TWI640625B - 體外快速切碎脂肪組織以分離活細胞之方法 - Google Patents

體外快速切碎脂肪組織以分離活細胞之方法 Download PDF

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孫立易
李典錕
馮清榮
張耀仁
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Abstract

本發明關於一種體外快速切碎脂肪組織以分離活細胞之方法，以解決習知以手持刀具切碎脂肪組織作為分離脂肪組織中活細胞之前置步驟，僅能分離出少量活細胞且具較低的細胞存活率之缺點。本發明之方法包括：提供一脂肪組織；利用一切割裝置將前述脂肪組織均質切碎；於前述已切碎之脂肪組織中加入一試劑進行水解；進一步離心分離；移除上清液，以獲取一細胞沉澱物。藉此，可縮短切碎脂肪組織之時間，且避免刀具重複使用造成汙染，並提高自每單位重量之脂肪組織獲得活細胞數，且不降低細胞存活率，作為分離脂肪組織活細胞之用途。

Description

體外快速切碎脂肪組織以分離活細胞之方法
本發明係有關於一種體外快速切碎脂肪組織以分離活細胞之方法，尤指一種利用一切割裝置將脂肪組織快速均質切碎，以利進一步自脂肪組織中分離出活細胞，以提高自每單位重量之脂肪組織獲得活細胞數，且不降低細胞存活率者。
按，間葉幹細胞的來源可自人體許多不同組織分離出來，例如由手術直接切除或經由抽脂手術取得的脂肪組織即為一幹細胞豐富的來源，可分離出脂肪幹細胞(Adipose tissue-derived stem cells,ADSCs)，其具有的優點有：取得方式侵入性低，對人體傷害小、且一次取得的量較多、可於體外增生培養等；加上脂肪幹細胞亦擁有可分化成硬骨、軟骨、肌肉以及脂肪細胞的潛力(Zuk et al.,2002)，因此，脂肪幹細胞被認為是最具研究發展潛力的幹細胞之一。
現今對於手術直接切除而得之塊狀脂肪組織切碎處理方式尚未有一套合適的自動化系統來搭配使用，而一般切碎處理方式有如中華民國專利201331366號一種「體外無血清成體幹細胞放大培養技術」，其方法中揭示 經手術切脂取得脂肪組織塊，並進一步利用手術刀具切碎該脂肪組織後與膠原蛋白酶酵素作用，再經分離可得基質血管層細胞(Stromal vascular fraction，SVF)，為基質細胞、血液細胞、血管內皮細胞與脂肪幹細胞等共同組合而成。惟，其利用手術刀具切碎脂肪組織的步驟，需要耗費較多時間才得以將脂肪組織盡可能的切碎，以獲取較多的基質血管層細胞；而操作切碎步驟的時間越長，對前述基質血管層細胞的存活率影響就越大，以至所獲取的脂肪間質幹細胞其存活率相對較低。此外，操作人員於操作不同來源檢體時較容易因重複使用手術刀具而產生檢體交叉汙染的風險。
另如中華民國專利201235471號「包含眼窩脂肪衍生之幹細胞(OFSC)之細胞群及彼等之分離與應用」，其方法中揭示由眼眶內腔直接移除的眼窩組織中收集而得，或由眼瞼內翻、眼瞼外翻、眼瞼下垂或眼袋之瞼造型手術所收集而得之眼窩脂肪，可簡易的使用剪刀或鑷子支解該眼窩脂肪組織再與膠原蛋白酶酵素作用，再進行過濾、離心分離以獲得細胞沉澱物，並將該細胞沉澱物進行細胞培養以獲得具有群落形成能力的細胞。惟，該案所揭示之方法同樣存在有使用剪刀或鑷子支解該眼窩脂肪組織，需要耗費較多時間才得以將脂肪組織盡可能的切碎，以獲取較多的細胞沉澱物；且相對地，其操作切碎步驟的時間越長，對前述細胞沉澱物中細胞的存活率之影響就越大。
綜合上述，為了解決上述習知利用手術刀具進行脂肪組織切碎作業所帶來的缺失，亟需要一可快速切碎脂肪組織以分離活細胞的方法，在不降低細胞存活率前提下，以進一步提高自每單位重量之脂肪組織取得活細胞數目。
今，本發明人有鑑於現有對於分離脂肪組織中活細胞之方法的缺失再予以研究，提供一種體外快速切碎脂肪組織以分離活細胞之方法，以期達到提高自每單位重量之脂肪組織取得活細胞數且不降低細胞存活率之目的。
爰此，本發明提供一種體外快速切碎脂肪組織以分離活細胞之方法，其包括下列步驟：步驟(a)提供一脂肪組織；步驟(b)將該脂肪組織置於一切割裝置之封閉容器中；步驟(c)使該切割裝置對該封閉容器施予一作用力，令該封閉容器中之一預設切削刀具對該脂肪組織執行快速均質切碎，獲得一均質化脂肪組織；步驟(d)於前述已切碎之該均質化脂肪組織中加入一試劑，進行水解反應；步驟(e)將前述經水解反應處理過之該均質化脂肪組織進行過濾、離心分離；步驟(f)將離心分離後之上清液移除，以獲取一細胞沉澱物。
進一步，於步驟(a)前可包含一以磷酸緩衝溶液(PBS)清洗前述脂肪組織之步驟。
進一步，前述步驟(a)中所述之脂肪組織係來自哺乳類動物外科手術切除而得來之塊狀脂肪組織。
進一步，前述哺乳類動物係人類。
進一步，前述步驟(b)中所述之切割裝置係一拋棄式之均質機。
進一步，前述拋棄式之均質機包含有一拋棄式封閉容器及一動力單元，且該拋棄式封閉容器內具有一切削刀具。
進一步，前述步驟(c)均質切碎條件為於15毫升(ml)體積之拋棄式封閉容器內置入1公克(g)至6公克脂肪組織，進行均質切碎。
進一步，前述步驟(c)均質切碎較佳條件為於15毫升體積之拋棄式 封閉容器內置入3公克脂肪組織，進行均質切碎。
進一步，前述動力單元之轉速為300每分鐘轉數(rpm)至3000每分鐘轉數，而作用時間為3分鐘至10分鐘。
進一步，前述動力單元之較佳轉速為600每分鐘轉數至1500每分鐘轉數，而最佳轉速為1200每分鐘轉數。
進一步，前述步驟(d)中所述之試劑係選自一胰蛋白酶(Trypsin)、一中性蛋白酶(Dispase)、一膠酶(Gelatase)、一玻尿酸酶(Hyaluronidase)、一第一型膠原蛋白酶(Collagenase type I)或一第四型膠原蛋白酶(Collagenase type IV)所構成群組之一或其組合。
進一步，本發明之方法係以該第一型膠原蛋白酶或該第四型膠原蛋白酶為實施例，且使用濃度為0.2毫克/毫升(mg/mL)至20毫克/毫升。
進一步，前述步驟(d)中所述之水解反應係全程置於一恆溫雜交反應烘箱中進行，且條件為溫度攝氏4度至45度、轉速為5每分鐘轉數至50每分鐘轉數以及時間0.5小時至24小時。
進一步，前述步驟(d)中所述之水解反應係全程置於一恆溫雜交反應烘箱中進行，較佳的條件為攝氏37度、轉速為15每分鐘轉數以及時間8小時。
進一步，前述步驟(e)中所述離心之條件為400×g，時間10分鐘。
進一步，前述步驟(e)更包含將過濾掉脂肪組織碎渣後所得一過濾液移入一離心管之步驟，以進行離心分離。
進一步，前述步驟(f)中所述之細胞沉澱物係一基質血管層細胞(SVF)。
進一步，前述步驟(f)之後更包括一步驟(g)將磷酸緩衝溶液加入前述細胞沉澱物中，清洗前述細胞沉澱物，再次離心以去除含有血水及前述試 劑之上清液，獲得一清洗後之細胞沉澱物。
進一步，前述步驟(g)之後更包括一步驟(h)將前述清洗後之細胞沉澱物置入一培養基中培養，以獲取一擴增之細胞。
進一步，前述擴增之細胞係實質未分化之一脂肪間質幹細胞。
進一步，前述脂肪間質幹細胞係屬至少表現細胞表面抗原CD90及CD105，且不表現CD45之細胞群。
進一步，前述培養基包含：一基礎培養基(Iscove`s modified Dulbecco`s medium,IMDM)、一血清添加物、一第二型纖維母細胞生長因子(Basic fibroblast growth factor,FGF-2)。
進一步，該血清添加物係一胎牛血清，且使用之體積百分濃度為百分之2至百分之10，而該第二型纖維母細胞生長因子使用濃度為1毫微克/毫升至20毫微克/毫升。
進一步，於前述步驟(h)之後包括一步驟(i)冷凍保存前述擴增之脂肪間質幹細胞，用於更進一步的應用。
進一步，於前述步驟(h)之後包括一步驟(i`)執行誘導分化前述擴增之脂肪間質幹細胞，以獲取自前述擴增之脂肪間質幹細胞所分化之細胞。
進一步，自前述擴增之脂肪間質幹細胞所分化之細胞，包括骨細胞、脂肪細胞或軟骨細胞之一。
本發明另提供一種細胞庫，係包含前述步驟(i)所冷凍保存之擴增之脂肪間質幹細胞。
本發明再提供一種醫藥組合物，其包含前述步驟(i`)所獲取自前述擴增之脂肪間質幹細胞所分化之細胞或前述實質未分化之脂肪間質幹細胞 之一或其組合。
本發明的功效在於：
(一)縮短切碎脂肪組織步驟所需時間：本發明藉由利用前述切割裝置可較習知以手術刀具執行切碎之方法更為縮短切碎脂肪組織步驟所需時間，且可降低操作人員間因技巧熟練差異所造成的影響，從而減低脂肪組織中細胞因離開人體時間過長所造成的細胞死亡現象，進而提高細胞存活率。
(二)提高活細胞收獲率：本發明藉由利用前述切割裝置將脂肪組織均質切碎，以增加脂肪組織與所添加之水解反應試劑的接觸面積增加，提高水解反應效果，以提高自每單位重量之脂肪組織取得基質血管層細胞之數目，並提高前述基質血管層細胞於進一步培養後，所得之脂肪間質幹細胞數目，且不降低細胞存活率。
(三)降低檢體交叉汙染：本發明係利用一拋棄式封閉容器以及一動力單元對所取得之塊狀脂肪組織檢體進行快速均質切碎步驟，不同來源之檢體各置入一拋棄式封閉容器中，可避免操作人員於操作不同來源檢體時因誤觸所造成的交叉汙染現象。
(四)獲取具有分化潛能的脂肪間質幹細胞：藉由本發明方法所獲取之脂肪間質幹細胞係屬至少表現細胞表面抗原CD90及CD105，且不表現CD45之細胞群，且具有分化為硬骨、軟骨及脂肪之能力，使經本發明方法所獲取之脂肪間質幹細胞為具有分化潛能的多潛能幹細胞之豐富來源。
(a)‧‧‧提供一脂肪組織
(b)‧‧‧將該脂肪組織置於一切割裝置之封閉容器中
(c)‧‧‧使該切割裝置對該封閉容器施予一作用力，令該封閉容器中之一預設切 削刀具對該脂肪組織執行快速均質切碎，獲得一均質化脂肪組織
(d)‧‧‧於前述已切碎之該均質化脂肪組織中加入一試劑，進行水解反應
(e)‧‧‧將前述經水解反應處理過之該均質化脂肪組織進行過濾、離心分離
(f)‧‧‧將離心分離後之上清液移除，以獲取一細胞沉澱物
(g)‧‧‧將磷酸緩衝溶液加入前述細胞沉澱物中，清洗前述細胞沉澱物，再次離心以去除含有血水及前述試劑之上清液，獲得一清洗後之細胞沉澱物
(h)‧‧‧將前述清洗後之細胞沉澱物置入一培養基中培養，以獲取一擴增之細胞
(i)‧‧‧冷凍保存前述擴增之細胞
(i‵)‧‧‧誘導分化前述擴增之細胞，以獲取一自前述擴增之細胞所分化的細胞
(1)‧‧‧脂肪組織
(1A)‧‧‧均質化脂肪組織
(2)‧‧‧均質機
(21)‧‧‧拋棄式封閉容器
(211)‧‧‧切削刀具
(22)‧‧‧動力單元
[第一圖]係為本發明之方法流程圖。
[第二A圖]係為本發明中其一捐贈者之不同脂肪組織公克數可得基質血管層細胞數目比較圖。
[第二B圖]係說明本發明中其一捐贈者之不同脂肪組織公克數所得基質血管層細胞之存活率比較圖。
[第二C圖]係為本發明中其二捐贈者之不同脂肪組織公克數可得基質血管層細胞數目比較圖。
[第二D圖]係說明本發明中其二捐贈者之不同脂肪組織公克數所得基質血管層細胞之存活率比較圖。
[第三A圖]係為本發明中經外科手術剪刀處理與均質機不同轉速條件下處理脂肪組織可得基質血管層細胞數目比較圖。
[第三B圖]係為本發明中經外科手術剪刀處理與均質機不同轉速條件下處理脂肪組織所得基質血管層細胞之存活率比較圖。
[第四A圖]係為本發明中9個捐贈者之脂肪組織以均質機切碎相對手術剪刀之可獲基質血管層細胞之總細胞得率比值比較圖。
[第四B圖]係為本發明中9個捐贈者之脂肪組織以均質機切碎相對手術剪刀之可獲基質血管層細胞之存活率比值比較圖。
[第五A圖]係為本發明中9個捐贈者之脂肪組織以均質機切碎相對手術剪刀之可獲脂肪間質幹細胞之總細胞得率比值比較圖。
[第五B圖]係為本發明中9個捐贈者之脂肪組織以均質機切碎相對手術剪刀之可獲脂肪間質幹細胞之存活率比值比較圖。
[第六A圖]係為本發明中捐贈者身體質量指數與每公克脂肪組織之基質血管層細 胞分得率(細胞/公克)關係圖。
[第六B圖]係為本發明中捐贈者身體質量指數與每公克脂肪組織之脂肪間質幹細胞分得率(細胞/公克)關係圖。
[第七A圖]係為本發明中脂肪間質幹細胞經誘導分化為硬骨細胞後，經鹼性磷酸酶染色結果圖。
[第七B圖]係為本發明中脂肪間質幹細胞經誘導分化為硬骨細胞後，經馮庫薩染色結果圖。
[第七C圖]係為本發明中脂肪間質幹細胞經誘導分化為軟骨細胞後，經阿爾辛藍染色結果圖。
[第七D圖]係為本發明中脂肪間質幹細胞經誘導分化為脂肪細胞後，經油紅O染色結果圖。
[第八圖]係為本發明中步驟(b)及(c)之操作示意圖。
為了讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，並配合所附圖示，作詳細說明如下：首先，請參第一圖，係本發明方法之流程圖，本發明係提供一種體外快速切碎脂肪組織以分離活細胞之方法，其包括下列步驟：步驟(a)提供一脂肪組織，其係來自哺乳類動物外科手術切除而得來之塊狀脂肪組織，而本發明係以來自人類外科手術切除而得來之塊狀脂肪組織為實施例；步驟(b)將該脂肪組織(1)置於一拋棄式之均質機(2)之拋棄式封閉容器(21)中之步驟，該均質機(2)(DT-20 gamma,IKA ULTRA TURRAX Tube drive)包含有一15毫升容積之拋棄式封閉容器(21)及一動力單元(22)，且該拋棄式封閉容器(21)內具有一切削 刀具(211)(參第八圖)；步驟(c)使該動力單元(22)對該拋棄式封閉容器(21)施予一作用力，令該拋棄式封閉容器(21)中之切削刀具(211)對該脂肪組織(1)執行快速均質切碎，獲得一均質化脂肪組織(1A)(參第八圖)，本發明係將1公克至6公克脂肪組織(1)置入該拋棄式封閉容器(21)內，進行均質切碎，而較佳實施例為將3公克脂肪組織(1)置入該拋棄式封閉容器(21)內，進行均質切碎。較佳的是，前述動力單元(22)之轉速為300每分鐘轉數至3000每分鐘轉數，而作用時間為3分鐘至10分鐘；而較佳轉速為600每分鐘轉數至1500每分鐘轉數，最佳轉速為1200每分鐘轉數；步驟(d)於前述已切碎之該均質化脂肪組織(1A)中加入一試劑，進行水解反應，其中該試劑係選自一胰蛋白酶、一中性蛋白酶、一膠酶、一玻尿酸酶、一第一型膠原蛋白酶或一第四型膠原蛋白酶所構成群組之一或其組合；較佳的是，本發明係以該第一型膠原蛋白酶或該第四型膠原蛋白酶(Worthington Biochemical Corporation)為實施例，且使用濃度為0.2毫克/毫升至20毫克/毫升；較佳的是，前述水解反應係全程置於一恆溫雜交反應烘箱(MO-01,Double Eagle Enterprise)中進行，且條件為溫度攝氏4度至45度、轉速為5每分鐘轉數至50每分鐘轉數以及時間0.5小時至24小時，而最佳條件為溫度攝氏37度、轉速為15每分鐘轉數以及時間8小時。步驟(e)將前述經水解反應處理過之脂肪組織先過濾掉脂肪組織碎渣以獲得一過濾液，其中前述過濾方式可以任何技術領域中已知的方式(例如濾膜或濾網)進行以獲得前述過濾液；再將該過濾液移入一50毫升體積之離心管進行離心分離，而前述離心之條件為400×g，時間10分鐘；及步驟(f)將分離後之上清液移除，以獲取一細胞沉澱物，該細胞沉澱物係一基質血管層細胞，其係由一基質細胞、一血液細胞、一血管內皮細胞與一脂肪間質幹細胞所組成。
較佳的是，前述步驟(f)之後更包括一步驟(g)將磷酸緩衝溶液加入前述細胞沉澱物中，清洗前述細胞沉澱物，再次離心以去除含有血水及前述試劑之上清液，獲得一清洗後之細胞沉澱物。較佳的是，前述步驟(g)之後更包括一步驟(h)將前述清洗後之細胞沉澱物置入一培養基中培養，以獲取擴增之實質未分化之一脂肪間質幹細胞。較佳的是，前述脂肪間質幹細胞係屬細胞表面抗原CD45-、CD90+及CD105+之細胞群。較佳的是，前述培養基包含：一基礎培養基(IMDM)、一血清添加物、一第二型纖維母細胞生長因子；其中，該血清添加物係一胎牛血清，且使用之體積百分濃度為百分之2至百分之10，而該第二型纖維母細胞生長因子使用濃度為1毫微克/毫升至20毫微克/毫升，較佳為10毫微克/毫升。
較佳的是，於前述步驟(h)之後包括一步驟(i)冷凍保存前述擴增之脂肪間質幹細胞，用於更進一步的應用，例如臨床醫學研究、再生醫學研究或細胞組織工程的發展。較佳的是，亦可於前述步驟(h)之後包括一步驟(i`)執行誘導分化前述擴增之脂肪間質幹細胞，以獲取自前述擴增之脂肪間質幹細胞所分化之細胞，而前述分化之細胞包含有骨細胞、脂肪細胞或軟骨細胞之一。
本發明同時提供一種細胞庫，係包含前述步驟(i)所冷凍保存之擴增之脂肪間質幹細胞。
較佳的是，此處所使用的「冷凍保存」一詞通常是指將細胞加入冷凍保護劑如二甲亞碸(DMSO)或是甘油後冷卻至零下的溫度保存的方法，例如為負80℃或是負196℃(液態氮的沸點)。冷凍保存可如熟知此技藝之人士所進行的方法與流程，惟非本發明訴求重點因此不予贅述(參閱1997年HummaPress公司所出版第2版Pollard，J.W.與Walker，J.M.．所著基礎細胞培養流程；2000年Wiley-Liss公司所出版第4版Freshney,R.I.，所著動物細胞的培養)。
本發明再提供一種醫藥組合物，其包含前述步驟(i`)所獲自前述擴增之脂肪間質幹細胞所分化之細胞或前述實質未分化之脂肪間質幹細胞之一或其組合。
較佳的是，前述醫藥組合物包含前述脂肪間質幹細胞、自前述脂肪間質幹細胞所分化之細胞、前述脂肪間質幹細胞所分泌之一細胞分泌物或是前述脂肪間質幹細胞之一細胞萃取物之一或其組合與合適的治療上可接受之一載體/賦形劑。較佳的是，熟知本項技術領域之技藝人士者皆知，原則上任何經由研究報導指出適合由人類間質幹細胞所治療的狀況或是疾病，皆可由本發明的醫藥組合物所治療。其中像是幹細胞移植係可有效的作為特定治療用途；例如，生成造血族系的幹細胞可用於代替骨髓中的造血系統；生成間質族系的幹細胞可用於修復肌肉骨骼疾病；幹細胞分化為上皮族系者可用於修復表面損傷；幹細胞分化為神經細胞族系者可用於治療神經退化性疾病。
較佳的是，本發明之方法所獲取之脂肪間質幹細胞係屬至少表現細胞表面抗原CD90及CD105，且不表現CD45之細胞群，且同時具有分化為硬骨、軟骨及脂肪之潛能，使經本發明方法所獲取之脂肪間質幹細胞為具有分化潛能的多潛能幹細胞之豐富來源，且同時具有細胞治療潛在的臨床應用性。因此，本發明之方法所獲取之脂肪間質幹細胞可應用於細胞治療、再生醫學及細胞組織工程上，例如治療退化性疾病、修復組織損傷、器官再生或組織再生。
本發明之實施例係以取自人類外科手術切除而得來之塊狀脂肪組織的實施例予以示範闡明，但本發明不受下述實施例所限制。
「實驗一」分離脂肪組織中基質血管層細胞
1.每公克脂肪組織可得基質血管層細胞之細胞數及細胞存活率
本實驗係於佛教慈濟綜合醫院所屬通過ISO14644 Class 7認證的基因與幹細胞再生實驗室內進行，且本實驗操作人員之訓練係依循人體細胞組織優良操作規範(GTP)進行。本發明搜集來自敏盛醫院11位剖腹產捐贈者之腹部皮下脂肪組織塊檢體，重量各約30公克，且本發明所搜集之檢體係通過敏盛醫院內部審查委員會批准進行。先以其中兩位捐贈者之檢體進行本實驗，其一捐贈者之檢體重量分為1公克、2公克、3公克、4公克、5公克及6公克等六組，而其二捐贈者之檢體重量分為1公克、2公克、3公克、4公克、5公克等五組，進行分離，其分離步驟如前所述般，不再贅述，而細胞存活率測定部分係將各別所得之基質血管層細胞以一碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染色後，經一自動細胞計數儀(Adam-MC,NanoEnTek)來計算各組所分離出的基質血管層細胞數；另基質血管層細胞之細胞數測定係先以一細胞膜溶解緩衝溶液將細胞膜打破，再以碘化丙啶染細胞核之DNA，藉此以避免該基質血管層細胞所包含的紅血球細胞影響該基質血管層細胞數目的計數，以獲得較精確之細胞數目測定值。
1.1 實驗結果
本實驗數據經微軟Excel軟體t測試(t-test)統計分析，以p<0.05為顯著水準，並將結果量化為統計圖。請先參閱第二A圖，係前述其一捐贈者之不同脂肪組織公克數可得基質血管層細胞數目比較圖，由結果發現，取3公克脂肪組織置入前述15毫升體積的拋棄式封閉容器中進行均質切碎的那組，其每公克脂肪組織可得基質血管層細胞之細胞數目超過2.5×105個，為最高的一組；續參第二B圖，係前述其一捐贈者之不同脂肪組織公克數所得基質血管層細胞存活率比較圖，由結果可發現，取3公克脂肪組織置入前述15毫升體積的拋棄式封閉容器中進行均質切碎的那組，其細胞存活率超過百分之80，為較高的一 組。另參第二C圖，係前述其二捐贈者之不同脂肪組織公克數可得基質血管層細胞數目比較圖，由結果可發現，同樣取3公克脂肪組織置入前述15毫升體積的拋棄式封閉容器中進行均質切碎的那組，其每公克脂肪組織可得基質血管層細胞之細胞數目超過7.0×104個，為最高的一組；續參第二D圖，係前述其二捐贈者之不同脂肪組織公克數所得基質血管層細胞存活率比較圖，由結果可發現，取3公克脂肪組織置入前述15毫升體積的拋棄式封閉容器中進行均質切碎的那組，其細胞存活率約百分之90，為較高的一組。藉由上述實驗得知，取3公克脂肪組織塊置入前述15毫升體積的拋棄式封閉容器中進行均質切碎為較佳條件，可於每公克脂肪組織獲得該基質血管層細胞之較佳細胞數目及較佳細胞存活率。
2.外科手術刀具與本發明中拋棄式之均質機不同轉速條件對細胞數目及細胞存活率之影響比較
本實驗係取前述其一捐贈者之脂肪組織塊，並分為外科手術剪刀組、轉速400組、轉速600組、轉速1200組及轉速1500組等五組，進行脂肪組織的均質切碎步驟，以利後續該基質血管層細胞的分離，而後續分離步驟與前述方法相同；且本實驗之細胞存活率測定方法與基質血管層細胞之細胞數測定方法皆與前述實驗相同，不再贅述。
2.1 實驗結果
本實驗數據經微軟Excel軟體t測試(t-test)統計分析，以p<0.05為顯著水準，並將結果量化為統計圖。參第三A圖所示，係外科手術剪刀處理與該均質機不同轉速條件下處理脂肪組織可得基質血管層細胞數目比較圖。由結果可知，在該均質機轉速1200那組，獲得約1.2×106個細胞數目，為最高的一 組，遠超過該外科手術剪刀組所能獲得的細胞數目。續參第三B圖，係外科手術剪刀處理與該均質機不同轉速條件下處理脂肪組織所得基質血管層細胞之存活率比較圖。由結果可知，在該均質機轉速1200那組，其所獲得基質血管層細胞之存活率約為百分之80，為較高的一組，而該外科手術剪刀組所獲得基質血管層細胞之存活率卻不到百分之70。藉由上述實驗結果可知，藉由本發明方法中以該均質機取代習知手術刀具進行脂肪組織塊的均質切碎作業，不僅可以提高所獲得基質血管層細胞之細胞數目，且又不會降低該基質血管層細胞之細胞存活率。
3.拋棄式之均質機處理相對手術剪刀處理下，所得基質血管層細胞之總細胞得率比值與存活率比值比較
本實驗係利用前述9個捐贈者的腹部皮下塊狀脂肪組織檢體，各分為手術剪刀組與均質機轉速1200組等兩組，各組取3公克脂肪組織塊進行均質切碎作業，以利後續該基質血管層細胞的分離，而後續分離步驟與前所述方法相同。本實驗之細胞存活率測定方法與基質血管層細胞之細胞數測定方法皆與前述實驗相同，不再贅述；惟，將所得結果轉換為均質機/手術剪刀之比值(倍)方式呈現。
3.1 實驗結果
本實驗數據經微軟Excel軟體t測試(t-test)統計分析，以p<0.05為顯著水準，並將結果量化為統計圖。參第四A圖，係本發明中9個捐贈者之脂肪組織以該均質機切碎相對手術剪刀之可獲基質血管層細胞之總細胞得率比值(倍)比較圖。由結果可發現，在前述9個捐贈者之脂肪組織以本發明方法中該均質機切碎相對手術剪刀之可獲基質血管層細胞之總細胞得率比值(倍)介於1.3倍至10.2倍間，比值大小因個體而異。續參第四B圖，係本發明中9個捐贈 者之脂肪組織以該均質機切碎相對手術剪刀之所獲基質血管層細胞之細胞存活率比值(倍)比較圖。由結果可發現，在前述9個捐贈者之脂肪組織以本發明方法中該均質機切碎相對手術剪刀之所獲基質血管層細胞之細胞存活率比值(倍)介於0.9倍至2.3倍間，比值大小因個體而異。由此可知，本發明之方法中以該均質機取代習知手術刀具進行脂肪組織塊的均質切碎作業，不僅可以提高所獲得基質血管層細胞之細胞數目，且又不會降低該基質血管層細胞之細胞存活率。
4.拋棄式之均質機處理相對手術剪刀處理下，所得脂肪間質幹細胞之總細胞得率比值與存活率比值比較
本實驗之分組方式與前述「實驗一」之3.相同，且進一步將各組所得之基質血管層細胞培養於一培養基中5天，以獲取脂肪間質幹細胞，並分析均質機處理相對手術剪刀處理下，對所得脂肪間質幹細胞之總細胞得率與存活率的影響。前述培養基包含有：一胎牛血清添加物(GIBCO-Invitrogen)、一第二型纖維母細胞生長因子(FGF-2,R&D Systems)之基礎培養基(IMDM,GIBCO-Invitrogen)中；其中，該胎牛血清添加物使用之體積百分濃度為百分之2至百分之10，該第二型纖維母細胞生長因子使用濃度為10毫微克/毫升。每組的基質血管層細胞以每平方公分10000顆細胞(cells/cm2)的細胞密度培養於細胞培養盤中(Becton Dickinson)，且所有細胞皆培養於攝氏37度、百分之5二氧化碳分壓及百分之95濕度環境下之培養箱(Forma Series II Model 3110,Thermo)，並每3天更換一次培養基。將培養5天後各組脂肪間質幹細胞以磷酸鹽緩衝溶液(PBS)清洗過一次後，以胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA,GIBCO-Invitrogen)溶液於攝氏37度作用5分鐘後再以細胞刮勺小心移除未被作用完全的細胞，加入等比例含胎牛血清之培養基中和胰蛋白酶的酵素作用活性。 細胞存活率之測定係以一細胞計數機(Vi-CELL AS,Beckman Coulter)計算。存活的細胞以0.4%台盼藍(Trypan-blue,GIBCO-Invitrogen)來與死細胞作區別，計算時判定活的間質幹細胞的參數設定為：100images，大小10至30微米，75%現場亮度，5%現場區域。另各組之脂肪間質幹細胞分得率係利用倍增時間(DT)的公式來進行計算，DT=t/(3.32[log10Nt-log10N0])，其中Nt指細胞最後密度，而N0指細胞起始密度。本實驗同樣將所得結果轉換為均質機/手術剪刀之比值(倍)方式呈現。
4.1 實驗結果
本實驗數據經微軟Excel軟體t測試(t-test)統計分析，以p<0.05為顯著水準，並將結果量化為統計圖。參第五A圖，係本發明中9個捐贈者之脂肪組織以該均質機切碎相對手術剪刀之可獲脂肪間質幹細胞之總細胞得率比值比較圖。由結果顯示可知，在前述9個捐贈者之脂肪組織以本發明方法中該均質機切碎相對手術剪刀之可獲脂肪間質幹細胞之總細胞得率比值(倍)介於1.2倍至7.8倍間，比值大小因個體而異。續參第五B圖，係本發明中9個捐贈者之脂肪組織以該均質機切碎相對手術剪刀之所獲脂肪間質幹細胞之細胞存活率比值(倍)比較圖。由結果可發現，在前述9個捐贈者之脂肪組織以本發明方法中該均質機切碎相對手術剪刀之所獲脂肪間質幹細胞之細胞存活率比值(倍)介於0.8倍至10.5倍間，比值大小因個體而異。由此可知，本發明之方法中以該均質機取代習知手術刀具進行脂肪組織塊的均質切碎作業，不僅可以提高所獲得脂肪間質幹細胞之細胞數目，且又不會降低該脂肪間質幹細胞之細胞存活率。
5.捐贈者之身高體重指數(BMI)與每公克脂肪組織中基質血管層細 胞及脂肪間質幹細胞之分得率關係
本實驗針對前述9個捐贈者之身高體重指數與前述拋棄式之均質機處理及習知外科手術剪刀處理所得實驗結果結合，以進一步分析身高體重指數與每公克脂肪組織中基質血管層細胞及脂肪間質幹細胞之分得率關係。
5.1 實驗結果
參第六A圖，係本發明中9位捐贈者身高體重指數與每公克脂肪組織之基質血管層細胞分得率(細胞/公克)關係圖。圖中本發明中拋棄式之均質機組的各點，經回歸計算出一R2為0.0794之趨勢虛線，而該外科手術剪刀組的各點，經回歸計算出一R2為0.0155之趨勢實線，由此可看出，本發明之方法相較外科手術剪刀組在捐贈者身高體重指數相對較低時，可以自每公克脂肪組織中獲取較多的基質血管層細胞。續參第六B圖，係本發明中9位捐贈者身高體重指數與每公克脂肪組織之脂肪間質幹細胞分得率(細胞/公克)關係圖。圖中本發明中該拋棄式之均質機組的各點，經回歸計算出一R2為0.3262之趨勢虛線，而該外科手術剪刀組的各點，經回歸計算出一R2為0.2146之趨勢實線，由此可看出，本發明之方法相較外科手術剪刀組在捐贈者身高體重指數相對較高時，可以自每公克脂肪組織中獲取較多的脂肪間質幹細胞。
「實驗二」經本發明方法所獲得之脂肪間質幹細胞之分析與應用
1.典型間葉幹細胞之細胞表面抗原分析
本實驗係以流式細胞儀(FACSCalibur,Becton Dickinson)進行細胞表面抗原之測定。將經本發明方法所獲得之脂肪間質幹細胞繼代培養後，以胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)溶液於攝氏37度作用5分鐘去附著，並以磷酸緩衝液清洗回收後離心，移除上清液以獲得一細胞沉澱物，再回溶於適量之磷 酸緩衝液中，分別對不同的抗原以相對應的免疫螢光一級抗體進行染色，包括CD13、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、β2微球蛋白(B2M)以及HLA-DR等抗體(Becton Dickinson)。避光於室溫下染色15分鐘後，加入適量磷酸緩衝液後上機分析，經流式細胞儀收集數據後，以流式細胞儀分析軟體(FACSCalibur,Becton Dickinson)進行分析。其中負控制組係為省略上述一級抗體之染色步驟者。
1.1 實驗結果
參下列表一，由結果可以發現經本發明方法所獲得之脂肪間質幹細胞，其細胞族群為CD13+、CD34-、CD44+、CD45-、CD73+、CD90+、CD105+，為類似間質幹細胞的細胞族群，亦即表示說，經本發明方法所獲得之脂肪間質幹細胞仍保有類似間質幹細胞的表面抗原特徵。
2.脂肪間質幹細胞之分化
文獻報導指出，脂肪間質幹細胞具有分化成中胚層細胞的能力， 像是脂肪和骨頭細胞。本實驗係將脂肪間質幹細胞經適當誘導分化培養後，使其分化成硬骨細胞、軟骨細胞及脂肪細胞，以確認經本發明方法所獲得之脂肪間質幹細胞，是否仍具有幹細胞多功能性分化能力。本發明中的誘導分化實驗係依據習知文獻中已被普遍使用的幹細胞誘導分化系統(Kanda et al.,2011；Song et al.,2010)，因非本案訴求重點因此不予贅述，其主要目的係於確認經本發明方法所獲得之脂肪間質幹細胞，是否仍具有幹細胞多功能性分化能力。分化之硬骨細胞以鹼性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)進行染色，該鹼性磷酸酶為成熟骨母細胞分化的重要指標，而其染色方法係依照習知染色技術進行(Yoshimura et al.,2011)，在此不再贅述；另再進行一習知的馮庫薩(Von-kossa)染色，以確認有磷酸鈣之存在。分化之軟骨細胞係以阿爾辛藍染色法(Alcian blue)來確認軟骨組織中擁有的蛋白多醣(Proteoglycan)之存在(Song et al.,2010)。分化之脂肪細胞以油紅O染色(Oil red O staining)，以確認是否有脂質空泡(Lipid vacuoles)的存在(Kanda et al.,2011)。
2.1 實驗結果
參第七A圖，係鹼性磷酸酶染色結果，比例尺為500微米(μm)，經本發明方法所獲得之脂肪間質幹細胞，經誘導分化為硬骨細胞，經鹼性磷酸酶染色後，有呈現黑色結晶的部分，亦即代表鹼性磷酸酶的存在；續參第七B圖，係馮庫薩(Von-kossa)染色結果，比例尺為500微米，可發現呈現有黑色或茶褐色的磷酸鈣結晶，再次說明了經本發明方法所獲得之脂肪間質幹細胞具有分化為硬骨細胞之能力。再參第七C圖，係阿爾辛藍染色結果，比例尺為500微米，可發現呈現出藍色的蛋白多醣染色結果，代表經本發明方法所獲得之脂肪間質幹細胞具有分化為軟骨細胞之能力。續參第七D圖，係油紅O染色 結果，比例尺為500微米，可發現有呈現出紅色的脂質空泡染色結果，亦即代表經本發明方法所獲得之脂肪間質幹細胞具有分化為脂肪細胞之能力。經由上述分化結果可得知，經本發明方法所獲得之脂肪間質幹細胞確實具有幹細胞多功能性分化能力。
綜合上述實驗結果可知，本發明之方法中以一拋棄式之均質機取代習知手術刀具進行脂肪組織塊的均質切碎作業，不僅可以提高所獲得脂肪間質幹細胞之細胞數目，且又不會降低該脂肪間質幹細胞之細胞存活率。另經本發明方法所獲得之脂肪間質幹細胞確實具有間質幹細胞之細胞表面抗原特徵以及多功能性分化能力，令本發明方法所獲得之脂肪間質幹細胞為具有分化潛能的多潛能幹細胞之豐富來源，且同時具有細胞治療潛在的臨床應用可能性。藉此可進一步將前述脂肪間質幹細胞做為製備醫藥組成物之用，以應用於細胞治療、再生醫學及細胞組織工程上，例如治療退化性疾病、修復組織損傷、器官再生及組織再生；亦或冷凍保存前述脂肪間質幹細胞並建立一細胞庫以為後續應用，例如臨床醫學研究、再生醫學研究或細胞組織工程的發展。
雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

Claims (26)

  1. 一種體外快速切碎脂肪組織以分離活細胞之方法，其包括有下列步驟：步驟(a)提供一脂肪組織；步驟(b)將該脂肪組織置於一切割裝置之封閉容器中，其中所述之切割裝置係一拋棄式之均質機，其中前述拋棄式之均質機包含有一動力單元；步驟(c)使該切割裝置之動力單元對該封閉容器施予一作用力，令該封閉容器中之一預設切削刀具對該脂肪組織執行快速均質切碎，獲得一均質化脂肪組織，其中該動力單元之轉速為600每分鐘轉數至1500每分鐘轉數；步驟(d)於前述已切碎之該均質化脂肪組織中加入一試劑，進行水解反應；步驟(e)將前述經水解反應處理過之該均質化脂肪組織進行過濾、離心分離；及步驟(f)將離心分離後之上清液移除，以獲取一細胞沉澱物。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之體外快速切碎脂肪組織以分離活細胞之方法，其中於步驟(a)前可包含一以磷酸緩衝溶液清洗前述脂肪組織之步驟。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之體外快速切碎脂肪組織以分離活細胞之方法，其中前述步驟(a)中所述之脂肪組織係來自哺乳類動物外科手術切除而得來之塊狀脂肪組織。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之體外快速切碎脂肪組織以分離活細胞之方法，其中前述哺乳類動物係人類。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之體外快速切碎脂肪組織以分離活細胞之方法，其中前述拋棄式之均質機包含有一拋棄式封閉容器，且該拋棄式封閉容器內具有一切削刀具。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之體外快速切碎脂肪組織以分離活細胞之方法，其中步驟(c)均質切碎條件為於15毫升體積之拋棄式封閉容器內置入1公克(g)至6公克脂肪組織，進行快速均質切碎。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之體外快速切碎脂肪組織以分離活細胞之方法，其中步驟(c)均質切碎較佳條件為於15毫升體積之拋棄式封閉容器內置入3公克脂肪組織，進行快速均質切碎。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之體外快速切碎脂肪組織以分離活細胞之方法，其中該動力單元作用時間為3分鐘至10分鐘。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之體外快速切碎脂肪組織以分離活細胞之方法，其中前述步驟(d)中所述之試劑係選自一胰蛋白酶(Trypsin)、一中性蛋白酶(Dispase)、一膠酶(Gelatase)、一玻尿酸酶(Hyaluronidase)、一第一型膠原蛋白酶(Collagenase type I)或一第四型膠原蛋白酶(Collagenase type IV)所構成群組之一或其組合。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之體外快速切碎脂肪組織以分離活細胞之方法，其中前述步驟(d)中所述之水解反應係全程置於一恆溫雜交反應烘箱中進行，且條件為攝氏4度至45度、轉速為5每分鐘轉數至50每分鐘轉數，以及時間0.5小時至24小時。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之體外快速切碎脂肪組織以分離活細胞之方法，其中較佳的條件為攝氏37度、轉速為15每分鐘轉數以及時間8小時。
  12. 如申請專利範圍第1項所述之體外快速切碎脂肪組織以分離活細胞之方法，其中前述步驟(e)中所述離心之條件為400×g、時間10分鐘。
  13. 如申請專利範圍第1項所述之體外快速切碎脂肪組織以分離活細胞之方法，其中前述步驟(e)更包含將過濾掉脂肪組織碎渣後所得一過濾液移入一離心管之步驟，以進行離心分離。
  14. 如申請專利範圍第1項所述之體外快速切碎脂肪組織以分離活細胞之方法，其中前述步驟(f)中所述之細胞沉澱物係一基質血管層細胞(Stromal Vascular Fraction,SVF)。
  15. 如申請專利範圍第1項所述之體外快速切碎脂肪組織以分離活細胞之方法，其中前述步驟(f)之後更包括一步驟(g)將磷酸緩衝溶液加入前述細胞沉澱物中，清洗前述細胞沉澱物，再次離心以去除含有血水及前述試劑之上清液，獲得一清洗後之細胞沉澱物。
  16. 如申請專利範圍第15項所述之體外快速切碎脂肪組織以分離活細胞之方法，其中前述步驟(g)之後更包括一步驟(h)將前述清洗後之細胞沉澱物置入一培養基中培養，以獲取一擴增之細胞。
  17. 如申請專利範圍第16項所述之體外快速切碎脂肪組織以分離活細胞之方法，其中所述擴增之細胞係實質未分化之一脂肪間質幹細胞。
  18. 如申請專利範圍第17項所述之體外快速切碎脂肪組織以分離活細胞之方法，其中所述之脂肪間質幹細胞係至少表現細胞表面抗原CD90或CD105或其組合，且不表現CD45之細胞群。
  19. 如申請專利範圍第18項所述之體外快速切碎脂肪組織以分離活細胞之方法，其中所述之脂肪間質幹細胞係應用於細胞治療、再生醫學或細胞組織工程之一或其組合。
  20. 如申請專利範圍第16項所述之體外快速切碎脂肪組織以分離活細胞之方法，其中所述培養基包含：一基礎培養基(IMDM)、一血清添加物、一第二型纖維母細胞生長因子(FGF-2)。
  21. 如申請專利範圍第20項所述之體外快速切碎脂肪組織以分離活細胞之方法，其中該血清添加物係一胎牛血清，且使用之體積百分濃度為百分之2至百分之10，而該第二型纖維母細胞生長因子使用濃度為1毫微克/毫升至20毫微克/毫升。
  22. 如申請專利範圍第17項所述之體外快速切碎脂肪組織以分離活細胞之方法，其中於前述步驟(h)之後包括一步驟(i)冷凍保存前述擴增之脂肪間質幹細胞，用於更進一步的應用。
  23. 如申請專利範圍第17項所述之體外快速切碎脂肪組織以分離活細胞之方法，其中於前述步驟(h)之後包括一步驟(i`)執行誘導分化前述擴增之脂肪間質幹細胞，以獲取一自前述擴增之脂肪間質幹細胞所分化的細胞。
  24. 如申請專利範圍第23項所述之體外快速切碎脂肪組織以分離活細胞之方法，其中自前述擴增之脂肪間質幹細胞所分化的細胞，包括骨細胞、脂肪細胞或軟骨細胞之一。
  25. 如申請專利範圍第22項所述之體外快速切碎脂肪組織以分離活細胞之方法，其中於前述步驟(i)之後包括一步驟(j)建立包含前述冷凍保存之擴增的脂肪間質幹細胞之細胞庫。
  26. 如申請專利範圍第23項所述之體外快速切碎脂肪組織以分離活細胞之方法，進一步包括一步驟(i``)製備包含前述脂肪間質幹細胞所分化的細胞或前述實質未分化之脂肪間質幹細胞之一或其組合的用於細胞治療的醫藥組合物。
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