CN115287257B - 基于弓形虫外分泌蛋白的成骨诱导分化培养基、制备方法及成骨诱导分化方法 - Google Patents

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Abstract

一种基于弓形虫外分泌蛋白的成骨诱导分化培养基、制备方法及成骨诱导分化方法，其成骨诱导分化培养基含有弓形虫外分泌蛋白。成骨诱导分化培养基还含有地塞米松、L‑抗坏血酸、β‑甘油磷酸钠和完全培养基。含量如下：弓形虫外分泌蛋白：0.5mg/mL～15mg/mL；地塞米松：80nM～120nM；L‑抗坏血酸：30mM～80mM；β‑甘油磷酸钠：3mM～15mM。本发明的弓形虫外分泌蛋白作为成骨诱导培养基添加成分可大幅提高间充质干细胞成骨分化效果。

Description

基于弓形虫外分泌蛋白的成骨诱导分化培养基、制备方法及 成骨诱导分化方法
技术领域
本发明涉及生物医学技术的干细胞技术领域，特别涉及一种基于弓形虫外分泌蛋白的成骨诱导分化培养基、制备方法及成骨诱导分化方法。
背景技术
骨缺损是临床常见的一种病症，全球每年因严重创伤、骨折后治疗不当、骨肿瘤等导致的大段骨缺损患者超过200万例，但骨缺损的治疗方法仍存争议。目前常规治疗方式为自体骨移植和异体骨移植，但两者都有弊端。自体骨移植存在对供区造成损伤、需要二次手术、易出现并发症等缺点，异体骨移植则存在潜在感染、受者体内排斥反应、术后疼痛等缺陷。因此，国内外学者开始运用骨组织工程研发新型骨缺损治疗技术，以改善传统骨缺损治疗技术的缺陷，加快骨修复进程，满足患者的需求。目前，骨组织工程技术仍处于基础研究阶段，在种子细胞、细胞因子和支架材料的选择上，仍未找到理想的组合方式。
间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSCs）具有强大的增殖分化潜能，在国内外都已被广泛应用于多种组织损伤修复的基础研究与临床实验。在过去的几十年里，各学者在骨组织缺损修复领域将间充质干细胞作为种子细胞，并联合支架材料对骨缺损进行修复治疗；这已成为改良骨缺损治疗方法的重要手段之一，并展现出了良好的应用及转化前景。间充质干细胞种类繁多，如人脐带间充质干细胞（human umbilical cordmesenchymal stem cells, hUC-MSCs）和人骨髓间充质干细胞（humanbonemarrowmesenchymal stem cells, hBM-MSCs）。
hUC-MSCs是从新生儿脐带组织中提取出的多能干细胞，于2000年在脐带血中被发现，后逐渐从脐带的华通质胶和血管周围组织中获得，具有取材方便、稳定传代、适应局部环境能力强及成骨活性较强的特点，是理想的骨组织工程细胞。hUC-MSCs参与人体修复的方式主要有：细胞分化、免疫调节、分泌多种细胞因子。现阶段，hUC-MSCs越来越多地参与组织器官的重建，并在骨修复及再生领域被大量研究，是骨组织工程中理想的种子细胞。既往研究表明hUC-MSCs具有成骨分化潜能，但具体机制仍不明。
人骨髓间充质干细胞（hBM-MSCs）是来源人骨髓基质非造血细胞的一种间充质干细胞，具有MSCs多向分化潜能的特点，可分化为多种类型的结缔组织，形成骨、软骨、骨骼肌、肌腱、韧带、真皮、脂肪和骨髓基质，也可以分化成神经系统的神经元和神经胶质细胞。目前，国内外对hBM-MSCs的体外成骨诱导分化研究较多，多方面、多角度地证实了hBM-MSCs的成骨分化能力，可作为种子细胞运用到骨组织工程中，为骨缺损、骨不连、骨延迟愈合等难治性骨疾病提供新思路。
目前，对于间充质干细胞向成骨细胞分化的诱导培养基配方尚未有统一定论，在配方的组成成分上各成分具体含量也不尽相同。此外，现有的成骨诱导分化培养基尚存在一些问题，如成骨诱导效率低、成骨诱导效果不稳定、成骨诱导分化时间长等，这些问题限制了间充质干细胞在科学领域的深入研究及在临床应用。
因此，针对现有技术不足，提供一种基于弓形虫外分泌蛋白的成骨诱导分化培养基、制备方法及成骨诱导分化方法以解决现有技术不足甚为必要。
发明内容
本发明的其中一个目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种基于弓形虫外分泌蛋白的成骨诱导分化培养基。该基于弓形虫外分泌蛋白的成骨诱导分化培养基能够提高成骨分化效果。
本发明的上述目的通过以下技术措施实现：
提供一种基于弓形虫外分泌蛋白的成骨诱导分化培养基，含有弓形虫外分泌蛋白。
本发明的基于弓形虫外分泌蛋白的成骨诱导分化培养基，还含有地塞米松、L-抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和完全培养基。
本发明的基于弓形虫外分泌蛋白的成骨诱导分化培养基，含量如下：
弓形虫外分泌蛋白：0.5mg/mL～15mg/mL；
地塞米松：80nM～120nM；
L-抗坏血酸：30mM～80mM；
β-甘油磷酸钠：3mM～15mM。
进一步，含量如下：
弓形虫外分泌蛋白：1mg/mL～10mg/mL；
地塞米松：100nM；
L-抗坏血酸：50mM；
β-甘油磷酸钠：10mM。
优选的，上述完全培养基由5%Vol.～15%Vol.胎牛血清、0.5%Vol.～2%Vol.青链霉素和余量为低糖DMEM培养基组成。
本发明的第二目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种成骨诱导分化方法。该成骨诱导分化方法能够提高成骨分化效果。
本发明的上述目的通过以下技术措施实现：
提供一种成骨诱导分化方法，采用上述的基于弓形虫外分泌蛋白的成骨诱导分化培养基对间充质干细胞进行培养。
优选的，上述间充质干细胞为人骨髓间充质干细胞。
另一优选的，上述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。
当所述间充质干细胞为人骨髓间充质干细胞时为4代～6代间充质干细胞。
当所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞时为4代～8代间充质干细胞。
本发明的第三目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种基于弓形虫外分泌蛋白的成骨诱导分化培养基的制备方法。该基于弓形虫外分泌蛋白的成骨诱导分化培养基的制备方法得到的成骨诱导分化培养基能够提高成骨分化效果。
本发明的上述目的通过以下技术措施实现：
提供一种如上述基于弓形虫外分泌蛋白的成骨诱导分化培养基的制备方法，弓形虫外分泌蛋白的制备方法为：
步骤a1、取出C57BL/6小鼠的腹腔液，所述C57BL/6小鼠为预先在腹腔中注射了复苏后弓形虫RH株速殖子的C57BL/6小鼠，进入步骤a2；
步骤a2、将腹腔液离心、洗涤及重悬，得到刚地弓形虫，进入步骤a3；
步骤a3、对刚地弓形虫进行体外传代培养，进入步骤a4；
步骤a4、加入Hank’s平衡盐溶液、恒温孵育，得到孵育后的混悬液，进入步骤a5；
步骤a5、将混悬液离心，收集上清液得到所述弓形虫外分泌蛋白。
本发明的一种基于弓形虫外分泌蛋白的成骨诱导分化培养基、制备方法及成骨诱导分化方法，其成骨诱导分化培养基含有弓形虫外分泌蛋白。本发明的弓形虫外分泌蛋白作为成骨诱导培养基添加成分可大幅提高间充质干细胞成骨分化效果，因此能明显提高成骨分化效果。
附图说明
利用附图对本发明作进一步的说明，但附图中的内容不构成对本发明的任何限制。
图1为不同浓度下弓形虫外分泌蛋白对人脐带间充质干细胞的细胞毒性作用。
图2为不同浓度下弓形虫外分泌蛋白对人骨髓间充质干细胞的细胞毒性作用。
图3为不同浓度下弓形虫外分泌蛋白对人骨髓间充质干细胞和人脐带间充质干细胞的成骨诱导分化效果。
图4为在常规成骨诱导培养基中添加不同浓度下弓形虫外分泌蛋白，检测人脐带间充质干细胞成骨分化标志蛋白表达情况。
图5为在常规成骨诱导培养基中添加不同浓度下弓形虫外分泌蛋白，检测人骨髓间充质干细胞成骨分化标志蛋白表达情况。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明的技术方案作进一步说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂材料等，如无特殊说明，均可自常规生化试剂商店或药品经营企业购买得到。
实施例1
一种基于弓形虫外分泌蛋白的成骨诱导分化培养基，含有弓形虫外分泌蛋白。
该成骨诱导分化培养基还含有地塞米松、L-抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和完全培养基。
该成骨诱导分化培养基含量如下：
弓形虫外分泌蛋白：0.5mg/mL～15mg/mL；
地塞米松：80nM～120nM；
L-抗坏血酸：30mM～80mM；
β-甘油磷酸钠：3mM～15mM。
完全培养基由5%Vol.～15%Vol.胎牛血清、0.5%Vol.～2%Vol.青链霉素和余量为低糖DMEM培养基组成。
刚地弓形虫（Toxoplasma gondii, T.gondii）是人畜共患病原体，不仅造成人与动物多个系统的器官损害，而且给畜牧养殖业造成一定的经济损失。弓形虫外分泌蛋白（excretory/secretory proteins,ESP）是弓形虫在生活史过程中向外界环境分泌或排泄的产物，与宿主接触紧密，含有多种蛋白，包括棒状体蛋白（rhoptryprotein,ROP）、微线体蛋白（microneme protein, MIC），致密颗粒蛋白（dense granules protein, GRA）、表面抗原（rhoptry neck protein, RON）、细胞骨架蛋白、与囊泡运输有关的Rab蛋白和热休克蛋白（heat shock proteins, HSP）等，这些蛋白具有较强的免疫原性和多种生物学功能，已被证实广泛地参与弓形虫的繁殖、定位、入侵宿主细胞及调控宿主免疫反应等生理过程。
本实施例的基于弓形虫外分泌蛋白的成骨诱导分化培养基中的弓形虫外分泌蛋白作为成骨诱导培养基添加成分可大幅提高间充质干细胞成骨分化效果。
实施例2
一种基于弓形虫外分泌蛋白的成骨诱导分化培养基，含有弓形虫外分泌蛋白。
该成骨诱导分化培养基还含有地塞米松、L-抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和完全培养基。
该成骨诱导分化培养基含量如下：
弓形虫外分泌蛋白：1mg/mL～10mg/mL；
地塞米松：100nM；
L-抗坏血酸：50mM；
β-甘油磷酸钠：10mM。
完全培养基由8%Vol.～12%Vol.胎牛血清、0.8%Vol.～1.5%Vol.青链霉素和余量为低糖DMEM培养基组成。
完全培养基为含有8%Vol.～12%Vol.胎牛血清、0.8%Vol.～1.5%Vol.青链霉素的低糖DMEM培养基。
与实施例1相比，本实施例的成骨诱导分化培养基的骨分化效果较优。
实施例3
一种基于弓形虫外分泌蛋白的成骨诱导分化培养基，含有弓形虫外分泌蛋白。
该成骨诱导分化培养基还含有地塞米松、L-抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和完全培养基。
该成骨诱导分化培养基含量如下：
弓形虫外分泌蛋白：5mg/mL；
地塞米松：100nM；
L-抗坏血酸：50mM；
β-甘油磷酸钠：10mM。
完全培养基由10.5%Vol.胎牛血清、12.4%Vol.青链霉素和余量为低糖DMEM培养基组成。
本实施例的地塞米松购自美国Sigma公司，货号为D4902-100MG；L-抗坏血酸购自美国Sigma公司，货号为A5960-25G；β-甘油磷酸钠购自美国Sigma公司，货号为G9422-50G；胎牛血清购自美国 Gibco公司，货号为10099-141；青链霉素也称青霉素-链霉素溶液（双抗），购自美国 Gibco公司，货号为15140-122；低糖DMEM培养基购自美国Gibco公司，货号为C11885500BT。
本实施例的成骨诱导分化培养基在实施例1范围内的骨分化效果较优。
实施例4
一种基于弓形虫外分泌蛋白的成骨诱导分化培养基，含有弓形虫外分泌蛋白。
该成骨诱导分化培养基还含有地塞米松、L-抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和完全培养基。
该成骨诱导分化培养基含量如下：
弓形虫外分泌蛋白：0.5mg/mL；
地塞米松：120nM；
L-抗坏血酸：30mM；
β-甘油磷酸钠：3mM。
完全培养基由5%Vol.胎牛血清、2%Vol.青链霉素和余量为低糖DMEM培养基组成。
本实施例的地塞米松购自美国Sigma公司，货号为D4902-100MG；L-抗坏血酸购自美国Sigma公司，货号为A5960-25G；β-甘油磷酸钠购自美国Sigma公司，货号为G9422-50G；胎牛血清购自美国 Gibco公司，货号为10099-141；青链霉素也称青霉素-链霉素溶液（双抗），购自美国 Gibco公司，货号为15140-122；低糖DMEM培养基购自美国Gibco公司，货号为C11885500BT。
本实施例的成骨诱导分化培养基在实施例1范围内的骨分化效果较优。
实施例5
一种基于弓形虫外分泌蛋白的成骨诱导分化培养基，含有弓形虫外分泌蛋白。
该成骨诱导分化培养基还含有地塞米松、L-抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和完全培养基。
该成骨诱导分化培养基含量如下：
弓形虫外分泌蛋白：15mg/mL；
地塞米松：80nM；
L-抗坏血酸：80mM；
β-甘油磷酸钠：15mM。
完全培养基由14.5%Vol.胎牛血清、0.6%Vol.青链霉素和余量为低糖DMEM培养基组成。
本实施例的地塞米松购自美国Sigma公司，货号为D4902-100MG；L-抗坏血酸购自美国Sigma公司，货号为A5960-25G；β-甘油磷酸钠购自美国Sigma公司，货号为G9422-50G；胎牛血清购自美国 Gibco公司，货号为10099-141；青链霉素也称青霉素-链霉素溶液（双抗），购自美国 Gibco公司，货号为15140-122；低糖DMEM培养基购自美国Gibco公司，货号为C11885500BT。
本实施例的成骨诱导分化培养基的在实施例1范围内的骨分化效果较优。
实施例6
一种基于弓形虫外分泌蛋白的成骨诱导分化培养基，含有弓形虫外分泌蛋白。
该成骨诱导分化培养基还含有地塞米松、L-抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和完全培养基。
该成骨诱导分化培养基含量如下：
弓形虫外分泌蛋白：2mg/mL；
地塞米松：100nM；
L-抗坏血酸：50mM；
β-甘油磷酸钠：10mM。
完全培养基由10%Vol.胎牛血清、1%Vol.青链霉素和余量为低糖DMEM培养基组成。
本实施例的地塞米松购自美国Sigma公司，货号为D4902-100MG；L-抗坏血酸购自美国Sigma公司，货号为A5960-25G；β-甘油磷酸钠购自美国Sigma公司，货号为G9422-50G；胎牛血清购自美国 Gibco公司，货号为10099-141；青链霉素也称青霉素-链霉素溶液（双抗），购自美国Gibco公司，货号为15140-122；低糖DMEM培养基购自美国Gibco公司，货号为C11885500BT。
本实施例的成骨诱导分化培养基在实施例1范围内的骨分化效果较优。
实施例7
一种基于弓形虫外分泌蛋白的成骨诱导分化培养基，含有弓形虫外分泌蛋白。
该成骨诱导分化培养基还含有地塞米松、L-抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和完全培养基。
该成骨诱导分化培养基含量如下：
弓形虫外分泌蛋白：10mg/mL；
地塞米松：100nM；
L-抗坏血酸：50mM；
β-甘油磷酸钠：10mM。
完全培养基由10%Vol.胎牛血清、1%Vol.青链霉素和余量为低糖DMEM培养基组成。
本实施例的地塞米松购自美国Sigma公司，货号为D4902-100MG；L-抗坏血酸购自美国Sigma公司，货号为A5960-25G；β-甘油磷酸钠购自美国Sigma公司，货号为G9422-50G；胎牛血清购自美国 Gibco公司，货号为10099-141；青链霉素也称青霉素-链霉素溶液（双抗），购自美国 Gibco公司，货号为15140-122；低糖DMEM培养基购自美国Gibco公司，货号为C11885500BT。
本实施例的成骨诱导分化培养基在实施例1范围内的骨分化效果较优。
实施例8
一种基于弓形虫外分泌蛋白的成骨诱导分化培养基，含有弓形虫外分泌蛋白。
该成骨诱导分化培养基还含有地塞米松、L-抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和完全培养基。
该成骨诱导分化培养基含量如下：
弓形虫外分泌蛋白：1mg/mL；
地塞米松：100nM；
L-抗坏血酸：50mM；
β-甘油磷酸钠：10mM。
完全培养基由10%Vol.胎牛血清、1%Vol.青链霉素和余量为低糖DMEM培养基组成。
本实施例的地塞米松购自美国Sigma公司，货号为D4902-100MG；L-抗坏血酸购自美国Sigma公司，货号为A5960-25G；β-甘油磷酸钠购自美国Sigma公司，货号为G9422-50G；胎牛血清购自美国 Gibco公司，货号为10099-141；青链霉素也称青霉素-链霉素溶液（双抗），购自美国 Gibco公司，货号为15140-122；低糖DMEM培养基购自美国Gibco公司，货号为C11885500BT。
本实施例的成骨诱导分化培养基在实施例1范围内的骨分化效果较优。
实施例9
一种采用如实施例3至8、对比例1中任意一项配比的基于弓形虫外分泌蛋白的成骨诱导分化培养基的制备方法。
其中地塞米松配制为称取适量地塞米松，用无水乙醇溶解，配成1mM的母液，0.22mM滤膜过滤除菌，分装在EP管里，于-20℃保存。
L-抗坏血酸配制为称取适量L-抗坏血酸，用磷酸盐缓冲液溶解，配成50mM母液，0.22mM滤膜过滤除菌，分装在EP管里，于-20℃保存。
b-甘油磷酸钠配制为称取适量b-甘油磷酸钠，用磷酸盐缓冲液溶解，配成1M母液，0.22mM滤膜过滤除菌，分装在EP管里，于-20℃保存。
弓形虫外分泌蛋白的制备方法为：
步骤a1、取出C57BL/6小鼠的腹腔液，C57BL/6小鼠为预先在腹腔中注射了复苏后弓形虫RH株速殖子的C57BL/6小鼠，进入步骤a2；
步骤a2、将腹腔液离心、洗涤及重悬，得到刚地弓形虫，进入步骤a3；具体为将腹腔液在2500rpm下离心15min，然后磷酸盐缓冲液充分洗涤3次并离心弃磷酸盐缓冲液，重悬后用细胞计数板镜下计数。按照感染复数(MOI)为刚地弓形虫：细胞=10：1感染宿主细胞ARPE-19进入步骤a3；
步骤a3、对刚地弓形虫进行体外传代培养，进入步骤a4；具体为待约80%的细胞被速殖子涨破后，对弓形虫RH株速殖子离心并计数，继续以MOI=10的比例进行体外传代培养。
步骤a4、加入Hank’s平衡盐溶液、恒温孵育，得到孵育后的混悬液，进入步骤a5；具体为待收集RH株速殖子数量足够多时，对速殖子进行计数，每1×108个速殖子加入0.5 mlHank’s平衡盐溶液，37℃下150rmp恒温摇床孵育4h；
步骤a5、将混悬液离心，收集上清液得到弓形虫外分泌蛋白，具体为对混悬液离心，在4℃下，12,000rmp，3min离心两次，弃沉淀，收集上清液，即为弓形虫外分泌蛋白。
其中C57BL/6小鼠的处理方法为将经过复苏的弓形虫RH株速殖子，然后往C57BL/6小鼠腹腔中注射等量（约5×104/只）RH株速殖子，待3d～5d，待小鼠出现竖毛、闭眼、活动量减少症状时，颈椎脱臼处死小鼠。
在低糖DMEM里，按照浓度依次加入胎牛血清、青链霉素、地塞米松、L-抗坏血酸、b-甘油磷酸钠和弓形虫外分泌蛋白，混合均匀后即为所需的成骨诱导培养基。
本发明的弓形虫RH株速殖子可以来自市售途径得到，也可以有现有技术培育得到，本实施例来自韩国忠南大学医学院感染生物学教研室的LEE YOUNG-HA教授培育。本实施例的磷酸盐缓冲液购自中国Solarbio公司，货号为P1020。
本实施例的一种基于弓形虫外分泌蛋白的成骨诱导分化培养基的制备方法，通过简单的步骤即可以制备得到的成骨诱导培养基，该成骨诱导培养基能明显提高成骨分化效果。
实施例10
一种成骨诱导分化方法，采用如实施例3至8的基于弓形虫外分泌蛋白的成骨诱导分化培养基对间充质干细胞进行培养。
本发明的间充质干细胞为人骨髓间充质干细胞，也可以为人脐带间充质干细胞。当所述间充质干细胞为人骨髓间充质干细胞时为4代～6代间充质干细胞。当所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞时为4代～8代间充质干细胞。
本发明的人脐带间充质干细胞的提取方法为，经广东医科大学附属医院伦理委员会批准，且患者知情同意情况下，取自愿捐献者的剖腹产胎儿脐带进行组织分离，在实验室生物安全柜里，用提前灭好菌的手术器械把脐带剪成约4～6cm每段，先剥离脐带的脐动脉和脐静脉，再把脐带外表皮层剔除，只留取脐带外表皮下组织层和华通胶质层的组织。用磷酸盐缓冲液（含2%Vol.青链霉素溶液）清洗数次后，把组织块剪碎为约1mm×1mm×1mm大小的组织块，以适当的密度平铺在10cm培养皿里，先在温箱中孵育30 min，再缓慢加入MEMAlpha培养基(含10%Vol.胎牛血清、1%Vol.青链霉素溶液)，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。待细胞爬出较密时，去除组织块，用0.25%胰蛋白酶消化，细胞塞过滤后按1：3传代。
本发明的人骨髓间充质干细胞的提取方法为，经广东医科大学附属医院伦理委员会批准，在患者知情同意情况下，在行髋关节置换术患者股骨近端部位无菌采取骨髓10ml，利用Ficoll-Histopaque (d=1.077 g/ml)分离单核细胞，采用MEM Alpha培养基（含10%Vol.胎牛血清和1%Vol.青链霉素溶液）重悬细胞，在37℃、5%CO2细胞培养箱中传代培养。
本实施例的胰蛋白酶购自美国Gibco公司，货号为25200-072；MEM-Apha培养基购自美国Gibco公司，货号为C12571500BT；DMEM培养基购自美国Gibco公司，货号为C11885500BT。
对比例1
一种成骨诱导分化培养基含有地塞米松、L-抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和完全培养基。
该成骨诱导分化培养基含量如下：
地塞米松：100nM；
L-抗坏血酸：50mM；
β-甘油磷酸钠：10mM。
完全培养基由10%Vol.胎牛血清、1%Vol.青链霉素和余量为低糖DMEM培养基组成。
本实施例的地塞米松购自美国Sigma公司，货号为D4902-100MG；L-抗坏血酸购自美国Sigma公司，货号为A5960-25G；β-甘油磷酸钠购自美国Sigma公司，货号为G9422-50G；胎牛血清购自美国 Gibco公司，货号为10099-141；青链霉素也称青霉素-链霉素溶液（双抗），购自美国 Gibco公司，货号为15140-122；低糖DMEM培养基购自美国Gibco公司，货号为C11885500BT。
检测步骤及结果分析
1、弓形虫外分泌蛋白对间充质干细胞的毒性作用
不同浓度弓形虫外分泌蛋白处理对间充质干细胞的毒性在96孔板中，每孔接种3000个人骨髓间充质干细胞或人脐带间充质干细胞，待细胞贴壁生长12h后，用含弓形虫外分泌蛋白不同的浓度的MEMAlpha培养基（含10%Vol.胎牛血清和1%Vol.青链霉素溶液）在37℃、5%CO2的条件下培养，24h后使用非放射性细胞毒性检测试剂盒（Cyto Tox 96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay kit）检测弓形虫外分泌蛋对细胞的毒性作用，
具体弓形虫外分泌蛋白的浓度0mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、10mg/ml或50mg/ml的MEMAlpha培养基（含10%Vol.胎牛血清和1%Vol.青链霉素溶液），如图1和2所示。
从图1和图2中，表明弓形虫外分泌蛋白在浓度为0μg/ml、1mg/ml、2mg/ml和10mg/ml内对细胞无毒性作用，因此得出0μg/m～10μg/ml的范围内对细胞无毒性作用；当弓形虫外分泌蛋白浓度到达50μg/ml，对细胞产生有一定的毒性作用。
2、弓形虫外分泌蛋白促进间充质干细胞成骨分化作用
2.1、为评估弓形虫外分泌蛋白对间充质干细胞向成骨细胞分化的影响作用，取体外扩增生长良好的第3~8代间充质干细胞，将细胞按3×104/孔的细胞量接种于12孔板内，置于37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养。待细胞贴壁生长至80%融合时，吸弃原培养基，加入对比例1（含弓形虫外分泌蛋白0mg/ml）、实施例8（含弓形虫外分泌蛋白1mg/ml）、实施例7（含弓形虫外分泌蛋白10mg/ml）的成骨诱导培养基培养，每3天换液一次；连续诱导14天后，用4%多聚甲醛对细胞进行固定，再行茜素红染色鉴定细胞成骨分化效果，如图3。
从图3可知，茜素红染色后，能观察到无论是人骨髓间充质干细胞还是间充质干细胞的对比例1、实施例8和实施例7均有茜素红染成红色，因此均有钙结节生成，实施例8和实施例7的钙结节数量均比对比例1的多，其中实施例7的结节数量显著增多，因此在诱导成骨分化过程中弓形虫外分泌蛋白有明显的促进作用。由此得出本发明的成骨诱导培养基与传统的常规成骨诱导培养基相比，在添加了弓形虫外分泌蛋白作的成骨诱导培养基后，大幅提高间充质干细胞成骨分化效果，且呈浓度依赖性。
2.2、人骨髓间充质干细胞或间充质干细胞在对比例1（含弓形虫外分泌蛋白0mg/ml）、实施例8（含弓形虫外分泌蛋白1mg/ml）、实施例7（含弓形虫外分泌蛋白10mg/ml）的成骨诱导培养基培养条件下，培养14天，收集细胞，利用RIPA缓冲液裂解细胞并进行超声波碎裂细胞后，4℃、12,000g、15min离心去除细胞碎片，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）测量蛋白浓度。蛋白样品制备好后取约20μg蛋白进行凝胶电泳，随后将蛋白转至PVDF膜，脱脂牛奶封闭后，4°C条件下进行一抗（Runx2、OPN、Osterix、b-actin、GAPDH）过夜孵育，二抗室温孵育1h，采用蛋白免疫印迹实验增强型显影剂曝光，得到目的条带，如图4和图5所示。
Runx2、OPN和Osteorix为评估细胞成骨分化程度的目的蛋白，β-actin、GAPDH是细胞内参基因。从图4可知，实施例7的目的蛋白的表达最高，实施例8的目的蛋白的表达居中，对比例1的目的蛋白的表达为最低，因此可以得到目的蛋白的表达与成骨诱导分化培养基里的弓形虫外分泌蛋白浓度呈浓度依赖性上升，表明弓形虫外分泌蛋白对间充质干细胞和人骨髓间充质干细胞的成骨分化有呈浓度依赖性的促进作用。
本实施例的Anti-Runx2 antibody购自英国abcam公司，货号为ab76956；Anti-Osteopontin antibody购自英国abcam公司，货号为ab8448；Anti-Sp7/Osterix antibody购自英国abcam公司，货号为ab22552；β-Actin购自美国Santa Cruz Biotechnology公司，货号为sc-47778；GAPDH购自美国Santa Cruz Biotechnology公司，货号为sc-32233。蛋白免疫印迹实验增强型显影剂购自美国ZETA life公司，货号为310208。BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）购自中国碧云天公司，货号为P0009；非放射性细胞毒性检测试剂盒(CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay kit)购自美国Promega公司，货号为G1782。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (6)

1.一种基于弓形虫外分泌蛋白的成骨诱导分化培养基，其特征在于：含有：
弓形虫外分泌蛋白：0.5mg/mL～15mg/mL；
地塞米松：80nM～120nM；
L-抗坏血酸：30mM～80mM；
β-甘油磷酸钠：3mM～15mM；
完全培养基，所述完全培养基由5%Vol.～15%Vol.胎牛血清、0.5%Vol.～2%Vol.青链霉素和余量为低糖DMEM培养基组成；
所述弓形虫外分泌蛋白的制备方法为：
步骤a1、取出C57BL/6小鼠的腹腔液，C57BL/6小鼠为预先在腹腔中注射了复苏后弓形虫RH株速殖子的C57BL/6小鼠，进入步骤a2；
步骤a2、将腹腔液离心、洗涤及重悬，得到刚地弓形虫，进入步骤a3；具体为将腹腔液在2500rpm下离心15min，然后磷酸盐缓冲液充分洗涤3次并离心弃磷酸盐缓冲液，重悬后用细胞计数板镜下计数；按照感染复数为刚地弓形虫：细胞=10：1感染宿主细胞ARPE-19进入步骤a3；
步骤a3、对刚地弓形虫进行体外传代培养，进入步骤a4；具体为待约80%的细胞被速殖子涨破后，对弓形虫RH株速殖子离心并计数，继续以MOI=10的比例进行体外传代培养；
步骤a4、加入Hank’s平衡盐溶液、恒温孵育，得到孵育后的混悬液，进入步骤a5；具体为待收集RH株速殖子数量足够多时，对速殖子进行计数，每1×108个速殖子加入0.5 mlHank’s平衡盐溶液，37℃下150rmp恒温摇床孵育4h；
步骤a5、将混悬液离心，收集上清液得到弓形虫外分泌蛋白；具体为对混悬液离心，在4℃下，12,000rmp，3min离心两次，弃沉淀，收集上清液，即为弓形虫外分泌蛋白。
2.一种成骨诱导分化方法，其特征在于：采用如权利要求1所述的基于弓形虫外分泌蛋白的成骨诱导分化培养基对间充质干细胞进行培养。
3.根据如权利要求2所述的成骨诱导分化方法，其特征在于：所述间充质干细胞为人骨髓间充质干细胞。
4.根据如权利要求2所述的成骨诱导分化方法，其特征在于：所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。
5.根据如权利要求4所述的成骨诱导分化方法，其特征在于：当所述间充质干细胞为人骨髓间充质干细胞时为4代～6代间充质干细胞；
当所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞时为4代～8代间充质干细胞。
6.一种如权利要求1所述的基于弓形虫外分泌蛋白的成骨诱导分化培养基的制备方法，其特征在于：所述弓形虫外分泌蛋白的制备方法为：
步骤a1、取出C57BL/6小鼠的腹腔液，C57BL/6小鼠为预先在腹腔中注射了复苏后弓形虫RH株速殖子的C57BL/6小鼠，进入步骤a2；
步骤a2、将腹腔液离心、洗涤及重悬，得到刚地弓形虫，进入步骤a3；具体为将腹腔液在2500rpm下离心15min，然后磷酸盐缓冲液充分洗涤3次并离心弃磷酸盐缓冲液，重悬后用细胞计数板镜下计数；按照感染复数为刚地弓形虫：细胞=10：1感染宿主细胞ARPE-19进入步骤a3；
步骤a3、对刚地弓形虫进行体外传代培养，进入步骤a4；具体为待约80%的细胞被速殖子涨破后，对弓形虫RH株速殖子离心并计数，继续以MOI=10的比例进行体外传代培养；
步骤a4、加入Hank’s平衡盐溶液、恒温孵育，得到孵育后的混悬液，进入步骤a5；具体为待收集RH株速殖子数量足够多时，对速殖子进行计数，每1×108个速殖子加入0.5 mlHank’s平衡盐溶液，37℃下150rmp恒温摇床孵育4h；
步骤a5、将混悬液离心，收集上清液得到弓形虫外分泌蛋白；具体为对混悬液离心，在4℃下，12,000rmp，3min离心两次，弃沉淀，收集上清液，即为弓形虫外分泌蛋白。
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