KR20190116869A - 샤르코-마리-투스 질환에서 유래한 유도만능 줄기세포로부터 운동신경세포의 분화 유도 방법 - Google Patents

샤르코-마리-투스 질환에서 유래한 유도만능 줄기세포로부터 운동신경세포의 분화 유도 방법 Download PDF

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문효원
두현명
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Abstract

샤르코-마리-투스 질환(Charcot-Marie-Tooth disease, CMT) 환자의 유도만능 줄기세포로부터 운동신경세포의 분화를 유도하는 방법에 관한 것으로서, 상기 운동신경세포를 이용하여 환자에게서 나타나는 유전 질환의 약물 효과를 비임상 단계에서 직접적으로 확인할 수 있는 바, 신약 개발의 초기단계부터 전임상 분야의 대부분 단계에 활용할 수 있다.

Description

샤르코-마리-투스 질환에서 유래한 유도만능 줄기세포로부터 운동신경세포의 분화 유도 방법{Method of inducing differentiation of motor neurons from induced pluripotent stem cells derived from Charcot-Marie-Tooth disease}
샤르코-마리-투스 질환(Charcot-Marie-Tooth disease, CMT) 환자의 유도만능 줄기세포로부터 운동신경세포의 분화를 유도하는 방법에 관한 것이다.
샤르코-마리-투스 질환(Charcot-Marie-Tooth disease; CMT) 또는 유전운동감각신경병은 운동신경 및 감각 신경이 특정한 유전자 돌연변이에 의해 손상되는 질환을 말한다. 유전되는 말초신경병에는 유전운동감각신경병(Hereditary motor and sensory neuropathies; HMSN), 유전운동신경병(Hereditary motor neuropathies; HMN) 및 유전감각신경병(Hereditary sensory neuropathies; HSN)의 3개로 분류되며 유전운동감각신경병은 이중 하나이다. 1886년에 샤르코, 마리 및 투스에 의해 처음으로 보고된 후 이들의 이름을 따서 샤르코-마리-투스 질환(Charcot-Marie-Tooth disease), 또는 첫 글자를 따서 CMT라고 줄여서 부른다. 그런데, 20세기 후반에 Dyck. 등이 CMT를 유전운동감각신경병으로 바꾸어서 명명하였고, 현재는 CMT와 HMSN을 함께 사용하고 있다. 샤르코-마리-투스 질환은 유전되는 양상에 따라 상염색체 우성유전을 하는 1형, 2형, 상염색체 열성유전을 하는 4형, 상염색체 우성 및 열성유전을 하는 3형, 및 X-염색체 연관유전을 하는 CMTX형으로 나누어진다. 이 중 샤르코-마리-투스 2형 A 타입(Charcot-Marie-Tooth type 2A, CMT2A)은 축삭 이상 질환으로 현재까지 치료 약물이 없으며 신규 약물을 개발할 수 있는 비임상 실험 방법도 확립되어 있지 않다.
일 양상은 샤르코-마리-투스 질환(Charcot-Marie-Tooth disease, CMT) 환자로부터 인간 체세포를 수득하는 단계; 상기 샤르코-마리-투스 질환 환자 유래 인간 체세포에 OCT4, SOX2, KLF4 및 c-MYC의 트랜스 유전자가 삽입된 벡터를 형질전환시켜 역분화 유도만능 줄기세포를 확립하는 단계; 및 상기 확립된 유도만능 줄기세포를 소분자 억제제(small molecule inhibitor) 및 레티노산(retinoic acid)이 포함된 배지에서 배양하여 운동신경세포를 유도하는 단계; 를 포함하는 유도만능 줄기세포로부터 운동신경세포의 분화를 유도하는 방법을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 방법에 의해 분화된 운동신경세포를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 운동신경세포를 유효성분으로 포함하는 샤르코-마리-투스 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 운동신경세포에 샤르코-마리-투스 질환의 치료제 후보 물질을 처리하는 단계; 상기 후보 물질이 처리된 세포에서 샤르코-마리-투스 지표의 수준을 측정하는 단계; 및 상기 샤르코-마리-투스 지표의 수준을 대조군과 비교하여 증가 또는 감소된 후보 물질을 선별하는 단계;를 포함하는 샤르코-마리-투스 환자 맞춤형 치료제의 선별 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 샤르코-마리-투스 질환(Charcot-Marie-Tooth disease, CMT) 환자로부터 인간 체세포를 수득하는 단계; 상기 샤르코-마리-투스 질환 환자 유래 인간 체세포에 OCT4, SOX2, KLF4 및 c-MYC의 트랜스 유전자가 삽입된 벡터를 형질전환시켜 역분화 유도만능 줄기세포를 확립하는 단계; 및 상기 확립된 유도만능 줄기세포를 소분자 억제제(small molecule inhibitor) 및 레티노산(retinoic acid)이 포함된 배지에서 배양하여 운동신경세포를 유도하는 단계; 를 포함하는 유도만능 줄기세포로부터 운동신경세포의 분화를 유도하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 용어, "유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)"는 이미 분화된 세포들로부터 인위적인 역분화 과정을 통해 다능성 분화능을 가지도록 유도된 세포를 지칭하는 것으로, 역분화 줄기세포 또는 유도만능 줄기세포라고도 한다. 상기 역분화 유도만능 줄기세포는 배아줄기세포와 유사한 특성을 가지며, 구체적으로 세포모양, 유전자, 단백질 발현 패턴이 유사하다. 또한, 다능성 분화능을 가지는 iPSC는 in vitro에서 전분화능 마커 단백질의 발현을 확인할 수 있으며, in vivo 에서 기형종 형성을 나타낸다. 특히, 생쥐의 배반포(blastocyst)에 상기 iPSC를 삽입시켰을 때, 키메라(chimera) 생쥐를 형성하고, 유전자의 생식선 전이(germline transmission)이 가능하다. 일 양상의 iPSC는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등의 모든 유래의 iPSC를 포함할 수 있다. 예를 들어, 인간 유래의 iPSC일 수 있으며, 샤르코-마리-투스 질환 환자, 구체적으로, 2형 A 타입 환자로부터 유래한 iPS를 포함할 수 있다.
일 구체예에 따른 방법은 샤르코-마리-투스 질환 환자로부터 인간 체세포를 수득하는 단계를 포함한다. 상기 인간 체세포는 섬유아세포일 수 있으며, 체세포를 수득하는 방법은 체세포를 수득하기 위한 통상적인 방법을 이용할 수 있다.
일 구체예에 따른 방법은 상기 샤르코-마리-투스 질환 환자 유래 인간 체세포에 OCT4, SOX2, KLF4 및 c-MYC의 트랜스 유전자가 삽입된 벡터를 형질전환시켜 역분화 유도만능 줄기세포를 확립하는 단계를 포함한다. 구체적으로, 트랜스 유전자(transgene)는 한 생물체에서 다른 생물체로 자연적인 이동에 의하거나 유전공학 기술에 의해 옮겨지는 유전자 또는 유전물질로서, 한 생물체에서 분리하여 다른 생물체에 도입하는 유전자 서열을 포함하는 DNA 세그먼트이다. 상기 트랜스 유전자로서 사용되는 OCT4, SOX2, KLF4 및 c-MYC는 본래 분화된 세포에서 역분화 유도만능 줄기세포로 역분화시키는 역할을 한다. 이때, 상기 역분화란 존재하는 분화된 세포들을 미분화 상태로 되돌려 새로운 분화 조직 형성이 가능하도록 하는 후성학적인 역행과정을 의미하는 것으로 리프로그래밍(reprogramming) 과정이라고도 하며, 세포 유전체의 후성학적인 변형(epigenetics changes)의 가역성에 기초한 것이다. 상기 역분화는 0% 내지 100%의 분화능을 가지는 분화된 세포들을 미분화 상태로 되돌리는 과정을 포함할 수 있고, 예를 들어, 0%의 분화능을 가지는 분화된 세포를 1%의 분화능을 가지는 분화된 세포로 미분화 시키는 과정을 포함할 수 있다. 또한, 상기 벡터는 센다이 바이러스, 레트로바이러스, 및 렌티바이러스를 이용한 바이러스-매개 또는 비바이러스성 벡터를 이용할 수 있다. 또한, 형질전환 후 상기 역분화 유도만능 줄기세포를 얻기 위해 상기 인간 체세포 배양용 배지는, 예를 들어, Eagles's MEM, α-MEM, Iscove's MEM, CMRL 1066, RPMI 1640, F12, F10, DMEM 등과 같은 통상적인 배지를 사용할 수 있다.
일 구체예에 따른 방법은 상기 확립된 유도만능 줄기세포를 소분자 억제제(small molecule inhibitor) 및 레티노산(retinoic acid)이 포함된 배지에서 배양하여 운동신경세포를 유도하는 단계를 포함한다. 구체적으로, 상기 운동신경세포를 유도하는 단계는 유도만능 줄기세포를 신경계 전구세포로 유도하는 단계; 및 상기 신경계 전구세포를 운동 신경 전구세포로 유도하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 소분자 억제제는 BMP 억제제 또는 소분자 TGFβ 패밀리 억제제일 수 있다. 상기 BMP 억제제는 BMP(bone morphogenic protein)의 BMP 수용체(타입 Ⅰ또는 타입 Ⅱ)로의 결합을 매개하는 BMP 신호의 억제와 연관된 소분자 억제제이나, 천역 억제제인 노긴(Noggin), 코딘(chordin), 폴리스타틴(follistatin) 또는 이와 유사한 것들과 같은 단백질 억제제와는 다르다. 이때, 소분자(small molecule)란, 유기 또는 무기 분자를 의미하고 큰 단백질(예를 들어, 분자량이 2,000, 30,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000 또는 10,000을 넘는 핵산), 또는 큰 다당류(예를 들어, 분자량이 2,000, 30,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000 또는 10,000을 넘는 다당류)와 같은 고분자를 포함하지 않는다. 상기 억제제는 만능줄기세포의 신경전구세포로의 분화를 유도하는 효과를 가지고 있어야 하며, 예를 들어, 퍼모프아민(Purmorphamine), 돌소몰핀(Dorsomorphine)과 같은 전사인자, SMAD1, SMAD5 또는 SMAD8를 활성화시킬 수 있는 BMP2, BMP4, BMP6, 또는 BMP7를 억제하는 화합물 및 이의 유도체를 포함할 수 있다.
또한, 상기 TGFβ 패밀리 억제제는 TGFβ 패밀리의 신호를 방해하는 소분자 억제제를 의미하며, 예를 들어, CHIR99021, SB431542, Compound E, NPC30345, SD093, SD908, SD208, LY2109761, LY364947, LY580276를 포함할 수 있다. TGFβ 패밀리 구성원은 유사분열, 세포분화, 배아 패선 형성(embryonic pattern formation) 및 기관형성(organogenesis)과 같은 세포 과정 및 발달 과정을 조절한다. 예를 들어, TGFβ 신호는 세린-트레오닌 카이나제 수용체(serine-threonine kinase receptor) 타입 Ⅰ 및 타입 Ⅱ의 이형 수용체 복합체(heteromeric receptor complex)를 통해서 수행된다. 상기 복합체는 하위 Smad 신호(downstream Smad signaling) 과정을 활성화하는데, 구체적으로, TGFβ가 수용체 복합체와 결합하였을 때, TGFβ 타입 Ⅱ 수용체는 TGFβ 타입 Ⅰ 수용체를 인산화학, 그 후에 TGFβ 타입 Ⅰ 수용체는 수용체-매개 Smad(R-Smad)를 인산화하여 하위 반응(downstream response)이 시작되게 한다. 활성화된 R-Smad 및 Smad4는 다형 복합체를 형성하여 활성화된 R-Smad가 핵으로 전이될 수 있고, 그 후에 대상 유전자의 전사적 조절이 유도된다. 이러한 TGFβ 패밀리 신호가 억제되면, 만능줄기세포의 신경전구세포로의 분화가 유도된다. 또한, 상기 BMP 신호가 억제되면, 신경전구세포의 유도 속도가 증가할 뿐만 아니라, 미분화세포(즉, 만능줄기세포)의 잔여 비율이 더 줄어들게 되므로 신경전구세포로의 전환 속도가 증가하게 된다.
상기 신경계 전구세포 유도는 상기 유도만능 줄기세포를 CHIR99021 및 SB431542이 포함된 배지에서 배양하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 CHIR99021 및 SB431542는 1:10 내지 10:1의 비율로 혼합할 수 있고, 예를 들어, 1:10 내지 10:1, 1:8 내지 8:1, 1:7 내지 7:1, 2:5 내지 5:2, 1.5: 6 내지 6: 1.5, 또는 2:3 내지 3:2일 수 있다. 이때, 혼합 비율이 상기 범위 미만인 경우, 내배엽 분화를 유도한다는 문제점이 있고, 상기 범위를 초과하는 경우, 중배엽 분화를 유도한다는 문제점이 있다. 또한, 상기 배지는 B27 보충제(supplements) 및/또는 아스코르브산(ascorbic acid)이 추가로 포함될 수 있다. 이때, 상기 B27 보충제는 세포 안정성 및 세포 성장을 위한 것이고, 상기 아스코르브산은 신경세포 유전자의 발현을 증가시키기 위한 것으로서, 상기 B27 보충제 및/또는 아스코르브산을 추가로 포함함으로써, 신경세포의 안정성을 유지하면서, 신경세포 유전자의 발현을 촉진시킬 수 있다는 이점이 있다.
또한, 상기 운동 신경 전구세포 유도는 상기 신경계 전구세포를 레티노산 및 퍼모프아민이 포함된 배지에서 배양하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 레티노산 및 퍼모프아민은 1:10 내지 10:1의 비율로 혼합할 수 있고, 예를 들어, 1:10 내지 10:1, 1:8 내지 8:1, 1:7 내지 7:1, 2:5 내지 5:2, 1.5: 6 내지 6: 1.5, 또는 2:3 내지 3:2일 수 있다. 이때, 혼합 비율이 상기 범위 미만인 경우, 중추신경의 분화를 유도한다는 문제점이 있고, 상기 범위를 초과하는 경우, 신경세포 분화에 적합하지 않다는 문제점이 있다. 또한, 상기 운동 신경 전구세포를 레티노산 및 Compound E가 포함된 배지에서 추가 배양할 수 있다. 구체적으로, 상기 레티노산 및 Compound E는 1:10 내지 10:1의 비율로 혼합할 수 있고, 예를 들어, 1:10 내지 10:1, 1:8 내지 8:1, 1:7 내지 7:1, 2:5 내지 5:2, 1.5: 6 내지 6: 1.5, 또는 2:3 내지 3:2일 수 있다. 이때, 혼합 비율이 상기 범위 미만인 경우, 분화를 유도하기에 충분하지 않다는 문제점이 있고, 상기 범위를 초과하는 경우, 중추신경의 분화를 유도한다는 문제점이 있다.
또한, 상기 배양은 예를 들어, 서스팬션 배양(suspension culture)(예를 들어, 분산 배양(dispersion culture)및 응집-서스팬션 배양(aggregation-suspension culture)과 같은 비부착 조건(non-adhension conditions)하에서의 3차원 배양(three-dimensional culture)을 포함할 수 있다. 배양 조건에 있어서, 배양 온도는 예를 들어, 30℃ 내지 40℃, 30 ℃ 내지 38℃, 32℃ 내지 37℃, 또는 33℃ 내지 36℃일 수 있으며, 배양은 CO2 함유 공기의 대기에서 수행될 수 있고, 상기 CO2 농도는, 예를 들어, 2% 내지 7%, 2 내지 5%, 또는 3% 내지 6%일 수 있다. 또한, 배양 시간은, 예를 들어, 7일 내지 21일, 7일 내지 17일, 7일 내지 15일, 9일 내지 15일, 또는 10일 내지 14일 일 수 있다.
다른 양상은 상기 방법에 의해 분화된 운동신경세포를 제공한다. 상기 방법의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다. 상기 운동신경세포는 샤르코-마리-투스 질환 환자, 구체적으로, 샤르코-마리-투스 2형 A 타입 환자 유래 역분화 유도만능 줄기세포로부터 분화된 것으로서, 샤르코-마리-투스 질환의 치료제에 대한 스크리닝 용도를 포함하여 재생의학 분야에 효과적으로 활용될 수 있다.
또 다른 양상은 상기 운동신경세포를 유효성분으로 포함하는 샤르코-마리-투스 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 운동신경세포의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다. 상기 조성물은 샤르코-마리-투스 질환 환자, 구체적으로, 샤르코-마리-투스 2형 A 타입 환자 유래 역분화 유도만능 줄기세포를 이용한 것으로서, 환자 맞춤형 치료 약물을 제공할 수 있는 이점이 있다.
일 양상에 따른 샤르코-마리-투스 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구제 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화되어 사용할 수 있고, 제형화를 위하여 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
상기 담체 또는, 부형제 또는 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리게이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조할 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제는 상기 운동신경세포에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제조할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다.
경구를 위한 액상 제제로는 현탁액, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용하는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등을 사용할 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등을 사용할 수 있다.
일 양상에 따른 샤르코-마리-투스 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서는 1일 0.0001 내지 2,000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 2,000 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어서 투여할 수도 있다. 다만, 상기 투여량에 의해서 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
일 양상에 따른 샤르코-마리-투스 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유 동물에 다양한 경로로 투여할 수 있다. 투여의 모든 방식은 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해서 투여할 수 있다.
또 다른 양상은 상기 운동신경세포에 샤르코-마리-투스 질환의 치료제 후보 물질을 처리하는 단계; 상기 후보 물질이 처리된 세포에서 샤르코-마리-투스 지표의 수준을 측정하는 단계; 및 상기 샤르코-마리-투스 지표의 수준을 대조군과 비교하여 증가 또는 감소된 후보 물질을 선별하는 단계;를 포함하는 샤르코-마리-투스 환자 맞춤형 치료제의 선별 방법을 제공한다. 상기 운동신경세포의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다. 또한, 상기 샤르코-마리-투스 질환은 CMT 1형, CMT 2형, CMT3형, CMT 4형, 또는 CMTX형 일 수 있으며, 구체적으로, 2형 A 타입일 수 있다.
일 구체예에 따른 방법은 운동신경세포에 샤르코-마리-투스 질환의 치료제 후보 물질을 처리하는 단계를 포함한다. 구체적으로, 상기 샤르코-마리-투스 질환의 치료제 후보 물질로는 히스톤 디아세틸라제 6(Histone deacetylase 6, HDAC6) 억제제인 트리코스타틴(Trichostatin), 투바신(Tubacin) 및 투바스타틴 A(tubastatin A) 일 수 있으며, 샤르코-마리-투스 환자 유래 유도만능 줄기세포를 이용하여 개발된 세포 치료제일 수 있다. 또한, 상기 후보 물질의 세포독성(cytotoxicity) 수준을 측정하기 위해 정상 대조군과 샤르코-마리-투스 환자 유래 신경세포에 후보 물질을 농도-의존(dose-dependent)적으로 처리하여 세포의 생존을 저해하지 않는 수준의 약물 농도를 결정할 수 있으며, 상기 세포의 생존력을 평가하기 위한 방법으로 3-(4,5-dimethylthia-zol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) test를 이용할 수 있다.
일 구체예에 따른 방법은 상기 후보 물질이 처리된 세포에서 샤르코-마리-투스 지표의 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 구체적으로, 상기 세포에 샤르코-마리-투스 치료제 후보 물질을 처리하였을 때, 상기 샤르코-마리-투스 지표를 측정하여 후보 물질이 샤르코-마리-투스에 대하여 나타내는 약물 효용성을 확인할 수 있다.
일 구체예에 따른 방법은 상기 샤르코-마리-투스 지표의 수준을 대조군과 비교하여 증가 또는 감소된 후보 물질을 선별하는 단계를 포함한다. 또한, 상기 선별된 후보 물질을 상기 운동신경세포에 처리하여 상기 후보 물질의 효과를 확인할 수 있다.
상기한 바와 같이, 일 양상에 따른 운동신경세포는 샤르코-마리-투스 질환 환자, 구체적으로, 샤르코-마리-투스 2형 A 타입 환자 유래 역분화 유도만능 줄기세포로부터 분화된 것으로서, 샤르코-마리-투스 질환의 치료제 후보 물질을 직접 환자에게 투여하지 않고, 비임상 단계에서 직접적으로 약물을 처리하여 나타나는 샤르코-마리-투스 지표 수준의 증가 또는 감소를 확인할 수 있는바, 신약개발 초기단계부터 전임상 분야의 대부분 단계에서 활용 가능하며, 환자 맞춤형 약물의 개발에 이용될 수 있다.
일 양상에 따른 방법은 샤르코-마리-투스 질환 환자로부터 유래된 역분화 유도만능 줄기세포로부터 제조된 운동신경세포를 이용하여 환자에게서 나타나는 유전 질환의 약물 효과를 비임상 단계에서 직접적으로 확인할 수 있는 바, 신약 개발의 초기단계부터 전임상 분야의 대부분 단계에 활용할 수 있다.
도 1은 일 구체예의 분화방법 모식도를 나타낸 그림이다.
도 2는 환자 기원 섬유아세포 분리 정제를 나타낸 사진이다.
도 3은 환자 기원 유도만능 줄기세포 확립을 나타낸 사진이다.
도 4는 운동신경세포 분화를 나타낸 사진이다.
도 5는 분화된 운동 신경세포의 특성을 확인한 사진이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 피부 생검(skin biopsy)을 통한 환자 유래 세포 분리
삼성서울병원 기관생명윤리위원회(institutional review board)의 승인심사를 거쳐 정상 피부 조직 및 RAB7(RAB7A, RAB7B) 유전자의 c.280C>T (p. R94W) 변이를 포함하는 CMT 2A(Charcot-Marie-Tooth type 2A, CMT2A) 환자의 피부 조직을 수득하였다. 구체적으로, 정상대조군 및 환자군에 대해 국소마취 후 피부 생검을 시행하였다. 상기 방법에 의해 얻어진 피부조직을 작은 조각으로 자른 후, 0.1% 젤라틴으로 코팅된 배양접시에서 부착하여 2주일 동안 배양하였다. 이후, Trypsin EDTA로 계대배양을 진행하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 배양 후 3일이 지난 후 각질형성세포(keratinocyte)가 주변부에 형성된 것을 확인할 수 있었다. 배양 7일 후, 섬유아세포(fibroblast)가 형성되었으며, 배양 2주 차에는 전체 면적의 80% 가까이 섬유아세포가 증식된 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2. CMT 환자 유래 유도-만능 줄기세포(induced puripotentstem cells, iPSC) 의 제조
상기 실시예 1에서 수득한 CMT 환자 피부 생검의 섬유아세포(fibroblast)로부터 신경세포분화를 위한 유도만능줄기세포(iPSCs)를 제조하기 위해 정상대조군 및 환자군의 섬유아세포에 4종류의 전사인자(Klfo, Oct3/4, Sox2, c-Myc)가 포함된 센다이 바이러스 시스템(Cell biolabs 社, 미국)을 사용하여 형질도입(transduction) 하였다. 이때 사용한 센다이 바이러스의 벡터는 호스트 게놈에 삽입되지 않고 수차례의 계대배양 후에 사라지므로 보다 안정한 iPSC를 생성할 수 있다. 센다이바이러스의 양은 MOI(multiplicity of infection) 3으로 하였고, 하룻밤 동안(overnight) 센다이바이러스에 감염한 다음, 상기 CMT 환자 피부 생검의 섬유아세포 배양 배지를 10% 우태아혈정이 포함된 DMEM 배지로 교체하고 6일 동안 배양하여 안정화하였다. 이후, 세포를 mitomycin C(Invitrogen)를 처리한 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblast, MEF)인 SNL 지지세포(feeder cells; Cell Biolabs 社, 미국)으로 옮기고, 4ng/㎖의 bFGF를 첨가한 ESC/iPSC 배지(KnockoutTM 社, 미국)와 혼합하여 매일 새로운 배지로 교체하면서 배양하였다. 센다이바이러스 감염 후 약 30일 후, iPSC의 형태에 맞는 세포 집락을 선택하여 분리하였다.
실시예 3. 신경계 전구세포로의 분화 유도
인체 발생할적 단계를 바탕으로 정의하면, 외배엽 세포는 대표적으로 신경계와 피부 조직을 형성한다. 신경세포 중 말초 신경계 세포는 중추 신경 세포 분화와 달리, 신경 중배엽 세포를 거쳐 직접적으로 척추 운동세포로 분화가 진행되므로, 말초 신경 연구를 위하여 척추 운동 신경세포의 분화를 효과적으로 유도하는데 중점을 두었다. 구체적으로, 신경중배엽 분화 단계로 높은 효율로 정제된 미분화 세포 부유체 및 부유 배양이 가능한 배양 접시(60 ㎜)에 1x106 cells 단일 세포와 분화 유도 인자인 소분자 물질 CHIR99021 3μM 및 SB431542 2μM를 neurobasal medium 및 DMEMF/12를 1:1의 비율로 섞은 배지에 첨가하여 5일 동안 배양하였다.
실시예 4. 운동신경 전구세포로의 분화 유도
상기 실시예 3에서 수득한 신경계 전구세포를 척추 운동신경 전구세포로의 분화를 유도하기 위하여 레티노산 0.5 μM 및 퍼모프아민 1 μM을 포함한 neurobasal medium에 첨가하여 2일 동안 배양하였다.
실시예 5. 운동 신경세포로의 분화 유도
상기 실시예 4에서 수득한 운동신경 전구세포를 레티노산 0.5 μM 및 퍼모포아민 2 μM가 첨가된 neurobasal 배지에서 2일 동안 부유 배양하여 미성숙한 운동 신경세포로의 분화를 유도하였다. 이후, 형성된 부유체를 Accumax를 사용하여 단일세포로 분리한 후, 라미닌(laminin)이 코팅된 배양 접시에 부착시켜 레티노산 0.5 μM 및 Compound E 0.1 μM가 포함된 neurobasal 배지에서 12일 동안 배양하여 성숙한 운동 신경세포의 분화를 유도하였다.
[실험예]
분화된 운동 신경세포의 특성 확인
상기 실시예 4에서 최종 분화된 운동 신경세포의 특성을 확인하기 위하여, 뉴런 마커 단백질 발현 및 운동신경세포 특이적 마커의 발현을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 4에서 최종 분화된 운동 신경세포를 젤라틴이 코팅된 슬라이드 배양 용기(chamber slide, Lab-Tek Ⅱ)에 SNL 세포와 일주일 동안 혼합 배양하였다. 이후, 4% 파라포름알데히드로 고정하고, 10% normal goat serum(NGS; Gibco社, 미국) 및 0.2% triton X-100을 처리하여 면역세포염색법으로 확인하였다. 사용한 1차 항체는 항-TUJ1 항체, 항-Neurofilament 항체이며, 적절한 Gy3-결합된 염소 유래 항-마우스 IgG 2차 항체 및 DAPI 대비 염색체를 사용하여 시각화에 이용하였다.
또한, 운동신경세포 특이적 마커인 Map2, islet1, CHAT 단백질의 발현도 상기와 동일한 방법으로 확인하였다. 구체적으로, 항-Map2 항체, 항-islet1 항체, 항-CHAT 항체를 사용하였고, 2차 항체로는 FITC-결합된 거위 항-마우스 IgG 및 Cy3-결합된 염소 항-토끼 IgG 및 Cy3-결합된 염소 항-마우스 IgG 항체를 사용하였으며, DAPI 대비 염색체를 시각화에 이용하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 분화된 운동 뉴런 세포는 운동 뉴런 마커 단백질인 TUJ1, Neurofilament 및 운동신경세포 특이적 마커 단백질인 Map2, islet1, CHAT를 유의적으로 발현하는 것을 확인할 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (15)

  1. 샤르코-마리-투스 질환(Charcot-Marie-Tooth disease, CMT) 환자로부터 인간 체세포를 수득하는 단계;
    상기 샤르코-마리-투스 질환 환자 유래 인간 체세포에 OCT4, SOX2, KLF4 및 c-MYC의 트랜스 유전자가 삽입된 벡터를 형질전환시켜 역분화 유도만능 줄기세포를 확립하는 단계; 및
    상기 확립된 유도만능 줄기세포를 소분자 억제제(small molecule inhibitor) 및 레티노산(retinoic acid)이 포함된 배지에서 배양하여 운동신경세포를 유도하는 단계; 를 포함하는 유도만능 줄기세포로부터 운동신경세포의 분화를 유도하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 샤르코-마리-투스 질환은 CMT 2형 A 타입(Charcot-Marie-Tooth type 2A, CMT2A)인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 소분자 억제제는 소분자 BMP 억제제 또는 소분자 TGFβ 패밀리 억제제인 것인 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 운동신경세포를 유도하는 단계는 유도만능 줄기세포를 신경계 전구세포로 유도하는 단계; 및
    상기 신경계 전구세포를 운동 신경 전구세포로 유도하는 단계;를 포함하는 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 운동 신경 전구세포를 레티노산 및 Compound E가 포함된 배지에서 추가 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  6. 청구항 4에 있어서, 상기 신경계 전구세포 유도는 상기 유도만능 줄기세포를 CHIR99021 및 SB431542 이 포함된 배지에서 배양하는 것인 방법.
  7. 청구항 4에 있어서, 상기 CHIR99021 및 SB431542 는 1:10 내지 10:1의 비율로 혼합된 것인 방법.
  8. 청구항 6에 있어서, 상기 배지는 B27 보충제(supplements) 및/또는 아스코르브산(ascorbic acid)이 추가로 포함되는 것인 방법.
  9. 청구항 4에 있어서, 상기 운동 신경 전구세포 유도는 상기 신경계 전구세포를 레티노산 및 퍼모프아민(purmorphamine)이 포함된 배지에서 배양하는 것인 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 레티노산 및 퍼모프아민은 1:10 내지 10:1의 비율로 혼합된 것인 방법.
  11. 청구항 1의 방법에 의해 분화된 운동신경세포.
  12. 청구항 11의 운동신경세포를 유효성분으로 포함하는 샤르코-마리-투스 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 샤르코-마리-투스 질환은 CMT 2형 A 타입인 것인 조성물.
  14. 청구항 11의 운동신경세포에 샤르코-마리-투스 질환의 치료제 후보 물질을 처리하는 단계;
    상기 후보 물질이 처리된 세포에서 샤르코-마리-투스 지표의 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 샤르코-마리-투스 지표의 수준을 대조군과 비교하여 증가 또는 감소된 후보 물질을 선별하는 단계;를 포함하는 샤르코-마리-투스 환자 맞춤형 치료제의 선별 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 선별된 후보 물질을 청구항 11의 운동신경세포에 처리하여 상기 후보 물질의 효과를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.





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