TW202409273A

TW202409273A - 擬迷走神經副交感神經細胞及其製作方法

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Publication number: TW202409273A
Application number: TW112128487A
Authority: TW
Inventors: 木田泰之; 髙山祐三; 赤木祐香二宮; 山下梓; 吉門理紗; 宮本靖久
Original assignee: 國立研究開發法人產業技術總合研究所; 日商朝日集團控股股份有限公司
Priority date: 2022-07-29
Filing date: 2023-07-28
Publication date: 2024-03-01

Abstract

本發明提供一種製作擬迷走神經副交感神經細胞之方法，其包括：(a)誘導多能幹細胞向副交感神經細胞之分化之步驟；及(b1)於上述步驟(a)之前向上述多能幹細胞導入編碼消化道激素受體之外源性核酸之步驟、或(b2)向藉由上述步驟(a)所獲得之副交感神經細胞或其前驅細胞導入編碼消化道激素受體之外源性核酸之步驟。又，本發明提供一種腦腸互動模型，其係包含藉由上述方法所製作之擬迷走神經副交感神經細胞與消化道激素分泌細胞而成。

Description

擬迷走神經副交感神經細胞及其製作方法

本發明係關於一種擬迷走神經副交感神經細胞及其製作方法。

已知腦與腸會相互作用，該等之雙方向性之關係被稱為「腦腸互動」或「腦腸軸」。於腸中，若存在於消化道上皮之胃腸內分泌細胞感知到營養素，則分泌消化道激素。若消化道激素作用於迷走傳入神經，則訊號被傳導至中樞神經系統。自中樞神經系統藉由迷走傳出神經路徑調節消化道之蠕動、消化液或消化道激素之分泌。

先前於腦腸互動之研究中，進行使用人類以外之動物之試驗、例如使用切斷了迷走神經束之小鼠之試驗、或藉由解剖所單離之器官之解析等。然而，近年來，就動物福祉、愛護等倫理上之觀點而言，強烈期望不使用動物之代替試驗系統。又，考慮到動物物種差，而謀求接近人類之試驗系統。於腦腸互動之研究中，亦謀求開發活體外試驗系統。然而，至今未報告有消化道迷走神經細胞之培養方法、或由人類多能幹細胞製作消化道迷走神經細胞之方法。

本發明者等人已報告有由人類多能幹細胞高效地誘導自主神經之方法及由人類多能幹細胞選擇性地誘導副交感神經細胞之方法(專利文獻1及2)。然而，藉由上述方法所製作之副交感神經細胞未內在性地表現成為消化道迷走神經之指標之消化道激素受體或表現較低。另一方面，藉由小鼠等之解析，已知於生物體內存在消化道激素受體之表現形式不同之超過10種消化道迷走神經細胞型。先前技術文獻專利文獻

專利文獻1：日本專利第6593811號專利文獻2：日本專利第6942398號

[發明所欲解決之問題]

本發明之目的在於提供一種恆常表現消化道激素受體、且具有消化道激素應答性之可用於腦腸互動之活體外試驗系統之擬迷走神經副交感神經細胞。 [解決問題之技術手段]

本發明者等人進行銳意研究，結果成功製作出表現胰高血糖素樣肽1受體、神經肽Y2型受體、胰高血糖素樣肽2受體、血清素3受體或膽囊收縮素1受體之擬迷走神經副交感神經細胞。

即，根據一實施方式，本發明提供一種製作擬迷走神經副交感神經細胞之方法，其包括：(a)誘導多能幹細胞向副交感神經細胞之分化之步驟；及(b1)於上述步驟(a)之前向上述多能幹細胞導入編碼消化道激素受體之外源性核酸之步驟、或(b2)向藉由上述步驟(a)所獲得之副交感神經細胞或其前驅細胞導入編碼消化道激素受體之外源性核酸之步驟。

又，根據一實施方式，本發明提供一種藉由上述方法所製作之擬迷走神經副交感神經細胞。

又，根據一實施方式，本發明提供一種包含編碼消化道激素受體之外源性核酸而成之多能幹細胞。

又，根據一實施方式，本發明提供一種包含編碼消化道激素受體之外源性核酸而成之擬迷走神經副交感神經細胞。

又，根據一實施方式，本發明提供一種檢測試樣中之消化道激素受體促效劑之方法，其包括：(1)使試樣接觸上述擬迷走神經副交感神經細胞之步驟；及(2)解析上述擬迷走神經副交感神經細胞之神經活動之步驟。

上述消化道激素受體較佳為選自由胰高血糖素樣肽1受體、神經肽Y2型受體、胰高血糖素樣肽2受體、血清素3受體及膽囊收縮素1受體所組成之群。

又，根據一實施方式，本發明提供一種控制腦腸互動之物質之篩選方法，其包括：(1)於候選物質之存在下培養上述擬迷走神經副交感神經細胞之步驟；及(2)解析上述擬迷走神經副交感神經細胞之神經活動之步驟。

又，根據一實施方式，本發明提供一種控制腦腸互動之物質之篩選方法，其包括：(1)於候選物質之存在下培養消化道激素分泌細胞之步驟；(2)自藉由上述步驟(1)所獲得之培養物回收培養上清液之步驟；(3)使上述培養上清液接觸上述擬迷走神經副交感神經細胞之步驟；及(4)解析上述擬迷走神經副交感神經細胞之神經活動之步驟。

又，根據一實施方式，本發明提供一種控制腦腸互動之物質之篩選方法，其包括：(1)於候選物質之存在下共培養消化道激素分泌細胞與上述擬迷走神經副交感神經細胞之步驟；及(2)解析上述擬迷走神經副交感神經細胞之神經活動之步驟。

又，根據一實施方式，本發明提供一種腦腸互動模型，其係包括消化道激素分泌細胞與上述擬迷走神經副交感神經細胞之共培養而成。

上述消化道激素分泌細胞較佳為腸內分泌細胞。

又，根據一實施方式，本發明提供一種上述擬迷走神經副交感神經細胞或上述腦腸互動模型之用途，其係用於控制腦腸互動之物質之篩選。 [發明之效果]

根據本發明之方法，能夠高效率且經濟地製作可用於腦腸互動之活體外試驗系統之擬迷走神經副交感神經細胞。又，本發明之擬迷走神經副交感神經細胞能夠模仿消化道迷走神經求心路之消化道激素應答。因此，本發明之擬迷走神經副交感神經細胞對於例如腦腸互動之活體外試驗系統之開發、針對消化道激素受體之促效劑之檢測或新穎促效劑之探索、消化道激素自消化道內分泌細胞釋出之檢測或誘導消化道激素釋出之物質之探索而言有用。

以下，對本發明進行詳細說明，但本發明並不限定於本說明書中所說明之實施方式。

根據第一實施方式，本發明係一種製作擬迷走神經副交感神經細胞之方法，其包括：(a)誘導多能幹細胞向副交感神經細胞之分化之步驟；及(b1)於上述步驟(a)之前向上述多能幹細胞導入編碼消化道激素受體之外源性核酸之步驟、或(b2)向藉由上述步驟(a)所獲得之副交感神經細胞或其前驅細胞導入編碼消化道激素受體之外源性核酸之步驟。

於本實施方式之方法中，由多能幹細胞誘導副交感神經細胞。「多能幹細胞」例如可例舉：胚胎幹(ES)細胞、人工多能幹(iPS)細胞、胚胎生殖(EG)細胞、多能生殖幹(mGS)細胞、Muse細胞等，但不限定於該等。於本實施方式之方法中，可使用任一多能幹細胞，較佳為使用ES細胞或iPS細胞，更佳為使用iPS細胞。

本實施方式中之多能幹細胞可為來自任意之脊椎動物者，較佳為來自小鼠、大鼠、兔、綿羊、山羊、豬、牛、猴、人類等哺乳動物，尤佳為來自人類。

多能幹細胞之製備方法被充分地確立(例如關於iPS細胞，為Cell, 2007; 131(5): 861-872, doi: 10.1016/j.cell.2007.11.019)，可依照該領域中公知之方法，由任意之組織或細胞製備多能幹細胞。或例如亦可自京都大學iPS細胞研究財團(CiRA_F)、理化學研究所生物資源研究中心(RIKEN BRC)、American Type Culture Collection(ATCC)等之細胞庫獲取已建立之iPS細胞株或ES細胞株。

將多能幹細胞向副交感神經細胞誘導之方法已被確立(例如國際公開第2020/040286、國際公開第2016/194522)，可依照該領域中公知之方法製備副交感神經細胞。具體而言，例如以DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium，達爾伯克改良伊格爾培養基)/HAM's F-12培養基、人類幹細胞(hES)培養基、N2培養基或該等之混合物等作為基礎培養基，於適當添加有如Dorsomorphin之BMP(bone morphogenetic protein，骨形成蛋白)訊號路徑抑制劑、如SB431542之TGF(transforming growth factor，轉形生長因子)訊號路徑抑制劑、如CHIR99021之Wnt訊號路徑活化劑、如纖維母細胞生長因子(bFGF)之FGF訊號路徑活化劑、如上皮生長因子(EGF)之EGF訊號路徑活化劑等之條件下培養多能幹細胞，藉此製備神經塉細胞，繼而，於適當添加有佛司可林等cAMP(cyclic adenosine monophosphate，環腺苷單磷酸)產生促進劑、如腦源性神經滋養因子(BDNF)之BDNF訊號路徑活化劑、如神經膠細胞株源性神經滋養因子(GDNF)之GDNF訊號路徑活化劑、如NGF-β之NGF訊號路徑活化劑、如神經營養物質3之NT-3訊號路徑活化劑、如抗壞血酸之維生素C、如佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)之蛋白激酶C活化劑、如視黃酸之視黃酸受體促效劑等之條件下培養神經塉細胞，藉此可製備副交感神經細胞。此時，多能幹細胞及神經塉細胞較佳為於上述分化誘導前經事先調整，多能幹細胞較佳為於包含如Y-27632之Rho激酶(ROCK)抑制劑之培養基中培養2～3天，神經塉細胞較佳為於包含如BMP4之BMP訊號路徑活化劑、如SANT-1之SHH(sonic hedgehog，音蝟因子)訊號路徑抑制劑、如IWR-1之Wnt訊號路徑抑制劑等之培養基中培養2～3天(國際公開第2020/040286、國際公開第2016/194522)。

於本實施方式之方法中，將編碼消化道激素受體之外源性核酸導入細胞。本實施方式中之「消化道激素受體」可為於迷走神經細胞中表現之任意之消化道激素受體。因此，於本實施方式之方法中，例如可使用編碼選自胰高血糖素樣肽1受體(GLP1R)、神經肽Y2型受體(NPY2R)、胰高血糖素樣肽2受體(GLP2R)、血清素3受體(5-HT3R)及膽囊收縮素1受體(CCKAR)等中之消化道激素受體之外源性核酸，但不限定於該等。於本實施方式之方法中，可將選自上述中之單獨或兩種以上之編碼消化道激素受體之外源性核酸適當組合使用。

編碼消化道激素受體之外源性核酸可於任意之時點導入細胞中。例如，編碼消化道激素受體之外源性核酸可導入分化誘導前之多能幹細胞中，亦可導入藉由分化誘導所獲得之副交感神經細胞，亦可導入正分化為副交感神經細胞之前驅細胞中。較佳為編碼GLP1R、NPY2R及CCKAR之外源性核酸可導入分化誘導前之多能幹細胞中；編碼GLP2R及5-HT3R之外源性核酸可導入藉由分化誘導所獲得之副交感神經細胞。

本實施方式中之編碼消化道激素受體之外源性核酸可為來自任意之脊椎動物者，較佳為來自小鼠、大鼠、兔、綿羊、山羊、豬、牛、猴、人類等哺乳動物，尤佳為來自人類。

編碼消化道激素受體之基因已經選殖，該等核酸序列資訊可自特定之資料庫獲取。例如若為人類胰高血糖素樣肽1受體(hGLP1R)基因，則可利用NM_002062.5，若為人類神經肽Y2型受體(hNPY2R)基因，則可利用NM_000910.4，若為人類胰高血糖素樣肽2受體(hGLP2R)基因，則可利用NM_004246.3，若為人類血清素3受體(hHTR3A)基因，則可利用NM_213621.4，若為人類膽囊收縮素1受體(hCCKAR)基因，則可利用NM_000730.3(均為NCBI RefSeq ID)。

本實施方式中之消化道激素受體可亦包括具有同等之活性之該等之變異體或同系物等。換言之，以維持其受體活性為限度，本實施方式中之消化道激素受體可包含含有與登錄於資料庫中之胺基酸序列具有例如80%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進而較佳為97%以上、進而更佳為98%以上、最佳為99%以上之同一性之胺基酸序列之蛋白質。胺基酸序列之同一性可使用序列解析軟體或使用該領域中慣用之程式(FASTA、BLAST等)算出。又，以維持其受體活性為限度，本實施方式中之消化道激素受體可包含含有登錄於資料庫中之胺基酸序列中置換、缺失、插入及/或附加有1～數個胺基酸之胺基酸序列之蛋白質。此處，「1～數個」例如可為1～30個，較佳為1～10個，尤佳為1～5個。

編碼消化道激素受體之外源性核酸可藉由該領域中周知之方法導入細胞中，例如將該等核酸選殖於表現載體並導入細胞中即可。例如並不限定於以下，但表現載體可使用反轉錄病毒、慢病毒、腺病毒、仙台病毒等病毒載體或pCMV(porcine cytomegalovirus，豬巨細胞病毒)等質體載體等。

於本實施方式之方法中，表現載體可根據其種類而藉由該領域中周知之方法導入細胞中。若為非病毒載體，例如可藉由脂轉染、電穿孔、顯微注射等導入。若為病毒載體，則可藉由以合適之效價或感染複數(MOI)感染細胞而導入。

根據本實施方式之方法，能夠製作擬迷走神經副交感神經細胞。

換言之，根據第二實施方式，本發明係一種藉由上述方法所製作之擬迷走神經副交感神經細胞。

此處，所謂「擬迷走神經副交感神經細胞」係指能夠模仿迷走神經細胞之消化道激素應答之副交感神經細胞。本實施方式中之擬迷走神經副交感神經細胞可藉由周知之副交感神經細胞標記物、自主神經細胞標記物、周邊神經細胞標記物、成熟神經細胞標記物及消化道激素受體之任意組合而定義，例如可基於ChAT(膽鹼乙醯轉移酶)、PHOX2B(配對樣(paired-like)同源匣2B)、PRPH(外周蛋白)、MAP2(微管相關蛋白質2)、VAChT(別名SLC18A3、囊泡乙醯膽鹼轉運體)、CHT(別名SLC5A7、高親和性膽鹼轉運體)、STMN2(抑微管裝配蛋白(stathmin)2)、PHOX2A(配對樣同源匣2A)、ASCL1(別名MASH1、Achaete-scute homolog1)或如以上所定義之消化道激素受體之表現而定義。進而，本實施方式中之擬迷走神經副交感神經細胞較佳為除了上述標記物以外表現菸鹼性乙醯膽鹼受體。標記物及消化道激素受體之表現可藉由RT-PCR(real time polymerase chain reaction，即時聚合酶鏈鎖反應)、西方墨點、流式細胞分析等公知之方法進行解析。

本實施方式中之擬迷走神經副交感神經細胞可基於消化道激素應答性而定義，例如可藉由利用鈣成像或膜電位測定確認針對消化道激素之反應性而定義。

根據第三實施方式，本發明係一種包含編碼消化道激素受體之外源性核酸而成之多能幹細胞。

根據第四實施方式，本發明係一種包含編碼消化道激素受體之外源性核酸而成之擬迷走神經副交感神經細胞。

第三及第四實施方式中之「編碼消化道激素受體之外源性核酸」、「多能幹細胞」及「擬迷走神經副交感神經細胞」與第一及第二實施方式中所定義者相同。第四實施方式之擬迷走神經副交感神經細胞可藉由第一實施方式之方法所製造，第三實施方式之多能幹細胞可為其中間產物。

第二及第四實施方式之擬迷走神經副交感神經細胞對於製作腦腸互動之活體外評價模型而言有用。又，第三實施方式之多能幹細胞對於穩定地製作擬迷走神經副交感神經細胞而言有用。

根據第五實施方式，本發明係一種檢測試樣中之消化道激素受體促效劑之方法，其包括：(1)使試樣接觸上述擬迷走神經副交感神經細胞之步驟；及(2)解析上述擬迷走神經副交感神經細胞之神經活動之步驟。

本實施方式中之「試樣」可為可包含消化道激素受體促效劑之任意者。本實施方式中之「消化道激素受體促效劑」可為作用於第一實施方式中所定義之消化道激素受體並進行活化之任意之物質，不僅可為已知之內源性消化道激素，而且可為新穎或已知之低分子化合物、核酸、蛋白質、肽、抗體、脂質等。又，本實施方式中之消化道激素受體促效劑可不僅包含完全促效劑，而且亦包含局部促效劑。因此，本實施方式之方法中之試樣例如可為由來自動物之體液、來自細胞或組織之萃取物、細胞或組織之培養上清液、植物萃取物等所製備者。本實施方式之方法中之試樣較佳為由來自人類之血液、血漿、血清等體液或來自人類消化道之細胞或腸道上皮組織之培養上清液所製備者。

為了使擬迷走神經副交感神經細胞與試樣接觸，於擬迷走神經副交感神經細胞之培養中添加試樣並保溫一定時間即可。保溫時間例如可為0.01秒～2小時。

繼而，對擬迷走神經副交感神經細胞之神經活動進行解析。神經活動藉由該領域中周知之方法進行解析即可，例如可藉由鈣成像或膜電位測定進行解析。鈣成像例如對擬迷走神經副交感神經細胞負載螢光鈣指示劑，基於螢光強度之變化測定細胞鈣濃度變化即可。膜電位例如可藉由利用測量局部場電位進行之細胞外電位之測定、利用膜片鉗法進行之細胞內電位之測定、使用膜電位敏感性色素之膜電位變化之測定等進行解析。為了判定神經活動是否因試樣之添加而發生變化，可同時進行未添加試樣之培養加以解析並比較，亦可與過去所實施之未添加試樣之培養相關之解析結果進行比較。於本實施方式之方法中，於添加有試樣之培養基中之擬迷走神經副交感神經細胞之神經活動與未添加試樣之培養基中之擬迷走神經副交感神經細胞相比有意義地增強之情形時，可評價為於試樣中存在消化道激素受體促效劑。

根據第六實施方式，本發明係一種控制腦腸互動之物質之篩選方法，其包括：(1)於候選物質之存在下培養上述擬迷走神經副交感神經細胞之步驟；及(2)解析上述擬迷走神經副交感神經細胞之神經活動之步驟。

候選物質可為離子、奈米粒子、低分子化合物、核酸、蛋白質、肽、抗體、脂質、動物或植物之細胞、組織或其萃取物、菌體或其破碎物或萃取物等，該等候選物質可為新穎者，亦可為公知者。

將擬迷走神經副交感神經細胞於添加有候選物質之培養基中培養一定時間。所添加之候選物質之濃度依候選物質之種類而異，例如若為低分子化合物，則可於0.001 nM～10 mM之範圍內適當選擇。培養時間例如可為0.01秒～2小時。

繼而，對擬迷走神經副交感神經細胞之神經活動進行解析。神經活動與第五實施方式同樣，例如可藉由鈣成像或膜電位測定進行解析。鈣成像例如對擬迷走神經副交感神經細胞負載螢光鈣指示劑，基於螢光強度之變化測定細胞鈣濃度變化即可。膜電位例如可藉由利用測量局部場電位進行之細胞外電位之測定、利用膜片鉗法進行之細胞內電位之測定、使用膜電位敏感性色素之膜電位變化之測定等進行解析。為了判定神經活動是否因候選物質之添加而發生變化，可同時進行未添加候選物質之培養加以解析並比較，亦可與過去所實施之未添加候選物質之培養相關之解析結果進行比較。於本實施方式之方法中，於添加有候選物質之培養基中之擬迷走神經副交感神經細胞之神經活動與未添加候選物質之培養基中之擬迷走神經副交感神經細胞相比有意義地增強之情形時，可評價為該候選物質為消化道激素受體促效劑，即有望用作控制腦腸互動之物質。

此處，「腦腸互動」係指中樞神經系統與消化道之雙方向性之通訊。已知腦腸互動與多種多樣之症狀或障礙相關。作為與腦腸互動異常之關聯較深之症狀或障礙，例如可例舉：飲食行為異常；噁心、腹痛、下痢、便秘等消化道障礙；焦慮行為、抑鬱等精神壓力症狀；阿茲海默症、帕金森氏症、多發性硬化症等神經退化性疾病；炎症、過敏等免疫應答異常；肥胖、脂質異常症、糖尿病等代謝性疾病等，但不限定於該等。控制腦腸互動之物質可使腦腸互動正常化，其結果，可判斷能夠預防或處置如上述之症狀或障礙，可有效地用於能夠預防或處置如上述之症狀或障礙之醫藥品、補充品、特定保健用食品、功能性標示食品之開發。

根據第七實施方式，本發明係一種控制腦腸互動之物質之篩選方法，其包括：(1)於候選物質之存在下培養消化道激素分泌細胞之步驟；(2)自藉由上述步驟(1)所獲得之培養物回收培養上清液之步驟；(3)使上述培養上清液接觸上述擬迷走神經副交感神經細胞之步驟；及(4)解析上述擬迷走神經副交感神經細胞之神經活動之步驟。本實施方式中之「擬迷走神經副交感神經細胞」與第一及第二實施方式中所定義者相同，「候選物質」及「腦腸互動」與第六實施方式中所定義者相同。

本實施方式中之「消化道激素分泌細胞」只要為能夠分泌消化道激素之細胞，則可為來自任意組織之任意之細胞。消化道激素分泌細胞分散存在於胃至直腸之消化道上皮及胰臟之蘭氏小島等，基於其組織分佈及所分泌之激素，分類為L細胞、K細胞、I細胞、S細胞、腸嗜鉻(EC)細胞、G細胞、D細胞、N細胞、M細胞等。於本實施方式之方法中，可將選自上述中之單獨或兩種以上消化道激素分泌細胞適當組合而使用。本實施方式中之消化道激素分泌細胞較佳為腸內分泌細胞，例如可為L細胞、K細胞、I細胞、S細胞、EC細胞、N細胞、M細胞等，但不限定於該等。

本實施方式中之消化道激素分泌細胞可為來自任意之脊椎動物者，較佳為來自小鼠、大鼠、兔、綿羊、山羊、豬、牛、猴、人類等哺乳動物，尤佳為來自人類。

又，本實施方式之方法中之消化道激素分泌細胞可為來自與擬迷走神經副交感神經細胞相同之動物者，亦可為來自不同之動物者。因此，於本實施方式之方法中，例如可將人類消化道激素分泌細胞與人類擬迷走神經副交感神經細胞組合使用，亦可將小鼠消化道激素分泌細胞與人類擬迷走神經副交感神經細胞組合使用。較佳為於本實施方式之方法中，可使用來自同種哺乳動物之消化道激素分泌細胞及擬迷走神經副交感神經細胞，尤佳為可使用人類消化道激素分泌細胞及人類擬迷走神經副交感神經細胞。

消化道激素分泌細胞可藉由已確立之公知之方法而製備(例如Sinagoga K.L.et al., Development, 2018, 145(19): dev165795)。具體而言，例如於由人類多能幹細胞誘導腸道類器官及大腸類器官之過程中，藉由使轉錄因子NEUROG3強制表現，能夠製備分泌GIP(glucose-dependent insulinotropic polypeptide，葡萄糖依賴性促胰島素多肽)、饑餓素、GLP-1、胃泌酸調節素(oxyntomodulin)等消化道激素之腸內分泌細胞。或可自ATCC等細胞庫獲取已建立之消化道激素分泌細胞株。消化道激素分泌細胞株例如可例舉人類L細胞株NCI-H716、小鼠L細胞株STC-1、小鼠L細胞株GLUTag、自小鼠或人類消化道採集之腸內分泌細胞等。

消化道激素分泌細胞可以DMEM、HAM's F-12培養基、RPMI1640培養基或該等之混合物等作為基礎培養基，使用添加有胎牛血清(FBS)、非必需胺基酸溶液、青黴素-鏈黴素等之培養基穩定地進行繼代培養。

將消化道激素分泌細胞於添加有候選物質之培養基中培養一定時間。所添加之候選物質之濃度依候選物質之種類而異，例如若為低分子化合物，則可於0.001 nM～10 mM之範圍內適當選擇。添加時間例如可為1秒～72小時。

繼而，自上述培養物回收培養上清液。任意選擇性地藉由透析或超過濾等將所回收之培養上清液純化或濃縮。

繼而，使上述培養上清液接觸擬迷走神經副交感神經細胞。為了使培養上清液接觸擬迷走神經副交感神經細胞，於擬迷走神經副交感神經細胞之培養基中添加培養上清液並保溫一定時間即可。培養上清液可相對於擬迷走神經副交感神經細胞之培養基以1～10倍之液量添加。保溫時間例如可為0.01秒～2小時。

繼而，對擬迷走神經副交感神經細胞之神經活動進行解析。神經活動與第五及第六實施方式同樣，例如可藉由鈣成像或膜電位測定進行解析。鈣成像例如對擬迷走神經副交感神經細胞負載螢光鈣指示劑，基於螢光強度之變化測定細胞鈣濃度變化即可。膜電位例如可藉由利用測量局部場電位進行之細胞外電位之測定、利用膜片鉗法進行之細胞內電位之測定、使用膜電位敏感性色素之膜電位變化之測定等進行解析。於本實施方式之方法中，可以未添加候選物質所製備之消化道激素分泌細胞之培養上清液作為對照而實施。於與添加候選物質所製備之消化道激素分泌細胞之培養上清液接觸之擬迷走神經副交感神經細胞之神經活動和與對照之培養上清液接觸之擬迷走神經副交感神經細胞之神經活動相比有意義地增強之情形時，可評價為該候選物質能夠促進消化道激素自消化道激素分泌細胞之分泌，即有望用作控制腦腸互動之物質。

根據第八實施方式，本發明係一種控制腦腸互動之物質之篩選方法，其包括：(1)於候選物質之存在下共培養消化道激素分泌細胞與上述擬迷走神經副交感神經細胞之步驟；及(2)解析上述擬迷走神經副交感神經細胞之神經活動之步驟。本實施方式中之「候選物質」及「腦腸互動」與第六及第七實施方式中所定義者相同。「消化道激素分泌細胞」與第七實施方式中所定義者相同。

於本實施方式之方法中，將消化道激素分泌細胞與擬迷走神經副交感神經細胞進行共培養。本實施方式中之「共培養」只要兩細胞共有相同之培養基，則可為任意形式之培養。因此，本實施方式中之共培養可為直接(接觸)共培養或間接(非接觸)共培養之任一者。具體而言，例如可將消化道激素分泌細胞與擬迷走神經副交感神經細胞直接混合進行共培養，亦可藉由過濾器等將消化道激素分泌細胞與擬迷走神經副交感神經細胞分離進行共培養。

於本實施方式之方法中，較佳為將消化道激素分泌細胞與擬迷走神經副交感神經細胞直接進行共培養。具體而言，於擬迷走神經副交感神經細胞之培養上接種消化道激素分泌細胞即可。消化道激素分泌細胞與擬迷走神經副交感神經細胞之比率例如可為1：3～3：1，較佳為1：1～2：1。消化道激素分泌細胞及擬迷走神經副交感神經細胞之接種濃度可分別為1×10 ⁵～1×10 ⁶個細胞/cm ²、1×10 ⁵～5×10 ⁵個細胞/cm ²之範圍。

此處所使用之培養基可為將用以培養消化道激素分泌細胞之培養基與用以培養擬迷走神經副交感神經細胞之培養基混合而成者。例如可為於DMEM、HAM's F-12培養基及RPMI1640培養基之混合培養基中適當添加胎牛血清(FBS)、非必需胺基酸溶液、N2補充品、B-27補充品等而成者。

將消化道激素分泌細胞及擬迷走神經副交感神經細胞於添加有候選物質之培養基中培養一定時間。所添加之候選物質之濃度依候選物質之種類而異，例如若為低分子化合物，則可於0.001 nM～10 mM之範圍內適當選擇。培養時間例如可為0.01秒～2小時。

繼而，對擬迷走神經副交感神經細胞之神經活動進行解析。神經活動與第五～第七實施方式同樣，例如可藉由鈣成像或膜電位測定進行解析。於本實施方式之方法中，可以未添加候選物質之培養基中之共培養及/或添加有候選物質之培養基中之擬迷走神經副交感神經細胞之單獨培養作為對照而實施。於添加有候選物質之共培養中之擬迷走神經副交感神經細胞之神經活動與對照中之擬迷走神經副交感神經細胞之神經活動相比有意義地增強之情形時，可評價為該候選物質能夠促進消化道激素自消化道激素分泌細胞之分泌，即有望用作控制腦腸互動之物質。

根據第九實施方式，本發明係一種腦腸互動模型，其係包括消化道激素分泌細胞與上述擬迷走神經副交感神經細胞之共培養而成。本實施方式中之「擬迷走神經副交感神經細胞」與第一及第二實施方式中所定義者相同，「消化道激素分泌細胞」及「腦腸互動」與第七實施方式中所定義者相同，「共培養」與第八實施方式中所定義者相同。

本實施方式之腦腸互動模型可與以上所記載之培養基或用於共培養之容器等組合，以用於控制腦腸互動之物質之篩選之套組的形式提供。套組可進一步包括適當追加之構成，例如可進一步包括緩衝液、鈣指示劑、化合物庫、記載有篩選之操作說明之說明書等。

本實施方式之腦腸互動模型可藉由根據第八實施方式中所記載之步序將消化道激素分泌細胞與擬迷走神經副交感神經細胞進行共培養而製作，可用於能夠促進消化道激素自消化道激素分泌細胞之分泌之物質、即控制腦腸互動之物質之篩選。

又，根據第十實施方式，本發明係一種用於控制腦腸互動之物質之篩選的上述擬迷走神經副交感神經細胞或上述腦腸互動模型之用途。本實施方式中之「擬迷走神經副交感神經細胞」與第一及第二實施方式中所定義者相同，「腦腸互動」與第七實施方式中所定義者相同，「腦腸互動模型」與第九實施方式中所定義者相同。依照第七、第八及第九實施方式中所記載之內容，可將上述擬迷走神經副交感神經細胞或上述腦腸互動模型用於控制腦腸互動之物質之篩選。實施例

以下例舉實施例對本發明進一步進行說明。再者，該等不對本發明進行任何限定。

＜1.表現消化道激素受體之慢病毒載體之製作＞委託VectorBuilder公司合成包含編碼消化道激素受體之序列之以下質體： pLV-hGLP1R(包含人類GLP1R基因(NCBI RefSeq ID：NM_002062.5)之質體，載體ID：VB900123-1388xwv)； pLV-hNPY2R(包含人類NPY2R基因(NCBI RefSeq ID：NM_000910.4)之質體，載體ID：VB900123-1387bah)； pLV-hGLP2R(包含人類GLP2R基因(NCBI RefSeq ID：NM_004246.3)之質體，載體ID：VB210830-1115xup)； pLV-hHTR3A(包含人類HTR3A基因(NCBI RefSeq ID：NM_213621.4之質體，載體ID：VB210823-1277qqk)；及 pLV-hCCKAR(包含人類CCKAR基因(NCBI RefSeq ID：NM_000730.3之質體，載體ID：VB900123-1385gxm)。

又，為了製備模擬感染用之慢病毒載體，準備包含編碼mCherry螢光蛋白而非消化道激素受體之序列之以下質體： pLV-mCherry(載體ID：VB900084-0158zxv)。

於經0.1 w/v%明膠塗佈之6孔板接種HEK293T細胞(1.5×10 ⁶/孔)。培養基使用含有10%FBS、1%非必需胺基酸(NEAA)、1%青黴素-鏈黴素之DMEM。使用500 μl之Opti-MEM(Thermo Fisher Scientific)及聚伸乙基亞胺(Polysciences inc.)，將上述質體(各4 μg)、封裝質體psPAX2(addgene，#12260)(2 μg)及包膜質體(pMD2.G)(addgene，#12259)(2 μg)轉染至HEK293T細胞(2孔)。於24小時後將培養基全量更換，進而於24小時後回收培養上清液並於4℃保管。於細胞中添加新的培養基，於24小時後回收培養上清液。與前一天所回收之培養上清液混合，利用PVDF(polyvinylidene difluoride，聚偏二氟乙烯)針筒過濾器(0.45 μm)過濾後，混合1/3量之Lenti-X Concentrator(Clontech)，於4℃保溫1小時。其後，於1500×g、4℃進行45分鐘離心分離，並回收顆粒物。將顆粒物懸浮於其後所使用之培養基(800 μL)中，而獲得病毒懸浮液。將病毒懸浮液以每孔200 μL進行分注，於-80℃保管。

＜2.強制表現消化道激素受體之副交感神經細胞及iPS細胞之製作＞ (2-1)試劑本實施例中所使用之試劑之資訊(試劑名、製品編號、製造商、簡稱等)如以下所述。・mTeSR1-cGMP(STEMCELL Technologies：ST-85850G)(以下表述為「mTeSR1」) ・DMEM/Ham's F-12(FUJIFILM Wako Pure Chemical：048-29785) ・DMEM(高葡萄糖)(FUJIFILM Wako Pure Chemical：043-30085) ・RPMI-1640(含有L-麩醯胺、酚紅)(FUJIFILM Wako Pure Chemical：189-02025)(以下表述為「RPMI-1640」) ・Opti-MEM(Thermo Fisher Scientific：31985062) ・STEM-CELLBANKER(STEM-CELLBANKER(商標)GMP等級)(ZNQ：CB045) ・胎牛血清(Biowest，Nuaille，France)(以下表述為「FBS」) ・剔除血清替代物(Thermo Fisher Scientific：10828-028)(以下表述為「KSR」) ・含有運鐵蛋白(Apo)補充品之N2補充品(FUJIFILM Wako Pure Chemical：141-09041)(以下表述為「N2」) ・MEM非必需胺基酸溶液(FUJIFILM Wako Pure Chemical：139-15651)(以下表述為「NEAA」) ・單硫代甘油溶液(FUJIFILM Wako Pure Chemical：195-15791) ・青黴素-鏈黴素溶液(FUJIFILM Wako Pure Chemical：168-23191)(以下表述為「P/S」) ・乙醇(99.5)(FUJIFILM Wako Pure Chemical：057-00456) ・腦源性滋養因子，人類，重組體(FUJIFILM Wako Pure Chemical：020-12913)(以下表述為「BDNF」) ・神經膠細胞株源性神經滋養因子，人類，重組體(FUJIFILM Wako Pure Chemical：075-04153)(以下表述為「GDNF」) ・神經生長因子-β，人類，重組體(FUJIFILM Wako Pure Chemical：141-07601)(以下表述為「NGF」) ・神經營養物質-3，人類，重組體(FUJIFILM Wako Pure Chemical：141-06643)(以下表述為「NT-3」) ・睫狀神經滋養因子，人類，重組體(FUJIFILM Wako Pure Chemical：032-18851)(以下表述為「CNTF」) ・L-抗壞血酸酯鎂鹽n水合物(FUJIFILM Wako Pure Chemical：013-12061)(以下表述為「抗壞血酸」) ・Y-27632(FUJIFILM Wako Pure Chemical：036-24023) ・佛司可林(FUJIFILM Wako Pure Chemical：067-02191)(以下表述為「FSK」) ・Dorsomorphin(Sigma-Aldrich：P5499-5MG)(以下表述為「DM」) ・SB431542水合物(Sigma-Aldrich：S4317-5MG)(以下表述為「SB」) ・CHIR99021(Cayman Chemical Company：13122)(以下表述為「CHIR」) ・IWR-1(Sigma-Aldrich：I0161-5MG) ・SANT1(Sigma-Aldrich：S4572-5MG) ・骨形成因子4(截斷(truncated))，人類，重組體(FUJIFILM Wako Pure Chemical：022-17071)(以下表述為「BMP4」) ・纖維母細胞生長因子(鹼性)(鹼性FGF)，人類，重組體(FUJIFILM Wako Pure Chemical：064-04541)(以下表述為「bFGF」) ・佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(FUJIFILM Wako Pure Chemical：162-23591)(以下表述為「PMA」) ・視黃酸(Sigma-Aldrich：R2625-50MG)(以下表述為「RA」) ・iMatrix-511(Nippi：892012) ・聚-L-鳥胺酸氫溴酸鹽(Sigma-Aldrich：P3655-10MG)(以下表述為「PLO」) ・來自Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤基底膜之層黏連蛋白(Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane)(Sigma-Aldrich：L2020-1MG)(以下表述為「層黏連蛋白」) ・Lipidure(日油股份有限公司：CM5206) ・基質膠(標準配方)(Corning：256234) ・Accutase(Thermo Fisher Scientific：A11105-01) ・TrypLE express(Thermo Fisher Scientific：12604-013) ・超純蒸餾水(Ultrapure distilled water)(Thermo Fisher Scientific：10977-015)(以下表述為「DW」) ・D-PBS(-)(FUJIFILM Wako Pure Chemical：045-29795) ・三羥甲基胺基甲烷緩衝液粉末(Tris Buffer Powder)，pH值為7.4(Takara Bio：T9153) ・HBSS(+)(不含酚紅)(FUJIFILM Wako Pure Chemical：084-08965)(以下表述為「HBSS」) ・鹽酸(FUJIFILM Wako Pure Chemical：080-01066) ・牛血清白蛋白(FUJIFILM Wako Pure Chemical：017-23294)(以下表述為「BSA」) ・二甲基亞碸(FUJIFILM Wako Pure Chemical：046-21981)(以下表述為「DMSO」) ・苯基甲基磺醯氟(Sigma-Aldrich：P7626-250MG)(以下表述為「PMSF」) ・MemGlow ^TM螢光電漿膜探針(Fluorogenic Plasma Membrane Probes)590(Cytoskeleton, Inc.：MG03-02)(以下表述為「MemGlow」)

(2-2)儲存溶液・FSK：使用DMSO製備為10 mM ・DM：使用DMSO製備為1 mM ・SB：使用DMSO製備為10 mM ・CHIR：使用DMSO製備為3 mM ・IWR-1：使用DMSO製備為10 mM ・SANT1：使用DMSO製備為250 μM ・PMA：使用DMSO製備為10 μg/mL ・RA：使用DMSO製備為1 mM ・BMP4：使用添加有0.1%BSA之4 mM鹽酸溶液製備為100 μg/mL ・bFGF：利用1 mM之三羥甲基胺基甲烷緩衝液(pH值為7.4)製備為500 μg/mL後，使用DMEM製備為10 μg/mL ・BDNF、GDNF、NGF、及NT-3：使用PBS製備為10 μg/mL ・抗壞血酸：使用PBS製備為50 mg/mL ・Y-27632：使用Opti-MEM製備為10 mM ・PLO：使用DW製備為1 mg/mL ・Lipidure：使用乙醇(99.5)製備為0.5%

(2-3)培養基・人類幹細胞培養基(hESM)：添加有20%之KSR、1%之NEAA、1%之單硫代甘油溶液、及1%P/S之DMEM/Ham's F-12 ・N2培養基：添加有1%之N2、1%之NEAA、及1%之P/S之DMEM/Ham's F-12 ・NDM1：添加有10 μM之FSK、10 ng/mL之GDNF、10 ng/mL之NT-3、10 ng/mL之NGF、及50 μg/mL之抗壞血酸之N2培養基・NDM2：添加有100 ng/mL之BDNF、及100 ng/mL之CNTF之NDM1 ・NDM3：添加有10 ng/mL之BDNF、1 μM之RA、及10 ng/mL之PMA之NDM1

(2-4)iPS細胞向副交感神經細胞之分化誘導・類胚體之形成(第-3天)：人類iPS細胞(201B7株)係自RIKEN BRC獲取。藉由Lipidure塗佈6孔板，以PBS將其洗淨。使用添加有10 μM之Y-27632之mTeSR1以1×10 ⁶個細胞/孔之濃度接種人類iPS細胞(201B7株)，於回轉式振盪器(Wakenbtech：WB-101SRC)上進行培養(95 rpm)。於接種後24小時及48小時將添加有10 μM之Y-27632之mTeSR1以2 mL/孔進行添加。培養3天直至形成類胚體(EB)。・分化步驟1(第0天)：將培養基更換為添加有2 μM之DM、10 μM之SB、及10 ng/ml之bFGF之hESM(4 mL/孔)，於回轉式振盪器上培養2天。・分化步驟2(第2天)：將培養基更換為添加有3 μM之CHIR、20 μM之SB、及10 ng/ml之bFGF之hESM(6 mL/孔)，於回轉式振盪器上培養3天。・分化步驟3(第5天)：將培養基更換為添加有3 μM之CHIR、及10 ng/ml之bFGF之hESM：N2(3：1)混合培養基(4 mL/孔)，於回轉式振盪器上培養2天。・分化步驟4(第7天)：將培養基更換為添加有10 μM之IWR-1、250 nM之SANT-1、25 ng/ml之BMP4、及10 ng/ml之bFGF之hESM：N2(1：1)混合培養基(3 mL/孔)，於回轉式振盪器上培養2天。・分化步驟5(第9天)：將培養基更換為添加有10 μM之IWR-1、250 nM之SANT-1、25 ng/ml之BMP4、及10 ng/ml之bFGF之hESM：N2(1：3)混合培養基(3 mL/孔)，於回轉式振盪器上培養3天，更換為新鮮之相同培養基，進一步培養24小時。・分化步驟6(第13天)：藉由以DW製備之PLO溶液(20 μg/ml)塗佈1小時後，利用DW洗淨1次，藉由以PBS製備之層黏連蛋白溶液(5 μg/ml)塗佈2小時，藉此準備經PLO及層黏連蛋白塗佈之24孔板。將藉由分化步驟5所獲得之EB回收，添加2 mL之TrypLE express，於37℃保溫10分鐘。添加含有10%FBS之DMEM(4 mL)而使酶促反應停止，藉由移液使細胞懸浮。進行200×g、4分鐘之離心分離，將細胞回收，藉由NDM1使細胞懸浮，並對細胞數進行計數。使用NDM2調整細胞懸浮液(1×10 ⁵個細胞/mL)，以1 mL/孔逐孔添加至經PLO及層黏連蛋白塗佈之24孔板。之後，以每週兩次之方式藉由新鮮之NDM2更換一半培養基並繼續培養。

(2-5)使消化道激素受體於分化後強制表現之副交感神經細胞之製作藉由上述(2-4)之步序，將人類iPS細胞(201B7株)向副交感神經細胞誘導。於誘導第20天之培養中，以稀釋為1/10之方式添加上述1中所製備之病毒懸浮液。於24小時後藉由NDM2更換全部培養基。之後，以每週兩次之方式藉由新鮮之NDM2更換一半培養基並繼續培養，對誘導第30天之後之細胞進行解析。

(2-6)使消化道激素受體強制表現之iPS細胞之製作使用添加有10 μM之Y-27632之mTeSR1將人類iPS細胞(201B7株)以6×10 ⁴個細胞/孔之濃度接種於經iMatrix塗佈之6孔板(第0天)。第二天將培養基更換為新鮮之mTeSR1(2 mL/孔)，添加上述1中所製備之200 μL/孔之病毒懸浮液(第1天)。其後，每天將培養基更換為新鮮之mTeSR1，自病毒之添加起4天後更換為添加有0.3 μg/mL之嘌呤黴素之mTeSR1(第5天)。於添加有0.3 μg/mL之嘌呤黴素之mTeSR1中將細胞自病毒之添加起培養10天以上，藉此進行嘌呤黴素選擇。將所獲得之細胞(以下記載為「消化道激素受體表現iPS細胞」)冷凍保存。

(2-7)利用使消化道激素受體強制表現之iPS細胞之副交感神經細胞之製作藉由上述(2-4)之步序將上述(2-6)中所製作之消化道激素受體表現iPS細胞向副交感神經細胞誘導。

＜3.使消化道激素受體強制表現之iPS細胞之品質評價＞ (3-1)消化道激素受體基因之表現 (i)qPCR解析藉由qPCR(quantitative Polymerase Chain Reaction，定量聚合酶鏈反應)確認消化道激素受體基因及幹細胞標記物NANOG基因之表現。使用NucleoSpin RNA(Takara Bio，U0955B)，自上述(2-6)中所製作之消化道激素受體表現iPS細胞中萃取全部RNA。使用含有gDNA Remover之ReverTra Ace(商標)qPCR RT Master Mix(東洋紡，FSQ-301)製備cDNA。使用THUNDERBIRD(商標)SYBR(商標)qPCR Mix(東洋紡，QPS-201)進行qPCR。作為內部對照組，使用管家基因36B4。反應及解析進行3遍。

表1.qPCR所使用之引子組(1) [表1]

引子	序列(5'→3')	SEQ NO.
36B4-F	AGATGCAGCAGATCCGCA	1
36B4-R	GTTCTTGCCCATCAGCACC	2
hNANOG-F	CCAACATCCTGAACCTCAGC	3
hNANOG-R	GCTATTCTTCGGCCAGTTG	4
hGLP1R-F	CTACGCACTCTCCTTCTCTGCT	5
hGLP1R-R	CGGACAATGCTCGCAGGATGAA	6
hNPY2R-F	CATCTTGCTTGGGGTAATTGGC	7
hNPY2R-R	AGAGTGAACGGTAGACACAGAG	8
hGLP2R-F	GGAAGTGGGCTCAGTACAAAC	23
hGLP2R-R	GTCCCGTTACAAAATATGCCAGA	24
hHTR3A-F	CATCTTCATTGTGCGGCTGGTG	25
hHTR3A-R	AGTCATCAGTCTTGGTGGCTTGG	26
hCCKAR-F	AGGATTTCATCTTCGGGAGCG	27
hCCKAR-R	CGGGACTGTAAGGGTTTGC	28

(ii)免疫細胞染色利用4%多聚甲醛將細胞固定後，藉由PBS(-)洗淨2次。添加0.2%TritonX-100/PBS(-)溶液，於室溫下保溫5分鐘後，將上清液去除。添加阻斷液(4%Block Ace(DS Pharma Biomedical)/0.2%TritonX-100/PBS(-))，於室溫下保溫30分鐘。去除阻斷液，添加第一抗體，於4℃保溫16～24小時。藉由0.2%TritonX-100/PBS(-)洗淨2次後，添加第二抗體及Hoechst33342溶液(同仁化學，稀釋為1/3000)，於室溫下保溫1小時。第一抗體及第二抗體之稀釋使用Can Get Signal immunostain Immunoreaction Enhancer Solution A(東洋紡)。

(第一抗體) ・抗GLP1R抗體(Thermo Fisher Scientific，PA5-97789)(1：50稀釋) ・抗NPY2R抗體(Sigma-Aldrich，SAB4502029-100UG)(1：100稀釋) ・抗GLP2R抗體(R&D Systems，MAB4285)(1：50稀釋) ・抗HTR3A抗體(Thermo Fisher Scientific，MA5-31771)(1：250稀釋) ・抗CCKAR抗體(Abcam，ab115287)(1：100稀釋)

(第二抗體) ・Alexa Fluor-555(F(ab')2-羊抗兔IgG(H＋L)第二抗體)(Thermo Fisher Scientific，A21430) ・Alexa Fluor-488(F(ab')2-羊抗鼠IgG(H＋L)第二抗體)(Thermo Fisher Scientific，A11017)

(3-2)向三胚層之分化能力使用STEMdiff(商標)三系分化套組(Trilineage differentiation kit)(STEMCELL Technologies，#ST-05230)，依照套組所附之操作說明，使消化道激素受體表現iPS細胞分化為內胚層或中胚層。將5天之培養後之細胞用於qPCR解析。向外胚層之分化能力之解析使用上述(2-7)中之分化誘導第13天之細胞。藉由qPCR解析外胚層標記基因(hPAX6或hNES)、中胚層標記基因(hNCAM1)或內胚層標記基因(hSOX17)之表現。qPCR除了使用以下引子以外，藉由與上述(3-1)同樣之步序進行。

表2.qPCR所使用之引子組(2) [表2]

引子	序列(5'→3')	SEQ NO.
hPAX6-F	AGAGTGGACAGACATCCGAG	9
hPAX6-R	GTTGACAAAGACACCACCGA	10
hNCAM1-F	CCGTCATCCTGCTTGATCAG	11
hNCAM1-R	GAGTTCAAGACGCAGCCA	12
hSOX17-F	GGCGCAGCAGAATCCAGA	13
hSOX17-R	CCACGACTTGCCCAGCAT	14
hNES-F	CGCTCAGGTCCTGGAAGGTCG	29
hNES-R	AAGTCTTGGAGCCACCGCCA	30

(3-3)染色體檢查為了評價消化道激素受體表現iPS細胞之安全性，而委託日本基因研究所股份有限公司進行利用G分染法進行之染色體檢查。

＜4.使消化道激素受體強制表現之副交感神經細胞或其自主神經系統前驅細胞之解析＞ (4-1)標記物表現 (i)qPCR解析藉由qPCR對神經塉細胞標記基因(hSOX10)、自主神經細胞標記基因(hPHOX2B)、周邊神經細胞標記基因(hPRPH)及副交感神經細胞標記基因(hCHAT)之表現進行解析。qPCR除了使用以下引子組以外，藉由與上述(3-1)同樣之步序進行。

表3.qPCR所使用之引子組(3) [表3]

引子	序列(5'→3')	SEQ NO.
hSOX10-F	CCTCACAGATCGCCTACACC	15
hSOX10-R	CATATAGGAGAAGGCCGAGTAGA	16
hPHOX2B-F	GCTGGCCCTGAAGATCGAC	17
hPHOX2B-R	TCAGACTTTTTGCCCGAGGAG	18
hPRPH-F	GCCTGGAACTAGAGCGCAAG	19
hPRPH-R	CCTCGCACGTTAGACTCTGG	20
hCHAT-F	GCCTTCTACAGGCTCCATCG	21
hCHAT-R	GGAGTGGCCGATCTGATGTT	22

(ii)免疫細胞染色藉由免疫細胞染色對消化道激素受體及MAP2或ChAT之表現進行解析。免疫細胞染色係藉由與上述(3-1)同樣之步序進行。MAP2及ChAT之染色使用以下抗體。・抗MAP2抗體(Abcam，ab11267)(1：500稀釋) ・抗ChAT抗體(Abcam，ab181023)(1：100稀釋)

(4-2)細胞內鈣成像於上述(2-5)及(2-7)中所製作之細胞(誘導第30天之後)中添加終濃度10 μM之Fluo-8 AM(AAT Bioquest，21083)，於37℃保溫20～30分鐘。去除培養基，置換為林格氏液(149 mM NaCl、2.8 mM KCl、2 mM CaCl ₂、1 mM MgCl ₂、10 mM HEPES、10 mM D-(+)-葡萄糖(pH值為7.2))後，測定細胞內鈣濃度變化。使用顯微鏡(Olympus，IX71)、共軛焦掃描單元(Confocal scanner unit)(Yokogawa，CSU-W1)、LED(Light Emitting Diode，發光二極體)光源(OPTO SCIENCE，X-Cite 120LED)、及解析軟體(MetaMorph)(Molecular Devices)，以500 ms/幀拍攝500～800幀。於途中(例如第250幀)添加消化道激素受體促效劑刺激。消化道激素受體促效劑及其添加量(終濃度)如以下所述：GLP1(人類、7-37)(PEPTIDE INSTITUTE，#4280-v)(以下記載為「GLP1」)(10 nM)；PYY(人類、3-36)(PEPTIDE INSTITUTE，#4400-v)(以下記載為「PYY」)(100 nM)；GLP2(人類)(PEPTIDE INSTITUTE，#4376-v)(以下記載為「GLP2」)(100 nM)；血清素(鹽酸血清素(Serotonin hydrochloride))(Sigma-Aldrich，H9523)(以下記載為「5-HT」)(100 μM)；CCK-33(人類)(PEPTIDE INSTITUTE，#4201-s)(以下記載為「CCK-33」)(10、100、1000 nM)。

(4-3)細胞外電位測定藉由上述(2-4)之分化步驟6所記載之步序，準備經PLO及層黏連蛋白塗佈之MEA測定用培養板(CytoView MEA 6(M384-tMEA-6W)，CytoView MEA 24(M384-tMEA-24W))(AXION Biosystems)。培養基使用NDM3，接種上述(2-4)或(2-7)中之誘導第13天之細胞(1×10 ⁵個細胞/8 μL)。之後，以每週兩次之方式藉由新鮮之NDM3更換一半培養基並繼續培養。

於NDM3或林格氏液中測定膜電位變化。使用1000×增益、200 Hz-3 kHz濾波器，檢測相對於測定雜訊標準偏差而變化為6倍以上之電位值作為神經放電(尖峰)。測定5分鐘電位後，以與上述(4-2)同樣之終濃度添加消化道激素受體促效劑，進一步測定5分鐘。

＜5.使hGLP1R強制表現之iPS細胞之品質評價＞於上述1之步序中，使用pLV-hGLP1R作為慢病毒載體，根據上述(3-1)之步序對藉由上述(2-6)之步序所製備之iPS細胞中之hGLP1R基因及蛋白質之表現進行解析。將qPCR之結果示於圖1。相較於野生型iPS細胞(對照)，被導入外源性hGLP1R基因之iPS細胞強烈表現hGLP1R基因(*P＜0.05、n＝3、學生t檢定)。將免疫細胞染色之結果示於圖2。圖中，比例尺表示100 μm。確認到被導入外源性hGLP1R基因之iPS細胞強烈表現hGLP1R蛋白質。基於該等結果，將該細胞設為「hGLP1R表現iPS細胞」。將hGLP1R表現iPS細胞之明視野圖像示於圖3。圖中，比例尺表示100 μm。

根據上述(3-1)之步序，藉由qPCR確認hGLP1R表現iPS細胞中之幹細胞標記物hNANOG基因之表現，將所得之結果示於圖4。圖中，「GLP1R」表示hGLP1R表現iPS細胞，「對照」表示野生型iPS細胞。確認到hGLP1R表現iPS細胞相較於野生型iPS細胞而強烈表現hNANOG基因(*P＜0.05、n＝3、學生t檢定)，為未分化狀態。

根據上述(3-2)之步序，對hGLP1R表現iPS細胞之向三胚層之分化能力進行評價。將結果示於圖5。被誘導向外胚層、中胚層或內胚層分化之hGLP1R表現iPS細胞分別強烈表現外胚層標記物hPAX6基因、中胚層標記物hNCAM1基因或內胚層標記物hSOX17基因。根據該等結果，可確認hGLP1R表現iPS細胞具有向三胚層之分化能力。

將藉由G分染法進行之染色體檢查之結果示於圖6。確認hGLP1R表現iPS細胞之染色體無異常。

＜6.由hGLP1R表現iPS細胞製備之副交感神經細胞或其自主神經系統前驅細胞之解析＞根據上述(2-7)之步序，誘導hGLP1R表現iPS細胞向副交感神經細胞之分化。將誘導第0天之EB及誘導第13天之細胞之顯微鏡圖像(明視野)示於圖7。比例尺表示100 μm。將與誘導第13天之細胞相關之qPCR之結果示於圖8。幹細胞標記物hNANOG基因之表現顯著減少，神經塉細胞標記物hSOX10基因及自主神經細胞標記物hPHOX2B基因之表現顯著增加(*P＜0.05、n＝3、學生t檢定)。根據該等結果，確認誘導第13天之細胞為自主神經系統前驅細胞。

將與誘導第40天之細胞相關之qPCR之結果示於圖9。確認到周邊神經細胞標記物hPRPH基因、副交感神經細胞標記物hCHAT基因及hGLP1R基因之強烈表現(*P＜0.05、n＝3、學生t檢定)。將免疫細胞染色之結果示於圖10。圖中，比例尺表示100 μm。除了hGLP1R蛋白質之表現以外，還確認到成熟神經細胞標記物MAP2蛋白質之表現。

藉由根據上述(4-3)之步序進行之細胞外電位測定對根據上述(2-7)之步序而由hGLP1R表現iPS細胞製備之細胞之配體應答性進行解析。將細胞外電位熱圖示於圖11。藉由添加GLP1，而觀察到表現出較高之神經放電頻度之區域。將神經放電頻度之變化率示於圖12。藉由添加GLP1，神經放電頻度上升(*P＜0.05、n＝74個電極/4孔、學生t)。

藉由根據上述(4-2)之步序進行之細胞內鈣成像對根據上述(2-7)之步序而由hGLP1R表現iPS細胞製備之細胞之配體應答性進行解析。將測定結果示於圖13。橫軸表示時間(秒)，縱軸表示將添加GLP1之前之螢光強度之平均值(F0)設為1時的螢光強度之變化率(ΔF/F0)。藉由添加GLP1，細胞內Ca ²⁺濃度上升。將每分鐘之神經放電(尖峰)之數示於圖14。藉由添加GLP1，尖峰數增加(*P＜0.05、n＝15個細胞/3樣品、學生t)。將神經放電之峰之振幅(相對於添加GLP1之前之螢光強度之平均值(F0)的螢光強度之變化率(ΔF/F0-1)×100)示於圖15。藉由添加GLP1，神經放電之強度增強(*P＜0.05、n＝15個細胞/3樣品、學生t)。

根據以上結果，表明由hGLP1R表現iPS細胞製備之副交感神經細胞為具有GLP1應答性之擬迷走神經副交感神經細胞。

＜7.使hNPY2R強制表現之iPS細胞之品質評價＞於上述1之步序中，使用pLV-hNPY2R作為慢病毒載體，根據上述(3-1)之步序對根據上述(2-6)之步序所製備之iPS細胞中之hNPY2R基因及蛋白質之表現進行解析。將qPCR之結果示於圖16。相較於野生型iPS細胞(對照)，被導入外源性hNPY2R基因之iPS細胞強烈表現hNPY2R基因(*P＜0.05、n＝3、學生t檢定)。將免疫細胞染色之結果示於圖17。圖中，比例尺表示100 μm。確認到被導入外源性hNPY2R基因之iPS細胞強烈表現hNPY2R蛋白質。基於該等結果，將該細胞設為「hNPY2R表現iPS細胞」。將hNPY2R表現iPS細胞之明視野圖像示於圖18。圖中，比例尺表示100 μm。

根據上述(3-1)之步序，藉由qPCR確認hNPY2R表現iPS細胞中之幹細胞標記物NANOG之表現，將所得之結果示於圖19。圖中，「NPY2R」表示hNPY2R表現iPS細胞，「對照」表示野生型iPS細胞。確認到hNPY2R表現iPS細胞相較於野生型iPS細胞而強烈表現NANOG基因(*P＜0.05、n＝3、學生t檢定)，為未分化狀態。

根據上述(3-2)之步序，對hNPY2R表現iPS細胞之向三胚層之分化能力進行評價。將結果示於圖20。被誘導向外胚層、中胚層或內胚層分化之hNPY2R表現iPS細胞分別強烈表現外胚層標記物hPAX6基因、中胚層標記物hNCAM1基因或內胚層標記物hSOX17基因。根據該等結果，可確認hNPY2R表現iPS細胞具有向三胚層之分化能力。

將藉由G分染法進行之染色體檢查之結果示於圖21。確認hNPY2R表現iPS細胞之染色體無異常。

＜8.由hNPY2R表現iPS細胞製備之副交感神經細胞或其自主神經系統前驅細胞之解析＞根據上述(2-7)之步序，誘導hNPY2R表現iPS細胞向副交感神經細胞之分化。將誘導第0天之EB及誘導第13天之細胞之顯微鏡圖像(明視野)示於圖22。比例尺表示100 μm。將與誘導第13天之細胞相關之qPCR之結果示於圖23。幹細胞標記物hNANOG基因之表現顯著減少，神經塉細胞標記物hSOX10基因及自主神經細胞標記物hPHOX2B基因之表現顯著增加(*P＜0.05、n＝3、學生t檢定)。根據該等結果，確認誘導第13天之細胞為自主神經系統前驅細胞。

將與誘導第40天之細胞相關之qPCR之結果示於圖24。確認到周邊神經細胞標記物hPRPH基因、副交感神經細胞標記物hCHAT基因及hNPY2R基因之強烈表現(*P＜0.05、n＝3、學生t檢定)。將免疫細胞染色之結果示於圖25。圖中，比例尺表示100 μm。除了hNPY2R蛋白質之表現以外，確認到成熟神經細胞標記物MAP2蛋白質之表現。

藉由根據上述(4-3)之步序進行之細胞外電位測定對根據上述(2-7)之步序而由hNPY2R表現iPS細胞製備之細胞之配體應答性進行解析。將細胞外電位熱圖示於圖26。藉由添加PYY，而觀察到表現出較高之神經放電頻度之區域。將神經放電頻度之變化率示於圖27。藉由添加PYY，神經放電頻度上升(*P＜0.05、n＝74個電極/4孔、學生t)。

藉由根據上述(4-2)之步序進行之細胞內鈣成像對根據上述(2-7)之步序而由hNPY2R表現iPS細胞製備之細胞之配體應答性進行解析。將測定結果示於圖28。橫軸表示時間(秒)，縱軸表示將添加PYY之前(0～125秒)之螢光強度之平均值(F0)設為1時的螢光強度之變化率(ΔF/F0)。藉由添加PYY，細胞內Ca ²⁺濃度上升。將每分鐘之神經放電(尖峰)之數示於圖29。藉由添加PYY，尖峰數增加(*P＜0.05、n＝15個細胞/3樣品、學生t)。將神經放電之峰之振幅(相對於添加PYY之前之螢光強度之平均值(F0)的螢光強度之變化率(ΔF/F0-1)×100)示於圖30。藉由添加PYY，神經放電之強度增強(*P＜0.05、n＝15個細胞/3樣品、學生t)。

根據以上結果，表明由hNPY2R表現iPS細胞製備之副交感神經細胞為具有PYY應答性之擬迷走神經副交感神經細胞。

＜9.使hGLP2R強制表現之iPS細胞之品質評價＞於上述1之步序中，使用pLV-hGLP2R作為慢病毒載體，根據上述(3-1)之步序對根據上述(2-6)之步序所製備之iPS細胞中之hGLP2R基因及蛋白質之表現進行解析。將qPCR之結果示於圖31。相較於野生型iPS細胞(對照)，被導入外源性hGLP2R基因之iPS細胞強烈表現hGLP2R基因(*P＜0.05、n＝3、學生t檢定)。將免疫細胞染色之結果示於圖32。圖中，比例尺表示100 μm。確認到被導入外源性hGLP2R基因之iPS細胞表現hGLP2R蛋白質。基於該等結果，將該細胞設為「hGLP2R表現iPS細胞」。將hGLP2R表現iPS細胞之明視野圖像示於圖33。圖中，比例尺表示1 mm。

根據上述(3-1)之步序，藉由qPCR確認hGLP2R表現iPS細胞中之幹細胞標記物hNANOG基因之表現，將所得之結果示於圖34。圖中，「hGLP2R」表示hGLP2R表現iPS細胞，「對照」表示野生型iPS細胞。確認到hGLP2R表現iPS細胞與野生型iPS細胞相同程度地表現hNANOG基因，為未分化狀態。

根據上述(3-2)之步序，對hGLP2R表現iPS細胞之向三胚層之分化能力進行評價。將結果示於圖35。被誘導向外胚層、中胚層或內胚層分化之hGLP2R表現iPS細胞分別強烈表現外胚層標記物hNES基因、中胚層標記物hNCAM1基因或內胚層標記物hSOX17基因。根據該等結果，可確認hGLP2R表現iPS細胞具有向三胚層之分化能力。

將藉由G分染法進行之染色體檢查之結果示於圖36。確認hGLP2R表現iPS細胞之染色體無異常。

＜10.由hGLP2R表現iPS細胞製備之副交感神經細胞或其自主神經系統前驅細胞之解析＞根據上述(2-7)之步序，誘導hGLP2R表現iPS細胞向副交感神經細胞之分化。將誘導第0天之EB及誘導第13天之細胞之顯微鏡圖像(明視野)示於圖37。比例尺表示100 μm。將與誘導第13天之細胞相關之qPCR之結果示於圖38。幹細胞標記物hNANOG基因之表現顯著減少，神經塉細胞標記物hSOX10基因及自主神經細胞標記物hPHOX2B基因之表現顯著增加(*P＜0.05、n＝3、學生t檢定)。根據該等結果，確認誘導第13天之細胞為自主神經系統前驅細胞。

將與誘導第40天之細胞相關之qPCR之結果示於圖39。確認到周邊神經細胞標記物hPRPH基因及副交感神經細胞標記物hCHAT基因之強烈表現(*P＜0.05、n＝3、學生t檢定)。又，相較於誘導第40天之模擬感染副交感神經細胞(對照)，確認到hGLP2R基因之強烈表現(*P＜0.05、n＝3、學生t檢定)。

將免疫細胞染色之結果示於圖40。圖中，比例尺表示100 μm。確認到hGLP2R蛋白質之較弱之表現及成熟神經細胞標記物MAP2蛋白質之表現。

＜11.使hHTR3A強制表現之iPS細胞之品質評價＞於上述1之步序中，使用pLV-hHTR3A作為慢病毒載體，根據上述(3-1)之步序對根據上述(2-6)之步序所製備之iPS細胞中之hHTR3A基因及蛋白質之表現進行解析。將qPCR之結果示於圖41。相較於野生型iPS細胞(對照)，被導入外源性hHTR3A基因之iPS細胞強烈表現hHTR3A基因(*P＜0.05、n＝3、學生t檢定)。將免疫細胞染色之結果示於圖42。圖中，比例尺表示100 μm。確認到被導入外源性hHTR3A基因之iPS細胞強烈表現hHTR3A蛋白質。基於該等結果，將該細胞設為「hHTR3A表現iPS細胞」。將hHTR3A表現iPS細胞之明視野圖像示於圖43。圖中，比例尺表示1 mm。

根據上述(3-1)之步序，藉由qPCR確認hHTR3A表現iPS細胞中之幹細胞標記物hNANOG基因之表現，將所得之結果示於圖44。圖中，「hHTR3A」表示hHTR3A表現iPS細胞，「對照」表示野生型iPS細胞。確認到hHTR3A表現iPS細胞與野生型iPS細胞相同程度地表現hNANOG基因，為未分化狀態。

根據上述(3-2)之步序，對hHTR3A表現iPS細胞之向三胚層之分化能力進行評價。將結果示於圖45。被誘導向外胚層、中胚層或內胚層分化之hHTR3A表現iPS細胞分別強烈表現外胚層標記物hNES基因、中胚層標記物hNCAM1基因或內胚層標記物hSOX17基因。根據該等結果，可確認hHTR3A表現iPS細胞具有向三胚層之分化能力。

將藉由G分染法進行之染色體檢查之結果示於圖46。確認hHTR3A表現iPS細胞之染色體無異常。

＜12.由hHTR3A表現iPS細胞製備之副交感神經細胞或其自主神經系統前驅細胞之解析＞根據上述(2-7)之步序，誘導hHTR3A表現iPS細胞向副交感神經細胞之分化。將誘導第0天之EB及誘導第13天之細胞之顯微鏡圖像(明視野)示於圖47。比例尺表示100 μm。將與誘導第13天之細胞相關之qPCR之結果示於圖48。幹細胞標記物hNANOG基因之表現顯著減少，神經塉細胞標記物hSOX10基因及自主神經細胞標記物hPHOX2B基因之表現顯著增加(*P＜0.05、n＝3、學生t檢定)。根據該等結果，確認誘導第13天之細胞為自主神經系統前驅細胞。

將與誘導第40天之細胞相關之qPCR之結果示於圖49。確認到周邊神經細胞標記物hPRPH基因及副交感神經細胞標記物hCHAT基因之強烈表現(*P＜0.05、n＝3、學生t檢定)。又，相較於誘導第40天之模擬感染副交感神經細胞(對照)，確認到hHTR3A基因之相同程度之表現(*P＜0.05、n＝3、學生t檢定)。

將免疫細胞染色之結果示於圖50。圖中，比例尺表示100 μm。確認到hHTR3A蛋白質及成熟神經細胞標記物MAP2蛋白質之表現。

＜13.使hCCKAR強制表現之iPS細胞之品質評價＞於上述1之步序中，使用pLV-hCCKAR作為慢病毒載體，根據上述(3-1)之步序對根據上述(2-6)之步序所製備之iPS細胞中之hCCKAR基因及蛋白質之表現進行解析。將qPCR之結果示於圖51。相較於野生型iPS細胞(對照)，被導入外源性hCCKAR基因之iPS細胞強烈表現hCCKAR基因(*P＜0.05、n＝3、學生t檢定)。將免疫細胞染色之結果示於圖52。圖中，比例尺表示100 μm。確認到被導入外源性hCCKAR基因之iPS細胞強烈表現hCCKAR蛋白質。基於該等結果，將該細胞設為「hCCKAR表現iPS細胞」。將hCCKAR表現iPS細胞之明視野圖像示於圖53。圖中，比例尺表示1 mm。

根據上述(3-1)之步序，藉由qPCR確認hCCKAR表現iPS細胞中之幹細胞標記物hNANOG基因之表現，將所獲得之結果示於圖54。圖中，「hCCKAR」表示hCCKAR表現iPS細胞，「對照」表示野生型iPS細胞。確認到hCCKAR表現iPS細胞與野生型iPS細胞相同程度地表現hNANOG基因，為未分化狀態。

根據上述(3-2)之步序，對hCCKAR表現iPS細胞之向三胚層之分化能力進行評價。將結果示於圖55。被誘導向外胚層、中胚層或內胚層分化之hCCKAR表現iPS細胞分別強烈表現外胚層標記物hNES基因、中胚層標記物hNCAM1基因或內胚層標記物hSOX17基因。根據該等結果，可確認hCCKAR表現iPS細胞具有向三胚層之分化能力。

將藉由G分染法進行之染色體檢查之結果示於圖56。確認hCCKAR表現iPS細胞之染色體無異常。

＜14.由hCCKAR表現iPS細胞製備之副交感神經細胞或其自主神經系統前驅細胞之解析＞根據上述(2-7)之步序，誘導hCCKAR表現iPS細胞向副交感神經細胞之分化。將誘導第0天之EB及誘導第13天之細胞之顯微鏡圖像(明視野)示於圖57。比例尺表示100 μm。將與誘導第13天之細胞相關之qPCR之結果示於圖58。幹細胞標記物hNANOG基因之表現顯著減少，神經塉細胞標記物hSOX10基因及自主神經細胞標記物hPHOX2B基因之表現顯著增加(*P＜0.05、n＝3、學生t檢定)。根據該等結果，確認誘導第13天之細胞為自主神經系統前驅細胞。

將與誘導第40天之細胞相關之qPCR之結果示於圖59。確認到周邊神經細胞標記物hPRPH基因及副交感神經細胞標記物hCHAT基因之強烈表現(*P＜0.05、n＝3、學生t檢定)。又，相較於誘導第40天之模擬感染副交感神經細胞(對照)，確認到hCCKAR基因之強烈表現(*P＜0.05、n＝3、學生t檢定)。

將免疫細胞染色之結果示於圖60。圖中，比例尺表示100 μm。確認到hCCKAR蛋白質及成熟神經細胞標記物MAP2蛋白質之表現。

藉由根據上述(4-3)之步序進行之細胞外電位測定對根據上述(2-7)之步序而由hCCKAR表現iPS細胞製備之細胞之配體應答性進行解析。將細胞外電位熱圖示於圖61。藉由添加CCK-33，而觀察到表現出較高之神經放電頻度之區域。將神經放電頻度之變化率示於圖62。藉由添加CCK-33，神經放電頻度上升(*P＜0.05、0 nM＝128個電極、10 nM＝23個電極、100 nM＝57個電極、1000 nM＝24個電極/2～4孔、學生t)。

藉由根據上述(4-2)之步序進行之細胞內鈣成像對根據上述(2-7)之步序而由hCCKAR表現iPS細胞製備之細胞之配體應答性進行解析。將測定結果示於圖63。橫軸表示時間(秒)，縱軸表示將添加CCK-33之前(0～199秒)之螢光強度之平均值(F0)設為1時的螢光強度之變化率(ΔF/F0)。藉由添加CCK-33，細胞內Ca ²⁺濃度上升。將相對於添加CCK-33之前(0～199秒)之螢光強度之平均值(F0)的添加CCK-33後(200～400秒)之螢光強度之平均值(ΔF _ave)之變化率(ΔF _ave/F0)示於圖64。藉由添加CCK-33，神經放電之強度增強(*P＜0.05、n＝20個細胞/3樣品、學生t)。

根據以上結果，表明由hCCKAR表現iPS細胞製備之副交感神經細胞為具有CCK-33應答性之擬迷走神經副交感神經細胞。

＜15.使hGLP1R於分化後強制表現之副交感神經細胞之解析＞於上述1之步序中，使用pLV-hGLP1R作為慢病毒載體，根據上述(3-1)之步序對根據上述(2-5)之步序所製備之副交感神經細胞中之hGLP1R蛋白質之表現進行解析。將誘導第40天中之免疫細胞染色之結果示於圖65。圖中，比例尺表示100 μm。確認到副交感神經細胞標記物hChAT蛋白質及hGLP1R蛋白質之強烈表現。

根據上述(2-7)之步序，藉由根據上述(4-2)之步序進行之細胞內鈣成像對使hGLP1R蛋白質於分化後強制表現之副交感神經細胞之配體應答性進行解析。將測定結果示於圖66。橫軸表示時間(秒)，縱軸表示將添加GLP1之前(0～124秒)之螢光強度之平均值(F0)設為1時的螢光強度之變化率(ΔF/F0)。藉由添加GLP1，細胞內Ca ²⁺濃度上升。

＜16.使hNPY2R於分化後強制表現之副交感神經細胞之解析＞於上述1之步序中，使用pLV-hNPY2R作為慢病毒載體，根據上述(3-1)之步序對根據上述(2-5)之步序所製備之副交感神經細胞中之hNPY2R蛋白質之表現進行解析。將誘導第40天中之免疫細胞染色之結果示於圖67。圖中，比例尺表示100 μm。確認到副交感神經細胞標記物hChAT蛋白質及hNPY2R蛋白質之強烈表現。

根據上述(2-7)之步序，藉由根據上述(4-2)之步序進行之細胞內鈣成像對使hNPY2R蛋白質於分化後強制表現之副交感神經細胞之配體應答性進行解析。將測定結果示於圖68。橫軸表示時間(秒)，縱軸表示將添加PYY之前(0～124秒)之螢光強度之平均值(F0)設為1時的螢光強度之變化率(ΔF/F0)。藉由添加PYY，細胞內Ca ²⁺濃度上升。

＜17.使hGLP2R於分化後強制表現之副交感神經細胞之解析＞於上述1之步序中，使用pLV-hGLP2R作為慢病毒載體，根據上述(3-1)之步序對根據上述(2-5)之步序所製備之副交感神經細胞中之hGLP2R基因及蛋白質之表現進行解析。將qPCR之結果示於圖69。於野生型iPS細胞(圖中為「未分化」)中未觀察到周邊神經細胞標記物hPRPH基因及副交感神經細胞標記物hCHAT基因之表現，與此相對，於被導入外源性hGLP2R基因之誘導第40天之細胞(圖中為「副交感神經細胞」)中確認到兩標記基因之強烈表現(*P＜0.05、n＝3、學生t檢定)。又，相較於誘導第40天之模擬感染副交感神經細胞(對照)，確認到hGLP2R基因之強烈表現(*P＜0.05、n＝3、學生t檢定)。

將誘導第40天中之免疫細胞染色之結果示於圖70。圖中，比例尺表示100 μm。確認到成熟神經細胞標記物MAP2蛋白質及hGLP2R蛋白質之強烈表現。

根據上述(2-7)之步序，藉由根據上述(4-2)之步序進行之細胞內鈣成像對使hGLP2R蛋白質於分化後強制表現之副交感神經細胞之配體應答性進行解析。將測定結果示於圖71。橫軸表示時間(秒)，縱軸表示將添加GLP2之前(0～80秒)之螢光強度之平均值(F0)設為1時的螢光強度之變化率(ΔF/F0)。藉由添加GLP2，細胞內Ca ²⁺濃度上升。將相對於添加GLP2之前(0～80秒)之螢光強度之平均值(F0)的添加GLP2後(240～400秒)之螢光強度之平均值(ΔF _ave)之變化率(ΔF _ave/F0)示於圖72。藉由添加GLP2，神經放電之強度增強(*P＜0.05、n＝20個細胞/3樣品、學生t)。

＜18.使hHTR3A於分化後強制表現之副交感神經細胞之解析＞於上述1之步序中，使用pLV-hHTR3A作為慢病毒載體，根據上述(3-1)之步序對根據上述(2-5)之步序所製備之副交感神經細胞中之hHTR3A基因及蛋白質之表現進行解析。將qPCR之結果示於圖73。於野生型iPS細胞(圖中為「未分化」)中未觀察到周邊神經細胞標記物hPRPH基因及副交感神經細胞標記物hCHAT基因之表現，與此相對，於被導入外源性hHTR3A基因之誘導第40天之細胞(圖中為「副交感神經細胞」)中確認到兩標記基因之強烈表現(*P＜0.05、n＝3、學生t檢定)。又，相較於誘導第40天之模擬感染副交感神經細胞(對照)，確認到hHTR3A基因之強烈表現(*P＜0.05、n＝3、學生t檢定)。

將誘導第40天中之免疫細胞染色之結果示於圖74。圖中，比例尺表示100 μm。確認到成熟神經細胞標記物MAP2蛋白質及hHTR3A蛋白質之強烈表現。

根據上述(2-7)之步序，藉由根據上述(4-2)之步序進行之細胞內鈣成像對使hHTR3A蛋白質於分化後強制表現之副交感神經細胞之配體應答性進行解析。將測定結果示於圖75。橫軸表示時間(秒)，縱軸表示將添加5-HT之前(0～80秒)之螢光強度之平均值(F0)設為1時的螢光強度之變化率(ΔF/F0)。藉由添加5-HT，細胞內Ca ²⁺濃度上升。將相對於添加5-HT之前(0～80秒)之螢光強度之平均值(F0)的添加5-HT後(240～400秒)之螢光強度之平均值(ΔF _ave)之變化率(ΔF _ave/F0)示於圖76。藉由添加5-HT，神經放電之強度增強(*P＜0.05、n＝20個細胞/3樣品、學生t)。

＜19.使hCCKAR於分化後強制表現之副交感神經細胞之解析＞於上述1之步序中，使用pLV-hCCKAR作為慢病毒載體，根據上述(3-1)之步序對根據上述(2-5)之步序所製備之副交感神經細胞中之hCCKAR基因及蛋白質之表現進行解析。將qPCR之結果示於圖77。於野生型iPS細胞(圖中為「未分化」)中未觀察到周邊神經細胞標記物hPRPH基因及副交感神經細胞標記物hCHAT基因之表現，與此相對，於被導入外源性hCCKAR基因之誘導第40天之細胞(圖中為「副交感神經細胞」)中確認到兩標記基因之強烈表現(*P＜0.05、n＝3、學生t檢定)。又，相較於誘導第40天之模擬感染副交感神經細胞(對照)，確認到hCCKAR基因之強烈表現(*P＜0.05、n＝3、學生t檢定)。

將誘導第40天中之免疫細胞染色之結果示於圖78。圖中，比例尺表示100 μm。確認到成熟神經細胞標記物MAP2蛋白質及hCCKAR蛋白質之強烈表現。

根據上述(2-7)之步序，藉由根據上述(4-2)之步序進行之細胞內鈣成像對使hCCKAR蛋白質於分化後強制表現之副交感神經細胞之配體應答性進行解析。將測定結果示於圖79。橫軸表示時間(秒)，縱軸表示將添加CCK-33之前(0～80秒)之螢光強度之平均值(F0)設為1時的螢光強度之變化率(ΔF/F0)。藉由添加CCK-33，細胞內Ca ²⁺濃度上升。將相對於添加CCK-33之前(0～80秒)之螢光強度之平均值(F0)的添加CCK-33後(240～400秒)之螢光強度之平均值(ΔF _ave)之變化率(ΔF _ave/F0)示於圖80。藉由添加CCK-33，神經放電之強度增強(*P＜0.05、n＝20個細胞/3樣品、學生t)。

＜20.由hGLP1R表現iPS細胞製備之副交感神經細胞と腸內分泌細胞と之共培養之製作＞使用含有10%FBS及1%P/S之RPMI-1640(以下記載為「H716培養基」)將來自人類L細胞之細胞株NCI-H716(ATCC：CCL-251)接種於10 cm培養皿(1～2×10 ⁶個細胞/培養皿)並培養3～4天。將細胞及培養基回收至15 mL離心管中，進行200×g、5分鐘離心分離，去除上清液。於細胞中添加不含FBS之H716培養基或林格氏液，製備為1×10 ⁶個細胞/mL。於所獲得之細胞懸浮液之1 mL中添加20 μM之MemGlow/DMSO溶液5 μL(終濃度100 nM)，於室溫下保溫10分鐘。其後，進行200×g、5分鐘離心分離，去除上清液。使用H716培養基洗淨1次後，接種於10 cm培養皿中。確認到MemGlow對細胞膜之染色最多維持10天。以下，將經MemGlow染色之NCI-H716細胞記載為「MemGlow染色NCI-H716」。

於根據上述(2-7)之步序而由hGLP1R表現iPS細胞製備之副交感神經細胞(以下記載為「hGLP1R表現副交感神經細胞」)(誘導第37天)中添加MemGlow染色NCI-H716(2×10 ⁵個細胞/mL)1 mL。其結果，於NDM2及H716培養基之1：1混合培養基中進行共培養。48小時之培養後，根據與上述(3-1)(ii)同樣之步序，進行免疫細胞染色。第一抗體使用抗MAP2抗體(Abcam，ab11267)(1：1000稀釋)。

將結果示於圖81。於共培養中，確認到於hGLP1R表現副交感神經細胞上黏著有MemGlow染色NCI-H716細胞。hGLP1R表現副交感神經細胞及MemGlow染色NCI-H716之任一者均未觀察到形態異常。進而，使用作為副交感神經之促效劑之菸鹼，根據上述(4-2)之步序進行細胞內鈣成像，確認共培養中之hGLP1R表現副交感神經細胞之菸鹼應答正常(資料省略)。根據該等結果，表明可將hGLP1R表現副交感神經細胞與NCI-H716細胞直接共培養。

＜21.與NCI-H716細胞之共培養中之hGLP1R表現副交感神經細胞之解析＞於根據上述(2-7)之步序所製備之hGLP1R表現副交感神經細胞(誘導第35天)中添加MemGlow染色NCI-H716(1×10 ⁶個細胞/mL)1 mL。於NDM2及H716培養基之1：1混合培養基中進行共培養。1小時之共培養後，將培養基更換為不含葡萄糖之林格氏液。藉由根據上述(4-2)之步序進行之細胞內鈣成像對針對葡萄糖(刺激腸內分泌細胞，與飲食控制相關)之應答進行解析。

將結果示於圖82。橫軸表示時間(秒)，縱軸表示將添加葡萄糖之前(0～199秒)之螢光強度之平均值(F0)設為1時的螢光強度之變化率(ΔF/F0)。藉由在共培養中添加葡萄糖，hGLP1R表現副交感神經細胞之細胞內Ca ²⁺濃度上升。將相對於添加葡萄糖之前(0～199秒)之螢光強度之平均值(F0)的添加葡萄糖後(200～400秒)之螢光強度之平均值(ΔF _ave)之變化率(ΔF _ave/F0)示於圖83。藉由在共培養中添加葡萄糖，hGLP1R表現副交感神經細胞之神經放電之強度增強(*P＜0.05、n＝20個細胞/樣品、學生t)。另一方面，hGLP1R表現副交感神經細胞之單獨培養未對葡萄糖產生應答(資料省略)。根據該等結果，提示NCI-H716細胞對葡萄糖產生應答而分泌GLP1，hGLP1R表現副交感神經細胞對GLP1產生應答。

繼而，藉由根據上述(4-2)之步序進行之細胞內鈣成像對上述共培養之針對α-次亞麻油酸之應答進行解析。使用作為NCI-H716細胞所表現之多元不飽和脂肪酸受體之促效劑的α-次亞麻油酸(FUJIFILM Wako Pure Chemical：127-05901)(以下記載為「ALA」)(100 μM)，測定溶液使用不含葡萄糖之林格氏液。

將結果示於圖84。橫軸表示時間(秒)，縱軸表示將添加ALA之前(0～199秒)之螢光強度之平均值(F0)設為1時的螢光強度之變化率(ΔF/F0)。藉由在共培養中添加ALA，hGLP1R表現副交感神經細胞之細胞內Ca ²⁺濃度上升。將相對於添加ALA之前(0～199秒)之螢光強度之平均值(F0)的添加ALA後(200～400秒)之螢光強度之平均值(ΔF _ave)之變化率(ΔF _ave/F0)示於圖85。藉由在共培養中添加ALA，hGLP1R表現副交感神經細胞之神經放電之強度增強(*P＜0.05、n＝20個細胞/樣品、學生t)。另一方面，hGLP1R表現副交感神經細胞之單獨培養未對ALA產生應答(資料省略)。根據該等結果，提示NCI-H716細胞對ALA產生應答而分泌GLP1，hGLP1R表現副交感神經細胞對GLP1產生應答。

＜22.針對NCI-H716細胞之培養上清液之hGLP1R表現副交感神經細胞之應答性＞將經HBSS稀釋之基質膠(終濃度0.4～0.6 mg/mL)添加於24孔板，於37℃保溫1小時。利用HBSS洗淨2次，加以乾燥後，使用H716培養基接種NCI-H716細胞(2×10 ⁵個細胞/孔)。培養48小時後，利用林格氏液洗淨1次，添加含有葡萄糖(10 mM)或ALA(100 μM)之林格氏液。於室溫下保溫4分鐘後，回收上清液。添加PMSF(終濃度50 μg/mL)，於用於測定之前，將上清液於冰上保存，於測定時恢復為室溫而使用。以下，將藉由含有葡萄糖之林格氏液所製備之上清液記載為「葡萄糖負載上清液」，將藉由含有ALA之林格氏液所製備之上清液記載為「ALA負載上清液」。使用葡萄糖負載上清液或ALA負載上清液，根據與上述(4-2)同樣之步序進行細胞內鈣成像。

將使用葡萄糖負載上清液之細胞內鈣成像之結果示於圖86。橫軸表示時間(秒)，縱軸表示將添加上清液之前(0～199秒)之螢光強度之平均值(F0)設為1時的螢光強度之變化率(ΔF/F0)。藉由添加葡萄糖負載上清液，hGLP1R表現副交感神經細胞(誘導第44天)之細胞內Ca ²⁺濃度上升。將相對於添加上清液之前(0～199秒)之螢光強度之平均值(F0)的添加上清液後(200～400秒)之螢光強度之平均值(ΔF _ave)之變化率(ΔF _ave/F0)示於圖87。圖中，「Ctrl」表示未與NCI-H716細胞接觸之林格氏液。hGLP1R表現副交感神經細胞亦與未負載葡萄糖之上清液發生反應，但葡萄糖負載上清液表現出更強之反應(***P＜0.001、n＝20個細胞/樣品、伴隨Tukey事後檢定之雙向配置ANOVA)。

將使用ALA負載上清液之細胞內鈣成像之結果示於圖88。橫軸表示時間(秒)，縱軸表示將添加上清液之前(0～199秒)之螢光強度之平均值(F0)設為1時的螢光強度之變化率(ΔF/F0)。藉由添加ALA負載上清液，hGLP1R表現副交感神經細胞(誘導第34天)之細胞內Ca ²⁺濃度上升。將相對於添加上清液之前(0～199秒)之螢光強度之平均值(F0)的添加上清液後(200～400秒)之螢光強度之平均值(ΔF _ave)之變化率(ΔF _ave/F0)示於圖89。圖中，「Ctrl」表示未與NCI-H716細胞接觸之林格氏液。hGLP1R表現副交感神經細胞亦與葡萄糖負載上清液相同程度地與ALA負載上清液表現出較強之反應(***P＜0.001、n＝20個細胞/樣品、伴隨Tukey事後檢定之雙向配置ANOVA)。

根據以上結果，確認NCI-H716細胞對葡萄糖及ALA產生應答而分泌GLP1，hGLP1R表現副交感神經細胞對GLP1產生應答。

圖1係表示野生型iPS細胞(induced Pluripotent Stem Cell，誘導性多能幹細胞)及導入有外源性hGLP1R(human glucagon-like peptide-1 receptor，人胰高血糖素樣肽1受體)基因之iPS細胞中之hGLP1R的mRNA之表現量之條形圖。圖2係表示導入有外源性hGLP1R基因之iPS細胞之Hoechst染色圖像(上)及使用抗GLP1R抗體之螢光免疫染色圖像(下)之圖。圖3係表示hGLP1R表現iPS細胞之顯微鏡圖像(明視野)之圖。圖4係表示野生型iPS細胞及hGLP1R表現iPS細胞中之hNANOG之mRNA之表現量的條形圖。圖5係表示未分化之hGLP1R表現iPS細胞、及被誘導向外胚層、中胚層或內胚層分化之hGLP1R表現iPS細胞中之hPAX6、hNCAM1(human neural cell adhesion molecule 1，人神經細胞黏附分子1)或hSOX17的mRNA之表現量之條形圖。圖6係表示藉由G分染法解析hGLP1R表現iPS細胞之染色體所得之結果之圖。圖7係表示由hGLP1R表現iPS細胞製備之誘導第0天之EB及誘導第13天之細胞之顯微鏡圖像(明視野)的圖。圖8係表示由hGLP1R表現iPS細胞製備之誘導第13天之細胞中的hNANOG、hSOX10及hPHOX2B之mRNA之表現量之條形圖。圖9係表示由hGLP1R表現iPS細胞製備之誘導第40天之細胞中的hPRPH、hCHAT(human choline acetyltransferase，人膽鹼乙醯轉化酶)及hGLP1R之mRNA之表現量之條形圖。圖10係表示由hGLP1R表現iPS細胞製備之誘導第45天之細胞之Hoechst染色圖像(上)、使用抗GLP1R抗體之螢光免疫染色圖像(中央)及使用抗GLP1R抗體＋抗MAP2抗體之螢光免疫染色圖像(下)之圖。圖11係表示添加有或未添加GLP1之條件下之由hGLP1R表現iPS細胞製備之誘導第27天的細胞之細胞外電位熱圖之圖。圖12係表示添加有或未添加GLP1之條件下之由hGLP1R表現iPS細胞製備之誘導第27天的細胞之放電頻度之變化率的條形圖。圖13係表示由hGLP1R表現iPS細胞製備之誘導第40天之細胞的鈣成像之結果之圖。(上)為剛添加GLP1(自測定開始起125秒時點)後之細胞之螢光圖像，(下)為3個細胞(細胞1～3)之螢光強度(強度(ΔF/F0))之經時變化。圖14係表示添加有或未添加GLP1之條件下之由hGLP1R表現iPS細胞製備之誘導第40天的細胞之Ca ²⁺尖峰數之條形圖。圖15係表示添加有或未添加GLP1之條件下之由hGLP1R表現iPS細胞製備之誘導第40天的細胞之Ca ²⁺尖峰之振幅之條形圖。圖16係表示野生型iPS細胞及導入有外源性hNPY2R基因之iPS細胞中之hNPY2R的mRNA之表現量之條形圖。圖17係表示導入有外源性hNPY2R基因之iPS細胞之Hoechst染色圖像(上)及使用抗NPY2R抗體之螢光免疫染色圖像(下)之圖。圖18係表示hNPY2R表現iPS細胞之顯微鏡圖像(明視野)之圖。圖19係表示野生型iPS細胞及hNPY2R表現iPS細胞中之hNANOG之mRNA的表現量之條形圖。圖20係表示未分化之hNPY2R表現iPS細胞、及被誘導向外胚層、中胚層或內胚層分化之hNPY2R表現iPS細胞中之hPAX6、hNCAM1或hSOX17之mRNA之表現量的條形圖。圖21係表示藉由G分染法解析hNPY2R表現iPS細胞之染色體所得之結果之圖。圖22係表示由hNPY2R表現iPS細胞製備之誘導第0天之EB及誘導第13天之細胞的顯微鏡圖像(明視野)之圖。圖23係表示由hNPY2R表現iPS細胞製備之誘導第13天之細胞中的hNANOG、hSOX10及hPHOX2B之mRNA之表現量之條形圖。圖24係表示由hNPY2R表現iPS細胞製備之誘導第40天之細胞中的hPRPH、hCHAT及hNPY2R之mRNA之表現量之條形圖。圖25係表示由hNPY2R表現iPS細胞製備之誘導第45天之細胞之Hoechst染色圖像(上)、使用抗NPY2R抗體之螢光免疫染色圖像(中央)及使用抗NPY2R抗體＋抗MAP2抗體之螢光免疫染色圖像(下)之圖。圖26係表示添加有或未添加PYY(peptide YY，肽YY)之條件下之由hNPY2R表現iPS細胞製備的誘導第27天之細胞之細胞外電位熱圖之圖。圖27係表示添加有或未添加PYY之條件下之由hNPY2R表現iPS細胞製備的誘導第27天之細胞之放電頻度之變化率的條形圖。圖28係表示由hNPY2R表現iPS細胞製備之誘導第40天之細胞的鈣成像之結果之圖。(上)為剛添加PYY(自測定開始起125秒時點)後之細胞之螢光圖像，(下)為3個細胞(細胞1～3)之螢光強度(強度(ΔF/F0))之經時變化。圖29係表示添加有或未添加PYY之條件下之由hNPY2R表現iPS細胞製備的誘導第40天之細胞之Ca ²⁺尖峰數之條形圖。圖30係表示添加有或未添加PYY之條件下之由hNPY2R表現iPS細胞製備的誘導第40天之細胞之Ca ²⁺尖峰之振幅的條形圖。圖31係表示野生型iPS細胞及導入有外源性hGLP2R基因之iPS細胞中之hGLP2R的mRNA之表現量之條形圖。圖32係表示導入有外源性hGLP2R基因之iPS細胞之Hoechst染色圖像(上)及使用抗GLP2R抗體之螢光免疫染色圖像(下)之圖。圖33係表示hGLP2R表現iPS細胞之顯微鏡圖像(明視野)之圖。圖34係表示野生型iPS細胞及hGLP2R表現iPS細胞中之hNANOG之mRNA的表現量之條形圖。圖35係表示未分化之hGLP2R表現iPS細胞、及被誘導向外胚層、中胚層或內胚層分化之hGLP2R表現iPS細胞中之hNES、hNCAM1或hSOX17的mRNA之表現量之條形圖。圖36係表示藉由G分染法解析hGLP2R表現iPS細胞之染色體所獲得之結果之圖。圖37係表示由hGLP2R表現iPS細胞製備之誘導第0天之EB及誘導第13天之細胞的顯微鏡圖像(明視野)之圖。圖38係表示由hGLP2R表現iPS細胞製備之誘導第13天之細胞中的hNANOG、hSOX10及hPHOX2B之mRNA之表現量之條形圖。圖39係表示由hGLP2R表現iPS細胞製備之誘導第40天之細胞中的hPRPH、hCHAT及hGLP2R之mRNA之表現量之條形圖。圖40係表示由hGLP2R表現iPS細胞製備之誘導第40天之細胞之Hoechst染色圖像(上)、使用抗GLP2R抗體之螢光免疫染色圖像(中央)及使用抗GLP2R抗體＋抗MAP2抗體之螢光免疫染色圖像(下)之圖。圖41係表示野生型iPS細胞及導入有外源性hHTR3A基因之iPS細胞中之hHTR3A的mRNA之表現量之條形圖。圖42係表示導入有外源性hHTR3A基因之iPS細胞之Hoechst染色圖像(上)及使用抗HTR3A抗體之螢光免疫染色圖像(下)之圖。圖43係表示hHTR3A表現iPS細胞之顯微鏡圖像(明視野)之圖。圖44係表示野生型iPS細胞及hHTR3A表現iPS細胞中之hNANOG之mRNA的表現量之條形圖。圖45係表示未分化之hHTR3A表現iPS細胞、及被誘導向外胚層、中胚層或內胚層分化之hHTR3A表現iPS細胞中之hNES、hNCAM1或hSOX17的mRNA之表現量之條形圖。圖46係表示藉由G分染法解析hHTR3A表現iPS細胞之染色體所得之結果之圖。圖47係表示由hHTR3A表現iPS細胞製備之誘導第0天之EB及誘導第13天之細胞的顯微鏡圖像(明視野)之圖。圖48係表示由hHTR3A表現iPS細胞製備之誘導第13天之細胞中的hNANOG、hSOX10及hPHOX2B之mRNA之表現量的條形圖。圖49係表示由hHTR3A表現iPS細胞製備之誘導第40天之細胞中的hPRPH、hCHAT及hHTR3A之mRNA之表現量的條形圖。圖50係表示由hHTR3A表現iPS細胞製備之誘導第40天之細胞之Hoechst染色圖像(上)、使用抗HTR3A抗體之螢光免疫染色圖像(中央)及使用抗HTR3A抗體＋抗MAP2抗體之螢光免疫染色圖像(下)之圖。圖51係表示野生型iPS細胞及導入有外源性hCCKAR基因之iPS細胞中之hCCKAR的mRNA之表現量之條形圖。圖52係表示導入有外源性hCCKAR基因之iPS細胞之Hoechst染色圖像(上)及使用抗CCKAR抗體之螢光免疫染色圖像(下)之圖。圖53係表示hCCKAR表現iPS細胞之顯微鏡圖像(明視野)之圖。圖54係表示野生型iPS細胞及hCCKAR表現iPS細胞中之hNANOG之mRNA的表現量之條形圖。圖55係表示未分化之hCCKAR表現iPS細胞、及被誘導向外胚層、中胚層或內胚層分化之hCCKAR表現iPS細胞中之hNES、hNCAM1或hSOX17的mRNA之表現量之條形圖。圖56係藉由G分染法解析hCCKAR表現iPS細胞之染色體所得之結果之圖。圖57係表示由hCCKAR表現iPS細胞製備之誘導第0天之EB及誘導第13天之細胞之顯微鏡圖像(明視野)的圖。圖58係表示由hCCKAR表現iPS細胞製備之誘導第13天之細胞中的hNANOG、hSOX10及hPHOX2B之mRNA之表現量之條形圖。圖59係表示由hCCKAR表現iPS細胞製備之誘導第40天之細胞中的hPRPH、hCHAT及hCCKAR之mRNA之表現量之條形圖。圖60係表示由hCCKAR表現iPS細胞製備之誘導第40天之細胞之Hoechst染色圖像(上)、使用抗CCKAR抗體之螢光免疫染色圖像(中央)及使用抗CCKAR抗體＋抗MAP2抗體之螢光免疫染色圖像(下)之圖。圖61係表示添加有或未添加CCK-33之條件下之由hCCKAR表現iPS細胞製備之誘導第27天的細胞之細胞外電位熱圖之圖。圖62係表示添加有或未添加CCK-33之條件下之由hCCKAR表現iPS細胞製備之誘導第27天的細胞之放電頻度之變化率之條形圖。圖63係表示由hCCKAR表現iPS細胞製備之誘導第40天之細胞的鈣成像之結果之圖。(上)為剛添加CCK-33(自測定開始起200秒時點)後之細胞之螢光圖像，(下)為3個細胞(細胞1～3)之螢光強度(強度(ΔF/F0))之經時變化。圖64係表示添加有或未添加CCK-33之條件下之由hCCKAR表現iPS細胞製備之誘導第34天的細胞之鈣成像中之螢光強度之變化率的條形圖。圖65係表示使hGLP1R基因於分化後強制表現之副交感神經細胞(誘導第40天)之Hoechst染色圖像(上)、使用抗ChAT抗體之螢光免疫染色圖像(中央)及使用抗GLP1R抗體之螢光免疫染色圖像(下)之圖。圖66係表示使hGLP1R於分化後強制表現之副交感神經細胞(誘導第30天)之細胞的鈣成像之結果之圖。(上)為剛添加GLP1(自測定開始起125秒時點)後之細胞之螢光圖像，(下)為3個細胞(細胞1～3)之螢光強度(強度(ΔF/F0))之經時變化。圖67係表示使hNPY2R基因於分化後強制表現之副交感神經細胞(誘導第40天)之Hoechst染色圖像(上)、使用抗ChAT抗體之螢光免疫染色圖像(中央)及使用抗NPY2R抗體之螢光免疫染色圖像(下)之圖。圖68係表示使hNPY2R於分化後強制表現之副交感神經細胞(誘導第45天)之細胞的鈣成像之結果之圖。(上)為剛添加PYY(自測定開始起125秒時點)後之細胞之螢光圖像，(下)為3個細胞(細胞1～3)之螢光強度(強度(ΔF/F0))之經時變化。圖69係表示使hGLP2R基因於分化後強制表現之副交感神經細胞(誘導第40天)中之hPRPH、hCHAT及hGLP2R的mRNA之表現量之條形圖。圖70係表示使hGLP2R基因於分化後強制表現之副交感神經細胞(誘導第40天)之Hoechst染色圖像(上)、使用抗GLP2R抗體之螢光免疫染色圖像(中央)及使用抗MAP2抗體之螢光免疫染色圖像(下)之圖。圖71係表示使hGLP2R於分化後強制表現之副交感神經細胞(誘導第37天)之細胞的鈣成像之結果之圖。(上)為剛添加GLP2(自測定開始起240秒時點)後之細胞之螢光圖像，(下)為3個細胞(細胞1～3)之螢光強度(強度(ΔF/F0))之經時變化。圖72係表示添加有或未添加GLP2之條件下之使hGLP2R基因於分化後強制表現之副交感神經細胞(誘導第37天)的放電強度之變化率之條形圖。圖73係表示使hHTR3A基因於分化後強制表現之副交感神經細胞(誘導第40天)中之hPRPH、hCHAT及hHTR3A的mRNA之表現量之條形圖。圖74係表示使hHTR3A基因於分化後強制表現之副交感神經細胞(誘導第40天)之Hoechst染色圖像(上)、使用抗HTR3A抗體之螢光免疫染色圖像(中央)及使用抗MAP2抗體之螢光免疫染色圖像(下)之圖。圖75係表示使hHTR3A於分化後強制表現之副交感神經細胞(誘導第37天)之鈣成像的結果之圖。(上)為剛添加5-HT(自測定開始起240秒時點)後之細胞之螢光圖像，(下)為3個細胞(細胞1～3)之螢光強度(強度(ΔF/F0))之經時變化。圖76係表示添加有或未添加5-HT之條件下之使hHTR3A基因於分化後強制表現之副交感神經細胞(誘導第37天)的放電強度之變化率之條形圖。圖77係表示使hCCKAR基因於分化後強制表現之副交感神經細胞(誘導第40天)中之hPRPH、hCHAT及hCCKAR的mRNA之表現量之條形圖。圖78係表示使hCCKAR基因於分化後強制表現之副交感神經細胞(誘導第40天)之Hoechst染色圖像(上)、使用抗CCKAR抗體之螢光免疫染色圖像(中央)及使用抗MAP2抗體之螢光免疫染色圖像(下)之圖。圖79係表示使hCCKAR於分化後強制表現之副交感神經細胞(誘導第37天)之鈣成像的結果之圖。(上)為剛添加CCK-33(自測定開始起240秒時點)後之細胞之螢光圖像，(下)為3個細胞(細胞1～3)之螢光強度(強度(ΔF/F0))之經時變化。圖80係表示添加有或未添加CCK-33之條件下之使hCCKAR基因於分化後強制表現之副交感神經細胞(誘導第37天)的放電強度之變化率之條形圖。圖81係表示hGLP1R表現副交感神經細胞及NCI-H716細胞之共培養之使用抗MAP2抗體之螢光免疫染色圖像(上)、MemGlow螢光圖像(中央)、及將該等重疊而成之圖像(下)之圖。圖82係表示添加有葡萄糖之hGLP1R表現副交感神經細胞(誘導第38天)及NCI-H716細胞之共培養之鈣成像的結果之圖。(上)為剛添加葡萄糖(自測定開始起200秒時點)後之螢光圖像，(下)為3個hGLP1R表現副交感神經細胞(細胞1～3)之螢光強度(強度(ΔF/F0))之經時變化。圖83係表示添加有或未添加葡萄糖之條件下之hGLP1R表現副交感神經細胞及NCI-H716細胞之共培養中之hGLP1R表現副交感神經細胞的放電強度之變化率之條形圖。圖84係表示添加有ALA之hGLP1R表現副交感神經細胞(誘導第44天)及NCI-H716細胞之共培養的鈣成像之結果之圖。(上)為剛添加ALA(自測定開始起200秒時點)後之螢光圖像，(下)為3個hGLP1R表現副交感神經細胞(細胞1～3)之螢光強度(強度(ΔF/F0))之經時變化。圖85係表示添加有或未添加ALA之條件下之hGLP1R表現副交感神經細胞及NCI-H716細胞之共培養中之hGLP1R表現副交感神經細胞的放電強度之變化率之條形圖。圖86係表示添加有來自負載有葡萄糖之NCI-H716細胞之培養上清液的hGLP1R表現副交感神經細胞(誘導第44天)之鈣成像之結果的圖。(上)為剛添加培養上清液(自測定開始起200秒時點)後之螢光圖像，(下)為3個hGLP1R表現副交感神經細胞(細胞1～3)之螢光強度(強度(ΔF/F0))之經時變化。圖87係表示添加有或未添加負載有葡萄糖之NCI-H716細胞之培養上清液之條件下的hGLP1R表現副交感神經細胞之放電強度之變化率的條形圖。圖88係表示添加有來自負載有ALA之NCI-H716細胞培養上清液的hGLP1R表現副交感神經細胞(誘導第34天)之鈣成像之結果的圖。(上)為剛添加培養上清液(自測定開始起200秒時點)後之螢光圖像，(下)為3個hGLP1R表現副交感神經細胞(細胞1～3)之螢光強度(強度(ΔF/F0))之經時變化。圖89係表示添加有或未添加負載有ALA或葡萄糖之NCI-H716細胞之培養上清液之條件下的hGLP1R表現副交感神經細胞之放電強度之變化率的條形圖。

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Claims

一種製作擬迷走神經副交感神經細胞之方法，其包括： (a)誘導多能幹細胞向副交感神經細胞之分化之步驟；及 (b1)於上述步驟(a)之前向上述多能幹細胞導入編碼消化道激素受體之外源性核酸之步驟、或 (b2)向藉由上述步驟(a)所獲得之副交感神經細胞或其前驅細胞導入編碼消化道激素受體之外源性核酸之步驟。
如請求項1之方法，其中上述消化道激素受體選自由胰高血糖素樣肽1受體、神經肽Y2型受體、胰高血糖素樣肽2受體、血清素3受體及膽囊收縮素1受體所組成之群。
一種擬迷走神經副交感神經細胞，其係藉由如請求項1或2之方法所製作。
一種多能幹細胞，其係包含編碼消化道激素受體之外源性核酸而成。
一種擬迷走神經副交感神經細胞，其係包含編碼消化道激素受體之外源性核酸而成。
如請求項4或5之細胞，其中上述消化道激素受體選自由胰高血糖素樣肽1受體、神經肽Y2型受體、胰高血糖素樣肽2受體、血清素3受體及膽囊收縮素1受體所組成之群。
一種檢測試樣中之消化道激素受體促效劑之方法，其包括： (1)使試樣接觸如請求項3、5或6之擬迷走神經副交感神經細胞之步驟；及 (2)解析上述擬迷走神經副交感神經細胞之神經活動之步驟。
一種控制腦腸互動之物質之篩選方法，其包括： (1)於候選物質之存在下培養如請求項3、5或6之擬迷走神經副交感神經細胞之步驟；及 (2)解析上述擬迷走神經副交感神經細胞之神經活動之步驟。
一種控制腦腸互動之物質之篩選方法，其包括： (1)於候選物質之存在下培養消化道激素分泌細胞之步驟； (2)自藉由上述步驟(1)所獲得之培養物回收培養上清液之步驟； (3)使上述培養上清液接觸如請求項3、5或6之擬迷走神經副交感神經細胞之步驟；及 (4)解析上述擬迷走神經副交感神經細胞之神經活動之步驟。
一種控制腦腸互動之物質之篩選方法，其包括： (1)於候選物質之存在下將消化道激素分泌細胞與如請求項3、5或6之擬迷走神經副交感神經細胞共培養之步驟；及 (2)解析上述擬迷走神經副交感神經細胞之神經活動之步驟。
如請求項9或10之篩選方法，其中上述消化道激素分泌細胞為腸內分泌細胞。
一種腦腸互動模型，其係包括消化道激素分泌細胞與如請求項3、5或6之擬迷走神經副交感神經細胞之共培養而成。
如請求項12之腦腸互動模型，其中上述消化道激素分泌細胞為腸內分泌細胞。