CN110157660A - 诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的诱导培养基和方法、成纤维细胞及应用 - Google Patents

诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的诱导培养基和方法、成纤维细胞及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的诱导培养基和方法、成纤维细胞及应用，涉及细胞工程领域。该诱导培养基包含基础培养基、血小板裂解液和TGF‑β信号通路抑制剂。该诱导培养基能够激活皮肤成纤维细胞的脂肪分化潜能并在脂肪分化的过程中分泌抗菌肽。使用该诱导培养基诱导成纤维细胞分泌抗菌肽，操作简单，可操控性强，缓解了现有技术中存在的缺乏一种获得能够体外分泌抗菌肽的成纤维细胞的问题。

Description

诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的诱导培养基和方法、成纤维细 胞及应用
技术领域
本发明涉及细胞工程领域，尤其是涉及一种诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的诱导培养基和方法、成纤维细胞及应用。
背景技术
人类皮肤成纤维细胞，位于皮肤真皮层，是起源于间质的一种具有一定分化潜能的细胞。目前认为皮肤成纤维细胞具有分泌胶原蛋白，弹性纤维等多种细胞外基质的功能，因此在医疗整形美容，皮肤损伤修复领域有着广泛的应用。
最新研究表明，皮肤成纤维细胞具有分化为皮肤真皮部位的脂肪的分化潜能，并且在分化过程中能分泌抗菌肽，对皮肤的先天免疫功能至关重要。抗菌肽是一种新型的抗菌类蛋白质，具有人体内天然成分，无耐药性，抗菌谱广泛等多种优势。但抗菌肽是生物大分子，不能直接通过皮肤吸收。
炎症性皮肤问题主要通过两类方法缓解，分别是外用或口服抗生素，外用或口服激素或者抗激素类药物。抗生素和激素类药物治疗存在耐药性，副作用较强，个体差异大等缺点。这两类治疗方法都存治疗周期长，有效期短，不能根治等缺点，尤其是当使用抗生素治疗时，随着抗生素使用的增加，各种耐药性细菌的产生使抗生素治疗的效果越来越差。而抗菌肽本身是生物大分子，如果外用涂抹，不能通过皮肤吸收，口服则导致抗菌肽降解。直接移植后的皮肤成纤维细胞不能分泌抗菌肽，对缓解炎症性皮肤问题没有效果。因此一种诱导皮肤成纤维细胞分泌抗菌肽的方法是对缓解皮肤问题是十分有意义的。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的诱导培养基，该诱导培养基能够激活皮肤成纤维细胞的脂肪分化潜能，并分泌抗菌肽。
本发明的第二目的在于提供一种诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的方法，缓解了现有技术中存在的缺乏一种获得能够体外分泌抗菌肽的成纤维细胞的问题。
本发明的第三目的在于提供一种采用上述诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的方法制备得到的成纤维细胞。
本发明的第四目的在于提供一种上述诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的诱导培养基，上述诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的方法，或上述成纤维细胞的应用。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的诱导培养基，该诱导培养基包含基础培养基、血小板裂解液和TGF-β信号通路抑制剂。
优选地，所述基础培养基包括高糖DMEM/F12；
优选地，所述TGF-β信号通路抑制剂包括SB431542。
优选地，按照体积百分比计，所述诱导培养基包含90％～95％的高糖DMEM/F12和5％～10％的血小板裂解液；所述诱导培养基还包含终浓度为2～3μmol/L的SB431542；
优选地，按照体积百分比计，所述诱导培养基包含92.5％～95％的高糖DMEM/F12和5％～7.5％的血小板裂解液；所述诱导培养基还包含终浓度为2～3μmol/L的SB431542；
优选地，按照体积百分比计，所述诱导培养基包含95％的高糖DMEM/F12和5％的血小板裂解液；所述诱导培养基还包含终浓度为2.5μmol/L的SB431542。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的方法，该方法包括使用上述诱导培养基培养成纤维细胞，以诱导成纤维细胞分泌抗菌肽；
优选地，所述成纤维细胞的汇合度为45％～55％时，使用所述诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的诱导培养基培养成纤维细胞；
优选地，使用所述诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的诱导培养基培养成纤维细胞至汇合度为85％～95％时，停止诱导。
优选地，所述成纤维细胞的制备方法如下：将去除了皮下组织和血管的皮肤组织在成纤维细胞培养基中培养至成纤维细胞迁出，并且成纤维细胞的汇合度达到75％～85％时传代，以获得成纤维细胞；
优选地，所述成纤维细胞培养基包括基础培养基和血小板裂解液；
优选地，按照体积百分比计，所述成纤维细胞培养基包含90％～95％的高糖DMEM/F12和5％～10％的血小板裂解液；
优选地，按照体积百分比计，所述成纤维细胞培养基包含92.5％～95％的高糖DMEM/F12和5％～7.5％的血小板裂解液；
优选地，按照体积百分比计，所述成纤维细胞培养基包含95％的高糖DMEM/F12和5％的血小板裂解液。
优选地，在使用所述诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的诱导培养基培养成纤维细胞前，先将成纤维细胞重悬，计数后以0.5×104/cm2～1.5×104/cm2的细胞密度接种于培养容器中，以用于诱导产生抗菌肽。
优选地，诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的方法包括如下步骤：
(a)使用缓冲液清洗浸泡过抗生素的皮肤组织至少三次，所述缓冲液包括生理盐水或PBS，然后去除皮肤组织中的皮下组织和血管；将除去皮下组织和血管的剩余组织在成纤维细胞培养基中浸润并剪碎后将每个皮下组织块接种于培养容器中培养；然后加入在成纤维细胞培养基培养至成纤维细胞迁出，当成纤维细胞的汇合度达到75％～85％时传代培养；
(b)在使用所述诱导培养基诱导成纤维细胞前，弃成纤维细胞培养基，D-PBS清洗贴壁的成纤维细胞后使用Accutase消化成纤维细胞并将成纤维细胞重悬，计数后以0.5×104/cm2～1.5×104/cm2的细胞密度接种于培养容器中，继续在成纤维细胞培养基中培养；
(c)当成纤维细胞的汇合度为45％～55％时，弃成纤维细胞培养基，D-PBS清洗成纤维细胞后加入所述诱导培养基培养成纤维细胞至细胞的汇合度为85％～95％时，停止诱导。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种采用上述诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的方法制备得到的成纤维细胞。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种上述诱导培养基，上述诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的方法，或上述成纤维细胞在如下(x1)～(x3)中至少一种的应用：
(x1)制备抗菌肽；
(x2)制备用于治疗皮肤类疾病的药品；
(x3)制备用于改善皮肤状态的产品。
优选地，所述制备用于治疗皮肤类疾病的药品和所述用于改善皮肤状态的产品以分泌抗菌肽的成纤维细胞作为活性物质，并通过移植至患处实现治疗作用和/或改善皮肤状态的作用；
优选地，所述成纤维细胞来源于自体皮肤组织；
优选地，所述治疗皮肤类疾病的药品包括治疗痤疮的药品。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的诱导培养基中含有血小板裂解液，能够为成纤维细胞提供生长所需的多种细胞因子，维持成纤维细胞良好的生长状态，并在诱导培养基中添加TGF-β信号通路抑制剂，以激活皮肤成纤维细胞的脂肪分化潜能，成纤维细胞在脂肪分化的过程中能够分泌抗菌肽。经过本发明诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的诱导培养基诱导的成纤维细胞具有脂肪分化的潜能，并且分泌抗菌肽的能力显著提高。
本发明提供的诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的方法，该方法包括使用上述诱导培养基培养成纤维细胞，以诱导成纤维细胞分泌抗菌肽。该方法操作简单，可操控性强，能够获得具有脂肪分化潜能和分泌抗菌肽能力的成纤维细胞。
本发明提供的采用上述诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的方法制备得到的成纤维细胞具有脂肪分化潜能和分泌抗菌肽的能力，可广泛应用于皮肤类疾病的治疗和制备用于治疗皮肤类疾病或者改善皮肤状态的产品。
本发明提供的诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的诱导培养基，诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的方法，或成纤维细胞可应用于制备抗菌肽，制备用于治疗皮肤类疾病的药品或制备用于改善皮肤状态的产品，可缓解或消除多种皮肤类疾病或改善多种皮肤问题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例6中皮肤组织的组织块贴壁10天后的形态；
图2为本发明实施例6中皮肤组织的组织块贴壁21天后的细胞形态；
图3为本发明实施例6中成纤维细胞的融合度为50％左右时的形态；
图4为本发明实施例6中成纤维细胞的融合度为90％左右时的形态；
图5为本发明实施例6中成纤维细胞诱导后6天的胞质内脂滴形态；
图6为本发明实施例6中成纤维细胞诱导后18天的油红O染色结果；
图7为本发明实施例6中成纤维细胞诱导后抗菌肽cathelidicin mRNA的表达量。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的诱导培养基，该诱导培养基中包含基础培养基、血小板裂解液和TGF-β信号通路抑制剂。
TGF-β(Transforming growth factor-β)在哺乳动物细胞生长发育过程中发挥多种作用，TGF-β信号通路控制皮肤成纤维细胞向脂肪分化，能够造成成纤维细胞失去成脂分化能力和抗菌肽分泌能力，抑制TGF-β信号通路能够激活皮肤成纤维细胞的脂肪分化潜能，促进抗菌肽的分泌。本发明所述的TGF-β信号通路抑制剂指的是能够抑制TGF-β信号通路发挥其生物学功能的物质。
所述基础培养基指的是为细胞的生长提供营养物质的培养基，所述营养物质包括但不限于为碳水化合物、氨基酸、无机盐和维生素等，并提供适宜细胞生长的pH和渗透压等生长环境、所述基础培养基包括但不限于高糖DMEM培养基、F12培养基、FM培养基和RPMI-1640培养基中的一种或者多种。
所述基础培养基中含有血小板裂解液，血小板裂解液(platelet lysate，PL)是将浓缩的血小板裂解后获得的液体成分，其中包含丰富的生长因子，包括但不限于为血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素生长因子(IGFs)和血管内皮生长因子(VEGF)等，PL弃去血小板的细胞结构，降低免疫原的同时保留了多种生长因子。
本发明提供的诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的诱导培养基中含有血小板裂解液，能够为成纤维细胞提供生长所需的多种生长因子，维持成纤维细胞良好的生长状态，并在诱导培养基中添加TGF-β信号通路抑制剂，以激活皮肤成纤维细胞的脂肪分化潜能，成纤维细胞在脂肪分化的过程中能够分泌抗菌肽。经过本发明诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的诱导培养基诱导的成纤维细胞具有脂肪分化的潜能，并且分泌抗菌肽的能力显著提高。
本发明提供的诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的诱导培养基，诱导的成纤维细胞的来源包括但不限于人或者其他哺乳类动物，具体的例如可以为但不限于为人类、牛、羊、猪、马、大鼠或小鼠等。当所述诱导培养基用于诱导来源于人的成纤维细胞时，血小板裂解液优选使用人血小板裂解液HPL，以更适于人源细胞的生长。
在一些优选的实施方式中，所述基础培养基包含高糖DMEM/F12，高糖DMEM/F12是将DMEM培养基和F12培养基以1:1结合，以利用F12含有的较丰富的营养成分和DMEM含有的较高浓度的营养成分。
在一些优选的实施方式中，所述TGF-β信号通路抑制剂包括SB431542，SB431542为4-[4-(1,3-苯并二唑-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]-苯酰胺水合物，是TGF-β-Samd2/3通路的特异性抑制剂，SB431542可以抑制Samd2/3的磷酸化，使Activin/Nodal/TGF-β信号的转导被阻断。
在一些优选的实施方式中，如下配比的诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的诱导培养基诱导效果较佳：按照体积百分比计，诱导培养基包含90％～95％的高糖DMEM/F12和5％～10％的血小板裂解液；可选地，所述高糖DMEM/F12的含量例如可以为但不限于为90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％或95％；可选地，所述血小板裂解液的含量例如可以为但不限于为5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或10％；同时诱导培养基还包含终浓度为2～3μmol/L的SB431542，所述SB431542的含量例如可以为但不限于为2μmol/L、2.1μmol/L、2.2μmol/L、2.3μmol/L、2.4μmol/L、2.5μmol/L、2.6μmol/L、2.7μmol/L、2.8μmol/L、2.9μmol/L或3.0μmol/L。
优化上述各组分的用量可以优化诱导培养基的诱导效果，因此在一些更优选的实施方式中，按照体积百分比计，所述诱导培养基包含92.5％～95％的高糖DMEM/F12和5％～7.5％的血小板裂解液；所述诱导培养基还包含终浓度为2～3μmol/L的SB431542。进一步优选地，按照体积百分比计，所述诱导培养基包含95％的高糖DMEM/F12和5％的血小板裂解液；所述诱导培养基还包含终浓度为2.5μmol/L的SB431542。
本发明还提供了一种诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的方法，该方法包括使用上述诱导培养基培养成纤维细胞，以诱导成纤维细胞分泌抗菌肽。该方法操作简单，可操控性强，能够获得具有脂肪分化潜能和分泌抗菌肽能力的成纤维细胞。
在一些可选的实施方式中，以如下条件诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的效果较佳：当成纤维细胞的汇合度为45％～55％时，使用所述诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的诱导培养基培养成纤维细胞；优选地，当使用所述诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的诱导培养基培养成纤维细胞至汇合度为85％～95％时，停止诱导。
用于实施本发明方法的成纤维细胞来源包括但不限于人或者其他哺乳类动物，具体的例如可以为但不限于为人类、牛、羊、猪、马、大鼠或小鼠等。
在一些优选的实施方式中，成纤维细胞通过如下方法获取：将去除了皮下组织和血管的皮肤组织，在成纤维细胞培养基中培养至成纤维细胞迁出，并且迁出的成纤维细胞的汇合度达到75％～85％时传代，以用于后续成纤维细胞的诱导。其中成纤维细胞培养基优选使用含有血小板裂解液的成纤维细胞培养基。
在一些优选的实施方式中，所述成纤维细胞培养基包括基础培养基和血小板裂解液。优选地，按照体积百分比计，所述成纤维细胞培养基包含90％～95％的高糖DMEM/F12和5％～10％的血小板裂解液；其中可选地，高糖DMEM/F12的含量例如可以为但不限于为90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％或95％；可选地，血小板裂解液的含量例如可以为但不限于为5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或10％。
在一些优选的实施方式中，如下配比的成纤维细胞培养基培养成纤维细胞的效果更佳：按照体积百分比计，所述成纤维细胞培养基包含92.5％～95％的高糖DMEM/F12和5％～7.5％的血小板裂解液。更优选地，按照体积百分比计，所述成纤维细胞培养基包含95％的高糖DMEM/F12和5％的血小板裂解液。
在一些优选地实施方式中，在使用所述诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的诱导培养基培养成纤维细胞前，先将成纤维细胞重悬，计数后以0.5×104/cm2～1.5×104/cm2的细胞密度接种于培养容器中，以用于诱导产生抗菌肽。可选地，接种细胞密度例如可以为但不限于为0.5×104/cm2、0.8×104/cm2、1.0×104/cm2、1.2×104/cm2或1.5×104/cm2，优选以1.0×104/cm2的细胞密度接种于培养容器中。
在一些优选的实施方式中，按照下述方法获得的分泌抗菌肽的成纤维细胞质量更佳：
(a)使用缓冲液清洗浸泡过抗生素的皮肤组织至少三次，其中抗生素优选使用160U/ml庆大霉素，所述缓冲液优选使用生理盐水或PBS，然后去除皮肤组织中的皮下组织和血管；将除去皮下组织和血管的剩余组织在成纤维细胞培养基中浸润约1min后剪碎，然后用眼科镊子将每个组织块接种于培养容器中，优选使用100mm的培养皿，放入二氧化碳培养箱中培养24小时后，缓慢加入成纤维细胞培养基10ml，继续放入二氧化碳培养箱中培养。一般在培养后10天，可见有成纤维细胞从组织块中迁出，待细胞汇合度达到80％左右时，开始第一次传代。
(b)在使用所述诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的诱导培养基诱导成纤维细胞前，弃成纤维细胞培养基，使用D-PBS清洗贴壁的成纤维细胞后使用Accutase消化成纤维细胞并将成纤维细胞重悬，D-PBS为杜氏磷酸缓冲液，Accutase为含有蛋白水解酶和胶原酶活性的细胞消化液、细胞重悬并计数后以0.5×104/cm2～1.5×104/cm2的细胞密度接种于培养容器中，继续在成纤维细胞培养基中培养；
(c)当成纤维细胞的汇合度达到50％左右时，弃成纤维细胞培养基，D-PBS清洗成纤维细胞后加入所述诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的诱导培养基，置于二氧化碳培养箱中培养48h左右至细胞的汇合度达到90％时，停止诱导，得到能够分泌抗菌肽的成纤维细胞。
采用上述方法制备得到的成纤维细胞具有脂肪分化潜能并分泌抗菌肽，当需要将上述成纤维细胞用于制备药物或其他产品，或者用于移植时，按照常规方法将细胞消化重悬即可，在一个优选的实施方式中，可按照如下方法操作：弃诱导培养基后使用D-PBS清洗，2mL的Accutase消化液37℃孵育将细胞消化至成纤维样细胞变圆并开始脱落，加入成纤维细胞培养基终止消化；300g×5min收集细胞后重悬，离心重悬细胞重复三次，然后细胞计数以用于后续的应用。
本发明还提供了采用上述诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的方法制备得到的成纤维细胞，该成纤维细胞具有脂肪分化潜能和分泌抗菌肽的能力，并可以在体外分泌抗菌肽，可以理解的是，当将该分泌抗菌肽的成纤维细胞移植至患处，该成纤维细胞可以在患处分泌抗菌肽，可广泛应用于皮肤类疾病的治疗和制备用于治疗皮肤类疾病或者改善皮肤状态的产品。
本发明还提供了上述诱导培养基，上述诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的方法，或上述成纤维细胞在如下(x1)～(x3)中至少一种的应用：
(x1)制备抗菌肽，本发明提供的诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的诱导培养基、诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的方法以及分泌抗菌肽的成纤维细胞可以用于制备抗菌肽，通过纯化出分泌抗菌肽的成纤维细胞中的抗菌肽，以得到能够作为药物的活性物质。
(x2)制备用于治疗皮肤类疾病的药品；所述用于治疗皮肤类疾病的药品可以以抗菌肽作为主要的或者辅助的活性成分，也可以以能够分泌抗菌肽的成纤维细胞作为主要的或者辅助的活性成分，可以理解的是，所述药品中还可以包含常规的药学领域可接受的辅料。例如当以分泌抗菌肽的成纤维细胞作物药物的活性成分以用于移植至患处时，所述药品中可以含有用于维持成纤维细胞活性的成分，例如各种营养物质，或者用于维持整个药品体系pH和渗透压的助剂等。
(x3)制备用于改善皮肤状态的产品，所述改善皮肤状态，包括减少或去除皱纹、提高皮肤弹性、改善瘢痕、缓解以及预防皮损或炎症等。所述产品可以直接以抗菌肽作为主要的或者辅助的活性成分，也可以以能够分泌抗菌肽的成纤维细胞作为主要的或者辅助的活性成分，可以理解的是，还可以包括任选的辅料，以维持产品形态，保持细胞活性或者为产品提供附加的功能。
在一些优选的实施方式中，所述用于治疗皮肤类疾病的药品和所述制备用于改善皮肤状态的产优选为能够移植至待改善部位的，含有能够分泌抗菌肽的成纤维细胞，并且这些成纤维细胞优选来自患者的自体皮肤组织，利用自体成纤维细胞，不涉及非人源蛋白质，细胞制剂中不含有非人源蛋白，抗生素和激素，因此具有较高的临床安全性和临床应用价值。
在一些优选的实施方式中，所述治疗皮肤类疾病的药品包括治疗痤疮的药品。痤疮是毛囊皮脂腺单位的一种慢性炎症性皮肤病，主要好发于青少年。痤疮的产生主要是由于毛囊中多种微生物尤其是痤疮丙酸杆菌大量繁殖，痤疮丙酸杆菌产生的脂酶分解皮脂生成游离脂肪酸，同时趋化炎症细胞和介质，最终诱导并加重炎症反应，痤疮进一步发展会演变成各种炎症性皮损。
将分泌抗菌肽的成纤维细胞移植至痤疮患处，可以使成纤维细胞在患处分泌抗菌肽，利用抗菌肽抑制患处微生物的生长，达到治疗或者缓解痤疮的目的。因此本发明提供的诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的诱导培养基和诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的方法能够用于获得分泌抗菌肽的成纤维细胞，将分泌抗菌肽的成纤维细胞制备成药品的活性成分，以用于治疗痤疮。可以理解的是，为了减少成纤维细胞对患者的免疫原性，所述药品中的成纤维细胞优选来自于患者的自体皮肤组织。
下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。
实验材料如下表所示：
名称 型号 销售厂家
HPL HPCPLCRL50 Helios Bioscience
高糖DMEM/12 11965092 GIBICO
accutase C-41310 promocell
DPBS SH30028.02 hyclone
SB431542 616464 SIGMA
实施例1
本实施例提供了一种诱导皮肤成纤维细胞产生抗菌肽的诱导培养基，按照体积百分比计，该诱导培养基包含95％的高糖DMEM/F12和5％的HPL；该诱导培养基还包含终浓度为2.5μmol/L的SB431542。
实施例2
本实施例提供了一种诱导皮肤成纤维细胞产生抗菌肽的诱导培养基，按照体积百分比计，该诱导培养基包含90％的高糖DMEM/F12和10％的HPL；该诱导培养基还包含终浓度为2.5μmol/L的SB431542。
实施例3
本实施例提供了一种诱导皮肤成纤维细胞产生抗菌肽的诱导培养基，按照体积百分比计，该诱导培养基包含85％的高糖DMEM/F12和15％的HPL；该诱导培养基还包含终浓度为2.5μmol/L的SB431542。
实施例4
本实施例提供了一种诱导皮肤成纤维细胞产生抗菌肽的诱导培养基，按照体积百分比计，该诱导培养基包含95％的高糖DMEM和5％的HPL；该诱导培养基还包含终浓度为2.5μmol/L的SB431542。
实施例5
本实施例提供了一种成纤维细胞培养基，按照体积百分比计，该成纤维细胞培养基包含95％的高糖DMEM/F12和5％的HPL。
实施例6
本实施例提供了一种诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的方法，包括如下步骤：
(a)制备自体成纤维细胞：利用组织块法分离自体成纤维细胞。将健康的皮肤组织用160U/ml庆大霉素浸泡1min后用生理盐水或者PBS再清洗三次。用已消毒的手术器械将上层的皮下组织和血管刮干净。将除去皮下组织和血管的剩余组织在实施例5提供的成纤维细胞培养基中浸润1min后取出，在60mm培养皿中用虹膜剪切碎，用眼科镊子将每个组织块接种于100mm培养皿中，放入二氧化碳培养箱中培养24小时后，缓慢加入成纤维细胞培养基10ml，继续放入二氧化碳培养箱中培养。自体皮肤成纤维细胞的分离过程如图1和图2所示，从图1中可以看出，组织块贴壁10天后有成纤维细胞迁出，从图2可以看出，组织块贴壁培养21天后，成纤维细胞为主要迁出细胞。
(b)用移液器移去培养皿内的培养基，加入D-PBS 10ml，轻轻晃动，弃去D-PBS，重复清洗一次。加入4倍稀释的Accutase液2ml，37℃放置，显微镜下观察细胞消化情况。当在细胞大部分脱壁时，加入10mL成纤维细胞培养基终止消化，收集细胞悬液至15ml离心管中，300g×5min收集细胞，弃去上清液。向装有细胞的15ml离心管中加入预温的成纤维细胞培养基，重悬细胞，细胞计数后，以1×104/cm2的细胞密度接种，置于二氧化碳培养箱中培养。
(c)当自体成纤维细胞汇合度达到50％左右时，如图3所示，用移液器移去培养皿内的成纤维细胞培养基，加入D-PBS 10ml，轻轻晃动，弃去D-PBS，重复清洗一次。加入预热的实施例1提供的诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的诱导培养基，置于二氧化碳培养箱中培养48hr，此时细胞汇合度达到90％，如图4所示，诱导结束后，细胞形态仍呈长梭形。
(d)DPBS洗两遍，每次1min；加入4倍稀释的accutase消化液2ml；37℃孵育6min后，镜下观察，成纤维样细胞变圆并开始脱落，加入含成纤维细胞培养基终止消化，轻轻拍打培养瓶底面，收集细胞悬液，300g×5min收集细胞，弃上清，生理盐水重悬细胞，收集细胞悬液，300g×5min收集细胞，弃上清，重复三次。细胞计数，生理盐水重悬细胞，使细胞密度达到1×107/ml。
效果例1诱导后细胞脂肪分化能力检测
用DMEM/F12+10％SR为基本培养基配制脂肪分化诱导液(含400μmol/L吲哚美辛，2μmol/L地塞米松，2％ITS，0.5mmol/L IBMX)；将细胞以2×105个/mL的密度传代至35mm培养皿中，待细胞生长至90％汇合度后，更换传代培养基为脂肪分化诱导液，此后每隔3天换液1次，期间每隔一段时间用显微镜观察脂滴形成状况，诱导18天后用油红O染色。
油红O染色方法如下：
(a)按饱和油红O：超纯水＝3：2的比例稀释饱和油红O，于4℃静置24-48h后离心沉淀析出的残渣，取上清作为工作液，4℃保存，可重复使用；配制60％异丙醇，放置于4℃备用。
(b)吸弃脂肪分化诱导液，加入2mL 4％PFA固定，4℃放置过夜或室温放置1h。
(c)加入1mL油红O工作液，室温静置20min～1h，期间在显微镜下观察脂滴着色情况，当脂滴变为鲜红色后，吸出染料。
(d)加入60％异丙醇直至脱去非特异性着色的油红O染色液，吸弃60％异丙醇。
(e)用PBS洗2次，在显微镜下拍照。实验结果如图5和图6所示：分化第6天即可见明显的脂滴位于细胞质中；诱导18天后用油红O染色。染色结果显示，脂滴成明显的橙红色颗粒状，位于细胞质中，脂滴大小不均等。
效果例2诱导后细胞抗菌肽分泌能力检测
用DMEM/F12+10％SR为基本培养基配制脂肪分化诱导液(含400μmol/L吲哚美辛，2μmol/L地塞米松，2％ITS，0.5mmol/L IBMX)；将细胞以2×105个/mL的密度传代至35mm培养皿中，待细胞生长至90％汇合度后，更换传代培养基为脂肪分化诱导液，此后每隔3天换液1次，分别诱导4、8、12天后用提取RNA，采用Trizol法提取总RNA，取1μg总RNA用于反转录PCR检测，实时荧光定量PCR检测抗菌肽cathelidicin mRNA的表达量，结果如图7所示，从图7中可以看出，随着脂肪分化过程的进行，cathelidicin mRNA的表达量逐渐升高，并且在分化后第8天达到最高值。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的诱导培养基，其特征在于，所述诱导培养基包含基础培养基、血小板裂解液和TGF-β信号通路抑制剂。
2.根据权利要求1所述的诱导培养基，其特征在于，所述基础培养基包括高糖DMEM/F12；
优选地，所述TGF-β信号通路抑制剂包括SB431542。
3.根据权利要求1或2所述的诱导培养基，其特征在于，按照体积百分比计，所述诱导培养基包含90％～95％的高糖DMEM/F12和5％～10％的血小板裂解液；所述诱导培养基还包含终浓度为2～3μmol/L的SB431542；
优选地，按照体积百分比计，所述诱导培养基包含92.5％～95％的高糖DMEM/F12和5％～7.5％的血小板裂解液；所述诱导培养基还包含终浓度为2～3μmol/L的SB431542；
优选地，按照体积百分比计，所述诱导培养基包含95％的高糖DMEM/F12和5％的血小板裂解液；所述诱导培养基还包含终浓度为2.5μmol/L的SB431542。
4.一种诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1-3任一项所述的诱导培养基培养成纤维细胞，以诱导成纤维细胞分泌抗菌肽；
优选地，所述成纤维细胞的汇合度为45％～55％时，使用所述诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的诱导培养基培养成纤维细胞；
优选地，使用所述诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的诱导培养基培养成纤维细胞至汇合度为85％～95％时，停止诱导。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述成纤维细胞的制备方法如下：将去除了皮下组织和血管的皮肤组织在成纤维细胞培养基中培养至成纤维细胞迁出，并且成纤维细胞的汇合度达到75％～85％时传代，以获得成纤维细胞；
优选地，所述成纤维细胞培养基包括基础培养基和血小板裂解液；
优选地，按照体积百分比计，所述成纤维细胞培养基包含90％～95％的高糖DMEM/F12和5％～10％的血小板裂解液；
优选地，按照体积百分比计，所述成纤维细胞培养基包含92.5％～95％的高糖DMEM/F12和5％～7.5％的血小板裂解液；
优选地，按照体积百分比计，所述成纤维细胞培养基包含95％的高糖DMEM/F12和5％的血小板裂解液。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在使用所述诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的诱导培养基培养成纤维细胞前，先将成纤维细胞重悬，计数后以0.5×104/cm2～1.5×104/cm2的细胞密度接种于培养容器中，以用于诱导产生抗菌肽。
7.根据权利要求4-6任一项所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)使用缓冲液清洗浸泡过抗生素的皮肤组织至少三次，所述缓冲液包括生理盐水或PBS，然后去除皮肤组织中的皮下组织和血管；将除去皮下组织和血管的剩余组织在成纤维细胞培养基中浸润并剪碎后将每个皮下组织块接种于培养容器中培养；然后加入在成纤维细胞培养基培养至成纤维细胞迁出，当成纤维细胞的汇合度达到75％～85％时传代培养；
(b)在使用所述诱导培养基诱导成纤维细胞前，弃成纤维细胞培养基，D-PBS清洗贴壁的成纤维细胞后使用Accutase消化成纤维细胞并将成纤维细胞重悬，计数后以0.5×104/cm2～1.5×104/cm2的细胞密度接种于培养容器中，继续在成纤维细胞培养基中培养；
(c)当成纤维细胞的汇合度为45％～55％时，弃成纤维细胞培养基，D-PBS清洗成纤维细胞后加入所述诱导培养基培养成纤维细胞至细胞的汇合度为85％～95％时，停止诱导。
8.采用权利要求4-7任一项所述的诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的方法制备得到的成纤维细胞。
9.权利要求1-3任一项所述的诱导培养基，权利要求4-7任一项所述的诱导成纤维细胞分泌抗菌肽的方法，或权利要求8所述的成纤维细胞在如下(x1)～(x3)中至少一种的应用：
(x1)制备抗菌肽；
(x2)制备用于治疗皮肤类疾病的药品；
(x3)制备用于改善皮肤状态的产品。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述制备用于治疗皮肤类疾病的药品和所述用于改善皮肤状态的产品以分泌抗菌肽的成纤维细胞作为活性物质，并通过移植至患处实现治疗作用和/或改善皮肤状态的作用；
优选地，所述成纤维细胞来源于自体皮肤组织；
优选地，所述治疗皮肤类疾病的药品包括治疗痤疮的药品。
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