KR20220004086A

KR20220004086A - 골수의 추출 및 저온보존을 위한 시스템 및 방법

Info

Publication number: KR20220004086A
Application number: KR1020217036963A
Authority: KR
Inventors: 에릭 제이. 우즈; 브라이언 에이치. 존스톤; 동셍 구; 오브리 마리 셰리; 켈시 그웬 머살; 존 알. 우즈; 제임스 하딘; 앨런 훅스
Original assignee: 오시움 헬스, 인크.
Priority date: 2019-04-15
Filing date: 2020-03-30
Publication date: 2022-01-11
Also published as: EA202192714A1; EP3956648A4; US20210214688A1; US20200399604A1; US10995318B2; JP2022529617A; US20200399607A1; MX2021012556A; CA3136263A1; IL304832A; CN113966466A; IL287185B1; US11447750B2; IL287185A; EP3956648A1; US11085024B2; WO2020214400A1; IL287185B2; US11702637B2; US11697799B2

Abstract

사망한 기증자로부터 획득된 뼈로부터 뼈 골수를 추출하고, 저온보존하기 위해 뼈 골수를 준비하고, 저온보존된 및 새로운 골수로부터 원하는 세포들을 획득하기 위한 방법들이 제공된다.

Description

골수의 추출 및 저온보존을 위한 시스템 및 방법

관련 출원에 대한 우선권 청구 및 참고

본원은 동시계류 중인 2020년 1월 6일자에 출원된 미국 실용신안 출원 제16/734,713호, 2019년 4월 15일자 출원되고 발명의 명칭이 "System and Method for Collecting and Preserving Bone Marrow for Clinical Use"인 미국 가출원 제 62/834,087호, 및 2019년 11월 21일에 출원되고, 발명의 명칭이 "System and Method for Extraction and Cryopreservation of Bone Marrow"인 동시계류 중인 미국 가출원 제62/938,480호에 대한 우선권을 청구한다. 3개의 출원 모두의 전체 개시 내용은 본원 명세서에서 참고로 명시적으로 통합되어 있다.

임상 목적을 위한 골수는 현재 HLA 일치된 형제들 또는 최적으로 일치된 비관계 기증자로부터 획득되고 있다. 다른 이식편 소스는 또한 현재 불일치된 동일단배체의 관계 또는 비관계 기증자 및 탯줄 혈액(umbilical cord blood, CB)을 포함하여 활용된다. 소정 질환을 가진 환자 내로 이식될 때, 기증자 골수 내의 조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cell, HSC)는 환자 내에 주입되고 면역 및 조혈 계통들을 재구성한다.

골수는 또한 중배엽 간질/줄기 세포(mesenchymal stromal/stem cell, MSC)에 대해 양호한 소스이며, 이는 예컨대, 지방세포, 골세포 및 연골세포와 같은 중배엽 근원의 세포 유형들로 분화되기 위해 다중계통 퍼텐셜(multilineage potential)을 갖는 자가-갱신 다능성 전구 세포이다. 또한, MSC는 염증 부위로 이주되고, 선천성 및 후천성 면역 계통들 둘 모두와 연관된 림프구들 사이의 상호 작용을 통해 강력한 면역억제 및 항염증 효과를 발휘할 수 있다.

현재 골수는 전형적으로 투관침 바늘로 피질 뼈에 생성된 구멍을 통해 수집되고, 이어서 골수 흡인 바늘과 주사기를 사용하여 골수를 주사기 내로 흡인한다. 다수의 주사기가 일반적으로 뼈에서부터 모든 골수를 추출하는 데 필요하다. 이어서 주사기는 살균 부위에서 제거되고, 각각의 주사기는 항응고제를 수용하는 수집 백에 연결되고, 골수가 백 내로 밀려들어간다. 이 단계는 전형적으로 골반 뼈들 둘 모두에서 여러 번 반복되며 흡인물의 오염을 초래할 수 있다.

60년 전에, 사망한 기증자로부터의 보관된(banked) 전체 골수(bone marrow, BM)가 또한 HSC의 매우 생존가능한 소스라는 것이 인식되었다. 사망한 장기 기증자로부터의 고기능성 BM의 회수는 개념적으로 수십 년 동안 발생한 장기 및 조직의 조달과 유사하고, 미국에서만 매년 실시되는 30,000건 초과의 장기 이식 및 1 백만건의 조직 이식으로 이어지고 있다. 골수 HSC는 민감한 장기와 대부분의 조직보다 강인한데, 그 이유는 이러한 세포가 BM 벽감(niche) 내의 저산소 환경에 거주하도록 자연적으로 진화되었고, 따라서, 장기간 허혈을 견딜 수 있기 때문이다. HSC는 전형적으로 휴지(G0) 상태에 있고, 따라서 거의 신진대사 기질을 필요로 하지 않으며 거의 폐기물을 생성하지 않는다. 사망한 장기 기증자 BM 내의 CD34+ HSC 및 원종(progenitor)은 생존가능이 높은 것으로 나타났다. (비록 비최적화 및 비검증된 회수 및 처리 절차에서도) 장기 기증자 BM으로부터 분리된 CD34+ 세포의 생존력에 대해 발표된 값은 살아있는 기증자 BM의 경우 93.5% 와 비교하여, 95.2% 이었다. 사망한 장기 기증자는 생존가능 BM 세포의 풍부한 소스이며 통계적으로 CD34 + 생존력 및 총 유핵세포(TNC)에 의해 살아있는 기증자와 구별할 수 없다. 장기 기증자로부터 CD34+ HSC의 높은 수율과 다량의 BM은 다수의 수여자에게 이식하기 위해 다수의 BM 유닛(≥2 유닛, ~ 2x10⁶CD34+ cells/kg에서, 70kg 환자를 기준으로 함)의 뱅킹(banking)을 가능하게 할 뿐만 아니라 1차 이식편 실패의 경우에 재이식할 수 있는 확실성을 가능하게 한다.

그럼에도 불구하고, 다수의 장애물이 시체 골수의 주류 사용을 방해하고 있다. 한 가지 중요한 장애물은 사망한 기증자 골수와 그 골수로부터의 세포 수율의 통제된 추출 및 보존을 위한 능률적인 공정을 찾는 것이다. 시체 장기 기증자로부터의 현재 모범 사례의 BM 회수는 여러 명의 숙련된 오퍼레이터를 필요로 하는 다수의 수동 단계를 포함한다. 전형적으로, 척추체(vertebral body, VB)는 이식 외과의사에 의해 회수되고, 초기에 처리 실험실로 수송되기 전에 OR에서 세척되며, 여기서 척추체는 추가의 처리 단계 이전에 강한 결합 조직의 모든 잔재를 제거하기 위해 다시 매우 신중하게 세척된다. 다음으로 VB는 먼저 뼈가 큐브(cube)들로 수동으로 절단됨으로써 3개의 그룹으로 처리되고, 이어서 큐브들이 뼈 분쇄 시스템으로 공급된다. 이어서 분쇄된 뼈는 여러 번 텀블링(tumbling)되고 세정되며, 세포는 최종적으로 원심분리를 통해 농축된다. 한 번에 3개 이하의 VB가 처리될 수 있으므로, 이 절차는 기증자당 3번 반복되어야 한다. 이러한 완전한 수동의 현재 공정은 전형적으로, 기증자당 $ 10,000 초과의 전형적인 비용으로 거의 11시간의 처리 시간을 가지며 40시간의 전체 노동력을 필요로 한다.

시체 뼈의 사용에 관한 다른 관심사는 뼈의 저온보존, 뱅킹 및 회수에 관한 것이다. 특히, 관심사는 기증자 뼈, 구체적으로 지리적으로 분산된 위치에서 회수되어 냉동 뱅킹 시설로 장거리 수송된 뼈에 대해 획득될 수 있는, HSC와 같은, 생존가능 세포의 품질에 관한 것이다. 사망한 기증자로터 뼈를 회수하기 위한 공정의 모든 단계는 허혈, 또는 골수 내의 세포에 대한 산소의 부족을 포함한다. 온 허혈 시간 및 저온 허혈 시간의 변화는 시체 뼈에서 파생된 HSC 및 전구 세포의 품질에 영향을 미칠 수 있는 것으로 알려져 있다. 미국 내의 현재 조직-뱅킹 지침은, 시체가 심장 마비의 12 시간 이내에 냉동된 경우, 심장무수축(asystole)을 동반하는 최대 24 시간까지 사망한 기증자로부터 조직을 회수하도록 허용한다. 그러나, 시체 냉각은 골수의 회수와 관련하여 체계적으로 조사되지 않은 변수이다. 온 허혈 및 저온 허혈 둘 모두에 대한 허용오차 한계를 결정하는 방법에 대한 필요성이 있으며, 이는 초과하면, 회수된 세포의 품질과 기능을 치료용으로 허용할 수 없게 만들 가능성이 있다.

본 명세서에 개시된 시스템 및 방법은 기존의 골수 및 줄기 세포 소스에 필요한 보완책을 제공한다. 전형적으로, 알로-BM 이식(allo-BM transplant)을 기다리는 환자의 절반 미만이 이식을 받는다. 살아있는 기증자 BM 레지스트리, BM 저온보존 및 자동 이식, 및 탯줄 혈액 뱅킹은 혈액 질환을 가진 수천명의 환자를 위한 인명 구조 해결책을 제공하였지만, 이러한 방법은 여전히 공급 및 물류와 관련된 심각한 한계를 겪고 있으며, 이러한 가치있는 보완책으로부터 이득을 가질 것이다. 추가적으로, 비록 희소하고 불리한 사건은 살아있는 골수 기증으로부터 있을 수 있고(즉, 골수 기증과 연관된 사망 위험은 1:10,000임), 그리고 말초 혈액 줄기 세포 기증이 현재 훨씬 많이 활용되는 반면, 그러한 기증자의 거의 모두는 뼈 통증을 경험할 것이고, 4명 중 한 명은 심각한 두통, 구역질, 또는 구연산염 독성효과를 겪을 것이며, 1/5,000은 비장 파열 또는 다른 치명적인 합병증을 경험할 것이다. 추가적으로, 줄기 세포 동원 작용제의 장기적 효력은 아직 알려지지 않았다. 시체 BM 뱅킹 및 기증의 기술적 타당성은 원칙적으로 입증되었지만, 이러한 방대한 대체 공급은 현재 본 발명에 의해 직접 해결되는 쟁점으로 인해 폐기되고 있다.

본 명세서에서 개시된 바와 같은 BM의 뱅킹은 살아있는 기증자를 찾을 수 없는 많은 환자와 일치시키도록 준비된 메커니즘을 제공한다. 그것은 급속하게 진행되는 질병 및 나쁜 예후를 가진 많은 환자에 대해 주문형 이식을 허용하고 이러한 환자에 대한 대기 시간을 수 개월에서 단지 1 내지 2 일로 감소시킴으로써 이식 후 생존율을 크게 증가시킬 수 있다. 그리고 중요하게도, 이러한 접근법은 각각의 기증자로부터 다량의 BM을 제공하며, 몇몇 환자를 위한 조혈 줄기 및 전구 세포(hematopoietic stem and progenitor cell, HSPC)의 이식을 허용하고 필요할 때 BM 이식을 즉각 반복을 가능하게 하기에 충분하다.

본 명세서에 개시된 방법과 시스템은 국가 비상사태 대비 노력을 위해 주문형 골수의 대량 공급을 가능하게 한다. 원자력 사고나 공격에 대한 의료 대책으로서 주문형 골수 및 줄기 세포 이식에 대한 긴급한 충족되지 않은 필요성은 HHS, BARDA의 수십억 달러 규모의 프로젝트 바이오 실드(Project Bioshield) 및 국방부에 의해 잘 문서화되었다. 본 개시는 또한 면역 내성 유도 및 그후와 같은 새로운 응용에 필요한 골수를 제공한다. 처리를 위한 프로토콜 및 장기간 동안 장기 기증자로부터의 BM의 실제 뱅킹이 이러한 접근법에 중요하다. 추가적으로, 오늘 사망한 기증자의 장기 이식을 수여하는 환자는 이러한 기증자로부터의 BM이 보관되어 있는 경우에, 그것이 미래에 입수하게 될 때 이러한 치료법에서 유익을 얻을 수 있고 - 이 방법은 생명유지에 필요한 기관 이식 수여자에게 즉시 유익하게 만든다. 성공하는 경우에, 연구되고 있는 다른 유망한 방법 및 처리는 HLA 불일치 비관련 기증자(mMUD) BM 이식을 포함하여 제안된 방법을 사용하여 시체 BM 조달 및 뱅킹의 가치를 크게 향상시킬 가능성이 있으며 - 특히 자가 면역 장애, 유전 질환, 다발성 경화증(Multiple Scleroris) 및 제1형 당뇨병의 가혹한 형태를 해결하기 위하여, 보관된 골수의 대량 공급이 BM 이식을 신속하게 필요로 하는 대부분의 수여자에 대해 즉시 사용가능하다.

하나의 양태에서, 사망한 기증자로부터 골수 세포를 획득하기 위한 방법이 제공되며, 본 방법은, 사망한 기증자로부터 뼈를 획득하는 단계; 연조직의 뼈를 세척하는 단계; 뼈를 뼈 조각들로 분쇄하는 단계; 분쇄된 뼈를 여과하고 세정하여 액체 조성물을 생성하는 단계; 여과 및 세정을 거친 분쇄된 뼈의 액체 조성물을 원심분리하여 골수 세포를 농축하는 단계; 및 표적 세포의 저온보존 및 후속 격리를 위해 골수 세포를 살균 용기 내로 추출하는 단계를 포함한다.

추가의 양태에서, 상술한 방법으로 분쇄하기 위한 뼈를 준비하는 데 사용하기 위한 뼈 절단 도구가 제공된다. 뼈 절단 도구는 2개의 핸들, 나이프 요소 및 나이프 요소를 뼈 내로 구동하기 위한 래칫 및 폴 기구를 포함하고, 여기서 세장형 핀들이 각각의 구성 요소의 개구들을 통과함으로써 구성 요소들이 서로 연결된다. 핀은 적어도 하나의 제거가능 유지 링에 의해 유지되어, 뼈 절단 도구가 세척을 위한 분해 및 세척후 재조립이 용이하게 될 수 있다. 뼈 절단 도구는 살균 환경을 견딜 수 있도록 부동태화된 표면을 갖는 의료 등급 스테인레스강으로 형성된다.

다른 양태에서, 사망한 기증자 골수로부터 세포를 회수하기 위한 방법이 제공되고, 본 방법은, 사망한 기증자로부터 뼈를 획득하는 단계; 뼈로부터 골수 세포를 추출하기 위해 뼈를 처리하는 단계; 1.063 내지 1.052 g/mL의 밀도를 갖는 저밀도 피콜(Ficoll) 용액을 획득하는 단계; 피콜 구배(Ficoll gradient)를 형성하기 위해 저밀도 피콜 용액을 원심분리관 내로 도입하는 단계; 원심분리관 내에서 피콜 구배에 따라 추출된 골수 세포를 계층화하는 단계; 피콜 구배 및 골수 세포를 포함하는 관을 원심분리하는 단계; 원심분리관 내부에서부터 연막 세포(buffy coat cell)를 획득하는 단계; 및 후속 사용 또는 처리를 위해 획득된 세포를 세척하는 단계를 포함한다.

도 1a 내지 도 1d는 본 개시의 한 양태에 따른 수동 조작식 뼈 절단 도구의 도면이다.
도 2는 본 개시의 하나의 특징부에 따른 여과 시스템의 도면이다.
도 3은 본 개시의 방법에 따라 처리된 골수 펠릿(pellet)을 수용하는 살균 백의 도면이다.
도 4는 골수 펠릿으로부터 지방을 분리하기 위해 백과 맞물리는 클립을 갖는 도 3의 살균 백의 도면이다.
도 5는 골수 펠릿의 격리를 위한 셋업을 도시한다.
도 6은 본 개시의 한 양태에 따른 냉각 박스의 사시도이다.
도 7은 본 개시에 따른 하나의 방법의 단계들의 흐름도이다.
도 8a 및 도 8b는 본 개시의 한 양태에 따른 자동화된 뼈 처리 시스템의 측면도 및 사시도이다.
도 9a 및 도 9b는 도 8a 및 도 8b에 도시된 시스템의 뼈 창상절제 스테이션의 사시도이다.
도 10a 및 도 10b는 도 8a 및 도 8b에 도시된 시스템의 뼈 분쇄 스테이션의 사시도 및 정면도이다.
도 11은 도 8a 및 도 8b에 도시된 시스템의 시브(sieve) 스테이션의 사시도이다.
도 12a 내지 도 12c는 시체 냉각 유무에 따른, 온 허혈 시간 및 저온 허혈 시간의 함수로서 CD34+ 세포 생존능의 표이다.
도 13a 내지 도 13c는 시체 냉각 유무에 따른, 온 허혈 시간 및 저온 허혈 시간의 함수로서 CFU-Total의 표이다.
도 14a 내지 도 14c는 시체 냉각 유무에 따른, 온 허혈 시간 및 저온 허혈 시간의 함수로서 CFU-Total의 표이다.
도 15는 온 허혈 시간과 저온 허혈 시간의 함수로서 생존력 임계값의 차트이다.

본 개시의 원리에 대한 이해를 촉진하기 위해, 이제 도면에 예시되고 하기에 서술된 명세서에 기재된 실시예를 참조할 것이다. 이에 의해 본 개시의 범위에 대해 어떠한 제한도 의도하지 않는 것으로 이해된다. 또한, 본 개시는 예시된 실시예에 대한 임의의 변경 및 수정을 포함하고, 본 개시가 관련된 당업자에게 일반적으로 발생하는 것과 같이 본 명세서에 개시된 원리의 추가 응용을 포함하는 것으로 이해된다.

본 개시는 최첨단 클린룸 내의 산업적 맥락에서 구현되도록 수정되는 임상 중심의 연구 프로토콜 및 시스템을 제공한다. 개시된 시스템의 하나의 양태는, 무엇보다도, 도입되는 기증자 뼈의 창상절제, 맞춤형 수술 스테인레스강 커터를 이용한 초기 파편화, 그리고 파편화된 뼈를 ~3mm 파편 크기로 분쇄하는 것을 포함한다. 이러한 정제는 숙련된 조직 처리 기술자가 6-시간 윈도(6-hour window) 이내에 기증자 뼈의 세트를 처리하여 의미 있는 양의 생존가능 골수를 산출할 수 있는 시스템을 제공한다.

본 명세서에 기술된 공정의 제1 단계는 사망한 기증자 골수의 잠재적 소스의 평가이다. 기증자로부터의 긴 뼈, 예컨대 경골을 처리함에 있어서, 나이가 들면서 붉은색 골수가 노란색으로 변환함으로 인해, 붉은 골수가 긴 뼈의 단부로 제한되고 기증자들 사이에 극적으로 변하는 것을 발견하였다. 또한, 혼합된 노란색-붉은색 골수는 척추체 또는 장골로부터의 골수와 같이 완전한 붉은색 골수에 비해 품질이 떨어지며, 혼합된 노란색-붉은색 골수는 후속 처리 단계를 복잡하게 하는 지방 침투를 포함하는 것으로 결정되었다. 소정 임상 실험에서 가장 양호한 기증자 긴 뼈는 동일한 기증자의 장골로부터 획득한 세포에 비해 단지 1/100^th BM cells/kg을 산출하였다. 이어서, 긴 뼈 처리는 바람직하게는 여분의 가치있는 "보편적" HLA 유형 또는 HIV 내성 델타 32 돌연변이를 가진 골수를 포함하는 것과 같은 특별한 경우에만 수행되는 것으로 결정되었다.

대조적으로, 척추체 및 장골은 고품질의 붉은색 골수의 일관된 최대 저장소를 나타낸다. 두 소스 모두를 이용하는 것은, 특히 본 명세서에 개시된 산업화된 스케일러블(scalable) GMP 공정의 구현에 의해 골수의 회수를 최적화하였다. 본 명세서에 개시된 공정의 완성은, 자가 이식을 위해 저온보존된 BM에 이미 사용되는 제품 구성과 유사한, 표준 혈액백에 1억 내지 1억 5천만 TNC/ml의 목표에 60 내지 70 ml 체적을 저장하는 최종 제품 구성의 저온보존을 초래한다.

기증자 뼈 준비

예시의 목적을 위해, 기증자 뼈는 척추체인 것으로 가정된다. 그러나, 본 명세서에 기재된 방법은 장골, 척추체와 장골의 조합, 또는 골수 및 골수로부터의 세포의 추출에 적합한 다른 뼈, 심지어 예상 수율이 낮은 기증자 뼈에도 사용될 수 있는 것으로 이해된다.

기증자 뼈는 임상적 회수를 위한 고정된 프로토콜에 따라 조달될 수 있는 것으로 이해된다. 뼈는 동의한 기관 및 조직 기증자로부터 절골도 및 망치를 사용하여 외과의사 또는 훈련된 OPO(organ pr℃urement organization: 장기 조달 조직)의 직원에 의해 회수될 수 있다. 미처리된 뼈는 가공 시설로 0 내지 10 ℉의 온도에서 습한 얼음 상에서 저체온 수송 동안 습기 유지를 보장하기 위해 염수에 담근 스폰지와 수건으로 바람직하게 싸이게 된다.

기증자 뼈를 준비하는 공정은 사망한 기증자로부터 뼈를 획득한 직후에 발생하거나 기증자 뼈가 저체온 환경에서 처리 시설로 수송된 후에 발생할 수 있다. 기증자 뼈는 회수 및 처리 시설로의 수송 동안 장기간의 허혈을 경험할 수 있기 때문에, 허혈의 길이와 유형 - 즉, 온 허혈 및 저온 허혈 - 을 추적하는 데 주의를 기울여야 한다. 본 명세서에 더 상세히 기술된 바와 같이, 미리결정된 기간의 온 허혈 및/또는 저온 허혈로 처리된 뼈는 생존가능 골수 세포의 의미있는 양을 얻기에 적합하다.

기증자 뼈를 처리하는 제1 단계에서, 뼈는 ISO-7(클래스 10,000) 배경(클린룸)을 갖는 ISO-5(클래스 100) 환경(생물안전 보관장)에서 창상절제되며, 이때 70%의 이소프로판올을 살포하는 것과 같이, 기증자 뼈를 수용한 백을 살균하는 데 특별한 주의를 기울인다. 일 실시예에서, 창상절제는 메스, 골절도 및 가우지(gouge)를 사용하여 수동으로 수행된다. 척추를 처리하는 경우에, 전형적으로 다수의 척추 수준을 포함하는 척추 세그먼트가 제공될 것이다. 전형적인 경우에, 척추 세그먼트는 10개의 척추체에 대해 T8에서 L5로 실행된다. 척추 세그먼트의 초기 창상절제 동안, 줄기피(pedicle)를 시각화하기에 충분한 연조직이 제거되었을때, 줄기피는, 예컨대 스트라이커 시스템 6 톱(Stryker System 6 Saw)(미국, 미시간주, 나이프라마주, 스트라이커)과 같은, 조직 처리 띠톱 또는 뼈 톱을 사용하여 제거된다. 저산소 망상조직 골수가 전체 창상절제 공정을 통해 보호된 상태로 유지되는 것을 보장하기 위해, 망상조직 뼈를 노출시킬 피질 뼈의 파손을 피하기 위한 특별한 주의를 기울어야 한다. 척추체의 전방 요소는 유지되는 한편, 줄기피 및 후방 요소는 폐기된다.

보닝 나이프(boning knife) 또는 조직 처리 띠톱을 사용하여 척추체는 추간판 디스크에서 분리된다. 각각의 척추체에 남아있는 추간판 디스크 및 연조직은 메스, 가위 및 / 또는 절골도로 제거되어 깨끗한 분리된 VB를 남긴다. 기증자 장골의 경우, 연조직은 가우지와 메스로 제거될 수 있으며, 이때 다시 피질 뼈가 파손되지 않는 것을 보장하기 위해 특별히 주의해야 한다. 뼈의 임의의 해부학 병상 또는 부상은 궁극적으로 뼈로부터 획득된 골수에 대한 배치 레코드(batch record)의 일부로서 언급되고 기록된다. 회수 공정 동안 손상된 뼈는 폐기된다.

VB는 살균 백 내에 배치되고 10% 표백액에 침지되어, 소정의 기간 동안 통상적으로 10 내지 25분 동안 5,000 ppm 무염소의 농도를 산출한다. 표백제는 항균 활성의 넓은 스펙트럼을 가지고, 독성 잔류물을 남기지 않으며, 물 경도(water hardness)의 영향을 받지 않으며, 신속히 작용한다. 기간이 끝나면, 뼈는 다른 살균 백으로 이송되고 3% 과산화수소(H₂O₂)용액에 침지된다. 뼈의 전체 표면이 용액과 접촉상태에 있음을 보장하도록 백을 닫고 얼마동안 흔든다. 대부분의 살아있는 세포는 카탈라아제(catalase)를 포함하며, 이는 H₂O₂ 의 H₂O 및 O₂로의 분해를촉진하는 효소이다. 이러한 분해는 H₂O₂ 용액이 뼈가 아닌 연조직에 접촉할 때 발포 또는 거품으로서 나타난다. 발포 수준은 뼈에 남아있는 연조직의 양을 나타내는 지표로서 관찰될 수 있다. 이러한 관찰은 인간 프로세서에 의해 수동으로, 또는 다른 실시예에서 자동화 프로세서에 의해 수행될 수 있다. 자동화 프로세서는 카메라와 같은 시각화 장치, 및 백 내의 발포 수준을 결정할 수 있는 개체 인식 소프트웨어를 통합한다. 불활성 대조 염료의 첨가는 인간 또는 자동화 프로세서가 발포 수준을 검출하는 데 도움을 줄 수 있다. 임의의 발포 또는 거품이 관찰되는 경우에, 뼈는 추가 처리를 위해 반환되어 뼈로부터 남아있는 연조직을 모두 제거하게 된다. 일단 VB 또는 장골이 모든 연조직에서 세척되면, 뼈는 새로운 살균 백으로 이송된다. 백은 1L의 PLASMA-LYTE™(Baxter Healthcare, Ltd.로부터 입수된 다중 전해질 주입물), 또는 다른 적합한 살균성 비피로겐 등장액(nonpyrogenic isotonic solution)으로 채워진다. 전체 뼈가 PLASMA-LYTE™과 접촉상태에 있음을 보장하도록 백을 닫고 얼마동안 흔든다.

골수 추출

뼈는 백에서 및 PLASMA-LYTE™에서 제거되며, 살균 거즈 또는 스폰지가 VB에 남아있는 임의의 액체를 흡수하는 데 사용된다. 한 가지 접근법에서, 톱 및/또는 모루 가위(anvil shears)가 절단하는 데 사용되고, VB는 1.5cm²피스와 같은 작은 조각으로 절단되고, 이는 뼈 분쇄기로 파편화될 정도로 충분히 작다. 공정을 단순화하기 위해 그리고 처리 요원에 대한 안전성 향상을 위해, 더 작은 조각으로 VB를 절단하는 데 사용되는 도 1a 내지 도 1d에 도시된 바와 같이 주문형 뼈 절단 도구(100)가 제공된다. 뼈 절단 도구(100)는 뼈를 관통하고 절단하도록 구성된 칼날(102a)을 갖는 나이프 요소(102)를 포함한다. 나이프 요소(102)는 피벗(105)에서 고정 핸들 구성요소(104)에 피벗가능하게 연결된다. 고정 핸들 구성요소(104)는 조오 단부(104a)를 포함하며, 이는 조오 단부에 유지된 뼈를 절단하기 위해 칼날(102a)과 나란히 배치된다. 도 1b에 도시된 바와 같이, 고정 핸들 구성요소는 도 1b 내지 도 1d에서 가장 잘 볼 수 있듯이, 그들 사이에 나이프 구성요소를 수용하도록 이격된 2개의 플레이트(104d)를 포함한다. 특히, 칼날(102a)은 조오 단부(104a)에서 2개의 플레이트(104d)들 사이를 통과하며, 이는 칼날(102a)이 조오 단부(104a)에 의해 포착된 뼈를 통과하도록 보장한다. 조오 단부(104a)는 리지 (104b)에 의해 분리된 두 개의 리세스(104c)를 포함할 수 있고, 칼날(102a)이 뼈를 통과할 때 리지(104b)는 뼈와 맞물리고 조오 단부 내에 뼈를 보유하는 데 도움을 준다. 대안적으로, 단일 리세스가 뼈를 유지하도록 구성된 조오 단부 내에 한정될 수 있다. 피벗(105)은 2개의 플레이트(104d) 및 플레이트들 사이에 개재된 나이프 구성요소(102)를 통해 연장되는 핀의 형태이다.

뼈 절단 도구(100)는 피벗(109)에서 고정 핸들(104)에 피벗가능하게 장착되는 레버 핸들(107)을 포함한다. 피벗은 고정 핸들(104)로부터 멀어지게 레버 핸들(107)을 편의하도록 구성된 비틀림 스프링(도시되지 않음)과 같은 편의 요소를 포함할 수 있다. 따라서 레버 핸들은 사용자가 두 개의 핸들을 잡고 압착할 때 고정 핸들을 향해 피벗되고, 이어서 사용자가 핸들 상의 그립을 해제할 때 고정 핸들에서 멀어지게 피벗하도록 구성된다. 레버 핸들(107)은 피벗(109)에서 2개의 플레이트(107a)들 사이에 개재된 고정 핸들(104)을 갖는 2개의 플레이트(107a)로 형성된다는 것을 이해할 수 있다. 피벗(105)과 마찬가지로, 피벗(109)은 2개의 플레이트(107a)를 통해 그리고 고정 핸들(104)을 통해 연장되는 핀의 형태이다. 2개의 핸들(104, 107) 모두는 사용자의 손바닥과 손가락에 의해 파지되는 윤곽을 갖는 각자의 그립 플레이트(gripping plate)(106, 108)를 포함한다. 그립 플레이트들(106, 108)은 2개의 핸들을 형성하는 한 쌍의 플레이트(104d, 107a)에 연결되었다. 그립 플레이트의 표면은 도구를 파지하기에 용이하게 하는 미끄럼 방지 특징부를 포함할 수 있다.

레버 핸들(107)은 피벗(113)에서 레버 핸들에 피벗가능하게 장착되는 폴(112)을 포함한다. 다른 피벗과 마찬가지로, 피벗(113)은 레버 핸들(107)을 형성하는 한 쌍의 플레이트(107a)를 통해 그리고 폴(112)의 한 단부를 통해 연장되는 핀이다. 피벗(113)은 비틀림 스프링(도시되지 않음)과 같은 편의 요소를 포함하며, 이는 나이프 요소(102)의 래칫 구성요소(110)를 향해 폴(112)을 편의시킨다. 폴(112)의 단부는 래칫 구성요소(110) 상의 치형부(110a)와 맞물려 래칫 구성요소를 회전시키고, 따라서 도 1a에 도시된 바와 같이 반시계 방향으로, 나이프 요소(102)를 회전시키도록 구성된다. 특히, 사용자가 2개의 핸들을 함께 압박함에 따라, 레버 핸들(107)이 고정 핸들(104)을 향해 이동되고, 이는 래칫의 치형부(110a)에 대해 폴(112)을 상향으로 밀어 올려 래칫을 상향으로 그리고 반시계 방향으로 피벗시킨다. 사용자가 레버 핸들을 해제하면, 핸들이 고정 핸들에서 멀리 이동되어, 폴(112)이 다른 치형부(112a)에 도달될 때까지 시계 방향으로 래칫을 아래로 미끄러지게 한다. 따라서 2개의 핸들의 반복적인 압박은 폴이 래칫을 연속적으로 회전시키도록 야기한다. 나이프 요소(102)는 또한 피벗(116)에서 자유 링크(114)에 피벗가능하게 연결되는 일체형 링크(103)를 포함한다. 자유 링크(114)는 피벗(115)에서 레버 핸들(107)에 피벗가능하게 연결된다. 폴이 래칫 구성요소(110)을 횡단할 때 일체형 링크(103) 및 자유 링크(114)는 나이프 요소(102)를 제위치에 보유한다. 자유 링크의 피벗(115)은 다른 피벗과 마찬가지로 핀이며, 그리고 고정 핸들(104)로부터 멀어지게 레버 핸들을 편의시키는 비틀림 스프링(도시되지 않음)과 같은 편의 요소를 포함한다. 이는 사용자가 도구의 핸들을 폐쇄 및 해제하도록 허용하여 래칫 구성요소(110)를 따라 폴(112)을 연속적으로 전진시키며, 이는 칼날(102a)을 뼈 안으로 연속적으로 전진시킨다.

본 개시의 뼈 절삭 도구(100)의 하나의 특징부에서, 피벗들(103, 109, 113, 115)은 도구의 완전한 분해를 허용하도록 구성된다. 완전한 분해는 도구를 완전히 세척하고 사용 동안 살균할 수 있도록 하는 데 중요하다. 따라서, 피벗들 각각은 핀 및 유지 링 구조물을 포함하며, 이때 유지 링은 핀 상의 구성 요소들을 함께 보유한다. 따라서, 도 1d에 도시된 바와 같이, 핀(121)은 레버 핸들(107)의 대향한 벽(107a)들과 같은 구성요소의 벽들을 통해, 그리고 나이프 요소(102)와 같이, 연결되는 구성요소 내의 대응하는 보어를 통해 연장될 수 있다. 유지 링(122)들은 핀(121)의 대향한 단부들에 있는 홈(123)들과 맞물려 구성요소들을 함께 보유할 수 있다. 대안적으로, 핀의 하나의 단부는 유지 링이 핀의 반대쪽 단부와 맞물리는 상태에 의해 확대된 헤드를 가질 수 있다. 도구(100)를 세척하고 살균할 필요가 있는 경우, 모든 유지 링(122)이 제거될 수 있고, 모든 핀(121)이 제거될 수 있고, 연결된 구성요소들이 분리될 수 있다. 따라서 나이프 요소(102), 고정 핸들(104) 및 레버 핸들(107)이 분리되어, 구성요소들의 모든 표면이 효과적으로 세척될 수 있다.

뼈 절단 도구(100)의 요소는 의료등급 스테인레스강으로 형성된다. 이 강은 뼈를 절단하는 데 필요한 힘을 견딜 수 있는 경화된 강이다. 세척 공정에서, 도구는 강에 해로울 수 있는 증기 살균을 받는다. 따라서, 본 개시의 하나의 특징부에서, 스테인레스강 요소의 표면은 살균 동안 강철 요소의 산화를 방지하도록 부동태화된다.

공정 단계로 돌아가서, 특히 골수를 추출하는 단계로 돌아가서, 뼈 절단 도구에 의해 생성된 조각은 즉시 살균 피처(pitcher) 내로 배치되어 300 내지 500mL의 분쇄 매체 내에 침지된다. 본 시스템 및 방법의 하나의 양태에서, 분쇄 매체는 10 U/mL 헤파린, 2.5% 인혈청 알부민(HSA), 3 U/mL Benzonase® 시약(Merck KGAA Corporation)을 갖는 베이스로서 PLASMA-LYTE™-A를 사용한다. 헤파린은 항응고제로 사용된다. HSA는 표면에 대한 세포 접착 및 흡착뿐아니라 반응성 산소 소거를 방지하도록 단백질 소스를 제공한다. 종래의 분쇄 매체는 DNase를 활용하지만, 본 개시의 경우 Benzonase® 시약이 DNase™ 시약(Qiagen Sciences LLC)을 대체한다는 점에 주의해야 한다. DNase는 DNA에서만 작용하는 반면, 현대의 제약 생명공학 처리는, DNA와 RNA의 모든 형태를 갈라낼 수 있고 그리고 세포가 현탁되는 용액의 점도를 감소시킬 수 있는 효소에 의존한다. IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Media)이 고밀도 세포 배양을 빠르게 확산시키는 데 적합하며 T- 및 B-림프구를 지원하는 데 이상적이기 때문에, IMDM은 PLASMA-LYTE™-A를 대체할 수 있는 점에 주의한다. 또한 Denarase® 시약(C-Lecta GmbH)은 본 공정에서 동일한 양의 Benzonase® 시약과 동등하다는 점에 주의한다. 300 내지 500mL의 분쇄 매체의 다른 피처는 분쇄 후 뼈 파편들을 수집하기 위해 유지되며, 뼈 파편이 분쇄 구성요소의 피처의 표면에 고착되는 것을 방지하도록 분쇄 동안 분쇄기를 세정하기 위해 약 100mL의 분쇄 매체의 다른 공급이 유지된다.

전기 뼈 분쇄기 또는 바이오렙 테크놀로지스 인크.(Biorep Technologies Inc.)(미국 플로리다주, 마이애미)의 분쇄기와 같은 특수 제작된 뼈 분쇄기는 ISO-7 클린룸 내의 ISO-5 환경에서 사용될 수 있다. 동일한 기증자로부터 VB와 장골 둘 모두가 처리되는 경우 뼈 유형들은 개별로 유지된다. 뼈는 분쇄 과정 동안 및 그 후에 항상 분쇄 매체 내에 침지된 채로 유지된다. 모든 기증자의 뼈 조각들이 분쇄되면, 뼈 분쇄기의 챔버는 새로운 가공 매체로 완전히 세정된다. 뼈 파편들은 분쇄기로부터 분쇄 매체를 수용하는 피처 내로 배출된다.

피처의 내용물이 살균 백으로 이송된다. 다음 단계에서, 살균 백의 내용물이 여과되어 고체 성분을 추출한다. 일 실시예에서, 각각의 백의 내용물은 일련의 스테인레스강 시브를 통과한다. 본 실시예에서, No. 40(425 μm) 시브는 No. 80(177 μm) 시브의 상단에 적층되고, 이는 액체 필터 내용물을 수용하도록 캐치-팬(catch-pan) 위에 안착되어 있다. 분쇄기의 출력을 수용하는 살균 백은 선회되고, 이어서 시브 스택 또는 여과 세트 위에 균일하게 부어지게 된다. 연조직 또는 기타 오염물질의 존재를 신호할 수 있는 과도한 군집(clumping)이 발생하지 않는다는 것이 보장되도록 여과 공정을 관찰한다. 시브의 표면 상에 유지되는 뼈 파편은 시브 상에서 균일하게 분포되고 250 mL의 새로운 가공 매체로 세정된다. 일 실시예에서, 세정하는 데 사용되는 처리 매체는 2.5 %의 HSA를 가진 상술한 분쇄 매체 또는 PLASMA-LYTE™이다. 양호하게 수행된 공정에서 약 1,000 mL일 수 있는 시브된 골수 제품은 후속 처리 및 분석을 위해 살균 팩으로 이송된다. 각각의 백의 내용물은 임의의 가시적 뼈 파편이나 연조직을 포함하지 않는다는 것을 확인하기 위해 육안으로 검사된다.

다른 실시예에서, 도 2에 도시된 바와 같이, 각각의 백의 내용물이 골수 여과 유닛을 통해 지나간다. 본 실시예에서, 시스템(150)은 상술한 분쇄 작업으로부터 뼈 파편 및 매체를 수용하는 살균 수집 백(152)을 지지하도록 구성된 스탠드(154)를 포함한다. 스탠드는 용기를 매달기 위해 살균 백의 캡(153)과 맞물리도록 구성된 용기 행거(155)를 포함한다. 백의 바닥은 수집 백의 몸체 내로 돌출되는 예비-필터(pre-filter)(162)를 포함하는 배출 조립체(160)를 포함한다. 하나의 특정 실시예에서, 예비-필터(162)는 850μm 필터이다. 필터(16)는 출력 튜브(164)에 연결되고, 이는 용기 클레임(container claim)(166)에 의해 제1 인라인 필터(170)의 입력 라인(171)에 연결된다. 특정 실시예에서, 제1 인라인 필터는 200 μm 또는 500 μm 필터이다. 제1 인라인 필터의 출력 라인(172)은 제2 인라인 필터(175)의 입력 라인(176)에 연결된다. 제2 인라인 필터는 200 μm 또는 500 μm 필터이다. 2개의 인라인 필터는 초기에 필터 시스템(150)을 통과하는 제1 패스에 대해 둘 모두다 500 μm이다. 이어서 제2 세정이 200 μm인 2개의 인라인 필터에 의해 분쇄 시에 수행된다. 이러한 이중-패스 여과는 더 깨끗한 현탁액을 초래하고 현탁액으로부터 지방 제거를 향상시킨다. 제2 인라인 필터(175)는 제2 여과 패스를 위한 백(152)과 같은, 살균 백에 맞물릴 수 있는 출력 라인(177)을 가진다. 시스템을 통과하는 제2 패스에서, 제2 인라인 필터(175)의 출력 라인(177)은 이송 팩 용기(180)의 용기 클램프(181)에 맞물릴 수 있다. 이송 팩 용기는 양호하게 수행된 공정에서 약 1000 mL일 수 있는 여과된 골수 제품을 수용할 수 있도록 600 내지 2000 mL 백일 수 있다.

품질 관리를 위해, 0.3 mL와 같은 소량의 골수가 주입 부위(157)에서 주사기를 사용하여 살균 팩(152)으로부터 추출되고 샘플을 뽑아내기 전에 역전 혼합이 수행된다. 샘플은 시스멕스 혈액학 분석기(Sysmex Hematology Analyzer)와 같은 혈액학 분석기에 의해 테스트되어, 연속적으로 처리되는 골수의 TNC 함량의 지표로서 샘플의 TNC(total nucleated cell: 총 유핵 세포) 함량을 결정할 수 있다.

지방 제거 및 농축

여과 단계에서 수집된 골수 제품은 본질적으로 지방 유화제이다. 상술한 시브 여과 접근법으로부터 획득된 현탁액의 지방 함량은 이중-패스 여과 시스템(150)으로부터 획득된 현탁액의 지방 함량보다 크다. 그러나, 두 경우 모두, 현탁액으로부터 지방 함유물을 제거할 필요가 있다. 여과 단계에서 획득된 현탁액은 튜브 용접기로 기밀하게 밀봉된 250 mL 백 내로 회수된다. 살균 백들 및 테어링 스틱(taring stick)들의 쌍들은 아래를 향하는 백 포트를 갖는 원심분리기 내에 장착되며, 균형이 맞추어진다. 체적 보정 플레이트는 원심 분리 중에 백의 구김(creasing)을 방지하는 데 사용된다. 일 실시예에서, 백은 실온에서 15분 동안 500 xg에서 원심분리되어 세포를, 바람직하게는 2 내지 3x10⁸/ml로 농축된다. 원심분리가 완료된 후, 각각의 백은 링 스탠드에 개별적으로 걸려 있다. 도 3에 도시된 바와 같이, 백 내의 개별 층들은 가시적이며, 이때 지방 층은 바닥에 골수 펠릿을 갖는 상청액의 상단에 명확하게 묘사되어 있다. 새로운 살균 백이 원심분리기에서 제거된 백에 용접된다. 백 클램프 또는 클립(190)은 도 4에 도시된 바와 같이 지방층 바로 아래에서 백 상에 배치되어, 지방층 아래에 폐쇄된 백을 고정하거나 압박한다. 이어서 펠릿이 원심분리 백에서부터 새로운 살균 백으로 배출되며, 이때 백 클립이 지방 층의 통과를 방지한다. 펠릿은 그것이 배출됨에 따라 교반되어 모든 펠릿을 재현탁하도록 한다. 펠릿의 약 절반이 새로운 백 내로 배출된 후, 배관(tubing)은 헤모스타트(hemostat) 또는 튜브 실러(tube sealer)로 폐쇄된다. 이어서 제2 원심분리 백은 펠릿을 수용하는 새로운 백에 용접되며, 제2 원심분리 백의 내용물이 새로운 백 내로 배출된다.

이러한 단계의 결과는 지방을 제거하기 위해 원심분리된 골수를 수용하는 새로운 살균 백이다. 이어서 탈지된(de-fatted) 골수의 이들 백은 실온에서 15 분 동안 500 xg에서 원심분리되며, 이때 체적 보정 플레이트가 백의 구김을 방지한다. 각각의 백이 제거되고 링 스탠드 상에 현수되고, 이 백에 폐기 봉투가 용접되고, 플라즈마 추출기가 도 5에 도시된 바와 같이, 폐기 봉투 내로 상청액을 제거하는 데 사용된다. 펠릿이 상승하거나 파손될 때, 배관은 헤모스타트로 고정된다. 이어서 배관이 밀봉되고 절단되어, 폐기되는 폐기 봉투로부터 펠릿-수용 백을 제거한다. 루어 연결부가 펠릿-수용 백에 용접된다. 각각의 백으로부터의 펠릿은 대형 주사기를 사용하여 벌크 백 내에 모이게 된다. 펠릿-수용 백은 세정 매체를 사용하여 벌크 백 내로 세정된다. 벌크 백은 모든 펠릿이 다시 현수되는 것을 보장하도록 여러 번 역전된다. 0.5 mL과 같은 소량의 처리된 BM은 밀도 및 세포 수에 대한 품질 관리 테스트를 위해 제거될 수 있다. 테스트 샘플은 또한 특히, 인간 백혈구 항원, CCR5delta 32 돌연변이 및 아폴리포단백질(apolipoprotein)(APOE)에 대해 평가될 수 있다.

골수의 저온보존

각각의 뼈 기증자는, 기증자로부터 획득된 10개의 척추와 장골을 기준으로 상술한 공정을 통해 골수의 3개 이상의 골수 백을 산출할 수 있는 것으로 고려된다. 주어진 기증자에 대한 공정의 끝에 3개의 골수 백이 획득되지 않는 경우, 기증자는 잠재적으로 전반적인 품질 관리를 통과하지 않은 것으로서 표시될 수 있다. 각각의 백 내에 미리결정된 체적의 골수가 고려되는데, 예컨대 250 mL 백 내에 70 mL가 수용된 것으로 고려된다. 이러한 미리결정된 체적은 골수 펠릿의 효율적인 저온보존에 필요한 동결 매체 성분의 체적을 계산하는 데 사용된다. 동결 매체는 세정 매체 및 저온보존 조성물(cryopreservation composition)의 용액이다. 동결보호제 조성물(cryoprotectant composition)은 디메틸 술폭시드(DMSO); 1,2 프로판 디올; 에틸렌 글리콜; 글리세롤; 포라마미드(foramamide); 에탄디올 또는 부탄 2,3 디올과 같은 침투성 매체; 및/또는 하이드록시에틸 전분(HES), 덱스트란(Dextran), 자당, 트레할로스, 유당, 라피노스, 리보톨(Ribotol), 매니톨(Mannitol) 또는 폴리비닐피롤리돈(PVP)과 같은 비침투성 매체일 수 있다. 또한 2.5% HSA는 삼투압, 세포 표면 단백질 안정화 및 반응성 산소 소거를 통해 동결보호를 제공한다. 바람직한 실시예에서, 저온보존 매체는 DMSO이다. 세정 매체는 플라즈마리테(PlasmaLyte), 이솔리테(Isolyte), IMDM 또는 주입에 적합한 다른 전해질 용액과 같은 전해질 매체일 수 있다. 동결 매체는 또한 산소 함량을 대기 미만, 예컨대 대기 농도의 3% 미만으로 감소시키기 위해 옥시라제(oxyrase)의 농도를 포함할 수 있다. 옥시라제의 첨가는 저온보존을 용이하게 할 수 있는 감압(hypobaric) 조성물을 생성한다.

동결 매체는 이전 단계에서 수집된 골수의 체적에 필요한 냉동 매체의 계산된 총 체적에 따라 동결보호제 및 세정 매체를 혼합함으로써 제조된다. 골수를 수용하는 백은 혼합을 위해 로커(r℃ker) 상에 배치되고, 동결 매체가 주사기에 의해 백 내로 도입된다. 동결 매체는 미리결정된 시간에 걸쳐 특정 비율로 도입된다. 일 실시예에서, 동결 매체는, 분당, 매체의 10%의 비율로 10분 동안 첨가된다. 일단 매체가 농축된 골수와 혼합되면, 테스트 샘플은 주사기에 의해 추출된다. 동결 매체와 골수의 나머지 혼합물은 개별 저온보존 백들 내로 미리결정된 양이 주입된다. 일 실시예에서, 70 mL의 골수 혼합물이 각각의 저온보존 백 내로 도입되고, 공기는 주사기에 의해 인출된다. 공정이 끝나면, 살균 테스트를 위해 8 mL 샘플이 제거될 수 있다. 각각의 저온보존 백은 4개의 격실을 생성하도록 밀봉되고, 이는 이어서 카세트에 보관하기 위해 분리되어 동결-냉동고(cryo-freezer) 내에 보관된다. 또 다른 실시예에서, 분리된 격실은 도 6에 도시된 냉각박스(200)와 같은 수동 냉각박스 내에 보관된다.

특정 골수 배치로부터의 테스트 샘플이 세포 수 및 살균성에 대해 검증된 경우, 저온보존된 골수의 백은 장기간 보관을 위해 추가로 냉각될 수 있다. 일 실시예에서, 백은 골수와 세포의 손상을 방지하기 위해 제어된 속도로 냉각된다. 하나의 특정 실시예에서, 백은 분당 -1 내지 -40 ℃의 속도로 백을 액체 질소 내로 급락시키는 데 적합한 온도로 냉각된다. 적합한 온도는 -40 내지 -100 ℃의 범위이다. 일단 그러한 온도에 도달되었으면, 백은 보관을 위한 -130 ℃ 미만의 온도로 더 빠른 속도로 추가로 냉각된다. 저온보존 백은 냉각박스(200)의 해당 격실들(201 내지 203) 내에 배치되고, 중첩 커버(205)가 백의 내용물의 저온보존을 위한 밀봉 환경을 제공하도록 격실 위로 폐쇄된다. 냉각박스는, 냉각박스가 -0.5 내지 -2 ℃/min의 냉각 속도, 전형적으로 -1 ℃/min의 냉각 속도를 생성하고 핵생성 온도가 -20 ℃ 초과하는 상태로 동결-냉동고 내에 배치된다. 동결 공정은 골수의 온도가 적합한 온도에 도달될 때까지 규정 속도로 계속된다. 백의 보관에 적합한 온도는 온도 -80 ℃ 이하 또는 -150 ℃ 이하이다.

다른 실시예에서, 상술한 제어된 속도의 저온보존과는 반대로, 백은 정적 챔버 온도에서 냉각된다. 수동 냉각 접근법에서, 냉각박스는 백이 안정적인 온도에 도달될 때까지 -86 ℃ 냉동고 내에 배치된다.

저온보존 보관은 여러 형태로 될 수 있다고 생각된다. 예를 들어, 저온보존된 골수는 1 mL 내지 5 mL 체적의 백 또는 0.1 내지 15 mL 체적의 병(vial) 내에 수용될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 70 mL 골수를 가진 백은 동결 냉동고 내의 냉각박스 내에 보관된다.

저온보존된 골수는 원하는 세포의 차후 해동 및 추출을 위해 동결뱅킹된다. 해동된 골수는 백혈병, 뇌종양, 유방암, 호지킨 병(Hodgkin's disease), 다발성 골수종, 신경모세포종, 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 혈액암, 난소암, 육종, 고환암, 기타 고형 장기암, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 당뇨병(diabetes mellitus), 낭포성 섬유증, 알츠하이머 병, 유전적 면역결핍증(genetic immunodeficiencies), 대사 장애, 골수 부전 증후군(marrow failure syndromes), 및 HIV에 대한 치료를 포함한 광범위한 치료법에 대해 제공될 수 있다. 골수는 또한 장기 기증자로부터 획득된 임플란트(implant)의 잠재적인 거부를 감소시키기 위하여 면역내성의 유도를 위해 이용될 수 있다. 골수 치료는 또한 방사선 및 소정 생물학 무기로 인한 피해자에 대해 권고될 수 있다.

골수는 상술한 방법을 사용하여 이전에 동결-뱅킹된 장기 및 조직 기증자 뼈로부터 획득될 수 있는 중간엽 간질/줄기 세포(MSC)에 대해 잘 알려진 소스이다. MSC는 지방세포, 골세포 및 연골세포와 같은 중배엽 근원의 세포 유형으로 분화되기 위해 다중계통 퍼텐셜을 갖는 자가-갱신 다능성 전구 세포이다. 또한, MSC는 염증 부위로 이주되고, 선천성 및 후천성 면역 계통 둘 모두와 연관된 림프구들 사이의 상호 작용을 통해 강력한 면역억제 및 항염증 효과를 발휘할 수 있다. MSC는 불완전한 골형성, 연골 결손, 심근 경색, 크론병(Crohn's disease), 다발성 경화증, 루푸스(Rupus)와 같은 자가면역질환, 간경화증, 골관절염, 및 류머티스성 관절염을 치료하는 데 사용될 수 있다. 이식편 대 숙주병 (GVHD)의 치료를 위해 및 조혈 줄기 세포 이식을 위해 공동-이식(co-transplant)에 사용될 수 있는 일치된 HSC/MSC 유닛이 지원한다.

본 방법은 도 7의 흐름도에 요약된 바와 같이, 상술한 공정 단계에 따라 향후 임상 사용을 위한 골수를 추출 및 뱅킹하는 시스템을 제공한다. 이러한 방법은 소정의 소수집단과 같이 일치하기 어려운 그룹에 골수 기증자를 일치시키는 현재 방법의 실패를 제거할 수 있다. 일단 골수가 저온보존되고 뱅킹되면, 골수의 소스에 대한 불확실성이 없고, 향후의 수여자를 기다릴 필요가 없으며, 골수는 반복가능한 대량 체적으로 입수가능할 수 있다.

골수의 회수를 위한 자동화 시스템

본 개시는 골수의 회수 및 심지어 골수로부터의 세포의 선택을 위한 자동화 공정을 고려한다. 하나의 양태에서, 자동화 시스템(209)은 도 8a 및 도 8b에 도시된 바와 같이, 순차적 스테이션들을 포함한다. 자동화 공정의 제1 스테이션(210)은 모든 연조직을 제거하기 위해 VB를 창상절제한다. 한 번에 하나의 VB에서 작동하는 수동 공정과는 대조적으로, 자동화 공정은 전체 기증자 VB 세트(최소 10개의 척추체일 수 있음)를 창상절제하도록 구성된다. VB는 주어진 기증자로부터 설정된 척추체를 지지하도록 구성된 랙 또는 트레이(212) 상에 장착된다. 트레이 (212)는 도 9a 및 도 9b에 도시된 바와 같이, 하우징(215)의 이송 레일(216) 상에 배치되며, 이때 트레이는 하우징 내부로 자동으로 또는 수동으로 전진된다. 하우징(215)은 염수의 고압 및 고속 제트를 VB로 지향하는 복수의 하이드로젯(hydrojet)(220)을 지지한다. 알려진 수동 공정에서, 저속 및 저압에서 작동하는 수동 하이드로젯은 세제 스트림을 VB로 지향한다. 수동 공정에서, 세제는 연조직의 VB를 세척하는 데 필요하다. 대조적으로, 본 개시의 자동화 세척 스테이션(210)은 염수 매체를 사용하며, 이때 워터 젯의 속도와 압력은 VB로부터 모든 연조직을 제거하기에 충분하다. 본 개시의 자동화 세척 스테이션은 다양한 거리에서 고도의 집중된 충격력을 생성하는 직접 스트림 또는 협소한 "V" 물/염수 젯을 생성하도록 구성된 젯을 포함한다. VB의 양호한 커버리지(coverage)를 달성하기 위해, 이 장치는 VB에 대해 상이한 배향들로 근접한 간격으로 많은 직접 젯을 포함하며, 이는 장치 내의 VB의 위치와는 별개로 균일한 세척을 가능하게 한다. 도 9a의 예시된 실시예에서, 하이드로젯들은 상부 행(row)(220) 및 하부 행(221)으로 제공된다. "V" 젯들은 VB들의 표면들의 완전한 커버리지를 달성하도록 상이한 각도들로 정렬된다. 추가적으로, 또는 대안적으로, 하이드로젯들(220, 221)은 완전한 커버리지를 보장하기 위해 VB의 트레이 위에서 진동하도록 구성될 수 있다.

시각화 장치(225)는 도 9b에 도시된 바와 같이, 모든 연조직이 제거되었는지 확인하기 위해 스테이션을 빠져나가는 VB를 시각화하고 해석하도록 작동가능한 창상절제 스테이션(10)의 출구에 배열된다. 그렇지 않은 경우, VB는 더 많은 하이드로젯 처리를 위해 레일(216)을 따라 다시 하우징으로 복귀된다. 레일(216)을 따라 트레이(212)의 이동을 제어하고 시각화 장치(225)에 의해 생성된 신호를 해석하기 위해 컨트롤러(도시되지 않음)가 제공될 수 있다는 점이 고려된다. 시각화 장치는 VB의 이미지를 획득하는 카메라를 포함할 수 있으며, 컨트롤러는 획득된 이미지에서 연조직을 인식할 수 있는 이미징 소프트웨어를 포함할 수 있다. 염료는 하이드로젯 창상절제 공정의 끝에서 세척된 VB에 적용될 수 있으며, 여기서 염료는 연조직에 의해 흡수되지만 뼈에서는 흡수되지 않는다. 따라서 염료는 뼈에서부터 임의의 잔여 연조직의 구별을 용이하게 하기 위해 콘트라스트를 제공할 수 있다. 시각화 장치(225)는 모든 각도에서 VB를 보기 위해 프레임(226)을 따라 병진하는 것 및 프레임을 병진하는 것과 같이, VB를 가로질러 촬영하도록 구성될 수 있다.

도 8a 및 도 8b로 돌아가서, 일단 VB가 모든 연조직이 세척되는 것으로 결정되면, 창상절제된 VB는 컨베이어(230)에 의해 자동 분쇄 스테이션(240)으로 공급되어 텀블링 및 최종 세포 추출을 위한 적절한 크기의 조각들을 생성한다. 상술된 수동 "큐빙(cubing)" 공정은 가변적이고, 시간이 많이 걸리며, 잠재적으로 작업자에게 안전하지 않을 수 있다. 자동화 시스템은 VB를 "큐빙"하는(즉, VB를 작은 조각으로 절단하는) 단계 및 큐브된 VB를 분쇄하여 VB를 2 내지 3 mm 조각으로 감소시키는 단계를 조합하는 분쇄 스테이션을 포함한다. 레일(216) 및 트레이(212)는 창상절제된 VB를 컨베이어(230) 상에 퇴적하도록 구성될 수 있으며, 컨베이어는 이어서 자동으로 VB를 도 10a 및 도 10b에 더 상세히 도시된 분쇄 스테이션(240)의 입력 호퍼(240)로 이송한다. 도 10a에 도시된 바와 같이, VB는 초기 밀 커터 모듈(244)을 통해, 이어서 퍼넬(funnel)(246)을 통해 미세 밀 커터 모듈(248)로 지향된다. 도 10b에 도시된 바와 같이, 초기 밀 커터 모듈(242)은 5 내지 8 mm 갭과 같은 미리결정된 갭만큼 분리되는 대향한 회전 분쇄 밀(245)들을 포함하여, 유입되는 VB가 조대한 크기(coarse-sized)의 세그먼트로 분쇄되도록 한다. 조대한 분쇄된 세그먼트들은 미세 밀 커터 모듈(248)에 공급되고, 여기에는 더 작은 직경의 분쇄 밀(249)이 제공된다. 미세하게 분쇄된 VB 세그먼트들을 생성하기 위해, 미세 분쇄 밀(249)은 2 내지 3 mm 정도의 더 작은 갭으로 분리된다. 도 10a에 도시된 바와 같이, 퍼넬(246)은 조대한 분쇄된 세그먼트들을 제2 분쇄 밀(248)로 전달하고, 퍼넬(250)은 미세하게 분쇄된 VB 세그먼트를 플레이트(253) 상에 지지된 수집 팬(252)으로 지향한다. 밀링 작동 중에, DNAse를 사용하여 처리/재현탁액 매체의 측정된 체적이 상부 호퍼를 통해 분쇄 커터로 지향될 수 있다. 이러한 매체는 분쇄 스테이션(240)의 작동 중에 수동으로 도입될 수 있거나, 호퍼(242) 내에 포함된 노즐을 통해 자동으로 구현될 수 있다.

미세 분쇄된 VB 세그먼트 및 처리 매체가 수집 팬(252) 내에 수집되고 플레이트(2)는 시브 스테이션(260)(도 8a 내지 도 8b)으로 수동 또는 자동으로 이동될 수 있다. 일단 시브 스테이션(260)에서는 팬(252)의 내용물이 시브 카트리지 유닛 내로 떨어지며, 이는 도 11에 도시된 바와 같이, 2개의 12인치 직경 필터 시브들을 포함하는데 - 상단에 #40 시브(262)와 그 뒤를 이어 #80 시브(264)가 따른다. 퍼넬(266)은 여과된 내용물을 수집 용기(268)로 지향한다. 필터에 의해 유지되는 분쇄물은 DNAse를 포함하지 않는 처리/재현탁액 매체로 시브 스테이션(260) 내부에서 세정된다. 수집 용기(268) 내의 액체 골수 제품은 이하에 설명되는 바와 같이, 세포 함량을 결정하도록 분석된 다음에 저온보존을 위한 적절한 체적으로 농축 및 포장될 수 있다. 대안적으로, 처리된 골수의 일부 또는 전부는 CD34+ 세포와 같은 특수 세포 제품에 대한 자동화된 세포 선택 접근법을 사용하여 추가로 처리될 수 있다. 대량의 세포가 이러한 접근법으로 단일 장기 기증자로부터 회수될 수 있기 때문에, 한 명의 기증자가 다수의 제품 유형을 산출할 수 있다. 더욱이, 소스는 (G-CSF의 동원된 말초 혈액과 반대로) 1차 골수이기 때문에, 세포 제품은 저온보존 처리를 견딜 것이다.

하나의 수정예에서, 분쇄 스테이션(240) 또는 시브 스테이션(260)으로부터의 출력은 동결 처리를 위한 수집 백으로 자동으로 공급될 수 있다. 이러한 수정예에서, 하부 퍼넬(250)은 살균 백에 연결된 유체 라인으로 내용물을 지향하도록 구성될 수 있다. 연동 펌프는 유체 라인과 맞물려 분쇄 스테이션으로부터 살균 백으로 출력을 펌핑할 수 있다. 유사한 배열체가 시브 스테이션의 퍼넬(266)과 맞물릴 수 있다.

본질적으로 골수 슬러리인 수집 용기(268)의 내용물은 인접 텀블러 스테이션(270)으로 수동 또는 자동으로 전달되고, 이는 기계적 텀블러(272)와 10개의 처리된 VB 및 연관된 처리/재현탁액 매체의 전체 내용물을 수용할 수 있는 대형 폐기가능 용기(274)를 포함한다. 텀블러(272)는 기계적으로 세포를 해방시키기 위해 분쇄 슬러리의 교반을 위한 패들(paddle)을 가진다. 텀블링 사이클이 완료되면, 텀블러의 내용물을 시브 매거진을 통해 용기(274) 내로 부어진다. 용기(274)의 내용물은 동결 보관을 위해 추가로 처리되거나 준비될 수 있다.

골수로부터의 세포 격리

본 개시의 하나의 양태에서, 밀도 감소된 피콜 및 면역자기성 CD34+ 세포 격리 키트를 사용하여 사망한 기증자 골수로부터 CD34-발현(CD34+) 세포를 선택하는 방법이 제공된다. 의외로, CD34 선택 전에 밀도 감소된 피콜을 이용한 세포 격리가 새로 준비된 사망한 기증자 골수로부터 고순도 및 생존가능 CD45/CD34+ 세포를 획득하는 데 유익하다는 것이 밝혀졌다. 한편, 종래의 밀도의 피콜은 해동된 저온보존된 사망한 기증자 골수로부터 CD45/CD34 + 세포 선택에 최적인 것으로 밝혀졌다.

최근에 사망한 기증자로부터 얻은 척추 섹션은 상술한 바와 같이 처리되었다. 따라서, 일 실시예에서, 뼈는 모든 연조직이 세척되고, 이어서 작은 조각들로 절단되고, 이들은 즉시 분쇄 매체의 500 mL 내로 침지되었다. 분쇄 매체는 PLASMA-LYTE™ A 주입 pH 7.4, 다중 전해질, 2.5% 인혈청 알부민(HSA)을 수용하는 주입 유형 1USP(PLASMA-LYTE™), 3 U/ml 데나라제(denarase), 10 U/ml 헤파린일 수 있다. 섹션된 VB는 뼈 분쇄기를 사용하여 분쇄되고, 여과되고, 세정 매체(예컨대, 2.5% HSA를 갖는 PLASMA-LYTE™)로 세정된다. 전체 세포 현탁액은 세포를 2 내지 3x10⁸/ml로 농축하기 위해 원심분리되고, 세포 농축물이 추출된다. 생성된 BM 제제의 일부분 또는 전부는 CD34 선택에 즉시 사용될 수 있으며, 한편 나머지는 저온보존을 위해 준비될 수 있다. 저온보존된 부분은 최종 농축물의 10% DMSO 및 5% HSA를 BM 세포에 첨가하는 것과, 수동 냉각 또는 약 -1℃/min의 속도로 제어 냉각에 의해 제제를 -86 ℃로 준비하는 것을 포함하며, 그 후 저온보존된 부분은 액체 질소 내로 급락된다.

CD34+ 세포의 선택을 위해, 새로 처리된 BM 제제가 사용되거나 이전에 저온보존된 부분이 사용을 위해 용해된다. 피콜-파케 PLUS(Ficoll-Paque PLUS)가 골수의 원하는 CD34+ 세포 성분을 분리하기 위해 BM 제제에 첨가된다. 1.077 g/mL의 피콜에 대한 종래의 밀도가 허용가능한 결과를 생성한다는 것이 저온보존된 골수로부터의 세포 선택을 통해 알게 되었다. 그러나, 본 개시의 하나의 양태에서, 새로 준비된 사망한 기증자 골수로부터의 세포 선택을 위해 피콜 밀도는 종래의 밀도보다 감소된다. 특히, 밀도는 피콜-파케 PLUS(밀도 1.077 g/mL, GE Company)를 플라즈마 리테-A 인젝션(Plasma Lyte-A Injection) pH 7.4(Baxter Healthcare 2B2544X)와 특정 비율로 혼합하여, 1.077 g/ml 미만, 특히 1.063 내지 1.052 g/mL 미만의 전체 밀도를 획득함으로써 감소된다. 하나의 특정 실시예에서, 1.063 g/mL의 밀도는 CD34+ 세포의 수량, 생존력 및 순도를 고려하여 CD34+ 세포의 격리에 최적인 것으로 나타났다.

일 실시예에서, 1.063 g/mL 밀도 피콜 용액의 5 ml 는 15-ml 원심분리관 내로 피펫되고, 사망한 기증자의 VB로부터 생성된 BM 용액은 피콜 구배에 따라 신중하게 계층화된다. 원심분리관은 실온에서 중단없이 400 g에서 30분 동안 원심분리된다. 원심분리 후, 연막 세포는 신중하게 획득되고, 세포는 0.5% HSA 및 2mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)(MACS 완충제, Miltenyi)를 수용하는 인산염-완충 염수(PBS)에서 세척된다. 하나의 특정 실시예에서, 원심분리는 400 g에서 5분 동안 수행되고, 생성된 세포 펠릿은 10 ml PBS에서 재현탁되고, 이어서 400 g에서 5분 동안 두번째 원심분리가 따른다.

격리된 연막 내의 유핵세포는 Sysmex XP-300을 사용하여 계산될 수 있다. 셀로미터 비전(Cellometer Vision)(Nexcellom) 또는 유동 세포측정기가 정제된 CD34 세포의 세포 수를 결정하는 데 사용될 수 있다. AOPI의 20 마이크로리터가 세포의 20 마이크로리터에 첨가될 수 있고, 혼합 후 총 생존가능 세포가 결정될 수 있다. CD34+ 세포는 제조업체의 프로토콜에 따라 CliniMAX 시스템(독일, 베르기쉬 글래드바흐, 밀테니) 또는 EasySep CD34 키트(Stemcell Technologies, 캐나다, BC, 밴쿠버)를 사용하여 양성 면역 분리 방법에 의해 선택될 수 있다. 다양한 피콜 밀도에서의 테스트로부터, 의외로, 본 개시에서 고려된 낮은 피콜 밀도(즉, 1.063 내지 1.052 g/mL 대 종래의 1.077 g/mL 밀도)가 더 최적의 세포 회수로 이어진다는 것이 결정되었다. 최적화는 선택한 CD34 세포의 순도, 생존력 및 수율에 기초한다. 90% 초과의 순도 및 90% 초과의 생존가능 CD34+ 세포의 목표가 바람직하다. 낮은 피콜 밀도는 더 큰 순도 및 더 적은 사망 세포를 초래한 반면, 의외로, 선택 전에 사망한 기증자 전체 골수 내에 존재한 CD34+ 세포의 더 많은 부분이 연막을 준비하기 위하여 낮은 피콜 밀도를 사용하여 손실된다는 것이 발견되었다. 따라서, 종래의 피콜 밀도 구배에서 달성된 CD45/CD34+ 셀의 높은 생존력 및 순도가 또한 수율의 큰 손실(입력된 CD34+ 세포의 약 60% 손실)로 이어진다.

따라서, 본 개시의 하나의 양태에 따라, 새로이 준비된 경우 90% 초과의 순도 및 생존력에서 CD45/CD34+ 세포의 선택에 대한 피콜의 최적 밀도는 1.077 미만이며 특히 1.063 내지 1.052 이다. 이러한 피콜 밀도는 종래의 피콜 밀도 접근법과 유사한 순도 및 세포 생존력을 가진 CD45/CD34+ 세포의 높은 수율을 제공한다.

본 개시의 다른 양태에서, CD34+ 세포는 초기에 상술한 저밀도 피콜-파케를 사용하여 새로 준비된 사망한 기증자 골수로부터 획득될 수 있다. BM은 극저온으로 동결될 수 있고, 이어서 CD34+ 세포는 차후에 종래의 밀도 피콜-파케를 사용하여 획득될 수 있다. 이러한 접근법은, 수정된 피콜 밀도를 사용하여 동결하기 전에 또는 종래의 피콜 밀도를 사용하여 동결 및 해동된 후에, 본질적으로 사망한 기증자 골수로부터 세포의 선택적 회수를 가능하게 한다.

처리된 골수로부터의 MSC의 회수

본 명세서에 개시된 시스템 및 방법의 또 다른 특징에서, 본 명세서에 기재된 방법의 VB 분쇄 및 용출 단계의 부산물인, 효소로 증해된 척추체(VB) 뼈 파편으로부터 중간엽 줄기 세포(MSC)를 회수하기 위한 방법이 제공된다. 이러한 방법에서, 콜라게나제 및 중성 프로테아제 둘 모두의 혼합물은 척추뼈 접착성 MSC(vBA-MSC)의 가능한 가장 높은 수율을 획득하는 데 사용된다. MSC는 본 개시에 따라 차후에 처리되는 저온보존된 VB 뼈 파편에서 회수될 수 있다. 하나의 특정 양태에서, 2개의 활성 아이소폼(isoform)으로 구성된 재조합형 클로스트리듐 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum) 콜라게나제는, MSC 추출 공정에서 유효량이 사용된다. VB 뼈 파편을 증해시켜 해방된 세포의 혼합물은 증식 vBA-MSC를 선택하도록 메센쿨트(Mesencult) 매체의 존재에서 조직-코팅된 플라스틱 상에서 배양된다. 새로 증해된 제제뿐만 아니라 VB-MSC의 상이한 통과는 유동 세포측정법, 콜로니 형성 단위-섬유아세포(colony forming unit-fibroblast)(CFU-F) 퍼텐셜, 집단 배가 시간(PDT) 및 체외에서의 트릴리니지(trilineage)(지방생성, 연골생성 및 골형성) 분화를 특징으로 할 수 있다.

따라서 본 개시는 정제된 콜라게나제와 중성 프로테아제의 조합을 사용하여 척추 뼈 파편으로부터 증해 및 MSC 회수를 최적화하는 방법을 고려한다. 하나의 특정 실시예에서, 콜라게나제는 정제된 클로스트리듐 히스톨리티쿰 콜라게나아제 및 파네이바실러스 폴리믹싸(Paneibacillus polymyxa) 중성 프로테아제로 구성된 DE 콜라게나제(Vitacyte)이다. 본 개시의 하나의 양태에 따라, 최적의 중성 프로테아제 농도 및 콜라게나제 농도(C1 및 C2 콜라게나제) 및 뼈 파편 중량(mg)에 대한 용액 체적(mL)의 최적 비율이 결정된다.

공정에 따르면, VB 뼈의 파편은 PLASMA-LYTE™, 2.5% 인혈청 알부민 및 10% 디메틸 술폭시드(DMSO)로 구성된 동결보호제 용액에 배치되고 4 ℃에서 1시간 동안 배양된다. 용액이 제거되고, 뼈 파편은 ~1^o/min의 비율로 -86 ℃로 냉각된 다음에 액체 질소 내로 급락된다. 액체 질소에서 24 내지 48 시간 후에, 뼈 파편은 37 ℃로 설정된 수조에서 급속하게 해동되고, 이어서 염수로 세척되고 상술한 콜라게나제/프로테아제 용액을 사용하여 증해된다.

최적의 체적 대 중량 비율은 2.5시간의 최적 배양 시간에서 5:1인 것으로 나타났다. 최적의 프로테아제는 19.6 U/mL의 중성 프로테아제 활성도를 생성하였다. 한편, 총 생존가능 MSC 세포 수는 일반적으로 콜라게나제 농도에 민감하지 않은 것으로 나타났다. 또한, 재조합형 콜라게나제 이소폼 C1 및 C2에 의해 생성된 수율은 C1/C2 비율에 관계없이, 정제된 콜라게나제를 가진 수율과 유사한 것으로 나타났다. 본 개시의 MSC 회수 공정에 대한 추가의 세부사항은 본 출원에 부록 A의 기술 문서에 나타나 있으며, 전체 개시 내용은 본 명세서에 참조로 통합된다.

허혈 시간에 기초하여 세포 생존력을 예측함

위에서 논의된 바와 같이, 기증자 뼈의 허혈 시간은 상술한 공정을 사용하여 추출된 세포의 생존력에 영향을 미친다. 본 개시에 따르면, 총 허혈은 사망 시점 (기증자의 동맥 계통이 교차-클램프(cross-clamp)되고 순환이 중단된 시점)으로부터 시작하여 뼈로부터 세포의 회수의 시작에서 종료되기까지의 간격으로서 정의된다. 통계 모델링을 위해, 이러한 총 간격은 다음과 같은 3가지의 연속적이고 상호 배타적인 시간 성분으로 분리될 수 있다: (a) 온 허혈 시간(Warm Ischemia Time)(WIT) - 사망 시간에서 시작되고, 뼈가 회수되어 얼음 상에서 포장될 때 또는 시체가 냉각기 내에 배치될 때 종료됨; (b) 시체 냉각 시간(Body Cooling Time)(BCT) - 시체가 냉각기 내에 배치될 때 시작되고, 뼈가 얼음 상에서 포장될 때 종료됨; 및 (c) 저온 허혈 시간(Cold Cooing Time)(CIT) - 뼈가 얼음 상에서 포장될 때 시작되고, HSPC와 같은 세포의 추출을 위한 처리가 시작될 때 종료됨. 따라서, 총 허혈 시간(Total Ischemia Time) = (WIT) + (BCT) + (CIT). 전체-시체 냉각이 사용되지 않는 경우 BCT는 0이고, 총 허혈 시간 = (WIT) + (CIT).

총 허혈 시간에 추가하여, 처리 경험에 대응하는 변수가 생존력 결정에 통합될 수 있다. 학습 곡선은 결과에 상당한 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, 따라서 이 사실을 제어하기 위해 변수 EXP는 현재 기증자 이전에 처리된 기증자의 수로 정의될 수 있다 - 즉, i ^th 기증자의 경우, EXP = i - 1. 다른 변수는 뼈 유형(척추체 및 장골과 같은), 기증자 성별 및 기증자 연령을 포함할 수 있다.

하나의 양태에서, 결과 변수는 다음과 같다: 생존가능한, 예컨대 CD34+ 세포와 같은 특정 세포 집단의 비율, 세포 처리를 동반하는 검출된 10⁵개의 유핵 세포당 콜로니 형성 단위(CFU)의 총 수, 및 10⁵개의 유핵 세포당 검출된 CFU 과립구 대식세포(CFU-GM)의 수.

본 개시에 따르면, 정규 최소 제곱(ordinary least squares)(OLS) 베타 회귀 모델이 사용되어 결과 변수를 예측할 수 있고, 선형 회귀 모델이 CFU 및 CFU-GM에 대해 사용될 수 있고, 베타 회귀 모델이 생존가능 CD34+ 세포의 비율에 대해 사용되거나 %CD34+에 대해 사용될 수 있고, 여기서 0 < (%cd34+) < 1. %CD34+를 예측하기 위한 베타 회귀 방정식은 다음과 같다:

여기서:

pCD34*

, 이는 관심 변수의 변환이다.

β₀ = 상수 (인터셉트(intercept))

β₁= 온 허혈 시간과 연관된 계수(WIT)

β₂ = 시체 냉각 시간과 연관된 계수(BCT)

β₃ = 시체 냉각 시간과 연관된 계수의 제곱(BCT²)

β₄ = 저온 허혈 시간과 연관된 계수(CIT)

β₅= 저온 허혈 시간과 연관된 계수의 제곱(CIT²)

역 링크 함수(inverse link function)는 선형 예측변수 η에 적용되어, 결과는 결과 변수 pCD34*의 예측치이고, 즉 기증자 뼈에서 추출될 것으로 예측되는 생존가능 CD34+ 세포의 백분율이다. 역 링크 함수는 다음과 같다:

또는 η에 대해 상기 방정식 (1)을 치환한다:

본 실시예에서, 수학적 모델은 특정 허혈 조건을 겪은 기증자 뼈로부터 추출될 수 있는 생존가능 CD34+ 세포의 비율을 예측한다.

의 값은 0과 1 사이에 있으며, 그 이유는 이것은 뼈 샘플에서 CD34+ 세포의 총 수에 대한 생존가능 CD34+ 세포 수의 비율이기 때문이다.

일 실시예에서, 예측된 %CD34+의 베타 회귀 계산을 위한 계수는 다음과 같은 값을 갖는다:

β₀ = 3.5000

β₁= -0.01996

β₂ = -0.181

β₃ = 0.007

β₄ = -0.111

β₅= 0.002

여기서 각각의 베타 계수 β_0, β1, β_2, β_3, β₄, β₅ 는 상술한 바와 같이 인터셉트, WIT, BCT, BCT², CIT 및 CIT²에 각각 대응한다.

총 콜로니 형성 유닛 CFU 및 CFU 과립구 소식세포CFU-GM의 수에 대한 예측은 다음과 같은 선형 회귀 모델을 사용하여 획득될 수 있다:

CFU 결과 변수를 결정하는 데 사용되는 선형 회귀 모델은 다음과 같은 계수 값을 가질 수 있다:

β₀ = 756.5084

β₁= -9.10826

β₂ = -95.03639

β₃ = 3.45603

β₄ = -4.53349

여기서 각각의 베타 계수 β_0, β1, β_2, β_3, β₄ 는 상술한 바와 같이 인터셉트, WIT, BCT, BCT², 및 CIT에 각각 대응한다.

CFU-GM 결과 변수를 결정하는 데 사용되는 선형 회귀 모델은 하기 형식을 가질 수 있다:

하기 계수 값들을 갖는다:

β₀ = 104.1805

β₁= -8.11295

β₂ = -5.52927

β₃ = 0.08872.

상기 모델은 허혈계 변수만을 고려하고 경험, 뼈 유형, 기증자 성별 및 기증자 연령 변수를 고려하지 않는 기본 또는 미조정된(un-adjusted) 모델이다. 모든 변수를 고려하는 %CD34+에 대한 완전히 조정된 모델은 다음과 같은 형식을 가질 수 있다:

계수에 대해 하기의 각각의 값을 갖는다:

CFU에 대해 완전히 조정된 모델은 다음과 같다:

계수 β₁은세포 수량 및 생존력에 대하여 처리된 기증자 수(즉, 경험)의 효과를 정량화하려고 시도한다. 완전히 조정된 CFU 모델에서, 계수 β₂는 시설들이 서로 다른 학습 경로들을 가질 수 있다는 가정에 기초하여 특정 시설에서의 경험에 해당한다. 이러한 계수들 중 하나 또는 둘 모두는 수정되거나 심지어 삭제될 수 있다.

이러한 모델을 관찰된 데이터에 적용하는 것은, %CD34+에 대해서는, 도 12a 내지 도 12c에 도시된 표에서 반영된 바와 같이, 총 CFU에 대해서는, 도 13a 내지 도 13C의 표에 도시된 바와 같이, 그리고 CFU-GM의 양에 대해서는, 도 14a 내지 도 14c의 표에 도시된 바와 같이, 허혈 시간 변수의 효과를 결정하는 데 사용될 수 있다. 이들 표에 있는 데이터는 특정 기증자 뼈가 기증자 뼈의 추가 처리를 보증하기에 충분한 세포를 산출할 수 있는지 여부를 결정하는 데 이용될 수 있다. 다시 말하면, 예측 모델은 허혈 허용오차 한계 및 HSPC 품질 수용 기준을 설정하는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, % CD34+ 결과 변수와 관련하여, 특정 기증자 골격을 고려하기 위해 80% 초과의 예측 값이 필요할 수 있다.

상술한 모델과 도 12a 내지 도 14c의 표에 도시된 예는, 뼈가 지리적으로 분산된 OPO에 의해 조달되고 처리 센터로 장거리 수송되어야 할 때 불가피한 장기간의 허혈 시간에도 불구하고 허용가능한 수준의 HSPC 품질을 달성할 수 있음을 시사한다. 이러한 조건하에서도, %CD34 + 변수를 80 내지 90 % 범위로 가능하게 하는, 온 및 저온 허혈 시간들의 유리한 조합이 달성될 수 있다. 모델은 또한 뼈 회수 전에 시체를 냉동하는 것을 제안하는데, 조직의 회수에 일반적인 실시는 골수 회수의 맥락에서는 덜 유익하다. 예를 들어 전체 시체 냉각을 사용했을 때, CD34+ 생존력은 평균 72.75% 인 반면, 시체 냉각을 사용하지 않았을 때, 평균은 바로 90% 미만이었다. 이들 모델은 최적의 실시가 시체 냉각을 생략할 것과, 회수된 뼈를 저온 허혈성 환경으로 가능한 신속하게 이동할 것을 제안한다. 모델은 추가로, WIT(온 허혈 시간)를 8시간 미만으로 제한하고 CIT(저온 허혈 시간)를 40시간 미만으로 제한하는 것이 기증자 뼈로부터 생존가능 세포의 의미있는 양을 회수하기 위한 기회를 최적화하는 것임을 제안한다.

본 명세서에 개시된 모델은 도 15에 도시된 차트에 따라 생존력을 예측하며, 여기서 80% CD34+ 세포 생존력 임계값이 허용가능한 것으로 결정된다. 차트에 반영된 바와 같이, 온 허혈 시간과 저온 허혈 시간의 관계는, WIT가 10시간이고 CIT가 18시간인 시점에서부터, WIT가 1시간이고 CIT가 27시간인 시점까지의 곡선을 따라간다.

본 개시의 세포 생존력을 예측하는 방법의 추가의 상세사항은 본 출원의 부록 B에서 발견되며, 전체 개시내용은 본 명세서에 참조로 통합된다.

본 개시는 예시적이고 문자적으로 제한하지 않은 것으로 간주되어야 한다. 단지 소정의 실시예만 제시되고, 본 개시의 정신 내에서 나오는 모든 변경, 수정 및 추가 응용은 보호를 받기 원하는 것으로 이해된다.

Claims

사망한 기증자의 골수로부터 세포들을 회수하기 위한 방법으로서,
사망한 기증자로부터 뼈를 획득하는 단계;
상기 뼈로부터 골수 세포들을 추출하기 위해 상기 뼈를 처리하는 단계;
1.063 내지 1.052 g/mL의 밀도를 갖는 저밀도 피콜(Ficoll) 용액을 획득하는 단계;
피콜 구배(Ficoll gradient)를 형성하기 위해 상기 저밀도 피콜 용액을 원심분리관 내로 도입하는 단계;
상기 원심분리관 내에서 상기 피콜 구배에 따라 상기 추출된 골수 세포들을 계층화하는 단계;
상기 피콜 구배 및 골수 세포를 포함하는 상기 관을 원심분리하는 단계;
상기 원심분리관 내부에서부터 연막 세포를 획득하는 단계;
후속 사용 및 처리를 위해 상기 획득된 세포들을 세척하는 단계
를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서,
상기 뼈는 척추제인 것인 방법.
제1항에 있어서,
상기 획득된 세포는 CD34+ 세포인 것인 방법.
제1항에 있어서,
상기 뼈를 처리하는 단계는,
연조직의 상기 뼈를 세척하는 단계;
상기 뼈를 조각들로 절단하고 이어서 상기 조각들을 분쇄하는 단계;
상기 뼈의 분쇄된 조각들을 여과하고 세정하는 단계;
골수 세포를 농축하기 위해 상기 여과 및 세정을 거친 뼈의 조각들의 현탁액을 원심분리하는 단계
를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서,
저밀도 피콜을 획득하는 상기 단계는 1.063 내지 1.052 g/mL의 밀도를 획득하기 위해 1.077 g/mL의 밀도의 피콜-파케(Ficoll-Paque)를 일정 비율로 PLASMA-LYTE^TM 와 혼합하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서,
상기 관을 원심분리하는 단계는 상기 관을 400g에서 30분 동안 원심분리하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서,
상기 획득된 세포를 세척하는 단계는 0.5% 인혈청 알부민(HSA) 및 2mM 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA)을 함유하는 인산염 완충 식염수(PBS)에서 상기 세포를 세척하는 단계를 포함하는 것인 방법.
사망한 기증자의 뼈로부터 골수 세포들을 획득하기 위한 방법으로서,
사망한 기증자로부터 뼈를 획득하는 단계;
연조직의 상기 뼈를 세척하는 단계;
상기 뼈를 뼈 조각들로 분쇄하는 단계;
액체 조성물을 생성하도록 상기 분쇄된 뼈를 여과 및 세정하는 단계;
골수 세포를 골수 세포 조성물로 농축하기 위해 상기 여과 및 세정을 거친 분쇄된 뼈의 액체 조성물을 원심분리하는 단계;
상기 골수 세포 조성물을 살균 용기 내로 추출하는 단계
를 포함하는 것인 방법.
제8항에 있어서,
상기 기증자의 뼈는 상기 사망한 기증자의 하나 이상의 척추체 및/또는 장골인 것인 방법.
제8항에 있어서,
상기 기증자의 뼈는 새롭게 획득되고 동결되지 않은 것인 방법.
제8항에 있어서,
상기 기증자의 뼈는 처리 시설로 이송되기 위해 동결된 후 해동되는 것인 방법.
제8항에 있어서,
상기 연조직의 뼈를 세척하는 단계는,
도구를 사용하여 상기 뼈로부터 연조직을 제거하는 단계;
이어서 상기 뼈로부터 연조직 및 연조직 세포를 제거하도록 되어 있는 하나 이상의 용액 내에 상기 뼈를 침지시키는 단계
를 포함하는 것인 방법.
제12항에 있어서,
하나 이상의 용액 내에 상기 뼈를 침지시키는 단계는,
표백제 용액 내에 상기 뼈를 침지시키는 단계;
이어서 과산화수소 용액 내에 상기 뼈를 침지시키는 단계
를 포함하는 것인 방법.
제12항에 있어서,
하나 이상의 용액 내에 상기 뼈를 침지시키는 단계는,
용기 내에 상기 뼈를 침지시키는 단계;
상기 용기 내부의 발포의 수준을 검출하는 단계;
발포가 검출되지 않을 때까지 과산화수소 용액 내에 상기 뼈를 침지시키는 단계를 적어도 반복하는 단계
를 포함하는 것인 방법.
제14항에 있어서,
상기 용기 내에 임의의 발포의 가시성을 향상시키도록 상기 과산화수소 용액에 불활성 대조 염료가 첨가되는 것인 방법.
제8항에 있어서,
상기 뼈를 분쇄하는 단계는,
상기 뼈를 파편들로 절단하는 단계;
이어서 분쇄 매체를 갖는 뼈 분쇄기 내에서 상기 뼈 파편들을 분쇄하는 단계
를 포함하는 것인 방법.
제16항에 있어서,
상기 분쇄 매체는 10 U/mL 헤파린, 2.5% 인혈청 알부민(HSA), 3 U/mL Benzonase®와 함께 베이스로서 PLASMA-LYTE^TM 을 포함하는 것인 방법.
제8항에 있어서,
상기 분쇄된 뼈를 여과 및 세정하는 단계는,
분쇄 매체 내에 상기 분쇄된 뼈를 침지시키는 단계;
상기 분쇄된 뼈 및 분쇄 매체를 일련의 시브(sieve)들을 통과시키는 단계;
그후 분쇄 매체와 함께 상기 시브들을 세정하는 단계;
상기 시브들을 통과하는 상기 액체 조성물을 용기 내에서 수용하는 단계;
이어서 상기 액체 조성물을 살균 용기로 이송하는 단계
를 포함하는 것인 방법.
제18항에 있어서,
상기 일련의 시브들은 제1 No. 40 시브(425 μm)에 이어서 제2 No. 80 시브(177 μm)를 포함하는 것인 방법.
제8항에 있어서,
상기 분쇄된 뼈를 여과 및 세정하는 단계는,
제1 수집 백 내부의 분쇄 매체 내에 상기 분쇄된 뼈를 침지시키는 단계;
상기 제1 수집 백을 매달고 상기 제1 수집 백의 바닥을 일련의 인라인 필터들 및 제2 수집 백에 연결하는 단계;
상기 제1 수집 백의 내용물을 상기 인라인 필터를 통해 상기 제2 수집 백 내로 통과시키는 단계
를 포함하는 것인 방법.
제20항에 있어서,
상기 일련의 인라인 필터는 200 μm 필터 또는 500 μm 필터 중 어느 것을 갖는 2개의 필터를 포함하는 것인 방법.
제21항에 있어서,
상기 제1 수집 백의 내용물의 제1 패스(pass)에서 상기 2개의 필터는 200 μm 필터이고, 상기 제2 수집 백의 내용물의 제3 수집 백 내로의 제2 패스에서 상기 2개의 필터는 500 μm 필터인 것인 방법.
제8항에 있어서,
상기 분쇄된 뼈를 여과 및 세정하는 단계는 상기 분쇄된 뼈의 지방 함유물을 제거하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제23항에 있어서,
상기 분쇄된 뼈의 상기 지방 함유물을 제거하는 단계는,
수집 백 내에 상기 분쇄된 뼈의 현탁액을 배치하는 단계;
매달려 있을 때 상기 수집 백의 상단에 지방층이 형성되도록 상기 수집 백을 원심분리하는 단계; 및
매달려 있는 상기 수집 백의 바닥에서부터 상기 골수의 펠릿을 제거하는 단계
를 포함하는 것인 방법.
제24항에 있어서,
상기 펠릿을 제거하기 전에 클립이 상기 지방층 아래로 상기 백 상에 배치되어, 상기 백을 집어서, 상기 펠릿이 제거될 때 상기 지방층의 통과를 방지하게 하는 것인 방법.
제8항에 있어서,
상기 골수 세포 조성물을 저온보존(cryopreserving)하는 단계
를 추가로 포함하는 것인 방법.
제26항에 있어서,
상기 골수 세포 조성물을 저온보존하는 단계는,
세정 매체 및 저온보존 조성물의 용액으로서 미리결정된 체적의 동결 매체를 준비하는 단계;
상기 골수 세포 조성물을 수용하는 상기 살균 용기 내로 미리결정된 비율로 상기 동결 매체를 도입하는 단계
를 포함하는 것인 방법.
제27항에 있어서,
상기 살균 용기는 60 내지 70 mL의 골수 세포 조성물을 수용하고, 상기 동결 매체의 미리결정된 체적은 상기 골수 세포 조성물의 체적에 대해 보정되는 것인 방법.
제27항에 있어서,
상기 미리결정된 비율은, 분당, 상기 동결 매체의 미리결정된 체적의 10%인 것인 방법.
제27항에 있어서,
상기 저온보존 조성물은 디메틸 술폭시드(DMSO); 1,2 프로판 디올; 에틸렌 글리콜; 글리세롤; 포라마미드(foramamide); 에탄디올 또는 부탄 2,3 디올; 하이드록시에틸 전분(HES), 덱스트란(Dextran), 자당, 트레할로스, 유당, 라피노스, 리보톨(Ribotol), 매니톨(Mannitol) 및 폴리비닐피롤리돈(PVP)을 포함하는 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 조성물일 수 있는 것인 방법.
제27항에 있어서,
상기 세정 매체는 플라즈마리테(PlasmaLyte); 이소리테(Isolyte); IMDM을 포함하는 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 조성물일 수 있는 것인 방법.
제27항에 있어서,
상기 동결 매체는 옥시라제(oxyrase)를 추가로 포함하는 것인 방법.
뼈 절단 도구로서,
사용자에 의해 파지되도록 구성된 단부 및 반대편의 조오(jaw) 단부를 갖는 고정 핸들로서, 상기 고정 핸들은 상기 조오 단부에서 뼈 맞물림 리세스를 한정하는 것인 고정 핸들;
상기 고정 핸들을 향해 그리고 상기 고정 핸들로부터 멀어지게 피벗되도록 제1 피벗에서 상기 고정 핸들에 피벗가능하게 연결된 레버 핸들로서, 상기 레버 핸들은 상기 레버 핸들을 상기 고정 핸들을 향해 연속적으로 피봇시킬 수 있도록 상기 고정 핸들을 파지하는 동안 상기 사용자에 의해 파지되도록 구성되는 것인 레버 핸들;
제2 피벗에서 상기 고정 핸들에 피벗가능하게 연결되고 그리고 상기 고정 핸들의 상기 조오 단부에서 상기 뼈 맞물림 리세스와 대면하는 칼날을 포함하는 나이프 요소로서, 상기 나이프 요소는 상기 고정 핸들과 상기 레버 핸들 사이에 배치된 래칫 구성요소를 포함하고, 상기 래칫 구성요소는 복수의 치형부들을 포함하는 것인 나이프 요소;
제3 피벗에서 상기 레버 핸들에 피벗가능하게 연결되고 그리고 상기 레버 핸들의 각각의 연속적인 피벗에서 상기 복수의 치형부들 각각을 사용자에 의해 상기 고정 핸들에 맞물리게 하도록 배열되는 폴 구성요소(pawl component)
를 포함하고;
상기 제1 피벗 각각은 상기 고정 핸들 및 상기 레버 핸들 내의 개구를 통과하는 세장형 핀을 포함하고, 상기 제2 피벗은 상기 고정 핸들 및 나이프 요소 내의 개구를 통과하는 세장형 핀을 포함하고, 상기 제3 피벗은 피벗 핸들 및 폴 구성요소 내의 개구를 통과하는 세장형 핀을 포함하고,
각각의 핀은 적어도 하나의 제거가능 유지 링에 의해 각자의 제1 피벗, 제2 피벗 및 제3 피벗 내에 제거가능하게 유지되어, 상기 고정 핸들, 피벗 핸들, 나이프 요소 및 폴 구성요소는 세척을 위한 분해 및 세척후 재조립이 용이하게 될 수 있는 것인 뼈 절단 도구.
제33항에 있어서,
상기 나이프 요소는 일체형 링크를 포함하고,
상기 도구는, 제4 피벗에서 레버 핸들에 피벗가능하게 연결되고 상기 일체형 링크에 피벗가능하게 연결된 자유 링크를 추가로 포함하고, 상기 제4 피벗은 용이한 분해를 위해 피벗 핸들 및 자유 링크 내의 개구를 통과하는 세장형 핀을 포함하는 것인 뼈 절단 도구.
제33항에 있어서,
상기 고정 핸들, 나이프 요소, 피벗 핸들, 폴 구성요소 및 자유 링크는 스테인레스강으로 형성되고, 이들의 표면들은 부동태화되는 것인 뼈 절단 도구.
제35항에 있어서,
상기 스테인레스강은 경화된 스테인레스강인 것인 뼈 절단 도구.