JP2022529617A - 骨髄の抽出および凍結保存のためのシステムおよび方法 - Google Patents

Abstract

【解決手段】死亡したドナーから取得された骨から骨髄細胞を抽出し、その骨髄を凍結保存のために調製し、そして凍結保存された新規の骨髄から望ましい細胞を取得するための方法が、提供される。【選択図】図７

Description

本出願は、２０２０年１月６日に出願された同時係属の実用特許出願第１６／７３４，７１３号、２０１９年４月１５日に出願され”Ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ ａｎｄ Ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｕｓｅ”と題された米国仮特許出願第６２／８３４，０８７号、および２０１９年１１月２１日に出願された”Ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ”と題された同時係属の米国仮特許出願第６２／９３８，４８０号の優先権を主張する。３出願全ての開示全体は、引用によって明確に本明細書に組み込まれる。

臨床目的の骨髄は、現在、ＨＡＬ適合の兄弟姉妹、または最適一致の非血縁者ドナーから採取されている。他の移植片ソースも現在使用されており、不適合でハプロタイプ一致の血縁者ドナーまたは非血縁者ドナー、および臍帯血（ＣＢ）を含む。特定の疾患を有する患者への移植時には、ドナーの骨髄中の造血幹細胞（ＨＳＣ）は、患者に生着し、そして免疫系と造血系とを再構成する。

骨髄はまた、間葉系間質細胞／幹細胞（ＭＳＣ）の良いソースであり、当該間葉系間質細胞／幹細胞（ＭＳＣ）は、脂肪細胞、骨細胞、および軟骨細胞などの中胚葉起源の細胞型に分化する多系統の可能性を備えた、自己再生する多能性前駆細胞である。加えて、ＭＳＣは、炎症の部位へ移動し、そして、自然免疫系と適応免疫系の両方に関連するリンパ球間の相互作用を通して、強力な免疫抑制効果と抗炎症効果とを発揮する。

現在、骨髄は、一般に、トロカール針で皮質骨に作られた穴を通して、そしてその時に、骨髄吸引針と注射器とを使用して骨髄を注射器に引き込んで、収集される。複数の注射器が、通常、骨から骨髄の全てを抽出するのに必要である。その後、注射器は滅菌野から取り出され、そして各注射器は抗凝血薬を含む収集袋に接続され、そして骨髄は袋に押し込まれる。この工程は、一般に両方の骨盤骨で多数回繰り返され、そして結果的に吸引液の汚染を引き起こし得る。

死亡ドナーからのバンクされた骨髄（ＢＭ）全体も、ＨＳＣの非常に生存可能性の高いソースであることが、６０年前に認識されていた。死亡した臓器ドナーからの高度に機能的なＢＭの回復は、概念的には、米国だけで毎年３０，０００件を上回る臓器移植と１００万件の組織移植の実施に至る、数十年の間行われている臓器や組織の調達と同様である。骨髄ＨＳＣは敏感な臓器やほとんどの組織よりも硬く、これらの細胞は、ＢＭ微小環境内の低酸素環境に存在するように自然に進化してきたため、長期間の虚血に耐えることができる。ＨＳＣは、一般に、静止（Ｇ０）状態であり、したがって、代謝基質をほとんど必要とせず、そして、老廃物をほとんど生成しない。死亡した臓器ドナーのＢＭ内のＣＤ３４＋ＨＳＣと前駆体とは、非常に生存能力が高いことがわかっている。臓器ドナーのＢＭから単離されたＣＤ３４＋細胞の生存能に対する公表された値は（最適化されておらず検証されてもいない回復手順と処理手順であっても）生体ドナーＢＭの９３．５％と比較して、９５．２％だった。死亡した臓器ドナーは生存能力のあるＢＭ細胞の豊富なソースであり、統計的に、ＣＤ３４＋の生存能と有核細胞の合計数（ＴＮＣ）では、生体ドナーと区別がつかない。収量の高いＣＤ３４＋ＨＳＣと臓器ドナーからの多量のＢＭによって、複数のレシピエントに移植するために複数のＢＭユニット（７０ｋｇの患者に基づいて～２ｘ１０^６のＣＤ３４＋細胞／ｋｇで＞＝２ユニット）をバンクすることが可能になり、並びに、一次移植片が失敗した場合に再移植できる確実性を確保することができるようになる。

しかし、複数の障壁が、死体骨髄の大勢の使用を妨げている。１つの重要な障壁は、死亡ドナーの骨髄とその骨髄からの細胞収量の、管理された抽出と保管のための、合理化されたプロセスを見つけることである。死体の臓器ドナーからＢＭを回復する現行の最良の実践は、数人の熟練したオペレータを必要とする複数の手技による工程を含む。一般に、椎体（ＶＢ）は移植外科医によって回収され、最初に手術室で洗浄されてから処理ラボに運ばれ、そこで、さらなる処理工程前に硬い結合組織のレムナントを全て除去するために、再び非常に注意深く洗浄される。次に、ＶＢは、最初に手動で骨を立方体に切断し、そしてその後に、立方体を骨研磨システムに供給することによって、３つのグループで処理される。その後、研磨された骨は複数回タンブリングされてすすがれ、最後に遠心分離によって細胞が濃縮される。一度に最大で３つのＶＢを処理することができるため、この手順は、ドナー１人当たり３回繰り返されなくてはならない。この完全に手動の現行のプロセスは、一般に、ドナー１人当たり１０，０００＄を超える一般コストで、ほぼ１１時間の処理時間を含む４０時間の総労働力を必要とする。

死体骨の使用に関する別の懸念は、骨の凍結保存、バンク、および回収に関係する。具体的には、その懸念は、特に、地理的に分散した位置で回収され、そして凍結保存バンク施設に長距離輸送された骨について、ドナーの骨から取得することができるＨＳＣなどの生細胞の品質に関係する。死亡したドナーから骨を回収するためのプロセスの各工程は、骨髄中に、虚血または細胞への酸素欠乏に関わる。温虚血と冷虚血時間のばらつきが、死体骨由来のＨＳＣと前駆細胞の品質に影響を及ぼす可能性があることが知られている。米国の現行の組織バンク用ガイドラインは、死体が心拍停止の１２時間以内に冷凍されれば、組織は心停止後２４時間までに死亡したドナーから回収することを可能にしている。しかし、身体冷却は、骨髄の回収に関して体系的に調査されてはいない可変事項である。温虚血と冷虚血の両方に対する許容限界で、それを超過すると、回収された細胞の品質と機能とが、治療的使用には許容不可能になる可能性がある許容限界を決定するための方法が必要である。

本明細書に開示されるシステムと方法とは、既存の骨髄と幹細胞ソースに対する必要な補完を提供する。一般に、同種ＢＭ移植を待つ患者で移植を受けるのは、半数に満たない。生体ドナーのＢＭ登録、ＢＭ凍結保存、および自家移植、そして臍帯血バンクは、血液疾患を有する何千もの患者に、命を救うことができるソリューションを提供してきた、しかし、これらの方法は依然として、供給と流通に関連する厳しい制限に悩まされており、この貴重な補完の恩恵を受けることになるだろう。さらに、まれではあるが、生体骨髄提供から有害事象が発生する可能性（つまり、骨髄提供に関連する死亡のリスクは１：１０，０００）があり、そして、現在、末梢血幹細胞提供がより多く利用されてはいるが、これらのドナーのほぼすべてが骨の疼痛を経験し、４人に１人が激しい頭痛、吐き気、またはクエン酸毒性を呈し、そして、１／５，０００が脾臓破裂またはその他の致命的な合併症を経験する。追加的に、幹細胞動員剤の長期的影響はまだ知られていない。死体のＢＭバンクおよびＢＭ提供の技術的可能性は原理的には実証されているが、これらの膨大な代替供給は、本発明によって直接取り組みがなされている問題によって、現在放棄されている。

本明細書に開示されるバンキングＢＭは、生体ドナーを見つけることができない多くの患者を一致させる、準備の整ったメカニズムを提供する。それは、オンデマンドの移植を可能にし、そしてこれらの患者にとっての待機時間を数か月からわずか１～２日に減じることによって、急速に進行する疾患と不良な予後を経験していた多くの患者の、移植後の生存率を大幅に上昇させることができる。および、重要なことは、このアプローチは、各ドナーから大量のＢＭを提供し、それは、数人の患者に対する造血幹細胞と前駆細胞（ＨＳＰＣ）の生着を可能にし、必要な時にＢＭ移植を即座に繰り返すことを可能にするのに十分であるということである。

本明細書に開示される方法およびシステムは、国家の緊急事態への準備努力のためのオンデマンドの骨髄の大量供給を可能にする。原子力事故または攻撃を受けた際の医療対策としての、オンデマンドの骨髄移植と幹細胞移植に対する緊急かつ対応されていない必要性が、ＨＨＳ、ＢＡＲＤＡの数十億ドルのプロジェクトバイオシールド、および国防総省によって十分に文書化されている。本開示はまた、免疫寛容誘導およびそれを超える、振興用途に必要な骨髄を提供する。臓器ドナーからのＢＭの、処理および実際の長期間バンクのためのプロトコルは、このアプローチにとって重要である。さらに、今日、死亡したドナーの臓器移植を受けている患者は、これらのドナーからのＢＭがバンクされ、将来利用可能になれば、この治療法の恩恵を受けることができるだろうし、そしてこの方法は主要臓器の移植レシピエントにとって、即座に有益なものとなるだろう。成功すれば、研究中の他の有望な方法と治療法とは、提案された方法を使用して、死体のＢＭの調達とバンクの価値を大幅に高める可能性を有しており、－これは、ＨＬＡ不一致の非血縁者ドナー（ｍＭＵＤ）のＢＭ移植を含み－、バンクされた骨髄の大量の供給を、ＢＭ移植を直ちに必要とするほとんどのレシピエントにとって即座に使用可能にし、特に、重症型の自己免疫障害、遺伝的疾患、多発性硬化症、および１型糖尿病に対応できる可能性を有している。

一態様では、死亡したドナーの骨から骨髄細胞を取得するための方法が提供され、当該方法は、死亡したドナーから骨を取得する工程と、軟組織を除去して骨を洗浄する工程と、骨を切片に粉砕する工程と、液体組成物を生成するために、粉砕された骨を濾過してすすぐ工程と、骨髄細胞を濃縮するために、濾過してすすがれた、粉砕された骨の液体組成物を遠心分離機にかける工程と、標的細胞の凍結保存とその後の単離のために、骨髄細胞を滅菌コンテナに抽出する工程と、を含む。

さらなる態様では、上記の方法で粉砕するための骨の調製時における使用のための骨切断ツールが提供される。骨切断ツールは、２つのハンドルと、ナイフ要素と、骨にナイフ要素を打ち込むためのラチェットおよび歯止め機構と、を含み、ここで、コンポーネントは、それぞれのコンポーネントの開口部を通る細長いピンによって互いに接続されている。ピンは、骨切断ツールを容易に洗浄するために分解し、そして洗浄後に再組立てできるように、少なくとも１つの取り外し可能な保持リングによって、取り外し可能に保持されている。骨切断ツールは、殺菌環境に耐えるように不動態化された表面を配する医療用グレードのステンレス鋼で形成されている。

別の態様では、死亡したドナーの骨髄から細胞を回収するための方法が提供され、当該方法は、死亡したドナーから骨を取得する工程と、骨から骨髄細胞を抽出するために骨を処理する工程と、１．０６３～１．０５２ｇｍ／ｍＬの密度を有する、低密度Ｆｉｃｏｌｌ溶液を取得する工程と、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配を形成するために、低密度Ｆｉｃｏｌｌ溶液を遠心分離管に導入する工程と、遠心分離管中で、抽出された骨髄細胞をＦｉｃｏｌｌ密度勾配上に層状に重ねる工程と、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配と骨髄細胞とを含有する遠心分離管を、遠心分離機にかける工程と、遠心分離管内からバフィーコート細胞を採取する工程と、その後の使用または処理ために、採取された細胞を洗い流す工程と、を含む。

本開示の一態様に係る、手作業による骨切断ツールの図である。 本開示の一態様に係る、手作業による骨切断ツールの図である。 本開示の一態様に係る、手作業による骨切断ツールの図である。 本開示の一態様に係る、手作業による骨切断ツールの図である。 本開示の一特徴に係る、濾過システムの図である。 本開示の方法に従って処理された骨髄ペレットを含有する、滅菌袋の図である。 骨髄ペレットから脂肪を分離するために袋をかみ合わせるクリップを配する、図３の滅菌袋の図である。 骨髄ペレットの単離のためのセットアップを示す。 本開示の一態様に係る、冷却ボックスの透視図である。 本開示に係る一方法の工程のフローチャートである。 本開示の一態様に係る、自動骨処理システムの側面図と斜視図である。 本開示の一態様に係る、自動骨処理システムの側面図と斜視図である。 図８Ａ～図８Ｂに示されるシステムの、骨郭清ステーションの斜視図である。 図８Ａ～図８Ｂに示されるシステムの、骨郭清ステーションの斜視図である。 図８Ａ、図８Ｂに示されるシステムの、骨粉砕ステーションの斜視図と正面図である。 図８Ａ、図８Ｂに示されるシステムの、骨粉砕ステーションの斜視図と正面図である。 図８Ａ、８Ｂに示されるシステムの篩ステーションの斜視図である。 死体冷却有り無しでの、温虚血時間と冷虚血時間の関数としてのＣＤ３４＋細胞の生存率の表である。 死体冷却有り無しでの、温虚血時間と冷虚血時間の関数としてのＣＤ３４＋細胞の生存率の表である。 死体冷却有り無しでの、温虚血時間と冷虚血時間の関数としてのＣＤ３４＋細胞の生存率の表である。 死体冷却有り無しでの、温虚血時間と冷虚血時間の関数としてのＣＦＵ合計の表である。 死体冷却有り無しでの、温虚血時間と冷虚血時間の関数としてのＣＦＵ合計の表である。 死体冷却有り無しでの、温虚血時間と冷虚血時間の関数としてのＣＦＵ合計の表である。 死体冷却有り無しでの、温虚血時間と冷虚血時間の関数としてのＣＦＵ合計の表である。 死体冷却有り無しでの、温虚血時間と冷虚血時間の関数としてのＣＦＵ合計の表である。 死体冷却有り無しでの、温虚血時間と冷虚血時間の関数としてのＣＦＵ合計の表である。 温虚血時間と冷虚血時間の関数としての生存率閾値の図表である。

本開示の原理についての理解を促進することを目的として、ここで、図面に示され、かつ以下に書かれた明細書に説明される、実施形態を参照する。これによる本開示の範囲に対する限定は意図されていないことが理解される。本開示は、示される実施形態に対する任意の変更および修正を含み、そして本開示が関係する当業者には通常想到するであろう、本明細書に開示された原理のさらなる適用を含むことが、さらに理解される。

本開示は、最先端技術のクリーンルームで産業的コンテキストで実践されるように修正された、臨床指向の研究プロトコルおよびシステムを提供する。開示されたシステムの一態様は、とりわけ、受け入れるドナーの骨のデブリードメント（ｄｅｂｒｉｄｅｍｅｎｔ）、カスタムメイドの外科用ステンレス鋼カッターを使用する最初の断片化、および断片化された骨を最大３ｍｍの断片サイズに粉砕することを含む。これらの改良は、熟練の組織処理技術で、ドナーの骨のセットを６時間の枠内で処理して有意義な量の生存能力のある骨髄を得ることができる、システムを提供する。

本明細書に記載されるプロセスの第一の工程は、死亡したドナーの骨髄の、有望なソースを評価することである。脛骨などの、ドナーからの長骨の処理に際し、年齢と共に赤い骨髄が黄色に変質することで、赤い骨髄は、長骨の端部に限定されており、そしてドナー間で劇的に異なるものであることがわかっている。さらに、黄色と赤色が混合している骨髄は、椎体または腸骨からの骨髄などの、全体が赤色の骨髄と比較して質が悪く、そして、黄色と赤色が混合している骨髄は、その後の処理工程を複雑化させる脂肪浸潤物を含むことが究明されている。ある臨床実験では、最良のドナー長骨でも、同じドナーの腸骨から取得された細胞と比較して、１ｋｇ当たり、１／１００のＢＭ細胞しか得ることができない。その後、長骨の処理は、さらに価値が高い「ユニバーサルな（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）」ＨＬＡタイプ、またはＨＩＶ耐性デルタ３２変異を有する骨髄を含むなどの、特別の場合にのみ実行されるのが好ましいことが究明されている。

対照的に、椎体と腸骨とは、高品質の赤色骨髄の最大で一貫性のあるリザーバとなる。両ソースの利用は、特に、本明細書に開示される工業化されたスケーラブルなＧＭＰプロセスの実装によって、骨髄の回収を最適化している。本明細書に開示されるプロセスの完了は、結果的に、標準的な血液袋に１億～１．５億のＴＮＣ／ｍｌを目標とする、６０ｍｌ～７０ｍｌの容量を保存する最終生成物構成の凍結保存をもたらし、これは、自家移植用に、凍結保存されたＢＭに対して既に使用されている生成物構成と同様となる。

ドナーの骨の調製
説明を目的として、ドナーの骨は椎体であると仮定する。しかし、本明細書に記載される方法は、腸骨、椎体と腸骨との組み合わせ、または骨髄および骨髄からの細胞の抽出に適している他の骨、さらには期待される収量が低いドナーの骨で使用できることが理解される。

ドナーの骨は、臨床的回収のための一定のプロトコルに応じて調達できることが理解される。骨は、外科医によって、または訓練されたＯＰＯ（臓器調達組織）の職員によって、切骨刀および槌を使用して、承諾済みの臓器および組織のドナーから回収することができる。未処理の骨は、好ましくは、生理食塩水に浸されたスポンジやタオルにくるまれて、０～１０°（華氏）の温度の湿った氷上で処理施設に低温輸送する間の水分保持が確保される。

ドナーの骨を調製するプロセスは、骨が死亡したドナーから取得された後すぐに生じてもよく、あるいは、ドナーの骨が処理施設に低温環境で輸送された後に生じてもよい。ドナーの骨は、回収中および処理施設への輸送中に長期間虚血状態になる場合があるため、注意して、虚血－つまり温虚血と冷虚血－の長さとタイプとをトラッキングしなければならない。本明細書により詳細に記載されるように、所定の期間の温虚血および／または冷虚血にさらされた骨は、有意義な量の生存能力のある骨髄細胞を取得するのに適している。

ドナーの骨を処理する第一の工程では、骨は、ＩＳＯ－５（クラス１００）環境（バイオセイフティーキャビネット）の中で、ＩＳＯ－７（クラス１０，０００）のバックグラウンド（クリーンルーム）で郭清され、これは、７０％のイソプロパノールを噴霧することによってなど、ドナーの骨を含有する袋の滅菌に特別の注意を払いながら行う。一実施形態では、デブリードメントは、手動で、メス、切骨刀、および丸のみ（ｇｏｕｇｅ）を使用して行われる。椎骨を処理する際、一般に、複数の椎骨のレベルを含む脊髄分節が提供されるだろう。典型的な場合では、背骨の分節は、１０の椎体のＴ８からＬ５へ走っている。脊髄分節の初期デブリードメント中は、椎弓根が見えるようにするために十分な軟組織を取り除く時に、椎弓根は、組織処理用帯のこ、またはＳｔｒｙｋｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ ６ Ｓａｗ（Ｓｔｒｙｋｅｒ、Ｋａｌａｍａｚｏｏ、ＭＩ）などの、骨のこぎりのいずれかを使用して取り出される。皮質骨が裂けると海綿質骨が露出するので、皮質骨を裂くことにならないように特別の注意を払い、郭清プロセス全体にわたって、低酸素の海綿骨骨髄が確実に保護され続けるようにする。椎体の前部の要素は残り、一方で、椎弓根と後部の素子とは廃棄される。

骨取り用ナイフまたは組織処理用帯のこを使用して、椎体は椎間板で分離される。各椎体に残る椎間板と軟組織とは、メス、はさみ、および／または切骨刀で取り除かれ、その後に、汚れのない分離されたＶＢが残る。ドナーの腸骨の場合には、軟組織は、皮質骨が決して裂けないように特別の注意を払いながら、丸のみとメスとで取り除くことができる。いずれの解剖病理または骨の傷も、最終的に骨から取得された骨髄に対して記録されたバッチの一部としてメモされ、そして記録される。回収プロセス中に損傷を受けた骨は、廃棄される。

ＶＢは滅菌袋に入れられ、そして、５，０００ｐｐｍの遊離塩素の濃度をもたらし、所定の期間、一般に１０分～２５分間、１０％の漂白溶液に浸される。漂白剤は、広域スペクトルの抗菌活性を有しており、有毒残留物を出さず、水の硬度に影響されず、そして素早く作用する。期間の終わりに、骨は、別の滅菌袋に移され、そして３％の過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）溶液に浸される。袋は閉じられ、そして骨の表面全体が確実に溶液に接するように、短時間振られる。ほとんどの生細胞はカタラーゼを含み、カタラーゼとは、Ｈ_２Ｏ_２のＨ_２ＯとＯ_２とへの分解を触媒する酵素である。Ｈ_２Ｏ_２溶液が骨ではなく軟組織と接触する時、この分解は、気泡または泡として現れる。気泡レベルは、骨の上に残る軟組織の量の指標として観察することができる。この観察は、ヒト用プロセッサによって手動で、または別の実施形態では自動プロセッサによって、実行することができる。自動プロセッサは、カメラなどのビジュアル化デバイス、および袋内の気泡レベルを判定することができるオブジェクト認識ソフトウェアを組み込む。不活性の造影剤の添加は、ヒト用プロセッサまたは自動プロセッサが気泡レベルを検出するのに役立ち得る。いずれの気泡または泡が観察される場合は、骨は、残りの軟組織の全てが骨から取り除かれるように、さらなる処理のために戻される。一旦全ての軟組織がＶＢまたは腸骨から取り除かれて洗浄されると、骨は新しい滅菌袋に移される。袋は、１ＬのＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ（商標）（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｌｔｄ．から入手した多電解質注入剤）、または他の適切な、滅菌で非発熱性の等張液で満たされている。袋は閉じられ、そして骨全体が確実にＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ（商標）に接触するように、短時間振られる。

骨髄の抽出
骨は袋とＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ（商標）から取り出され、そして、滅菌ガ―ゼまたは滅菌スポンジを使用して、ＶＢ上に残るいずれの液体をも吸収する。１アプローチでは、のこぎりおよび／またはアンビル剪断機を使用して、ＶＢを、骨の粉砕機で断片化するのに十分に小さい、１．５ｃｍ^２の切片などのより小さな切片に切断する。プロセスを単純化するために、および、処理担当職員に対する安全性を高めるために、図１Ａ～図１Ｄに示されるようなカスタム骨切断ツール（１００）が提供され、当該カスタム骨切断ツール（１００）は、ＶＢをより小さな切片に切断するために使用される。骨切断ツール（１００）は、骨を貫通して分断するように構成されたナイフエッジ（１０２ａ）を備えるナイフ要素（１０２）を含む。ナイフ要素（１０２）は、ピボット（１０５）で、固定ハンドルコンポーネント（１０４）に枢動自在に接続されている。固定ハンドルコンポーネント（１０４）は顎状の端部（１０４ａ）を含み、当該顎状の端部は、顎状の端部に保持された骨を通って切断するナイフエッジ（１０２ａ）と並置されている。図１Ｂに示されるように、固定ハンドルコンポーネントは、２つのプレート（１０４ｄ）を含み、当該２つのプレート（１０４ｄ）は、図１Ｂ～図１Ｄに最もよく確認できるように、その間にナイフコンポーネントを受けるようように離間されている。具体的には、ナイフエッジ（１０２ａ）は、顎状の端部（１０４ａ）で、２つのプレート（１０４ｄ）の間を通り、それにより、ナイフエッジ（１０２ａ）が、顎状の端部（１０４ａ）によって捕捉された骨を確実に通ることになる。顎状の端部（１０４ａ）は、頂上部（１０４ｂ）によって分離された２つの凹部（１０４ｃ）を含むことができ、これは、骨をはめこみ、そしてナイフエッジ（１０２ａ）が骨を通る際に骨を顎状の端部に保持するのに役立つ。代替的に、骨を保持するように構成された顎状の端部に、単一の凹部を、画定することができる。ピボット（１０５）は、２つのプレート（１０４ｄ）と、プレートの間に挟まれたナイフコンポーネント（１０２）とを通って延在する、ピンの形態である。

骨切断ツール（１００）は、ピボット（１０９）で固定ハンドル（１０４）に枢動自在に搭載されているレバーハンドル（１０７）を含む。ピボットは、レバーハンドル（１０７）を、固定ハンドル（１０４）から離れるように付勢するように構成されたトーションバネ（図示されず）などの付勢要素を含むことができる。レバーハンドルは、そのため、２つのハンドルがユーザーによって掴まれ、そして握られると、固定ハンドルの方に旋回するように、そして、ユーザーがハンドルの把持部を離すと、固定ハンドルから遠ざかって旋回するように、構成されている。レバーハンドル（１０７）が、ピボット（１０９）で２つのプレート（１０７ａ）の間に挟まれた固定ハンドル（１０４）を具備する、２つのプレート（１０７ａ）から形成されていることが認識され得る。ピボット（１０５）と同様に、ピボット（１０９）は、２つのプレート（１０７ａ）と、固定ハンドル（１０４）とを通って延在する、ピンの形態である。両方のハンドル（１０４）、（１０７）は、ユーザーの掌と指とによって掴まれるように形成された、それぞれの把持用プレート（１０６）、（１０８）を含む。把持用プレート（１０６）、（１０８）は、プレートのペア（１０４ｄ）、（１０７ａ）と接続しており、それによって２つのハンドルを形成する。把持用プレートの表面は、ツールを掴むことを促進するための、滑り止め機能を含むことができる。

レバーハンドル（１０７）は、レバーハンドルへのピボット（１１３）に枢動自在に搭載されている、歯止め（１１２）を含む。他のピボットと同様に、ピボット（１１３）は、レバーハンドル（１０７）を形成するプレートのペア（１０７ａ）を通って、および歯止め（１１２）の端部を通って延在する、ピンである。ピボット（１１３）は、トーションバネ（図示されず）などの付勢要素を含み、当該付勢要素は、歯止め（１１２）を、ナイフ要素（１０２）のラチェットコンポーネント（１１０）の方へ付勢する。歯止め（１１２）の端部は、ラチェットコンポーネント（１１０）上で歯（１１０ａ）をかみ合わせて、ラチェットコンポーネントを、そして従ってナイフ要素（１０２）を、図１Ａに見られるように反時計回りに回転させるように構成されている。具体的には、ユーザーが２つのハンドルを共に握ると、レバーハンドル（１０７）は固定ハンドルの方へ動き、それによって、歯止め（１１２）をラチェットの歯（１１０ａ）に対して上方に押し上げて、ラチェットを上方へかつ反時計回りに旋回させる。ユーザーがレバーハンドルを放と、ハンドルは固定ハンドルから離れ、それによって歯止め（１１２）が、ラチェットを、別の歯（１１２ａ）に到達するまで、時計回りに下方へ摺動させる。したがって、２つのハンドルを繰り返し握ると、歯止めがラチェットを連続的に回転させる。ナイフ要素（１０２）はまた、ピボット（１１６）でフリーリンク（１１４）に枢動自在に接続されている、一体型リンク（１０３）を含む。フリーリンク（１１４）は、ピボット（１１５）で、レバーハンドル（１０７）に枢動自在に接続されている。歯止めがラチェットコンポーネント（１１０）を横断する際、一体型リンク（１０３）とフリーリンク（１１４）とが、ナイフ要素（１０２）を適所に保持する。フリーリンクのピボット（１１５）は、他のピボットと同様に、ピンであり、そして、レバーハンドル（１０７）を固定ハンドル（１０４）から離れるように付勢するトーションバネ（図示されず）などの、付勢要素を含む。これにより、ユーザーがハンドルを閉じたり放したりして、歯止め（１１２）を、ラチェットコンポーネント（１１０）に沿って連続的に進めることが可能になり、そのことが、ナイフエッジ（１０２ａ）を骨の中へと連続的に進める。

本開示の骨切断ツール（１００）の一特徴では、ピボット（１０３）、（１０９）、（１１３）、および（１１５）は、ツールの完全分解が可能であるように構成されている。完全分解は、ツールを、使用と使用の間に完全に洗浄し、そして滅菌することを可能にするのに重要である。したがって、ピボットは各々、ピンと保持リング構成とを含んでおり、保持リングがピン上でコンポーネントを共に保持している。したがって、図１Ｄに示されるように、ピン（１２１）は、レバーハンドル（１０７）の向かい側の壁（１０７ａ）などの、コンポーネントの壁を通って、および、ナイフ要素（１０２）などの、接続されているコンポーネントの対応する穴を通って、延在することができる。保持リング（１２２）は、コンポーネントを共に保持するために、ピン（１２１）の対向する端部で、溝（１２３）を係合させることができる。代替的に、ピンの一方の端部は、ピンの対向する端部と係合する保持リングを具備する拡大ヘッドを有することができる。ツール（１００）を洗浄して滅菌する必要がある時には、保持リング（１２２）を全て取り外すことができ、ピン（１２１）を全て取り外すことができ、そして接続されているコンポーネントを分離することができる。したがって、ナイフ要素（１０２）、固定ハンドル（１０４）、およびレバーハンドル（１０７）を分離し、それによって、コンポーネントの全ての表面を効果的に洗浄することができる。

骨切断ツール（１００）の要素は、医療用グレードのステンレス鋼で形成される。鋼は、好ましくは、骨を通って切断するのに必要な力に耐え得る硬化鋼である。洗浄プロセスでは、ツールは蒸気滅菌にさらされるが、これは鋼に悪影響を及ぼし得る。したがって、本開示の一特徴では、ステンレス鋼要素の表面は、滅菌中の鋼要素の酸化を防ぐために不動態化されている。

プロセスの工程に戻ると、そして特に骨髄を抽出する工程に戻ると、骨切断ツールによって生成された切片は、直ちに滅菌のピッチャーに入れられ、３００～５００ｍＬの粉砕培地の中に浸される。本システムおよび方法の一態様では、粉砕培地は、ベースとしてＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ（商標）－Ａを、１０Ｕ／ｍＬのヘパリン、２．５％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、および３Ｕ／ｍＬのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）試薬（Ｍｅｒｃｋ ＫＧＡＡ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と共に使用する。ヘパリンは抗凝血薬として使用される。ＨＳＡは、表面への、細胞の付着と吸着とを防ぐためのタンパク質ソースと、並びに活性酸素の除去とをもたらす。従来の粉砕培地はＤＮａｓｅを使用しているが、本開示は、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）試薬がＤＮａｓｅ（商標）試薬（Ｑｉａｇｅｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＬＬＣ）の代わりに使用されていることに留意されたい。ＤＮａｓｅはＤＮＡにのみ作用するが、現代の製薬バイオテクノロジープロセスは、全ての形態のＤＮＡとＲＮＡとを開裂でき、かつ細胞が懸濁されている溶液の粘性を低下させることができる、酵素に頼っている。ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉａ）は高密度細胞培養物を高速で増殖させるのに適しており、そしてＴ－リンパ球とＢ－リンパ球とをサポートするのに理想的であるため、ＩＭＤＭをＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ（商標）－Ａの代わりに使用することができることに留意されたい。Ｄｅｎａｒａｓｅ（登録商標）試薬（Ｃ－Ｌｅｃｔａ ＧｍｂＨ）は、本プロセスでは、同じ量のＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）試薬と等価であることに、さらに留意されたい。粉砕後の骨断片を収集するために、３００～５００ｍＬの粉砕培地の別のピッチャーが保持されており、また、粉砕プロセス中に粉砕機を通してすすぎを行うために、約１００ｍＬの粉砕培地の別の供給源が保持されており、これによって、骨断片が粉砕コンポーネントのピッチャーの表面に付着するのを防ぐ。

Ｂｉｏｒｅｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ，（Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）の粉砕機などの、電気による骨の粉砕機または特注の骨の粉砕機は、ＩＳＯ－７クリーンルーム内のＩＳＯ－５環境で使用することができる。同じドナーからのＶＢと腸骨の両方が処理されている場合、骨のタイプは別々に保存される。骨は、粉砕プロセスの間、および粉砕プロセス後、ずっと、粉砕培地に浸されて保存される。一旦ドナーの骨の切片がすべて粉砕されれば、骨の粉砕機のチャンバは、新たな処理培地で徹底的にすすがれる。骨の断片は、粉砕機から、粉砕培地を含有しているピッチャーの中に放出される。

ピッチャーの内容物は滅菌袋に移される。次の工程で、滅菌袋の内容物は、固体のコンポーネントを抽出するために濾過される。一実施形態では、各袋の内容物は、一連のステンレス鋼の篩を通される。この実施形態では、４０番（４２５μｍ）の篩は８０番（１７７μｍ）の篩の上に重ねられており、当該８０番（１７７μｍ）の篩は、液体の濾過物を受けるための受け皿の上部に存在する。粉砕機からの生産物を含有している滅菌袋は、かき混ぜられ、そして、重ねられた篩または濾過セットに均等に注がれる。濾過プロセスは、軟組織または他の汚染物質の存在を示唆し得る、過度の凝集が発生していないことを確認するために観察される。篩の表面上に保持された骨の断片は、篩上で均等に分散され、そして２５０ｍＬの新たな処理培地ですすがれる。一実施形態では、すすぎに使用される処理培地は、上記の粉砕培地、または２．５％のＨＳＡと共に使用するＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ（商標）である。プロセスが良好に実行されるとおよそ１０００ｍＬになり得る、篩にかけられた後の骨髄生成物は、その後の処理と分析のために、無菌のパックに移される。各袋の内容物は目視で検査され、その内容物に、目に見える骨の断片または軟組織が含まれていないことが確認される。

別の実施形態では、図２に描写されるように、各袋の内容物は、骨髄濾過ユニットを通される。この実施形態では、システム（１５０）は、上記の粉砕作業からの骨の断片と培地とを含有している、滅菌収集袋（１５２）を支持するように構成された、スタンド（１５４）を含む。スタンドは、コンテナを懸濁するための滅菌袋のキャップ（１５３）を係合させるように構成されたコンテナハンガー（１５５）を含む。袋の底部は、収集袋の本体の中に突出するプレフィルタ（１６２）を含む、放出アセンブリ（１６０）を含む。１つの具体的な実施形態では、プレフィルタ（１６２）は、８５０μｍのフィルタである。フィルタ（１６２）は、コンテナクレイム（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ ｃｌａｉｍ）（１６６）によって第１の並列フィルタ（１７０）の入力ライン（１７１）に接続されている、出力管（１６４）に接続される。具体的な実施形態では、第１の並列フィルタは、２００μｍまたは５００μｍのフィルタである。第１の並列フィルタの出力ライン（１７２）は、第２の並列フィルタ（１７５）の入力ライン（１７６）に接続される。第２の並列フィルタは、２００μｍまたは５００μｍのフィルタである。２つの並列フィルタは両方とも、フィルタシステム（１５０）を介する第１の通過のために、最初は５００μｍである。その後、粉砕物上で、２００μｍである２つの並列フィルタよって、第２のすすぎが実行される。この二重通過による濾過は、結果的によりきれいな懸濁液をもたらし、懸濁液からの脂肪の除去を向上させる。第２の並列フィルタ（１７５）は、第２の濾過通過用に、袋（１５２）などの滅菌袋と係合することができる、出力ライン（１７７）を有する。システムを介する第２の通過時には、第２の並列フィルタ（１７５）の出力ライン（１７７）が、移動用パックコンテナ（１８０）のコンテナクランプ（１８１）と係合することができる。移動用パックコンテナは、プロセスが良好に実行されるとおよそ１０００ｍＬになり得る、濾過された後の骨髄生成物を収容する、６００ｍＬ～２０００ｍＬの袋であってもよい。

品質管理のために、０．３ｍＬなどの小量の骨髄が、注入部位（１５７）で注射器を使用して、かつサンプルを引き込む前の反転ミキシングを行って、滅菌パック（１５２）から抽出される。サンプルは、Ｓｙｓｍｅｘ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎａｌｙｚｅｒなどの血液分析器によってテストされ、その後に処理される骨髄のＴＮＣ（合計有核細胞数）含有量の指標として、サンプルのＴＮＣ含有量が判定されてもよい。

脂肪の除去と濃度
濾過工程から集められた骨髄生成物は、本質的には脂肪エマルジョンである。上に開示された篩濾過アプローチから取得された懸濁液の脂肪分は、二重通過濾過システム（１５０）から取得された懸濁液の脂肪分より多い。しかし、両者の場合で、懸濁液から脂肪分を取り除く必要がある。濾過工程から取得された懸濁液は、管用溶接機で密封された、２５０ｍＬの袋に回収される。滅菌袋と風袋用スティックとは、袋のポートが下を向くように、かつバランスを取って、遠心分離機に搭載される。容量補助プレートが、遠心分離中の袋のしわを防ぐために、使用される。一実施形態では、袋は室温で１５分間、５００ｘｇで遠心分離機にかけられ、細胞を、好ましくは２～３ｘ１０^８／ｍｌに濃縮する。遠心分離が完了した後、各袋は、リングスタンドに個々に吊り下げられる。袋内の別個の層は見える状態であり、脂肪層は上清の上部に、骨髄ペレットは底部に、図３に示されるように明確に輪郭が示される。新規の滅菌袋が、遠心分離機から取り外された袋に溶接される。袋のクランプまたはクリップ（１９０）が、図４に示されるように、袋上で、脂肪層の下に置かれ、袋が脂肪層の下で閉じられるように留められる、または縛られる。その後、ペレットは、遠心分離機用袋から新規の滅菌袋に排出され、袋のクリップが脂肪層の通過を妨げる。ペレットは、全てのペレットが再懸濁されるために排出される際に、撹拌される。ペレットの約半分が新規の袋に排出した後、管類は止血鉗子または管状シーラーで閉じられる。その後、第２の遠心分離機用袋が、ペレットを含有している新新規の袋に溶接され、そして、この第２の遠心分離機用袋の内容物が、新規の袋に排出される。

この工程は結果として、脂肪を取り出すために、遠心分離機にかけられた骨髄を含有している、新規の滅菌袋をもたらす。その後、脱脂された骨髄のこれらの袋は、室温で１５分間、５００ｘｇで遠心分離機にかけられ、容量補助プレートが、袋のしわを防ぐために使用される。各袋は取り外され、そしてリングスタンドに吊るされ、廃棄用袋がその袋に溶接され、そして、図５に示されるように、プラズマ抽出器が、上清を廃棄用袋の中に取り除くために使用される。ペレットが上昇するか壊れる時、管類は止血鉗子で留められる。その後、管類は、密閉され、そして廃棄用袋からペレット含有袋を取り出す役目を果たし、それは廃棄される。ルアー接続部は、ペレット含有袋に溶接される。各袋からのペレットは、大きな注射器を使用して、バルク袋に統合される。ペレット含有袋は、すすぎ用培地を使用して、すすがれてバルク袋に流し込まれる。バルク袋は、全てのペレットが確実に再懸濁されるように、数回反転される。０．５ｍＬなどの小量の処理されたＢＭは、密度と細胞数とについての品質管理テスト用に取り出され得る。テストサンプルはまた、とりわけ、ヒト白血球抗原、ＣＣＲ５のデルタ３２変異、およびアポリポタンパク質（ＡＰＯＥ）について評価することもできる。

骨髄の凍結保存
各々の骨のドナーからは、ドナーから取得された１０の椎骨と腸骨とに基づいて、上記のプロセスを通じて、３袋以上の骨髄を得ることができると企図される。所与のドナーに対するプロセスの終わりに、３袋の骨髄が取得されない場合、ドナーに、全体的な品質管理をパスしない可能性があるものとして、フラグを立てることができる。各袋の骨髄の所定容量は、２５０ｍＬの袋に含有される７０ｍＬなどが企図される。この所定容量は、骨髄ペレットの効率的な凍結保存に必要な冷凍用培地成分の容量を計算するために使用される。冷凍用培地は、すすぎ用培地と凍結保存用組成物との溶液である。凍結保護組成物は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、１，２プロパンジオール、エチレングリコール、グリセロール、ホルムアミド（ｆｏｒａｍａｍｉｄｅ）、エタンジオールまたはブタン２，３ジオール、などの浸透性培地、および／または、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、デキストラン、スクロース、トレハロース、ラクトース、ラフィノース、リビトール（Ｒｉｂｏｔｏｌ）、マンニトール、またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの非浸透性培地であり得る。２．５％のＨＳＡはまた、膠質浸透圧、細胞表面タンパク質安定化、および活性酸素の除去を通じて凍結保護をもたらす。好ましい実施形態では、凍結保存用培地はＤＭＳＯである。すすぎ用培地は、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ、Ｉｓｏｌｙｔｅ、ＩＭＤＭ、または注入に適している他の電解質溶液などの、電解質培地であり得る。冷凍用培地はまた、酸素含有量を、大気濃度の３％未満のなどの大気濃度未満に低減するために、ｏｘｙｒａｓｅの濃縮物を含むことができる。ｏｘｙｒａｓｅの添加によって、凍結保存を促進することができる低比重の組成物が生成される。

冷凍用培地は、以前の工程で収集された骨髄の容量に対して必要とされる、冷凍用培地の計算された合計容量に応じて、凍結保護培地とすすぎ用培地とを混合することによって調製される。骨髄を含有する袋は混合のためにロッカー（ｒｏｃｋｅｒ）に置かれ、そして、冷凍用培地は注射器によって袋の中に導入される。冷凍用培地は、特定の速度で所定時間にわたって導入される。一実施形態では、冷凍用培地は、毎分、培地の１０％の速度で、１０分間添加される。一旦、培地が濃縮骨髄と混合されると、テストサンプルは注射器によって抽出される。冷凍用培地と骨髄の混合物の残りは、所定量で別々の凍結保存袋へと注入される。一実施形態では、７０ｍＬの骨髄混合物が各凍結保存用袋の中に導入され、そして、空気は注射器で抜かれる。プロセスの終わりに、８ｍＬのサンプルは、無菌性テスト用に取り出され得る。各凍結保存用袋は、４つの区画を作るように密閉され、当該４つの区画はその後、凍結保存用フリーザーに貯蔵されるカセット中での保存のために、分離される。別の実施形態では、分離された区画は、図６に示される冷却ボックス（２００）などの、受動的冷却ボックスに保存される。

特定の骨髄バッチからのテストサンプルが細胞数と無菌性について検証されると、凍結保存された骨髄の袋は、長期間保存のためにさらに冷却され得る。一実施形態では、袋は、骨髄と細胞とへのダメージを防ぐために、制御された速度で冷却される。１つの具体的な実施形態では、袋は、毎分－１℃から－４０℃への速度で、袋を液体窒素に押し込むのに適している温度へと冷却される。適温は、－４０℃から－１００℃の範囲内である。一旦、その温度に到達すると、袋は、保存のために、－１３０°を下回る温度へと、より速い速度でさらに冷却される。凍結保存用袋は、冷却ボックス（２００）の対応する区画（２０１）～（２０３）内に置かれ、そして、オーバーラップカバー（２０５）が区画上で閉じられて、袋の内容物の凍結保存のための密閉環境を提供する。冷却ボックスは、冷却ボックスが、核生成温度が－２０℃を上回る状態で、毎分－０．５℃から－２℃、典型的には－１℃の冷却速度を生じさせるように、冷却フリーザー内に置かれる。冷凍プロセスは、骨髄の温度が適切な温度に到達するまで、規定の速度で継続する。袋の保存のための適切な温度は、＝＜－８０℃、または＝＜－１５０℃の温度である。

別の実施形態では、袋は、上記の制御された速度による凍結保存とは対照的に、静的なチャンバ温度で冷却される。受動的冷却アプローチでは、冷却ボックスは、袋が安定温度に到達するまで、－８６℃のフリーザーに置かれる。

凍結保存による保存は、多くの形態があり得ると企図される。例えば、凍結保存された骨髄は、１ｍＬから５ｍＬの容量の袋、または０．１ｍＬから１５ｍＬの容量のバイアルに含有され得る。好ましい実施形態では、７０ｍＬの骨髄の袋は、極低温貯蔵フリーザー内の冷却ボックスに保存される。

凍結保存された骨髄は、後の、望ましい細胞の、解凍と抽出のために凍結バンクされる。解凍された骨髄は、白血病、脳腫瘍、乳癌、ホジキン病、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、血液癌、卵巣癌、肉腫、精巣癌、他の実質臓器癌、関節リウマチ、多発性硬化症、真性糖尿病、嚢胞性線維症（ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｕｓ）、アルツハイマー病、遺伝子免疫不全、代謝障害、骨髄不全症候群、およびＨＩＶに対する処置を含む、広範囲の処置のために提供され得る。骨髄はまた、臓器ドナーから取得されたインプラントの潜在的な拒絶反応を低減するために、免疫寛容の誘導のために使用され得る。骨髄処置はまた、放射線や特定の生物兵器によってもたらされた負傷者に対しても示され得る。

骨髄は、間葉系間質細胞／幹細胞（ＭＳＣ）の公知のソースであり、当該間葉系間質細胞／幹細胞（ＭＳＣ）は、以前凍結バンクされた臓器と組織のドナーの骨髄から、上記の方法を使用して、採取され得る。ＭＳＣは、脂肪細胞、骨細胞、および軟骨細胞などの中胚葉性起原の細胞型に分化する多分化能を有する、自己再生の、多分化能前駆細胞である。加えて、ＭＳＣは、炎症の部位へ移動し、そして、自然免疫系と適応免疫系の両方に関連するリンパ球間の相互作用を通して、強力な免疫抑制効果と抗炎症効果とを発揮することができる。ＭＳＣは、骨形成不全症、軟骨欠損、心筋梗塞、クローン病、多発性硬化症、狼瘡などの自己免疫疾患、肝硬変、変形性関節症、および関節リウマチを処置する際に使用され得る。一致したＨＳＣ／ＭＳＣユニットは、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の処置のためと、造血幹細胞移植のサポートのための、同時移植で使用され得る。

本方法は、図７のフローチャートに要約されているように、上記のプロセス工程に従って、将来の臨床的使用のために、骨髄を抽出し、かつバンクするためのシステムを提供する。この方法は、特定のマイノリティーなどの、一致させることが困難なグループに骨髄ドナーを一致させる、現行の方法の不備を排除することができる。一旦、骨髄が凍結保存され、かつバンクされれば、骨髄のソースに関する不確実性はなくなり、将来のレシピエントを待つ必要は無く、そして、骨髄は大量の反復可能な容量で利用可能となる。

骨髄の回収のための自動システム
本開示は、骨髄の回収と、さらには骨髄からの細胞の選択のための、自動プロセスを企図している。一態様では、図８Ａ～図８Ｂに描写されるように、自動システム（２０９）は、連続的なステーションを含む。自動プロセスの第１のステーション（２１０）は、軟組織をすべて取り除くために、ＶＢを郭清する。一度に１つのＶＢ上で作業する手動プロセスとは対照的に、自動プロセスは、ドナーのＶＢセット全体（それは少なくとも１０の椎体であり得る）を郭清するように構成されている。ＶＢは、所与のドナーからの椎体セットを支持するように構成された、ラックまたはトレー（２１２）に搭載されている。トレー（２１２）は、図９Ａ～図９Ｂに示されるように、ハウジング（２１５）の移動用レール（２１６）に置かれ、トレーは、自動でまたは手動で、ハウジングの内側に進められる。ハウジング（２１５）は、高圧かつ高速の食塩水噴射をＶＢに向ける、複数のハイドロジェット（２２０）を支持する。既知の手動プロセスでは、より低速かつ低圧で作業する手動のハイドロジェットは、洗浄剤の流れをＶＢに向ける。手動プロセスでは、洗浄剤は、軟組織を除去してＶＢを洗浄するのに必要である。対照的に、本開示の自動洗浄ステーション（２１０）は、生理食塩水培地を、ＶＢから軟組織を全て除去するのに十分な水噴射の速度と圧力とで使用する。本開示の自動洗浄ステーションは、直接的な流れを生み出すように構成されたジェット、または、様々な距離で高密度の衝撃力を生成する細い「Ｖ字型」の水／生理食塩水ジェットを含む。ＶＢの良好な適用範囲を達成するために、デバイスは、接近した間隔でＶＢに対して様々な配向の、多くの直接噴射を含み、当該直接噴射が、デバイスにおけるＶＢの位置とは無関係に均一な洗浄を可能にする。図９Ａの示される実施形態では、ハイドロジェットは、上列（２２０）と下列（２２１）に設けられる。「Ｖ字型」ジェットは、ＶＢの表面を完全に適用範囲とすることを達成するために、異なる角度で位置合わせされている。追加的にまたは代替的に、ハイドロジェット（２２０）、（２２１）は、完全な適用を確実にするために、ＶＢのトレーにわたって振動するように構成され得る。

ビジュアル化デバイス（２２５）は、デブリードメントステーション（２１０）の出口に配置されており、当該デブリードメントステーション（２１０）は、図９Ｂに示されるように、全ての軟組織が取り除かれたか否かを判定するために、ステーションを出て行くＶＢを視覚化し、かつ読み取るように動作可能である。あるいは、ＶＢはその後、さらなるハイドロジェット処理のために、レール（２１６）に沿ってハウジングの中に戻される。コントローラ（図示されず）は、レール（２１６）に沿ったトレー（２１２）の動きを制御し、かつ、ビジュアル化デバイス（２２５）によって生成されたシグナルを読み取るために、提供され得ると企図される。ビジュアル化デバイスは、ＶＢの画像を取得するカメラを含むことができ、そして、コントローラは、取得された画像中の軟組織を認識することができる撮像ソフトウェアを含むことができる。造影剤は、ハイドロジェット・デブリードメント・プロセスの終わりに、洗浄されたＶＢに適用することができ、当該ハイドロジェット・デブリードメント・プロセスにおいて、造影剤は、骨ではなく軟組織によって吸収される。造影剤は、従って、骨からのいずれの残留軟組織の差別化を容易にためのコントラストを提供することができる。ビジュアル化デバイス（２２５）は、フレーム（２２６）に沿って移動することによって、および、ＶＢを全ての角度で視認するためにフレームを移動させることによってなど、ＶＢにわたってパン撮り（ｐａｎ）できるように構成されている。

図８Ａ～図８Ｂに戻ると、一旦、ＶＢが洗浄されて全ての軟組織が除去されると、郭清されたＶＢは、その後、タンブリングおよび最終細胞抽出用の、近似のサイズの切片を生成するために、コンベヤー（２３０）によって自動粉砕ステーション（２４０）に供給される。上記の、手動による「立方体化」プロセスは、変動しやすく、時間を消費し、オペレータにとって安全ではない可能性がある。自動システムは、ＶＢを「立法体化する」工程（つまり、ＶＢを小切片に切断する工程）と、立方体化されたＶＢを粉砕してＶＢを２ｍｍ～３ｍｍの切片に縮小する工程とを組み合わせる、粉砕ステーションを含む。レール（２１６）とトレー（２１２）とは、郭清されたＶＢをコンベヤー（２３０）に配置するように構成され得、当該コンベヤー（２３０）が、その後、ＶＢを、図１０Ａ～図１０Ｂにより詳細に示される粉砕ステーション（２４０）の投入ホッパー（２４２）に自動で移す。ＶＢは、図１０Ａに示されるように、初期ミルカッターモジュール（２４４）を通り、その後にファネル（２４６）を通って、微細ミルカッターモジュール（２４８）へと向けられる。図１０Ｂに示されるように、初期ミルカッターモジュール（２４２）は、５ｍｍ～８ｍｍの間隙などの所定の間隙によって離間されている、対向する回転粉砕ミル（２４５）を含み、それによって、受け入れＶＢは粗いサイズの分節に粉砕される。粗めに粉砕された分節は微細ミルカッターモジュール（２４８）に供給され、そこには小径粉砕ミル（２４９）が設けられている。微細粉砕ミル（２４９）は、２ｍｍ～３ｍｍほどのより小さな間隙によって離間されており、微細に粉砕されたＶＢの分節を生成する。図１０Ａに示されるように、ファネル（２４６）は、粗めに粉砕された分節を、第２の粉砕ミル（２４８）に運び、そして、ファネル（２５０）は、微細に粉砕されたＶＢ分節を、プレート（２５３）によって支持されている収集パン（２５２）に向ける。粉砕作業中、ＤＮＡｓｅを含む処理／再懸濁培地の測定容量は、上部ホッパーを通して粉砕カッターに向けられ得る。この培地は、粉砕ステーション（２４０）の作動中に手動で導入されてもよく、または、ホッパー（２４２）に組み込まれたノズルを通って自動で実装されてもよい。

微細に粉砕されたＶＢ分節と処理培地とは収集パン（２５２）に収集され、プレート（２５３）は、手動または自動で、篩ステーション（２６０）（図８Ａ～図８Ｂ）に移され得る。篩ステーション（２６０）では、パン（２５２）の内容物が、図１１に描写されるような、２つの、直径１２”のフィルタの篩－＃４０の篩（２６２）が上で、その下により微細な＃８０の篩（２６４）－を含む、篩のカートリッジユニットの中に落とされる。ファネル（２６６）は、濾過された内容物を回収コンテナ（２６８）に向ける。フィルタに残った粉砕物は、ＤＮＡｓｅを含まない処理／再懸濁培地を含む篩ステーション（２６０）内ですすがれる。回収コンテナ（２６８）中の液体骨髄生成物は、下記の通り、細胞の内容物を判定するために分析され、その後に、濃縮され、そして凍結保存用に適切な容量でパッケージ化され得る。代替的に、処理された骨髄のいくらかまたは全ては、ＣＤ３４＋細胞などの特別な細胞生成物用の、自動細胞選択アプローチを使用してさらに処理され得る。このアプローチで、単一の臓器ドナーから多量の細胞を回収することができるので、１人のドナーが複数の生成物型タイプを生み出し得る。さらに、ソースが（Ｇ－ＣＳＦ動態化抹消血液とは対照的に）１次骨髄であるため、細胞生成物は凍結保存処理に耐えることができるだろう。

一変更では、粉砕ステーション（２４０）または篩ステーション（２６０）からの生成物は、自動で極低温処置用の収集バッグに供給され得る。この変更では、低い位置のファネル（２５０）は、内容物を、殺菌袋に接続された流体ラインに向けるように構成され得る。蠕動ポンプは、粉砕ステーションから滅菌袋まで産出物をポンピングするために、流体ラインと係合し得る。類似の構成が、篩ステーションのファネル（２６６）に係合され得る。

実質的に骨髄のスラリーである、収集コンテナ（２６８）の内容物は、手動または自動のいずれかで、機械的タンブラー（２７２）と大型の使い捨て容器（２７４）とを含む、隣接のタンブラーステーション（２７０）に運ばれ、当該大型の使い捨て容器（２７４）は、１０の処理されたＶＢの全内容物と、関連する処理／再懸濁培地とを含有する。タンブラー（２７２）は、細胞を機械的に遊離させるために粉砕スラリーを攪拌するためのパドルを有する。タンブリグのサイクルが完了すると、タンブラーの内容物は篩マガジンを通って容器（２７４）に注がれる。容器（２７４）の内容物は、さらに処理されるか、または極低温保存のために調製され得る。

骨髄からの細胞単離
本開示の一態様では、方法は、密度低下Ｆｉｃｏｌｌと免疫磁気ＣＤ３４＋細胞単離キットとを使用して、死亡したドナーの骨髄からＣＤ３４発現（ＣＤ３４＋）細胞を選択するための方法が提供される。驚いたことに、ＣＤ３４選択前の密度低下Ｆｉｃｏｌｌを使用する細胞単離は、新規に調製された、死亡したドナーの骨髄から、高純度かつ高生存能のＣＤ４５／ＣＤ３４＋細胞を取得するのに有益であることが分かっている。他方、従来密度のＦｉｃｏｌｌは、解凍された、凍結保存の死亡したドナーの骨髄からの、ＣＤ４５／ＣＤ３４＋細胞選択に最適であることが分かっている。

死亡したばかりのドナーから取得された椎骨セクションが、上記の通り処理された。従って、一実施形態では、骨は洗浄されて全ての軟組織が除去され、そしてその後に小切片に切断され、当該小切片は、５００ｍＬの粉砕培地に即座に浸された。粉砕培地は、２．５％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、３Ｕ／ｍｌのｄｅｎａｒａｓｅ、および１０Ｕ／ｍｌのヘパリンを含有している、ＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ（商標）－Ａ注入用ｐＨ７．４、多電解質、注入用タイプ１ＵＳＰ（ＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ（商標））であり得る。区分化されたＶＢは、骨の粉砕機を使用して粉砕され、濾過され、そしてすすぎ用培地（２．５％のＨＳＡとＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ（商標）など）ですすがれる。細胞懸濁液全体が遠心分離機にかけられて、細胞が２～３ｘ１０^８／ｍｌに濃縮され、そして、細胞濃縮物が抽出される。結果として生じるＢＭ調製物の一部または全てが、即座にＣＤ３４選択に使用され得る一方で、残りは凍結保存用に調製され得る。凍結保存分は、１０％のＤＭＳＯと５％のＨＳＡとの最終濃縮物をＢＭ細胞に添加すること、および、受動的冷却によってまたは制御された冷却によってのいずれかで、およそ－１℃／分の速度で、調製物を－８６℃にすることを含み、その後、凍結保存分は、液体窒素に押し込まれる。

ＣＤ３４＋細胞の選択用には、新規に処理されたＢＭ調製物が使用されるか、または以前の凍結保存分が使用のために解凍されるかのいずれかである。骨髄の、望ましいＣＤ３４＋細胞成分を分離するために、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳがＢＭ調製物に添加される。凍結保存された骨髄からの細胞選択には、１．０７７ｇ／ｍＬのＦｉｃｏｌｌの従来密度が許容可能な結果を生むことが確認されている。しかし、本開示の一態様では、新規に調製された、死亡したドナーの骨髄からの細胞選択については、Ｆｉｃｏｌｌ密度が従来密度から低下される。特に、密度は、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（密度１．０７７ｇ／ｍＬ、ＧＥ Ｃｏｍｐａｎｙ）をＰｌａｓｍａ Ｌｙｔｅ－Ａ注入用ｐＨ ７．４（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ２Ｂ２５４４Ｘ）と特定の割合で混合することによって低下され、１．０７７ｇ／ｍｌ未満の全体密度、特に１．０６３～１．０５２ｇ／ｍＬが取得される。１つの具体的な実施形態では、ＣＤ３４＋細胞の量、生存能、および純度を考慮すると、１．０６３ｇ／ｍＬの密度がＣＤ３４＋細胞の単離に最適であることが分かった。

一実施形態では、５ｍｌの、１．０６３ｇ／ｍＬの密度のＦｉｃｏｌｌ溶液が、１５ｍｌの遠心分離管にピペットで移され、そして、死亡したドナーのＶＢから生成されたＢＭ溶液が、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配にわたって注意深く層状に重ねられる。遠心分離管は４００ｇで３０分間、室温で中断を入れずに遠心分離機にかけられる。遠心分離後、バフィーコート細胞が注意深く採取され、そして、当該細胞は、０．５％のＨＳＡと２ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（ＭＡＣＳ緩衝液、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を含有しているリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で洗い流される。１つの具体的な実施形態では、遠心分離は４００ｇで５分間実行され、そして、結果として生じる細胞ペレットは、１０ｍｌのＰＢＳ中で再懸濁され、その後に、４００ｇで５分間、第２の遠心分離にかけられる。

単離されたバフィーコート中の有核細胞は、Ｓｙｓｍｅｘ ＸＰ－３００を使用してカウントされ得る。Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ｖｉｓｉｏｎ（Ｎｅｘｃｅｌｌｏｍ）またはフローサイトメーターが、精製されたＣＤ３４細胞の細胞数を判定するために使用され得る。２０マイクロリットルのＡＯＰＩは、２０マイクロリットルの細胞に添加され得、そして混合した後に、生細胞の合計数が判定され得る。ＣＤ３４＋細胞は、ＣｌｉｎｉＭＡＸシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＥａｓｙＳｅｐ ＣＤ３４キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）を製造者のプロトコルに従って使用する、陽性免疫分別法（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）によって選択され得る。様々なＦｉｃｏｌｌ密度でのテストから、驚くべきことに、本開示で企図されるより低いＦｉｃｏｌｌ密度（すなわち、従来の１．０７７ｇｍ／ｍＬの密度に対して、１．０６３～１．０５２ｇｍ／ｍＬ）が、より最適な細胞回収につながることが究明された。最適化は、選択されたＣＤ３４細胞の純度、生存能、および収量に基づく。＞９０％の純度と＞９０％の生存能とを有するＣＤ３４＋細胞の標的が好ましい。より低いＦｉｃｏｌｌ密度は、結果的により高い純度とより少ない死細胞をもたらすが、驚くべきことに、選択前に、死亡したドナーの骨髄全体に存在していたＣＤ３４＋細胞のより多くは、バフィーコートを調製するためにより低いＦｉｃｏｌｌ密度を使用すると、失われてしまうことが分かった。したがって、従来のＦｉｃｏｌｌ密度勾配で達成されたＣＤ４５／ＣＤ３４＋細胞の高生存率と高純度とは、収量の大きな損失（受け入れたＣＤ３４＋細胞の約６０％の損失）にもつながる。

従って、本開示の一態様に従って、新規の調製については、＞９０％の純度と生存能とでのＣＤ４５／ＣＤ３４＋細胞の選択に対するＦｉｃｏｌｌの最適密度は、１．０７７未満で、具体的には１．０６３～１．０５２である。このＦｉｃｏｌｌ密度は、従来のＦｉｃｏｌｌ密度アプローチと類似の純度と生存能で、ＣＤ４５／ＣＤ３４＋細胞のより高い収量を提供する

本開示の別の態様では、ＣＤ３４＋細胞が、最初に、上記の低密度Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅを使用して新たに調製された、死亡したドナーの骨髄から取得され得る。ＢＭが極低温で冷凍され得、その後、ＣＤ３４＋細胞が、従来密度のＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅを使用して、後に取得され得る。このアプローチは、実質的に、－変更後のＦｉｃｏｌｌ密度を使用して冷凍する前か、または従来のＦｉｃｏｌｌ密度を使用して冷解凍した後かのいずれかで－、死亡したドナーの骨髄からの細胞の選択的回収を可能にする。

処理された骨髄からのＭＳＣの回収
本明細書に開示されるシステムと方法の別の特徴では、酵素消化された椎体（ＶＢ）骨断片から間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を回収するための方法が提供され、当該椎体（ＶＢ）骨断片は、本明細書に記載される方法の、ＶＢの粉砕工程と溶出工程との副産物である。この方法では、コラゲナーゼと中性プロテアーゼの両方の混合物が、可能な限り高い収量の椎骨付着ＭＳＣ（ｖＢＡ－ＭＳＣ）を取得するために使用される。ＭＳＣは、後に本開示に従って処理される、凍結保存されたＶＢ骨の断片から回収され得る。１つの具体的な態様では、２つの活性アイソフォームで構成された組み換えヒストリチクム菌コラゲナーゼは、ＭＳＣ抽出プロセスにおいて、有効な量で使用される。ＶＢ骨断片を消化することによって遊離された、細胞の混合物は、増殖性ｖＢＡ－ＭＳＣを選択するために、Ｍｅｓｅｎｃｕｌｔ培地の存在下で、組織コーティングされたプラスチック上で培養される。新規に消化された調製物とＶＢ－ＭＳＣの異なる経路とは、フローサイトメトリー、コロニー形成単位繊維芽細胞（ＣＦＵ－Ｆ）の可能性、集団倍加時間（ＰＤＴ）、および三血球系の（脂肪生成、軟骨形成、および骨形成の）インビトロの分化によって、特徴付けられ得る。

従って、本開示は、精製されたコラゲナーゼと中性プロテアーゼの組み合わせを使用して、消化と椎骨断片からのＭＳＣ回収とを最適化するための方法を企図している。１つの具体的な実施形態では、コラゲナーゼはＤＥコラゲナーゼ（Ｖｉｔａｃｙｔｅ）であり、それは、精製されたヒストリチクム菌コラゲナーゼおよびパエニバシラス・ポリミキサ（Ｐａｎｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）中性プロテアーゼとで構成されている。開示の一態様に従って、最適な、中性プロテアーゼ濃度とコラゲナーゼ濃度（Ｃ１コラゲナーゼとＣ２コラゲナーゼ）、および、最適な、骨断片重量（ｍｇ）に対する溶液容量（ｍＬ）の比率が判定される。

プロセスに従って、ＶＢ骨の断片は、ＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ（商標）、２．５％のヒト血清アルブミン、および１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で構成された凍結保護溶液中に置かれ、そして４℃で１時間インキュベートされる。溶液が取り出され、そして、骨断片は、１°／分の速度で－８６℃まで冷却され、そしてその後に液体窒素に押し込まれる。液体窒素中で２４時間～４８時間おいた後、骨断片は、３７℃に設定された水浴で高速で解凍され、そしてその後に、生理食塩水中で洗い流され、そして上記のコラゲナーゼ／プロテアーゼ溶液を使用して消化される。

最適な容量対重量比は、２．５時間の最適なインキュベーション時間で５：１であることが分かっている。最適なプロテアーゼは、１９．６Ｕ／ｍＬの中性プロテアーゼ活性を生成した。他方、生存能力のあるＭＳＣ細胞の合計数は、一般に、コラゲナーゼ濃度に感受性が無いことが分かった。また、組み換えコラゲナーゼアイソフォームのＣ１とＣ２とによって生成された収量は、Ｃ１／Ｃ２比率に関係無く、精製されたコラゲナーゼの収量に類似していることも分かった。本開示のＭＳＣ回収プロセスのさらなる詳細は、本出願に対する付録Ａの技術記事に確認することができ、その開示全体は、参照によって本明細書に組み込まれる。

虚血時間に基づく細胞生存能の予測
上に議論されるように、ドナーの骨の虚血時間は、上記のプロセスを使用して抽出された細胞の生存能に影響を与える。本開示に従って、合計虚血時間（ｔｏｔａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ）は、死亡時間（ドナーの動脈系がクロスクランプされ（ｃｒｏｓｓ－ｃｌａｍｐｅｄ）、そして血液循環が停止した時点）に開始して、骨からの細胞の回収の開始を以って終了する間隔として定義される。統計モデリングを目的として、この合計間隔は、３つの連続する相互排除の時間成分に分離され得る：（ａ）温虚血時間（ＷＩＴ）－死亡時間で開始し、骨が回収されて氷上でパックされた時、または死体がクーラー内に置かれた時、のいずれかで終了する；（ｂ）死体冷却時間（ＢＣＴ）－死体がクーラー内に置かれた時に開始し、骨が氷上でパックされた時に終了する；（ｃ）冷虚血時間（ＣＩＴ）－骨が氷上でパックされた時に開始し、処理がＨＳＰＣなどの細胞の抽出を開始する時に終了する。従って、合計虚血時間＝（ＷＩＴ）＋（ＢＣＴ）＋（ＣＩＴ）である。全身冷却が使用されない場合については、ＢＣＴは０で、合計虚血時間＝（ＷＩＴ）＋（ＣＩＴ）である。

合計虚血時間に加えて、処理経験に対応する変数が、生存能判定に組み込まれる得る。学習曲線が結果に対して有意な影響を与えることが知られており、したがって、この事実を制御するために、変数ＥＸＰは、現在のドナーの前に処理されたドナーの数－つまりｉ番目のドナーの場合、ＥＸＰ＝ｉ－１として定義され得る。他の変数は、（椎体や腸骨などの）骨タイプ、ドナーの性別、およびドナーの年齢を含み得る。

一態様では、結果変数は：例えば生存能力有りのＣＤ３４＋細胞などの特定の細胞集団の割合、細胞処理後に検出された１０^５の有核細胞あたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の合計数、および、１０^５の有核細胞あたりで検出されたＣＦＵ顆粒球マクロファージ（ＣＦＵ－ＧＭ）の数、である。

本開示に従って、通常の最小二乗法（ＯＬＳ）ベータ回帰モデルが、結果変数を予測するために使用され得、ＣＦＵとＣＦＵ－ＧＭに対しては直線回帰モデルが使用され、そして、生存能力有りのＣＤ３４＋細胞の割合または％ＣＤ３４＋に対してはベータ回帰モデルが使用され、式中、０＜（％ＣＤ３４＋）＜１である。％ＣＤ３４＋を予測するためのベータ回帰方程式は：

式中：

逆リンク関数が線形予測量ηに適用され、その結果は、結果変数ｐＣＤ３４^＊の予想値、すなわちドナーの骨から抽出されると予想される生存能力のあるＣＤ３４＋細胞のパーセンテージ、である。逆リンク関数は：

あるいは、ηに上の方程式（１）を代入すると：

この実施形態では、数理モデルは、特定の虚血条件にさらされたドナーの骨から抽出され得る、生存能力のあるＣＤ３４＋細胞の割合を予測する。Ｅ［ｐＣＤ３４^＊］の値は、骨サンプルにおける、ＣＤ３４＋細胞の合計数に対する、生存能力のあるＣＤ３４＋細胞の数の比率であるため、０～１の間である。

一実施形態では、予測％ＣＤ３４＋のためのベータ回帰計算用の係数は、次の値を有する：

式中、ベータ係数β_０、β_１、β_２、β_３、β_４、β_５の各々は、上記の通り、切片ＷＩＴ、ＢＣＴ、ＢＣＴ^２、ＣＩＴ、およびＣＩＴ^２にそれぞれ相当する。

合計コロニー形成単位ＣＦＵおよびＣＦＵ顆粒球ミクロファージＣＦＵ－ＧＭの数の予測は、以下の線形回帰モデルを使用して取得することができる：

ＣＦＵ結果変数を予測するために使用される線形回帰モデルは、次の係数値を有し得る：

式中、ベータ係数β_０、β_１、β_２、β_３、β_４の各々は、上記の通り、切片ＷＩＴ、ＢＣＴ、ＢＣＴ^２、およびＣＩＴにそれぞれ相当する。

ＣＦＵ－ＧＭ結果変数を判定するために使用される線形回帰モデルは、次の形態を有し得る：

係数値は以下の通り：

前述のモデルは、虚血に基づく変数のみを考慮し、経験、骨タイプ、ドナーの性別、およびドナーの年齢による変数を考慮していない、ベースモデルまたは未調整モデルである。変数の全てを考慮した時の、％ＣＤ３４＋に関する完全調整モデルは、次の形態を有し得る：

係数のそれぞれの値は以下の通り：
％ＣＤ３４＋

ＣＦＵについての完全調整モデルは以下の通り：

ＣＦＵ

係数β_１は、処理されたドナーの数（つまり経験）の、細胞の量と生存能に対する影響を定量化することを試みる。完全調整ＣＦＵモデルでは、係数β_２は、施設が様々な学習軌道を有し得るという仮定に基づいて、特定の施設における経験に相当する。これらの係数の一方または両方は、変更されてもよく、あるいは削除されてもよい。
ＣＦＵ－ＧＭ

これらのモデルの観察されたデータへの適用は、図１２Ａ～図１２Ｃに示される表に反映される通り％ＣＤ３４＋に対する虚血時間変数の影響を、図１３Ａ～図１３Ｃの表に示される通り合計ＣＦＵに対する虚血時間変数の影響を、そして、図１４Ａ～図１４Ｃの表に示される通りＣＦＵ－ＧＭの量に対する虚血時間変数の影響を、判定するのに使用され得る。これらの表のデータは、特定のドナーの骨がドナーの骨のさらなる処理を保証するのに十分な細胞を生成できるか否かを決定するために、使用され得る。言い換えれば、予測モデルは、虚血許容限界とＨＳＰＣ品質判定基準とを確立するために使用され得る。例えば、％ＣＤ３４＋の結果変数に関して、８０％を上回る予想値が、特定のドナーの骨を考慮するために必要になるかもしれない。

上記のモデルと、図１２Ａ～図１４Ｃの表に示される例は、地理的に分散したＯＰＯによって骨を調達し、処理センターに長距離輸送しなければならない場合に避けられない長期の虚血時間にもかかわらず、許容可能レベルのＨＳＰＣ品質が達成可能であることを示唆している。そのような条件下でさえ、温虚血時間と冷虚血時間の好ましい組み合わせが達成され得、８０－９０％の範囲の％ＣＤ３４＋の生存能を可能にする。モデルはまた、骨回収前の死体の冷凍は、組織の回収の際には一般的な実践法であるが、骨髄回収の状況では有益性が劣ることを示唆している。例えば、全身冷却が使用された時は、ＣＤ３４＋の生存能の平均は７２．７５％であったが、死体冷却が使用されなかった時は、その平均はちょうど９０％足らずであった。これらのモデルは、最適な実践法が、死体の冷却を省略し、そして回収された骨を冷虚血環境に、できる限り迅速に移すことであることを示唆している。ＷＩＴ（温虚血時間）を８時間未満に制限し、そしてＣＩＴ（冷虚血時間）を４０時間未満に制限すると、ドナーの骨から有意な量の生細胞を回収する機会が最適化される。

本明細書に開示されるモデルは、図１５に示される図表に従って生存能を予測し、当該図表では、８０％のＣＤ３４＋細胞の生存率閾値が、許容可能であると判定されている。図表に反映されているように、温虚血時間と冷虚血時間の関係は、ＷＩＴが１０時間でＣＩＴが１８時間である点から、ＷＩＴが１時間でＣＩＴが２７時間である点へのカーブに従う。

本開示の、細胞の生存率を予測するための方法のさらなる詳細は、本出願の付録Ｂに確認することができ、その開示全体は、参照によって本明細書に組み込まれる。

本開示は、例示的であると見なされるべきであり、性質を制限するものではないと見なされるべきである。特定の実施形態のみが提示されており、そして、本開示の趣旨の範囲内にあるすべての変更、修正、およびさらなる適用が保護されることが望ましいことが理解される。

付録Ａ

椎体の骨髄腔の骨表面にしっかりと接着した一次ヒト間葉系幹細胞の大規模なソースの特定および特徴付け
Ｂｒｉａｎ Ｈ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ，ＰｈＤ^１，２，Ｈａｎｎａｈ Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ，ＭＳ^１，２，Ｄｏｎｇｓｈｅｎｇ Ｇｕ，ＭＤ，ＰｈＤ^１，Ｓｒｅｅｄｈａｒ Ｔｈｉｒｕｍａｌａ，ＰｈＤ^３，Ｍａｄｅｌｙｎ Ｒ．Ｂｅｃｋ，ＭＳ^３，Ｍｉｃｈａｅｌ ＬａＦｏｎｔａｉｎｅ，ＰｈＤ^２，Ｇｅｒａｌｄ Ｂｒａｎｄａｃｈｅｒ，ＭＤ^４，Ｅｒｉｋ Ｊ．Ｗｏｏｄｓ，ＰｈＤ^{１，２，３＊
１}Ｏｓｓｉｕｍ Ｈｅａｌｔｈ，Ｉｎｃ．５７５４ Ｗ．７４ｔｈ Ｓｔ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ ４６２７８
^２Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｏｓｔｅｏｐａｔｈｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｍａｒｉａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ
^３Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ
^４Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｌａｓｔｉｃ ａｎｄ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，ＵＳＡ

^＊問い合わせの連絡先：
Ｅｒｉｋ Ｊ．Ｗｏｏｄｓ，ＰｈＤ，ＨＣＬＤ（ＡＢＢ），Ｏｓｓｉｕｍ Ｈｅａｌｔｈ，Ｉｎｃ．，５７５４ Ｗ．７４ｔｈ Ｓｔ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，４６２７８，ＵＳＡ．Ｅｍａｉｌ：Ｅｒｉｋ＠ＯｓｓｉｕｍＨｅａｌｔｈ．ｃｏｍ

要約書
治療用同種間葉系幹細胞／間質細胞（ＭＳＣ）は、現在様々な疾患兆候を処置するための有効性を評価するための臨床試験中にある。広域な流通のための最終的な商業化は、予測需要量を満たすために必要とされた十分なスケールでＭＳＣを経済的に製造するために製造工程におけるさらなる改善が必要とされる。ＭＳＣ製造の現在の高原価（ＣＯＧ）の主な要因は、複数のドナーからマスター細胞バンク（ＭＣＢ）を作製する必要性であり、これにより大規模製造の実行において変動が起こる。したがって、一次ＭＳＣの大きな単一ドナーのデポの有用性は、製造に関連するコストを下げることにより細胞治療市場に非常に役立つ。

我々は、ＭＳＣのすべての特徴を有する細胞の豊富な集団が椎体（ＶＢ）骨基質と密接に関連しており、タンパク質分解消化によってのみ遊離されることを発見した。ここで、我々は、これらの椎骨接着（ｖＢＡ）細胞が、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（ＩＳＣＴ）が定義した、ＭＳＣのすべての特徴（例えば、プラスチック接着、表面マーカー発現、および三系統分化）を有することを実証し、したがって、この集団を骨髄（ＢＭ）コンパートメントの吸引、またはすすぎによって回収されたと緩く結合したＭＳＣから区別するために、それらをｖＢＡ－ＭＳＣと名付けた。

パイロットバンキングおよび拡張は、３人の死亡したドナーから得られたｖＢＡ－ＭＳＣで実施され、継代１で平均２．９ｘ１０^８±１．３５ｘ１０^８のｖＢＡ－ＭＳＣのバンクサイズが１００ｇの消化されたＶＢ骨断片から得られることが実証された。細胞の各バンクは、集団の倍加回数を大幅に短縮することなく、合計９回の継代を通じて強力な増殖を示した。４継代の限られた拡張での理論上の平均総収量は、単一のドナーから２兆（２ｘ１０^１２）の細胞を産出させ、平均７０ｋｇのドナーにおける１０^６細胞／ｋｇで３０，０００回の投与量に相当する。したがって、ドナー間のばらつきによる製造および規制の非効率性を克服することにより、細胞治療市場に役立つＭＳＣの新しい豊富なソースを確立した。

キーワード
ヒト間葉系幹細胞／間質細胞
ＭＳＣ
椎体
骨髄
細胞療法
再生医療
大規模製造

略語

導入部
間葉系間質／幹細胞（ＭＳＣ）の強力な活性と高い拡張性により、限られた数のドナーに由来する「既製の」同種ＭＳＣ治療薬の開発に商業団体からかなりの関心が寄せられている。同種の「ユニバーサルドナー」に基づく細胞治療の開発により、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞治療で現在行われているように、個々のドナーのために自己細胞の個々のロットを製造する場合と比較して、大幅なコスト削減で、製造された各ロットの品質（例えば、同一性、効力、純度および安全性）を徹底的に評価することに注意を払って制御された製造が可能になる。

細胞治療の製造の固有の課題は、製造工程の規模に応じて拡大する。いくつかの兆候に対するＭＳＣの有効量は、１投与量当たり１ｘ１０^９細胞と高く、潜在的な需要を満たすために年間１０兆（１０ｘ１０^１２）の細胞を製造することを要求するであろう［１－４］。推定される経済規模でのこのレベルの生産でも、ＭＳＣの投与量当たりの商品原価（ＣＯＧ）は１００，０００ドルを超える可能性がある［３］。ロットサイズに比例して増幅される製造コストの重要な要因は、健康な志願者から安全に取得できる組織および体液の量が限られ、および各ドナーから分離されたＭＳＣの拡大の可能性が限られているため、新しいドナーからＭＳＣを分離することでマスター細胞バンク（ＭＣＢ）を補充する必要があることである。ＭＳＣは、例えば、ＢＭ吸引液に有核細胞（ＴＮＣ）合計の約０．００１－０．０１％を含むすべての組織においてまれである［７］。健康な志願者からのＢＭ吸引物は、ドナーの安全性のために１００ｍｌ（腸骨稜から両側に５０ｍｌ）に制限されていることを考えると、新鮮な非継代ＭＳＣの総収量は約２ｘ１０^４／ドナーである。１兆個の細胞に拡張することは、細胞増殖を９倍の集団に制限するために、１ｘ１０^７ＭＳＣのシードストックが必要になる［８］。この数は、拡張ＭＣＢおよびワーキング細胞バンク（ＷＣＢ）の品質管理測定のために予約されている細胞に追加される。したがって、各ドナーから取得可能なＭＳＣの数は、拡張の初期段階に最適な数よりも３桁以上少なくなる。

新しいドナーから新鮮な細胞を取得することによって細胞バンクを絶えず補充する必要性は、年齢や健康状態などの他の属性が一致する異なるドナーに由来するＭＳＣの間で観察された変動性のために、製造プロセスに不整合をもたらす［６、９、１０］。ドナー間の可変性および、その結果として生じる製造コストへの経済的影響は大きい。異なるドナーに由来する複数ロットのＭＳＣの大規模製造を調査した研究では、５人の異なるＢＭドナー間の累積集団倍増が培養物中に３０日間で１．８倍変動することが確認され［９］、結果は、３億５０００万ＭＳＣのバッチを製造するためのプロセス時間における＞１３日の変動であった。バッチ実行を調整するためのロジスティックスの負担に加えて、細胞ベースの治療法製造の主要なコスト要因でもある増殖培地のコストが、相応に増加した。さらに、著者らは、コロニー形成能に＞１８％の差があり、インターロイキン６の発現に＞５０％の差があることを発見し、個々のドナーに由来する各バッチの効力の品質管理検証にさらに複雑さが加えられた。同様に、５９人のヒト志願者ドナーから回収されたＢＭからのＭＳＣの６８バッチの臨床製造に関する単一施設の経験では、集団倍加時間が２倍以上（４６．８～１４１時間）、平均７１．７時間、変動することが観察され、ＭＳＣの最終バッチ数が１．９ｘ１０^７から５．４３ｘ１０^９の範囲で（平均５．４６ｘ１０^８）産出された［１０］。

製造工程ごとにＣＯＧを増加させるという直接的な経済的負担を課すだけでなく、細胞バンクを更新する必要性から生じる関連コストを伴う規制上の負担もある。ＭＣＢは、特定のドナーの細胞を使用するすべての製造工程のためのスターター培養の蓄積として役立つ。ＭＣＢの品質および安全性の評価に関する規制要件は、費用と時間がかかる［１１］。製造された細胞治療産物の適合性を評価するために必要な３つの包括的なパラメーター（安全性、効力、同一性など）のうち、個々のドナーの特性に関連する効力は、上記のように拡張に伴ってプロファイルが変化するため、最も問題がある。これは特に、ＭＳＣ集団が拡張の限界に近づき、老化に入り、その効力を大幅に制限する場合に当てはまる。これらの理由で、範囲を２倍にする集団は監督機関の重要な因子である；これらの理由から、集団倍増制限は規制当局にとって重要な要素であり；とはいえ、ＦＤＡへの提出では一般的に扱われていないものである［１３］。

大規模な製造の需要を満たすために、毎年複数のＭＣＢロットを生成することによる経済的および規制上の負担を軽減することは、操縦されていないＭＳＣの大規模なデポを特定する必要とする。潜在的な解決策は、通常、ルーチン医療処置の後に廃棄される、または死後に取得可能なＭＳＣを含む豊富な組織から生じ得る。脂肪由来幹／間質細胞（ＡＳＣ）は、一般的に数リットルの組織を産出させる選択的手順から取得され、最近広く調査されている；しかしながら、それは主として自己由来の使用のためである［１４、１５］。医療手順または死体によって取得された骨髄腔を含む骨から直接隔離すると、吸引物に存在するより高い割合のＭＳＣ（約０．０４％）を産出させ、これは、おそらく末梢血汚染がないことを反映している［１６］。死亡した臓器提供者から回収された椎体（ＶＢ）のＢＭから、～５ｘ１０^９の総有核細胞数が取得され、各ＶＢには約２ｘ１０^６のＭＳＣ、または回収された典型的な脊椎９ＶＢセグメントあたり約２ｘ１０^７の合計ＭＳＣが含まれている［１７］。さらに、腸骨、胸骨、肋骨、長骨の骨頭は、ＭＳＣを回収できるＢＭのソースである［１８－２０］。したがって、典型的な死亡したドナーからのＢＭのみのＶＢコンパートメントは、健康なヒトドナーから得られるよりも３桁以上多いＭＳＣをも産出させる。

ＢＭを溶出または吸引することによって取得された細胞に加えて、ＭＳＣの別の集団は骨髄腔の骨構造と密接に関連している［２１－２３］。齧歯類の長骨で初めて同定された骨接着ＭＳＣ（ＢＡ－ＭＳＣ）は、その後、長骨顆および椎骨から取得されたヒトの骨片から分離された［２４］。脊椎ＢＡ－ＭＳＣ（ｖＢＡ－ＭＳＣ）と呼ばれるＭＳＣの別のソースを発見し、これは、ＢＭ細胞を除去するために徹底的に洗浄した後も、ＶＢ骨の断片に付着したままで残り、プロテアーゼによる消化によってのみ遊離され得る。ｖＢＡ－ＭＳＣの頻度および機能は、溶出されたＶＢ ＢＭ－ＭＳＣ中のものと同等である。本論文では、これらのデータを提示し、個々のドナーから合計１兆個を超える細胞のバッチを作成するために大規模な製造プロセスで使用できるＭＳＣの新しいソースを確立し、したがって、何十年にもわたって最も楽観的なレベルの需要を満たし、商業規模の生産に対する現在の障害を克服する［２，８］。

材料および方法
組織および細胞のソース
脊椎は、生存している家族から研究使用についてのインフォームドコンセントを得た後、脳死した臓器提供者の心臓死後に回収された。回収された脊椎の各々は、特有のＩＤを割り当てられた。ドナー選択の選択基準は、脳死、１２歳～５５歳の年齢、非敗血症、および疾患と病原体がないことであった。３人の健康な志願者の実際の生体ドナーから吸引されたＢＭは、Ｌｏｎｚａ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から購入された。２継代で凍結保存された拡張生体ドナーＭＳＣは、Ｌｏｎｚａから購入された。関連するドナーの特徴は表１に提示される。

死亡したドナーの組織調達および運送
以前に開発された臨床回収法［１６、２５］は、ジョンズホプキンス大学で進行するＶＣＡ移植免疫寛容臨床試験（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ０１４５９１０７）後の経験と組み合わされて、調達および運送プロトコルの基礎を形成した。合理化された臓器調達機関（ＯＰＯ）の回収手順は、専用キットおよび回収と出荷手順に関する集中トレーと組み合わせて、使用された。回収された硬骨は、Ｏｓｓｉｕｍ Ｈｅａｌｔｈ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）に出荷された。脊椎セクションは、６つの異なるＯＰＯパートナーによって調達された：Ｇｉｆｔ ｏｆ Ｈｏｐｅ（Ｉｔａｓｃａ，ＩＬ）；Ｄｏｎｏｒ Ａｌｌｉａｎｃｅ（Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ）；Ｉｏｗａ Ｄｏｎｏｒ Ｎｅｔｗｏｒｋ（Ｎｏｒｔｈ Ｌｉｂｅｒｔｙ，ＩＡ）；Ｍｉｄ Ａｍｅｒｉｃａ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）；および Ｎｅｖａｄａ Ｄｏｎｏｒ Ｎｅｔｗｏｒｋ（Ｌａｓ Ｖｅｇａｓ，ＮＶ）。骨は、研究に同意した臓器および組織ドナーからのＩＲＢ承認プロトコル下で、オステオトームおよびマレットを使用してＯＰＯ職員によって回収された。回収された骨は、輸送中の水分保持を確保するために、生理食塩水に浸したラップスポンジとタオルで包まれた。包まれた検体は、２つの処理設備のうちの１つに湿った氷の上で一晩出荷された。

手動創面切除
受け取りの後、生物学的安全キャビネットで、メスとガウジを使用して軟組織は手動で創面切除した。一度見えたら、椎弓根を、組織処理バンドソーまたはＳｔｒｙｋｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ ６ Ｓａｗ（Ｓｔｒｙｋｅｒ、Ｋａｌａｍａｚｏｏ，ＭＩ）のいずれかを使用して取り除き、接続された椎体のみを残した。椎体を分離し、椎間板と軟組織をメスで除去した。創面切除プロセス全体を通して低酸素海綿骨を保存および保護するために、皮質骨が破壊されないように注意を払った。

カスタムメイドの外科用グレードのステンレス鋼アンビル鋏を使用して、ＶＢを骨挽き器で断片化するのに十分小さい約５ｃｍ^３の断片に切断した。断片を直ちに、２．５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ ＵＳＡ Ｉｎｃ．、Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ）、３Ｕ／ｍｌのベンゾナーゼ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）、および１０ Ｕ／ｍｌのヘパリン（ＭｃＫｅｓｓｏｎ、Ｉｒｖｉｎｇ，ＴＸ）を含むＰｌａｓｍａ－ＬｙｔｅＡ ｐＨ７．４（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）で構成される５００ｍＬの処理培地に沈めた。

粉砕と溶出
硬骨粉砕機（ＢｉｏｒｅｐＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ。Ｉｎｃ、Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）を生物学的安全キャビネットに組み立てた。約２５０ｍＬの新鮮な処理培地を含む２リットルのステンレス鋼ビーカーを、骨破片と培地の流れを受け取るために粉砕ヘッドの下に置いた。ステンレス鋼プランジャーを、粉砕機を通して破片を押すことを援助するために使用した。処理培地で粉砕機をすすぐことで、骨片が乾燥してチャンバーに付着することを防いだ。すべての骨片が粉砕されたら、チャンバーを新しい処理培地で完全にすすいだ。ステンレス鋼ビーカー中の最終量は１リットルであった。

ろ過を、柔軟なプレフィルターおよびインラインフィルターを備えた骨髄採取キット（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ，Ｌａｋｅ Ｚｕｒｉｃｈ，ＩＬ）を使用して実施した。すべての硬骨粉砕および培地を、骨髄採取キットに注意深く転写した。粉砕物からの最適な細胞放出を可能にするために、粉砕物を穏やかにマッサージした。その後、培地を２つの５００μｍフィルターおよび２つの２００のμｍフィルターを使用して濾過した。硬骨粉砕は洗浄水液体媒体を用いる２つの５００ｍＬの洗液を使用してすすがれる。骨の粉砕物を、すすぎ培地での２回の５００ｍＬ洗浄を使用してすすいでいる。洗浄水培地は２．５％のＨＳＡを用いるＰｌａｓｍａ－ｌｙｔｅであった。その後、すべての骨髄をサンプルが実験のために採取された収集バッグに収集した。

ＭＳＣ単離のための消化プロトコル
骨片（１または１００ｇ）を、５０ｍｌの円錐形状遠心管、または２５０ｍｌのＷｈｉｒｌＰａｋバッグのいずれかに転写した。ＤＥ１０コラゲナーゼの溶液（２ｍｇ／ｍｌ；Ｖｉｔａｃｙｔｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を、５：１（容積：重量）の比率で骨片に添加した。管および／またはバッグを、振盪培養器に転写し、１２５ｒｐｍで震動しながら３７°Ｃで２時間インキュベートした。プロテアーゼ活性は２％添加することにより中和された、Ｓｔｅｍｕｌａｔｅ（コックＲｅｇｅｎｔｅｃ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）および懸濁液は、５０ｍｌの円錐形スクリューキャップ管の中への７０μｍのキャップフィルターを通って濾過された。プロテアーゼ活性を２％Ｓｔｅｍｕｌａｔｅ（Ｃｏｏｋ Ｒｅｇｅｎｔｅｃ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を添加して中和し、および懸濁液を７０μｍのキャップフィルターで５０ｍｌ円錐形状スクリューキャップ管にろ過した。フィルターに保持された骨片は、もとの濾液と結合したヘパリン（１０Ｕ／ｍｌ）およびＢｅｎｚｏｎａｓｅ（１００のＵ／ｍｌ）を含有している、２５ｍｌのダルベッコの修飾されたリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）溶液は用いて洗われた。フィルターに保持された骨片を、元のろ液と組み合わせた、ヘパリン（１０Ｕ／ｍｌ）とベンゾナーゼ（１００Ｕ／ｍｌ）を含む２５ｍｌのダルベッコ修飾リン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）溶液で洗浄した。管を５分間３５０ｘｇで遠心分離機にかけ、上澄みを吸引し、およびペレットを１０ｍｌのＤＰＢＳに再懸濁した。その懸濁液を、５分間３５０ｘｇで再び遠心分離機にかけ、上澄みを吸引し、ペレットを分析のためにＤＰＢＳに再懸濁した。

腸骨およびＶＢＢＭからのＭＳＣの分離
腸濃縮で溶離させられたＢＭの１ｍｌの一定分量は４９ｍｌのＤＰＢＳと共に５０ｍｌの円錐形のバイアルへ削除され分注された。濃縮され溶出されたＢＭの１ｍｌアリコートを取り出し、４９ｍｌのＤＰＢＳとともに５０ｍｌの円錐形状バイアルにピペットで移した。バイアルを１０分間３００ｘｇで遠心分離機にかけ、上澄みを吸引し、およびペレットを１０ｍｌのＲｏｏｓｔｅｒ－Ｎｏｕｒｉｓｈ ｍｅｄｉｕｍ（Ｒｏｏｓｔｅｒ Ｂｉｏ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）に再懸濁した。下記に記載されているように、細胞を数え、培養した。

細胞計数
Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ｖｉｓｉｏｎ（Ｎｅｘｃｅｌｌｏｍ，Ｌａｗｒｅｎｃｅ，ＭＡ）を、総生細胞数を決定するために使用した。２０μｌのＶｉａＳｔａｉｎ ＡＯＰＩ試薬（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ）を、２０μｌの細胞を含有しているＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管に添加した。混合した後、２０μｌの溶液をＣｅｌｌｏｍｅｔｅｒスライドに加え、全細胞、生細胞、および生存率を計算した。

細胞培養
新鮮な細胞を、Ｒｏｏｓｔｅｒ－Ｎｏｕｒｉｓｈ ｍｅｄｉｕｍ（Ｒｏｏｓｔｅｒ Ｂｉｏ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）において２５，０００生存細胞／ｃｍ^２の密度でＣｅｌｌＢＩＮＤ(登録商標)Ｔ－２２５フラスコに播種した。非接着細胞を１日目の第１の培地交換の後に除去した。その後、コロニーが約８０－９０％融合性になるまで、培地を３－４日毎に交換した。細胞をＴｒｙｐＬＥ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｅｉｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で遊離させた。継代した細胞を３，０００細胞／ｃｍ^２の密度で播種したが、それ以外は新たに播種した細胞と同じプロトコルに従った。

3人のドナー（ＤＤ５、ＤＤ６、およびＤＤ７）のＭＣＢの生成を、ＣｅｌｌＢｉｎｄＲ Ｈｙｐｅｒｆｌａｓｋｓにおいて実施した。新鮮な一次消化物を、最初に上記のように２５，０００生細胞／ｃｍ^２で播種した。細胞をＴｒｙｐＬＥで遊離させ、ＭＣＢを形成するためにもう１つの継代を拡張した。継代１細胞の大部分を凍結保存培地（ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０；ＢｉｏＬｉｆｅ溶液、Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ）に再懸濁し、液体窒素の気相に保存した。

細胞を、ＤＭＥＭ（Ｃａｔ＃１０５６７０１４、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、アメリカ）、アスコルビン酸（２４８ｍＭ； Ｃａｔ＃ Ａ２２１８、Ｓｉｇｍａ、アメリカ）、組み換え塩基性線維芽細胞増殖因子（１０ｎｇ／ｍｌ； Ｃａｔ＃２３３－ＧＭ Ｐ－０２５、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、アメリカ）と組み換え上皮成長因子（１０ｎｇ／ｍｌ； Ｃａｔ＃２３６－ＧＭＰ－２００、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、アメリカ）からなる培地中で最大１０回継代した。７０~８０％の密集度の細胞を採収し、総細胞数を取得した。細胞の一部を、６ウェルプレートの３つのウェルに３０００細胞／ｃｍ^２で再播種し、培地を３~４日ごとに交換した。

フローサイトメトリーによるＭＳＣの表現型分析
２、３、４継代では、１．８μｌの以下の単一蛍光標識抗体または色素、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、Ｓｔｒｏ－１、および７ＡＡＤ（補足表Ｓ１）を、９６ウェルＶ底プレートの異なるウェルに添加した。１００ｍＩのＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏＴｅｃ）緩衝液および１００μｌの細胞（２００，０００の細胞）を、抗体を含有する各々のウェルに添加した。プレートを４℃で３０分間遮光してインキュベートし、その後、プレートを３００ｘｇで５分間遠心分離した。細胞を洗浄し、２００μｌのＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＮｏｖｏＣｙｔｅ ２０６０Ｒフローサイトメーターをデータ収集に使用し、ＮｏｖｏＥｘｐｒｅｓｓソフトウェア（Ａｃｅａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用してデータを分析した。

ＭＳＣの三系統分化
継代１後のＭＳＣを、軟骨形成、脂肪生成、および骨形成分化のために、それぞれ８．０ｘ１０^４、４．０ｘ１０^４、および２．０ｘ１０^４の３ｍｌのＭｅｓｅｎｃｕｌｔ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｂ．Ｃ．）を含む１２ウェルプレートのウェルに播種した。４．０ｘ１０^４のＭＳＣを含むウェルも対照として播種した。２時間インキュベートした後、軟骨形成ウェルのＭｅｓｅｎｃｕｌｔをＳｔｅｍＰｒｏ軟骨形成培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に取り替えた。１日後、脂肪生成ウェルと骨形成ウェルのＭｅｓｅｎｃｕｌｔを吸引し、それぞれＳｔｅｍＰｒｏ脂肪生成培地とＳｔｅｍＰｒｏ骨形成培地に取り替えた。それぞれの分化培地を、３日ごとに補充し、対照ウェルにはＭｅｓｅｎｃｕｌｔを補充した。１４、１２、および１６日後、それぞれ軟骨細胞、脂肪細胞、および骨細胞を含むウェルをそれぞれ、培地から吸引し、ＤＰＢＳで２回洗浄し、４％ホルマリンで３０分間固定し、ＤＰＢＳで１回洗浄し、染色した。０．１Ｎ ＨＣｌにおける軟骨細胞プロテオグリカンを青色に染色するアルシアンブルーを軟骨細胞ウェルに３０分間添加し、染色液を吸引し、ウェルを０．１ Ｎ ＨＣｌで３回洗浄し、蒸留水で中和し、および軟骨細胞を倒立光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）で可視化した。脂肪細胞の脂肪球を赤く染色するオイルレッドＯを脂肪細胞ウェルに１５分間添加し、染色液を吸引し、ウェルを蒸留水で３回洗浄し、脂肪細胞を倒立光学顕微鏡で可視化した。骨細胞のカルシウム沈着物を赤く染色する２％アリザリンレッドを骨細胞ウェルに３分間添加し、染色液を吸引し、ウェルを蒸留水で３回洗浄し、脂肪細胞を倒立光学顕微鏡で可視化した。すべての分化した細胞を、色と表現型プロファイルの視覚化によって定性的に分析した。

集団倍加時間
集団倍加時間を以下の式の使用によって各継代で決定した：
ｔ^＊ｌｏｇ（２）／ｌｏｇ（Ｔ_１／Ｔ_０）、ここで、ｔが一次播種と９０％の培養密臭度での細胞採収との間の時間（時間）であり、Ｔ_１は採収の細胞数であり、およびＴ_０は播種での初期計算である。

ＣＦＵ－Ｆアッセイ
新たに消化された細胞については、５ｍｌのＭｅｓｅｎｃｕｌｔ、２０μｌのアンホテリシンＢ、および１００μｌのゲンタマイシンを６ウェルプレートの３つのウェルに添加した。２．５ｘ１０^５、５．０ｘ１０^５と７．５ｘ１０^５細胞をそれぞれ、第１のウェル、第２のウェルおよび第３のウェルに添加した。コロニーが９０％融合性になるまで、または最大１２日間、プレートをインキュベータに入れた。培地を３～４日ごとに１４日間交換した。プレートをＤＰＢＳで２回洗浄し、２ｍｌのメタノールを各皿に５分間添加して細胞を固定した。５分後、メタノールをデカントし、プレートを空気乾燥させ、コロニーを１％クリスタルバイオレット溶液で染色した。〉５０の細胞を含有しているコロニーを記録した。継代された細胞を、細胞が３２細胞／ｃｍ^２、６５細胞／ｃｍ^２、および１２５細胞／ｃｍ^２の密度で播種されたこと以外、同様にアッセイした。

Ｔ細胞抑制アッセイ
Ｔ細胞活性化の抑制を、以前に公開されたプロトコルに従って、わずかな変更を加えて実行した［２６］。簡単に説明すると、末梢血単核細胞をＦｉｃｏｌｌ（ＧＥ、Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）分離によって全血（１０ｍｌ）から分離し、ＤＰＢＳに再懸濁した。大半の細胞を、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で標識し、使用されるまで凍結させた［２１］。継代２または３のＭＳＣを、場合によって１００ｎｇ／ｍｌのインターフェロン－γ（ＩＦＮγ；ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）で１８～２４時間事前刺激させ、ＲｏｏｓｔｅｒＮｏｕｒｉｓｈ（ＲｏｏｓｔｅｒＢｉｏ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）に再懸濁し、４ｘ１０^５、１ｘ１０^５、５ｘ１０^４、２．５ｘ１０^４、１．５ｘ１０^４、５ｘ１０^３細胞／ウェルの量で９６ウェルフラット底のプレートに添加した。容積が２００μｌ／ウェルになるまで、ＲｏｏｓｔｅｒＮｏｕｒｉｓｈを各ウェルに添加した。プレートを、ＭＳＣが付随することを可能にするために少なくとも２時間５％の湿度の１０％のＣＯ_２を備えた３７°Ｃインキュベータに置かれた。プレートを、ＭＳＣを付着させるために、湿度５％でＣＯ_２１０％の３７°Ｃのインキュベータに少なくとも２時間入れた。凍結保存されたＰＢＭＣを迅速に解凍し、Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ； Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；１０％ＦＢＳ、１００ｐｇ／ｍｌのＰｅｎＳｔｒｅｐ、２ｍＭのＬ－グルタミン、および１００μＭのβ－メルカプトエタノールが添加された）に４ｘ１０^６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。培地を、ＭＳＣを含むプレートから吸引し、および１００μｌのＰＢＭＣを、ＭＳＣを含むウェルのすべておよびＭＳＣを含まないウェルに添加した。ＭＳＣおよびＰＢＭＣを含む各ウェルに、４０μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で補足された１００μｌのＥＭＥＭを添加することによってＴ細胞を刺激させた。標識されているＰＢＭＣと標識されていないＰＢＭＣを含有している対照部ウェルも含まれており、その半分は、ＰＨＡで刺激され、あとの半分は刺激されてなかった。プレートをインキュベータに戻した。４日後、各ウェルからＰＢＭＣを取り出し、フローサイトメトリーを実行する前に、５μｌのＣＤ３－ＰＥおよび５μｌの７ＡＡＤで標識した。

統計
ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍバージョン８を統計分析（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ Ｔｅｓｔ）に使用した。＜０．０５のＰ値を、有意とみなした。

結果
軟組織を除去し、ＶＢを分離し、約１．５ｃｍ^３のサイズに断片化する前と後の典型的な脊柱（典型的にＴ８－Ｌ５）は、図１に示される。プラスチック接着ｖＢＡ－ＭＳＣは、培養において典型的な紡錘形の形態を有していた（図１Ｄ）。ドナーからの細胞を継代４で拡張し（初期播種は継代０と見なされた）、フローサイトメトリーでアッセイした。１~４継代のｖＢＡ－ＭＳＣは、取るに足りないレベルの造血幹細胞および前駆細胞表面マーカーＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、およびＣＤ４５を有し、少量から存在しない量のヒト白血球抗原ＤＲ（ＨＬＡ－ＤＲ）を発現した（図２Ａ）。ＰＥＣＡＭ１（ＣＤ３１）発現細胞（典型的に内皮細胞および単球）のレベルも２継代で低かった（＜７％）（データは示されていない）。反対に、継代されたｖＢＡ－ＭＳＣは、ＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５に対して均一に陽性であった。したがって、ｖＢＡ－ＭＳｃは、特徴的なＭＳＣ表面マーカープロフィールを有する［２８］。さらに、集団の可変部分（継代数に応じて約２０％以下）も多能性ＭＳＣ表面マーカーＳｔｒｏ－１を発現した［２９－３２］。

継代３ｖＢＡ－ＭＳＣの軟骨形成、脂肪生成および骨形成の可能性が各ドナーについて決定された。ｖＢＡ－ＭＳＣ分離物の各々は、軟骨細胞、脂肪細胞、および骨細胞に分化する可能性を実証した（図２Ｂ）。新たに単離された（すなわち、播種されていない）および継代されたｖＢＡ－ＭＳＣの両方の部分は、コロニー形成単位線維芽細胞（ＣＦＵ－Ｆ）の可能性によって決定されるように、高度のクローン増殖を実証した。新たに消化されたＶＢ骨断片の平均ＣＦＵ－Ｆ頻度は、０．０１±０．００４％（平均＋標準偏差）であり、これはＢＭ全体の増殖性ＭＳＣの頻度と同様である（図３）［７］。増殖細胞は細胞培養で維持され、１回および２回の継代後にそれぞれ３７±３．４％および２７±１．２％の頻度でコロニーを形成した。

Ｔ細胞活性化の抑制は、ＭＳＣの最もよく研究されている治療特性の１つであり、炎症性障害の臨床試験での試験の理論的根拠を提供する［３３、３４］。3人の異なるドナーからのｖＢＡ－ＭＳＣは、ＰＨＡによるＴ細胞の活性化を用量依存的に抑制した（図４）。ｖＢＡ－ＭＳＣと末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）との比率が１：１の場合の最大抑制は、８９±７％であった。すべての比率で抑制のわずかではあるが有意ではない増加は、抑制試験を実施する前に、ｖＢＡ－ＭＳＣをＩＦＮ－γで１８~２４時間前処理することによって観察された。ＩＦＮ－γによる処置は、ＭＳＣの抑制機能を刺激し、老化細胞への影響を増強することが示されている［１２］。ＩＦＮ－γプライミングに対する増強された反応の不足は、培養されたｖＢＡ－ＭＳＣが完全な免疫調節能力を保持していることを示している。

プラスチック接着ｖＢＡ－ＭＳＣの免疫表現型プロフィール、三系統分化能、ＣＦＵ－Ｆポテンシャル、および免疫調節特性により、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（ＩＳＣＴ）が発表したガイダンスによるこれらの細胞のＭＳＣとしての分類が確認される［２８］。ＢＭから得られたＭＳＣとの同等性をさらに確立するために、ｖＢＡ－ＭＳＣと中央ＢＭから分離されたＭＳＣとの比較が行われた（図５および図６）。２継代で凍結保存された市販の以前に拡張されたライブドナーＢＭ－ＭＳＣ（Ｅｘ ＬＤ ＢＭ－ＭＳＣ）および、ライブドナー吸引ＢＭから新たに単離されたＭＳＣ（ＬＤ ＢＭ－ＭＳＣ）の両方を使用した。さらに、死亡したドナーＶＢ ＢＭから分離されたＭＳＣ（ＤＤ ｖＢＭ－ＭＳＣ）も比較に含まれた。各ソースの３人のドナーからのＭＳＣは、継代２に拡張され、凍結保存された。後の融解に際して、細胞は、質量スペクトル分析を実施する前に以前に継代された。すべての４つのソースからのＭＳＣは、本質的に同一の免疫表現型細胞表面マーカープロフィールを示し、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、およびＨＬＡ－ＤＲを発現する細胞の数は非常に少なく、逆に、ほぼすべての細胞がＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５を発現した（図５Ａ）。

各ソースからのＭＳＣは、５継代（調査した最長期間）を通じて培養で急速に増殖し、４継代と５継代での集団倍加時間（ＰＤＴ）に差はなかった（図５ＣおよびＤ）。継代２まで事前に拡張して取得されたＥｘＬＤ ＢＭ－ＭＳＣは、他の３つのＭＳＣ集団よりも継代３で有意に高いＰＤＴを示した（図５Ｂ）。継代２Ｅｘ ＬＤ ＢＭ－ＭＳＣのＣＦＵ－Ｆポテンシャルも、他のＭＳＣ集団よりも大幅に低かった（図５Ｅ）。その後の継代は、ＣＦＵ－Ｆポテンシャルについて比較されなかった。最後に、三系統の分化能を比較したところ、各ＭＳＣ集団は、インビトロ脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞を質的に同じ頻度で形成していることが確認された（図６）。

ｖＢＡ－ＭＳＣの潜在的な臨床翻訳の有用性は、パイロット規模の製造実行を実行して、個々のドナーからの多数の細胞のバンキングおよび拡張の実現可能性を調べることによって評価された。3人の異なるドナーのＶＢの断片はｖＢＡ－ＭＳＣを単離するために消化された。量（１００ｇ）は、一般的なドナーから得られるＶＢ骨片の総重量の約３分の１に相当する。平均２．９ｘ１０^８±１．３５ｘ１０^８のｖＢＡ－ＭＳＣを含む、各ドナーからの継代１のＭＣＢを調製し、バルクを凍結保存し、残りを複数の継代で培養し、各継代での総細胞収量を追跡した（図７Ａ）。継代１はＭＣＢに最適であると見なされ、後の継代と本質的に同じ表面メーカープロファイルとＣＦＵ－Ｆポテンシャルを示した（図２および図３）。継代２への１回のさらなる拡張は、５．１７ｘ１０^９±４．３ｘ１０^９ｖＢＡ－ＭＳＣを含むＷＣＢを生成するために十分であった。観察された集団倍加に基づいて、ＷＣＢ全体の２つの拡張は、１兆個を超える細胞を製造するために十分であった。ＰＤＴは、継代数の上限で成長率が低下していることを示すことなく、継代２と９の間でほぼ一定のままであった。しかし、ドナーの間でＰＤＴに違いがあった（図７Ｂ）。２００万ｖＢＡ－ＭＳＣのシードストックから開始して、各ドナーで観察されたＰＤＴに基づいて、３人の異なるドナーから１兆個の細胞を製造するには、２３日、３６日、および２９日を必要とするであろう。これらの時間は、２次元組織培養フラスコを使用して計算されたものであり、バイオリアクターによって異なる可能性がある。

議論
多種多様な医学的障害を処置するためのＭＳＣの変革の可能性は、１０年以上にわたって理想化されてきた；それでも、前臨床および初期段階の臨床試験でこの可能性が数多く実証されているにもかかわらず、ＭＳＣベースの治療法は後期段階、登録（通常は米国では段階３）の臨床試験で成功を収めていないが、少数は比較的小さな管轄区域で限定的な適応症のために承認された。複数の事業体による激しい開発努力にもかかわらず、承認の進展が遅く、その結果として治療用ＭＳＣが商業化される理由は、確かに多因子的である。後から考えると、非常に成功したバイオ医薬品セクターのプロセスと手順を採用することでＭＳＣを大規模に製造しようとする試みが、一因となった可能性がある［３５、３６］。細胞由来の製品の製造と細胞自体の製造との間に多くの違いがある。バイオ医薬品は、ほぼ無制限に拡張する能力を有する不死化細胞株を使用して製造されており、単一のシードストックから大きなＭＣＢを生成することができる。逆に、ＭＳＣの限られた有効性および拡張の可能性は、不釣り合いに高い製造コストと規制上の負担で、毎年異なるドナーから複数のＭＣＢの生成を必要とする［３６］。

ここでは、死亡したドナーの椎骨からのＭＳＣの大規模なデポの識別と特性評価を通じて、これらの負担を軽減するための実行可能なソリューションを紹介する。ここに示された分析に基づいて、ｖＢＡ－ＭＳＣは、表現型および機能的に、中央ＢＭから取得したＭＳＣと同等である。細胞は典型的なＭＳＣマーカー（ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５）を発現し、造血幹細胞および前駆細胞マーカーの発現を欠き、非常に低レベルのＨＬＡクラスＩＩタンパク質を発現する（図２および図５Ａ）。ＢＭ－ＭＳＣと同様に、ｖＢＡ－ＭＳＣはクローン的に拡張する可能性があり、三系統の分化を誘導することができる（図２、３、５、および６）。継代されたｖＢＡ－ＭＳＣは、Ｔ細胞の活性化を抑制するのに完全に適合しており、ＩＦＮ－γによる以前の刺激との活性に違いがないことを示している（図４）。商業的ソースから得られた継代３（しかし、後の継代ではない）拡張したＢＭ－ＭＳＣのＰＤＴとＣＦＵ－Ｆの違いは、継代２での凍結保存からの回復が遅いことを反映している可能性が高い（図５Ｂ）。すべてのＭＳＣは継代２まで増殖させ、比較可能性を維持するために凍結保存した；しかし、拡張したＢＭ－ＭＳＣの商業的ソースは、別の培地で培養され、別の凍結保存培地で凍結された可能性がある。したがって、細胞は、その後の継代では明らかではなかった継代３への解凍および成長の遅延を経験した。

平均２．４ｘ１０^８のＭＳＣの細胞バンクサイズは、３人のドナーのそれぞれからの消化されたＶＢ骨断片１００ｇから取得可能であって（図７Ａ）。各バンクは、集団倍加時間を大幅に短縮することなく、合計９つの継代を通じて拡張された（図７Ｂ）。９つの継代による各ドナーの完全な拡張による理論的収量は、４ｘ１０^１９（４０千兆）細胞であり、平均７０ｋｇの患者の１０^６／ｋｇで５，０００億回以上の投与量に相当する。必然的に、実際の総細胞収量は、大規模製造に固有の非効率性および試験の要件のために低くなり；それにもかかわらず、単一のドナーからの大規模なバッチの生産のＣＯＧは、複数のドナーからの同等の規模の製造の場合よりもはるかに少ない可能性がある。直接製造コストの節約は、すべての製造キャンペーンに単一のドナーソースを使用することによる規制上の負担の軽減に加えられる。ｖＢＡ－ＭＳＣによる潜在的なコスト削減を検証する次のステップは、現在進行中のスケールアップされた製造実行を実行することである。

現在、なぜＭＳＣの一部の集団が簡単に移動したり、ＢＭ内で自由に浮遊したりする一方で、他の集団は骨／結合組織マトリックスにしっかりと接着したままであり、酵素消化によってのみ遊離できるのか、という問題を調査している。差異が存在する場合、それらの決定はこれらの細胞の頻度が比較的低いため複雑であり、表現型および機能の変化を誘発する培養で最初に拡張することなく、フローサイトメトリーなどの一般的な分析ツールを使用して特徴付けることが問題になる［３７－４５］。以前のある報告では、骨盤領域骨梁の新たに単離された酵素消化物には、吸引されたＢＭよりも１５倍高いＣＦＵ－Ｆが含まれていることが確認された［２４］；しかし、新たに単離したｖＢＡ－ＭＳＣとＢＭ－ＭＳＣとの間に同様の違いは確認されなかった。集団間の非類似性がある場合、それをよりよく理解するために、ｖＢＡ－ＭＳＣトランスクリプトームの単一細胞ＲＮＡ配列決定（ｓｃＲＮＡ－Ｓｅｑ）を追求している［４６、４７］。さらに、これらの細胞によって生成されるセクレトームと細胞外小胞を研究することにより、ｖＢＡ－ＭＳＣの治療可能性を特徴付け続けている。

要約すると、ここに提示されたデータに基づいて、ｖＢＡ－ＭＳＣの基本的な性質は吸引されたＢＭ－ＭＳＣと異なるようには見えない；したがって、これらの細胞は、製造コストと規制コストを大幅に節約しながら、治療用途にシームレスに置き換えることができる可能性がある。さらに、多数のＭＳＣを必要とする他の市場も、初代細胞の豊富なソースから利益を得る可能性がある。これらは、組織工学およびエクソソームなどのＭＳＣに由来する製品の製造、ならびに生物医学研究用途および薬用化粧品およびバイオエンジニアリング材料の新たな用途を含む。これらの市場の各々は、今後数十年で大幅に成長し、これによって２０４０年までにＭＳＣの合計需要は年間１０兆（１ｘ１０^２１）細胞を超えると予想される［２］。これらの市場のすべてにおけるＭＳＣの将来の高い需要は、米国のみで毎年１０，０００人の臓器提供者とさらに４０，０００人の組織提供者からの骨を含む死亡したドナー骨髄腔の豊富で安定した供給から得られるｖＢＡ－ＭＳＣによって完全に満たされる可能性がある。

図面の説明
図１。ｖＢＡ－ＭＳＣを単離するために典型的な脊柱の処理。椎骨（典型的にＴ８－Ｌ５）から、椎体（ＶＢ）を分離し、椎間板および残りの軟組織（Ｂ）を除去する前に、軟組織（Ａ）を取り除く。ＶＢは、接着細胞を遊離させるための酵素消化の前に約１．５ｃｍ^３の断片（Ｃ）に粉砕される。プラスチック接着ｖＢＡ－ＭＳＣは、培養で典型的な紡錘形を形成する（Ｄ；継代２細胞）。

図２。ｖＢＡ－ＭＳＣの表面抗原表現型および三系統分化。（Ａ）３人の異なるドナー（ＤＤ１、ＤＤ２およびＤＤ２３；表１）からの継代１、２、３および４のｖＢＡ－ＭＳＣを、蛍光標識抗体およびフローサイトメトリーを使用して表面抗原発現について分析した。各継代の培養した後の細胞の割合（側方散乱および前方散乱を使用して細胞全体でゲート制御）が示されている。（Ｂ）増殖培地（Ｂ－Ａ）で増殖した、あるいは（Ｂ－Ｂ）軟骨形成、（Ｂ－Ｃ）脂肪生成、または（Ｂ－Ｄ）骨形成のいずれかを受けるように誘導された継代３ｖＢＡ－ＭＳＣを、材料と方法で説明されているように、軟骨細胞（アルシアンブルー）、脂肪細胞（オイルレッドＯ）、または骨細胞（アリザリンレッド）の染色後に画像化した。画像は、3人の異なるドナー由来のｖＢＡ－ＭＳＣの結果を表している。すべては２０Ｘの拡大である。

図３。３人の異なるドナー（ＤＤ１、ＤＤ２およびＤＤ３；表１）から分離され、消化による分離直後（新鮮）、または１、または２継代後（Ｐ１およびＰ２）に播種されたｖＢＡ－ＭＳＣのコロニー形成単位線維芽細胞（ＣＦＵ－Ｆ）のポテンシャル。３人のドナーのそれぞれからの５ｘ１０^５（新鮮）、または６２４（継代された）の全細胞を６ウェルプレートの３つのウェルに播種し、３~４日ごとに培地を交換しながら１４日間インキュベートした。

図４。Ｔ細胞活性化のｖＢＡ－ＭＳＣ抑制。（Ａ）ＰＢＭＣとｖＢＡ－ＭＳＣの比率が減少する場合の抑制。単一のドナーの血液から分離されたＰＢＭＣは、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＳＦＥ）で標識された。ｖＢＡ－ＭＳＣを、９６ウェルプレートに２時間接着させた後、洗浄し、４ｘ１０^５のＰＢＭＣを添加した。いくつかの実験では、ＩＦＮ－γ（１００ｎｇ／ｍｌ）は、ＰＢＭＣを添加する１８－２４時間前に添加された。Ｔ細胞をＰＨＡで４日間刺激した。細胞をプレートから回収し、抗ＣＤ３－ＰＥ抗体で標識した後、フローサイトメトリーで分析した。活性化Ｔ細胞の割合がプロットされる。（Ｂ）ＰＨＡ活性化なしおよびＰＨＡ活性化ありのＰＢＭＣ単独、ならびにＰＨＡ活性化後のＰＢＭＣおよびＭＳＣの代表的なフロープロットが示されている。各データポイントは、３人の異なるドナー（ＤＤ１、ＤＤ２、およびＤＤ３）を使用した３つの異なる実験の平均を表す。エラーバーは標準偏差を表す。すべてのＰＢＭＣの比較のためＰ＞０．０５：ｖＢＡ－ＭＳＣ比率＋／－ＩＦＮ－γ。

図５。死亡したドナーの椎体ＢＭおよび生きているドナーの腸骨稜から吸引されたＢＭから単離されたＭＳＣに対するｖＢＡ－ＭＳＣの比較。（Ａ）継代３細胞の表面マーカー発現はフローサイトメトリーによって特徴づけられた。ＭＳＣの異なるソースは：死亡したドナーｖＢＡ－ＭＳＣ（ＤＤ ｖＢＡ－ＭＳＣ）；死亡したドナーの椎体骨髄由来ＭＳＣ（ＤＤ ＢＭ－ＭＳＣ）；生体ドナーから吸引されたＢＭ ＭＳＣ（ＬＤ ＢＭ－ＭＳＣ）；および、２継代で商業的ソースから取得された生体ドナーから吸引されたＢＭ、ＭＳＣ（ＬＤ Ｅｘ ＢＭ－ＭＳＣ）であった。異物をゲートアウトした後の全集団内の細胞の割合が示される。細胞型間の表面マーカー発現に違いはなかった。（Ｂ－Ｄ）継代２～３（Ｂ）、３～４（Ｃ）、および４～５（Ｄ）の集団倍加時間（ＰＤＴ）の比較。ＬＤ Ｅｘ ＢＭ－ＭＳＣは、ｖＢＡ－ＭＳＣおよびＬＤ ＢＭ－ＭＳＣのいずれよりも、継代２と３の間で大幅に（^＊、Ｐ＜０．０５）低速になった。ＰＤＴの差は後の２つの通路で観察されなかった。その後の２継代では、ＰＤＴの差は観察されなかった。（Ｅ）ＣＦＵ－Ｆアッセイは、継代された細胞のために図３に記載されているように実施された。ＣＦＵ－Ｆの形成は、継代２のＬＤ ＥｘＢＭ－ＭＳＣで、他の３つのＭＳＣソースと比較して大幅に低かった（^＊、Ｐ＜０．０５）。各棒は、各ＭＳＣソースの３人のドナーからの平均＋／-ｓｄを表す。特定のドナーは：ＬＤ ＢＭ－ＭＳＣ（ドナーＬＤ１、ＬＤ２とＬＤ３）；ＬＤ ＥｘＢＭ－ＭＳＣ（ドナーＬＤ４、ＬＤ５とＬＤ６）；ｖＢＭ－ＭＳＣおよびｖＢＡ－ＭＳＣ（ドナーＤＤ１、ＤＤ２とＤＤ３）であった。ドナーの特性を表１に示す。

図６。死亡したドナーの椎体ＢＭおよび生体ドナーの腸骨稜から吸引されたＢＭから単離されたｖＢＡ－ＭＳＣおよびＭＳＣの三系統分化。図２に示されるように、細胞を培養し、細胞型ごとに分化するように誘導した。４つのソースのいずれかからの継代３細胞の脂肪生成、軟骨形成、および骨形成の可能性のいずれにも質的な違いはなかった。画像は、ＭＳＣの各ソースに対する3人の異なるドナーの実験の代表である。拡大は各画像に示される。

図７。3人の異なるドナーのｖＢＡ－ＭＳＣの累積的な集団増加。３人のドナー（ＤＤ５、ＤＤ６、およびＤＤ７）からのＶＢの消化断片から取得されたｖＢＡ－ＭＳＣを分離し、継代１に拡張して、マスター細胞バンクを形成した。各ドナーの継代１ｖＢＡ－ＭＳＣの部分を、継代９に拡張した。（Ａ）３人のドナーからのｖＢＡ－ＭＳＣの各継代で観察されたおよび潜在的な累積成長収量。（Ｂ）継代０－９での累積的なｖＢＡ－ＭＳＣ集団倍加。集団倍加（ＰＤ）は、播種された細胞の初期数と、細胞を再播種する前に各プレートが８０％の密集度に達した後に回収された数に基づいて計算され、各継代後の理論的な総細胞収量を決定するために使用された。継代２~９での理論上の総収量は、各継代について計算されたＰＤをべき乗（基数２）し、先行する各継代からの累積細胞数を掛けることによって取得された。ドナーｖＢＡ－ＭＳＣはそれぞれ、継代ごとに３回ずつ播種された。各ウェルから取得された細胞数の間の変動係数（ＣＶ）は＜１５％であった。

図１

図２

図３

図４

図５

図６

図7

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２５．Ｇｏｒａｎｔｌａ，Ｖ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｔｏ ｉｓｏｌａｔｅ ｖｉａｂｌｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｖｅｒｔｅｂｒａｅ ｏｆ ｃａｄａｖｅｒｉｃ ｏｒｇａｎ ｄｏｎｏｒｓ ｆｏｒ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｏｒｇａｎ ｇｒａｆｔｉｎｇ．Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１２．１４（１）：ｐ．１０４－１３．
２６．Ｌｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｒｏｍａｌ Ｃｅｌｌ－Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ，２０１８．８（１）：ｐ．６８１６．
２７．Ｑｕａｈ，Ｂ．Ｊ．，Ｈ．Ｓ．Ｗａｒｒｅｎ，ａｎｄ Ｃ．Ｒ．Ｐａｒｉｓｈ，Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅ ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ，２００７．２（９）：ｐ．２０４９－５６．
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３０．Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｐ．Ｊ．ａｎｄ Ｂ．Ｔｏｒｏｋ－Ｓｔｏｒｂ，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｂｙ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＳＴＲＯ－１．Ｂｌｏｏｄ，１９９１．７８（１）：ｐ．５５－６２．
３１．Ｄｅｎｎｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＳＴＲＯ－１＋ ｍａｒｒｏｗ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｉｓ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ｃｅｌｌｓ Ｔｉｓｓｕｅｓ Ｏｒｇａｎｓ，２００２．１７０（２－３）：ｐ．７３－８２．
３２．Ｂｅｎｓｉｄｈｏｕｍ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｏｍｉｎｇ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｓｔｒｏ－１－ ｏｒ Ｓｔｒｏ－１＋ ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ＮＯＤ／ＳＣＩＤ ｍｏｕｓｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｏｌｅ ｉｎ ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ ＣＤ３４ ｃｅｌｌ ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ．Ｂｌｏｏｄ，２００４．１０３（９）：ｐ．３３１３－９．
３３．Ｇａｌｉｐｅａｕ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｎ ｉｍｍｕｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｃｙ ｒｅｌｅａｓｅ ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ ｆｏｒ ａｄｖａｎｃｅｄ ｐｈａｓｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ．Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１６．１８（２）：ｐ．１５１－９．
３４．Ｓｑｕｉｌｌａｒｏ，Ｔ．，Ｇ．Ｐｅｌｕｓｏ，ａｎｄ Ｕ．Ｇａｌｄｅｒｉｓｉ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ Ｗｉｔｈ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａｎ Ｕｐｄａｔｅ．Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２０１６．２５（５）：ｐ．８２９－４８．
３５．Ｇａｌｉｐｅａｕ，Ｊ．ａｎｄ Ｌ．Ｓｅｎｓｅｂｅ，Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｒｏｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２０１８．２２（６）：ｐ．８２４－８３３．
３６．Ｊｏｓｓｅｎ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｔ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｃａｌｅ：ｐｒｏｃｅｓｓ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１８．１０２（９）：ｐ．３９８１－３９９４．
３７．Ｂａｎｆｉ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ ａｇｉｎｇ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ，２００２．８（６）：ｐ．９０１－１０．
３８．Ｂａｘｔｅｒ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｅｌｏｍｅｒｅ ｌｅｎｇｔｈ ｒｅｖｅａｌｓ ｒａｐｉｄ ａｇｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２００４．２２（５）：ｐ．６７５－８２．
３９．Ｂｏｒｋ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ ｃｈａｎｇｅｓ ｕｐｏｎ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ａｇｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ．Ａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ，２０１０．９（１）：ｐ．５４－６３．
４０．Ｂｒｕｄｅｒ，Ｓ．Ｐ．，Ｎ．Ｊａｉｓｗａｌ，ａｎｄ Ｓ．Ｅ．Ｈａｙｎｅｓｗｏｒｔｈ，Ｇｒｏｗｔｈ ｋｉｎｅｔｉｃｓ，ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗａｌ，ａｎｄ ｔｈｅ ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｄｕｒｉｎｇ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｓｕｂｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９７．６４（２）：ｐ．２７８－９４．
４１．Ｄｉｇｉｒｏｌａｍｏ，Ｃ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ：ａ ｓｉｍｐｌｅ ｃｏｌｏｎｙ－ｆｏｒｍｉｎｇ ａｓｓａｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｇｒｅａｔｅｓｔ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｏ ｐｒｏｐａｇａｔｅ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ．Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ，１９９９．１０７（２）：ｐ．２７５－８１．
４２．Ｍｕｒａｇｌｉａ，Ａ．，Ｒ．Ｃａｎｃｅｄｄａ，ａｎｄ Ｒ．Ｑｕａｒｔｏ，Ｃｌｏｎａｌ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ａ ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｍｏｄｅｌ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ，２０００．１１３（ Ｐｔ ７）：ｐ．１１６１－６．
４３．Ｒｅｄａｅｌｌｉ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｍ ｃｙｔｏｇｅｎｏｍｉｃ ｔｏ ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃ ｐｒｏｆｉｌｅｓ：ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ，２０１２．３（６）：ｐ．４７．
４４．Ｍｏｒａｖｃｉｋｏｖａ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ Ｎａｔｉｖｅ Ｕｎｐａｓｓａｇｅｄ ａｎｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ－Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｒｏｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（ＭＳＣ）．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａ，２０１８．９３（９）：ｐ．８９４－９０４．
４５．Ｂａｒａ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｃｉｓｅ ｒｅｖｉｅｗ：Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｃｈａｎｇｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｕｌｔｕｒｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｂａｓｉｃ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２０１４．３２（７）：ｐ．１７１３－２３．
４６．Ｃｈｏｉ，Ｙ．Ｈ．ａｎｄ Ｊ．Ｋ．Ｋｉｍ，Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ Ｕｓｉｎｇ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ ＲＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌｓ，２０１９．４２（３）：ｐ．１８９－１９９．
４７．Ｈｗａｎｇ，Ｂ．，Ｊ．Ｈ．Ｌｅｅ，ａｎｄ Ｄ．Ｂａｎｇ，Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｐｉｐｅｌｉｎｅｓ．Ｅｘｐ Ｍｏｌ Ｍｅｄ，２０１８．５０（８）：ｐ．９６．

付録Ｂ
虚血時間と全身冷却の、死亡した臓器ドナーの骨髄から回収された造血幹細胞と前駆細胞の品質に対する関係性

Ｅｒｉｋ Ｊ． Ｗｏｏｄｓ， ＰｈＤ^{１，２，３＊}， Ａｕｂｒｅｙ Ｍ． Ｓｈｅｒｒｙ， ＭＳ^１，２， Ｊｏｈｎ Ｒ． Ｗｏｏｄｓ， ＰｈＤ^４， Ｊａｍｅｓ Ｈａｒｄｉｎ， ＰｈＤ^５， Ｍｉｃｈａｅｌ ＬａＦｏｎｔａｉｎｅ， ＰｈＤ^２， Ｇｅｒａｌｄ Ｂｒａｎｄａｃｈｅｒ， ＭＤ^６， Ｂｒｉａｎ Ｈ． Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ， ＰｈＤ^１，２

^１Ｏｓｓｉｕｍ Ｈｅａｌｔｈ， Ｉｎｃ． Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ， ＵＳＡ
^２Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｏｓｔｅｏｐａｔｈｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｍａｒｉａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ， ＵＳＡ
^３Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ， ＵＳＡ
^４Ｒｉｃｈａｒｄ Ｍ． Ｆａｉｒｂａｎｋｓ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ， Ｉｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ， ＵＳＡ
^５Ａｒｎｏｌｄ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｏｕｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ， Ｃｏｌｕｍｂｉａ， ＳＣ， ＵＳＡ
^６Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｌａｓｔｉｃ ａｎｄ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ Ｓｕｒｇｅｒｙ， Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， ＭＤ， ＵＳＡ

^＊住所・連絡先は以下の通り： Ｅｒｉｋ Ｊ． Ｗｏｏｄｓ， ＰｈＤ， ＨＣＬＤ（ＡＢＢ），Ｏｓｓｉｕｍ Ｈｅａｌｔｈ， Ｉｎｃ．， ５７５４ Ｗ． ７４^ｔｈ Ｓｔ．， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ， ４６２７８， ＵＳＡ．Ｅｍａｉｌ： Ｅｒｉｋ＠ＯｓｓｉｕｍＨｅａｌｔｈ．ｃｏｍ

Ｅｒｉｋ Ｊ． Ｗｏｏｄｓ， ＰｈＤ^{１，２，３＊}， Ａｕｂｒｅｙ Ｍ． Ｓｈｅｒｒｙ， ＭＳ^１，２， Ｊｏｈｎ Ｒ． Ｗｏｏｄｓ， ＰｈＤ^４， Ｊａｍｅｓ Ｈａｒｄｉｎ， ＰｈＤ^５， Ｍｉｃｈａｅｌ ＬａＦｏｎｔａｉｎｅ， ＰｈＤ^２， Ｇｅｒａｌｄ Ｂｒａｎｄａｃｈｅｒ， ＭＤ^６， Ｂｒｉａｎ Ｈ． Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ， ＰｈＤ^１，２

要約
死亡した臓器ドナーは、治療用の骨髄の未開発の供給源である。この骨髄は、生きているドナーから得られる骨髄の３～５倍の量を回収し、品質を検査し、凍結保存し、将来のオンデマンドで使用するために無期限にバンクに保管することができる。しかし、遺伝的に多様なスケールで構築された将来のＢＭバンクシステムの課題は、地理的に分散した場所で調達された骨が処理のために遠くの施設に輸送される際に必然的に発生する長期の虚血時間を管理することである。この研究の最終目的は、次の通りである：（ａ）現実的かつ十分な規模の調達・出荷条件の下で、虚血時間と献体由来の造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣｓ）の品質との関係を定量化すること、（ｂ）ＨＳＰＣの質に悪影響を及ぼす虚血時間の境界を特定こと、および、（ｃ）細胞の生存率と機能を維持するための方策としての全身冷却を検討すること、である。６２人のドナーから採取した骨を、さまざまな期間の温熱虚血時間（ＷＩＴ）、冷熱虚血時間（ＣＩＴ）、体冷却時間（ＢＣＴ）にさらして分析した。回収されたＨＳＰＣの生存率と機能に関連して、ＷＩＴ、ＣＩＴ、ＢＣＴの独立した関連性を定量化するために、回帰モデルを作成した。その結果、「現実の」のシナリオのもとで：（ａ）高品質なＨＳＰＣｓの回収に適した温熱虚血時間と冷熱虚血時間の組み合わせが容易に実現できる（例えば、８０～９０％の範囲のＣＤ３４＋の生存率が一般的に観察された）；（ｂ）骨の回収前に体を冷やすと、細胞の生存率が低下する（例えば、ＣＤ３４＋の生存率は、体を冷やした場合は７３％以下、冷やさない場合は８９％以上）；および、（ｃ）椎骨（ＶＢ）は、腸骨（ＩＬ）に比べて優れたＨＳＰＣｓの供給源である（例：ＶＢがソースの場合、％ＣＤ３４＋の生存率が８０％超であるのに対し、ＩＬがソースの場合は７４％未満であること）。我々の定量的モデルは、虚血時間の許容範囲やＨＳＰＣの品質基準を策定するために使用することができ、また、データに基づいた業界基準を制定しようとしている新興のＢＭバンクシステムに情報を提供することができる。

キーワード：死亡したドナーの骨髄、骨髄バンキング、骨髄虚血時間、造血幹細胞移植

はじめに
死亡したドナーの骨髄は、造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣｓ）の大量かつ未開発の供給源であり、将来の骨髄移植（ＢＭＴ）に必要に応じて冷凍保存やバンク化が可能である。ＢＭバンクの魅力は、一つには、例えば、原子力災害のような大規模災害が発生し、広範な骨髄不全が生じた場合など、需要が急増した際にＨＳＰＣを直ちに利用できるという認識に基づいている［１， ２］。最近、固形臓器や血管複合体移植（ＶＣＡ）を受けた患者に、ドナーのＢＭ細胞を注入して一過性の混合キメラを確立すること、および／または末梢の免疫修正を行なうとで、耐久性や操作性のある免疫寛容を誘導することの成功により、関心はさらに高まっている［３－５］。死亡した臓器ドナー由来のＢＭのバンクは、非人間の霊長類で成功した遅延プロトコルを使用した将来の寛容誘導手順のためのリポジトリを確立する［６、７］。

死亡した臓器ドナーからのＢＭを凍結保存してバンキングするには、臍帯血バンクと同様のコンセプトのＢＭバンクを設立する必要がある。臍帯血と同様に、ＢＭは凍結保存後も生物学的機能を維持しており、遺伝的に多様な、オンデマンドの幹細胞移植源として機能することがよく知られている［８－１１］。重要なことに、米国では５０年以上前から活動しているＯＰＯ（Ｏｒｇａｎ Ｐｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ：臓器調達機関）の全国ネットワークは、死亡したドナーから回収された骨組織を調達し、輸送するための十分に機能している既存のインフラを提供する。しかしながら、既存のＯＰＯインフラストラクチャーを利用する臓器ドナーＢＭ調達とバンキングの仕組みを組織することは、生物学的材料を回収して、臨床生産に適した規模のＢＭ細胞処理専門センターに安全に輸送することを含め、調和的な努力を必要とするだろう。

生きているＢＭドナーの場合にあまり重要視されなかった決定的な問題は、死亡したドナーから回収した骨の回収・出荷時にどうしても発生する虚血時間である。臨床生産システムを大規模化する前に、今後は、温冷虚血時間の違いが、地理的に分散した場所で回収され、中央の処理施設に長距離輸送された骨から得られたＨＳＰＣの品質にどのような影響を与えるかを明らかにする必要がある。また、温熱虚血と冷熱虚血の両方について、それらが許容範囲を超えた場合、ＨＳＰＣｓの品質と機能が治療に使用できないものになる可能性が高いため、許容範囲の上限を設定する必要がある。

さらに、死亡したドナーの骨の回収や出荷の際の全身冷却の影響についても、より深く理解する必要があります。米国の現行の組織バンクガイドラインでは、心停止から１２時間以内に遺体を冷蔵することを条件に、死亡したドナーから２４時間以内に組織を回収することが認められている［１２］。しかし、体の冷却は、ＢＭの回収に関連して体系的に調査されていない変数であり、組織の回収のために確立された基準とは異なる基準を必要とする可能性がある。

ここで、虚血時間および全身冷却と、死体の椎骨から回収したＨＳＰＣｓの品質との関連性を定量化した結果を初めて開示する。今回の分析では、死亡したドナーから回収した骨を回収後４０時間を超える累積時間にわたり温・冷虚血の状態に晒しても、生存率に悪影響を及ぼす体冷却を回避すれば、死亡したドナーから高品質で機能的なＨＳＰＣが得られることがわかった。これらの知見は、臓器提供者から得られたＢＭの温冷虚血時間の許容範囲やＨＳＰＣの品質許容基準を設定する上で有用である。

方法
研究設計
これは、虚血および体冷却時間が、死亡した臓器提供者のＢＭから回収されたＨＳＰＣｓの生存率と機能に及ぼす影響をモデル化するために設計された、実際的な観察的な実地研究である［１３］。この研究は、一般化され、日常的な実践の場で適用できる観察結果を生み出すように設計された。本研究では、通常の実地環境で活動している複数のＯＰＯに参加してもらうことで、外部妥当性（一般化可能性）を高めた。骨の回収と出荷の詳細に関する特別なトレーニング（下記参照）を除き、通常の調達条件が適用された。ＯＰＯは地理的に分散していたため、収集されたデータは「現実の」調達・出荷シナリオで見られる可能性のある虚血時間の全範囲をカバーしている。

ドナー組織の調達と輸送
ジョンズ・ホプキンス大学で実施中のＶＣＡ移植免疫寛容臨床試験（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ： ＮＣＴ０１４５９１０７）での経験をもとに、これまでに開発された臨床的な回収方法を、調達および輸送プロトコルの基礎とした［４，１４－１６］。しかし、これらのプロトコルは、幅広い地域で骨を回収・輸送しても機能的に生存するＨＳＰＣを安定して生産することを可能とするような形で複数のＯＰＯが確実に運用できるように最適化と検証を要求した。そのために、ＯＰＯの回収手順を合理化し、専用のキットを用意し、回収や出荷の手順について集中的なトレーニングを行った。回収された骨は、Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ， コロラド州 （施設 Ａ）またはＩｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，イリノイ州（施設 Ｂ）にある２つの処理施設のいずれかに輸送された。椎骨部分（施設ＡおよびＢ）および腸骨（施設Ａのみ）は６つのＯＰＯが調達した。Ｇｉｆｔ ｏｆ Ｈｏｐｅ （Ｉｔａｓｃａ， イリノイ州）；Ｄｏｎｏｒ Ａｌｌｉａｎｃｅ （Ｄｅｎｖｅｒ， コロラド州）；ｏｗａ Ｄｏｎｏｒ Ｎｅｔｗｏｒｋ （Ｎｏｒｔｈ Ｌｉｂｅｒｔｙ， アイオワ州）；Ｍｉｄ Ａｍｅｒｉｃａ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ （Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ミズーリ州）；ａｎｄ Ｎｅｖａｄａ Ｄｏｎｏｒ Ｎｅｔｗｏｒｋ （Ｌａｓ Ｖｅｇａｓ，ネバダ州）。骨はＯＰＯ職員がＩＲＢ認証済みのプロトコルに基づいて、研究同意を得た臓器・組織提供者からオステオトームとマレットを用いて回収された。未処理の骨は、生理食塩水に浸したラップスポンジやタオルで包み、出荷時の保湿性を確保するために３重に密封した袋に入れた。包まれた標本は、２つの処理施設のうちの１つにウェットアイシングされ一晩の間に出荷された。

手作業による創面切除
受け取った後、ＩＳＯ５のクリーンルーム（施設Ａ）または生物学的安全キャビネット（施設Ｂ）で、メスとグージを使って手作業で軟組織を剥離した。見えるようになると、組織処理用のバンドソーまたはＳｔｒｙｋｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ ６ Ｓａｗ（Ｓｔｒｙｋｅｒ， Ｋａｌａｍａｚｏｏ，ＭＩ）を使って、連結された椎体だけを残して椎弓根を除去した。骨切りナイフ（施設Ｂ）または組織加工用バンドソー（施設Ａ）を使って、椎間板のところで椎体を分離した。残った椎間板と軟部組織をメスで除去し、きれいに分離したＶＢを残した。腸骨の軟部組織は丸のみとメスで取り除いた。創面切除の全過程において、低酸素状態の海綿骨ＢＭを保存・保護するために、皮質骨が破壊されないように配慮した。

ＶＢと腸骨は、ノコギリやアンビル剪断器を使って、５ｃｍ^３の大きさに切断され、骨研磨機で断片化するのに十分な大きさになった。その破片を直ちに５００ｍＬの処理液（１００Ｕ／ｍＬのＤＮａｓｅ、１０Ｕ／ｍＬのヘパリン、２．５％のヒト血清アルブミンを含むＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）に浸した。ＩＭＤＭは、急速に増殖する高密度の細胞培養に適しており、ＴおよびＢリンパ球のサポートに理想的である。ＤＮａｓｅは、死にかけている細胞からのＤＮＡの放出や、死後のドナー由来のＢＭのストレスによる細胞の凝集を緩和するために不可欠である。抗凝固剤としてヘパリンを使用した。ＨＳＡは、細胞の付着や表面への吸着を防ぐためのタンパク質源を提供した。

粉砕と溶出
電気式骨研磨機はＩＳＯ－５クリーンルーム（施設 Ａ）中に設置され、専用の骨研磨機（Ｂｉｏｒｅｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）は生物学的安全キャビネット（施設Ｂ）中に設置された。いずれの施設でも、新鮮な処理媒体１００ｍＬを入れた２Ｌのステンレス製ビーカーを粉砕ヘッドの下に置き、骨片や媒体の流れを受け止めた。同じドナーからＶＢとＩＬの両方を処理した場合、骨の種類は別々にした。骨が乾燥してチェンバに付着するのを防ぐために、プロセス中に処理液を使ってグラインダーをすすいだ。すべての骨片が粉砕された後、チャンバは新しい処理媒体で十分に洗浄された。ステンレス製ビーカー中の最終的な体積は、典型的には約７５０ｍＬだった。

ステンレス製のふるいは、Ｎｏ．４０（４２５μｍ）とＮｏ．８０（１７７μｍ）を重ね、丸い受け皿（ＷＳ Ｔｙｌｅｒ，Ｓｔ．Ｃａｔｈｅｒｉｎｅｓ，ＯＮ）の上に設置した。ステンレスビーカーを旋回させながら、ふるいの上に注いだ。骨片をふるいの上に均等に分散させ、２５０ｍＬの新鮮な処理液で洗浄した。ふるいにかけられたＢＭ生成物（約１０００ｍＬ）は、最終的な分析のために無菌パックに移した。

有核細胞の計数
ＢＭ抽出液のアリコートは、塩化アンモニウムの赤血球溶解緩衝液で赤血球溶解を行った。１５ｍＬのコニカルチューブ中で、９％塩化アンモニウム４ｍＬをＢＭ細胞懸濁液１ｍＬに加え、室温で５分間インキュベートした。インキュベーション後、溶解したサンプルを、１００Ｕ／ｍＬのＤＮａｓｅ、１０Ｕ／ｍＬのヘパリン、２．５％ＨＳＡ処理液を含むＩＭＤＭとともにチューブの上部まで満たした。溶解された試料は、５分間３００のｘｇに遠心分離機にかけられデカントされた。その後、サンプルを１５ｍＬの処理液で洗浄し、３００×ｇで５分間遠心分離し、デカンテーションを行った。最後に、溶解した細胞を１ｍＬの同じ処理液で再懸濁した。トリパンブルーと血球計数装置を用いて、生存核細胞数を得た。

フローサイトメトリー
ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製ＮｏｖｏＣｙｔｅ ２０６０Ｒを用いてフローサイトメトリーを行った。ＣＤ４５＋細胞とＣＤ３４＋細胞の計数にはＩＳＨＡＧＥ法を用いた［１６］。溶解した骨髄抽出液５００μＬを、ＣＤ４５ＦＩＴＣ、ＣＤ３４－ＡＰＣ、７－ＡＡＤ、Ａｎｎｅｘｉｎ－ＰＥ各２μＬで１５分間染色した。すべてのコンジュゲート抗体はＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から、７－ＡＡＤはＴｏｎｂｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から入手した。また、コントロールと補正のために、個々のコンジュゲート抗体で細胞を染色した。１５分間インキュベートした後、細胞をダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、遠心分離して、５００μＬのＰＢＳに再懸濁した。これらのサンプルをフローサイトメーターで直接実行し、ＩＳＨＡＧＥゲートスキーム［１６］を用いて分析した。各サンプルについて、Ｓｉｎｇｌｅｔｓゲートでゲートされた１００，０００のトータルイベントを収集した。

コロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイ
ＲＢＣ溶解細胞懸濁液の濃度を、まず処理溶媒で１０^５生細胞／ｍＬに修正し、２５０μＬを２．５ｍＬの半固形培地Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ Ｏｐｔｉｍｕｍ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ， Ｃａｎａｄａ）に加え、そして、適切な混合を達成するためにしっかりと攪拌した。３ｃｃのシリンジを用いて、細胞を含むＭｅｔｈｏｃｕｌｔを少なくとも２．２ｍＬ除去した。１．１ｍＬを３５ｍｍの非組織培養用ディッシュ２枚にそれぞれ分注した。皿に蓋をして傾け、皿の表面全体がＭｅｔｈｏｃｕｌｔでコーティングされるようにした。この２つの皿を、より大きな１００ｍｍシャーレの中に置き、３つ目の蓋をしていない３５ｍｍの皿には、プレートを加湿するために滅菌したＤＩ水を入れた。プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で１４日間培養した後、コロニーをスコアリングした。

統計的モデリングに使用されたドナーおよび骨髄サンプルの数
６２人のドナーから提供された７５個の骨が、２つのＢＭ処理施設のうちの１つに最初に受け入れられた。データ記録が完了したサンプルの数は、モデル化された結果によって異なる。付録Ｂ表１は、受領した数と、統計的モデル化が可能な完全なデータを持つ数の内訳を結果別に示したものである。

虚血時間の定義
全虚血とは、死亡時（ドナーの動脈系がクロスクランプされて循環が停止した時）から処理施設でのＢＭ回収開始までの時間とした。統計的なモデル化のために、この全区間を連続した相互に排他的な３つの時間要素に分けた。（ａ）温虚血時間（ＷＩＴ）：死亡した時から、骨を回収して氷詰めにした時まで、または死体をクーラーに入れた時まで。（ｂ）体冷却時間（ＢＣＴ）死体をクーラーに入れる時から始まり、回収した骨を氷詰めにする時まで。（ａ）冷虚血時間（ＷＩＴ）：回収した骨を氷詰めにしてから、ＨＳＰＣ抽出のための処理を開始した時まで。これらの定義により、総虚血時間＝ （ＷＩＴ）＋（ＢＣＴ）＋（ＣＩＴ）である。死体冷却が使用されなかった時、ＢＣＴは０にコードされ、総虚血時間＝（ＷＩＴ）＋（ＣＩＴ）だった。虚血時間は、結果予測モデルの主要な変数と考えられた。

経験の定義
これが、ＢＭが死体の硬骨から処理された我々の手になる最初シリーズであったため、処理の経験を積むことで、ＨＳＰＣの質が学習によって向上するのではないかという仮説を立てた。この仮説は、産業上の製造［１７］と医療現場［１８－２０］の両方において、学習曲線が結果とコストに大きな影響を与えることを実証した、長年にわたる研究に基づく。学習のためのコントロールに、我々は、現在ドナーに先立って処理されたドナー数として定義された変数、「経験」を作り出した。ｉ番目のドナーの場合、経験値はｉ－１とコード化され、経験値は常に現在処理されているケースのシリアルナンバーより１つ小さいことを示す。施設Ａが施設Ｂよりも５ヶ月前にＢＭの処理を開始したため、また、Ｂ施設はＡ施設で処理されたケースに参加して学ぶことができるという利点があったため、この２つの施設では、学習の軌跡が異なるのではないかという仮説を立てた。この違いを考慮して、各施設の経験を別々にコード化した。モデル内の施設を識別するために、施設Ａ＝１、施設Ｂ＝０とコード化した。「経験」の効果は、最初に個別の回帰モデルで推定され、その後、学習の成果に対する効果をコントロールするために、最終的な修正モデルの共変数として組み込まれた。

他の共変数
統計モデルにおけるテストされた他の変数は：（１）「骨の種類」、椎骨（ＶＢ）と腸骨（ＩＬ）（ＢＭ細胞の２つの供給源を表し、コードはＶＢ＝１、ＩＬ＝０）。「ドナー性別」（パーセント雄）；および「ドナー年齢」（年）。これらの付加的な共変数は外生的な要因として扱われ、統計的に有意であるか、モデルの性能を向上させる場合にのみ、最終的なモデルに含めた。

結果変数
結果は、潜在能的なインヴィヴォの有用性の品質証明として、３つの品質尺度によって定義された：（ａ）回収したＣＤ３４＋細胞のうち、７－ＡＡＤで測定した生存率（％ＣＤ３４＋）の割合、（ｂ）プレーティングされた１０^５個の総核細胞（ＴＮＣ）あたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の総数（ＣＦＵ－ＴＯＴＡＬ）、および（ｃ）１０^５個の有核細胞あたりに検出されたＣＦＵ顆粒球マクロファージの数（ＣＦＵ－ＧＭ）。

まとめの統計
ドナーおよび処理施設の特徴、虚血時間、結果の評価は、必要に応じて平均値またはパーセンテージにまとめた。施設（Ａ対Ｂ）、骨の種類（ＶＢ対ＩＬ）、死体冷却（はい、または、いいえ）の間で、独立グループｔテスト、または比率についてのｚテストを用いて、粗比較（未修正）を行った。

統計的モデル化
虚血時間の結果との関連は、まず虚血時間のみを予測因子とした未修正の回帰モデルで検討した。次に、「経験」と結果との個別の関連性を判断するために、付加的なモデルを評価した。最後に、虚血の影響を、「施設」、「経験」、「骨の種類」、「ドナーの性別」、「ドナーの年齢」の潜在的な影響について制御された多変量モデルで評価した。目的とする３つの結果（％ＣＤ３４＋、ＣＦＵＴＯＴＡＬ、ＣＦＵ－ＧＭ）のそれぞれについて個別のモデルを評価した。

ＯＬＳ（最小二乗推定法）線形回帰を用いて、二者間相互作用や対数項、二次多項式項を組み込んだモデルなど、さまざまな候補モデルを検証した。これらの候補の中から、以下の基準に基づいて最適な縮小モデルを選択した。（ａ）説明力が最も高い（Ｒ^２の値が高い）モデルを選好した。（ｂ）最も少ない予測因子で最大の変動率を説明する、単純明快なモデルを選好した。修正済みＲ^２は、予測変数の数が多いモデルにペナルティを課すことでオーバースペックを防ぐもので［２１］、最も解析的なモデルを選択する際の説明力の比較指標として用いた。修正済みＲ^２を維持または増加させると同時に、最高のＲ^２値を達成したモデルを選好した。（ｃ）モデルとモデル係数の両方に関連する標準誤差が比較的小さいことで示されるような、精度の高いモデルを選好した。（ｄ）残差プロットの評価により、最も適合したモデルを選好した。残差をプロットして識別可能なパターンを視覚的に調べ、残差を観測値に回帰することで定量的に確認し、相互作用の可能性や根底にある曲線関係を明らかにした。

％ＣＤ３４＋は閉じた単位区間［０＜（％ＣＤ３４＋）＜１］に限定された割合であるため、従来のＯＬＳ線形回帰は、この区間の境界を超える非現実的な適合値を生成することが判明した。これを補正するために、％ＣＤ３４＋のモデルでは線形回帰に替えてベータ回帰を使用した［２２］。ベータ回帰は、応答変数が連続的なスケールで測定され、最小値と最大値で区切られた率や割合である場合に有効である。変換された変数、ｐＣＤ３４＊＝［１００ｘ（％ＣＤ３４＋）＋１］／１０２をモデル化し、これは、結果変数が開区間［０＜（％ＣＤ３４＋）＜１］に制限されなければならないというベータ回帰の分布仮定を満たす。予測値を元のパーセント単位で報告できるように、ベータ回帰の結果を逆変換して求め：
Ｐｒｅｄ（％ＣＤ３４＋）＝［１０２ｘ（Ｐｒｅｄ（ｐＣＤ３４＊））－１／１００］
（ベータ回帰モデルの技術的な説明は、オンライン補足資料の技術付録Ａに記載される）。

モデル妥当性検証：すべてのモデルは，リーブ・ワン・アウト・ブートストラップ交差検定（ｌｅａｖｅ－ｏｎｅ－ｏｕｔ ｂｏｏｔｓｔｒａｐ ｃｒｏｓｓ－ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）を用いて検証した［２３］。これは、データセットから無作為に１つの観察結果を除外し、残りの観察結果からモデルを再評価することで達成される。そして、除外された観察結果を推定するために得られたモデルを使用する。この手順を２００回繰り返し、予測値、モデル係数、標準誤差、９５％信頼区間を含む２００のモデルを得た。モデルパラメータは、２００個のブートストラップされたモデルの平均値としてまとめられた。ブートストラップモデルは、除外された観察結果に影響されていないため、この形式の検証は、元のモデルが新しい観察結果を予測するために使用されるときに見られる可能性のある予測精度の評価として役立つ［２１］。モデルの係数は、オリジナルのモデルについて報告され、および２００のクロスバリデートされたモデルの平均係数＋９５％信頼区間と比較される。

結果
サンプルの特徴を付録Ｂ表２に示し、および、総虚血時間、および個々の虚血時間成分ＷＩＴ、ＣＩＴ、および死体冷却（ＢＣＴ）の分布を６２人のドナーそれぞれについて付録Ｂ図１に示す。ドナーの多数（７７．２％）は男性だった。ドナーの平均年齢は４１．２歳だった。平均虚血時間は、時間（＋標準誤差）単位では、ＷＩＴについては３．６＋０．４、ＢＣＴについては７．９＋０．９、および、ＣＩＴについては１９．６＋１．２ だった。平均の総虚血時間は３１．０＋１．２時間だった。ＢＭ標本からは、平均２．４３＋０．６４％のＣＤ４５ｄｉｍ ＣＤ３４＋ＨＳＰＣが回収され、そのうち平均７９．３＋３．０％が生存細胞であった。ＢＭには、１０^５個のＴＮＣ（ｔｏｔａｌ ｎｕｃｌｅａｔｅｄ ｃｅｌｌｓ）をプレーティングした際に平均２５０．３＋４９．４８ＣＦＵ－Ｔｏｔａｌ、１０^５個のＴＮＣをプレーティングした際に平均３８．２＋７．７８ＣＦＵ－ＧＭが含まれた。

未修正の比較
「施設」、「骨の種類」、「死体冷却」の比較を付録Ｂ表３に示す。ドナーの年齢と性別の分布は「施設」、「骨の種類」、または「死体冷却」の使用の有無によって有意な差はなかった。

施設によって骨の種類の分布に大きな違いがあったが（Ａ施設では処理された骨のうちＶＢが２７％、それに対しＢ施設では１００％であった）、これは、施設ＢがＶＢのみを受け入れる構造になっていたためである。また、施設Ａの方が経験値が高く（施設Ａ＝５３本の骨を処理したのに対し、施設Ｂ＝２４本の骨を処理した；ｐ＜０．００００１）、ＷＩＴが有意に長かった（施設Ａ＝３．５５時間、施設Ｂ＝２．１３時間、ｐ＝０．００３）、および、ＣＩＴが有意に短かった（施設Ａ＝１９．５５時間、施設Ｂ＝２８．３８時間、ｐ＝０．００４）。ＢＣＴ，総虚血時間ともに，両施設で差はなかった。また、ＣＦＵ－ＧＭ数については、Ａ施設の方がＢ施設よりも有意に少なかった（それぞれ２８．３８対６４．３１、ｐ＝０．０４）。生存しているＣＤ３４＋やＣＦＵ－ＴＯＴＡＬの割合については、２つの施設で有意な差はなかった。施設ごとの差は、最終的な回帰モデルにて制御された。

「骨の種類」によるＢＣＴにおける差（表３の中間区分）は、ＩＬ（８．５１時間）と比較すると、より短いＢＣＴに関連付けられるＶＢの処理（６．３２時間）に伴って、有意性（ｐ＝０．０９）に近づいた。このことは、ＶＢのみを処理する施設Ｂの方が施設ＡよりもＢＣＴが短かったためである。また、骨の種類によっても結果が異なった。ＶＢは、ＩＬと比較して、ＣＦＵ－ＴＯＴＡＬ（それぞれ３４１．２９対９７．４４／１０^５細胞；ｐ＝０．０２）とＣＦＵ－ＧＭ（それぞれ５０．４６対１８．０３／１０^５細胞；ｐ＝０．０４）の数が多かった。骨の種類は、最終的な回帰モデルで制御された。

骨の回収前に体を冷やした場合（付録Ｂ表３の最右列）、ＷＩＴの平均値は有意に短くなる傾向があった（死体冷却あり：２．６５時間、死体冷却なし：３．９８時間、ｐ＝０．０４）。ＣＩＴについても同様であった（死体冷却あり：１９．５１時間、死体冷却なし：２８．８３時間、ｐ＝０．００９）。死体冷却が利用された時、すべての結果がより悪かったことは注目すべきである。ＣＤ３４＋の平均生存率は、死体冷却ありで７２．７５％、死体冷却なしで８９．８６％であった（ｐ＝０．０００１）。同様に、死体冷却をした場合としなかった場合では、平均ＣＦＵ－ＴＯＴＡＬ数はプレーティングされた１０^５のＴＮＣにつき、それぞれ１００．１６対６５９．００（ｐ＝＜０．００００１）、平均ＣＦＵ－ＧＭ数は、プレーティングされた１０^５のＴＮＣにつき、それぞれ１８．５２対９４．８５（ｐ＜０．００００１）だった。「死体冷却」は、初期および最終的な虚血時間回帰モデルの両方で説明された。

虚血時間回帰モデル
未修正の（基底）回帰モデルは、予報値（他の共変数について未修正）としてＷＩＴ、ＢＣＴ、およびＣＩＴだけを使用した。（これらのモデルの概要は、オンライン補足資料、技術付録Ｃ、表Ｓ３～Ｓ５にまとめられている。）骨の種類、施設、経験が結果と関連する有意な変数であることが判明したため（付録Ｂ表３）、これらの共変量の影響を統計的にコントロールするために修正モデルを作成した。

ＣＤ３４＋の生存率を予測するベータ回帰モデルを表４に示す。（ベータ回帰の詳細は、オンライン補足資料、技術付録Ａに記載されている）。回収されたＣＤ３４＋細胞の生存率は、ＢＣＴの増加に伴って有意に低下し、ＣＤ３４＋がゼロに近づくにつれて低下した（線形効果、ｐ＝０．００２、二次多項式効果、ｐ＝０．０３）。また、ＣＩＴの増加に伴い、％ＣＤ３４＋が同様に曲線的に減少した（線形効果、ｐ＝０．００３、２次の多項式効果、ｐ＝０．００５）。骨の種類」と「ＷＩＴ」はいずれも有意ではなかった。経験（ｐ＝０．０９）と施設×経験の交互作用（ｐ＝０．０７）は統計的有意性に近づいた。オッズ比とは、関連する予測変数の１単位の変化に伴う％ＣＤ３４＋の変化を示すものである。例えば、ＷＩＴの１時間の増加に関連するオッズ比は０．９６６３で、ＷＩＴが１時間増加するごとに、％ＣＤ３４＋が以前の値の９６．６３％に減少することを示している。このモデルの予測の妥当性は、オリジナルモデルの推定パラメータ（表４の左パネル）とブートストラップモデルの推定パラメータ（右パネル）の類似性によって証明されている。このモデルは、統計的に有意である（ｐ＝０．００１）。

ＣＦＵ－ＴＯＴＡＬの線形回帰の結果を付録Ｂ表５に示す。ここでは、ＢＭ細胞の供給源としての「骨の種類」の重要性が明らかになった。ＢＭ細胞をＩＬではなくＶＢから回収した場合、ＣＦＵ－ＴＯＴＡＬは２０７／１０^５ＴＮＣをプレーティングして増加した（ｐ＝０．０２５）。ＢＣＴのＣＦＵＴＯＴＡＬへの影響は負であった。ＢＣＴの増加に伴い、ＣＦＵ－ＴＯＴＡＬの回復量は減少し、その減少率は逓減していった（線形効果、ｐ＝０．００００５、２次の多項式効果、ｐ＝０．００２）。ＷＩＴとＣＩＴの効果は統計的に有意ではなかった。「経験」も有意ではなかったが、「経験」を統計的にコントロールすることでモデルのパフォーマンスが向上したため、「経験」を残した。「骨の種類」と「経験」の両方を統計的にコントロールした場合、モデルの説明力は、Ｒ^２＝３５％から４７％に向上した。修正後のＲ^２も３５％から４０％に改善しており、この改善はモデルのオーバースペックの結果ではないことを示している。また、標準誤差が小さくなったことから、モデルの精度も向上した。オリジナルモデルの推定パラメータ（付録Ｂ表５の左パネル）とブートストラップモデルの平均化された結果（右パネル）が類似していることは、モデルの予測の妥当性を証明している。このモデルは有意で（ｐ＝０．０００００５）、ＣＦＵＴＯＴＡＬの変動の４７．３％を説明した。

ＣＦＵ－ＧＭの線形回帰の結果を付録Ｂ表６に示す。最良のＣＦＵ－ＧＭモデルには、経験や施設ではなく、骨のタイプがコントロール変数として含まれていた。「骨の種類」は統計的に有意ではなかったが、これを含めることで説明力がＲ^２＝３２％から３４％に向上し、調整後のＲ^２は変わらず（２９％）、モデルがオーバースペックではないことが示唆されたため、モデルに残した。「骨の種類」 を統計的にコントロールした結果、ＷＩＴとＢＣＴは引き続きＣＦＵ－ＧＭと統計的に有意な関係を示した。ＷＩＴは１時間経過するごとにＣＦＵ－ＧＭを－７．１９／１０^５ ＴＮＣプレーティング分減少させ（ｐ＝０．０３）、ＢＣＴは１時間経過するごとにＣＦＵ－ＧＭを－５．２４／１０^５ ＴＮＣプレーティング分減少させた（ｐ＝０．００００３）。ＣＩＴは効果がなかった（ｐ＝０．８６）。このモデルの予測の妥当性は、オリジナルモデルのパラメータ（付録Ｂ表６の左パネル）とブートストラップモデルの平均化された結果（右パネル）の類似性によって証明されている。このモデルは有意であり（ｐ＜０．００００１）、ＣＦＵ－ＧＭの変動の３４％弱を説明している。

％ＣＤ３４＋モデルからの予測
表４の調整済みベータ回帰モデルから生成された予測値の範囲を図２に示す。予測のパターンは、ＷＩＴとＣＩＴの様々な組み合わせが、回収したＣＤ３４＋細胞の生存率をどのように変化させるかを示している。図２の予測値は、体冷却を行わない場合に予想される結果である。ＷＩＴとＣＩＴの値の範囲を見てみると、ＷＩＴはＣＩＴよりも細胞の生存率に悪影響を及ぼすことがわかる。ＷＩＴが３時間以下に抑えられた場合、ＣＤ３４＋細胞の生存率は、ＣＩＴの２４時間まで８０％以上（緑色の領域）を維持する。しかし、ＷＩＴを３時間以上に延長すると、耐えられるＣＩＴの時間は徐々に短くなる。凍結保存の効果はテストしていないため、これらの予測値は、回収した細胞のその後の凍結・解凍による生存率の損失の可能性を考慮していない。ＣＦＵ－ＴＯＴＡＬおよびＣＦＵ－ＧＭについても、付録Ｂ表５および付録Ｂ表６に示した係数を用いて同様の予測を行うことができる。

考察
ドナーの総数と調達した骨の数からすると、この実用的な観察的実地研究はこれまでで最大のものであり、また、虚血時間と体冷却時間が死亡したドナーの骨から回収したＨＳＰＣの品質に与える影響を定量化した最初の研究である。この研究は、一般化してルーチンの実践に応用できる外部の有効なデータを作成することを意図して設計された。この研究は、通常のＯＰＯの動作条件で見られる可能性のある一連の虚血時間を網羅しており、ドナーの骨が心停止直後に回収され（すなわち、体冷却なし）、骨の回復が早く（すなわち、短いＷＩＴ）、長時間の搬送を必要としない（すなわち、ＣＩＴの減少）単一施設で行われた以前の研究とは異なっていた［４，１４，１５］。

本研究では、３つの主要な目的があった。（ａ）虚血時間と死亡ドナー由来のＨＳＰＣの品質との統計的関係を定量化すること、（ｂ）虚血時間が長くなるとＨＳＰＣの品質に悪影響を及ぼす境界条件を明らかにすること、（ｃ）細胞の機能と生存率を維持するための方策としての全身冷却を検討すること。本研究の結果は、４つの主要なメッセージを伝えている。

第１に、地理的に分散しているＯＰＯが調達した骨を、国を超えて遠くの処理センターに輸送しなければならない場合、必然的に虚血時間が長くなるにもかかわらず、許容できるレベルのＨＳＰＣ品質を達成することができる。我々の分析によると、このような条件下では、温熱虚血時間と冷熱虚血時間の好ましい組み合わせが容易に達成でき、ＣＤ３４＋細胞の生存率は８０～９０％の範囲に収まることがわかった。全体として、回収された生存ＣＤ３４＋細胞の調整前の平均割合は８０％弱（７９．３％、付録Ｂ表２）であった。

第２のメッセージは、組織の回収では一般的に行われている、骨の回収前に体を冷やすことは、死体のＢＭから回収したＨＳＰＣの生存率と機能に悪影響を及ぼすということである。全身冷却を行った場合、ＣＤ３４＋細胞の生存率は平均７２．７５％であった。死体冷却を行わなかった場合、平均生存率は９０％近くに達し（８９．９６％、Ｔａｂｌｅ ３）、死体冷却を行わず、回収した骨をできるだけ早く低温の虚血環境に移すことが最適な方法であることが示唆された。

第３のメッセージは、ＢＭのソース（骨の種類）が重要である、ということだ。我々の分析では、ＶＢはＩＬと比較して、生存しているＨＳＰＣｓの優れた供給源であることが示された。無調整の比較では、ＣＤ３４＋細胞の生存率は、ＶＢがソースの場合は８０％を超えたが、ＩＬがソースの場合は７４％を下回った（表３）。この違いの理由は明確ではなく、おそらく多面的なものであろう。生理的な違いよりも、２つの骨タイプで使用した分離プロセスの違いがより重要な要因であった可能性が高い。死亡したドナーのＶＢとＩＬのＢＭを比較した最初の研究であることを考えると、他に直接比較できるデータは存在しない。最も近いのは、故人ドナーのＶＢと生体ドナーの吸引された腸骨稜のＢＭから回収されたＣＤ３４＋細胞の生存率を比較したもので、違いは見られなかった［２４－２６］。

分析から得られた第４のメッセージは、経験が重要であり、処理センターによって大きく異なる可能性があるということだ。ほとんどの技術的活動と同様に、死体の骨からのＢＭ細胞の処理は、学習曲線に沿って行われる。この現象は、８０年以上前に初めて記録され［２７］、その後、オペレーションズ・マネジメントの標準的な教科書に取り入れられた［１７，２８］。最近では，学習曲線現象が医療処置の結果とコストの両方に及ぶことが示されている［１８－２０］。今回調査したＢＭ処理センターでは、異なる学習軌跡が観察され（結果はオンライン補足資料の技術的付録Ｂに掲載）、また、今回は２つのセンターのみを分析したが、この結果は、学習のペースや学習曲線の形がセンターによって大きく異なる可能性を示唆しており、このことは、今後のトレーニングプログラム、ＢＭ処理プロトコル、および認証方法を設計する際に考慮すべき要素である。我々が調査したＢＭ処理センターでは、異なる学習軌道が観察された（結果は、オンラインサプリメントの技術的付録Ｂに掲載）。今回の分析では、ＢＭの処理には量と結果の関係が存在し、処理の経験を多く積んだ量の多い地域センターは、量の少ないセンターに比べて、より質の高いＢＭ製品を生産する可能性があることが示唆された。

本研究の目的は、収量や生存率を最適化することではなかったが、最適化を目的とした以前の 死亡したヒトドナーのＢＭの回収に関する報告書のデータと比較することができる。過去に行われた３つの研究では、合計９９人の故人ドナーのＢＭと合計５８人の生体ドナーのＢＭが比較された［２４－２６］。これらの報告では、死亡したドナーのＢＭから回収されたＣＤ３４＋細胞の割合（２．１＋０．６％、平均＋標準偏差）は、生きているドナーから吸引したＢＭ（１．５６＋０．９２％）と統計的な差はなかった（ｐ＝０．３２）。これは、回収されたＣＤ３４＋細胞の平均割合が２．４３＋０．６４％（平均＋標準誤差）であった我々の調査結果とよく一致しているＣＤ３４＋の割合には大きなばらつきが見られたが、これは虚血時間の極端な違いを反映していると思われ、結果的にこの研究では到着時のドナー組織の質を反映していると考えられる。

死亡したドナーのＣＤ３４＋ＨＳＰＣｓの品質は、ＣＤ３４＋細胞の生存率とＣＦＵの可能性を測定することで、生体ドナーのＨＳＰＣｓと比較されている［２４－２６］。死亡したドナーから回収されたＣＤ３４＋細胞の平均生存率は９５．２＋３．６％であったのに対し、生きているドナーの場合は９３．５＋０．３５％であった。死亡したドナーのＢＭと生きているドナーのＢＭのＨＳＰＣｓの機能的な同等性は、ＣＦＵ－ＧＭの頻度を比較することによって確立され、死亡したドナーのＢＭではプレーティングされた１０^５ＴＮＣあたり１０５±６５であったのに対し、生きているドナーのＢＭではプレーティングされた１０^５ＴＮＣあたり８１．４±１７であった。これと比較して、死亡したドナーのＢＭから得られた全体的な平均値（表２および３）は、これらの品質基準の両方で低くなっているが、これはおそらく、極端な範囲の虚血時間と、体冷却を行ったことが、平均的な細胞生存率に悪影響を及ぼしたためと考えられる。今回報告された知見をもとに、ＷＩＴ８時間、ＣＩＴ３０時間という制限を設け、体冷却を行わないようにした。このプロトコルの変更に伴い、これらの基準を満たす５０人のドナーの椎体が回収され、処理されている（原稿準備中）。平均的なＣＤ３４＋ＨＳＰＣの生存率は９０．５＋１．９％、平均的なＣＦＵ－ＧＭは１５８．３＋１３．５／１０^５ＴＮＣがプレーティングされ、これは以前の研究［２４－２６］と同等であった。

全体として、我々の研究は、死亡したドナーから大量のＢＭを回収してバンクに入れることが可能であることを示している。十分なＨＬＡの多様性を持つＢＭバンクを構築するには、故人ドナーの髄質骨の十分な供給源と安定した供給が必要である。幸いなことに、１９６８年のＵｎｉｆｏｒｍ Ａｎａｔｏｍｉｃａｌ Ｇｉｆｔ Ａｃｔにより、地理的に分散した５８のＯＰＯのシンジケートが設立された。毎年、死亡した方のうち約１万人が臓器を提供し、さらに約４万人が組織を提供し、年間で約３万個の臓器と１００万個以上の組織が回収されている（ｕｎｏｓ．ｏｒｇ／ｄａｔａ／ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ－ｔｒｅｎｄｓ／ ａｃｃｅｓｓｅｄ（２９ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１９））。このネットワークを通じて大量の骨が回収される可能性があるため、骨の調達、回収、輸送、そして ＢＭ 処理センターやバンクセンターと連携した統合システムを構築するために必要なインベントリを提供する ことができる。このような統合されたシステムを構築するためには、複数のＯＰＯが協力して、合意された運用プロトコルに沿って調整する必要がある。今回の研究では、既存のＯＰＯのインフラを利用して、このようなシステムを構築することが可能であることを示した。特に、骨の調達・回収から、国を越えた輸送、ＢＭ処理センターへの到着まで、好ましい虚血環境を維持するためのプロトコルを開発し、実施することができることを実証した。我々のデータは，体冷却と虚血時間の変数に制約がないため，高い外部妥当性（一般化可能性）を有していると考えられ，我々の予測モデル（図２）の結果は，現実的な虚血時間の許容範囲やＨＳＰＣの品質許容基準を設定するために使用することができる。

ＢＭバンクシステムの構築は、現在の生体ドナー登録に比べて、いくつかの明確な利点がある。第１に、生きているドナーの人的なリスクは、現在の主流である末梢血の動員による採血では改善されないのに対し、これがなくなる。次に、死亡したドナーからは、生きているドナーに比べてはるかに大量のＨＳＰＣｓを回収することができるため、グラフトが失敗した場合に同じドナーから複数回注入することができる。さらに、回収された細胞は既知の量でパッケージ化され、品質が検査され、後で必要に応じて使用するために凍結保存される。このユニットは凍結保存されているため、無期限に保存することができ［２９］、生体ドナー登録が減少している問題を回避することができる。最後に、ＢＭバンクは、広範な骨髄不全を引き起こす原子力災害のような大規模災害が発生した際に、需要が急増した場合にすぐに利用できる資源として役立ちます。

これらの利点を十分に発揮するためには、多くのロジスティックな問題やシステム上の問題に対処しなければならない。その中でも、骨の回収、出荷、加工の際に生じる長期の虚血時間を効果的に管理して、ＢＭ製品の品質と生産量を保証する必要があると認識されている。ＢＭバンクは、現在、大きな可能性を秘めた存在となっている。ＢＭバンキングは、現在、存在し始めており、大きな可能性を示し始めている。始まったばかりのＢＭ処理施設の観点から、我々の統計モデルの結果は、虚血許容限界の定量的な設定や、死体の骨から得られたＨＳＰＣｓの生存率と機能を保護するための品質許容基準の設定に使用することができる。また、より広い政策的観点からも、我々のモデルは、データに基づいた業界標準を制定するための、新たなＢＭバンクシステムの基盤を提供することができる。

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オンライン補足
技術付録Ａ
経験モデル
学習を説明するために、現在のドナーの前に処理されたドナーの数として定義される変数経験を作成した。ドナーは、処理された順にｉ＝１．．．ｎと連続して番号付けされ、経験はｉ－１とコード化され、経験が常に現在処理されているドナーより１つ少ないことを示した。施設Ａは施設Ｂの５か月前に骨髄の処理を開始し、施設Ｂには施設Ａで処理された症例に参加する（そしてそこから学ぶ）という利点があったため、２つの施設の学習軌道は異なっていた。この違いを考慮して、経験は各施設で別々にコード化された。モデル内の２つの施設を識別するために、施設Ａ＝１、施設Ｂ＝０とコード化した。

回帰モデル：
結果（％ＣＤ３４＋、ＣＦＵ－ＴＯＴＡＬ／１０^５、ＧＭ－ＴＯＴＡＬ／１０^５）は、施設（処理が行われた場所）、経験（今回の症例の前に施設で処理された症例数）、および施設ｘ経験の相互作用の線形結合としてモデル化された。ＣＤ３４＋はベータ回帰を用いてモデル化された（技術付録Ｂ参照）。他の２つの結果（ＣＦＵ－ＴＯＴＡＬとＣＦＵ－ＧＭ）は、従来のＯＬＳ線形回帰を用いてモデル化された。モデルは次のような線形形式をしている：

相互作用項β_３は、施設Ａが施設Ｂとは異なる経験との線形関係（異なる学習軌跡）を持っていた可能性を考慮する。

検証可能な効果を導き出すための代数
施設Ａのためのモデルは：

である。

施設Ｂのモデルは、施設Ｂ＝０となり、β_１とβ_３に関連する項がモデルから脱落するため、減少する。したがって、施設Ｂのためのモデルは：

である。

式［Ａ．２］と式［Ａ．３］の違いから、モデルで検証可能な効果への洞察力を提供することができる。

［Ａ．４］から、次の効果は帰無仮説として検証可能である：

数値計算例
以下は、表Ｓ１の回帰係数と観測されたデータ値から、ＣＦＵ－ＧＭ／１０^５に対する経験の影響を予測するための作業例である：

施設Ａと施設Ｂの両方が２０人のドナーを処理したと仮定すると、２１人目のドナーに対するそれぞれの結果はどうなるだろうか。

施設Ｂのための解釈：
経験がない状態（経験＝０）からスタートした場合、初期のＣＦＵ－ＧＭ収率（インターセプト項）はβ_０＝１１１．９１ ＣＦＵ－ＧＭ／１０^５となることが予想される。各処理された追加のドナーは、施設Ｂの開始額からβ_２＝－３．５７ ＣＦＵ－ＧＭ／１０^５を差し引くことが予想される。処理された２１番目のドナーにとって、施設Ｂの予想収益は、（β_０）＋（β_２×２０）＝１１１．９１＋（－３．５７ｘ２０）＝４０．５１ＣＦＵ－ＧＭ／１０^５になる。

施設Ａのための解釈：
経験なしで、施設Ａの収率は施設Ｂよりもβ_０＋β_１＝［１１１．９１＋（－９９．３４）］＝１２．５７ ＣＦＵ－ＧＭ／１０^５単位多いと推測される。施設Ａが処理する追加の症例ごとに、施設Ａの出発の収率にβ_２＋β_３＝（－３．５７＋４．１７）＝０．６０ ＣＦＵ－ＧＭ／１０^５が追加される。２１件目の処理の場合、施設Ａの収率は（β_０＋β_１）＋（β_２＋β_３）×（２０）＝１２．５７＋（０．６０×２０）＝２４．５７ＣＦＵ－ＧＭ／１０^５であるだろう。ここで留意すべきは、施設Ａの学習勾配は正であり、追加の症例が処理されるたびにβ_３＝４．１７ ＣＦＵ－ＧＭ／１０^５が追加され、施設Ｂの学習勾配は負であり、各症例でβ_２＝－３．５７ ＣＦＵ－ＧＭ／１０^５が減算されることである。これは、古典的な相互作用の例である。相対的な用語で表すと、追加の学習経験はそれぞれ、施設Ｂと比較した施設Ａの純利益β_２＋β_３＝（－３．５７＋４．１７）＝０．６０ ＣＦＵ－ＧＭ／１０^５に関連付けられる。

これらの例は、３つの結果すべてに現れたパターンを図示する。施設Ｂの前にＢＭセルの処理を開始した施設Ａは、比較的低いパフォーマンスレベルで開始し、追加の症例が処理されるたびに単調に改善された。比較すると、施設Ａの初期作業に参加した（そこから学んだ）施設Ｂはより高いレベルのパフォーマンスで開始したが、経験の増加に伴って大きな変化はなく、やや低下していった。

技術付録Ｂ
ベータ回帰
本文では、ＣＤ３４＋を使用して回収されたＣＤ３４＋細胞の数を示し、％ＣＤ３４＋を使用して生存可能なＣＤ３４＋細胞の総数の割合を示す。すなわち：

である。

比率であるため、％ＣＤ３４＋は閉じた単位区間（０＝＜％ＣＤ３４＋＝＜１）に限定され、つまり、０％または１００％またはその中間の任意の値を取ることができるが、０％未満または１００％を超えることはできない。この制限を考慮すると、通常の最小二乗（ＯＬＳ）線形回帰では、区間の境界を超える非現実的な近似値が生成され、予測値の一部は０％未満であり、一部は１００％を超えていた。これを修正するために、％ＣＤ３４＋のモデルに対してＯＬＳ線形回帰の代わりにベータ回帰［１］を考慮した。最尤ベータ回帰は、ベータ分布の確率変数をモデル化するために使用され、これは、回答変数が連続的なスケールで測定され、最小値と最大値で区切られた率や割合である場合に、特に有効である。他の２つの結果変数、ＣＦＵ－ＴＯＴＡＬとＣＦＵ－ＧＭをモデル化するために、引き続きＯＬＳ線形回帰を使用した。

ここでは、回収されたＣＤ３４＋細胞のうち、生存していたものの割合を示すために、ｐＣＤ３４＝％ＣＤ３４＋を使用する。結果がベータ分布変数として評価可能であることを確認するために、ｐＣＤ３４を次のように変換した：

この変換により、ｐＣＤ３４＊は開区間（０＜ｐＣＤ３４＊＜１）に制限され、結果変数は０％または１００％に近づくことはあっても、等しくなることはないという分布の仮定を満たすことになる。そして、制限された割合であるｐＣＤ３４＊をベータ回帰によってモデル化した。解釈を容易にするために、ベータ回帰からの予測値を逆変換して、取得した：

ベータ回帰方程式：
ベータ回帰式は、線形予測因子であるｈに対する結果のロジットリンク関数を利用する。ｐＣＤ３４＊を予測するための基本的なベータ回帰方程式は：

であった。

数値計算例：
計算を図示するために、表Ｓ２に示した係数と虚血時間を使用する。

方程式［Ｂ．１］を使用して、以下の方程式［Ｂ．２］に示すようにηを解く：

それらは非線形関数を介して結果変数に関連しているため、線形予測子ηの係数には単純な直感的な意味がない。しかしながら、逆リンク関数をｈに適用することで、より解釈しやすい結果を得ることができる。

逆リンク関数：
逆リンク関数、ｅｘｐ（η）／［１＋ｅｘｐ（η）］は、線形予測子ηを結果変数ｐＣＤ３４＊の期待値に変換する：

方程式［Ｂ．２］から計算された予測値η＝２．２５０７６８８に逆リンク関数を適用すると、期待値Ｅ［ｐＣＤ３４＊］が得られる：

この結果は、表Ｓ２に示した予測因子の特定の値に対するｐＣＤ３４＊の予想値と解釈できる。

［Ｂ．３］の結果をｐＣＤ３４（生存しているＣＤ３４＋細胞の割合）で解釈するには、逆変換を使用する：

方程式［Ｂ．４］は、表Ｓ．１で特定された値の場合、予想される生存ＣＤ３４＋細胞の割合は、ｐＣＤ３４＝％ＣＤ３４＋＝９１．３１％となる。

与えられた予測変数の１単位の変化によるｐＣＤ３４＊への予想される影響を決定する：
任意の予測因子のベータ回帰係数は，方程式中の他のすべての予測因子をコントロールしながら，その予測因子が１単位変化したときのｐＣＤ３４＊への影響を推定するために使用できる。これは検討中の特定の回帰係数のべき乗によって達成される。例えば、温熱虚血時間（ＷＩＴ）の１時間の増加が、生存しているＣＤ３４＋細胞の割合と生存していないＣＤ３４＋細胞の割合の比に与える影響を計算するために、検討している比は：

である

表Ｓ２の、ＷＩＴに関連した回帰係数はβ_１＝－０．０１９９６である。
したがって、ＷＩＴの１時間の増加が、生存率と非生存率のＣＤ３４＋細胞の比率に与える影響は：

である。

方程式［Ｂ．５］は、ＷＩＴを１時間増加させ、方程式の他の変数（ＢＣＴおよびＣＩＴ）を変更しない場合、ＣＤ３４＋細胞の生存率と非生存率の比は２％減少し、その以前の値の９８％になることを示している。我々は予め、方程式［Ｂ．３］でｐＣＤ３４＊＝０．９０５を計算した。したがって、ＷＩＴが１時間増加すると、ｐＣＤ３４＊は０．９８ｘ０．９０３＝０．８８５に減少し、２％減少する。同様に、これにより、予測されるｐＣＤ３４が０．９１３から０．８９３に減少し、約２％減少する。乗数的因子０．９８は、温熱虚血時間の連続した範囲に沿った任意の単位の変化に適用される定数である。他の予測因子の因子は、ｐＣＤ３４＊に対するＢＣＴおよびＣＩＴの単位変更の影響を推定するために同じ方法で取得できる。

技術付録Ｃ
未調整（ベース）虚血時間の回帰モデル
初期（ベース）回帰モデルでは、ＷＩＴ、ＢＣＴ、ＣＩＴのみを予測因子とした（他の共変量の調整は行わない）。％ＣＤ３４＋、ＣＦＵ－ＴＯＴＡＬ、およびＣＦＵ－ＧＭのこれらのモデルの結果は表Ｓ３－Ｓ５に示される。モデル結果は表の左のパネルに示され、２００の交差検定された型（それぞれ，全データセットから１つの観測データを除外して推定したもの）の平均された結果は、右パネルに示される。

ＣＤ３４＋のベータ回帰モデルは表Ｓ３に示される。ＷＩＴと％ＣＤ３４＋の関係は統計的に有意ではなかったが、ＢＣＴ（線形成分、ｐ＝０．００１および２次多項式成分、ｐ＝０．０１）、およびＣＩＴ（線形成分、ｐ＝０．００１および２次多項式成分、ｐ＝０．００４）は両方とも％ＣＤ３４＋に曲線的に関連した。いずれの場合も、ＣＤ３４＋の収量はＢＣＴとＣＩＴの増加に応じて減少するが、ＢＣＴとＣＩＴの上限値ではわずかに増加する。表Ｓ３のオッズ比は、ＣＤ３４＋細胞全体に対する生存可能なＣＤ３４＋細胞の連続変数比であり、特定の予測因子における１単位の変化の影響を示す。これらの量は、検討中の特定の予測因子に関連付けられた回帰係数のべき乗によって取得される。例えば、ＷＩＴに関連した係数はβ_１＝－０．０１９９６である。（表Ｓ３）べき乗は次の結果を生成する：

これは、表Ｓ３に示されている温虚血の連続オッズ比の値である。この結果は、ＢＣＴとＣＩＴが一定に保たれている場合、ＷＩＴが１単位（１時間）増加するごとに、生存可能なＣＤ３４＋と生存不可能なＣＤ３４＋の比率が以前の値の９８．０２％に減少することを示している。乗数的因子０．９８０２は、ＷＩＴの連続範囲に沿った任意の場所での１単位の変化に適用できる定数である。他の予測因子の因子は表Ｓ３に示され、方程式の他の変数を一定に保持するＢＣＴまたはＣＩＴの１単位の変化の影響を推定するために使用できる。ベータ回帰予測方程式は統計的に有意である（ｐ＝０．０００９）。

表Ｓ３の右半分は、ブートストラップされた交差検定の平均された結果を示し、未来の観察［２］を予測することにおいて、オリジナルモデルの確認の推定を提供する。オリジナルモデルが誤って特定された場合、再推定されたブートストラップモデルのパラメーターは、オリジナルモデルのパラメーターとは異なるだろう。しかしながら、表Ｓ３で明らかにされるように、オリジナルモデル（左パネル）と関連したモデルのパラメーター（回帰係数、標準エラー、および９５％の信頼区間）は、ブートストラップの再サンプリングを通して生成された対応するパラメーター（右パネル）とほぼ同様であり、同じ母体から引き出された未来のデータに適用された場合にオリジナルモデルの予測妥当性の証拠を提供する。［ベータ回帰および例計算に関する技術的詳細は上の技術付録Ｂで提供される］。

表Ｓ４は、ＣＦＵ－ＴＯＴＡＬのための直線回帰結果を示す。直線回帰での係数は、関連した予測因子における単位変化の影響の直接推定値である。ＢＣＴは表Ｓ４で単に統計的に有意な予測因子である。ＷＩＴとＣＩＴは有意ではない。ＢＣＴとＣＦＵ－ＴＯＴＡＬの関係は曲線であり、ＢＣＴが１時間増加するごとに、ＣＦＵ－ＴＯＴＡＬが－９５．０３６３９／１０^５セル（ｐ＜０．０００１）減少すると同時に、ＣＦＵ－ＴＯＴＡＬ^２が３．４５６０３／１０^５（ｐ＝０．０００８）増加することを示す。ともに線形および２次多項式成分は減速速度で減衰するＣＦＵ－ＴＯＴＡＬの減少傾向を生み出すために結びつく。モデルパラメータ（表Ｓ４の左パネル）は、ブートストラップモデルの平均されたパラメーターに似ており、オリジナルモデルの予測的妥当性の証拠を提供する。モデルは統計的に有意で（ｐ＝０．００００２）、ＣＦＵ－ＴＯＴＡＬにおける分散の３５％について説明する。

表Ｓ５は、ＣＦＵ－ＧＭのための直線回帰結果を示す。このモデルにおいて、ＷＩＴとＢＣＴの影響は統計的に有意であるその一方でＣＩＴの影響は有意ではない。ＣＩＴとＢＣＴを一定とした場合、ＷＩＴを１時間行うごとにＣＦＵ－ＧＭを－８．１１２９５／１０^５（ｐ＝０．０１）減少させる。ＷＩＴとＣＩＴを一定とした場合、ＢＣＴを１時間行うごとにＣＦＵ－ＧＭを－５．５２９２７／１０^５（ｐ＜０．０００００９）減少させる。表Ｓ５の右側は、ブートストラップモデルの推定パラメーターはオリジナルモデルのそれらに似ており、未来のデータに適用されたとき、オリジナルモデルの予測的妥当性の証拠を再び提供する。モデルは統計的に有意で（ｐ＝０．００００２）、ＣＦＵ－ＧＭ数での全変動の３２％を占める。

参考文献
Ｆｅｒｒａｒｉ ＳＬＰ， Ｃｒｉｂａｒｉ－Ｎｅｔｏ Ｆ． Ｂｅｔａ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｆｏｒ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｒａｔｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．２００４， ３１（７）：７９９－８１５
２．Ｈａｒｒｅｌ Ｊｒ， Ｆ．Ｅ．， Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｗｉｔｈ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｌｉｎｅａｒ ｍｏｄｅｌｓ， ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ， ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ．２ｎｄ ｅｄ． Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｅｒｉｅｓ ｉｎ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．２００１， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｓｐｒｉｎｇｅｒ．５８２

Claims (36)

1. 死亡したドナーの骨髄から細胞を回収する方法であって、前記方法は、
   死亡したドナーから骨を取得する工程と、
   前記骨から骨髄細胞を抽出するために前記骨を処理する工程と、
   １．０６３～１．０５２ｇｍ／ｍＬの密度を有する、低密度Ｆｉｃｏｌｌ溶液を取得する工程と、
   Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配を形成するために、低密度Ｆｉｃｏｌｌ溶液を遠心分離管に導入する工程と、
   前記遠心分離管中で、抽出された骨髄細胞をＦｉｃｏｌｌ密度勾配上に層状に重ねる工程と、
   Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配と骨髄細胞とを含有する前記遠心分離管を、遠心分離機にかける工程と、
   前記遠心分離管内からバフィーコート細胞を採取する工程と、
   その後の使用または処理ために、採取された細胞を洗い流す工程と、
   を含む、方法。
2. 前記骨は椎体である、請求項１に記載の方法。
3. 採取された細胞はＣＤ３４＋細胞である、請求項１に記載の方法。
4. 前記骨を処理する工程は、
   軟組織を除去して前記骨を洗浄すること、
   前記骨を切片に切断した後に、前記切片を粉砕すること、
   粉砕された骨の切片を濾過してすすぐこと、および、
   骨髄細胞を濃縮するために、濾過してすすがれた骨の切片の懸濁液を遠心分離機にかけること、
   を含む、請求項１に記載の方法。
5. 低密度Ｆｉｃｏｌｌ溶液を取得する工程は、１．０６３～１．０５２ｇｍ／ｍＬの密度を取得するための割合で、１．０７７ｇ／ｍＬの密度のＦｉｃｏｌｌ－ＰａｑｕｅをＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ（商標）と混合することを含む、請求項１に記載の方法。
6. 前記遠心分離管を遠心分離機にかける工程は、４００ｇで３０分間、前記遠心分離管を遠心分離機にかけることを含む、請求項１に記載の方法。
7. 採取された細胞を洗浄する工程は、０．５％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と２ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で、細胞を洗い流すことを含む、請求項１に記載の方法。
8. 死亡したドナーの骨から骨髄細胞を取得する方法であって、前記方法は、
   死亡したドナーから骨を取得する工程と、
   軟組織を除去して前記骨を洗浄する工程と、
   前記骨を切片に粉砕する工程と、
   液体組成物を生成するために、粉砕された骨を濾過してすすぐ工程と、
   骨髄細胞を骨髄細胞組成物に濃縮するために、濾過してすすがれた骨の前記液体組成物を遠心分離機にかける工程と、
   前記骨髄細胞組成物を滅菌コンテナに抽出する工程と、
   を含む、方法。
9. 前記ドナーの骨は、死亡したドナーの１以上の椎体および／または腸骨である、請求項８に記載の方法。
10. 前記ドナーの骨は、新たに取得され、そして冷凍されていない、請求項８に記載の方法。
11. 前記ドナーの骨は、処理施設への輸送のために冷凍された後に解凍される、請求項８に記載の方法。
12. 軟組織を除去して前記骨を洗浄する工程は、
    ツールを使用して、前記骨から軟組織を取り除くこと、およびその後に、
    軟組織と軟組織の細胞とを前記骨から取り除くように適合された１以上の溶液中に前記骨を浸すこと、
    を含む、請求項８に記載の方法。
13. １以上の溶液中に前記骨を浸すことは、
    漂白溶液剤中に前記骨を浸すこと、およびその後に、
    過酸化水素溶液中に前記骨を浸すこと、
    を含む、請求項１２に記載の方法。
14. １以上の溶液中に前記骨を浸すことは、
    コンテナ中に前記骨を浸すこと、
    前記コンテナ内の気泡のレベルを検出すること、および、
    気泡が検出されなくなるまで、少なくとも過酸化水素溶液中に前記骨を浸すことを繰り返すこと、
    を含む、請求項１２に記載の方法。
15. 前記コンテナ中の任意の気泡の視認性を向上させるために、不活性の造影剤が過酸化水素溶液に添加される、請求項１４に記載の方法。
16. 前記骨を粉砕する工程は、
    前記骨を断片に切断すること、およびその後に、
    骨の断片を、粉砕培地を備えた骨の粉砕機中で粉砕すること、
    を含む、請求項８に記載の方法。
17. 前記粉砕培地は、１０Ｕ／ｍＬのヘパリン、２．５％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、および３Ｕ／ｍＬのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）試薬と共に、ベースとしてＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ（商標）を含む、請求項１６に記載の方法。
18. 粉砕された前記骨を濾過してすすぐ工程は、
    粉砕培地中に前記粉砕された骨を浸すこと、
    前記粉砕された骨と前記粉砕培地とを、一連の篩に通すこと、
    その後、前記篩を前記粉砕培地ですすぐこと、
    篩を通る前記液体組成物を、コンテナ中で受取ること、およびその後に、
    前記液体組成物を前記滅菌コンテナに移すこと、
    を含む、請求項８に記載の方法。
19. 前記一連の篩は、第１のＮｏ．４０の篩（４２５μｍ）と、その後に第２のＮｏ．８０の篩（１７７μｍ）とを含む、請求項１８に記載の方法。
20. 粉砕された前記骨を濾過してすすぐ工程は、
    第１の収集袋内の粉砕培地中に、粉砕された骨を浸すこと、
    前記第１の収集袋を懸濁して、前記第１の収集袋の底部を一連の並列フィルタと第２の収集袋とに接続すること、および、
    前記第１の収集袋の内容物を前記並列フィルタに通して、前記第２の収集袋に送ること、
    を含む、請求項８に記載の方法。
21. 前記一連の並列フィルタは、２００μｍのフィルタまたは５００μｍのフィルタのいずれかを有する２つのフィルタを含む、請求項２０に記載の方法。
22. 前記第１の収集袋の前記内容物の第１の通過時には、前記２つのフィルタは２００μｍのフィルタであり、そして、第３の収集袋への、前記第２の収集袋の内容物の第２の通過時には、前記２つのフィルタは５００μｍのフィルタである、請求項２１に記載の方法。
23. 前記粉砕された骨を濾過してすすぐ工程は、粉砕された骨の脂肪分を取り除くことを含む、請求項８に記載の方法。
24. 前記粉砕された骨の前記脂肪分を取り除くことは、
    収集袋に前記粉砕された骨の懸濁液を入れること、
    懸濁時に、脂肪層が収集袋の上部に形成されるように、前記収集袋を遠心分離機にかけること、および、
    懸濁された収集袋の底部から、前記骨髄のペレットを取り出すこと、
    を含む、請求項２３に記載の方法。
25. 前記ペレットを取り出す前に、前記ペレットが取り出される時に、前記袋を挟んで前記脂肪層の通過を妨げるために、前記脂肪層の下の前記袋上にクリップが置かれる、請求項２４に記載の方法。
26. 前記骨髄細胞組成物を、凍結保存する工程をさらに含む、請求項８に記載の方法。
27. 前記骨髄細胞組成物を凍結保存する工程は、
    すすぎ用培地と凍結保存組成物の溶液として、所定の容量の冷凍培地を調製すること、および、
    所定速度で前記骨髄細胞組成物を含有する滅菌コンテナに、前記冷凍用培地を導入すること、
    を含む、請求項２６に記載の方法。
28. 前記滅菌コンテナは６０ｍＬ～７０ｍＬの骨髄細胞組成物を含有し、そして、所定容量の冷凍用培地は骨髄細胞組成物の前記容量に対して較正されている、請求項２７に記載の方法。
29. 前記所定速度は、毎分、前記冷凍用培地の前記所定容量の１０パーセント（１０％）である、請求項２７に記載の方法。
30. 前記凍結保存組成物は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、１，２プロパンジオール、エチレングリコール、グリセロール、ホルムアミド、エタンジオールまたはブタン２，３ジオール、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、デキストラン、スクロース、トレハロース、ラクトース、ラフィノース、リビトール、マンニトール、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、を含む群から選択される１以上の組成物であり得る、請求項２７に記載の方法。
31. 前記すすぎ用培地は、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ、Ｉｓｏｌｙｔｅ、およびＩＭＤＭ、
    を含む群から選択される１以上の組成物であり得る、請求項２７に記載の方法。
32. 前記冷凍用培地は、ｏｘｙｒａｓｅをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
33. 骨切断ツールであって、
    ユーザーによって把持されるように構成された端部と、向かい側の顎状の端部とを有する固定ハンドルであって、骨係合凹部を前記顎状の端部に画定する、固定ハンドルと、
    レバーハンドルであって、前記レバーハンドルは、前記固定ハンドルの方へ、および前記固定ハンドルから離れるように枢動するように、第１のピボットで前記固定ハンドルに枢動自在に接続され、そして、前記ユーザーが、前記固定ハンドルを把持して、前記レバーハンドルを前記固定ハンドルの方へ連続的に枢動させている間に、前記ユーザーによって把持されるように構成された、レバーハンドルと、
    ナイフ要素であって、前記ナイフ要素は、第２のピボットで前記固定ハンドルに枢動自在に接続され、そして、前記固定ハンドルの前記顎状の端部で、前記骨係合凹部に面したナイフエッジを含み、前記ナイフ要素は、前記固定ハンドルと前記レバーハンドルとの間に配置されたラチェットコンポーネントを含み、前記ラチェットコンポーネントは、複数の歯を含む、ナイフ要素と、
    歯止めコンポーネントであって、前記歯止めコンポーネントは、第３のピボットで前記レバーハンドルに枢動自在に接続され、そして、前記レバーハンドルの各々の連続したピボットで前記複数の歯の各々を前記固定ハンドルと係合するように、ユーザーによって配置された、歯止めコンポーネントと、
    を含み、
    ここで、前記第１のピボットの各々は、前記固定ハンドルと前記レバーハンドルの開口部を通る細長いピンを含み、前記第２のピボットは、前記固定ハンドルと前記ナイフ要素の開口部を通る細長いピンを含み、そして、前記第３のピボットは、ピボットハンドルと前記歯止めコンポーネントの開口部を通る細長いピンを含み、そして、
    ここで、各ピンは、それぞれの第１、第２、および第３のピボット内で、少なくとも１つの取り外し可能な保持リングによって、取り外し可能に保持されており、それによって、前記固定ハンドル、前記ピボットハンドル、前記ナイフ要素、および前記歯止めコンポーネントは、容易に洗浄のために分解され、そして洗浄後に再組立てされることができる、
    骨切断ツール。
34. 前記ナイフ要素は一体型リンクを含み、そして、
    前記骨切断ツールは、第４のピボットで前記レバーハンドルに枢動自在に接続され、かつ前記一体型リンクに接続されている、フリーリンクをさらに含み、前記第４のピボットは、容易に分解するための、前記ピボットハンドルと前記フリーリンクの開口部を通る細長いピンを含む、
    請求項３３に記載の骨切断ツール。
35. 前記固定ハンドル、前記ナイフ要素、前記ピボットハンドル、前記歯止めコンポーネント、および前記フリーリンクは、ステンレス鋼で形成され、そして、それらの表面は不動態化されている、請求項３３に記載の骨切断ツール。
36. 前記ステンレス鋼は硬化ステンレス鋼である、請求項３５に記載の骨切断ツール。

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