CN112430572A - 一种脐带间充质干细胞采集物的处理方法 - Google Patents

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陈玲玲
刘秋诗
李莉
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Abstract

本发明属于细胞技术领域，尤其是一种脐带间充质干细胞采集物的处理方法，包括如下步骤：将剪掉结扎两端的脐带放置在清洗液中浸泡，然后用生理盐水冲洗；将冲洗完毕的脐带剪成长短相同的两段，剥离静脉和动脉血管，然后剪碎成1cm3的小组织块；将小组织块接种于培养皿中，向培养皿中加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液进行培养。发明将剥离血管后的脐带分成1cm3的组织块，原代细胞的爬出速度快，最终可以获得更多的间充质干细胞。并且采用本发明的方法，提高了从脐带血中分离出充质干细胞的回收率，并且制备的间充质干细胞具有更高的增殖和分化潜能，有利于其在后期研究和临床应用中发挥更加重要的作用。

Description

一种脐带间充质干细胞采集物的处理方法
技术领域
本发明涉及干细胞技术领域，尤其涉及一种脐带间充质干细胞采集物的处理方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是来源于发育早期的中胚层和外胚层，具有自我更新、多向分化、多方向分化潜能、造血支持以及免疫调控等特性的细胞，产生并释放营养性物质，通过旁分泌途径促进细胞修复及血管生成，在再生医学领域有重要作用。
目前，主要从脂肪、骨髓、脐带、胎盘组织中提取间充质干细胞。间充质干细胞连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，为临床治疗各种疾病，如神经系统疾病、肾病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤等的治疗提供了新的途径。脐带间充质干细胞(UCMSCs)是存在于脐带华尔通胶(Wharton 'sjelly)和血管周围组织中的一种干细胞。来源于脐带的间充质干细胞，取材方便，来源丰富，易于采集和运输，生物学特性稳定，免疫原性低，无异体排斥反应，成本低，对捐献者无损害及不涉及伦理问题等优势，使其成为未来干细胞在医疗应用上具有巨大潜力的理想选择。
目前脐带间充质干细胞主要是从人脐带中采集得到，采用的方法是沿脐静脉内腔纵向切开血管，剥离脐静脉和动脉内膜，将剥离出的组织切成5mm以下的小块放在培养液中培养。如专利申请号201010528733.4“一种人脐带间充质干细胞的制备方法”中脐带的分离步骤是沿脐带结扎内侧剪断，加入适量的生理盐水清洗至表面无血渍后将脐带剪成 2-3cm的小段，沿脐带静脉血管剪开并剥离静脉血管壁和动脉血剥离出华通氏胶后将华通氏胶移至离心管中，用组织剪将华通氏胶剪碎至 1-3mm3 大小的组织块。采用此方法处理脐带间充质干细胞采集物，最后经过培养后得到的脐带间充质干细胞，其原代细胞爬出较慢，得到的细胞数量较少。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在缺陷，提供一种脐带间充质干细胞采集物的处理方法，能够提高原代细胞的爬出速度，最终可以获得更多的间充质干细胞。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种脐带间充质干细胞采集物的处理方法，包括如下步骤：
1）将剪掉结扎两端的脐带放置在清洗液中浸泡，然后用生理盐水冲洗；
2）将冲洗完毕的脐带剪成长短相同的两段，剥离静脉和动脉血管，然后剪碎成1cm3的小组织块；
3）将小组织块接种于培养皿中，向培养皿中加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液进行培养。
优选的，所述步骤1）中的清洗液为含3%双抗的0.9%生理盐水。
优选的，所述步骤1）中清洗液的浸泡时间为3min。
优选的，所述步骤2）中剥离静脉和动脉血管的方法为：沿静脉将脐带撕开或用剪刀剪开，找到2根动脉和1根静脉血管，将血管剥离。
优选的，所述步骤3）中接种的方法为将组织块种于100mm培养皿，间隔1cm，每皿种6-10个组织块。
优选的，所述步骤3）中培养液的加入量为0.07-0.1mL/cm2。
优选的，所述步骤3）中培养液加入时加液的枪头尽量靠近培养皿，且速度缓慢。
有益效果：本技术方案中去除了静脉血管和动脉血管中其他杂质细胞的影响，提高了后期培养所得细胞的纯度。并且本发明将剥离血管后的脐带分成1cm3的组织块，原代细胞的爬出速度快，最终可以获得更多的间充质干细胞。并且采用本发明的方法，提高了从脐带血中分离出充质干细胞的回收率，并且制备的间充质干细胞具有更高的增殖和分化潜能，有利于其在后期研究和临床应用中发挥更加重要的作用。
附图说明
图1为本发明实施例1和对比例1的小组织块原代培养P0代细胞生长状态对比图，其中A为实施例1的组织块原代培养P0代细胞生长状态，B为对比例1原代培养P0代细胞生长状态；
图2本发明实施例1和对比例1的小组织块原代培养P1代细胞生长状态对比图，其中A为实施例1的组织块原代培养P1代细胞生长状态，B为对比例1原代培养P1代细胞生长状态。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1
本发明提供了一种脐带间充质干细胞采集物的处理方法，包括如下步骤：
1）打开手术器械盒，工作人员取带钩镊子一把，不带钩镊子一把，剪刀一把；用酒精棉球擦拭上述手术器械，并在酒精灯上过火；过火完毕，待冷却后将其架在打开的培养皿盖上；开运输瓶上的封口胶，将瓶口在酒精灯火焰上快速过火消毒后打开瓶盖；用镊子夹出脐带，将剪掉结扎两端的脐带放置在含3%双抗的0.9%生理盐水清洗液中浸泡3min，然后用生理盐水冲洗，防止脐带干燥；
2）将冲洗完毕的脐带剪成长短相同的两段，沿静脉将脐带撕开或用剪刀剪开，找到2根动脉和1根静脉血管，将血管剥离；然后部分剪碎成1cm3的小组织块；
3）将小组织块种于100mm培养皿，间隔1cm，每皿种6-10个组织块，向培养皿中加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液进行培养；培养液的加入量为0.07-0.1mL/cm2，培养液加入时加液的枪头尽量靠近培养皿，且速度缓慢。
上述剩余5ml脐带组织装入5支2ml冻存管，加1ml冻存保护液置在-80℃以下保存。
对比例1
对比例1与实施例1的主要区别在于，对比例1将剥离血管后的脐带剪成1-3mm3的小组织块，其他的步骤与实施例1相同。
脐带组织块大小对细胞培养的影响试验：
将实施例1和对比例1中的小组织块分别铺平10皿和 5皿培养皿，加入培养基，置于37℃，5%CO2培养箱中静置7天培养。
7天后第一次换液，组织块培养皿中均无细胞爬出，12天后第二次换液，显微镜下观察实施例1中的组织块周围爬出细胞且较密，对比例1中小块组织块周围刚刚爬出细胞且较稀。
P0传P1代对比：对比例1组织块培养17天后进行传代，10皿传4皿；实施例1组织块组织块培养17天后进行传代，5皿传5皿；细胞生长状态如图1。
P0代细胞数量对比如下表1所示，以5皿计数
表1 P0代细胞数量对比
Figure DEST_PATH_IMAGE001
P1传P2代对比：将实施例1和对比例1的小组织块原代培养至P1代三天后传代，细胞形态状态对比如图2。
P1代细胞数量对比如下表2所示，以5皿计数。
表2 P1代细胞数量对比
Figure 914944DEST_PATH_IMAGE002
从这两例脐带培养结果可以看出，在原代培养过程中，实施例1中的组织块爬出细胞明显快于对比例1的组织块，数量上也多余对比例1，且在形态上实施例1组织块爬出的细胞形态稍小，而在次代培养过程中，以相同浓度铺皿，均是在三天之后细胞扩增至90%-100%融合，达到传代要求，次代细胞形态差异不大。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种脐带间充质干细胞采集物的处理方法，其特征在于，包括如下步骤：
将剪掉结扎两端的脐带放置在清洗液中浸泡，然后用生理盐水冲洗；
将冲洗完毕的脐带剪成长短相同的两段，剥离静脉和动脉血管，然后剪碎成1cm3的小组织块；
将小组织块接种于培养皿中，向培养皿中加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液进行培养。
2.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞采集物的处理方法，其特征在于，所述步骤1）中的清洗液为含3%双抗的0.9%生理盐水。
3.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞采集物的处理方法，其特征在于，所述步骤1）中清洗液的浸泡时间为3min。
4.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞采集物的处理方法，其特征在于，所述步骤2）中剥离静脉和动脉血管的方法为：沿静脉将脐带撕开或用剪刀剪开，找到2根动脉和1根静脉血管，将血管剥离。
5.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞采集物的处理方法，其特征在于，所述步骤3）中接种的方法为将组织块种于100mm培养皿，间隔1cm，每皿种6-10个组织块。
6.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞采集物的处理方法，其特征在于，所述步骤3）中培养液的加入量为0.07-0.1mL/cm2。
7.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞采集物的处理方法，其特征在于，所述步骤3）中培养液加入时加液的枪头尽量靠近培养皿，且速度缓慢。
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