CN105561343A - 一种预防人或动物弓形虫病的dna疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种预防人或动物弓形虫病的DNA疫苗，通过PCR扩增ROP19基因，将其插入真核表达载体pEGFP-C1中构建重组质粒pEGFP-C1-ROP19(pROP19)，提取含目的基因的重组质粒获得弓形虫ROP19DNA疫苗。本发明采用DNA疫苗对BALB/c小鼠进行主动免疫后，通过测定免疫鼠的细胞和体液免疫指标来评价疫苗的免疫原性，通过计数小鼠弓形虫攻击实验后大脑中包囊的数量以及小鼠存活率来评估疫苗的免疫保护性。本发明可有效地增强体液免疫和细胞免疫反应，有效地降低免疫小鼠在接受弓形虫PRU株(II型)攻击后大脑包囊的形成率，以及延长弓形虫RH株(I型)攻击后小鼠的存活时间。

Description

一种预防人或动物弓形虫病的DNA疫苗

技术领域

本发明涉及一种疫苗，特别涉及一种基于弓形虫棒状体蛋白19(ROP19)的复合抗原表位，通过构建含有目的基因的重组质粒而获取的弓形虫疫苗，用于人或动物弓形虫病的预防。

背景技术

弓形虫(Toxoplasmagondii)是世界性分布的寄生原虫，广泛寄生于人体及动物的有核细胞内，引起严重的人兽共患病。弓形虫感染孕早期妇女可导致流产、早产甚至死产，亦可通过胎盘引起新生儿畸形和胎儿眼部并发症。对于免疫力缺乏或者低下的人群(如艾滋病和肿瘤患者)，弓形虫可导致严重的临床症状(如弓形虫脑病)甚至死亡。在免疫功能正常的宿主体内，弓形虫往往形成慢性感染，引起不可逆的中枢神经系统和视力的损害。作为一种机会致病性胞内寄生的原虫，弓形虫在宿主体内主要引起细胞免疫反应，是通过识别抗原蛋白的十几个氨基酸序列发挥作用，这就是抗原表位。表位分为T细胞表位和B细胞表位。T细胞表位在细胞内由主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex,MHC)I或II分子识别并递呈到细胞表面，然后分别被CD8⁺细胞毒T细胞的TCR识别和辅助性CD4⁺T细胞的TCR识别。B细胞表位则直接被B细胞受体BCR识别。有效的抗弓形虫病的疫苗主要产生保护性的Th1型细胞免疫反应，而除了CD8⁺T细胞表位之外，混合CD4⁺T细胞表位及B细胞表位可有效增强Th1型细胞免疫反应。因此研制针对弓形虫同时具有人类及BALB/c小鼠MHC分子限制性T细胞表位和B细胞表位的新疫苗是非常迫切和必要的。

弓形虫的棒状体蛋白(rhoptryprotein，ROP)由前端的分泌器官棒状体分泌，在细胞入侵时发挥着主导作用，尤其与纳虫泡的形成关系密切。ROP的结构形态为棒状，故称之为棒体状蛋白，棒状体蛋白种类繁多，结构各异，具有各种各样的功能。其中已有部分关于ROP家族成员疫苗研究的报道，主要包括ROP1和ROP2家族，目前已证实可作为疫苗候选基因的ROP2家族成员包括ROP2、ROP4、ROP5、ROP8、ROP13、ROP16、ROP17和ROP18，每种棒状蛋白的氨基酸序列和具体的结构单元不同，导致其免疫原理不同，同时免疫保护效果不同。

发表在SCI收录期刊ParasitologyInternational上“ImmuneresponseinducedbyrecombinantMycobacteriumbovisBCGexpressingROP2geneofToxoplasmagondii”文章公开报道有关ROP2DNA疫苗研究报道，然而ROP2DNA疫苗的免疫保护效果并不能达到令人满意的程度。另外上述的其他ROP蛋白制备成为的疫苗并没有同时抗RH株弓形虫(I型株)和PRU株弓形虫(II型株)的优异性能。

ROP家族成员之一的ROP19蛋白，主要定位于弓形虫棒状体和纳虫空泡，目前对于ROP的研究报道较少，而且并没有ROP19蛋白在制备预防人或动物弓形虫病的DNA疫苗的相关报道。

发明内容

针对上述现有技术，在生物信息学分析中，弓形虫ROP19蛋白的氨基酸序列及编码ROP19蛋白的碱基序列从ToxoDB10.0(http://toxodb.org/toxo/)获取(GeneID:TGME49_242240)。通过使用PSORTII分析ROP19蛋白的亚细胞定位，并用IEDB预测出的同时具有人类及BALB/C小鼠MHC分子限制性的弓形虫ROP19的T细胞优势表位，用DNAStar-Protean软件综合分析预测ROP19的B细胞优势表位，并将其与弓形虫SAG1的T细胞表位及B细胞表位分析比较，分析结果表明弓形虫ROP19基因具备成为优良DNA疫苗的潜力。根据ToxoDB10.0发表的弓形虫ROP19序列设计合成一对引物，通过PCR扩增ROP19基因，将其插入真核表达载体pEGFP-C1中构建重组质粒pEGFP-C1-ROP19(pROP19)，大量提取的含目的基因的重组质粒获得弓形虫ROP19DNA疫苗。并观察该疫苗肌肉注射免疫BALB/c小鼠的免疫原性和小鼠抗RH株弓形虫(I型株，主要为速殖子造成急性期感染)和PRU株弓形虫(II型株，易形成包囊的虫株)攻击的保护效果。

本发明采用的技术方案具体如下：

一种预防人或动物弓形虫病的DNA疫苗，pEGFP-C1质粒在真核细胞中具有良好的表达效果，在实验中，将弓形虫棒状体蛋白19(ROP19)的基因插入真核表达载体pEGFP-C1中，构建重组质粒pEGFP-C1-ROP19，该重组质粒pEGFP-C1-ROP19即为弓形虫ROP19DNA疫苗。

本发明的疫苗，可作为预防人或动物弓形虫感染，控制宿主脑组织中包囊形成及抵抗弓形虫急性感染的有效候选疫苗。

优选的，根据编码ROP19蛋白的碱基序列及pEGFP-C1质粒上酶切位点的距离，选择将所述弓形虫棒状体蛋白19的基因插入pEGFP-C1中BamHI和KpnI位点间。

本发明提供一种制备预防人或动物弓形虫病的DNA疫苗的制备方法，包括以下步骤：以弓形虫ROP19基因为DNA模板，通过聚合酶链反应扩增ROP基因片段，将其插入到真核表达载体pEGFP-C1中BamHI和KpnI位点间构建重组质粒pEGFP-C1-ROP19(pROP19)，提取含有目的基因的重组质粒，获得弓形虫ROP19DNA疫苗。

优选的，PCR扩增采用的引物如下：上游引物：

5′-CGGGGTACCATGAGAAGGCTGCTGCTTTC-3′，如SEQIDNO：1所示；下游引物：

5′-CGGGATCCTCACTGAGATCTGGATGC-3′，如SEQIDNO：2所示。

优选的，聚合酶链反应的条件为：95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min，共30个循环。

优选的，扩增后产物经质量分数为1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的片段，回收后的PCR产物和pEGFP-C1质粒载体分别酶切3h后电泳，切胶后用试剂盒再分别回收酶切后的PCR纯化产物和pEGFP-C1质粒载体，回收片段以5∶1的比例混合后在T4连接酶作用下连接过夜；转化后均匀涂于LK培养基平板上培养过夜，挑单个菌落于LK液体培养基培养，8h后提取质粒获得含有目的基因的重组DNA疫苗。

本发明还提供上述疫苗在预防人或动物弓形虫病中的应用。

优选的，所述弓形虫病包括急性弓形虫病和慢性弓形虫病，所述DNA疫苗能控制宿主脑组织中包囊形成及抵抗弓形虫急性感染。

优选的，所述弓形虫病中的弓形虫的种类包括RH株弓形虫(I型株)和PRU株弓形虫(II型株)。

ROP家族成员之一的ROP19蛋白，主要定位于弓形虫棒状体和纳虫空泡，具有优良的抗原表位，且与虫体在胞内的生长和发育息息相关。ROP19蛋白定位于病原体膜上的蛋白能更有效刺激机体的体液免疫。我们通过使用PSORTII分析ROP19蛋白的亚细胞定位，发现它位于内质网的比例是55.6％(22.2％：质膜，11.1％：细胞质，11.1％：细胞外)。此外，目前现有的最佳预防弓形虫的DNA疫苗是SAG1疫苗，在这项研究中，我们使用DNASTAR软件预测弓形虫SAG1和ROP19的B细胞表位。图2显示了ROP19预测的结果。通过比对，我们发现ROP19具有比SAG1更优异的抗原指数和表面概率。我们的数据表明，ROP19具有优秀的B细胞表位。在我们的研究中，使用在线服务IEDB分析ROP19的T细胞表位。通过IEDB在线服务预测了弓形虫SAG1和ROP19的肽结合于MHCII类分子的IC50值。通过生物信息学分析鉴定出ROP19所具备的Th细胞表位结合MHCII类分子的能力更高，如图2所示。分析结果表明弓形虫ROP19基因具备成为优良DNA疫苗的潜力。

本发明的重组弓形虫ROP19DNA疫苗，对BALB/c小鼠进行肌肉注射免疫。通过测定细胞和体液免疫反应指标来评价疫苗的免疫原性，通过计数PRU株弓形虫攻击实验后小鼠大脑中包囊的数量及RH株弓形虫攻击后小鼠生存率来评估疫苗的免疫保护性。结果表明与对照组相比，重组弓形虫ROP19DNA疫苗组能有效地降低免疫小鼠在弓形虫PRU株(II型)攻击后大脑包囊的形成率，提高RH株弓形虫攻击后小鼠的免疫保护性反应及生存率。本发明的突出效果是：该疫苗可作为控制弓形虫慢性感染过程中脑组织包囊形成及急性感染时提高免疫反应及生存率的有效的候选疫苗。

本发明的疫苗，评估该疫苗的的免疫原性的方式为：将DNA疫苗经肌肉注射免疫BALB/c小鼠2次，间隔3周。分别于第一次免疫后2周，第2次免疫后2周，和第三次免疫后2周，于免疫鼠眼内眦静脉取血，分离血清，测定血样中的IgG浓度。于末次免疫后4周，无菌取免疫鼠的脾脏，通过200目铜网研磨制备脾单细胞悬液，加入ROP19复合表位肽刺激培养后检测细胞因子来评估该疫苗的的免疫原性。

本发明的疫苗，评估该疫苗的的免疫保护性的方式为：小鼠于末次免疫后4周，用II型弓形虫PRU虫株包囊20个攻击。8周后处死小鼠，无菌条件下取脑，物理研磨制备脑组织匀浆液。显微镜下包囊计数。通过比较实验组和对照组小鼠脑的包囊数来评价疫苗的免疫保护性。用I型弓形虫RH虫株速殖子1000个攻击，记录小鼠存活时间。

本发明是重组弓形虫ROP19DNA疫苗，目的在于提高小鼠针对弓形虫的免疫保护性反应，减少脑组织内包囊的形成。另外，攻击实验所选择的弓形虫虫株是弓形虫I型RH株，其易造成弓形虫急性感染，采用经腹腔注射1000个速殖子来模拟弓形虫急性感染过程。II型弱毒株PRU株，其在宿主体内容易形成包囊，采用经口给予20个包囊来模拟弓形虫慢性感染过程。

附图说明

图1：重组DNA疫苗的构建。以弓形虫基因组获作为DNA模板，通过聚合酶链反应扩增获得ROP19基因片段,并插入载体pEGFP-C1的BamHI和KpnI位点间,产生pEGFP-C1-ROP19。

图2：弓形虫ROP19和SAG1B细胞表位和T细胞表位分析比对。

图3：重组质粒鉴定；泳道M：DNA标记物；泳道1：pEGFP-C1单酶切；泳道2：pEGFP-C1-ROP19单酶切；泳道3：pEGFP-C1-ROP19双酶切。

图4：免疫鼠血清中抗弓形虫免疫球蛋白IgG含量的测定及脾细胞中细胞因子(IFN-γ和IL-4和IL-10)含量的测定。分别在免疫后第2、4、6周末免疫鼠内眼眦取血法取血，分离血清。使用酶联免疫吸附试验测定血清中总抗弓形虫免疫球蛋白(Ig)的含量。如图所示，在两次免疫接种后，与对照组PBS和空载体组相比，DNA疫苗免疫组的抗体滴度水平增加明显，在第4周末和第6周末，DNA疫苗免疫组小鼠中均检测到高水平的弓形虫特异性IgG抗体(P<0.01)。于末次免疫后4周，无菌取免疫鼠的脾脏，通过200目铜网研磨制备脾单细胞悬液，加入ROP19复合表位肽刺激培养后流式细胞术检测细胞因子的含量。如图中所示，与对照组PBS和空载体组相比，DNA疫苗免疫组的细胞因子含量显著增加(P<0.01)。

图5：重组DNA疫苗针对弓形虫的免疫保护性。小鼠经口感染悬浮于0.1毫升PBS中的弓形虫包囊20个。感染两个月后，所有小鼠均被处死，分离小鼠大脑进行物理研磨，制备脑组织匀浆液。将脑组织匀浆液混均，取10微升于显微镜下计数三次取平均值，小鼠脑的包囊数为10倍的平均值。免疫小鼠的攻击实验表明：与对照组PBS和空载体pEGFP-C1组相比，重组DNA疫苗pEGFP-C1-ROP19免疫组的小鼠存活率明显提高，且脑中检测到包囊数量显著减少(P<0.01)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

本发明中未详尽描述的试剂、方法均为所属领域的常规试剂、方法。

实例1.弓形虫ROP19抗原表位预测

通过DNAStar-Protean软件综合分析预测ROP19(ToxoDB10.0(http://toxodb.org/toxo/)(GeneID:TGME49_242240))的B细胞优势表位；用IEDB预测同时具有人类及BALB/C小鼠MHC分子限制性的弓形虫ROP19T细胞优势表位(图2)。

实例2.重组弓形虫ROP19基因的DNA疫苗

根据弓形虫ROP19的基因序列，设计合成引物如下：上游引物：

5′-CGGGGTACCATGAGAAGGCTGCTGCTTTC-3′，如SEQIDNO：1所示；下游引物：

5′-CGGGATCCTCACTGAGATCTGGATGC-3′，如SEQIDNO：2所示。

如图1所示，用所提取的弓形虫基因组DNA为模板扩增ROP19基因，反应条件为：95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min，共30个循环。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的片段，回收后的PCR产物和pEGFP-C1质粒载体分别酶切3h后电泳，切胶后用试剂盒再分别回收酶切后的PCR纯化产物和pEGFP-C1质粒载体，回收片段以5∶1的比例混合后在T4连接酶作用下连接过夜，基因片段插入pEGFP-C1中BamHI和KpnI位点间。转化后均匀涂于LK培养基平板上培养过夜，挑单个菌落于LK液体培养基培养，8h后提取质粒获得含有目的基因的重组DNA疫苗。结果如图3所示，凝胶电泳显示重组质粒的构建和鉴定。

实例3.弓形虫重组基因疫苗免疫BALB/c鼠

SPF级雌性BALB/c鼠(6-8周)购自山东大学实验动物中心。45只小鼠随机分成3组，实验组每组小鼠经后腿肌肉注射100μg重组疫苗pEGFP-C1-ROP19，对照组注射免疫100μg空载体pEGFP-C1和100μgPBS。小鼠共免疫三次，间隔两周。

实例4.免疫鼠体液免疫和细胞免疫水平的测定

分别在第2、4、6周末小鼠内眼眦取血法取血，血样先在室温下静置3h，然后3000rpm，离心30min，收集血清。使用酶联免疫吸附试验测定血清中总抗弓形虫免疫球蛋白(Ig)的含量。结果如图4所示。在两次免疫接种后，与对照组PBS和空载体组相比，疫苗免疫组的抗体滴度水平增加明显，在第4和第6周末，重组基因疫苗免疫组小鼠中检测到高水平的弓形虫特异性IgG抗体(P<0.01)(图4)。

在末次免疫后4周，无菌取免疫鼠的脾脏，通过200目铜网研磨制备脾单细胞悬液。使用红细胞裂解缓冲液除去脾细胞中的红细胞后，重悬于含有10％胎牛血清的1640培养基中，调整细胞悬浮液的浓度为3×10⁷个细胞/ml，加入ROP19复合表位肽刺激培养后流式细胞术检测细胞因子的含量。结果表明，重组基因免疫组的小鼠脾细胞中检测出大量的IFN-γ，明显高于对照组(P<0.01)。提示该DNA疫苗主要诱导小鼠产生Th1型细胞免疫应答(图4)。

实例5.弓形虫重组DNA基因疫苗保护性研究

末次免疫后4周，免疫小鼠进行攻击实验。小鼠经口感染悬浮于0.1毫升PBS中的弓形虫包囊20个。感染两个月后，所有小鼠均被处死，分离小鼠大脑进行物理研磨，制备脑组织匀浆液。将脑组织匀浆液混均，取10微升于显微镜下计数三次取平均值，小鼠脑的包囊数为10倍的平均值。免疫小鼠的攻击实验表明：与对照组PBS或空载体组相比，重组基因疫苗免疫组的小鼠存活率明显提高，相较于SCI论文“ImmuneresponseinducedbyrecombinantMycobacteriumbovisBCGexpressingROP2geneofToxoplasmagondii”公开报道ROP2DNA疫苗的免疫保护效果(10％存活率)，小鼠的存活率显著提高。且脑中检测到包囊数量显著减少(P<0.01)(图5)。

综上所述，重组DNA疫苗pEGFP-C1-ROP19可以有效的诱导小鼠产生有效的体液和细胞免疫应答。基因疫苗免疫不仅可以成功地提升体液免疫和细胞免疫反应，提高小鼠生存率，而且有效的保护免疫小鼠对弓形虫包囊的攻击，减少免疫小鼠的大脑包囊形成的数量。该疫苗可作为控制弓形虫急性或慢性感染的有效的候选疫苗，用于人和动物弓形虫病的预防。

Claims (8)

1.一种预防人或动物弓形虫病的DNA疫苗，其特征是：将弓形虫棒状体蛋白19的基因插入真核表达载体pEGFP-C1中，构建重组质粒pEGFP-C1-ROP19，该重组质粒pEGFP-C1-ROP19即为弓形虫ROP19DNA疫苗。

2.如权利要求1所述的DNA疫苗，其特征是：所述弓形虫棒状体蛋白19的基因插入pEGFP-C1中BamHI和KpnI位点间。

3.一种预防人或动物弓形虫病的DNA疫苗的制备方法，其特征是：包括以下步骤：以弓形虫ROP19基因为DNA模板，通过聚合酶链反应扩增ROP基因片段，将其插入到真核表达载体pEGFP-C1中BamHI和KpnI位点间构建重组质粒pEGFP-C1-ROP19，提取含有目的基因的重组质粒，获得弓形虫ROP19DNA疫苗。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征是：PCR扩增采用的引物如下：上游引物：5′-CGGGGTACCATGAGAAGGCTGCTGCTTTC-3′，如SEQIDNO：1所示；下游引物：5′-CGGGATCCTCACTGAGATCTGGATGC-3′，如SEQIDNO：2所示。

5.如权利要求3所述的制备方法，其特征是：聚合酶链反应的条件为：95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min，共30个循环。

6.权利要求1或2所述的DNA疫苗在预防人或动物弓形虫病中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征是：所述DNA疫苗能控制宿主脑组织中包囊形成及抵抗弓形虫急性感染。

8.如权利要求6所述的应用，其特征是：所述弓形虫病中感染的弓形虫的种类包括RH株弓形虫和PRU株弓形虫。