JP2013514072A - 臍帯組織から間葉系前駆細胞の亜集団を含む単核細胞および内皮前駆細胞の亜集団を含む血管細胞を単離する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
発明の領域
本発明は、一般に、間葉系細胞および内皮前駆細胞に関し、より具体的には、臍帯組織から間葉系細胞および血管前駆細胞を単離する方法に関する。
間葉系間質細胞または前駆細胞または幹細胞の優れた供給源が、臍帯の間質であるホウォートンゼリーであることは、既に確立されている。臍帯は、胚発生13日目に胚外中胚葉から発生し、2本の動脈および1本の静脈から構成されており、それらは全て、プロテオグリカンおよびムコ多糖に富む独特の結合組織間質であるホウォートンゼリーにより取り囲まれている。コラーゲンに富むマトリックスに埋め込まれたこれらの間質細胞は、典型的な繊維芽細胞ではなく、むしろ筋線維芽細胞である。最近の研究において、臍帯間質細胞が間葉系幹細胞の特徴を保有しており、臍帯間質細胞が心筋形成型、軟骨形成型、骨形成型、および脂肪形成型のような間葉系細胞系統へと分化することが報告された。ヒト血管周囲臍細胞および得られた骨形成性結節の単離、培養、および分化の挙動は、数人の研究者により既に証明されている。ヒト臍帯間葉系幹細胞のドーパミン作動性ニューロンへの分化能も証明されている。最近、ブタ臍帯マトリックス細胞において、Oct-4、Sox-2、およびNanogのような胚性幹細胞マーカーのうちのいくつかが証明された。同様に、臍帯の血管系から得られた内皮前駆細胞は、他の供給源から得られた類似の前駆細胞の特性を保有していることが示されている。
MSCは、臍帯のいくつかのコンパートメント(図1)から単離されている。具体的には、MSCは、臍帯血、臍静脈内皮下層、およびホウォートンゼリー(図1)から単離されている。ホウォートンゼリー内では、MSCは、比較的不明瞭な三つの領域:血管周囲ゾーン、血管間ゾーン、および羊膜下から単離されている。臍帯の異なるコンパートメントから単離されたMSCが異なる集団を表すか否かは未知である。この考察は、ホウォートンゼリー細胞(WJC;図1のゾーン3〜5)から単離されたMSCに制限される。ホウォートンゼリー細胞(WJC)の亜集団は、MSC表面マーカーを示し、従って、それらはMSCファミリーであることが示唆される。
五つの別々の領域が間葉系間質細胞を含有していることが示されている:(1)MSCは、臍帯血から新鮮に調製された単核細胞画分の20〜50%から単離され得る;(2)MSCは、臍静脈内皮下層から単離されている;(3)MSCは、臍血管の外層、例えば、血管周囲領域の酵素消化の後、単離され得る;(4)健康な個体において、血管内空間は一貫してMSCを産生する;(5)羊膜下領域。ホウォートンゼリーはゾーン3〜5を含む。この概説は、臍帯血(ゾーン1)または臍静脈内皮下層(ゾーン2)に由来するMSCではなく、ホウォートンゼリー由来細胞に焦点を当てる。
本発明は、臍帯組織からのホウォートンゼリーからの間葉系幹細胞の亜集団を含有している単核細胞および内皮前駆細胞の亜集団を含有している血管細胞の単離、加工、および凍結保存のための方法および専用キットに関する。
本発明の組成物、方法、および培養方法論を記載する前に、本発明は、記載された特定の組成物、方法、および実験条件に限定されず、従って、組成物、方法、および条件は変動し得ることが理解されるべきである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲においてのみ限定されるため、本明細書において使用される用語法は、特定の態様を記載することのみを目的とし、限定的なものではないことも理解されるべきである。
凍結保存された細胞の生成
間葉系細胞および血管前駆細胞を単離する方法は、以下のようにして、以下の試薬、装置、および消耗品を用いて、実施され得る。
i. 獲得時の充填用の無菌の容器(例えば、Sterilin製品コード190DB/IRR無菌250ml容器);
ii. 獲得時に臍帯の両端に固定される2個の無菌の鉗子;
iii. 液体(例えば、血液/羊水/膣液)を除去するための無菌のガーゼ;
iv. 充填前の除染のためのアルコール/70%エタノールまたは類似のあらかじめパックされたスワブ;
v. 洗浄/注射用生理食塩水(例えば、輸送中に臍帯に添加される約100mlのメディカルグレード0.9%NaCl溶液);および
vi. 無菌のハサミ(好ましくは、使い捨て)。
試薬、消耗品、および装置には、表1に示される以下のものが含まれ得る。
LOは、加工の全体を通したUCTの追跡可能性、およびSOP-01手法で決定された指定された細胞保管場所への細胞治療生成物の安全な貯蔵管理(banking)を維持する責任を負う。
以下の手法は、GentleMACS(商標)テクノロジーを使用した自動化された細胞解離、および組織の手動の細砕(mincing)の両方に適用される。
静脈を同定し、端から端までモスキート鉗子を挿入する。2本の動脈を同定する。有鈎トリーブ(trieve)を使用して、1本の動脈およびその血管周囲ゼリーの一部を固定する。静脈を拡大させたまま、モスキート鉗子を除去する。他の有鈎トリーブを使用して、拡大した静脈を固定し、動脈および血管周囲組織を臍帯切片から解離させるため、動脈を保持しているトリーブを引く。
Claims (9)
- 以下を含む、臍帯組織から間葉系細胞を単離する方法:
(a)臍帯の試料由来のホウォートンゼリー(WJ)マトリックスから血管組織を分離する工程、
(b)WJマトリックスから細胞を解離させ、血漿中に懸濁させる工程、
(c)解離した細胞を未解離の細胞およびマトリックスから分離する工程、ならびに
(d)解離し分離した細胞を凍結保存し、それにより、臍組織から間葉系細胞を単離する工程。 - 凍結保存が、凍結保護剤を解離し分離した細胞と混和する工程を含む、請求項1記載の方法。
- 解離し分離した細胞が汚染菌を含まないことを確証する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 請求項1記載の方法により得た、単離された間葉系細胞。
- 以下を含む、臍帯組織から血管前駆細胞を単離する方法:
(a)臍帯の試料由来のホウォートンゼリー(WJ)マトリックスから血管組織を分離する工程、
(b)血管組織から血管前駆細胞を解離させ、血漿中に懸濁させる工程、および
(c)解離した血管前駆細胞を凍結保存し、それにより、臍組織から血管前駆細胞を単離する工程。 - 凍結保存が、凍結保護剤を解離した血管前駆細胞と混和する工程を含む、請求項5記載の方法。
- 解離した血管前駆細胞が汚染菌を含まないことを確証する工程をさらに含む、請求項5記載の方法。
- 請求項5記載の方法により得た、単離された血管前駆細胞。
- 以下を含むキット:
(a)獲得時の充填用の無菌の容器、
(b)2個の無菌の鉗子、
(c)無菌のガーゼ、
(d)アルコールスワブ、
(e)生理食塩水溶液、および
(f)無菌のハサミ。
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