CN111117954A - 一种脐带来源原代间充质干细胞的分离培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种脐带来源原代间充质干细胞的分离培养方法，属于生物技术领域。本发明的分离培养方法包括组织的保存液的配制、脐带采集、脐带消毒清洗、华通氏胶分离、华通氏胶剪碎、离心分离和接种处理。本发明以人脐带为材料提取原代间充质干细胞，提取培养过程无需消化酶，对组织内细胞无伤害，原代细胞分离也无需过滤，提高了提取效率；本发明的培养周期短，效率高，获得的原代间充质干细胞稳定。

Description

一种脐带来源原代间充质干细胞的分离培养方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种脐带来源原代间充质干细胞的分离培养方法。
背景技术
脐带间充质干细胞（UMSCs）具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。它在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。从人脐带中分离出MSCs，且细胞含量、增殖能力强，免疫原性低，并且具有取材方便，无伦理学争议等优点，因此越来越受到研究工作者们的关注。
脐带间充质干细胞是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞。脐带间充质是一类低免疫原性细胞，且具有很强的免疫调节功能。脐带间充质干细胞拥有MSC的全部特性，并且含量丰富，易于分离培养。
脐带间充质干细胞具有多分化潜能，在特定的诱导条件下，UC-MSC不仅能分化为骨、软骨、脂肪、肌腱等中胚层细胞，而且能够向内胚层组织细胞(如心肌细胞、肝细胞)和外胚层组织细胞(如神经细胞)分化。UC-MSC不具致瘤性，能在不同的诱导条件及合适的体内生长微环境中，安全地定向分化为不同的组织细胞系，具有修复各种组织和器官的能力。
人脐带是一种胶状的结缔组织，如何高效地从脐带中分离脐带间充质干细胞是一直以来的难题。原代脐带间充质干细胞的最常见分离方法包括酶消化法。酶消化培养法的经济成本高，通常需要使用专用的消化设备，消化时间长，一般4～5h，且消化程度不易把控，消化不够，无法得到足够数量的细胞，消化时间过久，使用的酶对细胞的损伤大，导致细胞发生损伤、老化聚团，得到的细胞增殖活性不佳，无法在体外快速扩增，获得大量脐带间充质干细胞。且由于消化液为黏稠液体，离心时不易分离出细胞。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种脐带来源原代间充质干细胞的分离培养方法，该方法对组织内细胞损伤小，可更大范围的保护充质干细胞的活性和分化潜能，缩短分离时间同时，缩短爬出细胞出现的时间，具有工艺简便、生产成本低、重复性好。
本发明的上述发明目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种脐带来源原代间充质干细胞的分离培养方法，包括下列步骤：
S1、保存液的配制，将生理盐水和双抗溶液配制成的保存液放入取样瓶，4℃冷藏保存；
S2、脐带采集，在无菌条件下采集脐带组织，并置于保存液中，0-4℃冷藏运输，24小时内对脐带组织进行处理；
S3、脐带消毒清洗，将取样瓶中的脐带取出，置于无菌烧杯中，烧杯放入75%酒精，快速漂洗脐带不超过3分钟，并去除脐带两头各1cm；使用工作液清洗脐带，直至清洗后的溶液基本无色为止；
S4、华通氏胶分离，将脐带进行机械分离，获得剥离的华通氏胶；
S5、华通氏胶剪碎，将华通氏胶剪碎成小于2mm3的组织块；
S6、离心分离，将剪碎的华通氏胶放入无菌烧杯中加5-20ml生理盐水混悬，将细胞组织悬液转移至50ml离心管，生理盐水补足45ml，进行离心处理，去除上清液，取离心沉淀；
S7、接种处理，取多个T175培养瓶，每个T175培养瓶加入10ml DF-12培养基，用移液管或药匙按每1-3ml离心沉淀接种于一个T175培养瓶中，摇匀，均匀平铺到培养瓶底部，并置于培养箱中培养。
上述的脐带来源原代间充质干细胞的分离培养方法，其中，步骤S1中、保存液中的双抗浓度为10％。
上述的脐带来源原代间充质干细胞的分离培养方法，其中，步骤S3中，所述工作液为生理盐水与庆大霉素按质量配比200：1制得。
上述的脐带来源原代间充质干细胞的分离培养方法，其中，步骤S4中，在无菌条件下剥离脐带外模，将脐带的两根动脉和一根静脉去除，得到华通氏胶。
上述的脐带来源原代间充质干细胞的分离培养方法，其中，步骤S5中，包括在无菌烧杯中加入5％双抗的PBS缓冲液，将剥离的华通氏胶剪成0.3-2cm的小段放入无菌烧杯中浸泡3分钟；生理盐水洗净后，用镊子转移至无菌容器中，用手术剪将华通氏胶小段剪碎成1-2mm3的组织块。
上述的脐带来源原代间充质干细胞的分离培养方法，其中，步骤S6中，离心处理以400-1000g离心4-8min。
上述的脐带来源原代间充质干细胞的分离培养方法，其中，步骤S7中，所述培养箱内部的温度为37℃，所述培养箱内部的二氧化碳体积份数5% CO2。
本发明的上述发明目的是通过以下技术方案得以实现的：
1、本发明在分离过程中未采用消化酶，所以得到的细胞不含异种蛋白，对组织细胞的损伤小，缩短了爬出细胞的出现时间，整体上提高了脐带间充质干细胞分离效率。
2、本发明由于直接从脐带内分离华通氏胶，能有效减少脐带分离过程中的污染，避免了杂细胞的污染，保证了细胞的纯度和活力。
附图说明
图1是本发明的步骤框图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步详细说明。
如图1所示，一种脐带来源原代间充质干细胞的分离培养方法，包括下列步骤：
S1、保存液的配制， 将90ml的生理盐水加入取样瓶，再加入10ml双抗溶液，配制浓度为10％双抗保存液，放入4℃冰箱中保存待用。
S2、脐带采集，在无菌条件下采集脐带组织，并置于保存液中，0-4℃冷藏运输，24小时内对脐带组织进行处理。
胎儿娩出后，常规断脐，用碘伏纱布自脐带断端向胎盘断端快速擦拭，消毒2遍并清除血液羊水胎粪，并用含有生理盐水的纱布擦拭1遍去除碘伏，从断口处将脐血放尽并用无菌纱布擦拭除尽脐血。把脐带放入取样瓶， 0-4℃冷藏运输，24小时内送达实验室对脐带组织进行处理，还需要采集母亲外周血5ml进行艾滋、梅毒、乙肝、丙肝、巨细胞病毒检测。
S3、脐带消毒清洗，将取样瓶中的脐带取出，置于无菌烧杯中，烧杯中含有75%酒精，快速漂洗脐带小于3分钟，用镊子去除每段脐带外表面血和挤出血管内的血，将脐带从烧杯中取出，放至新的培养皿，加入的生理盐水漂洗2-3次，去除残留的酒精并使脐带表面不含血迹，并用无菌手术剪去除脐带两头各约1cm，再将脐带转移到新的含有工作液的培养皿中，工作液为生理盐水与庆大霉素按质量配比200：1制得，将脐带清洗2-3遍，使清洗后的工作液基本无色为止。
S4、华通氏胶分离，将脐带进行机械分离，在无菌条件下剥离脐带外模，将脐带的两根动脉和一根静脉去除，得到华通氏胶。
S5、华通氏胶剪碎，在无菌烧杯中加入5％双抗的PBS缓冲液，将剥离的华通氏胶剪成0.3-2cm的小段放入无菌烧杯浸泡3分钟；生理盐水洗净后，用镊子转移至无菌容器中，用手术剪剪碎约400-500次左右，将华通氏胶小段剪碎成1-2mm3的组织块。
S6、离心分离，将剪碎的华通氏胶放入无菌烧杯中加5-20ml生理盐水混悬，将细胞组织悬液转移至50ml离心管，生理盐水补足45ml，进行离心处理，去除上清液，取离心沉淀，离心处理以400-1000g离心4-8min。
S7、接种处理，取多个T175培养瓶，每个T175培养瓶加入10ml DF-12培养基，每个T175培养瓶进行详细标注样本信息，如日期、操作人姓名、细胞标号等，用移液管或药匙按每1-3ml离心沉淀接种于一个T175培养瓶中，摇匀，均匀平铺到培养瓶底部，并置于培养箱中培养，培养箱内部的温度为37±0.4℃，所述培养箱内部的二氧化碳体积份数5%±0.1CO2。
本发明的细胞从组织中爬出的时间由15-20天，缩短至5-10天，大大提升了工作效率，且经过流式细胞鉴定细胞纯度为99.9%。
实施例1：
S1、保存液的配制， 将90ml的生理盐水加入取样瓶，再加入10ml双抗溶液，配制浓度为10％双抗保存液，放入4℃冰箱中保存待用。
S2、脐带采集，在无菌条件下采集脐带组织，并置于保存液中，0-4℃冷藏运输，24小时内对脐带组织进行处理。
S3、脐带消毒清洗，将取样瓶中的脐带取出，置于无菌烧杯中，烧杯中含有75%酒精，快速漂洗脐带3分钟，用镊子去除每段脐带外表面血和挤出血管内的血，将脐带从烧杯中取出，放至新的培养皿，加入的生理盐水漂洗2-3次，去除残留的酒精并使脐带表面不含血迹，并用无菌手术剪去除脐带两头各约1cm，再将脐带转移到新的含有工作液的培养皿中，工作液为生理盐水与庆大霉素按质量配比200：1制得，将脐带清洗2-3遍，使清洗后的工作液基本无色为止。
S4、华通氏胶分离，将脐带进行机械分离，在无菌条件下剥离脐带外模，将脐带的两根动脉和一根静脉去除，得到华通氏胶。
S5、华通氏胶剪碎，在无菌烧杯中加入5％双抗的PBS缓冲液，将剥离的华通氏胶剪成2cm的小段放入无菌烧杯浸泡3分钟；生理盐水洗净后，用镊子转移至无菌容器中，用手术剪剪碎约400-500次左右，将华通氏胶小段剪碎成1-2mm3的组织块。
S6、离心分离，将剪碎的华通氏胶放入无菌烧杯中加20ml生理盐水混悬，将细胞组织悬液转移至50ml离心管，生理盐水补足45ml，进行离心处理，去除上清液，取离心沉淀，离心处理以1000g离心4min。
S7、接种处理，取多个T175培养瓶，每个T175培养瓶加入10ml DF-12培养基，每个T175培养瓶进行详细标注样本信息，如日期、操作人姓名、细胞标号等，用移液管或药匙按每3ml离心沉淀接种于一个T175培养瓶中，摇匀，均匀平铺到培养瓶底部，并置于培养箱中培养，培养箱内部的温度为37±0.4℃，所述培养箱内部的二氧化碳体积份数5%±0.1CO2。
实施例二：
S1、保存液的配制， 将90ml的生理盐水加入取样瓶，再加入10ml双抗溶液，配制浓度为10％双抗保存液，放入4℃冰箱中保存待用。
S2、脐带采集，在无菌条件下采集脐带组织，并置于保存液中，0-4℃冷藏运输，24小时内对脐带组织进行处理。
S3、脐带消毒清洗，将取样瓶中的脐带取出，置于无菌烧杯中，烧杯中含有75%酒精，快速漂洗脐带2分钟，用镊子去除每段脐带外表面血和挤出血管内的血，将脐带从烧杯中取出，放至新的培养皿，加入的生理盐水漂洗2-3次，去除残留的酒精并使脐带表面不含血迹，并用无菌手术剪去除脐带两头各约1cm，再将脐带转移到新的含有工作液的培养皿中，工作液为生理盐水与庆大霉素按质量配比200：1制得，将脐带清洗2-3遍，使清洗后的工作液基本无色为止。
S4、华通氏胶分离，将脐带进行机械分离，在无菌条件下剥离脐带外模，将脐带的两根动脉和一根静脉去除，得到华通氏胶。
S5、华通氏胶剪碎，在无菌烧杯中加入5％双抗的PBS缓冲液，将剥离的华通氏胶剪成1.5cm的小段放入无菌烧杯浸泡3分钟；生理盐水洗净后，用镊子转移至无菌容器中，用手术剪剪碎约400-500次左右，将华通氏胶小段剪碎成1-2mm3的组织块。
S6、离心分离，将剪碎的华通氏胶放入无菌烧杯中加10ml生理盐水混悬，将细胞组织悬液转移至50ml离心管，生理盐水补足45ml，进行离心处理，去除上清液，取离心沉淀，离心处理以800g离心5min。
S7、接种处理，取多个T175培养瓶，每个T175培养瓶加入10ml DF-12培养基，每个T175培养瓶进行详细标注样本信息，如日期、操作人姓名、细胞标号等，用移液管或药匙按每1.5ml离心沉淀接种于一个T175培养瓶中，摇匀，均匀平铺到培养瓶底部，并置于培养箱中培养，培养箱内部的温度为37±0.4℃，所述培养箱内部的二氧化碳体积份数5%±0.1CO2。
实施例三：
S1、保存液的配制， 将90ml的生理盐水加入取样瓶，再加入10ml双抗溶液，配制浓度为10％双抗保存液，放入4℃冰箱中保存待用。
S2、脐带采集，在无菌条件下采集脐带组织，并置于保存液中，0-4℃冷藏运输，24小时内对脐带组织进行处理。
S3、脐带消毒清洗，将取样瓶中的脐带取出，置于无菌烧杯中，烧杯中含有75%酒精，快速漂洗脐带1.5分钟，用镊子去除每段脐带外表面血和挤出血管内的血，将脐带从烧杯中取出，放至新的培养皿，加入的生理盐水漂洗2-3次，去除残留的酒精并使脐带表面不含血迹，并用无菌手术剪去除脐带两头各约1cm，再将脐带转移到新的含有工作液的培养皿中，工作液为生理盐水与庆大霉素按质量配比200：1制得，将脐带清洗2-3遍，使清洗后的工作液基本无色为止。
S4、华通氏胶分离，将脐带进行机械分离，在无菌条件下剥离脐带外模，将脐带的两根动脉和一根静脉去除，得到华通氏胶。
S5、华通氏胶剪碎，在无菌烧杯中加入5％双抗的PBS缓冲液，将剥离的华通氏胶剪成1cm的小段放入无菌烧杯浸泡3分钟；生理盐水洗净后，用镊子转移至无菌容器中，用手术剪剪碎约400-500次左右，将华通氏胶小段剪碎成1-2mm3的组织块。
S6、离心分离，将剪碎的华通氏胶放入无菌烧杯中加5ml生理盐水混悬，将细胞组织悬液转移至50ml离心管，生理盐水补足45ml，进行离心处理，去除上清液，取离心沉淀，离心处理以400g离心4min。
S7、接种处理，取多个T175培养瓶，每个T175培养瓶加入10ml DF-12培养基，每个T175培养瓶进行详细标注样本信息，如日期、操作人姓名、细胞标号等，用移液管或药匙按每1ml离心沉淀接种于一个T175培养瓶中，摇匀，均匀平铺到培养瓶底部，并置于培养箱中培养，培养箱内部的温度为37±0.4℃，所述培养箱内部的二氧化碳体积份数5%±0.1CO2。
本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种脐带来源原代间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括下列步骤：
S1、保存液的配制，将生理盐水和双抗溶液配制成的保存液放入取样瓶，4℃冷藏保存；
S2、脐带采集，在无菌条件下采集脐带组织，并置于保存液中，0-4℃冷藏运输，24小时内对脐带组织进行处理；
S3、脐带消毒、清洗，将取样瓶中的脐带取出，置于无菌烧杯中，烧杯放入75%酒精，快速漂洗脐带小于3分钟，并去除脐带两头各1cm；使用工作液清洗脐带，直至清洗后的溶液基本无色为止；
S4、华通氏胶分离，将脐带进行机械分离，获得剥离的华通氏胶；
S5、华通氏胶剪碎，将华通氏胶剪碎成小于2mm3的组织块；
S6、离心分离，将剪碎的华通氏胶放入无菌烧杯中加5-20ml生理盐水混悬，将细胞组织悬液转移至50ml离心管，生理盐水补足45ml，进行离心处理，去除上清液，取离心沉淀；
S7、接种处理，取多个T175培养瓶，每个T175培养瓶加入10ml DF-12培养基，用移液管或药匙按每1-3ml离心沉淀接种于一个T175培养瓶中，摇匀，均匀平铺到培养瓶底部，并置于培养箱中培养。
2.如权利要求1所述的脐带来源原代间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤S1中、保存液中的双抗浓度为10％。
3.如权利要求1所述的脐带来源原代间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤S3中，所述工作液为生理盐水与庆大霉素按质量配比200：1制得。
4.如权利要求1所述的脐带来源原代间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤S4中，在无菌条件下剥离脐带外模，将脐带的两根动脉和一根静脉去除，得到华通氏胶。
5.如权利要求1所述的脐带来源原代间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤S5中，包括在无菌烧杯中加入5％双抗的PBS缓冲液，将剥离的华通氏胶剪成0.3-2cm的小段放入无菌烧杯中浸泡3分钟；生理盐水洗净后，用镊子转移至无菌容器中，用手术剪将华通氏胶小段剪碎成1-2mm3的组织块。
6.如权利要求1所述的脐带来源原代间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤S6中，离心处理以400-1000g离心4-8min。
7.如权利要求1所述的脐带来源原代间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤S7中，所述培养箱内部的温度为37℃，所述培养箱内部的二氧化碳体积份数5% CO2。
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