RU2674344C2 - Способ получения биобезопасной культуры мезенхимальных стволовых клеток из Вартонова студня пуповины человека - Google Patents
Способ получения биобезопасной культуры мезенхимальных стволовых клеток из Вартонова студня пуповины человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2674344C2 RU2674344C2 RU2016149581A RU2016149581A RU2674344C2 RU 2674344 C2 RU2674344 C2 RU 2674344C2 RU 2016149581 A RU2016149581 A RU 2016149581A RU 2016149581 A RU2016149581 A RU 2016149581A RU 2674344 C2 RU2674344 C2 RU 2674344C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- culture
- cells
- umbilical cord
- mesenchymal stem
- stem cells
- Prior art date
Links
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 26
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 title claims abstract description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 title abstract 4
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 title abstract 4
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 title abstract 4
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 title abstract 4
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 title abstract 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 36
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000002356 single layer Substances 0.000 claims abstract description 11
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims abstract description 10
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 10
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims abstract description 9
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract description 5
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 claims abstract description 5
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 229930183010 Amphotericin Natural products 0.000 claims abstract description 4
- QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N Amphotericin A Natural products OC1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C=CC=CC=CC=CCCC=CC=CC(C)C(O)C(C)C(C)OC(=O)CC(O)CC(O)CCC(O)C(O)CC(O)CC(O)(CC(O)C2C(O)=O)OC2C1 QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 229940009444 amphotericin Drugs 0.000 claims abstract description 4
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims abstract description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 10
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims description 7
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000008274 jelly Substances 0.000 claims description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 5
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims 1
- 241000208202 Linaceae Species 0.000 claims 1
- 235000004431 Linum usitatissimum Nutrition 0.000 claims 1
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 abstract description 3
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 abstract description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 abstract description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 abstract description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 abstract 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 4
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 4
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 208000034423 Delivery Diseases 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 101000785710 Homo sapiens Zinc finger protein 281 Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102100026316 Zinc finger protein 281 Human genes 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 230000036266 weeks of gestation Effects 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 208000027089 Parkinsonian disease Diseases 0.000 description 1
- 206010034010 Parkinsonism Diseases 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 239000012907 medicinal substance Substances 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 206010033675 panniculitis Diseases 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000011476 stem cell transplantation Methods 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004003 subcutaneous fat Anatomy 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/48—Reproductive organs
- A61K35/50—Placenta; Placental stem cells; Amniotic fluid; Amnion; Amniotic stem cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине, а именно к биотехнологии, и может быть использовано для получения биобезопасной культуры мезенхимальных стволовых клеток из Вартонова студня пуповины человека. Способ включает выделение из ткани пуповины после операции «кесарево сечение» первичной культуры мезенхимальных стволовых клеток из Вартонова студня. Причем при выделении мезенхимальных стволовых клеток пуповину освобождают от остатков крови и промывают в растворе Версена с добавлением антибиотиков 100 Ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,25 мкг/мл амфотерицина в течение 1 ч при комнатной температуре на шейкере, вены канюлируют с обеих сторон и промывают физиологическим раствором (0,9%). Дезагрегацию ткани проводят раствором, содержащим 0,1% коллагеназы 2 типа и 0,15% коллагеназы 4 типа, приготовленным на среде DMEM/F12 в соотношении 1:1, инкубируют при 37°С в течение 30 мин, собирают отделившиеся клетки. Далее центрифугируют при 800 об/мин в течение 15 мин, получая осадок клеток, который ресуспендируют в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 100 Ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия. Ресуспендируют осадок клеток в ростовой среде DMEM/F12 в соотношении 1:1, переносят в культуральные флаконы и культивируют в атмосфере, содержащей 5% СO2 до формирования 3/4 монослоя, меняя ростовую среду 3 раза в неделю. При достижении 3/4 монослоя клетки пересевают, получая культуру МСК, причем после 1 пассажа часть клеток используют для выявления наличия в культуре вирусов СПИД, гепатита В и С и микоплазмы методом ПЦР и в случае позитивного анализа на эти инфекции культура бракуется. Использование данного способа позволяет повысить выход и жизнеспособность мезенхимальных стволовых клеток, полученных из Вартонова студня пуповины человека. 1 табл.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и клеточной терапии и касается получения из Вартонова студня пуповины человека биобезопасной культуры мезенхимальных стволовых клеток однородной клеточной популяции. Изобретение может найти применение в медицине для лечения различных заболеваний.
В настоящее время клеточная терапия находит все более широкое применение в медицине. Путем трансплантации стволовых клеток успешно лечат различные заболевания, такие, как остеопороз (Патент РФ №2265442 от 10.12.2005), аллергические заболевания (Патент РФ №2250773 от 27.04.2005), паркинсонизм (Патент РФ №2259836 от 10.09.2005), травму головного мозга (Патент РФ №2216336 от 20.11.2003), онкологические заболевания (Патент РФ №2257219 от 27.07.2005), выращивают органы для трансплантации, изготавливают фармпрепараты из их дериватов.
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) нередко используют в роли трансплантата, т.к. они активизируют собственные резервы организма, способствуют образованию цитокинов и факторов роста.
Обычно МСК получают из костного мозга, (патент 2303632) хотя их можно выделять из фетальных органов гемопоэза, из скелетных мышц, из подкожной жировой ткани. Выделение и культивирование МСК относительно несложно, но существует проблема получения однородной клеточной популяции мезенхимальных стволовых клеток в достаточном количестве для трансплантации и консервации впрок. По известным методикам выращивания МСК из костного мозга обычно получают гетерогенные популяции клеток стромы с незначительным содержанием в них стволовых клеток. В работе с МСК используют традиционные методики работы с клетками (Культура животных клеток. Методы. Под ред. Р.Фрешни. М.: Мир. 1989 г. ), в каждом случае подбирая индивидуальную последовательность действий, условия выделения и наработки клеточной массы.
Однако одним из наиболее перспективных источников стволовых клеток является пуповина человека, (патент 2303632RU)
Известен способ лечения заболеваний роговицы у собак, заключающийся в ретробульбарном введении лекарственного вещества в непосредственной близости от патологического очага, отличающийся тем, что в качестве лекарственного средства используют мезенхимальные стволовые клетки пуповины или плаценты, взятые после нормальных родов, при этом осуществляют ретробульбарное введение клеток путем инъекции 1-2 мл физиологического раствора, содержащего 0,075-0,20×10 6 клеток/кг веса одномоментно 1-2 раза в год. Мезенхимальные стволовые клетки пуповины или плаценты были получены в соответствии со стандартной методикой следующим образом. Образцы пуповины или плаценты человека собирали после нормальных родов на 39-40 неделе гестации. Вены пуповины и плаценты канюлировали и промывали вначале раствором Хенкса, а затем 0,1% раствором коллагеназы I типа, приготовленным на среде DMEM без сыворотки, и инкубировали при 37°С 30 мин. Затем сосуды вновь промывали раствором Хенкса, ткань подвергали непродолжительному мягкому механическому воздействию, и собирали отделившиеся клетки. Полученные клетки осаждали центрифугированием. Осадок ресуспендировали в среде DMEM, содержащей 10% сыворотки, 100 Ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия, 10 нг/мл базального фактора роста фибробластов (b-FGF), переносили в культуральные чашки и культивировали до формирования монослоя, меняя среду 2 раза в неделю. При достижении монослоя клетки пересевали в соотношении 1:3. (патент 2481112 RU)
Известен СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ПРОИСХОДЯЩИХ ИЗ ПУПОВИННОЙ КРОВИ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ZNF281 (патент 2511417 RU)
Недостатком способа является то, что в крови подавляющая часть стволовых клеток преиндуцирована в сторону клеток крови и не может быть использована для лечения заболеваний, не связанных с патологией крови.
Известен СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СОСУДИСТЫХ И ДЕМИЕЛИНИЗИРУЮЩИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ И КЛЕТОЧНАЯ КУЛЬТУРА, ПОЛУЧЕННАЯ ЭТИМ СПОСОБОМ (патент RU 2347579), включающий в себя выделение из пуповины новорожденного после нормальных родов культуры стволовых клеток, отличающийся тем, что осуществляют выделение культуры аллогенных мезенхимальных стволовых клеток для парентерального введения их пациенту с неврологической патологией, при выделении аллогенных мезенхимальных стволовых клеток пуповину освобождают от остатков крови и промывают в растворе Версена с добавлением антибиотиков 100 Ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,250/мл амфотерицина в течение 1 ч при комнатной температуре на шейкере, вены канюлируют с обеих сторон и промывают сначала раствором Хенкса, а затем 0,1%-ным раствором коллагеназы 1 типа, приготовленным на среде DMEM, и инкубируют при 37°С в течение 30 мин, затем осуществляют механическое воздействие на ткани пуповины, собирают отделившиеся клетки, промывая их раствором Хенкса, полученную после механического воздействия и промывания суспензию клеток центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин, получая осадок клеток, который ресуспензируют в ростовой среде DMEM, содержащей 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 100 Ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия, ресуспендированный осадок клеток в ростовой среде DMEM переносят в культуральные чашки и культивируют до формирования монослоя, меняя ростовую среду DMEM 2 раза в неделю, и при достижении монослоя клетки пересевают в соотношении 1:3, а перед проведением клеточной терапии монослой переводят в суспензию путем обработки смесью раствора Версена и 0,25%-ного раствора трипсина в соотношении 1:1 в течение 20 мин при 37°С, которую затем трижды промывают физиологическим раствором с рН 7,2, затем суспензию осаждают центрифугированием в течение 5 мин при 1000 об/мин, осадок клеток ресуспензируют в стерильном физиологическом растворе, получая аллогенные мезенхимальные стволовые клетки пуповины человека в количестве от 1-5 млн клеток в 5 мл физиологического раствора. Способ по п. 1, отличающийся тем, что выделение аллогенных мезенхимальных клеток производят из пуповины новорожденного после нормальных родов на 38-40 недели гестации. Клеточная культура для лечения заболеваний нервной системы, включающая полученную из пуповины новорожденного культуру стволовых клеток для парентерального введения их пациенту, отличающаяся тем, что она получена с возможностью выделения культуры аллогенных мезенхимальных стволовых клеток по п. 1, причем количество аллогенных мезенхимальных стволовых клеток в клеточной культуре - в диапазоне от 1 до 5 млн клеток в 5 мл физиологического раствора. Способ выбран нами в качестве прототипа. Недостатком прототипа является низкий выход МСК и низкая жизнеспособность клеток, вызванная применением в качестве дезагреганта смеси смесью раствора Версена и 0,25%-ного раствора трипсина в соотношении 1:1 в течение 20 мин при 37°С. Кроме того, такая культура может нести опасность для реципиента и медицинского персонала, проводящего манипуляции с такими препаратами из-за их возможной зараженности вирусами СПИДА, гепатитов В и С, микоплазмой.
Нами предложен способ получения биобезопасной культуры мезенхимальных стволовых клеток из Вартонова студня пуповины человека, включающий в себя выделение из пуповины новорожденного после операции «кесарево сечение» первичной культуры мезенхимальных стволовых клеток из Вартонова студня. При выделении мезенхимальных стволовых клеток пуповину освобождают от остатков крови и промывают в растворе Версена с добавлением антибиотиков 200 Ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,25 мкг/мл амфотерицина в течение 1 ч при комнатной температуре на шейкере, вены канюлируют с обеих сторон и промывают физиологическим раствором (0,9%), затем осуществляют механическое и ферментативное воздействие на ткани пуповины, собирают отделившиеся клетки. Данный способ отличается тем, что дезагрегацию ткани проводят раствором, содержащим 0,1% коллагеназы 2 типа и 0,15% коллагеназы 4 типа, приготовленным на среде DMEM\F12 в соотношении 1:1, инкубируют при 37°С в течение 30 мин, собирают отделившиеся клетки, центрифугируют при 800 об/мин в течение 15 мин, получая осадок клеток, который ресуспендируют в ростовой среде DMEM\ F12, содержащей 10% фетальной сыворотки теленка, 100 Ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия, ресуспендируют осадок клеток в ростовой среде DMEM\ F12 в соотношении 1:1 переносят в культуральные флаконы и культивируют в атмосфере, содержащей 5% CO2 до формирования 3\4 монослоя, меняя ростовую среду 3 раза в неделю, и при достижении 3\4 монослоя клетки пересевают в соотношении 1:2, причем после 1 пассажа часть клеток используют для выявления наличия в культуре вирусов СПИД, гепатита В и С и микоплазмы методом ПЦР и в случае позитивного анализа на эти инфекции культура бракуется.
Предложенный способ позволяет получать биобезопасную культуру, не зараженную опасными вирусами. Пересев клеток при достижении ими 3\4 монослоя позволяет поддерживать их в стадии логарифмического роста, что препятствует дифференцировке и повышает пролиферативный потенциал. Применение в качестве дезагрегирующего агента смеси содержащей 0,1% коллагеназы 2 типа и 0,15% коллагеназы 4 типа, приготовленной на среде DMEM\ F12 в соотношении 1:1 повышает выход и жизнеспособность клеток (табл. 1)
Claims (1)
- Способ получения биобезопасной культуры мезенхимальных стволовых клеток из Вартонова студня пуповины человека, включающий в себя выделение из ткани пуповины после операции «кесарево сечение» первичной культуры мезенхимальных стволовых клеток из Вартонова студня, причем при выделении мезенхимальных стволовых клеток пуповину освобождают от остатков крови и промывают в растворе Версена с добавлением антибиотиков 100 Ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,25 мкг/мл амфотерицина в течение 1 ч при комнатной температуре на шейкере, вены канюлируют с обеих сторон и промывают физиологическим раствором (0,9%), затем осуществляют механическое и ферментативное воздействие на ткани пуповины и собирают отделившиеся клетки, отличающийся тем, что дезагрегацию ткани проводят раствором, содержащим 0,1% коллагеназы 2 типа и 0,15% коллагеназы 4 типа, приготовленным на среде DMEM/F12 в соотношении 1:1, инкубируют при 37°С в течение 30 мин, собирают отделившиеся клетки, центрифугируют при 800 об/мин в течение 15 мин, получая осадок клеток, который ресуспендируют в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 100 Ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия, ресуспендируют осадок клеток в ростовой среде DMEM/F12 в соотношении 1:1, переносят в культуральные флаконы и культивируют в атмосфере, содержащей 5% СO2 до формирования 3/4 монослоя, меняя ростовую среду 3 раза в неделю, и при достижении 3/4 монослоя клетки пересевают, получая культуру МСК, причем после 1 пассажа часть клеток используют для выявления наличия в культуре вирусов СПИД, гепатита В и С и микоплазмы методом ПЦР и в случае позитивного анализа на эти инфекции культура бракуется.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016149581A RU2674344C2 (ru) | 2016-12-16 | 2016-12-16 | Способ получения биобезопасной культуры мезенхимальных стволовых клеток из Вартонова студня пуповины человека |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016149581A RU2674344C2 (ru) | 2016-12-16 | 2016-12-16 | Способ получения биобезопасной культуры мезенхимальных стволовых клеток из Вартонова студня пуповины человека |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2016149581A3 RU2016149581A3 (ru) | 2018-06-20 |
| RU2016149581A RU2016149581A (ru) | 2018-06-20 |
| RU2674344C2 true RU2674344C2 (ru) | 2018-12-07 |
Family
ID=62619405
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016149581A RU2674344C2 (ru) | 2016-12-16 | 2016-12-16 | Способ получения биобезопасной культуры мезенхимальных стволовых клеток из Вартонова студня пуповины человека |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2674344C2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2710263C1 (ru) * | 2019-09-19 | 2019-12-25 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Самарский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ получения и культивирования фибробластоподобных клеток из пуповины новорожденного |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2252252C1 (ru) * | 2004-04-09 | 2005-05-20 | Тепляшин Александр Сергеевич | Способ выделения мезенхимальных стволовых клеток |
| RU2347579C1 (ru) * | 2007-07-03 | 2009-02-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Медицинские технологии" | Способ получения клеточной культуры для лечения сосудистых и демиелинизирующих заболеваний нервной системы и клеточная культура, полученная этим способом (варианты) |
| WO2011073388A1 (en) * | 2009-12-18 | 2011-06-23 | Lifeline Cord Blood Bank | Methods for isolating mononuclear cells that include a subpopulation of mesenchymal progenitor cells and vascular cells that include a subpopulation of endothelial progenitor cells from umbilical cord tissue |
| CN104762256A (zh) * | 2015-03-26 | 2015-07-08 | 湖北省生命源干细胞有限公司 | 一种从脐带华通氏胶提取间充质干细胞的方法 |
-
2016
- 2016-12-16 RU RU2016149581A patent/RU2674344C2/ru active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2252252C1 (ru) * | 2004-04-09 | 2005-05-20 | Тепляшин Александр Сергеевич | Способ выделения мезенхимальных стволовых клеток |
| RU2347579C1 (ru) * | 2007-07-03 | 2009-02-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Медицинские технологии" | Способ получения клеточной культуры для лечения сосудистых и демиелинизирующих заболеваний нервной системы и клеточная культура, полученная этим способом (варианты) |
| WO2011073388A1 (en) * | 2009-12-18 | 2011-06-23 | Lifeline Cord Blood Bank | Methods for isolating mononuclear cells that include a subpopulation of mesenchymal progenitor cells and vascular cells that include a subpopulation of endothelial progenitor cells from umbilical cord tissue |
| CN104762256A (zh) * | 2015-03-26 | 2015-07-08 | 湖北省生命源干细胞有限公司 | 一种从脐带华通氏胶提取间充质干细胞的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| АРУТЮНЯН И.В. И ДР. Проангиогенный потенциал мультьипотентных стромальных слеток пупочного канатика человека: исследование in vitro // II Национальный конгресс по регенративной медицине, Москва, 2-5 декабря 2015 г., Материалы конггресса: стр.11-12, [онлайн], [найдено 22.03.2018]. Найдено из Интернет: URL: https://mediexpo.ru/fileadmin/user_upload/content/pdf/thesis/thesis_nkrm2015.pdf. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2710263C1 (ru) * | 2019-09-19 | 2019-12-25 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Самарский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ получения и культивирования фибробластоподобных клеток из пуповины новорожденного |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2016149581A3 (ru) | 2018-06-20 |
| RU2016149581A (ru) | 2018-06-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7060494B2 (en) | Growth of human Mesenchymal Stem Cells (hMSC) using umbilical cord blood serum and the method for the preparation thereof | |
| Toupadakis et al. | Comparison of the osteogenic potential of equine mesenchymal stem cells from bone marrow, adipose tissue, umbilical cord blood, and umbilical cord tissue | |
| US20040203142A1 (en) | Growth of neural precursor cells using umbilical cord blood serum and a process for the preparation thereof for therapeutic purposes | |
| RU2323252C1 (ru) | Способ культивирования мезенхимальных стволовых клеток человека ex vivo | |
| KR20190055790A (ko) | 세포 배양 배지를 사용한 제대 양막(umbilical cord amniotic membrane)으로부터 중간엽 줄기세포를 분리하는 방법 | |
| JP2020191861A (ja) | 臍帯間葉系幹細胞ＭＳＣｓ及びその培養法と応用 | |
| JP6545690B2 (ja) | 栄養膜基底層から由来した幹細胞及びそれを含む細胞治療剤 | |
| KR20120095022A (ko) | 간엽줄기세포 및 면역조절 ｔ 세포를 유효성분으로 포함하는 이식편대숙주질환 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물 | |
| KR101585032B1 (ko) | 중간엽줄기세포-하이드로겔을 함유하는 조성물 및 이의 제조방법 | |
| KR101430708B1 (ko) | 인간 침샘 줄기세포, 그 제조방법, 그 배양액, 및 침샘 손상 치료를 위한 그 용도 | |
| CN113005078A (zh) | 一种筛选优质人脐带间充质干细胞免疫调节能力干细胞量化标准的构建方法及应用 | |
| TW201809269A (zh) | 細胞培養用培養基及細胞培養方法 | |
| CN111849883A (zh) | 一种用于体外扩增自体人毛囊间充质干细胞培养基及其培养方法 | |
| KR20180122288A (ko) | 사람 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포 기반 3d 바이오프린팅 조직체 및 이의 이용 | |
| CN106701670A (zh) | 一种增强间充质干细胞分泌生物活性因子能力及培养液中活性因子的提取方法 | |
| RU2645255C1 (ru) | Способ получения биобезопасной культуры мезенхимальных стволовых клеток из ворсин хориона человека | |
| RU2674344C2 (ru) | Способ получения биобезопасной культуры мезенхимальных стволовых клеток из Вартонова студня пуповины человека | |
| CN110090227B (zh) | 人羊膜上皮细胞在治疗移植物抗宿主病中的用途 | |
| WO2022247848A1 (zh) | 毛囊间充质干细胞的制备方法以及应用 | |
| CN102119936B (zh) | 制备利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤注射液的方法及其注射液 | |
| Xu et al. | Immunoregulatory effect of neuronal-like cells in inducting differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. | |
| Malakar et al. | Stem cells: a potential regenerative medicine for treatment of diseases | |
| KR20230025801A (ko) | 활막 유래 간엽계 줄기 세포의 제조 방법 및 관절 치료용 세포 제제의 제조 방법 | |
| CN115287257B (zh) | 基于弓形虫外分泌蛋白的成骨诱导分化培养基、制备方法及成骨诱导分化方法 | |
| US9670457B2 (en) | Stem cells and matrix from cord tissue |