의해 유전자 목록을 획득하였다.
도 29는 hiDP 직접 리프로그래밍 동안 유전자 발현 변화를 마이크로어레이 데이터 세트로부터 분석한 결과를 나타낸다. 유전자 목록은 도 28의 유전자 목록에서 마이크로어레이 유전자 목록에는 존재하지 않는 유전자를 제외한 것이다.
도 30은 Fb로부터 프로모터 영역에서 H3K4me3 마크를 상실한 유전자의 GO 생물학적 과정 분석한 결과이다.
도 31은 섬유아세포와 관련된 유전자의 게놈 브라우저 샷으로, hiDP 직접 리프로그래밍 동안 H3K4me3 및 H3K27ac 히스톤 마크의 변화를 분석한 결과이다.
도 32는 본 발명의 일 실시예에서 수득한 hiDP 및 hiNSC의 TH+ 및 TUJ1+ 신경세포로의 분화를 면역세포화학염색에 의해 확인한 결과이다.
도 33은 TH+ 도파민성 신경세포의 정량분석 결과를 도시하는 그래프이다.
도 34는 TUJ1+ 신경세포의 정량분석 결과를 도시하는 그래프이다.
도 35는 hiDP로부터 신경세포로의 분화 개시 후 12주째에 각 마커에 대한 면역세포화학염색 결과이다.
도 36은 신경세포로 분화된 hiDP가 항-GFAP 항체에 의해 염색된 전체 플레이트 스캐닝 이미지이다.
도 37은 GFAP+ 별아교세포의 정량분석 결과이다.
도 38은 hiDP-유래 신경세포에서 중뇌 도파민성 신경세포 마커(TH, FOXA2, NURR1, LMX1A 및 EN1)에 대한 면역세포화학염색 결과이다.
도 39는 hiNSC 및 hiDP로부터 분화된 신경세포에서 FOXA2, NURR1, EN1 및 HOXA2의 발현량을 비교하기 위하여 qRT-PCR을 수행한 결과이다.
도 40은 TPH2+, vGLUT1+, GABA+ 및 CHAT+ 신경세포에 대한 면역세포화학염색을 통하여 hiDP-신경세포의 순도를 확인한 결과이다.
도 41은 hiDP-유래 신경세포에서 TPH2+, vGLUT1+, GABA+ 및 CHAT+ 신경세포를 정량분석한 결과이다.
도 42는 hiDP-유래 신경세포가 hiDP와 별개임을 나타내는 전사체 프로파일의 산포도 분석 결과이다.
도 43은 hiDP와 비교하여, hiDP-유래 신경세포에서 5배 상향 조절된 유전자의 DAVID 기능 어노테이션 클러스팅 분석 결과이다.
도 44는 hiDP-유래 신경세포 성숙도 및 특이도를 확인하기 위하여, 성숙한 신경세포 마커(MAP2, NEUN, SYN) 및 모노아민 수송체(VMAT2)에 대한 면역세포화학염색 결과이다.
도 45는 hiDP-유래 신경세포 및 hiNSC-유래 신경세포의 도파민 분비를 측정한 결과이다.
도 46은 패치 클램프 세트의 배쓰 상에서(좌측) 및 막에 부착된 패치 피펫과 함께(우측) 배양된 hiDP-유래 신경세포의 위상 대조 이미지(phase contrast image)이다.
도 47은 hiDP-유래 신경세포의 자발적인 활성 전위(AP)를 나타내는 도면이다.
도 48은 Na+ 채널 차단제 테트로도톡신(TTX) 처리 전(중간) 및 후 (하부)의 전류 주입 단계(전류 프로토콜: 상부)에 의해 유도된 막 전위 변화의 기록을 나타내는 도면이다.
도 49는 주입하는 전류의 양에 반응하여 유발된 AP 기록을 나타내는 도면이다.
도 50은 반복적인 짧은 과분극에 의해 AP 이후 촉발되는 반동된 탈분극(화살표)을 보여주는 기록이다.
도 51은 TTX 존재 전(중간; 내측 Na+ 전류와 함께) 및 후(하부; 차단된 Na+ 전류)에 전압 단계(프로토콜: 상부)에 따라 탈분극 시킴으로써 유도된 내측 Na+(INa) 및 외측 K+(IK) 전류의 기록에 대한 전체-세포 전류의 기록이다.
도 52는 hiDP 및 PSC-DP 마이크로어레이 데이터 세트로부터의 예측성 마커 및 공통적인 DP 마커에 대한 유전자 발현 수준을 나타낸다.
도 53은 공통적인 DP 마커(FOXA2, LMX1A 및 CORIN)에 대한 qRT-PCR을 수행한 결과이다.
도 54는 예측성 마커(EN1, PAX2, PAX5, PAX8 및 SPRY1)에 대한 qRT-PCR을 수행한 결과이다.
도 55는 hiDP 및 PSC-DP 마이크로어레이 데이터 세트로부터의 부리(rostral) 및 꼬리(caudal) 유전자에 대한 유전자 발현 수준을 나타낸다.
도 56은 hiDP로부터 신경세포로의 분화 개시 후 표시된 날에 세포 주기(Ki-67) 마커에 대한 면역세포화학염색 결과이다.
도 57은 hiDP-유래 신경세포의 Ki-67+ 세포에 대한 정량분석 결과이다.
도 58은 hiDP 직접 리프로그래밍 동안에 Fb 내지 22번 계대배양된 hiDP의 변이 풍부도를 전체 염색체에서 확인한 도면으로, 14번 염색체에서의 결과를 대표적으로 나타낸 도면이다. SNV를 성별 매치된 레퍼런스 인간 게놈과 비교하여 식별하였다.
도 59는 24번 계대배양된 hiDP의 핵형을 나타낸다.
도 60은 hiDP 이식 유무에 따른 파킨슨병이 유도된 마우스의 아포모르핀 유도 회전수를 나타내는 도면이다.
도 61은 TH 및 DAT를 염색한 이식편의 면역세포화학염색의 결과이다. 염색을 위해서, 각 마우스를 이식 후 12주째에 희생시켰다.
도 62는 PD 모델 마우스에서 TH+ 신경세포의 정량분석 결과이다.
도 63은 이식편-유도 종양 형성을 확인하기 위하여, 마우스 선조체에서 Nissl 염색을 나타낸 도면이다.
도 64는 이식편-유도 종양 형성을 확인하기 위하여, 인간-특이적 미토콘드리아에 대한 DAB 염색을 나타낸 도면이다.
도 65는 면역결핍 마우스에서 피하 이식에 의한 hiDP(n=6) 및 분화된 hiDP(5 dpd, n=8 및 7 dpd, n=10)의 종양 형성 능력을 확인한 결과이다. 동질 hiPSC(n=6)를 양성 대조용으로서 사용하였다.
도 66은 실험군의 면역결핍 마우스 사진이다. hiPSC 주입군의 사진에서, 10주째 사진인 가장 우측을 제외하고 나머지는 6 wpi에서 획득하였다. 모든 다른 군의 사진은 10 wpi에서 획득하였다. 점선은 종양을 가리킨다.
도 67은 본 발명의 일 실시예에서 수득한 A-hiDP의 특징을 확인하기 위한 DP 마커들의 대표적인 면역세포화학염색 결과이다.
도 68은 본 발명의 일 실시예에서 수득한 A-hiDP의 연속적인 계대배양 동안에 전체 세포의 수를 카운트한 결과이다. 데이터는 시작 세포 수에 대한 배수 변화의 로그 값을 나타낸다.
도 69는 본 발명의 일 실시예에서 수득한 A-hiDP의 장기적인 배양 후 핵형 분석 결과이다.
도 70은 본 발명의 일 실시예에서 수득한 A-hiDP의 후기(p20~21)에 계대배양된 A-hiDP에서 CORIN 및 FOXA2의 발현을 유세포 분석법으로 확인한 결과이다.
도 71은 본 발명의 일 실시예에서 수득한 A-hiDP로부터 분화된 세포들의 중뇌 도파민성 신경세포 마커에 대한 면역세포화학염색 결과이다.
도 72는 본 발명의 일 실시예에서 수득한 A-hiDP로부터 분화된 세포에서 TH+ 신경세포의 정량분석 결과이다.
도 73은 본 발명의 일 실시예에서 수득한 A-hiDP로부터 분화된 세포에서 TPH2+, vGLUT1+, GABA+ 및 CHAT+ 신경세포에 대한 면역염색 결과이다.
도 74는 hiDP-유래 신경세포 및 A-hiDP-유래 신경세포에서 도파민 분비를 측정하여 시험관내 기능을 확인한 결과이다.
도 75는 본 발명의 일 실시예에서 수득한 PBMC 유래 hiDP에서 CORIN, FOXA2, Ki-67, PAX6 및 LMX1A의 발현을 확인하기 위하여 면역세포화학염색을 수행한 결과이다.
도 76은 본 발명의 일 실시예에서 수득한 PBMC 유래 hiDP에서 중뇌 DP 마커들의 발현량을 qRP-PCR로 확인한 결과이다.
도 77은 본 발명의 일 실시예에서 수득한 PBMC 유래 hiDP를 신경세포로 분화시킨 결과의 대표적인 명시야 이미지이다.
도 78은 본 발명의 일 실시예에서 수득한 PBMC 유래 hiDP를 신경세포로 분화시킨 후, 중뇌 도파민성 신경세포 및 신경세포의 성숙 마커들의 발현량을 qRP-PCR로 확인한 결과이다.
도 79는 본 발명의 일 실시예에서 사용한 WNT 신호전달 작용제 CHIR99021와 TGF-β 억제제 A83-01외에, WNT 신호전달 작용제 CHIR98014와 TGF-β 억제제 SB431542를 사용하여 hiDP 직접 리프로그래밍을 시도하고, 각각의 조건에서 분리된 hiDP를 확인한 도면이다.
도 80은 CHIR98014와 SB431542를 사용하여 만들어진 hiDP에서 주요 마커 유전자들의 발현을 확인한 도면이다. 대조군으로 모섬유아세포와 CHIR99021, A83-01을 사용하여 만든 hiDP를 사용하였다.
도 81은 hiDP 및 hiPSC 리프로그래밍 동안 qRT-PCR로 측정한 만능 마커인 OCT4와 NANOG의 발현 변화를 나타내는 도면이다.
도 82는 hiDP 및 hiNSC 리프로그래밍 동안 qRT-PCR로 측정한 DP 마커들(EN1, LMX1A 및 FOXA2) 및 NSC 마커(PAX6)의 발현 변화를 나타내는 도면이다.
도 83은 열 충격 유무에 따른 hiPSC와 hiDP 리프로그래밍 과정의 개략도이다.
도 84는 알칼리성 인산분해효소 염색을 통하여 hiPSC로의 리프로그래밍이 진행되는 조건에서 생성된 hiPSC를 확인한 결과이다(도 83의 위쪽 3가지 조건).
도 85는 hiDP로의 직접 리프로그래밍이 진행되는 조건에서 FOXA2에 대한 면역세포화학염색 결과이다(도 83의 아래쪽 2가지 조건).
도 86은 알칼리성 인산분해효소 염색을 통하여 hiPSC로의 리프로그래밍이 진행되는 조건에서 생성된 hiPSC를 확인한 결과이다(도 83의 두 번째, 세 번째 조건).
도 87은 마우스 iDP 직접 리프로그래밍 조건이 인간 섬유아세포에서도 효과가 있는지를 확인하기 위한 실험의 개략도이다.
도 88은 마우스 iDP 직접 리프로그래밍 조건을 인간 섬유아세포에 사용하여 실험한 결과, 최종적으로 형성된 세포의 형태이다.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명하도록 한다.
유도 도파민성 신경세포 전구체의 제조 방법
본 발명은 일 측면에서, a) 성체세포에 Oct4, Sox2, Klf4 및 Myc로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 도입하는 단계; b) 상기 세포를 EGF 및 FGF2를 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및 c) 상기 세포를 FGF8, SHH, Wnt 신호전달 작용제 및 TGF-β 억제제를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 유도 도파민성 신경세포 전구체(induced dopaminergic neuronal progenitors. iDPs)의 제조방법에 관한 것이다.
본 명세서에서 용어 "성체세포"란 분화가 일어난 세포로서, 여러 종류의 세포로 분화할 수 있는 능력을 말하는 다분화능을 완전히 소실하거나 대부분 소실한 상태의 세포를 의미한다. 본 발명에서는 분화가 완료된 세포일 수 있으며, 만능 인자의 발현 수준을 증가시키는 것을 통해 일부 다분화능 또는 전분화능을 회복할 수 있는 대상이 되는 세포를 의미할 수 있다.
구체적으로, 상기 성체세포는 섬유아세포, 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 또는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 성체세포는 인간 유래일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 인간 신생아 섬유아세포, 인간 성체 섬유아세포 및 인간 말초 혈액 단핵 세포에 대하여, 본 발명의 iDPs 제조방법을 적용하여 인간 iDPs(hiDPs)를 성공적으로 수득할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "Oct4(octamer-binding transcription factor 4), Sox2(SRY(sex determining region Y)-box 2), Klf4(Kruppel-like factor 4) 및 Myc로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자"는 리프로그래밍 인자로 널리 공지된 OSKM 인자(Yamanaka 인자)들로서, 분화된 세포가 역분화되어 만능성을 다시 수득하는 과정에 중요한 역할을 하는 인자들을 의미한다. 즉, 세포가 자가 재생능, 또는 다분화능을 유지 또는 획득하도록 기능하는 인자들을 의미한다. 상기 인자들은 특히, 이미 분화가 진행된 세포를 다시 전능성 또는 다능성 세포로 리프로그래밍하는 역할을 할 수 있다. 또한, 상기 Myc는 L-Myc 또는 c-Myc일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 성체세포에 Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc를 도입할 수 있다. 상기 리프로그래밍 인자의 도입은 당업계에 공지된 방법에 의하여 수행될 수 있으며, 예를 들어 센다이 바이러스 벡터가 이용될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "EGF(epidermal growth factor)"는 표피 성장 인자로서, 상피세포의 증식을 촉진하는 펩타이드 중 하나를 의미한다.
본 명세서에서 용어 "FGF2(fibroblast growth factor 2)"는 섬유아세포 성장 인자 2를 의미하고, 섬유아세포를 자극하여 내피세포 또는 평활근세포의 증식 및 혈관 신생에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진다.
본 명세서에서 용어 "FGF8(fibroblast growth factor 8)"은 섬유아세포 성장 인자 8을 의미하고, 섬유아세포를 자극하여 증식을 유도하는 성장인자로서, 태아의 뇌신경 발달에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진다.
본 명세서에서 용어 "SHH(sonic hedgehog)"은 헤지호그라고 불리는 포유류 신호전달 경로를 구성하는 단백질을 의미하며, 헤지호그 신호전달 경로에 있어서 가장 많이 연구된 리간드로서 척추동물의 기관 형성을 조절하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려진다.
본 발명에서 용어 "Wnt 신호전달 작용제"는 Wnt 신호전달 경로에서 신호전달을 활성화하는 물질을 의미한다. Wnt와 수용체의 결합으로 활성화하는 세포 내 신호전달 경로에는 적어도 β-카테닌 경로와 평면 세포 극성 경로, Ca2＋경로인 3종류가 존재한다.
β-카테닌 경로에서는 β-카테닌의 안정성을 조절하여, 여러 가지 표적 유전자의 발현을 조절한다. 이 경로는 세포의 증식 또는 분화를 조절하고 있으며, 이 경로를 구성하는 단백질의 유전자 이상이 사람의 암에서 높은 빈도로 나타난다. 평면 세포 극성 경로에서는 저분자량 G단백질 Rho과를 개재하여 Jun 인산화효소 또는 Rho 인산화효소를 활성화한다. Ca2＋ 경로에서는 세포 내의 Ca2＋ 동원을 개재하여 단백질 인산화 효소C 또는 카르모듈린 인산화 효소를 활성화한다. 평면 세포 극성 경로와 Ca2＋ 경로는 세포의 극성 또는 운동을 조절한다. Wnt는 이러한 신호전달 경로의 활성화를 조절하는 것으로서 여러 가지 세포 반응을 조절하는 것으로 알려진다.
상기 Wnt 신호전달 작용제는 다음과 같이 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:
1) Wnt 단백질 19종: Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11 및 Wnt16b;
2) β-카테닌을 증가시키는 물질: 대부분의 세포는 β-카테닌 증가에 의해 Wnt 신호전달에 반응한다;
3) Dishevelled를 인산화하는 물질: Wnt와 이의 수용체인 frizzled가 결합하면 인산화하여 β-카테닌을 활성화시키거나, 평면 세포 극성 경로에서 Rho 또는 Ras를 활성화시킨다;
4) GSK3(glycogen synthase kinase 3: 글루코겐 합성효소 키나제)의 억제제: 리튬(Li), LiCl, 이가 아연(bivalent Zn), BIO(6-bromoindirubin-3'-oxime), SB216763, SB415286, CHIR99021, CHIR98014, QS11 수화물 (QS11 hydrate), TWS119, 켄폴론(Kenpaullone), 알스터폴론(alsterpaullone), 인디루빈-3-옥심(Indirubin-3'-oxime), TDZD-8, Ro 31-8220 메탄설폰산염(Ro 31-8220 methanesulfonate salt) 등;
5) Axin, APC 등과 같은 Wnt 신호전달 경로의 음성적 조절자(negative regulator)의 억제제, 또는 RNAi 등;
6) Wnt 신호전달 경로를 활성화하는 단백질: 노린(Norrin)은 frizzled 4와 결합하며, R-스포딘 2(R-spondin2)는 frizzled 8 및 LRP6와 반응한다;
7) 형질감염(transfection) 등을 포함하는 유전자 전이(gene transfer)에 의한 Wnt 과발현 구성물 또는 베타-카테닌 과발현 구성물을 이용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 Wnt 신호전달 작용제는 하기의 화학식 I로 표시되는 CHIR99021이다:
Figure 112020100305331-pat00001
<화학식 I>
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 Wnt 신호전달 작용제는 하기의 화학식 II로 표시되는 CHIR98014이다:
Figure 112020100305331-pat00002
<화학식 II>
상기 TGF-β 억제제는 A83-01, SB431542, RepSox, LY364947 및 SB525334로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 TGF-β 억제제는 하기의 화학식 III으로 표시되는 A83-01이다:
Figure 112020100305331-pat00003
<화학식 III>
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 TGF-β 억제제는 하기의 화학식 IV로 표시되는 SB431542이다:
Figure 112020100305331-pat00004
<화학식 IV>
본 발명에 있어서, 상기 b)단계 배양 후, 추가적으로 ROCK(Rho-associated protein kinase) 억제제인 Y-27632를 첨가하여 추가적으로 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 추가적인 배양은 12시간 내지 36시간 동안, 구체적으로 24시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 b)단계의 배지는 Wnt 신호전달 작용제, TGF-β 억제제, 2-포스포-L-아스코르브산 및 부티르산 나트튬(Sodium butyrate; NaB)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 추가적으로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 b)단계의 배지는 Wnt 신호전달 작용제 및 TGF-β 억제제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 c)단계의 배지는 2-포스포-L-아스코르브산을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 b)단계의 배지는 1 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖의 EGF 및 1 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖의 FGF2를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 b)단계의 배지는 20 ng/㎖의 EGF, 20 ng/㎖의 FGF2, 3.0 μM의 CHIR9902, 0.5 μM의 A83-01, 50 ng/㎖의 2-포스포-L-아스코르브산 및 0.2 mM의 NaB를 포함할 수 있다. 기본 배지로 인간 신경세포 리프로그래밍 배지(RepM-Neural)가 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 c)단계의 배지는 10 ng/㎖ 내지 1000 ng/㎖의 FGF8, 100 ng/㎖ 내지 2000 ng/㎖의 SHH, 0.1 μM 내지 50.0 μM의 Wnt 신호전달 작용제 및 0.01 μM 내지 10.0 μM의 TGF-β 억제제를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 c)단계의 배지는 100 ng/㎖의 FGF8, 800 ng/㎖의 SHH, 3.0 μM의 CHIR9902, 0.5 μM의 A83-01 및 50 ng/㎖의 2-포스포-L-아스코르브산를 포함할 수 있다. 기본 배지로 RepM-Neural이 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 a)단계는 12시간 내지 36시간 동안, 구체적으로 24시간 동안 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 b)단계는 5일 내지 9일 동안, 구체적으로 7일 동안 수행할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 b)단계는 EGF, FGF2, CHIR99021 및 A83-01를 포함하는 배지에서 7일 동안 배양한 후에, 동일한 배지에 추가적으로 Y-27632를 첨가하여 추가적으로 24시간 동안 배양할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 c)단계는 10일 내지 18일 동안, 구체적으로 13일 내지 15일 동안 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 제조방법은 성체세포로부터 iDPs를 직접 리프로그래밍 할 수 있다. 구체적으로, 상기 제조방법은 성체세포로부터 만능 중간체가 제조되는 단계를 거치지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 만능 세포 특이적 마커, iNSCs 특이적 마커 및 중뇌 기저판 특이적 마커의 발현량 변화를 측정한 결과 hiDPs 리프로그래밍 경로는 hiPSCs 및 hiNSCs 리프로그래밍 경로와 별개인 것을 확인할 수 있으며, 열 충격 단계 유무에 따른 hiPSC와 hiDPs 리프로그래밍 과정을 수행하여 본 발명의 hiDPs가 만능 중간체 단계를 통하지 않고 섬유아세포로부터 직접 생성되는 것을 확인할 수 있다.
유도 도파민성 신경세포 전구체
본 발명은 다른 측면에서, 상기 제조방법으로 제조된 유도 도파민성 신경세포 전구체(iDPs)에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 측면에서, (i) CORIN, FOXA2 및 LMX1A로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자가 만능 줄기세포 유래 도파민성 신경세포 전구체(PSC-DPs)와 비교하여 감소된 발현을 나타내거나, (ii) EN1, PAX2, PAX5, PAX8 및 SPRY1로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자가 만능 줄기세포 유래 도파민성 신경세포 전구체와 비교하여 증가된 발현을 나타내거나, 또는 (iii) 상기 (i)의 감소된 발현 및 상기 (ii)의 증가된 발현을 나타내는, 유도 도파민성 신경세포 전구체에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 iDPs의 발현량을 기준으로 하여 주지된 도파민성 신경세포 특이적 마커(FOXA2, LMX1A 및 CORIN)의 상대적인 발현량을 비교한 결과, 상기 iDPs가 PSC-DPs 보다 1,000배 내지 100,000배 낮은 것을 할 수 있다. 또한, PSC-DP의 발현량을 기준으로 하여, 이식 결과에 대한 예측 마커(EN1, PAX2, PAX5, PAX8 및 SPRY1)의 상대적인 발현량을 비교한 결과, 상기 iDPs가 PSC-DPs 보다 3배 내지 300배 높은 것을 확인할 수 있다.
상기 유도 도파민성 신경세포 전구체는 CORIN, FOXA2 및 LMX1A로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자가 만능 줄기세포 유래 도파민성 신경세포 전구체와 비교하여 1,000배 내지 100,000배 감소된 발현을 나타낼 수 있다. 구체적으로, LMX1A는 1,000배 내지 100,000배, 10,000배 내지 100,000배, 10,000배 내지 90,000배, 10,000배 내지 80,000배, 10,000배 내지 70,000배, 10,000배 내지 60,000배, 10,000배 내지 50,000배, 10,000배 내지 40,000배, 10,000배 내지 30,000배, 또는 10,000배 내지 20,000배 감소된 발현을 나타낼 수 있고; CORIN 및 FOXA2는 1,000배 내지 100,000배, 1,000배 내지 10,000배, 1,000배 내지 9,000배, 1,000배 내지 8,000배, 1,000배 내지 7,000배, 1,000배 내지 6,000배, 1,000배 내지 5,000배, 1,000배 내지 4,000배, 1,000배 내지 3,000배, 또는 1,000배 내지 2,000배 감소된 발현을 나타낼 수 있다. 보다 구체적으로, FOXA2는 1,000배 내지 10,000배, 2,000배 내지 9,000배, 3,000배 내지 8,000배, 4,000배 내지 7,000배 또는 5,000배 내지 6,000배 또는 35,000배 감소된 발현을 나타낼 수 있고; LMX1A는 10,000배 내지 100,000배, 20,000배 내지 90,000배, 30,000배 내지 80,000배, 30,000배 내지 70,000배 또는 35,000배 내지 65,000배 감소된 발현을 나타낼 수 있으며; CORIN은 1,000배 내지 5,000배, 1,200배 내지 4,500배, 1,500배 내지 4,000배, 1,700배 내지 3,500배 또는 2,000배 내지 3,000배 감소된 발현을 나타낼 수 있다.
상기 유도 도파민성 신경세포 전구체는 EN1, PAX2, PAX5, PAX8 및 SPRY1로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자가 만능 줄기세포 유래 도파민성 신경세포 전구체와 비교하여 3배 내지 300배 증가된 발현을 나타낼 수 있다. 구체적으로, 3배 내지 300배, 3배 내지 200배, 3배 내지 100배, 3배 내지 90배, 3배 내지 80배, 3배 내지 70배, 3배 내지 60배, 3배 내지 50배, 3배 내지 40배, 3배 내지 30배, 3배 내지 20배, 3배 내지 10배 증가된 발현을 나타낼 수 있다. 보다 구체적으로, 3배 내지 300배, 3배 내지 270배, 3배 내지 260배, 3배 내지 250배, 3배 내지 240배, 3배 내지 230배 또는 3배 내지 220배 증가된 발현을 나타낼 수 있다.
상기 유도 도파민성 신경세포 전구체는 HOXB1을 발현하지 않을 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 iDPs는 도파민성 신경세포 전구체 특이적 마커인 CORIN 및 중뇌 기저판 특이적 마커인 FOXA2, LMX1A 및 EN1을 발현하며, 후뇌 특이적 마커인 HOXB1을 발현하지 않을 수 있다. 이를 통하여, 본 발명의 iDPs는 고도로 순수한 중뇌-특이적 특성을 가지는 것을 확인할 수 있다.
또한, 상기 iDPs는 mRNA 수준에서는 LMX1A을 발현하지만, 단백질 수준에서는 LMX1A를 발현하지 않을 수 있다. 또한, 상기 유도 도파민성 신경세포 전구체로부터 분화된 도파민성 신경세포는 mRNA 수준에서뿐만 아니라 단백질 수준에서도 LMX1A를 발현할 수 있다.
이를 통하여, 본 발명의 iDPs가 기존에 파킨슨병 치료제를 위해 생체 내 이식이 가능한 것으로 알려진 PSC-DPs와 구별되는 별개의 세포이며, 생체 내 이식을 통한 PD 치료에 보다 적합한 것을 확인할 수 있다.
또한, 상기 iDPs는 내인성 Oct4 및 NANOG가 iPSCs와 비교하여 감소된 발현을 나타내고, PAX6는 iNSCs와 비교하여 감소된 발현을 나타내고, EN1, LMX1A 및 FOXA2는 iNSCs와 비교하여 증가된 발현을 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 iDPs는 iPSCs와 비교하여 만능 세포 특이적 마커인 내인성 Oct4 및 NANOG가 감소된 발현을 나타내고; iNSCs와 비교하여, iNSCs 특이적 마커인 PAX6가 감소된 발현을 나타내고, 중뇌 기저판 특이적 마커인 EN1, LMX1A 및 FOXA2가 증가된 발현을 나타냄을 확인할 수 있다.
이를 통하여, hiDPs 리프로그래밍 과정은 hiPSCs 및 hiNSCs 리프로그래밍 경로와 별개인 것을 확인할 수 있다.
유도 도파민성 신경세포 전구체를 포함하는 약학적 조성물
본 발명은 또 다른 측면에서, 상기 유도 도파민성 신경세포 전구체를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 명세서에서 용어 "파킨슨 병(Parkinson's Disease, PD)"은 뇌의 흑질에 분포하는 도파민성 신경세포가 점차 소실되어 발생하는 질병으로, 신경계의 만성 진행성 퇴행성 질환이다. 파킨슨병 환자는 60세 이상에서 인구의 약 1%에 달하는 것으로 추정되고 있다. 파킨슨병의 원인은 아직까지 정확하게 밝혀지지 않았으나, 유전적 요소, 돌연변이에 의한 요소, 단백질 기능 이상 등의 다인성 질환이라는 것이 일반적인 학설이다. 원인은 정확하게 밝혀지지 않았으나, 결국 중뇌의 도파민성 신경세포의 소실이 일어남에 따른 증상들이 나타난다는 것은 공통적이기 때문에 해당 도파민성 신경세포의 소실을 막는 것, 도파민성 신경세포를 대체하는 것, 도파민성 신경세포의 손실에 따른 증상을 완화하는 것 등으로 치료하고 있다.
본 발명의 일 구현예에서, PD 마우스 모델에서 10일 이상 신경세포로 분화된 hiDPs을 이식한 후 4주 째부터 운동 결함의 현저한 개선을 확인할 수 있다.
이를 통하여, 생체 내 이식된 본 발명의 hiDPs가 기능성 도파민성 신경세포로 분화하며, 이는 PD 마우스 모델에서 운동의 회복에 기여할 가능성이 높은 것을 확인할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 통상적인 방법에 따라 제제로 배합되는 통상적이고 무독성인 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물에 사용되는 첨가제의 예는 감미제, 결합제, 용매, 용해 보조제, 습윤제, 유화제, 등장화제, 흡수제, 붕해제, 산화방지제, 보존제, 윤활제, 활택제, 충전제, 향미제 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 첨가제는 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 소르비톨, 셀룰로스, 글리신, 실리카, 활석, 스테아르산, 스테아린, 마그네슘 스테아레이트, 마그네슘 알루미노실리케이트, 전분, 젤라틴, 트라가칸트 검, 알긴산, 나트륨 알기네이트, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 한천, 물, 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 염화나트륨, 염화칼슘 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 비경구 투여(예를 들어, 정맥, 근육, 피하, 또는 뇌내 투여)를 위한 다양한 제제 형태로 배합될 수 있다. 특히, 본 발명의 조성물은 뇌내 투여, 예를 들어, 뇌혈관 내 투여, 경막 내 투여 또는 뇌실 내 투여될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 조성물은 개체의 뇌 내로 측뇌실 주사(lateral cerebro ventricular injection)에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 주사는 개체의 두개골 내에 만들어진 천두공, 대수공 또는 개체의 두개골 내에 이식된 저장고 및 상기 저장고에 연결된 카테터를 포함하는 뇌실 내 카테터 시스템을 통하여 수행될 수 있다.
구체적으로 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈61. 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 한편, 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물은 치료학적으로 유효한 양 또는 약학적으로 유효한 양으로 환자에 투여될 수 있다.
여기서 "치료학적으로 유효한 양" 또는 "약학적으로 유효한 양"이란 대상 질환을 예방 또는 치료하는데 유효한 화합물 또는 조성물의 양으로서, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다. 상기 유효량의 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 조성물에서 화합물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 kg 당 약 0.1 mg 내지 약 1,000 mg, 또는 약 5 mg 내지 약 200 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1회 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로, 본 발명의 범위는 이에 한정되지 않는다.
파킨슨병 예방 또는 치료제 스크리닝 방법
본 발명은 또 다른 측면에서, 상기 유도 도파민성 신경세포 전구체에 파킨슨병 예방 또는 치료제 후보 물질을 처리하는 단계; 및 후보 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 유도 도파민성 신경세포 전구체의 증식력, 활성 또는 도파민성 신경세포로의 분화능을 측정하는 단계를 포함하는 파킨슨병 예방 또는 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 유도 도파민성 신경세포 전구체를 포함하는 파킨슨병 예방 또는 치료제의 스크리닝을 위한 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "파킨슨병 예방 또는 치료제 후보 물질"은 통상적인 선정 방식에 따라 파킨슨병의 예방 또는 치료의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 기타 추출물 또는 천연물, 또는 화합물 등이 될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "대조군"은 파킨슨병 예방 또는 치료제 후보 물질을 처리하지 않은 유도 도파민성 신경세포 전구체를 포함하는 군으로, 상기 후보 물질을 처리한 군과 병렬관계에 속하는 세포를 포함하는 군을 의미한다.
본 발명에 있어서, 파킨슨병 예방 또는 치료제 스크리닝 방법은 본 발명의 유도 도파민성 신경세포 전구체에 상기 후보 물질들을 처리하여, 후보 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하는 방식으로 고안될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 유도 도파민성 신경세포 전구체에 상기 파킨슨병 예방 또는 치료제 후보 물질을 처리하는 경우에, 후보 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 iDPs의 증식력 또는 활성이 증가하거나, 도파민성 신경세포로의 분화능이 증가되면, 해당 후보 물질을 파킨슨병 예방 또는 치료제로 판단하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
이러한 스크리닝 방법에 의하여 선택된 물질은 이후의 파킨슨병 예방 또는 치료제 개발 과정에서 선도 물질(leading compound)로 작용하게 되며, 선도 물질을 변형시키고 최적화함으로써, 새로운 파킨슨병의 예방 또는 치료제를 개발할 수 있다.
유도 도파민성 신경세포 전구체 제조용 혼합물 또는 배지 조성물
본 발명은 또 다른 측면에서, Oct4, Sox2, Klf4 및 Myc로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 도입된 성체세포, EGF 및 FGF2를 포함하는 유도 도파민성 신경세포 전구체 제조용 혼합물에 관한 것이다.
상기 유도 도파민성 신경세포 전구체 제조용 혼합물은 Wnt 신호전달 작용제 및 TGF-β 억제제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 유도 도파민성 신경세포 전구체, 상기 Wnt 신호전달 작용제 및 상기 TGF-β 억제제에 관한 설명은 상기 기재된 바와 동일하다.
본 발명은 또 다른 측면에서, 유도 도파민성 신경세포 전구체, FGF8, SHH, Wnt 신호전달 작용제 및 TGF-β 억제제를 포함하는 혼합물에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 측면에서, EGF, FGF2, Wnt 신호전달 작용제 및 TGF-β 억제제를 포함하는 유도 도파민성 신경세포 전구체 제조용 배지 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 측면에서, FGF8, SHH, Wnt 신호전달 작용제 및 TGF-β 억제제를 포함하는 유도 도파민성 신경세포 전구체 제조 또는 유지용 배지 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현예에서, 성체세포로부터 hiDPs를 직접 리프로그래밍 하는 과정에서, 초기 단계에서는 EGF 및 FGF2이 필수적이며, 후기 단계에서는 SHH, FGF8, Wnt 신호전달 작용제 및 TGF-β 억제제를 동시에 처리하는 것이 가장 효율적인 것을 확인할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. hiDPs 직접 리프로그래밍
실시예 1.1. hiDPs 직접 리프로그래밍 프로토콜의 개발
마우스 모델에서의 선행 연구(대한민국 공개특허 10-2015-0015294)를 기초로 하여, 인간 유도 도파민성 신경세포 전구체를 제조하기 위한 프로토콜을 개발하기 위해, OSKM(Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) 인자의 발현 유도와 함께, 여러 인자들의 조합하여 hiDPs 직접 리프로그래밍을 수행하였다(도 1의 조건 1 내지 4).
EGF 및 FGF2의 처리를 포함하지 않는 조건 4의 경우에는 세포 콜로니 형태가 형성되지 않았다(도 2). 따라서, EGF 및 FGF2의 처리가 hiDPs 직접 리프로그래밍의 초기 단계에 필수적이라는 점을 확인하였다.
또한, hiDPs 직접 리프로그래밍 프로토콜을 확립하기 위하여, 직접 리프로그래밍의 초기 및 후기 단계에서의 여러 인자들의 조합을 실험하였다. 그 결과, 초기 단계에서는 EGF 및 FGF2와 함께, WNT 신호전달 작용제인 CHIR99021과 TGF-β 억제제인 A83-01의 조합(이하, 집합적으로 CHA라 칭한다)을 조합하여 사용하는 경우에 생성되는 콜로니의 수가 가장 많은 것을 확인하였다(도 3). 한편, 초기 단계에서 EGF, FGF2, CHIR99021 및 A83-01를 처리한 후, 후기 단계에서도 CHA 처리가 필요하며, SHH 및 FGF8를 함께 처리하는 경우에 월등히 증가된 개수의 콜로니가 형성되었음을 확인하였다(도 4).
SHH 신호전달은 중뇌 발달에서 FOXA2 발현을 증가시키므로, SHH의 농도를 800 ng/㎖까지 증가시켰으며, 이는 FOXA2 및 SHH의 발현량을 상향 조절하였으나. LMX1A 발현량에는 영향을 미치지 않았다(도 5). 이러한 과정들을 통하여 hiDPs 직접 리프로그래밍 프로토콜을 확립하였다(도 6).
실시예 1.2. 인간 신생아 섬유아세포로부터 hiDPs의 직접 리프로그래밍
인간 신생아 섬유아세포(CRL-2097)를 American Type Culture Collection(Rockville, MD, USA)으로부터 구입하고, CRL-2097를 hFM 배지(10% 소 태아 혈청(FBS) 및 0.1 mM 비-필수 아미노산으로 보충된 modified Eagle's medium; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에서 유지하였다.
CRL-2097를 24-웰 플레이트에 30,000 cells/웰로 플레이팅하였다. 다음날(형질도입후 0일째, 0 dpt), 상기 세포에 적합한 형질도입의 배수성(MOI; KOS:M:K = 4.2:4.2:2.5)으로 센다이 바이러스(SeV) 혼합물(CytoTune™-iPS 2.0 Sendai reprogramming kit; Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 OKSM 인자를 형질도입하였다.
형질도입한 CRL-2097을 24시간 동안 배양한 후에, SeV 혼합물을 포함하는 배지를 3.0 μM CHIR99021(Tocris), 0.5 μM A83-01(Tocris), 50 ㎍/㎖ 2-포스포-L-아스코르브산(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 0.2 mM NaB(Sigma-Aldrich), 20 ng/㎖ 상피세포 성장 인자(EGF; Peprotech) 및 20 ng/㎖ 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2; Peprotech)를 함유하는 인간 신경세포 리프로그래밍 배지(RepM-Neural: 0.05% Albumax-I, 1X N2, 1X B27 minus Vitamin A, 2 mM Glutamax 및 0.11 mM β-메르캅토에탄올로 보충되고, Advanced DMEM/F12와 Neurobasal 배지가 1:1로 혼합된 배지; 모두 Thermo Fisher Scientific)로 일주일 동안 교체하였다.
일주일 후에, 배양된 세포들을 10 μM Y-27632(Tocris)와 함께 Accutase(Millipore)로 해리하고, 7 dpt에서 Geltrex-코팅된 6-웰 플레이트상에 10 μM Y-27632를 함유하는 동일한 배지로 재플레이팅하였다.
다음날, 배양 배지를 3.0 μM CHIR99021, 0.5 μM A83-01, 50 ㎍/㎖ 2-포스포-L-아스코르브산, 100 ng/㎖ FGF8(Peprotech) 및 800 ng/㎖ 소닉 헤지호그(SHH; R&D systems, Minneapolis, MN, USA)를 추가로 넣어준 RepM-Neural로 교체하였다. 13 내지 15일 후에, 일부 콜로니를 분리하여 hiDPs를 수득하고, SHH 농도(200 ng/㎖)가 감소된 배지를 사용하여 Geltrex-코팅된 플레이트 상에서 유지하였다.
실시예 1.3. 인간 성체 섬유아세포로부터 hiDPs의 직접 리프로그래밍
인간 성체 섬유아세포(HDF4)를 국립 충남 대학교 병원(대한민국, 대전)으로부터 수득하고, 이를 실시예 1.2에 기재된 방법과 동일하게 hiDPs로의 직접 리프로그래밍을 수행하여, 성체 체세포-유래 hiDPs(A-hiDPs)를 수득하였다.
실시예 1.4. 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터 hiDPs의 직접 리프로그래밍
인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC; PBMNC015C)를 StemExpress(Folsom, CA, USA)에서 구입하였다.
30,000개의 PBMC를 적합한 형질도입의 배수성(MOI; KOS:M:K = 4.2:4.2:2.5)으로 SeV 혼합물(CytoTune??)과 섞어서 2,250 rpm으로 90분 동안 상온에서 원심분리하여 형질도입하였다. 형질도입한 PBMC의 상등액을 제거하고, iMatrix511로 코팅된 배양 접시로 옮긴 후, 37℃ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다.
배양 후에, 2,250 rpm으로 10분 동안 상온에서 원심분리하여 상등액을 제거하고, 세포들을 해리한 후에 3.0 μM CHIR99021, 0.5 μM A83-01, 50 ㎍/㎖ 2-포스포-L-아스코르브산, 0.2 mM NaB, 20 ng/㎖ EGF 및 20 ng/㎖ FGF2를 함유하는 인간 신경세포 리프로그래밍 배지(RepM-Neural: 0.05% Albumax-I, 1X N2, 1X B27 minus Vitamin A, 2 mM Glutamax 및 0.11 mM β-메르캅토에탄올로 보충되고, Advanced DMEM/F12와 Neurobasal 배지가 1:1로 혼합된 배지)에서 14일 동안 배양하였다.
14일 후에, 배양된 세포들을 10 μM Y-27632와 함께 Accutase로 해리하고, iMatrix511(Nippi)-코팅된 6-웰 플레이트상에 10 μM Y-27632를 함유하는 동일한 배지로 재플레이팅하였다.
다음날, 배양 배지를 3.0 μM CHIR99021, 0.5 μM A83-01, 50 ㎍/㎖ 2-포스포-L-아스코르브산, 100 ng/㎖ FGF8 및 800 ng/㎖ SHH를 추가로 넣어준 RepM-Neural로 교체하였다. 13 내지 15일 후에, 일부 콜로니를 분리하여 PBMC-hiDPs(70262-01 및 70262-02)를 수득하고, SHH 농도(200 ng/㎖)가 감소된 배지를 사용하여 iMatrix511-코팅된 플레이트 상에서 유지하였다.
비교예 1. hiNSC 리프로그래밍
인간 유도 신경 줄기세포(hiNSC)로의 리프로그래밍을 위하여, 인간 섬유아세포(CRL-2097)를 24-웰 플레이트상에 30,000 cells/웰로 플레이팅하였다. 다음날, 상기 세포에 적합한 형질도입의 배수성(MOI; KOS:M:K = 4.2:4.2:2.5)으로 SeV 혼합물(CytoTune??)을 형질도입하였다.
형질도입한 CRL-2097를 24시간 동안 배양한 후에, SeV 혼합물을 포함하는 배지를 3.0 μM CHIR99021, 0.5 μM A83-01 및 10 ng/㎖ hLIF(Peprotech)를 함유하는 인간 신경세포 리프로그래밍 배지로 교체하였다. 상기 배지는 격일마다 교체하였다. 7 dpt에서, 배양된 세포들을 Accutase로 해리하고 재플레이팅하였다. 21 dpt에서, 일부 신경 콜로니를 분리하여 hiNSCs를 수득하고, 동일한 배지를 사용하여 Geltrex-코팅된 플레이트 상에서 유지하였다.
비교예 2. hiPSC 리프로그래밍
hiPSC로의 리프로그래밍을 위하여, 인간 섬유아세포(CRL-2097)를 24-웰 플레이트상에 30,000 cells/웰로 플레이팅하였다. 다음날, 제조사의 설명서에 따라 SeV 혼합물(CytoTune??)로 형질도입하였다.
형질도입한 CRL-2097를 24시간 동안 배양한 후에, SeV 혼합물을 포함하는 배지를 hFM로 교체하였다. 3 dpt에서, 배양 배지를 1 mM 니코틴아마이드(Sigma-Aldrich)을 함유하는 mTeSR-1(Stemcell Technologies)배지로 교체하였다. 7 dpt에서, 세포를 Accutase로 해리하고, Geltrex-코팅된 6-웰 플레이트상에 재플레이팅하였다. 21 dpt에서, 일부 콜로니를 분리하여 hiPSCs를 수득하고, 동일한 배지를 사용하여 Geltrex-코팅된 플레이트 상에서 유지하였다.
비교예 3. PSC-DP의 제조
hiPSCs를 iMatrix 511-코팅된 24-웰 플레이트상에 500,000 cells/웰로 플레이팅하였다. 다음날(day0), 8% 넉아웃 혈청 대체물(Knockout Serum Replacement), 0.1 mM MEM NEAA, 0.1 mM 피루브산 나트륨(sodium pyruvate) 및 0.1 mM 2-메르캅토에탄올(mercaptoethanol)로 보충된 GMEM(모두 Thermo Fisher Scientific) 배지에 100 nM LDN193189와 0.5 uM A83-01을 8일 동안 추가로 첨가하여 신경 유도(neural induction)하였다. 그리고 나서, 7일 동안(신경유도 day1 내지 7) 100 ng/ml FGF8, 2 uM 퍼모프아민(Purmorphamine) 및 100 ng/ml SHH을 첨가하고, 신경유도 day3 내지 12동안은 3.0 uM CHIR99021 및 0.2 mM 아스코르브산을 첨가하여 배양하여, PSC-DPs를 수득하였다.
실험 프로토콜
실시예 1, 비교예 1 내지 비교예 3에서 수득된 세포의 특성을 규명하기 위해 사용된 실험 프로토콜을 하기 실시예 2 내지 8에 기술한다.
실시예 2. RNA 단리 및 정량적인 역전사-중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR)
QiaShredder(Qiagen, Hilden, Germany) 및 DNase I(Qiagen)를 포함하는 RNeasy 미니 키트를 사용하여 세포로부터 전체 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA는 iScript cDNA 합성 키트(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 역전사하였다. 하나의 qPCR 반응에서는 합성된 cDNA 주형의 1/50 희석물을 사용하였고, iQ™ SYBR Green Supermix (Bio-rad)와 프라이머를 더하여 준 혼합물을 Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System(Thermo Fisher Scientific) 기기를 사용하여 qRT-PCR을 수행하였다. qRT-PCR에서 사용된 프라이머 서열은 하기의 표 1과 같다.
Gene Forward primer 서열번호 Reverse primer 서열번호
FOXA2 GGAGCAGCTACTATGCAGAGC 1 CGTGTTCATGCCGTTCATCC 2
SHH CTCGCTGCTGGTATGCTCG 3 ATCGCTCGGAGTTTCTGGAGA 4
LMX1A ACGTCCGAGAACCATCTTGAC 5 CACCACCGTTTGTCTGAGC 6
CORIN CCAAAGCCGGTCTTGAGAG 7 GAGGAGGTTAGCAGTCGCC 8
EN1 CGCAGCAGCCTCTCGTATG 9 CCTGGAACTCCGCCTTGAG 10
PAX2 ACGAGGCTTGGAGATTCAGCAA 11 TGTCGGCCTGAAGCTTGATGT 12
PAX5 ACTTGCTCATCAAGGTGTCAG 13 TCCTCCAATTACCCCAGGCTT 14
PAX8 ATAGCTGCCGACTAAGCATTGA 15 ATCCGTGCGAAGGTGCTTT 16
SPRY1 GCCCTGGATAAGGAACAGCTAC 17 GCCGAAATGCCTAATGCAAAGA 18
Endo-OCT4 AGTTTGTGCCAGGGTTTTTG 19 ACTTCACCTTCCCTCCAACC 20
NANOG AACGTTCTGCTGGACTGAGC 21 ATGCTTCAAAGCAAGGCAAG 22
PAX6 GTCCATCTTTGCTTGGGAAA 23 TAGCCAGGTTGCGAAGAACT 24
NURR1 ACCACTCTTCGGGAGAATACA 25 GGCATTTGGTACAAGCAAGGT 26
HOXA2 CCCCTGTCGCTGATACATTTC 27 TGGTCTGCTCAAAAGGAGGAG 28
GAPDH TGCACCACCAACTGCTTAGC 29 GGCATGGACTGTGGTCATGAG 30
실시예 3. 면역세포화학 분석
분석에 사용할 샘플을 4% 파라포름알데하이드(Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA) 및 0.15% 피크르산(Sigma-Aldrich)으로 고정하고, 실온에서 1시간 동안 3% 소 혈청 알부민(BSA; Thermo Fisher Scientific) 및 0.3% Triton X-100(Sigma-Aldrich)이 포함된 Dulbecco's 인산염-완충된 식염수(DPBS)로 블록킹(blocking)한 후에 투과화하였다. 이어서, 모든 샘플은 1% BSA가 포함된 DPBS에 희석된 1차 항체 용액과 함께 4β에서 밤새도록 배양하였다. 사용된 1차 항체는 하기 표 2에 기재된 바와 같다.
Antibody Dilution Supplier (Catalog Number)
Rat anti-CORIN 1:100 R&D systems (#MAB2209)
Mouse anti-EN1 1:30 DSHB (#4G11.c)
Sheep anti-HOXB1 1:500 R&D systems (#AF6318)
Rabbit anti-PAX6 1:300 BioLegend (#901302)
Rabbit anti-PAX2 1:100 BioLegend (#901001)
Mouse anti-PAX5 1:50 BD (#610862)
Mouse anti-KI67 1:500 BD (#556003)
Mouse anti-TUJ1 1:2000 BioLegend (#801213)
Rabbit anti-TUJ1 1:2000 BioLegend (#802001)
Mouse anti-TH 1:1000 Sigma-Aldrich (#T1299)
Rabbit anti-TH 1:1000 Millipore (#AB152)
Mouse anti-FOXA2 1:200 Abcam (#ab60721)
Rabbit anti-NURR1 1:500 Santa cruz (#sc-991)
Rabbit anti-LMX1A 1:1000 Millipore (#AB10533)
Rabbit anti-TPH2 1:1000 Novus Biologicals (#NB100-74555)
Rabbit anti-vGLUT1 1:1000 Synaptic Systems (#135 303)
Rabbit anti-GABA 1:1000 Sigma-Aldrich(#A2052)
Goat anti-CHAT 1:1000 Millipore (#AB144P)
Rabbit anti-GFAP 1:500 Dako (#Z0334)
Mouse anti-O4 1:50 Millipore (#MAB345)
Rabbit anti-CALB 1:2000 Swant (#D-28k)
Chicken anti-MAP2 1:5000 Abcam (#ab5392)
Mouse anti-NEUN 1:50 Millipore (#MAB377)
Rabbit anti-SYNAPSIN-I 1:2000 Millipore (#AB1543)
Goat anti-GIRK2 1:200 Abcam (#ab65096)
Rabbit anti-VMAT2 1:200 Millipore (#AB1598P)
Rat anti-DAT 1:500 Millipore (#MAB369)
샘플을 0.1% BSA가 포함된 DPBS로 3회 세척한 후에, 실온에서 1시간 동안 Alexa Fluor 488- 또는 Alexa Fluor 594- 접합된 2차 항체(모두 Thermo Fisher Scientific)와 함께 배양하였다. Hoechst 33342(Ho.; Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 핵을 염색하고, Leica DMI4000B 현미경(Leica, Wetzlar, Germany) 및 Olympus FV1000 공초점 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 형광 이미지를 수득하였다.
실시예 4. 크로마틴 면역침전-시퀀싱 수행
크로마틴 면역침전-시퀀싱(chromatin immuno precipitation-seqencing; ChIP-seq)을 수행하기 위하여, SampleChIP 효소 크로마틴 IP 키트(Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)를 사용하였다.
400만개의 세포를 실온에서 10분 동안 1% 포름알데하이드와 가교 결합한 후에, 0.125 M 글리신을 첨가하고 10분 동안 배양하였다. 이어서, DPBS로 세척하고 제조사의 설명서에 따라 3가지의 세포 용해액으로 연속적으로 배양하여 세포에 손상을 주어 크로마틴을 분리하였다.
분리된 크로마틴은 Bioruptor Pico(Diagenode, Seraing, Belgium)를 사용하여 10 내지 18주기(30초 온/30초 오프)동안 초음파 처리하고, 이어서 히스톤 및 IgG 대조군 항체와 함께 4β에서 밤새도록 배양하였다. 면역침전된 크로마틴을 단백질 G 자기 비드(Protein G magnetic bead)에 가교 결합한 후, DNA 정제 과정을 수행하였다. ChIP-seq 라이브러리는 Illumina 플랫폼용 NEBNext 울트라 DNA 라이브러리 프렙 키트(New England BioLabs, Ipswich, MA, USA)를 사용하여 구성하고, Illumina HiSeq 2000(Illumina, San Diego, CA, USA)로 시퀀싱하였다.
ChIP-seq의 원 데이터는 Bowtie2(Version 2. 2. 6)로 미리-처리하고 MACS 소프트웨어(version 1. 4. 2)로 분석하였다(Feng et al., 2011; Langmead and Salzberg, 2012).
또한, hiDPs 직접 리프로그래밍 동안에 프로모터 영역에서 H3K4me3 마크의 획득 또는 상실을 갖는 유전자를 선택하기 위하여, 표준화된 태그를 분석하고 R을 사용하여 열 지도 포맷으로 시각화하였다.
H3K4me3 마크의 획득 또는 상실의 유전자 목록을 사용하여 DAVID(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)를 이용한 GO 분석을 수행하고, 상위 GO 생물학적 과정을 Microsoft Excel(Version 16. 16. 11)로 시각화하였다.
"중뇌 발달" 및 "신경계 발달"의 유전자 목록을 QuickGO(https://www.ebi.ac.uk/QuickGO/)로부터 획득하고, 모든 나열된 유전자에서 ChIP-seq의 결과를 R을 사용하여 박스 플롯으로 시각화하였다.
특정한 게놈 위치에서 ChIP-seq 신호를 분석하기 위해서 Integrative Genomics Viewer(IGV; Version 2. 3. 91)를 사용하였다.
실시예 5. 마이크로어레이 분석
전반적인 유전자 발현 프로파일을 Agilent Human GE 4 X 44K (V2) chip (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)로 분석하였다. 간단히, 모든 샘플의 RNA 품질을 Agilent 2100 Bioanalyzer System으로 검사한 후에, 증폭, 표지화 및 혼성화 단계를 수행하였다. 원 자료(raw data)는 Agilent's GeneSpringGX software(Version 7. 3. 1)를 사용하여 표준화하였다.
원 자료의 수치를 log2-전환 데이터 또는 Z-점수로 변환한 후에 추가적인 분석을 수행하였다. 선별된 유전자의 발현 프로파일을 R(version 3. 2. 3, https://cran.r-project.org/bin/windows/base) 패키지 'gplot'을 사용하여 열 지도 포맷으로 시각화하였다.
주요 성분 분석(Principal Components Analysis; PCA) 및 산포도(Scatter plot)는 R을 사용하여 분석하고 시각화하였다. 기능상 분류된 유전자 온톨로지(Gene Ontology; GO)/시그날경로(pathway)를 ClueGO 플러그-인(Version 2.2.5, http://apps.cytoscape.org/apps/cluego)과 함께 Cytoscape 소프트웨어 플랫폼(version 3.3.0, http://www.cytoscape.org/whatβisβcytoscape.html)을 사용하여 분석하였다. 수득한 데이터의 비교를 위하여, 공개되어 있는 마이크로어레이 데이터(GSE74991)를 NCBI GEO에서 다운받아 사용하였다.
실시예 6. 전기생리학적 분석
전체-세포 패치-클램프 기록(Whole-cell patch-clamp recordings)을 수행하여 자발적인 또는 유발 활동 전위(Action Potentials; APs) 및 전압-개폐 나트륨/칼륨 전류를 측정하였다. 커버슬립 상에 플레이팅된 세포를 기록 챔버에 넣고, 137 mM NaCl, 2.0 mM CaCl2, 10 mM HEPES 및 20 mM 글루코스(NaOH로 조절된 pH 7.3)를 함유하는 35β배쓰 용액으로 연속적으로 관류시켰다(5 ㎖/분).
패치 피펫은 보로실리케이트 유리 모세관(Clark Electromedical Instruments, UK)으로 제조하였으며 PP-830 피펫 풀러(Narishige Scientific Instrument Lab.; Tokyo, Japan)를 사용하여 작동하였다. 피펫의 저항은 140 mM K-글루코네이트, 5 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 0.5 mM EGTA 및 10 mM HEPES(KOH로 조절된 pH 7.25)를 함유하는 피펫 용액으로 충전하였을 때에 5 내지 6 MΩ이었다.
전압- 또는 전류-클램프 프로토콜 생성 및 데이터 수득은 Digidata 1440 A/D 컨버터(Molecular Devices, San Jose, CA, USA) 및 pCLAMP 10.3 소프트웨어 (Molecular Devices)를 구비한 컴퓨터로 조절하였다. 신호를 5 kHz에서 필터링하고 Axopatch 200B 증폭기(Molecular Devices)를 사용하여 10 kHz에서 샘플링하였다.
자발적인 APs 파이어링(firing)은 전류 주입 없이(I=0) I-클램프 모드로 기록되었으며, 재반동된 APs는 과분극 전류(-20 pA, 0.2 s)의 짧은 주입으로 유도하였다. 또한, 유발된 APs는 1초동안 -0.1 에서부터 0.2 nA까지 0.02-nA씩 단계적으로 전류를 증가시키며 주입하여 기록하였다. 전압-개폐 전류의 측정을 위하여, 1초 동안 -70 에서부터 +110 mV까지 20-mV씩 단계적으로 증가시키며 전류를 주입하였다.
실시예 7. CGH 어레이 분석
직접 리프로그래밍 및 장기적인 계대배양에 의한 카피수 변화(copy number alterations, CNAs)를 측정하기 위하여, 게놈 혼성화 마이크로어레이(Comparative Genomic Hybridization array; CGH array)를 수행하였다.
게놈 DNA를 세포로부터 Wizard Genomic DNA Purification Kit(Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 추출하고, DNA 농도 및 순도를 ND-1000 분광광도계(Nanodrop Technologies, Wilmington, DE, USA)를 사용하여 측정하였다. DNA 품질은 레퍼런스 DNA(Agilent Technologies)와 함께 2% 아가로스 겔에 전기영동하여 DNA의 분해가 나타나는지 확인하였다.
카피수 변화(CNAs)를 측정하기 위하여, SurePrint G3 Human CGH Microarray 4 Υ 180 K kit (Agilent Technologies)를 사용하였다. Agilent의 남성 및 여성 게놈 DNA(유럽의 정상적인 개인)를 레퍼런스 DNA로서 사용하였다. DNA 1.5 ㎍을 37β에서 2시간 동안 AluI 및 RsaI를 사용하여 절단하였다. 섬유아세포 및 hiDPs(p7, p13 및 p22)에서 얻어진 각각의 절단된 샘플을 Cy5-dUTP, 레퍼런스 DNA의 경우 Cy3-dUTP를 사용하여 라벨링하였다. SureTag DNA Labeling Kit Purification Columns(Agilent Technologies)을 이용하여 라벨링된 DNA를 분리하고, 65β에서 24시간 동안 마이크로어레이 슬라이드와 혼성화를 수행하였다. 이어서, 마이크로어레이 슬라이드를 스캐닝하고 Agilent Feature Extraction software V10.7.3.1을 사용하여 원 자료를 추출하였다.
원 자료를 약간의 변형과 함께 디폴트(default) 설정 하에서 Genomic Workbench 7.0.4.0 software(Agilent Technologies)를 사용하여 분석하였다. ADM-2 알고리즘에서 임계값(threshold)을 6으로 설정하고, 프로브 맵핑을 UUCSC 게놈 브라우저(Human NCBI37/hg19) 내에서 게놈 위치에 따라 수행하였다.
실시예 8. 단일 뉴클레오타이드 변이 및 삽입/결실 유무의 확인
유전자 돌연변이인 단일 뉴클레오타이드 변이(Single Nucleotide Variations; SNVs) 및 삽입/결실(insertion/deletion; indel)의 유무를 확인하기 위하여, 세포로부터 게놈 DNA를 추출한 후에 종양 및 줄기세포의 특징과 관련된 유전자를 포함하는 맞춤 패널을 사용하여 NGS를 수행하였다.
배양된 세포를 스크레이퍼를 사용하여 수확한 후에 용해하고 제조사의 설명서에 따라 DNeasy Blood & Tissue 키트(Qiagen)를 사용하여 게놈 DNA를 추출하였다.
추출된 게놈 DNA를, Qubit DsDNA HS 분석 키트(Qiagen)와 함께 Qubit 3.0 Fluorometer(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 형광투시 정량분석으로 측정하였다. 투입 DNA의 최종 농도를 0.67 ng/㎕로 조절하였다. 제조사의 설명서에 따라 Ion Chef System(Thermo Fisher Scientific)에 부합하도록 라이브러리를 제조하였다. 이어서, 정교화된 라이브러리를 Ion 540 Chip(Thermo Fisher Scientific) 및 Ion 540 kit-Chef Kit(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 시퀀싱하였다.
수득한 시퀀싱 원 데이터를 FASTQ 포맷에서 Torrent Suite software(Thermo Fisher Scientific, v5.10)의 Torrent Mapping Alignment Program aligner를 사용하여 hg19 인간 레퍼런스 게놈으로 조절하였다. 변이 콜 포맷(variant call format) 파일을 생성하기 위한 SNV 콜링은 Oncomine Variant Annotator v2.3(Thermo Fisher Scientific) 플러그-인을 사용하였다. TSV 포맷에서 추출된 필터링되지 않은 파일을 다음과 같은 기준을 근거로 분석하였다: 변이 유형은 SNVs와 MNVs(Multi Nucleotide Variations 만을 선택하였고 분석 위치에서 인트론 및 UTR을 제외하고 엑손과 스플라이스 부위를 포함하였다.
실험예 1. 인간 신생아 섬유아세포로부터 생성된 hiDPs의 특성 분석
실험예 1.1. 중뇌 특이적 유전자 마커의 발현 분석
실시예 1.2에서 얻어진 hiDPs와 비교예 1에서 얻어진 hiNSCs에서 중뇌 특이적 유전자 마커의 발현 여부 및 발현량을 비교하였다.
CORIN은 DPs에 대한 특이적 마커이며 만능 줄기세포(PSC)에서 분화된 중뇌 세포 중 DPs만을 농축시키기 위한 표면 항원으로서 사용된다. CORIN에 대한 항체를 이용하여 농축 및 분리된 CORIN+ 세포의 이식은 PD 설치류 및 영장류 모델에서 치료 효과를 나타내는 것으로 보고되었다.
실시예 1.2에서 얻어진 hiDPs와 비교예 1에서 얻어진 hiNSCs를 실시예 3에 기재된 방법으로 CORIN에 대한 면역세포화학염색을 수행한 결과, hiDPs에서는 양성 신호가 검출되었으나, 동일한 신경외배엽 계통으로부터 유래된 hiNSCs에서는 양성 신호가 검출되지 않았다(도 7).
또한, 실시예 1.2에서 얻어진 hiDPs와 비교예 1에서 얻어진 hiNSCs의 중뇌 특이적 마커의 발현량을 비교하기 위하여, 실시예 2에 기재된 방법으로 qRT-PCR을 수행하였다. CORIN 뿐만 아니라, 중뇌 기저판(floor plate) 세포에서 풍부한 것으로 알려진 FOXA2, LMX1A 및 EN1은 hiNSCs 보다는 hiDPs에서 더 높은 발현량을 나타내는 것을 확인하였다(도 8).
실시예 1.2에서 얻어진 hiDPs의 국부적인 정체성(regional identity)를 확인하기 위하여, 실시예 3에 기재된 방법으로 중뇌(EN1) 및 후뇌(HOXB1) 특이적 마커에 대한 면역세포화학염색을 수행한 결과, EN1은 대부분의 hiDPs에서 발현되었으나, HOXB1 발현은 검출되지 않았다(도 9).
이를 통하여, 본 발명의 hiDPs는 중뇌 특이적 특성을 가지고 있음을 확인하였다.
실험예 1.2. 증식 가능성의 평가
기존에 공지된 바에 의하면, PSC-유래된 DPs(PSC-DPs)의 임상 적용에 대한 주요 문제점 중 하나는 제한된 증식 및 특이적 마커 발현과 같은 세포 특성의 점진적인 변화이므로, 본 발명의 hiDPs를 연속적인 계대배양에 걸쳐 증식시킬 수 있는지 여부를 검증하는 실험을 수행하였다.
실시예 1.2에서 얻어진 hiDPs를 120일 이상 동안 배양하는 과정에서 늘어난 세포의 수를 측정한 결과, 증식 속도는 일정하게 나타나고 세포 수는 1024배 이상 증식한 것을 통하여, 증식 가능함을 확인하였다(도 10).
장기간의 배양 동안에 hiDPs 자체의 특성을 유지하는지 여부를 평가하기 위해서, 중간(7-9) 및 후기(18-20) 계대배양 상태의 hiDPs를 분석하였다.
실시예 1.2에서 얻어진 hiDPs의 중간 및 후기 계대배양에서, 실시예 3에 기재된 방법으로 세포 주기 마커인 Ki-67 및 CORIN, PAX2, PAX5 및 FOXA2를 포함하는 DPs 특이적 마커에 대한 면역세포화학염색을 수행한 결과, 상기 마커들을 일정하게 발현하는 것을 확인하였다(도 11). 특히, PAX2 및 PAX5는 생체 내 이식 후 도파민성 신경세포로의 분화능과 밀접한 상관관계가 있는 중뇌-후뇌 경계에서 발현을 하는 것으로 알려져 있다. 한편, 실험예 1.1에 기재된 바와 같이, mRNA 수준에서 발현이 확인된 LMX1A이 단백질 수준에서는 발현을 확인할 수 없었다(도 8 및 도 11).
또한, 유세포 분석법을 통하여 CORIN 및 FOXA2에 대한 정량 분석을 수행한 결과, 실시예 1.2에서 얻어진 hiDPs가 7번 이상의 계대배양 및 20번 이상의 계대배양을 거쳐도 CORIN 및 FOXA2에 대하여 각각 62% 이상 및 99% 이상 양성임을 확인하였다(도 12).
이를 통하여, 본 발명의 hiDPs는 여러 번의 계대배양을 거쳐도 고도로 순수한 중뇌-특이적 특성을 유지하면서 증식 가능한 것을 확인하였다.
실험예 1.3. 미토콘드리아 구조의 분석
PSC, 신경 줄기세포, 조혈모세포, 간엽 줄기세포 및 암 세포와 같이 고도로 증식성인 세포는 세포 에너지 요구 및 다른 필수 생성물의 합성을 위한 구성요소를 생산하기에 적합한 해당 작용에 매우 의존적인 대사작용을 하는 것으로 공지되어 있다. 더욱이, 해당 작용은 미성숙 미토콘드리아 구조와 밀접하게 관련된다. 이에, 실시예 1.2에서 얻어진 hiDPs와 대조군으로 비교예 3에서 얻어진 PSC-DPs의 미토콘드리아 구조를 분석하였다.
미토콘드리아 형태를 비교하기 위하여, 실시예 1.2에서 얻어진 hiDPs와 비교예 3에서 얻어진 PSC-DPs를 실시예 3에 기재된 방법으로 미토콘드리아 특이적 마커인 TOM20에 대하여 면역세포화학염색을 수행하고, 이를 단순화 및 정량분석 하기 위하여, TOM20에 대한 본래 형광 이미지를 골격화하였다. 그 결과, PSC-DPs와 비교하여 hiDPs에서 세포 당 더 많은 수의 미토콘드리아가 있음을 확인하였다(도 13 및 도 14).
또한, 미토콘드리아 당 분지(branch)의 수를 분석한 결과, hiDPs가 PSC-DPs와 비교하여 더 간단한 미토콘드리아 구조(40개 미만의 분지)를 가지는 것을 확인하였다(도 15).
이를 통하여, 본 발명의 hiDPs가 PSC-DPs와 비교하여 해당작용을 위한 미성숙 미토콘드리아를 가지며, 이러한 특성은 hiDPs의 매우 높은 증식성과 관련이 있음을 입증하였다.
실험예 2. hiDPs 직접 리프로그래밍 과정에서의 세포 특성 변화 분석
실험예 2.1. 유전적 특성의 변화 분석
모 섬유아세포(CRL-2097; Fb), 직접 리프로그래밍 과정(8 dpt 및 16 dpt) 및 실시예 1.2에서 얻어진 hiDPs의 전사체를 비교하기 위하여, 실시예 5에 기재된 방법으로 마이크로어레이를 수행하였다. 차별적으로 발현된 유전자(Differentially Expressed Gene; DEG) 분석 및 PCA에 의해 hiDPs 직접 리프로그래밍 동안, 전체적인 유전자 발현의 변화가 나타남을 확인하였다(도 16 및 도 17).
DEG의 기능에 대한 정보를 얻기 위해서, DAVID 기능 어노테이션 클러스터링에 의해 GO terms 풍부도(enrichment) 분석을 수행하였다. 그 결과, hiDPs에서 현저하게 상향 조절된(5배 변화 이상) 유전자는 신경계 발달, 뉴런의 생성, 시냅스 조직화 및 유사분열 세포주기 과정(장기간 증식 능력과 일치함)과 관련되어 있음을 확인하였다(도 18).
유사분열 세포주기 과정 GO terms에 포함되는 유전자들의 발현 수준을 평가하기 위해서, 유전자의 열 지도 분석을 수행하였고, 섬유아세포에서 hiDPs로의 직접 리프로그래밍이 진행되면서 관련 유전자의 발현이 전반적으로 증가되는 양상을 나타냄을 확인하였다(도 19).
이를 통하여, hiDPs 직접 리프로그래밍 과정 동안에 증식 가능한 신경계통 세포, 특히 중추 신경계의 유전적 특성을 획득하였음을 확인하였다.
또한, 모 섬유아세포(Fb)와 이로부터 생성된 hiDPs의 전사체 프로파일을 산포도 분석을 통하여 비교한 결과, 뚜렷한 차이를 나타냈다(도 20).
실시예 1.2에서 얻어진 hiDPs와 기존에 이식 가능한 것으로 보고된 DPs의 특성을 비교하기 위해서, hiDPs 전사체 데이터와 공개적으로 입수할 수 있는 배아 줄기세포(ESP)-유래 DP 데이터; 즉 integrated associated protein(IAP)-양성 분류된, IAP-음성 분류된 및 분류되지 않은 데이터 간의 클러스터 분석을 수행하였다. IAP는 중뇌에 존재하는 도파민성 세포의 신뢰할만한 마커이며, IAP-양성 분류된 세포는 PD 래트 모델에서 분류되지 않은 세포에 비해 개선된 기능 회복을 나타냈다. 분석 결과, 실시예 1.2에서 수득한 hiDPs가 IAP-음성 분류된 DPs 및 분류되지 않은 DPs와 비교하여 IAP-양성 분류된 DPs에 더 유사한 것을 확인하였다(도 21).
이를 통하여, PD 환자를 위한 재생 의학에서 본 발명의 hiDPs의 잠재성을 입증하였다.
실험예 2.2. 후성적 특성의 변화 분석
세포 운명의 변화는 후성 유전학적 기작을 수반하므로 실시예 1의 hiDPs 직접 리프로그래밍 조건이, 신경원성 신호를 수용할 수 있는 개방된 크로마틴 구조로의 후성적 변화를 촉진한다고 추정하였다. 이를 입증하기 위해서, 모 섬유아세포(Fb), 16 dpt 및 실시예 1.2에서 얻어진 hiDPs에서 활성(H3K4me3 및 H3K27ac) 크로마틴 마크에 대한 ChIP-seq 분석을 통해 게놈-범위(genome-wide)의 후성적 변화를 분석하였다.
ChIP-seq 분석 결과, 직접 리프로그래밍 과정 동안 다수 유전자의 전사 개시 부위(TSS) 가까이에서 H3K4me3이 현저하게 증가함을 확인하였다. 또한, 이들 영역은 H3K27ac를 동시에 축적하는 경향을 나타냈으며, 중뇌 마커 유전자, 예를 들어 EN1, EN2, SOX2, LMX1B, FGF8, LMX1A 및 RFX4의 프로모터 영역을 포함하였다(도 22). 또한, 열 지도 분석을 통하여 이들 영역과 관련된 유전자의 발현이 hiDPs 직접 리프로그래밍 동안 상향-조절되는 것을 확인하였다(도 23).
GO-term 분석은 이들 게놈 위치가, 특히 "전사 조절", "신경계 발달" 및 "중뇌 발달" GO-terms와 관련되었음을 나타내며, 이는 전반적인 신경세포 유전자의 발현 유도를 의미한다(도 24). 또한, H3K4me3 및 H3K27ac의 증가는 "중뇌 발달" 및 "신경계 발달"과 관련된 유전자의 프로모터 영역에서 검출되었다(도 25 및 도 26).
구체적으로, H3K4me3 및 H3K27ac 히스톤 마크의 변화를 분석한 결과, 중뇌-후뇌 경계 특이적 유전자(EN1, EN2 및 PAX5) 및 중뇌 기저판 특이적 유전자(FGF8, FOXA2 및 LMX1A)의 프로모터 영역은 hiDPs 직접 리프로그래밍 동안 H3K4me3 및 H3K27ac를 획득하고, 도파민성 신경세포 유전자(VAMT2, GIRK2 및 NEUROD1)의 프로모터는 분화 이전에 이미 개방된 크로마틴 구조를 나타내는 것을 확인하였다(도 27).
TSS 부근의 게놈에서 H3K4me3이 점진적으로 사라지는 유전자들도 다수 존재함을 확인하였다. 이러한 유전자들에서는 H3K27ac이 점진적으로 없어졌으며, hiDPs 직접 리프로그래밍 동안 하향-조절되었다(도 28 및 도 29). 이들 유전자는 섬유아세포에서 고도로 발현되는 콜라겐 피브릴 조직화의 유전자 세트와 관련되어 있는 것을 확인하였다(도 30).
구체적으로, COL1A1, COL5A1 및 THY1의 게놈 위치는 이들의 활성 크로마틴 마크를 점진적으로 상실하였다(도 31).
이를 통하여, 크로마틴 상태의 전환이 중뇌 발달과 관련된 유전자 위치로 중뇌 발달 신호의 접근성을 용이하게 함으로써 hiDPs 직접 리프로그래밍을 가능하게 함을 입증하였다.
실험예 3. hiDPs로부터 중뇌 DNs의 분화
실험예 3.1. 중뇌 DNs로의 분화 가능성 확인
도파민성 신경세포(DNs)로의 분화 가능성을 평가하기 위해서, 실시예 1.2에서 얻어진 hiDPs 및 비교예 1에서 얻어진 hiNSCs를 신경세포 분화 배지에서 배양하였다. 구체적으로, hiDPs 및 hiNSCs를 Geltrex-코팅된 플라스틱 커버슬립(13 ㎜ 직경, Thermo Fisher Scientific)상에 30,000 cells/㎟으로 플레이팅하였다. 다음날, 배양 배지를 1X B27(minus vitamin A), 1X 페니실린/스트렙토마이신(Thermo Fisher Scientific), 20 ng/㎖ 뇌-유래 신경 영양 인자(Peprotech), 20 ng/㎖ 신경교세포-유래 신경 영양 인자(Peprotech), 0.5 mM dbcAMP(Enzo-Life Sciences, Basel, Switzerland) 및 50 ㎍/㎖ 2-포스포-L-아스코르브산을 함유하는 DMEM/F-12 기반의 신경세포 분화 배지(ND 배지)로 교체하였다. 분화를 시작하기 위하여, 1주일 동안 0.2 mM 소듐 부티레이트 및 0.1 μM 화합물-E(γ-세크레타제 억제제; Millipore)를 첨가하였다. 배양 배지는 3일마다 전체 양의 절반씩 교체하였다.
분화 개시 21일 후에, hiDPs(62.9 ± 5.3%)는 hiNSCs(15.3 ± 8.0%)보다 더 높은 비율의 TH+ 도파민성 신경세포를 생성하였다(도 32 및 도 33). 그러나, 이들 두 세포간에서 전체 신경세포를 나타내는 TUJ1으로 면역세포화학염색한 후에 정량분석한 결과 TUJ1+ 신경세포의 양에는 유의한 차이가 없었다(도 34).
실시예 1.2에서 얻어진 hiDPs를 10주 이상 신경세포 분화 조건에서 배양하였을 때, GFAP+ 별아교세포(성상교세포, astrocyte)가 생성됨을 확인하였다(도 35). 또한, 매우 적은 수(전체 세포에서 2~4 정도)이지만 O4+ 희돌기아교세포(oligodendrocyte)도 일부 나타남을 확인하였다(도 35). 이러한 신경교세포(glial cell)의 비율을 정량화하기 위하여 실시예 3에 기재된 방법으로 면역세포화학염색 후, 전체 면적에 대한 형광 이미지 스캐닝을 수행하였으며(도 36), 실시예 1.2에서 얻어진 hiDPs가 분화된 세포들 중 11.7 ± 0.7%가 GFAP+ 별아교세포인 것을 확인하였다(도 37).
이를 통하여, 본 발명의 hiDPs는 중뇌-특이적 DNs 및 신경교세포로 효율적으로 분화되는 것을 입증하였다.
실험예 3.2. 분화된 중뇌 DNs의 특성 분석
실험예 3.2.1. 유전적 특성 분석
실시예 1.2에서 얻어진 hiDPs로부터 분화된 DNs을 특성을 분석하기 위하여, 실시예 3에 기재된 방법으로 중뇌 DNs의 핵심 마커에 대한 면역세포화학염색을 수행하였다. 그 결과, TH+ DNs의 대부분은 중뇌 마커 FOXA2, NURR1, LMX1A 및 EN1을 동시-발현하였다(도 38). hiDPs의 중간 및 후기 계대배양에서, LMX1A에 대한 면역세포화학염색을 수행한 결과, LMX1A의 발현이 확인되지 않았으나(도 11), hiDPs로부터 분화된 DNs에서는 LMX1A의 발현이 확인되었다.
hiDPs는 분화 후에 상대적으로 분화 전과 비교하여 중뇌 마커(FOXA2, NURR1 및 EN1)의 발현이 상대적으로 높은 수준임을 확인하였으며, HOXA2(후뇌에 대한 마커)는 분화 여부와 관계없이 유사하게 발현되었다(도 39).
hiDPs로부터 분화된 DNs의 다른 신경세포 하위 유형의 비율을 조사하기 위하여, 세로토닌성(TPH2), 글루타메이트성(vGLUT1), GABA성(GABA) 및 콜린성(CHAT) 신경세포에 대한 특정한 마커들에 대한 면역세포화학염색을 수행하고, 이를 정량분석하였다. 그 결과, 약간의 CHAT+ 신경세포 마커가 측정되었으나, vGLUT1+, GABA+, 또는 TPH2+ 신경세포는 검출되지 않았다(도 40 및 도 41).
또한, hiDPs 및 hiDPs 유래 신경세포의 전사체 프로파일을 산포도 분석을 통하여 비교한 결과, 별개의 뚜렷한 유전자 발현 패턴의 차이를 나타내었다(도 42).
DAVID 기능 어노테이션 클러스터링 분석을 통하여, hiDPs 유래 신경세포에서 가장 현저하게 상향-조절된(5배 변화 이상) 유전자는 "신경계 발달"과 성숙화와 관련된 GO terms, 예를 들어 "시냅스 신호전달", "화학적 시냅스 전달" 및 "신경세포 분화"와 관련된 것을 확인하였다(도 43).
DNs로의 분화 이전 hiDPs의 ChIP-seq 데이터(도 27)를 고려해보면, 신경세포의 분화 및 성숙화와 관련된 유전자들의 빠른 발현 변화는, 분화 전에 이미 후성적 상태의 변화가 이루어졌기에 가능한 것으로 예측된다.
이를 통하여, 본 발명의 hiDPs는 고도 순수한 중뇌-특이성 DNs의 분화 가능성을 가지며, 이러한 가능성은 분화 전에 결정되었음을 입증하였다.
실험예 3.2.2. 시험관 내 기능적 특성 분석
실시예 1.2에서 얻어진 hiDPs로부터 분화된 중뇌 DNs의 시험관 내 기능적 특성을 평가하기 위하여, 실시예 3에 기재된 방법으로 성숙한 신경세포 마커에 대하여 면역세포화학염색을 수행하였다.
TH+ 신경세포의 대부분은 MAP2(성숙한 신경세포 마커)와 공-염색되었고 MAP2+ 신경세포는 또 다른 성숙한 신경세포 마커인 신경세포 핵(NEUN)과 공-염색되었다(도 44). 또한, MAP2+ 신경세포는 시냅스 앞부분 마커인 SYNAPSIN-I(SYN)를 발현하였다(도 44).
또한, 42일 동안 분화시킨 hiDPs 유래 신경세포와 hiNSCs 유래 신경세포간의 분비된 도파민 수준을 비교하기 위하여 정량분석하였다. 구체적으로, 분화 후 42일째 세포에 10분 동안 56 mM KCl(Sigma-Aldrich)를 처리하여 배양하였다. 10분 후, 전체 배양 배지를 획득하여 Dopamine Research ELISA kit(LDN, Nordhorn, Germany)를 사용하여 효소-결합 면역 분석을 수행하였다. 샘플의 흡광도 값을 표준 농도의 시료를 사용하여 제작된 표준 곡선과 비교하였다. 그 결과, hiDPs로부터 분화된 신경세포는 hiNSCs로부터 분화된 신경세포보다 훨씬 더 많은 도파민을 분비하였다(도 45).
hiDPs 유래 신경세포가 본래의 신경세포와 유사한 기능성 막 특성을 갖는지 여부를 평가하기 위하여, 분화 개시 후 100 내지 120일째에 실시예 6에 기재된 방법으로 전체-세포 패치-클램프 기록을 수행하였다(도 46). 그 결과, 자발적인 APs가 전체 세포 중 20개 세포에서 검출되었다(50%, n = 40; 도 47).
APs는 또한 탈분극 전류의 주입 후에 세포의 대부분에서 유발되었으며(도 48), 이는 Na+ 이온 채널 특유의 억제제인 테트로도톡신(TTX)에 의해 차단되었고(도 48), AP 파이어링이 주입 전류량의 증가에 따라 증가하였다(도 49). 또한, 재반동된 탈분극이 막 과분극에 의해 유도되었다(도 50). 자발적 및 유발된 APs는 신경세포의 기능성을 나타내는 특징이며, 재반동된 APs는 중뇌 도파민성 신경세포의 특징으로 알려져 있다.
전압-클램프 모드에서, 빠른 불활성화 내측 및 외측 전류가 모두 관찰되었으며, 이는 전압-의존적인 K+- 및 Na+-채널 전류에 상응한다. 내측 Na+ 채널 전류는 TTX에 의해 완전히 차단되었다(도 51). 휴지 막 전위는 -43.6 내지 -68.4 mV의 범위였으며, 평균은 대략 -56.9 mV(n=20)였다.
이를 통하여, 본 발명의 hiDPs로부터 분화된 신경세포가 시험관 내에서 도파민을 분비하는 능력 및 막 특성과 관련하여 기능성이 있음을 입증하였다.
실험예 4. PD 마우스 모델에의 hiDPs 이식
실험예 4.1. hiDPs 이식 적합성 평가
최근에 이식-전 세포에서 세포 이식 후 PD의 치료학적 효과를 예측할 수 있는 일부 마커가 보고되었다(Kirkeby et al., 2017). 주지된 DPs 특이적 마커(FOXA2, LMX1A 및 CORIN)는 이식 결과에 대한 예측 마커(EN1, PAX2, PAX5, PAX8 및 SPRY1)의 발현과 음의 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌다.
PD 동물 모델에 대한 세포 이식 전에, 실시예 1.2에서 얻어진 hiDPs 및 실시예 1.3에서 얻어진 A-hiDPs의 이식 적합성을 평가하기 위해서, 실시예 5에 기재된 방법으로 마이크로어레이를 수행하여 전사체 프로파일에서 주지된 DPs 특이적 마커와 치료 효과 예측 마커들의 발현 수준을 비교하였다.
그 결과, PSC-DPs와 비교하여, 실시예 1.2에서 얻어진 hiDPs에서 주지된 DPs 마커의 발현 수준은 낮은 반면, 예측 마커의 수준은 더 높은 것을 확인하였다(도 52). 이러한 결과는 qRT-PCR에 의해 재확인하였다(도 53 및 도 54). 구체적으로, hiDP의 발현량을 기준으로 하여, 주지된 DPs 특이적 마커(FOXA2, LMX1A 및 CORIN)의 상대적인 발현량을 비교한 결과, PSC-DP가 hiDP 보다 1,000배 내지 100,000배 높은 것을 확인하였다. 한편, PSC-DP1의 발현량을 기준으로 하여, 이식 결과에 대한 예측 마커(EN1, PAX2, PAX5, PAX8 및 SPRY1)의 상대적인 발현량을 비교한 결과, hiDP가 PSC-DP 보다 3배 내지 300배 높은 것을 확인하였다.
또한, 예측 마커 발현을 갖는 DPs는 꼬리 중뇌(midbrain-hindbrain boundary) 특징을 갖는 것으로 보고되고 있기 때문에, hiDPs 및 PSC-DPs에서 특정한 영역 마커의 발현 수준을 실시예 5에 기재된 방법으로 마이크로어레이를 수행하여 분석하였다. hiDPs는 부리(rostral) 유전자 보다는 꼬리(caudal) 유전자의 더 높은 발현을 보였으며, 이는 꼬리 중뇌 정체성을 나타낸다(도 55).
이를 통하여, 본 발명의 hiDPs는 PSC-DPs와는 구별되는 별개의 세포임을 알 수 있으며, PSC-DPs와 비교하여, 생체 내 이식을 통한 PD 치료에 보다 적합한 것을 확인하였다.
실험예 4.2. hiDPs 이식의 적합한 시점 확인
고도로 증식성인 hiDPs의 특성으로 인한 생체 내 종양 형성을 피하기 위하여, 세포 분열이 더 이상 발생하지 않는 시점에 hiDPs를 이식하는 것이 적합할 것으로 예상하였다.
세포 분열이 발생하지 않는 시점을 확인하기 위하여, 실시예 3에 기재된 방법으로 Ki-67에 대하여 면역세포화학염색을 수행하고, 이를 정량분석 하였다. 그 결과, 증식성을 나타내는 Ki-67+ 세포가 신경세포로의 분화 조건에 의하여 점진적으로 감소하였으며, 분화 후 8일째에서는 발견되지 않았다(도 56 및 도 57). 따라서, PD 마우스 모델에 분화-후 7일째 hiDPs를 이식하기로 결정하였다.
한편, 장기간의 계대배양을 거쳐도 게놈의 안정성이 유지되는지 확인하기 위해서, 실시예 7에 기재된 방법으로 CGH array를 수행하여, 장기간 배양된 hiDPs 및 이의 모 섬유아세포의 카피수 변화를 비교 분석하였다. 모 섬유아세포와 비교하여, 22번의 계대배양에 걸쳐 배양된 hiDPs에서 CNVs는 발견되지 않았다(도 58). 또한, 핵형 분석 결과를 통하여, 24번의 계대배양된 hiDPs에서 염색체의 구조 이상이 없음을 확인하였다(도 59).
이를 통하여, 장기간에 걸친 반복된 분열 후에도 hiDPs의 게놈 구조가 안정하게 유지되므로 생체 내 이식에 적합한 것을 입증하였다.
실험예 4.3. hiDPs 이식의 PD 치료 효과 확인
정상 마우스를 아베르틴 마취하에서 중뇌의 흑질 내에 6-하이드록시도파민(6-OHDA; Sigma-Aldrich)을 주사하여 단측성 병변을 만들었다(A-P: -3.1 ㎜; M-L: ±1.1 ㎜; D-V: -4.4 ㎜). 6-OHDA-유도 병변 형성 전 및 형성 후 4주 및 6주째에 아포모르핀(0.4 ㎎/㎏; Sigma-Aldrich)을 주사하여 회전 행동을 유도하고, 이를 측정하여 파킨슨병 모델이 만들어졌는지를 평가하였다. 아포모르핀 투여 60분 후에 병변 측으로의 400±50회의 회전을 나타내는 동물은 파킨슨병 모델이 만들어진 것으로 판단하고, hiDPs 이식에 사용하였다.
총 1 x 105개의 분화된 hiDPs 세포를 6-OHDA-처리된 마우스의 병변 선조체 내에 이식하였다(A-P: +0.4 ㎜; M-L: ±1.5 ㎜; D-V: -2.8 ㎜). 세포 이식 후 7일 동안 매일 사이클로스포린 A를 복강 내 주사하였다. 아포모르핀-유도 회전 행동을 이식 후 2주마다 측정하였다. 시계방향 및 반-시계방향 회전의 수를 카운트하고 뇌 반구에 대해 60분 당 총 회전수로 표현하였다. 편향을 최소화하기 위하여, PD 마우스 모델의 행동 분석은 블라인드 방식으로 두 실험자에 의해 독립적으로 평가하였다.
6-OHDA-유도 PD 마우스 모델에서 10일 이상 신경세포로 분화된 hiDPs의 이식 후에, 행동 결함이 점차적으로 회복된 반면, 모의(sham) 및 비히클(vehicle) 대조군에서는 회복을 관찰할 수 없었다(도 60). 또한, hiDPs-주입된 마우스는 이식 후 4주 째부터 운동 결함의 현저한 개선을 나타내었다(도 60).
hiDPs 이식의 효과를 직접적으로 평가하기 위해서, 선조체의 TH 및 DAT에 대한 면역세포화학염색을 위해 마우스를 안락사하였다. 모의 및 비히클 대조군에서 6-OHDA 투여에 의한 양성 신호를 발견하지 못했으나, hiDPs-이식된 마우스의 선조체에서 TH+DAT+ 세포가 발견되었다(도 61 및 도 62).
이를 통하여, 생체 내 이식된 본 발명의 hiDPs가 기능성 DNs으로 분화하며, 이는 PD 마우스 모델에서 운동의 회복에 기여할 가능성이 높은 것을 입증하였다.
실험예 4.4. hiDPs 이식의 종양원성 평가
hiDPs-이식된 랫드의 생체 내에서 종양원성의 부재를 추가로 확인하기 위하여, 면역억제제를 매일 주사하면서 정상 랫드의 선조체에 hiDPs를 이식하였다. 랫드 선조체에 대한 Nissl 염색 및 인간-특이적 미토콘드리아에 대한 DBA 염색 결과를 통하여, 이식편이 확산 없이 주입 부위에서 유지되고, 이식편 주변의 뇌 구조가 대측성 배향과 비교하여 붕괴되지 않았으며, 세포의 크기 및 모양의 가변성 면에서 다형성을 포함하여, 신경 로제트(rosette) 또는 악성 종양이 이식편에서 나타나지 않은 것을 확인하였다(도 63 및 도 64).
이를 통하여, PD 마우스 모델에서의 데이터와 일치하는 바와 같이, 정상 랫드에서 본 발명의 hiDPs를 이식한 경우에 이식된 부위에 종양을 형성시키지 않음을 입증하였다.
추가적으로, 면역결핍 NSG 마우스를 사용하여 hiDPs의 종양원성을 확인하였다. 구체적으로, 실시예 1.2에서 수득한 hiDPs, 이식에 사용된 분화된 hiDPs 및 동질 hiPSCs를 NSG 마우스에 피하 주사하였다. hiPSCs-주사된 군에서 주사-후 4주째에 종양이 형성되기 시작하였고, 주사-후 9주째에 모든 마우스에서 종양이 형성되었다(도 65 및 도 66). 대조적으로, hiDPs-주사된 군에서는 hiDPs 의 분화 여부와 관계없이, 어떠한 종양도 생성되지 않았다(도 65 및 도 66).
이를 통하여, 본 발명의 hiDPs 이식의 PD에 대한 치료학적 효능 및 종양 형성에 대한 안전성을 확인하였다.
실험예 5. 인간 성체 섬유아세포로부터 생성된 A-hiDPs의 특성 분석
실시예 1.3에서 얻어진 A-hiDPs에서 대표적인 DPs 마커인 CORIN, PAX2, PAX5 및 FOXA2, 세포 주기 마커인 Ki-67 및 hiNSCs의 핵심 마커인 PAX6의 발현 여부를 확인하기 위하여, 실시예 3에 기재된 방법으로 면역세포화학염색을 수행하였다. 그 결과, CORIN, PAX2, PAX5, FOXA2 및 Ki-67는 발현하였으나, PAX6는 발현하지 않는 것을 확인하였다(도 67).
A-hiDPs를 100일 이상 동안 배양하는 과정에서 증가된 세포의 수를 측정한 결과, 증식 속도는 일정하게 나타나고 세포 수는 1020배 이상 증식한 것을 통하여, 증식 가능함을 확인하였다(도 68). 또한, 핵형 분석 결과를 통하여 20번 이상의 계대배양을 거쳐도 A-hiDPs 염색체의 구조 이상이 없음을 확인하였으며(도 69), 유세포 분석법을 통하여 DPs의 핵심 마커인 CORIN 및 FOXA2의 발현이 20번 이상 계대배양을 거쳐도 높은 수준(각각 61.2% 및 99.5%)으로 유지되는 것을 확인하였다(도 70).
DNs로의 분화 능력을 확인하기 위해서, 실험예 3.1에 기재된 신경세포 분화 조건에서 A-hiDPs를 배양하였다. A-hiDP로부터 분화된 TH+ 신경세포는 LMX1A, NURR1 및 FOXA2와 공-염색되었으며, 이는 중뇌-특이성 특징을 나타낸다(도 71). 또한, A-hiDP는 TH+ 신경세포를 고수율(52%)로 생성하였다(도 72).
A-hiDPs로부터 분화된 DNs의 다른 신경세포 하위유형의 비율을 조사하기 위하여, 세로토닌성(TPH2), 글루타메이트성(vGLUT1), GABA성(GABA) 및 콜린성(CHAT) 신경세포 특이적 마커들에 대한 면역세포화학염색을 수행한 결과, 해당 세포들이 존재하지 않음을 확인하였다(도 73).
A-hiDPs로부터 분화된 DNs는 실시예 1.2에서 얻어진 hiDPs(Y-hiDPs)로부터 분화된 DNs와 비교하여, 유사한 양의 도파민을 분비하는 것을 확인하였다(도 74).
이를 통하여, 실시예 1.2에 기재된 hiDPs 직접 리프로그래밍 프로토콜의 재현성을 입증하였다.
실험예 6. 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터 생성된 hiDPs의 특성 분석
실시예 1.4에서 얻어진 PBMC-hiDPs(70262-01 및 70262-02)에서 대표적인 DPs 마커인 CORIN, LMX1A 및 FOXA2, 세포 주기 마커인 Ki-67 및 hiNSCs의 핵심 마커인 PAX6의 발현 여부를 확인하기 위하여, 실시예 3에 기재된 방법으로 면역세포화학염색을 수행하였다. 그 결과, CORIN, FOXA2 및 Ki-67는 발현하고, LMX1A 및 PAX6는 발현하지 않는 것을 확인하였다(도 75).
또한, PBMC-hiDPs에서 중뇌 DPs 특이적 마커들(CORIN, EN1, PAX5, PAX8, SPRY1 및 CNPY1)의 발현량을 실시예 1.2에서 얻어진 섬유아세포 유래 hiDPs(Fb-hiDPs)와 비교하기 위하여, 실시예 2에 기재된 방법으로 qRT-PCR을 수행하였다. 그 결과, CORIN, EN1, PAX5, PAX8, SPRY1, CNPY1의 발현량이 Fb-hiDPs와 비교하여 큰 차이가 없음을 확인하였다(도 76).
DNs로의 분화 능력을 확인하기 위해서, 실험예 3.1에 기재된 신경세포 분화 조건에서 A-hiDPs를 배양하였다. 분화 후 21일째에 명시야 이미지를 촬영한 결과, 신경세포 특이적 형태로 분화된 것을 확인하였다(도 77). 또한, 중뇌 DNs 특이적 마커(TH, EN1, NURR1) 및 신경세포의 성숙화와 관련된 마커(MAP2, NeuroN; NEUN)의 발현량을 측정하기 위하여 qRT-PCR을 수행한 결과, Fb-hiDPs와 비교하여 큰 차이가 없는 것을 확인하였다(도 78).
이를 통하여, 실시예 1.2에 기재된 hiDPs 직접 리프로그래밍 프로토콜은 섬유아세포 뿐만 아니라 PBMC를 포함한 다른 체세포에도 동일하게 적용될 수 있음을 입증하였다.
실험예 7. CHIR99021 및 A83-01을 대체하는 저분자 화합물을 사용한 hiDPs 직접 리프로그래밍
실시예 1.2에 기재된 hiDPs 직접 리프로그래밍 프로토콜과 동일하지만, WNT 신호전달 작용제인 CHIR99021 또는 TGF-β 억제제인 A83-01을 대체하는 다른 저분자 화합물을 사용하여 hiDPs 직접 리프로그래밍을 수행하였다. 구체적으로, 3.0 μM CHIR99021(Stemcell Technologies)을 2.0 μM CHIR98014로 변경하거나, 0.5 μM A83-01을 2.0 μM SB431542로 변경하였다.
실시예 1.2에 기재된 프로토콜 및 각각의 변경된 프로토콜에서 hiDPs 직접 리프로그래밍을 수행한 결과, 모든 조건에서 hiDPs 형태의 세포가 생성되는 것을 확인하였다(도 79).
모 섬유아세포 및 각각의 조건에서 형성된 hiDPs에서 중뇌 DPs 특이적 마커들(EN1, PAX2, PAX5 및 PAX8)의 발현량을 비교하기 위하여, 실시예 2에 기재된 방법으로 qRT-PCR을 수행하였다. 그 결과, 네 가지 유전자 모두 모 섬유아세포에 비하여 발현이 증가한 것을 확인하였다(도 80).
이를 통하여, 실시예 1.2에 기재된 hiDPs 직접 리프로그래밍 프로토콜을 수행함에 있어서, WNT 신호전달 작용제 및 TGF-β 억제제 효과를 나타내는 것으로 알려진 다른 저분화 화합물을 사용하더라도 hiDPs 직접 리프로그래밍이 성공적으로 수행될 수 있음을 입증하였다.
실험예 8. hiDPs 리프로그래밍 과정 중 만능 단계의 우회
hiDPs 리프로그래밍은 만능 유도 인자인 OSKM의 이소성 발현에 의존하기 때문에, 실시예 1을 통하여 얻어진 hiDPs가 일시적인 만능 획득 이후 분화 과정을 통해 생성되었을 가능성이 존재한다. 이러한 가능성을 실험하기 위해서, 실시예 2에 기재된 방법으로 qRT-PCR을 수행하여 hiDPs, hiNSCs 및 hiPSCs 각각의 핵심 마커 유전자 발현량을 비교하였다.
hiPSCs의 핵심 마커를 분석한 결과, 내인성 OCT4의 발현량은 hiPSCs 리프로그래밍의 14 dpt부터 상향 조절되었으나 hiDPs 리프로그래밍 과정 전체에 걸쳐 변화하지 않았고, NANOG의 발현량은 hiPSCs 리프로그래밍의 과정 전체에 걸쳐 상향 조절된 반면, hiDPs 리프로그래밍의 7~14 dpt에서 일시적으로 증가하였다가 다시 감소하였으며, 이는 최종적으로 얻어진 hiPSC와 비교하면 낮은 수준임을 확인하였다(도 81).
hiNSCs의 핵심 마커 중 하나인 PAX6의 발현이 hiNSCs 리프로그래밍의 14 dpt에서 처음 검출되었고, 이후 hiNSC 리프로그래밍 과정에서 계속 증가하였다(도 82). hiDPs의 핵심 마커를 분석한 결과, EN1, LMX1A 및 FOXA2의 발현 수준은 hiDPs 리프로그래밍의 14 dpt에서 또는 더 일찍 증가하였으나, hiNSCs 리프로그래밍 과정 전체에 걸쳐 발현량이 매우 낮은 것을 확인하였다(도 82). 이를 통하여, hiDPs 리프로그래밍 과정은 hiPSCs 및 hiNSCs 리프로그래밍 경로와 별개임을 입증하였다.
한편, hiDPs 리프로그래밍은 OSKM을 사용하므로, 리프로그래밍 과정 동안에 일시적으로 만능 세포가 생성되고, 이후에 재-분화되어 hiDPs를 생성될 가능성이 존재한다. 이러한 가능성을 실험하기 위해서, 실시예 1, 비교예 1 및 2에서 사용한 SeV는 열에 의해 불활성화 되는 특성을 갖고 있으므로, 리프로그래밍 과정 중에 열 충격을 통하여 hiPSCs가 생성될 수 없는 수준으로 OSKM의 발현을 낮춘 후에 실시예 1의 hiDPs 및 비교예 2의 hiPSC 리프로그래밍을 수행하였다 (도 83).
hiPSCs는 5 dpt 내지 7 dpt의 열 충격 하에서 20일째에 ALP+ 콜로니가 관찰되지 않은 반면, 열 충격 없는 대조용 세포로부터는 ALP+ 콜로니가 발생하였다(도 84). 또한, ALP+ 세포 생성이 불가능한 열 충격 조건하에서 hiDPs 리프로그래밍 결과, FOXA2+ 콜로니가 검출되었고(도 85), 이는 이들 콜로니가 hiDPs로 세포 운명 전환된 것을 의미한다.
추가적으로, hiDPs가 만능 중간체로부터 생성되는 경우, hiDPs 리프로그래밍이 진행중인 중간체는 만능을 유도하는 배양 환경으로의 변화와 함께 hiPSC로 전환될 수 있을 것이라는 예측하였다.
hiDPs 리프로그래밍 과정에서 48시간 동안의 열 충격을 가한 경우에, 8 dpt시점에 hiDPs 리프로그래밍 배양 조건을서 hiPSC 리프로그래밍 배양 조건으로 변화하여도, ALP+ 콜로니는 검출되지 않았다(도 84). 리프로그래밍 과정이 열 충격에 의한 세포 노화로 인해 늦춰졌을 가능성이 있기 때문에, 기존 20일 에서 30일까지 리프로그래밍 조건을 계속 유지하였으나, 여전히 ALP+ 콜로니는 검출되지 않았다(도 86).
이를 통하여, 실시예 1의 hiDPs 리프로그래밍은 만능 중간체 단계를 거치지 않고 체세포로부터 직접 생성됨을 입증하였다.
실험예 9. 인간 섬유아세포에 대한 마우스 iDPs 직접 리프로그래밍 수행
본 발명자들이 이전에 마우스 섬유아세포를 iDPs로 직접 리프로그래밍한 조건을 인간 섬유아세포에 사용하여 인간 유도 도파민성 신경세포 전구체(hiDPs)가 생성되는지 확인하였다.
인간 섬유아세포(CRL2097)를 Matrigel(BD Biosciences, USA)이 코팅된 배양 용기에 접종하여, 10% FBS, 1% 비-필수 아미노산(NEAA) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S, Penicillin/Streptomycin)이 함유된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 배양한 후, OSKM 인자를 형질도입 하였다(D0). 형질도입 후 6일째(D5)에, 세포를 1X N2, 1X B27, 0.05% BSA, 2 mM GlutaMax, 0.11 mM 베타-메르캅토에탄올을 포함하는 Advanced DMEM/F12 및 신경 기본배지(neurobasal medium)의 혼합 배지(1:1 혼합)에 유도 인자로써 200 ng/mL SHH 또는 100 ng/mL SHH 및 100 ng/mL FGF8를 포함하는 RepM-N 배지로 배양하기 시작하여, 19일 동안 추가 배양하였다(도 87).
그 결과, 200 ng/mL 또는 100 ng/mL의 SHH를 사용한 두 조건 모두에서 hiDPs를 포함하는 신경세포 계통의 세포로 볼 수 없는 형태의 세포만 발생하는 것을 확인하였다(도 88).
이를 통하여 마우스 iDPs 직접 리프로그래밍 조건은 인간 섬유아세포의 hiDPs로의 직접 리프로그래밍에는 효과가 없는 것을 입증하였다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> METHOD FOR PRODUCING INDUCED DOPAMINEGERIC NEURONAL PROGENITORS BY DIRECT REPROGRAMMING <130> FPD-202007-0070C <150> KR 10-2019-0116258 <151> 2019-09-20 <160> 30 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXA2_F <400> 1 ggagcagcta ctatgcagag c 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXA2_R <400> 2 cgtgttcatg ccgttcatcc 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SHH_F <400> 3 ctcgctgctg gtatgctcg 19 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SHH_R <400> 4 atcgctcgga gtttctggag a 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LMX1A_F <400> 5 acgtccgaga accatcttga c 21 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LMX1A_R <400> 6 caccaccgtt tgtctgagc 19 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CORIN_F <400> 7 ccaaagccgg tcttgagag 19 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CORIN_R <400> 8 gaggaggtta gcagtcgcc 19 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EN1_F <400> 9 cgcagcagcc tctcgtatg 19 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EN1_R <400> 10 cctggaactc cgccttgag 19 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAX2_F <400> 11 acgaggcttg gagattcagc aa 22 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAX2_R <400> 12 tgtcggcctg aagcttgatg t 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAX5_F <400> 13 acttgctcat caaggtgtca g 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAX5_R <400> 14 tcctccaatt accccaggct t 21 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAX8_F <400> 15 atagctgccg actaagcatt ga 22 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAX8_R <400> 16 atccgtgcga aggtgcttt 19 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPRY1_F <400> 17 gccctggata aggaacagct ac 22 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPRY1_R <400> 18 gccgaaatgc ctaatgcaaa ga 22 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Endo-OCT4_F <400> 19 agtttgtgcc agggtttttg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Endo-OCT4_R <400> 20 acttcacctt ccctccaacc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NANOG_F <400> 21 aacgttctgc tggactgagc 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NANOG_R <400> 22 atgcttcaaa gcaaggcaag 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAX6_F <400> 23 gtccatcttt gcttgggaaa 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAX6_R <400> 24 tagccaggtt gcgaagaact 20 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NURR1_F <400> 25 accactcttc gggagaatac a 21 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NURR1_R <400> 26 ggcatttggt acaagcaagg t 21 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HOXA2_F <400> 27 cccctgtcgc tgatacattt c 21 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HOXA2_R <400> 28 tggtctgctc aaaaggagga g 21 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_F <400> 29 tgcaccacca actgcttagc 20 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_R <400> 30 ggcatggact gtggtcatga g 21

Claims (30)

  1. 다음 단계를 포함하는 유도 도파민성 신경세포 전구체(induced dopaminergic neuronal progenitors, iDPs)의 제조방법:
    a) 성체세포에 Oct4, Sox2, Klf4 및 Myc로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 도입하는 단계;
    b) 상기 세포를 EGF 및 FGF2를 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및
    c) 상기 세포를 FGF8, SHH, Wnt 신호전달 작용제 및 TGF-β 억제제를 포함하는 배지에서 배양하는 단계,
    상기 유도 도파민성 신경세포 전구체는
    (i) CORIN, FOXA2 및 LMX1A 유전자가 만능 줄기세포 유래 도파민성 신경세포 전구체와 비교하여 감소된 발현을 나타내고,
    (ii) EN1, PAX5, PAX8 및 SPRY1 유전자가 만능 줄기세포 유래 도파민성 신경세포 전구체와 비교하여 증가된 발현을 나타내는, 유도 도파민성 신경세포 전구체이고,
    상기 성체세포는 인간 유래인, 유도 도파민성 신경세포 전구체의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 성체세포는 섬유아세포, 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 또는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)인, 유도 도파민성 신경세포 전구체의 제조방법.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 Wnt 신호전달 작용제는
    i) Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11 및 Wnt16b;
    ii) GSK3 억제제인 리튬, LiCl, 이가 아연, BIO, SB216763, SB415286, CHIR99021, CHIR98014, QS11 수화물, TWS119, 켄폴론, 알스터폴론, 인디루빈-3-옥심, TDZD-8 및 Ro 31-8220 메탄설폰산염;
    iii) Axin 억제제;
    iv) APC 억제제;
    v) 노린;
    vi) R-스폰딘 2; 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 유도 도파민성 신경세포 전구체의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 TGF-β 억제제는 A83-01, SB431542, RepSox, LY364947, SB525334 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 유도 도파민성 신경세포 전구체의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 b)단계 배양 후, ROCK(Rho-associated protein kinase) 억제제인 Y-27632를 첨가하여 배양하는 단계를 더 포함하는 것인, 유도 도파민성 신경세포 전구체의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 b)단계의 배지는 Wnt 신호전달 작용제, TGF-β 억제제, 2-포스포-L-아스코르브산 및 부티르산 나르튬(Sodium butyrate; NaB)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 추가적으로 포함하는 것인, 유도 도파민성 신경세포 전구체의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 b)단계의 배지는 Wnt 신호전달 작용제 및 TGF-β 억제제를 추가로 포함하는 것인, 유도 도파민성 신경세포 전구체의 제조방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 c)단계의 배지는 2-포스포-L-아스코르브산를 추가적으로 포함하는 것인, 유도 도파민성 신경세포 전구체의 제조방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 b)단계의 배지는 1 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖의 EGF 및 1 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖의 FGF2를 포함하는 것인, 유도 도파민성 신경세포 전구체의 제조방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 c)단계의 배지는 10 ng/㎖ 내지 1000 ng/㎖의 FGF8, 100 ng/㎖ 내지 2000 ng/㎖의 SHH, 0.1 μM 내지 50.0 μM의 Wnt 신호전달 작용제 및 0.01 μM 내지 10.0 μM의 TGF-β 억제제를 포함하는 것인, 유도 도파민성 신경세포 전구체의 제조방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 a)단계는 12시간 내지 36시간 동안 수행하는 것인, 유도 도파민성 신경세포 전구체의 제조방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 b)단계는 5일 내지 9일 동안 수행하는 것인, 유도 도파민성 신경세포 전구체의 제조방법.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 c)단계는 10일 내지 18일 동안 수행하는 것인, 유도 도파민성 신경세포 전구체의 제조방법.
  15. 제1항에 있어서,
    성체세포로부터 유도 도파민성 신경세포 전구체를 직접 리프로그래밍 하는 것인, 유도 도파민성 신경세포 전구체의 제조방법.
  16. 제1항의 제조방법으로 제조된 유도 도파민성 신경세포 전구체.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 유도 도파민성 신경세포 전구체는 증식 가능한 것인, 유도 도파민성 신경세포 전구체.
  18. (i) CORIN, FOXA2 및 LMX1A 유전자가 만능 줄기세포 유래 도파민성 신경세포 전구체와 비교하여 감소된 발현을 나타내고,
    (ii) EN1, PAX5, PAX8 및 SPRY1 유전자가 만능 줄기세포 유래 도파민성 신경세포 전구체와 비교하여 증가된 발현을 나타내는, 유도 도파민성 신경세포 전구체로서,
    상기 전구체는 인간 유래인, 유도 도파민성 신경세포 전구체.
  19. 제18항에 있어서,
    (i) CORIN, FOXA2 및 LMX1A 유전자가 만능 줄기세포 유래 도파민성 신경세포 전구체와 비교하여 1,000배 내지 100,000배 감소된 발현을 나타내는, 유도 도파민성 신경세포 전구체.
  20. 제18항에 있어서,
    (ii) EN1, PAX5, PAX8 및 SPRY1 유전자가 만능 줄기세포 유래 도파민성 신경세포 전구체와 비교하여 3배 내지 300배 증가된 발현을 나타내는, 유도 도파민성 신경세포 전구체.
  21. 제18항에 있어서,
    HOXB1을 발현하지 않는, 유도 도파민성 신경세포 전구체.
  22. 제18항에 있어서,
    내인성 Oct4 및 NANOG는 유도 만능 줄기세포와 비교하여 감소된 발현을 나타내는, 유도 도파민성 신경세포 전구체.
  23. 제18항에 있어서,
    PAX6은 유도 신경 줄기세포와 비교하여 감소된 발현을 나타내며,
    EN1, LMX1A 및 FOXA2은 유도 신경 줄기세포와 비교하여 증가된 발현을 나타내는, 유도 도파민성 신경세포 전구체.
  24. 제16항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 기재된 유도 도파민성 신경세포 전구체를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  25. 제16항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 기재된 유도 도파민성 신경세포 전구체에 파킨슨병 예방 또는 치료제 후보 물질을 처리하는 단계; 및
    후보 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 유도 도파민성 신경세포 전구체의 증식력, 활성 또는 도파민성 신경세포로의 분화능을 측정하는 단계를 포함하는 파킨슨병 예방 또는 치료제 스크리닝 방법.
  26. Oct4, Sox2, Klf4 및 Myc로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 도입된 인간 성체세포, EGF, FGF2, Wnt 신호전달 작용제 및 TGF-β 억제제를 포함하는, 제16항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 기재된 유도 도파민성 신경세포 전구체 제조용 혼합물.
  27. 제16항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 기재된 유도 도파민성 신경세포 전구체, FGF8, SHH, Wnt 신호전달 작용제 및 TGF-β 억제제를 포함하는 혼합물.
  28. EGF, FGF2, Wnt 신호전달 작용제 및 TGF-β 억제제를 포함하는, 제16항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 기재된 유도 도파민성 신경세포 전구체 제조용 배지 조성물.
  29. FGF8, SHH, Wnt 신호전달 작용제 및 TGF-β 억제제를 포함하는, 제16항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 기재된 유도 도파민성 신경세포 전구체 제조 또는 유지용 배지 조성물.
  30. 제16항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 기재된 유도 도파민성 신경세포 전구체를 신경세포 분화 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 도파민성 신경세포의 제조방법.
KR1020200121802A 2019-09-20 2020-09-21 직접 리프로그래밍을 통한 유도 도파민성 신경세포 전구체의 제조방법 KR102288424B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20190116258 2019-09-20
KR1020190116258 2019-09-20

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20210034535A KR20210034535A (ko) 2021-03-30
KR102288424B1 true KR102288424B1 (ko) 2021-08-11

Family

ID=74882974

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200121802A KR102288424B1 (ko) 2019-09-20 2020-09-21 직접 리프로그래밍을 통한 유도 도파민성 신경세포 전구체의 제조방법

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20230000923A1 (ko)
EP (1) EP4032974A4 (ko)
JP (1) JP2022549224A (ko)
KR (1) KR102288424B1 (ko)
CN (1) CN114867849A (ko)
AU (1) AU2020350408A1 (ko)
CA (1) CA3155277A1 (ko)
WO (1) WO2021054806A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023204567A1 (ko) * 2022-04-20 2023-10-26 고려대학교 산학협력단 인간 체세포를 증식 가능한 신경줄기세포로 전환하는 방법.

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101696874B1 (ko) 2013-07-31 2017-01-16 한국생명공학연구원 직접 리프로그래밍을 통한 유도 도파민성 전구세포 제조방법

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7544511B2 (en) * 1996-09-25 2009-06-09 Neuralstem Biopharmaceuticals Ltd. Stable neural stem cell line methods
RU2014147015A (ru) * 2012-04-24 2016-06-10 Интернэшнл Стем Селл Корпорейшн Получение нервных стволовых клеток и дофаминергических нейронов из плюрипотентных стволовых клеток человека
US20140248696A1 (en) * 2013-03-01 2014-09-04 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods of maintaining, expanding, and diffrentiating neuronal subtype specific progenitors
SG11201601720RA (en) * 2013-09-05 2016-04-28 Univ Kyoto New method for inducing dopamine-producing neural precursor cells
WO2016026438A1 (en) * 2014-08-19 2016-02-25 Tongji University Methods and compositions for selective generation of dopaminergic precursors
AU2015311816B2 (en) * 2014-09-03 2019-04-04 Massachusetts Institute Of Technology Compositions, systems, and methods for generating inner ear hair cells for treatment of hearing loss
KR101782488B1 (ko) * 2015-05-19 2017-09-28 주식회사 스템랩 Oct4가 도입된 인간체세포로부터 직접적 리프로그래밍을 통한 희소돌기아교 전구세포를 유도하는 방법
LT3303564T (lt) * 2015-06-01 2022-05-10 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Vidurinių smegenų dopamininių (mda) neuronų diferenciacijos in vitro būdai
CN109072198B (zh) * 2016-04-22 2022-08-26 国立大学法人京都大学 产多巴胺神经祖细胞的制备方法
EP4001403A1 (en) * 2016-08-16 2022-05-25 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Methods for differentiating pluripotent cells

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101696874B1 (ko) 2013-07-31 2017-01-16 한국생명공학연구원 직접 리프로그래밍을 통한 유도 도파민성 전구세포 제조방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J Stem Cells Regen Med. 14(1):34-44 (2018.05.30.)*
Redox Biol. 11:606-612 (2017.04.)*

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023204567A1 (ko) * 2022-04-20 2023-10-26 고려대학교 산학협력단 인간 체세포를 증식 가능한 신경줄기세포로 전환하는 방법.

Also Published As

Publication number Publication date
KR20210034535A (ko) 2021-03-30
JP2022549224A (ja) 2022-11-24
AU2020350408A1 (en) 2022-04-07
EP4032974A1 (en) 2022-07-27
CN114867849A (zh) 2022-08-05
CA3155277A1 (en) 2021-03-25
WO2021054806A1 (ko) 2021-03-25
US20230000923A1 (en) 2023-01-05
EP4032974A4 (en) 2023-12-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230114089A1 (en) Method for inducing dopaminergic neuron progenitor cells
Kaewkhaw et al. Transcriptome dynamics of developing photoreceptors in three-dimensional retina cultures recapitulates temporal sequence of human cone and rod differentiation revealing cell surface markers and gene networks
Wang et al. Formative pluripotent stem cells show features of epiblast cells poised for gastrulation
JP6262205B2 (ja) ヒト多能性幹細胞からの神経幹細胞およびドーパミン作動性ニューロンの誘導方法
US20160160177A1 (en) Method and medium for neural differentiation of pluripotent cells
Hou et al. Direct conversion of human fibroblasts into neural progenitors using transcription factors enriched in human ESC-derived neural progenitors
EP2737057B1 (en) Novel markers for dopaminergic neuron progenitor cells
WO2018193949A1 (ja) ドパミン神経細胞の調製方法
Motohashi et al. Neural crest cells retain their capability for multipotential differentiation even after lineage‐restricted stages
KR102288424B1 (ko) 직접 리프로그래밍을 통한 유도 도파민성 신경세포 전구체의 제조방법
Okabe et al. Neural development of methyl-CpG-binding protein 2 null embryonic stem cells: a system for studying Rett syndrome
US20220090010A1 (en) Method of producing enteric neurons and uses thereof
Denis et al. Global transcriptional profiling of neural and mesenchymal progenitors derived from human embryonic stem cells reveals alternative developmental signaling pathways
Hermanto et al. Xeno‐free culture for generation of forebrain oligodendrocyte precursor cells from human pluripotent stem cells
Medina-Cano et al. Rapid and robust directed differentiation of mouse epiblast stem cells into definitive endoderm and forebrain organoids
WO2015124725A1 (en) Late born central nervous system cell types
CN112011510B (zh) 一种由人多能干细胞制备多巴胺神经元的方法
Chen et al. Adult limbal neurosphere cells: a potential autologous cell resource for retinal cell generation
WO2022222974A1 (zh) 一种质控和富集人多巴胺能神经前体细胞的方法
Patni et al. Progress in human embryonic stem cell research and aging
TW202409273A (zh) 擬迷走神經副交感神經細胞及其製作方法
EP4355864A1 (en) Methods of generating sacral neural crest lineages and uses thereof
Smits Generation of midbrain organoids as a model to study Parkinson's disease
FARIA PEREIRA EPIGENETIC AND FUNCTIONAL ASSESSMENT OF ENHANCEROPATHIES ACROSS HUMAN MODELS: FOCUS ON GABRIELE-DE VRIES SYNDROME
WO2022020798A1 (en) Methods of differentiating neurons and identification of disease phenotypes thereof

Legal Events

Date Code Title Description
A302 Request for accelerated examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant