CN114457010A - 一种干细胞衍生品及其制备方法和应用 - Google Patents

一种干细胞衍生品及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种干细胞衍生品及其制备方法和应用。其制备方法包括如下步骤：步骤S1:在3～10％氧浓度的环境下，将脐带或胎盘制备成组织块，将所述组织块在第一培养基中进行培养，当贴壁细胞的融合度为30％～90％时，进行细胞消化传代，将消化传代后的细胞传到第4至6代时，将细胞继续接种于第二培养基中继续培养48～72h后，离心得到第一上清液和沉淀。步骤S2：将沉淀用生理盐水重悬，将细胞破碎离心得到第二上清液；步骤S3：将第一上清液和第二上清液合在一起经过除菌过滤，再超滤得到干细胞衍生品。本发明的方法能够获得大量的干细胞衍生品。

Description

一种干细胞衍生品及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种干细胞衍生品及其制备方法和应用。
背景技术
干细胞衍生品是由各种来源的间充质干细胞或其他组织干细胞(如神经干细胞，皮肤干细胞等)经体外扩增培养获得的细胞因子和外泌体等具有高活性的物质(成分包括：角质细胞生长因子、表皮细胞生长因子、血管内皮生长因子、神经生长因子、肝细胞生长因子、白细胞介素-6、粒细胞集落刺激因子、转化生长因子-β、血小板衍生因子、促红细胞生成素、基质细胞衍生因子、多种活性肽、酶、透明质酸和蛋白质、核酸、脂质等)。
干细胞具有强大的旁分泌功能，其分泌物富含多种生长因子和信号分子，可激活其临近细胞或组织，从而产生相应的生物学作用。干细胞衍生品的作用也基于此。随着不断的临床摸索，拥有各种生物学功效的干细胞衍生品的应用价值，从被认识逐渐到被认可。目前干细胞衍生品在烧伤烫伤，难愈合性溃疡及术后创伤修复领域的潜在应用价值比较大。目前，对于干细胞衍生品的制备大多是超速离心或蛋白质沉淀法，存在制备时间长，收获量少等缺点。
因此，有必要开发一种高效且大量制备干细胞衍生品的方法。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明提供了一种干细胞衍生品的制备方法。
本发明还提供了一种干细胞衍生品。
本发明还提供了一种干细胞衍生品的应用。
本发明的第一方面提供了一种干细胞衍生品的制备方法，包括如下步骤：
步骤S1:在3～10％氧浓度的气氛下，将脐带或胎盘制备成组织块，将所述组织块在第一培养基中进行培养，当贴壁细胞的融合度为30％～90％时，进行细胞消化传代，将消化传代后的细胞传到第4至6代时，将细胞继续接种于第二培养基中继续培养48～72h后，以6000～8000g，2～6℃离心10～30min得到第一上清液和沉淀；
步骤S2：将步骤S1所得的沉淀用生理盐水重悬，将细胞反复冻融或超声波破碎后，8000～10000g，2～6℃离心10～30min，得到第二上清液；
步骤S3：将第一上清液和第二上清液合并得到混合液，将所述混合液经过除菌过滤后进行第一次超滤得到第一滤液，将所述第一滤液进行第二次超滤，得到第二滤液，所述第二滤液即为干细胞衍生品，所述超滤采用的超滤膜为300～500KD。
本发明关于干细胞衍生品的制备方法的技术方案中的一个技术方案，至少具有以下有益效果：
本发明首先以3～10％的低氧浓度下对间充质干细胞进行培养，促进细胞外泌体和细胞因子的分泌，再通过破碎细胞、过滤除菌和超滤离心从而能够获得大量的干细胞衍生品。
根据本发明的一些实施方式，所述步骤S3中，所述混合液还包括检测步骤：对所述混合液进行厌氧菌、需氧菌、内毒素和支原体检测。
根据本发明的一些实施方式，所述步骤S2中，所述超声波破碎至少包括以下条件：超声时间为1～5秒、间隙时间为5～10秒、超声10～30次、超声温度为2～6℃。
根据本发明的一些实施方式，所述步骤S2中，细胞反复冻融包括以下步骤：所述反复冻融是指先冷至-20℃以下；再加热至30～40℃，交替进行若干次。
根据本发明的一些实施方式，步骤S3中，第一次超滤的条件是；经过500KD超滤膜的超滤管中4000～8000g，2～6℃，10～30min离心细胞碎片和大分子量蛋白分子；第二次超滤的条件是：再将离心管内的液体在300KD超滤膜的超滤管进行4000～8000g，2～6℃，10～30min离心得到干细胞衍生品。
根据本发明的一些实施方式，在所述步骤S3中还设有检测程序：对上清液进行厌氧菌、需氧菌、内毒素和支原体检测。
根据本发明的一些实施方式，所述方法还包括在步骤S3后，将所述干细胞衍生品在4～-80℃条件下进行保存或制备成冻干粉、凝胶剂进行保存。
将所述干细胞衍生品进行4℃条件下保存一周，-80℃下保存6个月；制备成冻干粉，或凝胶剂冷藏的方式保存2年。
根据本发明的一些实施方式，所述第一培养基是含有5～10％血清的培养基。所述第一培养基可以是市购基础培养基，也可以选自DMEM(dulbecco's modified eaglemedium)培养基、a-MEM(minimum Eagle's medium)培养基、MEM-EBSS(MEM EagleswithEarle’sBalanced Salts)培养基中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述第二培养基为不含外源外泌体的培养基和无血小板裂解物添加物的培养基。
根据本发明的一些实施方式，所述第二培养基可以是市购基础培养基，也可以是选自DMDM培养基、a-MEM培养基、MEM-EBSS培养基中的至少一种。
本发明的第二方面提供一种干细胞衍生品，由上述制备方法制备得到。
本发明的第三方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包括活性成分和药学上可接受的辅料，所述活性成分包括所述的干细胞衍生品；或由上述所述的制备方法制备的干细胞衍生品。
所述药学上可接受的辅料包括但并不限于，离子交换剂；铝；硬脂酸铝；卵磷脂；血清蛋白，如人血清蛋白；缓冲物质如磷酸盐；甘氨酸；山梨酸；山梨酸钾；饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物；水；盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐；胶体硅；三硅酸镁；聚乙烯吡咯烷酮；聚丙烯酸脂；蜡；聚乙烯-聚氧丙烯-阻断聚合体；羊毛脂；糖，如乳糖，葡萄糖和蔗糖；淀粉如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素和它的衍生物如羧甲基纤维素钠，乙基纤维素和乙酸纤维素；树胶粉；麦芽；明胶；滑石粉；辅料如可可豆脂和栓剂蜡状物；油如花生油，棉子油，红花油，麻油，橄榄油，玉米油和豆油；二醇类化合物，如丙二醇和聚乙二醇；酯类如乙基油酸酯和乙基月桂酸酯；琼脂；缓冲剂如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原的水；等渗盐；林格(氏)溶液；乙醇；磷酸缓冲溶液；和其他无毒的合适的润滑剂如月桂硫酸钠和硬脂酸镁；着色剂；释放剂；包衣衣料；甜味剂；调味剂；香料；防腐剂和抗氧化剂。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明所采用的试剂、方法和设备，如无特殊说明，均为本技术领域常规试剂、方法和设备。
以下实施例及对比例中采用的原料如下：
胎盘：来源于湖南省长沙市三甲医院妇产科。
脐带：来源于湖南省长沙市三甲医院妇产科。
实施例1
实施例1提供一种干细胞衍生品的制备方法，包括如下步骤：
步骤S1、将洗涤后的脐带剪取4-5段，每段约2厘米，共约8～10cm，用无菌镊在0.9％氯化钠注射液中洗涤脐带小段，以清除脐带小段血管中淤血和凝块。无菌有齿镊配合尖头剪沿血管刨开脐带小段并剔除血管。使用无菌有齿镊将脐带小段转移至新的培养皿中再次浸泡清洗一次，把血液彻底清洗干净，并用无菌组织专用剪将脐带小段剪切成1-3mm3的组织匀浆块。在3％氧浓度条件下，吸取组织均浆，平均分配接种至5个细胞专用培养皿中，每皿中约2mL左右组织块，将培养皿置于中转CO2培养箱中开始培养。次日观察细胞贴壁情况，若无异常利用电动助吸器每皿加入4mL新鲜培养基(10％胎牛血清的a-MEM培养基)，第4天补液，显微镜下观察细胞贴壁情况，若无异常利用电动助吸器每皿加入4mL新鲜培养基，脐带组织培养第7天进行全量换液。镜下观察细胞有3处以上细胞克隆，融合度达到30％-90％时进行组织块弃除处理：轻轻晃动培养皿，将组织块从培养皿底部晃动起来，把组织块连同培养基全部弃掉，未浮动的组织块用1支3mL无菌吸管轻触，使之漂起，然后用生理盐水冲洗2遍，加入1.5mL胰酶消化液，培养箱中孵育2min，待细胞变圆后加入终止液10mL，快速震荡并用吸管吹打细胞贴壁面，再吸出细胞悬液到50mL的离心管中，加入10mL的生理盐水，1200g，4℃离心10min收集沉淀，再次加入20mL生理盐水洗涤，加入5mL完全培养基重悬，计数。使细胞浓度为2×104个细胞/mL的密度接种于5％胎牛血清的a-MEM培养基，置培养箱中3％氧浓度下培养。传到第4代时，使用不含胎牛血清和无血小板裂解物等添加物的a-MEM培养基培养基细胞并继续培养48～72h，以6000g离心力4℃离心30min得到第一上清液和沉淀。
步骤S2：将沉淀用生理盐水重悬，将细胞反复冻融：先冷至-20℃，然后放于室温(或40℃)迅速融化，如此反复冻融多次。或是冰上超声波破碎5分钟，重复30次，8000离心力4℃离心30min离心得到第二上清液；
步骤S3：将第一上清液和第二上清液合在一起进行(厌氧菌、需氧菌、内毒素和支原体)检测。将检测合格的上清液，经过0.22um滤膜除菌过滤，经过500KD超滤膜的超滤管中4000g，4℃，30min离心；再将离心管内的液体在300KD超滤膜的超滤管中4000g，4℃，30min离心得到干细胞衍生品。
将干细胞衍生品在4℃下储存。
实施例2
实施例2提供一种干细胞衍生品的制备方法，包括如下步骤：
步骤S1、将胎盘平铺在托盘中，其中带有羊膜和胎盘的胎儿面向上，一手持镊子，一手持剪刀，用剪刀和镊子剥离绒毛膜层，用镊子尽可能的去除绒毛膜上的红色组织，充分剪碎组织块，用细胞刮刀将组织块平铺于2个175培养瓶中。小心将培养瓶放入5％低氧培养箱中培养3小时。每瓶缓慢加入含有10％胎牛血清的DMEM培养基15mL，静置培养7天。用10mL移液管吸取15mL培养液，尽量避免吸取组织块，然后补充10％胎牛血清的DMEM培养基20mL，5～7天进行全量换液。观察细胞融合达30～90％，即可进行细胞传代，用移液管吸弃旧培养基，更换移液管，加入30mL生理盐水。轻轻震荡洗涤组织贴壁面，弃去，重复2次。每瓶加0.25％胰酶5mL，均匀浸润细胞贴壁面，37℃孵育1min～3min。待细胞变圆后每瓶加终止液20mL，快速震荡，用10mL移液管吹打细胞贴壁面，吸出细胞悬液入50mL离心管中，2000rpm，离心6min，弃上清，沉淀用26mL生理盐水重悬，取样计数。加40mL生理盐水再次离心洗涤，沉淀用20mL完全培养基重悬。根据细胞数量铺瓶(T175培养瓶)，使细胞浓度为4×104个细胞/mL，标记，置5％低氧培养箱中培养。传到第6代时，使用不含外泌体的培养基和无血小板裂解物等添加物培养基悬浮细胞并继续培养48～72h，以8000g离心力4℃离心10min得到第一上清液和沉淀；
步骤S2：将沉淀用生理盐水重悬，将细胞反复冻融：先冷至-20℃，然后放于室温(或40℃)迅速融化，如此反复冻融多次。或是冰上超声波破碎5分钟，重复10～30次，10000g离心力4℃离心10min离心得到第二上清液；
步骤S3：将第一上清液和第二上清液合在一起进行(厌氧菌、需氧菌、内毒素和支原体)检测。将检测合格的上清液，经过0.22um滤膜除菌过滤，经过500KD超滤膜的超滤管中8000g，4℃，10min离心；再将离心管内的液体在300KD超滤膜的超滤管中8000g，4℃，10min离心得到干细胞衍生品。
实施例3
实施例3提供一种干细胞衍生品的制备方法，其制备方法与实施例1相同，其区别在于，实施例3的氧浓度为7％。
实施例4
实施例4提供一种干细胞衍生品的制备方法，其制备方法与实施例1相同，其区别在于，实施例4的氧浓度为9％。
实施例5
实施例5提供一种干细胞衍生品的制备方法，其制备方法与实施例1相同，其区别在于，实施例5的氧浓度为10％。
对比例1
对比例1也提供一种干细胞衍生品的制备方法：将洗涤后脐带剪取4-5段，每段约2厘米，共约8～10cm，用无菌镊在0.9％氯化钠注射液中洗涤脐带小段，以清除脐带小段血管中淤血和凝块。无菌有齿镊配合尖头剪沿血管刨开脐带小段并剔除血管。使用无菌有齿镊将脐带小段转移至新的培养皿中再次浸泡清洗一次，把血液彻底清洗干净，并用无菌组织专用剪将脐带小段剪切成1～3mm3的组织匀浆块。在正常氧浓度条件下，吸取组织均浆，平均分配接种至5个细胞专用培养皿中，每皿中约2mL左右组织块，将培养皿置于中转CO2培养箱中开始培养。次日观察细胞贴壁情况，若无异常利用电动助吸器每皿加入4mL新鲜培养基(10％胎牛血清的a-MEM培养基)，第4天补液，显微镜下观察细胞贴壁情况，若无异常利用电动助吸器每皿加入4mL新鲜培养基，脐带组织培养第7天进行全量换液。镜下观察细胞有3处以上细胞克隆，融合度达到70％-90％时进行组织块弃除处理：轻轻晃动培养皿，将组织块从培养皿底部晃动起来，把组织块连同培养基全部弃掉，未浮动的组织块用1支3mL无菌吸管轻触，使之漂起，然后用生理盐水冲洗2遍，加入1.5mL胰酶消化液，37℃5％CO2培养箱中孵育2min，待细胞变圆后加入终止液10mL，快速震荡并用吸管吹打细胞贴壁面，再吸出细胞悬液到50mL的离心管中，加入10mL的生理盐水，1200g，4℃离心10min收集沉淀，再次加入20mL生理盐水洗涤，加入5mL完全培养基重悬，计数。使细胞浓度为2×104个细胞/mL的密度接种于5％胎牛血清的a-MEM培养基，置培养箱中3％氧浓度下培养。传到第4代时，使用不含胎牛血清和无血小板裂解物等添加物的a-MEM培养基培养基细胞并继续培养48～72h，以6000～8000g离心力4℃离心10～30min得到上清液。
性能测试
干细胞衍生品中蛋白浓度的测试：将本发明实施例1～5以及对比例中的干细胞衍生品用BCA法测定蛋白质含量；
实施例1～5以及对比例中OD562测出的干细胞衍生品中蛋白浓度的数据
Figure BDA0003508948830000071
当时用对比例1的方法提取干细胞衍生品时，蛋白总质量和总浓度都要低于本申请的方法。
在本发明中通过蛋白总质量和总浓度来确定外泌体和细胞因子的含量，蛋白总质量和总浓度越高说明获得的外泌体和细胞因子越多。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种干细胞衍生品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1:在3～10％氧浓度的气氛下，将脐带或胎盘制备成组织块，将所述组织块在第一培养基中进行培养，当贴壁细胞的融合度为30％～90％时，进行细胞消化传代，将消化传代后的细胞传到第4至6代时，将细胞继续接种于第二培养基中继续培养48～72h后，以6000～8000g，2～6℃，10～30min离心得到第一上清液和沉淀；
步骤S2：将步骤S1所得的沉淀用生理盐水重悬，将细胞反复冻融或超声波破碎后，8000～10000g，2～6℃离心10～30min，得到第二上清液；
步骤S3：将第一上清液和第二上清液合并得到混合液，将所述混合液经过除菌过滤后进行第一次超滤得到第一滤液，将所述第一滤液进行第二次超滤，得到第二滤液，所述第二滤液即为干细胞衍生品，所述超滤采用的超滤膜为300～500KD。
2.根据权利要求1所述的干细胞衍生品的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述混合液还包括检测步骤：对所述混合液进行厌氧菌、需氧菌、内毒素和支原体检测。
3.根据权利要求1所述的干细胞衍生品的制备方法，其特征在于，所述超声波破碎至少包括以下条件：超声时间为1～5秒、间隙时间为5～10秒、超声10～30次、超声温度为2～6℃。
4.根据权利要求1所述的干细胞衍生品的制备方法，其特征在于，所述反复冻融是指先冷至-20℃以下；再加热至30～40℃，交替进行若干次。
5.根据权利要求1所述的干细胞衍生品的制备方法，其特征在于，所述方法还包括在步骤S3后，将所述干细胞衍生品在4～-80℃条件下进行保存或制备成冻干粉、凝胶剂进行保存。
6.根据权利要求1所述的干细胞衍生品的制备方法，其特征在于，所述第一培养基是含有5～10％血清的培养基。
7.根据权利要求1所述的干细胞衍生品的制备方法，其特征在于，所述第二培养基为不含外源外泌体的培养基和无血小板裂解物添加物的培养基。
8.根据权利要求7所述的干细胞衍生品的制备方法，其特征在于，所述第一培养基包括DMEM培养基、a-MEM培养基或MEM-EBSS培养基中的至少一种。
9.一种干细胞衍生品，其特征在于，由权利要求1～8任一项所述的干细胞衍生品的制备方法制备得到。
10.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括活性成分和药学上可接受的辅料，所述活性成分包括权利要求9所述的干细胞衍生品；或由权利要求1～8任一项所述的制备方法制备的干细胞衍生品。
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