RU2677688C1 - Способ выделения хондроцитов - Google Patents
Способ выделения хондроцитов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2677688C1 RU2677688C1 RU2017132220A RU2017132220A RU2677688C1 RU 2677688 C1 RU2677688 C1 RU 2677688C1 RU 2017132220 A RU2017132220 A RU 2017132220A RU 2017132220 A RU2017132220 A RU 2017132220A RU 2677688 C1 RU2677688 C1 RU 2677688C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- chondrocytes
- cartilage
- fragments
- solution
- suspension
- Prior art date
Links
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 137
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 238000002955 isolation Methods 0.000 title description 11
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 claims abstract description 97
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 70
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 53
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 34
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims abstract description 29
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims abstract description 25
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims abstract description 22
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 claims abstract description 19
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims abstract description 19
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims abstract description 19
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 claims abstract description 19
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims abstract description 19
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims abstract description 18
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims abstract description 15
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 13
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 11
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 44
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 13
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 11
- 210000005065 subchondral bone plate Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 5
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 claims description 4
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000013049 sediment Substances 0.000 claims description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- 238000007747 plating Methods 0.000 claims description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims 1
- 101710151387 Serine protease 1 Proteins 0.000 claims 1
- 102100032491 Serine protease 1 Human genes 0.000 claims 1
- 101710119665 Trypsin-1 Proteins 0.000 claims 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- YRQNKMKHABXEJZ-UVQQGXFZSA-N chembl176323 Chemical compound C1C[C@]2(C)[C@@]3(C)CC(N=C4C[C@]5(C)CCC6[C@]7(C)CC[C@@H]([C@]7(CC[C@]6(C)[C@@]5(C)CC4=N4)C)CCCCCCCC)=C4C[C@]3(C)CCC2[C@]2(C)CC[C@H](CCCCCCCC)[C@]21C YRQNKMKHABXEJZ-UVQQGXFZSA-N 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 25
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 21
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 21
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 21
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 13
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 12
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 11
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 10
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 9
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 7
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 7
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 6
- 210000001188 articular cartilage Anatomy 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 210000000629 knee joint Anatomy 0.000 description 5
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 5
- -1 agrecan Proteins 0.000 description 4
- 230000001857 anti-mycotic effect Effects 0.000 description 4
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 4
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 102000000503 Collagen Type II Human genes 0.000 description 3
- 108010041390 Collagen Type II Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 3
- 239000012574 advanced DMEM Substances 0.000 description 3
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 3
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 2
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 2
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 2
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 2
- 201000002972 idiopathic scoliosis Diseases 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000009528 severe injury Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011883 total knee arthroplasty Methods 0.000 description 2
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 208000006820 Arthralgia Diseases 0.000 description 1
- 208000005243 Chondrosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- 208000003947 Knee Osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 102000055008 Matrilin Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010072582 Matrilin Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010062575 Muscle contracture Diseases 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 1
- 241000469816 Varus Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 238000011882 arthroplasty Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 208000006111 contracture Diseases 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- 238000013150 knee replacement Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 238000003754 machining Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000000399 orthopedic effect Effects 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007514 turning Methods 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 230000002747 voluntary effect Effects 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине, а именно к способу выделения хондроцитов. Способ выделения хондроцитов включает забор материала, срезание хрящевой ткани с кости, нарезание хрящевой ткани на фрагменты, далее полученные фрагменты хрящевой ткани помещают в фильтрующее устройство, инкубируют в растворе трипсина, полученную суспензию хондроцитов центрифугируют, супернатант отбрасывают, а образовавшийся осадок хондроцитов промывают раствором фосфатного буфера PBS 2 раза, осуществляют отбор первой фракции хондроцитов, затем нелизированные фрагменты хрящевой ткани, находящиеся в фильтрующем устройстве, инкубируют в растворе коллагеназы II типа, полученный осадок хондроцитов промывают раствором фосфатного буфера PBS 2 раза, осуществляют отбор второй фракции хондроцитов, затем первую и вторую фракцию хондроцитов объединяют, далее нелизированные фрагменты хрящевой ткани удаляют из фильтрующего устройства и инкубируют в культуральной среде DMEM/F12, содержащей FBS, пенициллин, стрептомицин, амфотерицин В, затем вышеописанную культуральную среду отбрасывают и добавляют раствор коллагеназы II типа, полученный после осаждения хондроцитов центрифугированием на втором этапе, инкубируют, полученную суспензию хондроцитов центрифугируют, образовавшийся супернатант, содержащий коллагеназу II типа, отбрасывают, а полученный осадок хондроцитов промывают раствором фосфатного буфера PBS 2 раза, осуществляют отбор третьей фракции хондроцитов и соединяют ее с первой и второй фракциями хондроцитов, затем полученную суспензию хондроцитов высевают на культуральный пластик для адгезионных культур в среде DMEM/F12 содержащей FBS, пенициллин, стрептомицин, амфотерицин В, получая первичную клеточную популяцию нулевого пассажа. Заявленный способ позволяет повысить выход хондроцитов. 1 пр.
Description
Изобретение относиться к медицине, а именно к травматологии и ортопедии, клеточной биологии, цитологии и может быть использовано в регенеративной медицине при изготовлении биомедицинского клеточного продукта.
Известен способ изоляции и характеристики хондроцитов хрящевой ткани после тотального эндопротезирования коленного сустава человека (Naranda J, 
Gorenjak M, Vogrin M, Maver U. Isolation and characterization of human articular chondrocytes from surgical waste after total knee arthroplasty (TKA). Peer J. 2017 Mar 21; 5:e3079. doi: 10.7717/peerj.3079.eCollection 2017.) Хрящевую ткань удаляют на полную толщину хирургическим путем с мыщелка бедренной кости пациентов с остеоартрозом коленного сустава без системных заболеваний во время выполнения операции тотального эндопротезирования. Используют стандартные режущие блоки для резекции бедренной кости, а резекцию выполняют обычным способом. Сразу же после удаления костные отрубы переносят в предварительно стерилизованную стеклянную бутылку емкостью 250 мл заполненную раствором фосфатного буфера (PBS, Sigma-Aldrich, Мюнхен, Германия) и доставляют в лабораторию для изоляции клеток. В лаборатории, в условиях ламинарного шкафа костные отрубы переносят в чашку Петри, заполненную PBS, чтобы предотвратить высыхание ткани. Хрящевую ткань удаляют с поверхности костей, используя лезвие №11, чтобы получить фрагменты хрящевой ткани, размером 2×2 мм. PBS удаляют пипеткой, и чашку Петри заполняют 10 мл раствора 0,25% Трипсина/ЭДТА (Sigma, Франция). Фрагменты хрящевой ткани инкубируют в течение 3 часов в условиях CO2 инкубатора (CO2-инкубатор МСО-19AICUVH-PE, Panasonic, Токио, Япония), при температуре 37°C и 5 мас. % CO2. Затем добавляют 20 мл модифицированной среды Dulbecco Eagle, Advanced DMEM, (Gibco, Grand Island, NY, USA) к суспензии клеток. Суспензию переносят в пробирку типа falcon объемом 50 мл и центрифугируют при 300 g в течение 10 мин. (центрифуга 5804 R, Eppendorf, Гамбург, Германия). Супернатант отбрасывают и осадок клеток повторно суспензируют в 20 мл Advanced DMEM и центрифугируют при 200 × g в течение 5 мин. (центрифуга 5804 R, Эппендорф, Гамбург, Германия). Супернатант снова отбрасывают, и клеточный осадок повторно суспензируют в 10 мл Advanced DMEM, дополненной 100 ME/мл пенициллина, 1 мг/мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина и 5 вес. % Эмбриональной бычьей сыворотки (FBS, Gibco, Grand Island, NY, USA) и высевают на 25 см2 флаконы. Нелизированные фрагменты хрящевой ткани высевают на 25 см2 флаконы вместе с суспензией первичных хондроцитов. Через 7 суток инкубирования из фрагментов хрящевой ткани хондроциты мигрируют в радиальном направлении. Формирование конфлюэнтного монослоя наблюдают через 14 суток.
Недостатки данного способа заключаются в том, что выделяется низкое количество хондроцитов за счет того, что после забора хрящевую ткань нарезают в чашке Петри, что приводит к получению слишком больших фрагментов хрящевой ткани с низкой площадью поверхности, что снижает скорость и полноту лизирования фрагментов хрящевой ткани ферментами. Также, это приводит к потере биологического материала в процессе механической обработки. Кроме того, выделение низкого количества хондроцитов связано с тем, что обработка фрагментов хрящевой ткани осуществляется одним ферментом (трипсином) который лизирует в основном неколлагеновые белки матрикса хрящевой ткани и обладает крайне низким сродством к основному компоненту межклеточного матрикса - коллагену II типа. Низкий уровень жизнеспособности хондроцитов, выделяемых данным способом, обусловливается тем, что в процессе ферментативной обработки не предусмотрен отбор выделенных клеток. После забора хрящевую ткань нарезают в чашке Петри, как следствие получают фрагменты хрящевой ткани более крупного размера, тем самым снижается площадь соприкосновения фермента и субстрата, что ведет к увеличению времени воздействия и, как следствие, к снижению жизнеспособности хондроцитов. Низкая степень лизирования за счет того, что используется один фермент. Высок риск возникновения контаминации за счет использования одной и той же лабораторной посуды для механической и ферментативной обработки. В последующем будет наблюдаться снижение чистоты эксперимента, который будет проведен на данной культуре хондроцитов в связи с тем, что при использовании данного способа происходит смешивание популяции хондроцитов, выделенных путем ферментативного расщепления фрагментов хрящевой ткани и хондроцитов, мигрирующих из нелизированных фрагментов хрящевой ткани. Это приводит к присутствию в культуре хондроцитов клеток с различным уровнем энергетического и пластического обмена, т.е. клеток с разным функциональным состоянием. Указанные недостатки приводят к увеличению времени подготовки биологического материала и увеличению его количества, следовательно, увеличивают количество используемых ферментов, что увеличивает затраты.
Известен способ выделения и культивирования хондроцитов полученных из различных источников (И.И. Ким «Выделение и культивирование хондроцитов полученных из различных источников» журнал «Клеточная трансплантология и тканевая инженерия», №4 [6], 2006 г. Стр. 48-50). В работе использовали хрящевую ткань фетусов человека, хрящевую ткань позвоночников человека, больных идиопатическим сколиозом и межпозвонковые диски новорожденной собаки. Выделение хондроцитов производили механо-ферментативным методом, используя в качестве диспергента следующие реакционные смеси: 1) коллагеназу IV типа в концентрации 0,05%, 0,1%, 0,15%, 2) трипсин в концентрации 0,025%, 3) гиалуронидазу I-S типа в концентрации 0,05% и 4) сочетание ферментов коллагеназы и гиалуронидазы в концентрации 0,05% каждого. Хрящевую ткань, очищенную от окружающих мягких тканей, измельчали до фрагментов размером 1-3 мм2. Затем обрабатывали ферментом: фетальную ткань в течение 5-8 часов и 18-20 часов - хрящевую ткань позвоночника больных идиопатическим сколиозом при постоянном помешивании при температуре 37°. После ферментации полученную взвесь клеток пропускали через нейлоновый фильтр и отмывали 2 раза от раствора фермента питательной средой, затем центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 минут. Процент жизнеспособных хондроцитов подсчитывали с помощью трипанового синего. Индекс пролиферации культуры определяли при каждом пассаже. Клетки культивировали с использованием среды DMEM/F12 (Биолот, Санкт-Петербург) с добавлением 20% сыворотки крови плодов коровы (Биолот, Санкт-Петербург). Клетки с поверхности культурального флакона снимали с помощью смеси растворов 0,02% трипсина-версена (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора) в соотношении 5:1. Пассирование проводили 2 раза в неделю. Морфологию культур клеток оценивали с помощью инвертированного микроскопа. Криоконсервацию проводили ступенчатым методом погружения в жидкий азот с помощью внутриклеточного криопротектора DMSO в концентрации 10%. Для статистической обработки данных использовали метод достоверности различий между группами по критерию Стьюдента с определением показателя статистической достоверности (при p<0,05 различия рассматривались как статистически достоверные).
Недостатки данного способа заключаются в том, что выделяется низкое количество хондроцитов за счет того, что после забора хрящевую ткань нарезают в чашке Петри, что приводит к потере биологического материала в процессе механической обработки. Обработка фрагментов хрящевой ткани осуществляется неспецифичными к субстрату ферментами, это приводит к сильному повреждению хондроцитов и, как следствие, к уменьшению их количества. Низкий уровень жизнеспособности хондроцитов, за счет того, что в процессе ферментативной обработки не предусмотрен отбор выделенных хондроцитов. После забора хрящевую ткань нарезают в чашке Петри, как следствие получают фрагменты хрящевой ткани более крупного размера, увеличивается время воздействия или концентрация ферментов на фрагменты хрящевой ткани, тем самым снижая уровень жизнеспособности хондроцитов. Низкая степень лизирования за счет того, что используются не специфичные ферменты к субстрату. Высок риск возникновения контаминации за счет постоянного помешивания и переворачивания лизирующего раствора с хрящевой тканью при температуре 37° в течении 18-20 часов. В последующем будет наблюдаться низкая чистота эксперимента, который будет проведен на данной культуре в связи с тем, что при пассировании хондроцитов в процессе культивирования происходит снижение синтеза белков внеклеточного матрикса (протеогликанов, в частности - агрекана, коллагена II типа). Происходит снижение количества выделенных хондроцитов, за счет того, что используют нейлоновый фильтр, это приводит к невозможности извлечения нелизированных фрагментов хрящевой ткани и дальнейшей ферментативной обработки так же увеличивает общее время процесса выделения хондроцитов. Отсутствие фильтрации способствует попаданию нелизированных фрагментов хрящевой ткани в суспензию хондроцитов, что приводит к увеличению разнородности популяции хондроцитов. Указанные недостатки приводят к увеличению времени подготовки биологического материала и увеличению количества исходного биологического материала, следовательно, увеличивает количество используемых ферментов, что увеличивает затраты.
Известен способ выделения хондроцитов человека (Phenotypic modulation in sub-population of human articular chondrocytes in vitro C.W. Archer, J. McDowel, M.T. Bayliss, M.D. Stephens, G. Bentley. \\ Journal of Cell Science 97, 361-371 (1990), принятый за прототип. В качестве биоматериала используют суставной хрящ больных остеосаркомой и хондросаркомой, полученный в ходе операции по эндопротезированию сустава. Поверхностную зону суставного хряща 15% отделяют от базовой (остальной хрящ на всю глубину 85% с помощью скальпеля. Экспланты хрящевой ткани переносят в чашку Петри. Процедуру нарезки и измельчения хрящевых кусочков проводят после выдерживания эксплантов, как суборганной культуры ночь в среде Хэма F12, содержащей 10% плодной сыворотки теленка (ФТС), 
аскорбиновой кислоты и 2% антибиотик/антимикотик для обеспечения стерильности образцов до ферментативной обработки. Далее хрящевую ткань промывают PBS и измельчают на фрагменты. Измельченный хрящ инкубируют раствором проназы 
растворенной в среде Хэма F12, содержащей 10% плодной сыворотки теленка (ФТС), 2% антибиотик/антимикотик при 37°C на роллере в течение 1 часа и 15 минут в зависимости от объема материала. Далее хрящевые эксплантаты обрабатывают раствором коллагеназы (Тип 1А) в течение 3-х часов на роллере. Затем клеточную суспензию центрифугируют при 1000g. Клетки промывают и высеивают на чашки Петри диаметром 9 см. на ночь. Затем прикрепившиеся клетки обрабатывают раствором 0,1% трипсина и 0,05% EDTA в PBS, центрифугируют и ресуспензируют в среде. Клетки культивируют на подложке агарозы (Sigma, type V) в среде Хэма F12, содержащей 10% плодной сыворотки теленка (ФТС), аскорбиновой кислоты, и 2% антибиотик/антимикотик.
Недостатки данного способа заключаются в том, что выделяется низкое количество хондроцитов за счет того, что после забора хрящевую ткань нарезают в чашке Петри, что приводит к потере, биологического материала в процессе механической обработки. Обработка кусочков хрящевой ткани осуществляется неспецифичными ферментами к субстрату, это приводит к сильному повреждению хондроцитов и, как следствие, к низкому количеству выделяемых хондроцитов. Низкий уровень жизнеспособности хондроцитов, за счет того что после забора хрящевую ткань нарезают в чашке Петри как следствие получают фрагменты хрящевой ткани более крупного размера, увеличивается время воздействия или концентрация ферментов на фрагменты хрящевой ткани, тем самым снижая уровень жизнеспособности хондроцитов. Низкая степень лизирования за счет того, что используются не специфичные ферменты к субстрату. Высокий риск возникновения контаминации культуры хондроцитов связанный с выдерживанием эксплантов, как суборганной культуры ночь в среде Хэма F12, содержащей 10% плодной сыворотки теленка (ФТС), 
аскорбиновой кислоты и 2% антибиотик/антимикотик. В последующем будет наблюдаться низкая чистота эксперимента, который будет проведен на данной культуре в связи с тем, что при пассировании хондроцитов в процессе культивирования происходит снижение синтеза белков внеклеточного матрикса (протеогликанов, агрекана, коллагена II типа). В последующем будет наблюдаться снижение чистоты эксперимента, который будет проведен на данной культуре хондроцитов в связи с тем, что при использовании данного способа происходит смешивание популяции хондроцитов, выделенных путем ферментативного расщепления фрагментов хрящевой ткани и хондроцитов, мигрирующих из недорасщепленных фрагментов хрящевой ткани. Это приводит к присутствию в культуре хондроцитов с различным уровнем энергетического и пластического обмена, т.е. клеток с разным функциональным состоянием. Отсутствие фильтрации способствует попаданию нелизированных фрагментов хрящевой ткани в суспензию хондроцитов, что приводит к увеличению разнородности популяции хондроцитов. Указанные недостатки приводят к увеличению времени подготовки биологического материала и увеличению количества исходного биологического материала, и, следовательно, увеличивает количество используемых ферментов, что увеличивает затраты.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание способа свободного от выше указанных недостатков.
Указанный технический результат достигается тем, что способ выделения хондроцитов включающий забор материала, срезание хрящевой ткани с кости, нарезание хрящевой ткани на фрагменты, инкубирование в культуральной среде, инкубирование фрагментов хрящевой ткани в растворе коллагеназы, промывание, центрифугирование суспензии клеток и высевание на культуральный пластик, нарезают хрящевую ткань на субхондральной кости глубиной до кости, надрезы через 0,5-1 мм выполняют параллельно во взаимно перпендикулярных направлениях, затем соскребают параллельно костной поверхности, полученные фрагменты хрящевой ткани для одновременной фильтрации и ферментативной обработки помещают в фильтрующее устройство, затем инкубируют в 0,2-0,3% растворе трипсина, при соотношении фрагментов хрящевой ткани к трипсину 1:10 в течение 0,5-1 часа при температуре 37°С в условиях перемешивания, полученную суспензию хондроцитов центрифугируют, супернатант отбрасывают, а образовавшийся осадок хондроцитов промывают раствором фосфатного буфера PBS 2 раза, осуществляют отбор первой фракции хондроцитов, затем нелизированные фрагменты хрящевой ткани, находящиеся в фильтрующем устройстве, инкубируют в 0,3-0,8% растворе коллагеназы II типа в течение 1,5-2,5 часа при температуре 37°С в условиях перемешивания, полученный осадок хондроцитов промывают раствором фосфатного буфера PBS 2 раза, осуществляют отбор второй фракции хондроцитов, затем первую и вторую фракцию хондроцитов объединяют, далее нелизированные фрагменты хрящевой ткани удаляют из фильтрующего устройства и инкубируют в течении 18-20 часов при температуре 37°С в культуральной среде DMEM/F12 содержащую 15% FBS, 42.19 ед/мл пенициллина, 0.042 мг/мл стрептомицина, 0.053 мг/л амфотерицина В, затем культуральную среду DMEM/F12 содержащую 15% FBS, 42.19 ед/мл пенициллина, 0.042 мг/мл стрептомицина, 0.053 мг/л амфотерицина В отбрасывают и добавляют 0,3-0,8% раствор коллагеназы II типа, полученный после осаждения хондроцитов центрифугированием на втором этапе, инкубируют 1,5-2 часа при температуре 37°С в условиях перемешивания, полученную суспензию хондроцитов центрифугируют, образовавшийся супернатант, содержащий коллагеназу II типа, отбрасывают, а полученный осадок хондроцитов промывают раствором фосфатного буфера PBS 2 раза, осуществляют отбор третьей фракции хондроцитов и соединяют ее с первой и второй фракциями хондроцитов, затем полученную суспензию хондроцитов высевают на культуральный пластик для адгезионных культур в среде DMEM/F12 содержащей 15% FBS, 42.19 ед./мл пенициллина, 0.042 мг/мл стрептомицина, 0.053 мг/л амфотерицина В, получая первичную клеточную популяцию нулевого пассажа.
Вариант осуществления способа.
1 этап - Получение первой фракции хондроцитов.
Производят забор биологического материала, например, анатомически целостное образование из суставного хряща и субхондральной кости. Далее транспортируют в стерильном контейнере и помещают в ламинарный шкаф. Биологический материал, например, анатомически целостное образование из суставного хряща и субхондральной кости трижды промывают раствором фосфатного буфера PBS с 42.19 ед/мл пенициллина, 0.042 мг/мл стрептомицина, 0.053 мг/л амфотерицина В, в конечных концентрациях. На поверхности суставного хряща через 0,5-1 мм медицинским инструментом, например скальпелем, делают параллельные надрезы глубиной до субхондральной кости во взаимно перпендикулярных направлениях. После этого медицинским инструментом, например скальпелем, параллельно субхондральной кости срезают хрящевую ткань на всю глубину и соскребают в отдельную одноразовую стерильную посуду, например чашку Петри, тем самым получая фрагменты хрящевой ткани. С целью одновременной фильтрации и ферментативной обработки фрагменты хрящевой ткани помещают в фильтрующее устройство, например лабораторную капроновую сетку, сформированную в виде мешка. Затем его переносят в лабораторную посуду, например, бюкс, и добавляют 0,2-0,3% раствора трипсина. Соотношение объема биологического материала, например фрагментов хрящевой ткани к объему 0,2-0,3% раствора трипсина составляет 1:10. Помещают в термостатируемый шейкер, обрабатывают биологический материал, например фрагменты хрящевой ткани 0,2-0,3% раствором трипсина в течение 0,5-1 часа в условиях перемешивания при температуре 37°C и при скорости 100-120 rpm. В результате этого в лабораторной посуде, например бюксе, образуется суспензия хондроцитов в растворе 0,2-0,3% трипсина и не полностью расщепленный биологический материал, например фрагменты хрящевой ткани в фильтрующем устройстве, например лабораторной капроновой сетке, сформированной в виде мешка. С помощью дозирующего устройства, например автоматического дозатора, производят забор суспензии ходроцитов в 0,2-0,3% растворе трипсина из лабораторной посуды, например, бюкса, и осуществляют перенос в центрифужную пробирку, оставив в лабораторной посуде фильтрующее устройство, например лабораторную капроновую сетку, сформированную в виде мешка с биологическим материалом, например фрагментами хрящевой ткани. Затем нелизированный биологический материал, например фрагменты хрящевой ткани, промывают одним объемом культуральной среды, например DMEM/F12, содержащей 15% FBS, 42.19 ед./мл пенициллина, 0.042 мг/мл, 0.053 мг/л амфотерицина В. Затем указанную культуральную среду например DMEM/F12, содержащую 15% FBS, 42.19 ед./мл пенициллина, 0.042 мг/мл, 0.053 мг/л амфотерицина В отбирают из лабораторной посуды с оставшимися в ней нелизированными фрагментами хрящевой ткани с помощью дозирующего устройства, например, автоматического дозатора переносят в центрифужную пробирку, в которой находится суспензия хондроцитов в 0,2-0,3% растворе трипсина для ингибирования фермента. Цикл промывки повторяют дважды. Затем центрифужную пробирку с полученной суспензией хондроцитов и с ингибированным компонентами полной среды 0,2-0,3% раствором трипсина центрифугируют 5-10 минут при 1500 об./мин., супернатант отбрасывают. Полученный в ходе центрифугирования осадок хондроцитов выделенных 0,2-0,3% раствором трипсина промывают раствором фосфатного буфера PBS 2 раза, центрифугируют 5-10 минут при 1500 об./мин. и ресуспензируют в той же центрифужной пробирке с 1 мл культуральной среды, например DMEM/F12, содержащей 15% FBS, 42.19 ед/мл пенициллина, 0.042 мг/мл стрептомицина, 0.053 мг/л амфотерицина В и подсчитывают концентрацию хондроцитов в суспензии в камере Горяева и пересчитывают полученный результат по формуле пересчета количества клеток на 1 мл суспензии. Затем суспензию хондроцитов переносят с помощью дозирующего устройства, например, автоматического дозатора, в культуральную посуду для суспензионных культур, например, чашку Петри и помещают в CO2-инкубатор с целью сохранения.
2 этап - Получение второй фракции хондроцитов.
К фрагментам нелизированного биологического материала, например фрагментам хрящевой ткани, находящимся в фильтрующем устройстве, например капроновой сетке, сформированной в виде мешка, и помещенной в лабораторную посуду, например, бюкс, дозирующим устройством, например, автоматическим дозатором добавляют 0,3-0,8% раствора коллагеназы II типа. Затем лабораторную посуду с фрагментами хрящевой ткани в 0,3-0,8% растворе коллагеназы II типа помещают на 1,5-2,5 часа в термостатируемый шейкер, где получают следующую фракцию хондроцитов при температуре 37°C в условиях перемешивания и при скорости 100-120 rpm. В результате этого образуется суспензия хондроцитов в растворе 0,3-0,8% коллагеназы II типа и не полностью расщепленный биологический материал, например фрагменты хрящевой ткани. Далее с помощью дозирующего устройства, например автоматического дозатора, производят перенос суспензии хондроцитов в растворе 0,3-0,8% коллагеназы II типа в центрифужную пробирку. Центрифугируют в течение 5-10 минут при скорости вращения ротора 1500-1700 об./мин. После центрифугирования образовавшийся супернатант, содержащий 0,3-0,8% раствор коллагеназы II типа из центрифужной пробирки переносят в чистую стерильную пробирку, закрывают и сохраняют 18-20 часов при температуре +4°C. Образовавшийся в ходе центрифугирования осадок хондроцитов, промывают раствором фосфатного буфера PBS 2 раза. Далее осадок хондроцитов ресуспензируют в 1 мл культуральной среды DMEM/F12, содержащей 15% FBS, 42.19 ед/мл пенициллина, 0.042 мг/мл, 0.053 мг/л амфотерицина В и подсчитывают концентрацию выделенных хондроцитов в суспензии в камере Горяева и пересчитывают полученный результат по формуле пересчета количества клеток на 1 мл суспензии. Затем полученную суспензию хондроцитов переносят в культуральную посуду для суспензионных культур, например чашку Петри, содержащую суспензию хондроцитов, выделенных раствором 0,2-0,3% трипсина на первом этапе. Таким образом, в одной культуральной посуде, например чашке Петри, через 2-4 часа находится суспензия хондроцитов, выделенных в ходе 1 и 2 этапа: 1 фракция включает в себя суспензию хондроцитов, выделенных раствором 0,2-0,3% трипсина на 1 этапе, вторая - суспензию хондроцитов, выделенных 0,3-0,8% раствором коллагеназы II типа на 2 этапе. Суспензию хондроцитов помещают в CO2-инкубатор и инкубируют в течение 18-20 часов.
3 этап - Получение третьей фракции хондроцитов и первичной клеточной популяции нулевого пассажа.
Оставшиеся после 1-2 этапов фрагменты нелизированного биологического материала, например фрагменты хрящевой ткани, находящиеся в фильтрующем устройстве, например лабораторной капроновой сетке и лабораторной посуде, например, бюксе с помощью медицинского инструмента, например, шпателя переносят в одноразовую стерильную посуду для суспензионных культур, например, флакон площадью 25 см2, и помещают в CO2-инкубатор на 18-20 часов в среду, например, DMEM/F12 содержащую 15% FBS, 42.19 ед/мл пенициллина, 0.042 мг/мл стрептомицина, 0.053 мг/л амфотерицина В. Далее отбирают вместе с культуральной средой, например, DMEM/F12, содержащую 15% FBS, 42.19 ед/мл пенициллина, 0.042 мг/мл стрептомицина, 0.053 мг/л амфотерицина В. Затем нелизированные фрагменты хрящевой ткани из культуральной посуды, например, флакона площадью 25 см2, и переносят с помощью дозирующего устройства в лабораторную посуду, например бюкс. После этого дают нелизированным фрагментам хрящевой ткани осесть, отбирают дозирующим устройством, например, автоматическим дозатором культуральную среду, например, DMEM/F12, содержащую 15% FBS, 42.19 ед./мл пенициллина, 0.042 мг/мл стрептомицина, 0.053 мг/л амфотерицина В, и добавляют 0,3-0,8% раствор коллагеназы II типа, хранившейся 18-20 часов при температуре +4° полученной после осаждения суспензии хондроцитов центрифугированием на 2 этапе выделения. Помещают в термостатируемый шейкер и термостатируют в течении двух часов при температуре 37°C в условиях перемешивания и при скорости 100-120 rpm. В результате этого через 1,5-2 часа происходит полное лизирование биологического материала, например фрагментов хрящевой ткани 0,3-0,8% раствором коллагеназы II типа и образуется суспензия хондроцитов. Затем полученную суспензию хондроцитов с помощью дозирующего устройства, например, автоматического дозатора, переносят в центрифужную пробирку. Центрифугируют в течение 5-10 минут при скорости вращения ротора 1500-1700 об./мин. После центрифугирования образовавшийся супернатант, содержащий коллагеназу II типа, отбрасывают. Полученный осадок хондроцитов промывают раствором фосфатного буфера PBS 2 раза. Затем полученную в ходе 3 этапа суспензию хондроцитов помещают в центрифугу и собирают центрифугированием в течение 5-10 минут при скорости вращения ротора 1500-1700 об./мин., ресуспендируют и подсчитывают концентрацию выделенных хондроцитов в суспензии в камере Горяева и пересчитывают полученный результат по формуле пересчета количества клеток на 1 мл суспензии. После 3-го этапа суспензию хондроцитов переносят в культуральную посуду для суспензионных культур, например чашку Петри, содержащую суспензию хондроцитов, выделенных на 1-м и 2-м этапе. Затем хондроциты полученные после 3-х этапов высевают на культуральный пластик для адгезионных культур в среде DMEM/F12 («Биолот», Россия) с добавлением 15% сыворотки крови плодов коровы (FBS «Gibco», США), пенициллина - стрептомицина («Биолот»,), и амфотерицина В («Биолот», Россия) тем самым получают первичную клеточную популяцию нулевого пассажа.
В результате подсчета установлено, что на 1-м этапе при обработке фрагментов хрящевой ткани 0,2-0,3% раствором трипсина выделяется от 0,06 до 0,14 миллионов клеток в миллилитре суспензии. На 2-м этапе, при обработке нелизированных фрагментов хрящевой ткани 0,3-0,8% растворе коллагеназы II типа выделяется от 0,48 до 2,25 миллионов клеток в миллилитре суспензии. На 3-м этапе, при обработке нелизированных фрагментов хрящевой ткани 0,3-0,8% растворе коллагеназы II типа выделяется от 0,9 до 2,6 миллионов клеток в миллилитре суспензии. Затем полученные данные после трех этапов складывают. В результате после 3-х этапов обработки установлено, что выделяется от 2,2 до 3,8 миллионов клеток в миллилитре суспензии. Из чего следует, что заявляемый нами способ позволяет достичь максимального выделения жизнеспособных хондроцитов.
После 3-х этапной обработки фрагментов хрящевой ткани полнота лизирования ткани, характеризуемая по массе остатка фрагментов хрящевой ткани при лизировании 1 грамма хрящевой ткани составляет 0,007-0,05 граммов. Из чего следует что у заявляемого нами способа высокая степень лизирования с минимальным остатком субстрата.
После 3-х этапов обработки фрагментов хрящевой ткани с целью определения жизнеспособности хондроцитов используют метод прижизненного окрашивания трипановым синим. В результате использования этого метода установлено, что у большинства хондроцитов наблюдается сохранение бесцветной окраски, тем самым подтверждается целостность клеточной мембраны большинства хондроцитов в суспензии и их жизнеспособность.
Пример клинического применения
Пациентка К., 1953 года рождения поступила в 2017 году в Новосибирский НИИТО для планового оперативного лечения. Анамнез: боли в области коленного сустава с 2013 года. Ранее травма правого коленного сустава. С 2015 года присоединилось ограничение движения в левом коленном суставе. Проводилось консервативное лечение по месту жительства без положительного эффекта. После проведенного комплексного обследования, осмотров специалистов установлен клинический диагноз: Двусторонний посттравматический гонартроз 3 степени справа, 2 степени слева. Варусная деформация правой нижней конечности. Комбинированная контрактура правого коленного сустава. Синдром гоналгии справа. Рекомендовано эндопротезирование левого коленного сустава. Основание для забора биологического материала: решение о плановом оперативном лечении и информированное добровольное согласие пациента на использование для научных работ послеоперационного материала от 13.02.2017. Производят забор биологического материала, например анатомически целостное образование из суставного хряща и субхондральной кости и выполняют 1-й этап в соответствии с предложенным способом. В результате после первого этапа при обработке фрагментов хрящевой ткани 0,2-0,3% раствором трипсина выделилось 0,068 миллионов клеток в миллилитре суспензии. Затем выполняют 2-й этап в соответствии с предложенным способом. В результате после второго этапа при обработке фрагментов хрящевой ткани в 0,3-0,8% растворе коллагеназы II типа выделилось 1,08 миллионов клеток в миллилитре суспензии. Затем полученные фракции суспензию хондроцитов выделенных в ходе 1 и 2 этапа соединяют в культуральном флаконе для суспензионных культур. Затем выполняют 3-й этап в соответствии с предложенным способом. В результате при обработке нелизированных фрагментов хрящевой ткани 0,3-0,8% растворе коллагеназы II типа выделилось 2,59 миллионов клеток мл. После 3-го этапа суспензию хондроцитов переносят в культуральный флакон содержащий суспензию хондроцитов, выделенных на 1-м и 2-м этапе. Затем хондроциты полученные после 3-х этапов высевают на культуральный пластик для адгезионных культур в среде DMEM/F12 («Биолот», Россия) с добавлением 15% сыворотки крови плодов коровы (ФТС) («Gibco», США), 42.19 ед./мл пенициллина, 0.042 мг/мл, 0.053 мг/л амфотерицина В (Биолот, Санкт-Петербург), и амфотерицина В (Биолот, Санкт-Петербург), тем самым получают первичную клеточную популяцию нулевого пассажа.
В результате после 3-х этапов обработки установлено, что выделилось 3,73 миллионов клеток в миллилитре суспензии. Из чего следует, что заявляемый нами способ позволяет достичь максимального выделения жизнеспособных хондроцитов.
С целью определения жизнеспособности хондроцитов используют метод прижизненного окрашивания трипановым синим. В результате, которого было установлено, что у 85-90% хондроцитов наблюдается сохранение бесцветной окраски, тем самым подтверждается целостность клеточной мембраны большинства хондроцитов в суспензии и их жизнеспособность.
После 3-х этапной обработки фрагментов хрящевой ткани путем визуальной оценки было установлено, что в суспензии отсутствуют фрагменты хрящевой ткани. При взвешивании осадка нелизированных фрагментов хрящевой ткани установлено, что их масса ровна 0,015 грамма. Из чего следует что у заявляемого нами способа высокая степень лизирования с минимальным остатком субстрата.
Преимущество предложенного способа по сравнению с существующими заключается в том, что позволяет достичь максимального выделения хондроцитов за счет того, что хрящевую ткань нарезают на субхондральной кости через 0,5-1 мм делают параллельные надрезы глубиной до субхондральной кости во взаимно перпендикулярных направлениях. Срезают хрящевую ткань параллельно субхондральной кости на всю глубину и соскребают. Обработка кусочков хрящевой ткани осуществляется ферментами специфичными к субстрату. Выделение производят последовательно сначала раствором трипсина, а затем каллагенозой II типа. Способ обеспечивает высокий уровень жизнеспособности хондроцитов, за счет того что хрящевую ткань нарезают на субхондральной кости. Получают мелкие фрагменты хрящевой ткани, что увеличивает площадь взаимодействия субстрата и фермента, и как следствие уменьшается время воздействия и концентрация ферментов на фрагменты хрящевой ткани, тем самым повышается уровень жизнеспособности хондроцитов. Осуществляют отбор фракций суспензии хондроцитов после каждого этапа ферментативной обработки. Способ обеспечивает высокую степень лизирования за счет того, что используются специфичные ферменты к компонентам межклеточного матрикса хрящевой ткани, как следствие увеличивается площадь поверхности субстрата в результате поэтапной обработки сначала раствором трипсина, а затем коллагеназой II типа, увеличивается проникновение кислорода в клетки. Низкая степень контаминации за счет того, что после забора биологического материала сразу проводят выделение хондроцитов по предложенному нами способу. Происходит разделение технологичных этапов механической и ферментативной обработки связанных со сменой стерильной лабораторной посуды. В последующем будет наблюдаться высокая чистота эксперимента, который будет проведен на данной культуре в связи с тем, что в результате заявляемого способа получают первичную клеточную популяцию нулевого пассажа с однородным функциональным состоянием хондроцитов. При использовании фильтрующего устройства происходит совмещение двух процессов: процесса ферментативной обработки и процесса фильтрации хондроцитов от фрагментов хрящевой ткани, это позволяет сократить время выделения хондроцитов и увеличить количество выделяемых хондроцитов. Использование фильтрующего устройства позволяет производить отбор суспензии хондроцитов быстро, что важно для непрерывного лизиса и регулярно, что обеспечивает получение более однородной популяции жизнеспособных хондроцитов с одинаковыми свойствами. Указанные достоинства приводят к уменьшению времени подготовки биологического материала и уменьшению количества исходного биологического материала, следовательно, сокращается количество используемых ферментов, что уменьшает затраты.
Способ выделения хондроцитов реализуется на современном оборудовании, с использованием современных технологий и материалов.
Claims (1)
- Способ выделения хондроцитов, включающий забор материала, срезание хрящевой ткани с кости, нарезание хрящевой ткани на фрагменты, инкубирование в культуральной среде, инкубирование фрагментов хрящевой ткани в растворе коллагеназы, промывание, центрифугирование суспензии клеток и высевание на культуральный пластик, отличающийся тем, что нарезают хрящевую ткань на субхондральной кости глубиной до кости, надрезы через 0,5-1 мм выполняют параллельно во взаимно перпендикулярных направлениях, затем соскребают параллельно костной поверхности, полученные фрагменты хрящевой ткани для одновременной фильтрации и ферментативной обработки помещают в фильтрующее устройство, затем инкубируют в 0,2-0,3%-ном растворе трипсина при соотношении фрагментов хрящевой ткани к трипсину 1:10 в течение 0,5-1 ч при температуре 37°С в условиях перемешивания, полученную суспензию хондроцитов центрифугируют, супернатант отбрасывают, а образовавшийся осадок хондроцитов промывают раствором фосфатного буфера PBS 2 раза, осуществляют отбор первой фракции хондроцитов, затем нелизированные фрагменты хрящевой ткани, находящиеся в фильтрующем устройстве, инкубируют в 0,3-0,8%-ном растворе коллагеназы II типа в течение 1,5-2,5 ч при температуре 37°С в условиях перемешивания, полученный осадок хондроцитов промывают раствором фосфатного буфера PBS 2 раза, осуществляют отбор второй фракции хондроцитов, затем первую и вторую фракцию хондроцитов объединяют, далее нелизированные фрагменты хрящевой ткани удаляют из фильтрующего устройства и инкубируют в течение 18-20 ч при температуре 37°С в культуральной среде DMEM/F12, содержащей 15% FBS, 42.19 ед/мл пенициллина, 0.042 мг/мл стрептомицина, 0.053 мг/л амфотерицина В, затем культуральную среду DMEM/F12, содержащую 15% FBS, 42.19 ед/мл пенициллина, 0.042 мг/мл стрептомицина, 0.053 мг/л амфотерицина В, отбрасывают и добавляют 0,3-0,8% раствор коллагеназы II типа, полученный после осаждения хондроцитов центрифугированием на втором этапе, инкубируют 1,5-2 ч при температуре 37°С в условиях перемешивания, полученную суспензию хондроцитов центрифугируют, образовавшийся супернатант, содержащий коллагеназу II типа, отбрасывают, а полученный осадок хондроцитов промывают раствором фосфатного буфера PBS 2 раза, осуществляют отбор третьей фракции хондроцитов и соединяют ее с первой и второй фракциями хондроцитов, затем полученную суспензию хондроцитов высевают на культуральный пластик для адгезионных культур в среде DMEM/F12, содержащей 15% FBS, 42.19 ед./мл пенициллина, 0.042 мг/мл стрептомицина, 0.053 мг/л амфотерицина В, получая первичную клеточную популяцию нулевого пассажа.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017132220A RU2677688C1 (ru) | 2017-09-14 | 2017-09-14 | Способ выделения хондроцитов |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017132220A RU2677688C1 (ru) | 2017-09-14 | 2017-09-14 | Способ выделения хондроцитов |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2677688C1 true RU2677688C1 (ru) | 2019-01-21 |
Family
ID=65084987
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017132220A RU2677688C1 (ru) | 2017-09-14 | 2017-09-14 | Способ выделения хондроцитов |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2677688C1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114958712A (zh) * | 2022-05-25 | 2022-08-30 | 武汉大学 | 一种带壁细胞表面修饰高分子的方法、被修饰后的细胞及其应用 |
| RU2825897C2 (ru) * | 2024-02-15 | 2024-09-02 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр радиологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ радиологии" Минздрава России) | Способ получения назальных хондроцитов новорожденных крысят |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2285039C2 (ru) * | 2004-07-06 | 2006-10-10 | ГУ Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии МЗ РФ | Способ получения донорских хондробластов |
| RU2409662C2 (ru) * | 2009-03-26 | 2011-01-20 | Сергей Павлович Миронов | Способ получения донорских хондроцитов |
-
2017
- 2017-09-14 RU RU2017132220A patent/RU2677688C1/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2285039C2 (ru) * | 2004-07-06 | 2006-10-10 | ГУ Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии МЗ РФ | Способ получения донорских хондробластов |
| RU2409662C2 (ru) * | 2009-03-26 | 2011-01-20 | Сергей Павлович Миронов | Способ получения донорских хондроцитов |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| J. MCDOWEL, M.T. BAYLISS, M.D. STEPHENS, G. BENTLEY. Phenotypic modulation in sub-population of human articular chondrocytes in vitro. Journal of Cell Science. 1990, 97, р.361-371. * |
| КИМ И. И. Выделение и культивирование хондроцитов, полученных из различных источников // "Клеточная трансплантология и клеточная инженерия" N 4 (6), 2006, стр. 48-50. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114958712A (zh) * | 2022-05-25 | 2022-08-30 | 武汉大学 | 一种带壁细胞表面修饰高分子的方法、被修饰后的细胞及其应用 |
| CN114958712B (zh) * | 2022-05-25 | 2024-03-19 | 武汉大学 | 一种带壁细胞表面修饰高分子的方法、被修饰后的细胞及其应用 |
| RU2825897C2 (ru) * | 2024-02-15 | 2024-09-02 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр радиологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ радиологии" Минздрава России) | Способ получения назальных хондроцитов новорожденных крысят |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Vangsness Jr et al. | Umbilical cord tissue offers the greatest number of harvestable mesenchymal stem cells for research and clinical application: a literature review of different harvest sites | |
| Jager et al. | Bone marrow concentrate: a novel strategy for bone defect treatment | |
| Patterson et al. | The efficiency of bone marrow aspiration for the harvest of connective tissue progenitors from the human iliac crest | |
| Jonason et al. | Primary murine growth plate and articular chondrocyte isolation and cell culture | |
| JP2009028056A (ja) | 骨髄誘導間葉細胞に特異的なモノクローナル抗体 | |
| WO2006121612A1 (en) | Treatment of joint disease, methods and apparatuses therefor | |
| Sanjurjo-Rodriguez et al. | Ovine mesenchymal stromal cells: morphologic, phenotypic and functional characterization for osteochondral tissue engineering | |
| CN108348555A (zh) | 细胞扩增方法和治疗组合物 | |
| KR101669038B1 (ko) | 영양막 기저층으로부터 유래된 줄기세포 및 이를 포함하는 세포치료제 | |
| Min et al. | Proliferation and osteoblastic differentiation of bone marrow stem cells: comparison of vertebral body and iliac crest | |
| Spoliti et al. | In vitro release and expansion of mesenchymal stem cells by a hyaluronic acid scaffold used in combination with bone marrow | |
| CN108685948A (zh) | 一种新型医用细胞修复剂的制备方法 | |
| Tevlin et al. | A novel method of human adipose-derived stem cell isolation with resultant increased cell yield | |
| Johnstone et al. | Identification and characterization of a large source of primary mesenchymal stem cells tightly adhered to bone surfaces of human vertebral body marrow cavities | |
| Linon et al. | Engraftment of autologous bone marrow cells into the injured cranial cruciate ligament in dogs | |
| Lauritano et al. | Regenerative dentistry and stem cells: a multilineage differentiation as a safe and useful alternative way of harvesting and selection adipose derived mesenchymal stem cells | |
| RU2677688C1 (ru) | Способ выделения хондроцитов | |
| US9434923B2 (en) | Preparation of parental cell bank from foetal tissue | |
| WO2021011779A2 (en) | Mesenchymal stem cell compositions | |
| Somoza et al. | Isolation of chondrocytes from human cartilage and cultures in monolayer and 3D | |
| Kumazawa et al. | Osteogenic potential, multipotency, and cytogenetic safety of human bone tissue-derived mesenchymal stromal cells (hBT-MSCs) after long-term cryopreservation | |
| WO2011145110A1 (en) | A novel cord blood plasma nutrient formulation and a method for the preparation thereof | |
| CN115040693B (zh) | 含cd56+亚细胞群来源外泌体的生物材料及其制备方法 | |
| CN103857788A (zh) | 生长和分化因子8(gdf-8)的用途 | |
| CN115287257B (zh) | 基于弓形虫外分泌蛋白的成骨诱导分化培养基、制备方法及成骨诱导分化方法 |