CN116583594A - 用于骨髓的提取和低温保藏的系统和方法 - Google Patents
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Abstract
提供了用于从获自死亡供体的骨中提取骨髓细胞，用于制备骨髓以供低温保藏，以及用于从低温保藏的新鲜骨髓中获得所需细胞的方法、系统和组合物。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年10月14日提交的美国临时申请号63/091,890；2020年11月6日提交的美国临时申请号63/110,571；2020年12月23日提交的美国临时申请号63/130,255；以及2021年3月30日提交的美国临时申请号63/168,178的权益。所述四件优先权申请各自的整体内容都通过引用而明确地并入本文中。
关于联邦政府资助的研究的声明
本发明是依照美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)的合同号5R44AI129444在美国政府支持下完成的。
背景技术
出于临床目的骨髓目前是从HLA匹配的兄弟姐妹或者最佳匹配的非亲属供体采集。其他移植来源现在也被利用，包括不匹配的单倍体相合的亲属或非亲属供体和脐带血(CB)。在移植到患有某些疾病的患者中时，供体骨髓中的造血干细胞(HSC)植入该患者中，并且重建免疫和造血系统。骨髓也是间充质基质/干细胞(MSC)的良好来源，后者是自我更新的多能祖细胞，具有分化为中胚层起源的细胞类型(诸如脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞)的多谱系潜力。
目前，收集骨髓通常是通过用套管针在皮质骨中开孔，然后使用骨髓抽吸针和注射器将骨髓抽入注射器中。通常需要多个注射器从骨中提取足够的骨髓。然后将注射器从无菌区中取出，每个注射器与包含抗凝剂的收集袋相连，并将骨髓推入该袋中。将此步骤重复多次，通常是在两块盆骨中进行，并且可能导致抽吸物的污染。
认识到，可以从死亡供体中获得全骨髓(BM)。然而，多种障碍阻碍了尸体骨髓的主流使用。一个重要的障碍是找到一种精简的过程来受控地提取和保藏死亡供体的骨髓以及来自该骨髓的细胞产量。关于使用尸体骨的另一问题涉及骨的低温保藏和回收。具体地，该问题涉及可从低温保藏的供体骨中获得的存活的细胞诸如HSC的品质。
发明内容
本公开内容的方面包括一种用于加工包含细胞或其衍生物的生物样品的方法，所述方法包括：产生包含细胞或其衍生物的生物样品的第一体积，其中所述第一体积包含细胞或其衍生物的第一浓度；产生包含细胞或其衍生物的生物样品的第二体积，其中所述第二体积小于所述第一体积并且包含细胞的第二浓度，其中细胞的所述第二浓度与细胞的所述第一浓度相差不超过30％；以及以第一冷却速率冷却所述第一体积并且以第二冷却速率冷却所述第二体积，其中所述第一冷却速率与所述第二冷却速率大约相同；其中所述第一体积中细胞的解冻后细胞增殖速率与所述第二体积中细胞的解冻后增殖速率相差不超过30％。在一些实施方案中，第一体积被容纳在第一容器中，其中第二体积被容纳在第二容器中，并且其中所述第一容器和所述第二容器暴露于共同温度。在一些实施方案中，第二体积小于第一体积的50％。在一些实施方案中，第二体积小于第一体积的40％。在一些实施方案中，第二体积小于第一体积的37.5％。在一些实施方案中，第二体积小于第一体积的35％。在一些实施方案中，第二体积小于第一体积的30％。在一些实施方案中，第二体积小于第一体积的20％。在一些实施方案中，第二体积小于第一体积的15％。在一些实施方案中，第二体积小于第一体积的10％。在一些实施方案中，第二体积小于第一体积的5％。在一些实施方案中，第二体积小于第一体积的1％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后存活率与第二体积中细胞的解冻后存活率相差不超过30％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后存活率与第二体积中细胞的解冻后存活率相差不超过25％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后存活率与第二体积中细胞的解冻后存活率相差不超过20％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后存活率与第二体积中细胞的解冻后存活率相差不超过15％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后存活率与第二体积中细胞的解冻后存活率相差不超过13.6％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后存活率与第二体积中细胞的解冻后存活率相差不超过10％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后存活率与第二体积中细胞的解冻后存活率相差不超过5％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后细胞增殖速率与第二体积中细胞的解冻后细胞增殖速率相差不超过25％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后细胞增殖速率与第二体积中细胞的解冻后细胞增殖速率相差不超过20％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后细胞增殖速率与第二体积中细胞的解冻后细胞增殖速率相差不超过15％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后细胞增殖速率与第二体积中细胞的解冻后细胞增殖速率相差不超过13.6％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后细胞增殖速率与第二体积中细胞的解冻后细胞增殖速率相差不超过10％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后细胞增殖速率与第二体积中细胞的解冻后细胞增殖速率相差不超过5％。在一些实施方案中，细胞的解冻后存活率为至少50％。在一些实施方案中，细胞的解冻后增殖速率为至少1CFU-GM/105个细胞。在一些实施方案中，第一冷却速率和第二冷却速率包括约-0.1℃/min至约-5℃/min的超冷冻(supra-freeze)速率，直至至少冰已经在冷冻介质中成核。在一些实施方案中，第一冷却速率和第二冷却速率包括约-2.5℃/min至约-4℃/min的超冷冻速率，直至至少冰已经在冷冻介质中成核。在一些实施方案中，第一冷却速率和第二冷却速率包括约-2.5℃/min至约-3.5℃/min的超冷冻速率，直至至少冰已经在冷冻介质中成核。在一些实施方案中，第一冷却速率和第二冷却速率包括约-1℃/min至约-2℃/min的亚冷冻(sub-freeze)速率。在一些实施方案中，细胞的解冻后存活率为至少60％。在一些实施方案中，细胞的解冻后存活率为至少70％。在一些实施方案中，细胞的解冻后存活率为至少80％。在一些实施方案中，细胞的解冻后存活率为至少90％。在一些实施方案中，(c)发生在一个或多个冷冻机中。在一些实施方案中，第一容器和第二容器设置在一个或多个冷冻机中的第一冷冻机中。在一些实施方案中，第一容器被容纳在一个或多个冷冻机中的第一冷冻机中，并且第二容器被容纳在一个或多个冷冻机中的第二冷冻机中。在一些实施方案中，一个或多个冷冻机包括静态冷冻机。在一些实施方案中，第一冷冻机、第二冷冻机或二者是静态冷冻机。前述权利要求中任一项所述的方法，其中一个或多个冷冻机包括控速冷冻机。在一些实施方案中，第一冷冻机、第二冷冻机或二者是控速冷冻机。在一些实施方案中，一个或多个冷冻机被设定在约-70℃至-90℃。在一些实施方案中，一个或多个冷冻机被设定在低于-80℃。在一些实施方案中，一个或多个冷冻机被设定在-86℃。在一些实施方案中，第二体积被直接置于隔热容器中，使得每个小瓶紧邻于隔热容器的隔热材料。在一些实施方案中，所述方法还包括将第一体积布置在静态冷冻机内，使得第一体积不接触一个或多个冷冻机的壁。在一些实施方案中，第一体积中的包含细胞或其衍生物的生物样品和第二体积中的包含细胞或其衍生物的生物样品经历相同的冷却速率。在一些实施方案中，所述细胞是干细胞或免疫细胞。在一些实施方案中，所述干细胞包括造血干细胞(HSC)、间充质干细胞(MSC)或二者。在一些实施方案中，生物样品包含一种或多种器官、血液或二者。在一些实施方案中，所述免疫细胞包括T细胞。在一些实施方案中，所述血液是脐带血或外周血。在一些实施方案中，HSC包括CD34+细胞。在多种实施方案中，所述方法还包括以下步骤：将第一体积和第二体积转移至长期贮藏容器，例如，长期贮藏容器低于-86℃。
本公开内容的另一方面包括一种用于加工骨髓或其衍生物的方法，所述方法包括：产生骨髓或其衍生物的第一体积，其中所述第一体积包含骨髓或其衍生物的第一浓度；产生骨髓或其衍生物的第二体积，其中所述第二体积小于所述第一体积并且包含第二浓度，其中所述第二浓度与所述第一浓度相差不超过30％；以及以第一冷却速率冷却所述第一体积并且以第二冷却速率冷却所述第二体积，其中所述第一冷却速率与所述第二冷却速率大约相同；其中第一体积中骨髓源性细胞群的解冻后细胞增殖速率与第二体积中骨髓源性细胞群的解冻后增殖速率相差不超过30％。在一些实施方案中，第一体积被容纳在第一容器中，其中第二体积被容纳在第二容器中，并且其中所述第一容器和所述第二容器暴露于单一/相同温度。在一些实施方案中，第二体积小于第一体积的50％。在一些实施方案中，第二体积小于第一体积的40％。在一些实施方案中，第二体积小于第一体积的37.5％。在一些实施方案中，第二体积小于第一体积的35％。在一些实施方案中，第二体积小于第一体积的30％。在一些实施方案中，第二体积小于第一体积的20％。在一些实施方案中，第二体积小于第一体积的15％。在一些实施方案中，第二体积小于第一体积的10％。在一些实施方案中，第二体积小于第一体积的5％。在一些实施方案中，第二体积小于第一体积的1％。在一些实施方案中，第一体积中骨髓源性细胞群的解冻后存活率与第二体积中骨髓源性细胞群的解冻后存活率相差不超过30％。在一些实施方案中，第一体积中骨髓源性细胞群的解冻后存活率与第二体积中骨髓源性细胞群的解冻后存活率相差不超过25％。在一些实施方案中，第一体积中骨髓源性细胞群的解冻后存活率与第二体积中骨髓源性细胞群的解冻后存活率相差不超过20％。在一些实施方案中，第一体积中骨髓源性细胞群的解冻后存活率与第二体积中骨髓源性细胞群的解冻后存活率相差不超过15％。在一些实施方案中，第一体积中骨髓源性细胞群的解冻后存活率与第二体积中骨髓源性细胞群的解冻后存活率相差不超过13.6％。在一些实施方案中，第一体积中骨髓源性细胞群的解冻后存活率与第二体积中骨髓源性细胞群的解冻后存活率相差不超过10％。在一些实施方案中，第一体积中骨髓源性细胞群的解冻后存活率与第二体积中骨髓源性细胞群的解冻后存活率相差不超过5％。在一些实施方案中，第一体积中骨髓源性细胞群的解冻后细胞增殖速率与第二体积中骨髓源性细胞群的解冻后增殖速率相差不超过25％。在一些实施方案中，第一体积中骨髓源性细胞群的解冻后细胞增殖速率与第二体积中骨髓源性细胞群的解冻后增殖速率相差不超过20％。在一些实施方案中，第一体积中骨髓源性细胞群的解冻后细胞增殖速率与第二体积中骨髓源性细胞群的解冻后增殖速率相差不超过15％。在一些实施方案中，第一体积中骨髓源性细胞群的解冻后细胞增殖速率与第二体积中骨髓源性细胞群的解冻后增殖速率相差不超过13.6％。在一些实施方案中，第一体积中骨髓源性细胞群的解冻后细胞增殖速率与第二体积中骨髓源性细胞群的解冻后增殖速率相差不超过10％。在一些实施方案中，第一体积中骨髓源性细胞群的解冻后细胞增殖速率与第二体积中骨髓源性细胞群的解冻后增殖速率相差不超过5％。在一些实施方案中，骨髓源性细胞群的解冻后存活率为至少50％。在一些实施方案中，骨髓源性细胞群的解冻后增殖速率为至少1CFU-GM/105个细胞。在一些实施方案中，第一冷却速率和第二冷却速率包括约-0.1℃/min至约-5℃/min的超冷冻速率，直至至少冰已经在冷冻介质中成核。在一些实施方案中，第一冷却速率和第二冷却速率包括约-2.5℃/min至约-4℃/min的超冷冻速率，直至至少冰已经在冷冻介质中成核。在一些实施方案中，第一冷却速率和第二冷却速率包括约-2.5℃/min至约-3.5℃/min的超冷冻速率，直至至少冰已经在冷冻介质中成核。在一些实施方案中，第一冷却速率和第二冷却速率包括约-1℃/min至约-2℃/min的亚冷冻速率。在一些实施方案中，骨髓源性细胞群的解冻后存活率为至少60％。在一些实施方案中，骨髓源性细胞群的解冻后存活率为至少70％。在一些实施方案中，骨髓源性细胞群的解冻后存活率为至少80％。在一些实施方案中，骨髓源性细胞群的解冻后存活率为至少90％。在一些实施方案中，(c)发生在一个或多个冷冻机中。在一些实施方案中，第一容器和第二容器设置在一个或多个冷冻机中的第一冷冻机中。在一些实施方案中，第一容器被容纳在一个或多个冷冻机中的第一冷冻机中，并且第二容器被容纳在一个或多个冷冻机中的第二冷冻机中。在一些实施方案中，一个或多个冷冻机包括静态冷冻机。在一些实施方案中，第一冷冻机、第二冷冻机或二者是静态冷冻机。前述权利要求中任一项所述的方法，其中一个或多个冷冻机包括控速冷冻机。在一些实施方案中，第一冷冻机、第二冷冻机或二者是控速冷冻机。在一些实施方案中，一个或多个冷冻机被设定在约-70℃至-90℃。在一些实施方案中，一个或多个冷冻机被设定在低于-80℃。在一些实施方案中，一个或多个冷冻机被设定在-86℃。在一些实施方案中，第二体积被直接置于隔热容器中，使得每个小瓶紧邻于隔热容器的隔热材料。在一些实施方案中，所述方法还包括将第一体积布置在静态冷冻机内，使得第一体积不接触一个或多个冷冻机的壁。在一些实施方案中，第一体积中的骨髓或其衍生物的生物样品和第二体积中的骨髓或其衍生物的生物样品经历相同的冷却速率。在一些实施方案中，骨髓源性细胞是干细胞或免疫细胞。在一些实施方案中，所述干细胞包括造血干细胞(HSC)、间充质干细胞(MSC)或二者。在一些实施方案中，HSC包括CD34+细胞。在多种实施方案中，所述方法还包括以下步骤：将第一体积和第二体积转移至长期贮藏容器，例如，长期贮藏容器低于-86℃。
本公开内容的另一方面包括一种用于加工MSC的方法，所述方法包括：产生MSC的第一体积，其中所述第一体积包含骨髓或其衍生物的第一浓度；产生MSC的第二体积，其中所述第二体积小于所述第一体积并且包含第二浓度，其中所述第二浓度与所述第一浓度相差不超过30％；以及以第一冷却速率冷却所述第一体积并且以第二冷却速率冷却所述第二体积，其中所述第一冷却速率与所述第二冷却速率大约相同；其中所述第一体积中MSC的解冻后细胞增殖速率与所述第二体积中MSC的解冻后增殖速率相差不超过30％。在一些实施方案中，第一体积被容纳在第一容器中，其中第二体积被容纳在第二容器中，并且其中所述第一容器和所述第二容器暴露于单一/相同温度。在一些实施方案中，第二体积小于第一体积的50％。在一些实施方案中，第二体积小于第一体积的40％。在一些实施方案中，第二体积小于第一体积的37.5％。在一些实施方案中，第二体积小于第一体积的35％。在一些实施方案中，第二体积小于第一体积的30％。在一些实施方案中，第二体积小于第一体积的20％。在一些实施方案中，第二体积小于第一体积的15％。在一些实施方案中，第二体积小于第一体积的10％。在一些实施方案中，第二体积小于第一体积的5％。在一些实施方案中，第二体积小于第一体积的1％。在一些实施方案中，第一体积中MSC的解冻后存活率与第二体积中MSC的解冻后存活率相差不超过30％。在一些实施方案中，第一体积中MSC的解冻后存活率与第二体积中MSC的解冻后存活率相差不超过25％。在一些实施方案中，第一体积中MSC的解冻后存活率与第二体积中MSC的解冻后存活率相差不超过20％。在一些实施方案中，第一体积中MSC的解冻后存活率与第二体积中MSC的解冻后存活率相差不超过15％。在一些实施方案中，第一体积中MSC的解冻后存活率与第二体积中MSC的解冻后存活率相差不超过13.6％。在一些实施方案中，第一体积中MSC的解冻后存活率与第二体积中MSC的解冻后存活率相差不超过10％。在一些实施方案中，第一体积中MSC的解冻后存活率与第二体积中MSC的解冻后存活率相差不超过5％。在一些实施方案中，第一体积中MSC的解冻后细胞增殖速率与第二体积中MSC的解冻后增殖速率相差不超过25％。在一些实施方案中，第一体积中MSC的解冻后细胞增殖速率与第二体积中MSC的解冻后增殖速率相差不超过20％。在一些实施方案中，第一体积中MSC的解冻后细胞增殖速率与第二体积中MSC的解冻后增殖速率相差不超过15％。在一些实施方案中，第一体积中MSC的解冻后细胞增殖速率与第二体积中MSC的解冻后增殖速率相差不超过13.6％。在一些实施方案中，第一体积中MSC的解冻后细胞增殖速率与第二体积中MSC的解冻后增殖速率相差不超过10％。在一些实施方案中，第一体积中MSC的解冻后细胞增殖速率与第二体积中MSC的解冻后增殖速率相差不超过5％。在一些实施方案中，MSC的解冻后存活率是至少50％。在一些实施方案中，MSC的解冻后增殖速率为至少1CFU-GM/105个MSC。在一些实施方案中，第一冷却速率和第二冷却速率包括约-0.1℃/min至约-5℃/min的超冷冻速率，直至至少冰已经在冷冻介质中成核。在一些实施方案中，第一冷却速率和第二冷却速率包括约-2.5℃/min至约-4℃/min的超冷冻速率，直至至少冰已经在冷冻介质中成核。在一些实施方案中，第一冷却速率和第二冷却速率包括约-2.5℃/min至约-3.5℃/min的超冷冻速率，直至至少冰已经在冷冻介质中成核。在一些实施方案中，第一冷却速率和第二冷却速率包括约-1℃/min至约-2℃/min的亚冷冻速率。在一些实施方案中，MSC的解冻后存活率是至少60％。在一些实施方案中，MSC的解冻后存活率是至少70％。在一些实施方案中，MSC的解冻后存活率为至少80％。在一些实施方案中，MSC的解冻后存活率为至少90％。在一些实施方案中，(c)发生在一个或多个冷冻机中。在一些实施方案中，第一容器和第二容器设置在一个或多个冷冻机中的第一冷冻机中。在一些实施方案中，第一容器被容纳在一个或多个冷冻机中的第一冷冻机中，并且第二容器被容纳在一个或多个冷冻机中的第二冷冻机中。在一些实施方案中，一个或多个冷冻机包括静态冷冻机。在一些实施方案中，第一冷冻机、第二冷冻机或二者是静态冷冻机。在一些实施方案中，一个或多个冷冻机包括控速冷冻机。在一些实施方案中，第一冷冻机、第二冷冻机或二者是控速冷冻机。在一些实施方案中，一个或多个冷冻机被设定在约-70℃至-90℃。在一些实施方案中，一个或多个冷冻机被设定在低于-80℃。在一些实施方案中，一个或多个冷冻机被设定在-86℃。在一些实施方案中，第二体积被直接置于隔热容器中，使得每个小瓶紧邻于隔热容器的隔热材料。在一些实施方案中，所述方法还包括将第一体积布置在静态冷冻机内，使得第一体积不接触一个或多个冷冻机的壁。在一些实施方案中，第一体积中的MSC和第二体积中的MSC经历相同的冷却速率。在一些实施方案中，MSC是骨髓源性MSC(BM-MSC)或椎骨粘附的MSC(vBA-MSC)。
本公开内容的另一方面包括一种用于加工包含细胞或其衍生物的生物样品的方法，所述方法包括：产生包含细胞或其衍生物的生物样品的第一体积，其中所述第一体积包含细胞或其衍生物的第一浓度；产生包含细胞或其衍生物的生物样品的第二体积，其中所述第二体积小于所述第一体积并且包含细胞的第二浓度，其中细胞的所述第二浓度与细胞的所述第一浓度相差不超过30％；产生细胞特定的冷冻曲线；以第一冷却速率冷却所述第一体积，其中所述第一冷却速率根据冷冻曲线而产生；以及以第二冷却速率冷却所述第二体积，其中所述第一冷却速率根据冷冻曲线而产生；其中所述第一冷却速率与所述第二冷却速率大约相同；并且其中第一体积中细胞的解冻后细胞增殖速率与第二体积中细胞的解冻后细胞增殖速率相差不超过30％。权利要求1所述的方法，其中第一体积被容纳在第一容器中，其中第二体积被容纳在第二容器中，并且其中所述第一容器和所述第二容器暴露于单一/相同温度。在一些实施方案中，第二体积小于第一体积的50％。在一些实施方案中，第二体积小于第一体积的40％。在一些实施方案中，第二体积小于第一体积的37.5％。在一些实施方案中，第二体积小于第一体积的35％。在一些实施方案中，第二体积小于第一体积的30％。在一些实施方案中，第二体积小于第一体积的20％。在一些实施方案中，第二体积小于第一体积的15％。在一些实施方案中，第二体积小于第一体积的10％。在一些实施方案中，第二体积小于第一体积的5％。在一些实施方案中，第二体积小于第一体积的1％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后存活率与第二体积中细胞的解冻后存活率相差不超过30％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后存活率与第二体积中细胞的解冻后存活率相差不超过25％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后存活率与第二体积中细胞的解冻后存活率相差不超过20％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后存活率与第二体积中细胞的解冻后存活率相差不超过15％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后存活率与第二体积中细胞的解冻后存活率相差不超过13.6％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后存活率与第二体积中细胞的解冻后存活率相差不超过10％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后存活率与第二体积中细胞的解冻后存活率相差不超过5％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后细胞增殖速率与第二体积中细胞的解冻后细胞增殖速率相差不超过25％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后细胞增殖速率与第二体积中细胞的解冻后细胞增殖速率相差不超过20％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后细胞增殖速率与第二体积中细胞的解冻后细胞增殖速率相差不超过15％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后细胞增殖速率与第二体积中细胞的解冻后细胞增殖速率相差不超过13.6％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后细胞增殖速率与第二体积中细胞的解冻后细胞增殖速率相差不超过10％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后细胞增殖速率与第二体积中细胞的解冻后细胞增殖速率相差不超过5％。在一些实施方案中，细胞的解冻后存活率为至少50％。在一些实施方案中，细胞的解冻后增殖速率为至少1CFU-GM/105个细胞。在一些实施方案中，细胞的解冻后存活率为至少60％。在一些实施方案中，细胞的解冻后存活率为至少70％。在一些实施方案中，细胞的解冻后存活率为至少80％。在一些实施方案中，细胞的解冻后存活率为至少90％。在一些实施方案中，(c)发生在一个或多个冷冻机中。在一些实施方案中，第一容器和第二容器设置在一个或多个冷冻机中的第一冷冻机中。在一些实施方案中，第一容器被容纳在一个或多个冷冻机中的第一冷冻机中，并且第二容器被容纳在一个或多个冷冻机中的第二冷冻机中。在一些实施方案中，一个或多个冷冻机包括静态冷冻机。在一些实施方案中，第一冷冻机、第二冷冻机或二者是静态冷冻机。前述权利要求中任一项所述的方法，其中一个或多个冷冻机包括控速冷冻机。在一些实施方案中，第一冷冻机、第二冷冻机或二者是控速冷冻机。在一些实施方案中，一个或多个冷冻机被设定在约-70℃至-90℃。在一些实施方案中，一个或多个冷冻机被设定在低于-80℃。在一些实施方案中，一个或多个冷冻机被设定在-86℃。在一些实施方案中，第二体积被直接置于隔热容器中，使得每个小瓶紧邻于隔热容器的隔热材料。在一些实施方案中，所述方法还包括将第一体积布置在静态冷冻机内，使得第一体积不接触一个或多个冷冻机的壁。在一些实施方案中，第一体积中的包含细胞或其衍生物的生物样品和第二体积中的包含细胞或其衍生物的生物样品经历相同的冷却速率。在一些实施方案中，所述细胞是干细胞或免疫细胞。在一些实施方案中，所述干细胞包括造血干细胞(HSC)、间充质干细胞(MSC)或二者。在一些实施方案中，生物样品包含一种或多种器官、血液或二者。在一些实施方案中，所述免疫细胞包括T细胞。在一些实施方案中，所述血液是脐带血或外周血。在一些实施方案中，HSC包括CD34+细胞。在多种实施方案中，所述方法还包括以下步骤：将第一体积和第二体积转移至长期贮藏容器，例如，长期贮藏容器低于-86℃。
本公开内容的另一方面包括一种用于加工骨髓或其衍生物的方法，其中所述骨髓或其衍生物源自于死亡供体，所述方法包括：从死亡供体中获得骨或骨碎片，任选地将所述骨加工成骨碎片；从骨或骨碎片中提取骨髓或其衍生物；以及低温保藏骨髓或其衍生物，其中所述低温保藏包括在静态温度冷冻机中以大于约-1℃/min的冷冻速率降低骨髓或其衍生物的温度。在一些实施方案中，所述低温保藏包括在约-2.5℃/min至约-5℃/min的超冷冻速率下冷却骨髓或其衍生物，直至至少冰已经在冷冻介质中成核。在一些实施方案中，所述低温保藏包括在约-2.5℃/min至约-4℃/min的超冷冻速率下冷却骨髓或其衍生物，直至至少冰已经在冷冻介质中成核。在一些实施方案中，所述低温保藏包括在约-2.5℃/min至约-3.5℃/min的超冷冻速率下冷却骨髓或其衍生物，直至至少冰已经在冷冻介质中成核。在一些实施方案中，所述低温保藏包括在约-1℃/min至约-2℃/min的亚冷冻速率下冷却骨髓或其衍生物。在一些实施方案中，在不使用被动冷却箱的情况下保持超冷冻速率和亚冷冻速率。在一些实施方案中，所述低温保藏包括将骨髓或其衍生物的一个或多个等分试样布置在静态冷冻机内，使得等分试样不接触静态冷冻机的壁。在多种实施方案中，在静态冷冻机内，骨髓或其衍生物的等分试样没有直接贮藏在骨髓或其衍生物的另一等分试样上方。在一些实施方案中，骨髓或其衍生物包含CD34+细胞群。在一些实施方案中，在骨髓或其衍生物解冻之后CD34+细胞群包含至少70％的存活的CD34+细胞。在一些实施方案中，在骨髓或其衍生物解冻之后CD34+细胞群包含至少80％的存活的CD34+细胞。在一些实施方案中，静态冷冻机被设定在约-70℃至-90℃。在一些实施方案中，静态冷冻机被设定在-86℃。在一些实施方案中，静态冷冻机被设定在低于-80℃。
本公开内容的一方面包括一种用于加工骨髓或其衍生物的方法，其中所述骨髓或其衍生物源自于死亡供体，所述方法包括：从死亡供体中获得骨；使所述骨与漂白剂溶液接触至少约10分钟至至少约25分钟，其中所述骨浸没在漂白剂溶液中；从所述骨中提取骨髓或其衍生物，其中所述骨髓或其衍生物中包含的CD34+细胞的至少90％是存活的。在一些实施方案中，骨髓或其衍生物与漂白剂溶液接触至少约25分钟。在一些实施方案中，漂白剂溶液包含10％漂白剂。在一些实施方案中，所述骨是椎体。在一些实施方案中，过氧化氢是3％过氧化氢溶液。在一些实施方案中，所述方法还包括将经漂白的骨产物从包含漂白剂溶液的容器中转移至包含过氧化氢溶液的容器。在一些实施方案中，所述方法还包括将经漂白的骨产物在过氧化氢溶液内搅动。在一些实施方案中，c)中经漂白的骨产物浸没在包含过氧化氢的溶液中包括：将经漂白的骨产物浸没在包含过氧化氢溶液的容器中；检测与经漂白的骨产物相关的泡沫或泡沫状物；以及重复i和/或ii直至未检测到泡沫或泡沫状物为止。在一些实施方案中，所述方法还包括手动地从经漂白的骨产物中去除与ii中泡沫或泡沫状物相关的软组织。在一些实施方案中，将惰性造影染料添加至包含过氧化氢的溶液中以增强与经漂白的骨产物相关的任何泡沫或泡沫状物的可见度。
本公开内容的另一方面是一种用于加工骨髓或其衍生物的方法，其中所述骨髓或其衍生物源自于死亡供体，所述方法包括：从死亡供体中获得骨或骨碎片，任选地将所述骨加工成骨碎片；在研磨溶液存在下机械地研磨骨或骨碎片以产生多个骨研磨屑；将多个骨研磨屑置于约100至约200转/分钟(“RPM”)的摇床上约1至约20分钟；以及从该摇床取下该溶液，其中该溶液包含骨髓或其衍生物，其中骨髓或其衍生物包含至少约1,000个CD34+细胞/ml、1,500个CD34+细胞/ml、3,000个CD34+细胞/ml、5,000个CD34+细胞/ml、10,000个CD34+细胞/ml、15,000个CD34+细胞/ml、30,000个CD34+细胞/ml、50,000个CD34+细胞/ml、100,000个CD34+细胞/ml、150,000个CD34+细胞/ml、200,000个CD34+细胞/ml、250,000个CD34+细胞/ml、300,000个CD34+细胞/ml、350,000个CD34+细胞/ml、400,000个CD34+细胞/ml、450,000个CD34+细胞/ml、500,000个CD34+细胞/ml、550,000个CD34+细胞/ml、600,000个CD34+细胞/ml、650,000个CD34+细胞/ml、700,000个CD34+细胞/ml、750,000个CD34+细胞/ml、800,000个CD34+细胞/ml、850,000个CD34+细胞/ml、900,000个CD34+细胞/ml、950,000个CD34+细胞/ml、1,000,000个CD34+细胞/ml、1,050,000个CD34+细胞/ml、1,100,000个CD34+细胞/ml、1,150,000个CD34+细胞/ml、1,200,000个CD34+细胞/ml、1,250,000个CD34+细胞/ml、1,300,000个CD34+细胞/ml、1,350,000个CD34+细胞/ml、1,400,000个CD34+细胞/ml、1,450,000个CD34+细胞/ml、1,500,000个CD34+细胞/ml、1,550,000个CD34+细胞/ml、1,600,000个CD34+细胞/ml、1,650,000个CD34+细胞/ml、1,700,000个CD34+细胞/ml、1,750,000个CD34+细胞/ml、1,800,000个CD34+细胞/ml、1,850,000个CD34+细胞/ml、1,900,000个CD34+细胞/ml、1950,000个CD34+细胞/ml、2,000,000个CD34+细胞/ml、2,000,000个CD34+细胞/ml、3,000,000个CD34+细胞/ml、5,000,000个CD34+细胞/ml或10,000,000个CD34+细胞/ml骨髓或其衍生物或更多。
在一些实施方案中，所述方法还包括使所述溶液与冲洗介质接触以及重复c，以及随后从摇床取下所述溶液。在一些实施方案中，所述方法还包括一次或多次重复步骤c，以及随后从摇床取下所述溶液。在一些实施方案中，至少约1,500,000个CD34+细胞/ml骨髓或其衍生物包含至少85％的存活的CD34+细胞。在一些实施方案中，至少约1,500,000个CD34+细胞/ml骨髓或其衍生物包含至少90％的存活的CD34+细胞。
本公开内容的另一方面包括一种用于加工从骨髓或其衍生物中获得的CD34+细胞群的方法，其中所述骨髓或其衍生物源自于死亡供体，所述方法包括：从死亡供体中获得骨或骨碎片，任选地将所述骨加工成骨碎片；从骨或骨碎片中提取骨髓或其衍生物；以及使骨髓或其衍生物与稳定化缓冲剂接触，其中所述稳定化缓冲剂包含大于约3U/ml的核酸酶；进行CD34+细胞分离测定法以产生包含CD34+细胞群的细胞组合物，其中包含CD34+细胞群的组合物包含至少约80,000个CD34+细胞/750μl的与稳定化缓冲剂接触的骨髓或其衍生物。在一些实施方案中，至少约80,000个CD34+细胞/750μl的与稳定化缓冲剂接触的骨髓或其衍生物包含至少70％的存活的CD34+细胞。在一些实施方案中，至少约80,000个CD34+细胞/750μl的与稳定化缓冲剂接触的骨髓或其衍生物包含至少80％的存活的CD34+细胞。在一些实施方案中，至少约80,000个CD34+细胞/750μl的与稳定化缓冲剂接触的骨髓或其衍生物包含至少90％的存活的CD34+细胞。在一些实施方案中，稳定化缓冲剂包含大于约5U/ml的核酸酶。在一些实施方案中，稳定化缓冲剂包含大于约10U/ml的核酸酶。在一些实施方案中，稳定化缓冲剂包含大于约15U/ml的核酸酶。在一些实施方案中，稳定化缓冲剂包含约20U/ml的核酸酶。在一些实施方案中，稳定化缓冲剂包含大于约20U/ml的核酸酶。在一些实施方案中，核酸酶是或/>在一些实施方案中，稳定化缓冲剂还包含大于约5U/ml的抗凝剂。在一些实施方案中，稳定化缓冲剂还包含大于约10U/ml的抗凝剂。在一些实施方案中，稳定化缓冲剂还包含约10U/ml的抗凝剂。在一些实施方案中，所述抗凝剂是肝素。在一些实施方案中，稳定化缓冲剂还包含人血清白蛋白(HSA)。在一些实施方案中，稳定化缓冲剂包含0.5％HSA。
本公开内容的另一方面包括一种稳定化缓冲剂，其包含：至少5U/ml的抗凝剂；以及大于3U/ml的核酸酶。在一些实施方案中，稳定化缓冲剂包含大于约5U/ml的核酸酶。在一些实施方案中，稳定化缓冲剂包含大于约10U/ml的核酸酶。在一些实施方案中，稳定化缓冲剂包含大于约15U/ml的核酸酶。在一些实施方案中，稳定化缓冲剂包含大于约20U/ml的核酸酶。在一些实施方案中，稳定化缓冲剂包含约20U/ml的核酸酶。在一些实施方案中，核酸酶是或/>在一些实施方案中，稳定化缓冲剂还包含大于约10U/ml的抗凝剂。在一些实施方案中，稳定化缓冲剂还包含约10U/ml的抗凝剂。在一些实施方案中，所述抗凝剂是肝素。在一些实施方案中，稳定化缓冲剂还包含人血清白蛋白(HSA)。在一些实施方案中，稳定化缓冲剂包含0.5％HSA。
本文所述的任何方面或实施方案可以与本文公开的任何其他方面或实施方案组合。
根据其中仅显示和描述了本公开内容的说明性实施方案的以下详细描述，对于本领域的技术人员而言，本公开内容的其他方面和优点将变得明白易懂。正如将认识到的，本公开内容能够具有其他不同的实施方案，并且其若干细节能够在各种明显的方面进行修改，其全部都不偏离本公开内容。因此，附图和描述应被视为说明性的，而非限制性的。
附图说明
本发明的新颖特征在随附的权利要求中具体地阐述。通过参考以下阐述了其中利用了本发明原理的说明性实施方案的详细描述以及附图(本文中也称为“附图”和“图”)，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，其中：
图1是根据本公开内容的一个特征的过滤系统的视图。
图2是容纳根据本公开内容的方法加工的骨髓沉淀的无菌袋的视图。
图3是图2的无菌袋的视图，夹子夹紧该袋而将脂肪与骨髓沉淀分隔。
图4示出了用于分离骨髓沉淀的装置。
图5是根据本公开内容的一个方面的冷却箱的透视图。
图6是根据本公开内容的一种方法的流程图。
图7A和图7B是根据本公开内容的一个方面的自动化骨加工系统的侧视图和透视图。
图8A和图8B是图7A和图7B中所示的系统的骨清理站的透视图。
图9A和图9B是图7A和图7B中所示的系统的骨研磨站的透视图和正视图。
图10是图7A和图7B中所示的系统的筛分站的透视图。
图11A-图11C是在有和无身体冷却的情况下随着热缺血和冷缺血时间而变化的CD34+细胞存活率的表。
图12A-图12C是在有和无身体冷却的情况下随着热缺血和冷缺血时间而变化的CFU-总量的表。
图13A-图13C是在有和无身体冷却的情况下随着热缺血和冷缺血时间而变化的CFU-总量的表。
图14显示了-86℃ Eppendorf Cryocube型号F740hi的一个搁架中的HPC骨髓(HPC,Marrow)实验性试验盒位置。
图15显示了-86℃ Eppendorf Cryocube型号F740hi的一个搁架中的盒位置的示例性可替代的排布。
图16显示了用于确定超冷冻/亚冷冻冷却速率以及成核温度的图的实例。
图17A-图17E显示了当用稳定化缓冲剂从冷冻样品中加工骨髓细胞时防止了聚集体的形成。图17A示出了抗体标记之后的骨髓细胞浆料。数字编号对应于所用的缓冲剂。用稳定化缓冲剂(4)加工的骨髓细胞样品表现出不存在聚集体。图17B示出了在用稳定化缓冲剂加工的骨髓细胞样品中在过滤之后缺乏截留的聚集体。图17C和图17D显示了用CliniMACS缓冲剂加工的骨髓细胞的聚集体的形成(图17C)，或者用稳定化缓冲剂加工的骨髓细胞的聚集体不存在(图17D)。图17E示出了用稳定化缓冲剂加工的骨髓细胞表现出骨髓细胞的增加的存活产量和CD34表达。纯度大于60％，并且回收了大于60％CD34细胞。CD3计数与CD34计数之间的比率是0.5％(例如5个表达CD3的细胞/100个表达CD34的细胞)。
图18显示了实施例9中洁净室C的示例性洁净室图。
图19显示了如实施例9中所述对VB去污染的示例性洁净室工作流程。
图20显示了在8周时血液中人CD34+的示例性流式细胞术图。
图21显示了用于确定从死亡供体和活供体中分离的BM细胞的表型的门控策略。
图22显示了在活供体对比于死亡供体BM中CD45+白细胞、CD34+HSPC和CD3+T细胞的相对值和绝对值。条形代表平均值+/-标准偏差。
图23显示了HPC骨髓和活供体BM之间的CFU潜力比较。
图24显示了从器官供体(OD)和活供体(LD)BM中分离的CD34+HSC的相似存活率和数量。来自5项研究的平均值。
图25显示了在注射CD34+细胞之后16周受辐射的NSG小鼠的骨髓中人CD45+细胞的水平。模拟对照是来自未受辐射的未经处理的小鼠的骨髓。细胞表面CD45表达通过流式细胞术来确定。粗条代表N＝5(脐带血)或10(HPC骨髓)只小鼠的平均值。标准偏差由细竖直线显示。
图26显示了在对NSG小鼠辐射和用CD34+细胞移植之后16周在骨髓(BM)、外周血(PB)和脾脏中人CD45+和CD34+细胞的百分比。
图27描绘了次级移植。在注射来自植入来自所示供体的CD34+细胞的小鼠的总骨髓之后16周受辐射的NSG小鼠的骨髓中人CD45+细胞的水平。模拟对照是来自未受辐射的未经处理的小鼠的骨髓。细胞表面CD45表达通过流式细胞术来确定。粗条代表N＝10只小鼠的平均值。标准偏差由细竖直线显示。
图28是生产低温保藏的骨髓(“HPC骨髓”)的总体连续制造和过程控制流程图，如实施例16中所述。
本公开内容的新颖特征在随附的权利要求中具体地阐述。通过参考以下阐述了说明性实施方案的详细描述，将获得对本公开内容的特征和优点的更好理解。
具体实施方式
引言
本文公开的组合物、系统和方法提供了对现存骨髓和干细胞来源的所需补充。具体地，本文公开的组合物、系统和方法提供了用于从人尸体中分离、加工和使用骨髓和造血干细胞(“HSC”)的技术。本文所述的组合物、系统和方法独有的特征导致本领域的当前状态的改进。这些特征导致功能性骨髓和HSC的显著改进的产量，减轻了对骨髓和HSC的分离、加工和使用通常所需的资源的总体负担。
本文公开的组合物、系统和方法提供了从本领域中已知的骨髓和HSC的分离和加工技术(尤其用于从活供体中加工骨髓和HSC的那些技术)的偏离。本公开内容描述了用于产生本文所述的骨髓和HSC组合物的加工技术的多种实施方案。
如下所述，将各种骨从死亡供体中取出和制备以供机械和酶法加工。然后将骨机械地加工，其中骨髓和/或骨髓源性细胞(例如HSC)被过滤而产生存活的骨髓(以及骨髓中或附近包含的HSC)组合物。骨和细胞组合物被进一步机械地/酶法地加工而产生最佳产量的存活的细胞。这些加工步骤提供从本领域的当前状态的偏离，由此导致改进的细胞组合物和加工方法。
然后骨髓被进一步加工以供即刻使用或保藏。在一些实施方案中，骨髓被进一步加工以产生包含特定HSC群(例如CD34+细胞)的细胞组合物。本文描述了优化的组合物、系统和方法，提供了改进的骨髓和HSC加工技术和组合物。
本文所述的这些优化的组合物、系统和方法为医学执业者(例如免疫学、再生医学)认识到的当前问题提出了独特的解决方案。利用本文所述的优化的组合物、系统和方法可以产生与目前储库(depot)相比将具有更多存活的细胞的骨髓“库”或储库，而且使用本文所述的组合物、系统和方法产生的骨髓储库还将具有更多样化(例如不同HLA表型)的骨髓/HSC组合物，从而产生可从使用本文所述的组合物、系统和方法产生的骨髓储库中受益的更大的潜在对象群体。
本公开内容的方面提供了一种低温保藏的细胞产品，其被分成两体积，第一体积(例如，低温保藏袋)包含用于移植到有需要的对象中的细胞产品，并且第二体积充当所述第一体积的代用品。如本文中使用的，代用小瓶通常是细胞产品的较小体积，并且可以按照需要对代用品进行解冻和测定例如细胞存活率(尤其通过解冻后增殖而确定的“功能存活率”)。对代用小瓶的测定结果代表对第一(较大)体积的预期测定结果；然而，通过使用代用品，不需要为了测定而解冻第一体积，而是在需要使用时解冻，例如，用于移植到有需要的对象中。
在不希望受理论约束的情况下，对于给定的细胞类型，需要特定的最佳冷却速率以便该细胞类型或细胞产品存活于低温保藏。此最佳冷却速率使细胞内冰形成(IIF)所致的损伤与由细胞外冰形成产生的高溶质浓度所致的损伤平衡。如果细胞被过快地冷却，则致损性IIF是可能的；如果细胞被过慢地冷却，则致损性溶质效应是可能的。为了代用小瓶准确地代表第一体积，在两体积中细胞应在大约相同的速率(即优化的速率)下被冷冻；此共同速率在两体积中导致细胞的等同的存活和存活率。重要地，第二体积可以与第一体积贮藏在相同的长期贮藏系统中，因此将在长期贮藏持续时间期间暴露于相同条件，故此，促进了代用小瓶准确地代表容纳用于移植的细胞的低温保藏袋的能力。这些最终允许测试第二体积以至少确定对低温保藏袋的贮藏是否适当地维持并且不必操纵和测试第一体积的细胞。更具体地，通过测定代用小瓶，低温保藏袋在其即刻使用之前不需要被升温和/或处理。此特征以两种方式特别有助于对象的结果和健康。第一，用于移植的细胞仅在准备施用于对象(并且优选地在施用的部位处)时才被解冻，而不是在使用之前大约两周时被解冻以便可以进行测定以确保细胞产品适合于使用；这两周延迟(在此期间使细胞保持在室温下、在冰上、或者在37℃，或者更糟地重新冷冻并返回冷贮藏)可能一旦移植时不利地影响它们的存活率和效用。第二，因为对象可能在移植之前经受清髓性预处理(myeloablativeconditioning)，所以患者可能预先阻止清髓性预处理直至细胞产品已经被测定和确定为适合于使用为止，这通常耗时约两周；由于具有代用小瓶，所以一旦已经鉴定适合的产品，对象就开始清髓性预处理，从而缩短该对象保持免疫受损的时间长度。
本公开内容提供了用于确保所述两体积在相同速率下冷却的方法。至少基于物理定律，细胞产品的较小体积相比于细胞产品的较大体积将在更快速率下冷却。于是，相对于具有较慢的冷却速率的较大体积，具有较快的冷却速率的较小体积应具有增加的IIF。本公开内容的方法促进第一(较大)体积与第二(较小)体积之间细胞冷却的等同速率，以至每个体积将具有相似量的IFF，于是，代用小瓶(较小体积)将准确地代表较大的第一体积。在不希望受理论约束的情况下，本公开内容的方法部分地基于使用直接容纳或间接容纳第一体积或第二体积的不同类型的容器和/或使容器就位在相同冷冻机(例如，静态温度冷冻机)内，将第二(较小)体积的冷却速率减慢至第一(较大)体积经受的速率。因此，较小体积(即，第二体积/代用小瓶)中的细胞与较大体积(即，第一体积/低温保藏袋)中的细胞当处于相同静态冷冻机(例如，-86℃静态冷冻机)中时经受相似的冷却速率(例如，约-1℃/分钟)。重要地，为了减慢较小的第二体积的冷却速率，将代用小瓶直接置于隔热的小瓶容器(例如，冷冻贮藏系统)中，该容器当置于低于-80℃的静态冷冻机(例如，-86℃静态冷冻机)中时，代用小瓶中的细胞经受约-1℃/分钟速率的冷冻速率；在不使用隔热的小瓶容器的情况下，代用小瓶中的细胞可能经受约-10℃/分钟速率的冷冻速率，由此可能导致IIF所致的损伤。在另一方面，较大的第一体积(低温保藏袋)不需要直接置于隔热的容器中，反而当该袋置于非隔热(以避免减慢该袋的冷却速率)的盒中并被移动至-86℃静态冷冻机时，低温保藏袋中的细胞优选地经受约-1℃/分钟的冷冻速率。“直接置于”意味着每个小瓶都紧邻于隔热容器的隔热材料。这些操纵使第一体积和第二体积的细胞具有细胞内水向细胞的细胞外空间大致等同的渗透；此渗透增加细胞内溶质浓度，并且有助于避免形成(有害的)细胞内冰晶并且促进细胞外冰形成(其对细胞的有害性较小)。一旦(在-86℃静态冷冻机中)冷冻的第一步骤，就将低温保藏袋和代用小瓶置于相同的长期贮藏装置(例如，液氮贮藏罐)中并且在长期贮藏装置内就位在大致相似的位置。
因此，本公开内容的方法允许生产细胞产品的代用样品，该代用样品预期准确地代表要向有需要的对象施用的细胞产品的部分，并且提供了细胞产品，该细胞产品不仅在治疗性上有益于所述对象，而且促进对象的结果和健康，当低温保藏的细胞产品仅仅被容纳在单个袋中并且没有代用小瓶时，其方式是不可实现的。
制备供体骨
椎体和髂骨代表了高品质红骨髓的最大持续性储备。利用一种或两种来源已经优化了对骨髓的回收，特别是通过实施本文公开的工业化的可扩展性GMP过程。在一些实施方案中，本文公开的过程的完成导致在标准血袋中以1-1.5亿个总成核细胞/ml的目标贮藏60-70ml体积的最终产品的低温保藏。在一些情况中，该生产方法提供一种系统，在该系统中有技术的组织加工技术人员可以在6小时窗口内加工一系列供体骨而产生有意义数量的存活的骨髓。
在一些实施方案中，供体骨是椎体。然而，应理解本文所述的方法可以用于髂骨、椎体和髂骨的组合，或者适合于提取骨髓以及来自骨髓的细胞的其他骨，甚至具有较低预期产量的供体骨。
应理解，可以根据用于临床回收的固定方案来获取供体骨。骨可以由外科医生或训练有素的器官获取组织(OPO)的人员使用骨凿和木槌从同意的器官和组织供体中回收。椎骨段必须小心地进行回收，优选地从胸椎和腰椎回收。通过使用骨凿和木槌而切开并取出骨段。将尽可能多的脊髓取出。有执照的外科医生可以监督这些步骤，以确保有效地回收VB并防止疾病传播和细菌移位。
椎骨段一旦回收就被擦拭以进行微生物培养测试，并置于具有用盐水浸透的无菌的垫、海绵或毛巾的无菌的带标签袋中，以确保在低温运输期间保持水分。然后将这些置于冷却器中在湿冰袋之间以进行运输。对VB的回收必须发生在最小的热缺血时间(≤8小时)。运输和加工的启动必须在最小的冷缺血时间(≤40小时)内完成。包装最后被运输至加工设施。
VB料被包裹并装入双袋。将袋子置于隔热的托运箱中，以袋装的湿冰包围它们。托运箱被密封并通过医疗快递送到Ossium。当到达时，检查包装是否符合协议，并测量椎体温度以确保符合运输要求。
制备供体骨的过程可以在从死亡供体中获得骨后不久发生，或者可以在供体骨已经在低温环境下被运至加工设施后发生。由于供体骨在回收和运输至加工设施期间可能经受长时间的缺血，因此必须注意跟踪缺血的长度和类型，例如，热缺血和冷缺血。正如本文更详细地描述的，经过预定时期的热缺血和/或冷缺血的骨适合于获得有意义数量的存活的骨髓细胞。
在加工供体骨期间，在ISO-5(100级)环境(生物安全操作柜)和ISO-7(10,000级)背景(洁净室)下对骨进行清理，特别注意对容纳供体骨的袋子进行灭菌，例如通过用70％异丙醇喷洒。在一个实施方案中，通过使用手术刀、骨凿和凿子手动地进行清理。在加工椎骨时，通常将提供包括多个椎骨节的脊柱段。在典型的情况中，脊柱段从T8延伸至L5，十个椎体。在脊柱段的初始清理期间，当足够的软组织已经被去除以显现椎弓根(pedicles)时，通过使用组织加工带锯或骨锯，诸如Stryker System 6Saw(Stryker,Kalamazoo,MI)，或用图1A至图1D中所示的手工工具去除椎弓根。特别注意要避免破坏皮质骨而可能暴露骨松质，以确保低氧的松质骨髓在整个清理过程中保持受到保护。包含骨松质材料的椎体的前部元件被保留，而椎弓根和后部元件被弃去。
通过使用剔骨刀或组织加工带锯，将椎体(VB)在椎间盘处分离。用手术刀、剪刀和/或骨凿去除残留在每个椎体上的椎间盘和软组织，留下干净的、分离的VB。在供体髂骨的情况下，可以用凿子和手术刀去除软组织，再次特别注意要确保皮质骨不被破坏。骨的任何解剖病理或损伤都被注意和记录，作为最终从骨中获得的骨髓的批记录的部分。在回收过程期间受损的骨被弃去。
在一些情况中，尸体骨经过“预加工”以减少尸体骨携带的污染物，其有风险将污染转移到加工骨的设施中。在这些情况下，两名技术人员执行预加工的不同方面。第一名技术人员打开容纳收集的尸体骨的包装，优选地容纳在密封的内袋中。第二名技术人员戴着无菌手套，从包装中取出尸体骨，并将组织置于第一(冲洗)盆中。第二名技术人员用约4％葡萄糖酸氯己定溶液在冲洗盆中或上方剧烈地擦洗尸体骨的所有表面约3分钟。第一名技术人员戴着无菌手套，将无菌盐水倒在经擦洗的尸体骨上，溢流物被捕集到冲洗盆中。将足量的盐水倒在尸体骨上，以冲洗其所有表面。然后将经冲洗的尸体骨置于与冲洗盆邻近的无菌布上。必要时可以重复盐水冲洗。将醇例如70％异丙醇倒在尸体骨上。将足量的醇倒在尸体骨上，以接触其所有表面。醇溢流物被捕集在冲洗盆中。将尸体骨置于敞开的容器中，用醇喷洒，然后将敞开的容器和骨转移至罩子中，在其中可以对骨进行进一步加工。
本公开内容的方面包括一种用于加工骨髓或其衍生物的方法，其中所述骨髓或其衍生物源自于死亡供体，所述方法包括：从死亡供体中获得骨；使所述骨与漂白剂溶液接触至少约10分钟至至少约25分钟，其中所述骨浸没在漂白剂溶液中；从所述骨中提取骨髓或其衍生物，其中所述骨髓或其衍生物中包含的CD34+细胞的至少90％是存活的。在一些实施方案中，骨髓或其衍生物与漂白剂溶液接触至少约25分钟。在一些实施方案中，漂白剂溶液包含10％漂白剂。在一些实施方案中，所述骨是椎体。在一些实施方案中，过氧化氢是3％过氧化氢溶液。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将经漂白的骨产物从包含漂白剂溶液的容器中转移至包含过氧化氢溶液的容器中。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将经漂白的骨产物在过氧化氢溶液内搅动的步骤。在一些实施方案中，经漂白的骨产物浸没在包含过氧化氢的溶液中包括：将经漂白的骨产物浸没在包含过氧化氢溶液的容器中；检测与经漂白的骨产物相关的泡沫或泡沫状物；以及重复浸没，直至未检测到泡沫或泡沫状物为止。在一些实施方案中，所述方法进一步包括从经漂白的骨产物中手动地去除与泡沫或泡沫状物相关的软组织。在一些实施方案中，将惰性造影染料添加至包含过氧化氢的溶液中，以增强与经漂白的骨产物相关的任何泡沫或泡沫状物的可见度。
在一些实施方案中，将骨在漂白剂溶液中搅动(例如，震摇)。
经预加工的或未经预加工的VB被置于无菌袋中并且浸没在约10％漂白剂溶液(0.5％次氯酸钠在无菌水中)，产生5,000ppm游离氯的浓度，持续预定的时期，通常约5分钟至约25分钟，例如，5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟、21分钟、22分钟、23分钟、24分钟、25分钟或更久以及介于其间的任何时间长度。漂白剂具有广谱抗微生物活性，不会留下毒性残余物，不受水硬度影响并且快速起效。
从在漂白剂处理的不同持续时间下加工的每组VB而来的骨髓可以通过流式细胞术进行测试以评估从所述骨髓中分离的细胞的存活率。如表4中所示例的，VB浸泡大于10分钟与当VB浸泡多达25分钟时相比没有产生细胞存活率的显著差异。然而，在不希望受理论约束的情况下，漂白时间的增加改进了最终产品。例如，增加VB浸泡在漂白剂中较长的时间段允许漂白剂填充VB的孔或裂缝而进一步将VB去污染或灭菌。
漂白剂溶液可以是约5％漂白剂至约15％漂白剂，例如，约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或约15％漂白剂。在一些实施方案中，漂白剂处理包括使用1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更高百分比的漂白剂。在一些实施方案中，漂白剂处理包括使VB与漂白剂接触至少1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11,分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟或更长的持续时间。在一些实施方案中，VB浸没在漂白剂溶液中至少约10分钟至至少约25分钟，例如，约10至约12分钟、约11至约14分钟、约13至约16分钟、约15至约18分钟、约17至20分钟、约19至22分钟、或者约21至25分钟以及介于其间的任何间隔。在一些实施方案中，与从未经漂白剂处理的VB中分离的骨髓细胞相比，在本文所述的漂白剂处理的任何持续时间下从经漂白剂处理的VB中分离的骨髓细胞的存活率没有降低。在一些实施方案中，从在11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟或更长持续时间的漂白剂处理下处理的VB中分离的骨髓细胞的存活率与从在10分钟漂白剂处理下处理的VB中分离的骨髓细胞的存活率相比未降低或者降低小于3％。在一些实施方案中，从大于10分钟处理的VB中分离的骨髓细胞的存活率与从在10分钟漂白剂处理下处理的VB中分离的骨髓细胞的存活率相比降低小于2％。在一些实施方案中，从大于10分钟处理的VB中分离的骨髓细胞的存活率与从在10分钟漂白剂处理下处理的VB中分离的骨髓细胞的存活率相比降低小于1％。
令人感兴趣地，漂白剂处理提供了对骨的表面灭菌，但是未渗入包含BM的隔室中。因此，本文公开的漂白剂处理基本上不降低从BM中获得的存活的细胞的产量。
在一些实施方案中，从浸没在漂白剂中的骨中提取的骨髓或其衍生物中包含的存活的CD34+细胞的百分比为至少约80％至约95％。在一些实施方案中，从浸没在漂白剂中的骨中提取的骨髓或其衍生物中包含的存活的CD34+细胞的百分比为至少约80％至约85％、约80％至约90％、约80％至约95％、约85％至约90％、约85％至约95％，或者约90％至约95％。在一些实施方案中，从浸没在漂白剂中的骨中提取的骨髓或其衍生物中包含的存活的CD34+细胞的百分比为至少约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，从浸没在漂白剂中的骨中提取的骨髓或其衍生物中包含的存活的CD34+细胞的百分比为至少约80％、约85％或约90％。在一些实施方案中，从浸没在漂白剂中的骨中提取的骨髓或其衍生物中包含的存活的CD34+细胞的百分比为至多约85％、约90％或约95％。
在漂白期结束时，将骨转移至另一无菌袋并且浸没在3％过氧化氢(H2O2)溶液中。在一些情况中，H2O2溶液包含PLASMA-LYTETM(多电解质注射液，其是无菌的、无热原的等渗溶液，是细胞的水和电解质平衡的类晶体的基本来源，获自Baxter Healthcare,Ltd.)。在一些情况中，H2O2溶液包含PLASMA-LYTETM和人血清白蛋白(HSA)，其是稳定化剂和贮藏剂(它可以在H2O2溶液中被稀释而达到2.5％HSA)。将所述袋封闭并且短暂震摇以确保骨的整个表面与溶液接触。大多数活细胞包含过氧化氢酶，其是催化H2O2分解成H2O和O2的酶。当H2O2溶液接触软组织而非接触骨时此分解表现为泡沫或泡沫状物。可以观察泡沫水平，作为骨上剩余软组织的量的指示。此观察可以手动地通过处理人员进行，或者在另一实施方案中，通过自动化的处理器进行。自动化的处理器包括可视化装置例如照相机，以及目标识别软件(其可以确定袋内的泡沫水平)。惰性造影染料的添加可以有助于处理人员或自动化的处理器检测泡沫水平。如果观察到任何泡沫或泡沫状物，则将骨返回以供进一步加工而从骨中去除所有剩余的软组织。一旦VB或髂骨已经被清除所有软组织，就将骨转移至新的无菌袋。该袋填充有1L的PLASMA-LYTETM，或其他合适的无菌、无热原的等渗溶液。将该袋封闭并且短暂震摇以确保整个骨与PLASMA-LYTETM接触。
在一些实施方案中，所述方法还包括将经漂白的骨产物在过氧化氢溶液内搅动的步骤。在一些实施方案中，经漂白的骨产物浸没在包含过氧化氢的溶液中包括：经漂白的骨产物浸没在包含过氧化氢溶液的容器中；检测与经漂白的骨产物相关的泡沫或泡沫状物；以及重复该浸没直至未检测到泡沫或泡沫状物为止。在一些实施方案中，所述方法还包括手动地从经漂白的骨产物中去除与泡沫或泡沫状物相关的软组织。在一些实施方案中，将惰性造影染料添加至包含过氧化氢的溶液以增强与经漂白的骨产物相关的任何泡沫或泡沫状物的可见度。
漂白步骤和过氧化氢步骤可以重复多次。
在不希望受理论约束的情况下，认为H2O2溶液不仅有助于对骨进行表面灭菌，它有助于将任何残余漂白剂分解成盐、氧气和水。
在表面灭菌之后，可以将尸体骨用水、盐水或者低温防护剂溶液冲洗。然后，可以将经表面灭菌的尸体骨置于包含低温防护剂溶液的封闭容器中，并且压力减低。
低温防护剂渗入尸体骨中
可以在足以使低温防护剂溶液能够渗入尸体骨中的时间长度期间和条件下使尸体骨与低温防护剂溶液接触。在下文和其他部分描述了用于低温保藏骨的方法。在一些情况中，足以允许低温防护剂溶液渗入的条件包括使用真空辅助的低温防护剂渗入尸体骨中，如PCT/US2021/042064中公开的，其内容通过引用而以其整体并入本文中。在其他情况中，尸体骨浸没在低温防护剂溶液中并且不使用真空。
本公开内容的方面是一种用于低温保藏尸体骨的方法，其使用真空来辅助低温防护剂渗入尸体骨中。所述方法包括以下步骤：(a)将尸体骨置于包含低温防护剂溶液的封闭容器中；(b)降低封闭容器中的压力，并且任选地使封闭容器保持在减压下，以去除尸体骨中存在的水的至少一部分；(c)升高封闭容器中的压力并且使封闭容器保持在升高的压力以允许低温防护剂溶液渗入尸体骨中；(d)将尸体骨从封闭容器中取出；以及(e)将尸体骨冷却至至少低于0℃的温度，从而低温保藏尸体骨。
出人意料地，通过将尸体骨浸入低温防护剂的封闭容器中并且将间歇性真空施加于封闭容器，与通过被动扩散可能发生的相比，低温防护剂显著更快速地渗入尸体骨。关于PCT/US2021/042064，比较图2与图4A和图4B，以及图3与图5。低温防护剂的这种有效渗入促成在尸体骨的冷冻期间减少的冰晶形成，以及最终提取具有复制潜力的存活的骨髓细胞。
步骤(b)和(c)可以发生仅一次，或者步骤(b)和(c)可以重复至少一次、至少两次、至少四次、至少五次或者至少六次。在一些实施方案中，重复减压和升压可以增加低温防护剂渗入尸体骨中。参见，例如，PCT/US2021/042064的图5。在其他实施方案中，在减压和升压的单次循环之后，有低温防护剂充足地渗入尸体骨中。
在多种实施方案中，在低温防护剂的真空辅助的渗入之前，将尸体骨(例如，椎体)二等分，切成四等份或者更多地分割。
封闭容器中的减压可以是约-400mmHg至约-800mmHg的任何压力值。压力需求应是足以去除尸体骨中存在的水的至少一部分。封闭容器中的减压可以具有以下值：约-400mmHg、-425mmHg、-450mmHg、-475mmHg、-500mmHg、-525mmHg、-550mmHg、-575mmHg、-600mmHg、-625mmHg、-650mmHg、-675mmHg、-700mmHg、-725mmHg、-750mmHg、-775mmHg或-800mmHg。在一些实施方案中，封闭容器中的减压是约-400mmHg至约-500mmHg。
在一些实施方案中，一旦封闭容器中的压力开始减低，封闭容器就需要约1分钟至约10分钟来达到期望的减压。作为实例，封闭容器可能需要小于1分钟、约1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟或约10分钟和介于其间的任何时间长度(例如，一分钟的分数，例如，约5秒、10秒、20秒、30秒、40秒、约50秒和介于其间的任何秒数)来达到期望的减压。在一些实施方案中，尸体骨快速地(例如，约1秒至约1分钟)达到期望的减压。
在一些实施方案中，一旦已经达到减压，就使尸体骨保持在减压下。可以使尸体骨保持小于1分钟至约50分钟。作为实例，使封闭容器在减压下保持小于1分钟、约1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、21分钟、22分钟、23分钟、24分钟、25分钟、26分钟、27分钟、28分钟、29分钟、30分钟、31分钟、32分钟、33分钟、34分钟、35分钟、36分钟、37分钟、38分钟、39分钟、40分钟、41分钟、42分钟、43分钟、44分钟、45分钟、46分钟、47分钟、48分钟、49分钟或约50分钟和介于其间的任何时间长度(例如，1分钟的分数，例如，约5秒、10秒、20秒、30秒、40秒、约50秒和介于其间的任何秒数)。在一些实施方案中，尸体骨在减压下未保持任何可测量的时间，反而，所述方法进展至步骤(c)，升高封闭容器中的压力。
在步骤(c)中，升高封闭容器的压力，直至压力为约0mmHg至约760mmHg。换言之，将压力升高至高达标准大气温度。确切的升压可以是在特定范围内的任何量，例如，0mmHg、50mmHg、100mmHg、150mmHg、200mmHg、250mmHg、300mmHg、350mmHg、400mmHg、450mmHg、500mmHg、550mmHg、600mmHg、650mmHg、700mmHg或750mmHg。然而，该升压必须足够高以允许低温防护剂溶液渗入尸体骨中。
封闭容器可以在升压下保持小于约2小时。作为实例，小于1小时、小于半小时、约半小时或更短时间。在一些实施方案中，封闭容器在升压下保持10分钟。封闭容器保持在升压下的持续时间必须足够长以允许低温防护剂溶液渗入尸体骨中。作为实例，封闭容器在升压下保持约1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、21分钟、22分钟、23分钟、24分钟、25分钟、26分钟、27分钟、28分钟、29分钟或约30分钟，以及介于其间的任何时间长度(例如，1分钟的分数，例如，约5秒、10秒、20秒、30秒、40秒、约50秒以及介于其间的任何秒数)。
封闭容器以及其中容纳的低温防护剂可以在室温下。或者，封闭容器以及其中容纳的低温防护剂可以低于室温，例如，低达4℃。封闭容器以及其中容纳的低温防护剂可以高于室温，例如，高达37℃。
任何合适的低温防护剂可以用于低温防护剂溶液中。低温防护剂的实例包括二甲基亚砜(也称为DMSO、C2H6OS和ME2SO)；1,2丙烷二醇(也称为丙二醇)；乙二醇；甘油；甲酰胺(foramamide)；乙烷二醇、丁烷2,3二醇；羟乙基淀粉(HES)；葡聚糖；蔗糖；海藻糖；乳糖；棉子糖；核糖醇(ribotol)；甘露醇；和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。在一些实施方案中，低温防护剂是DMSO。低温防护剂溶液可以包含约5％DMSO至约100％DMSO，例如，约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％DMSO。低温防护剂溶液可以包含约10％DMSO。低温防护剂溶液可以包含约20％DMSO。在一些实施方案中，低温防护剂溶液可以包含约40％DMSO或60％DMSO。在一些实施方案中，优选较高百分比的低温防护剂，例如，等效细胞悬浮液值的两倍的百分比有助于驱动渗透性渗入。
低温防护剂溶液可以具有作为基础的水或盐水。在一些实施方案中，盐水对于人组织是等渗的。在实施方案中，盐水是0.9％盐水溶液。可以使用任何商业上可获得的盐水溶液：氯化钠溶液、PBS、HEPES、林格液或乳酸盐。盐水可以是0.9％氯化钠。
低温防护剂溶液还可以包含蛋白质。作为实例，所述蛋白质可以是人白蛋白(例如，HSA)或人血小板裂解物的成分。商业上可获得的人血小板裂解物产品的实例是StemulateTM(来自Regentec)。
在一些实施方案中，低温防护剂溶液包含约10％蛋白质，例如，10％人血小板裂解物或10％白蛋白。
在一个实例中，低温防护剂溶液包含约20％DMSO和约10％人血小板裂解物在0.9％NaCl中。
在另一实例中，低温防护剂溶液包含约40％DMSO和约10％人血小板裂解物在0.9％NaCl中。
在又一实例中，低温防护剂溶液包含约60％DMSO和约10％人血小板裂解物在0.9％NaCl中。
在另一实例中，低温防护剂溶液包含约80％DMSO和约10％人血小板裂解物在0.9％NaCl中。
在另一实例中，低温防护剂溶液包含约100％DMSO在0.9％NaCl中。
在任何上述方面中，所述方法可以包括以下步骤：通过导入压缩气体(例如，氮气、氙气、CO2、氩气、H2S或氦气)、通过升华而释放的气体(例如，凭借干冰的CO2)或者通过蒸发而提供的气体(例如，凭借液氮的氮气)，使包含低温防护剂的封闭容器中的压力增加至高于760mmHg，从而气体渗入尸体骨中。在实施方案中，所述气体是CO2，例如，压缩CO2。在一些实施方案中，所述气体是氮气，例如，压缩氮气。当所述气体是压缩的时，相比于通过升华而获得的气体，气体渗入椎体中所需的时间较少。
或者，在任何上述方面中，并非将尸体骨置于包含低温防护剂溶液的封闭容器中，而是将尸体骨置于缺少低温防护剂溶液的封闭容器中。在这些可替代的方面中，所述方法包括以下步骤：通过导入压缩气体(例如，氮气、氙气、CO2、氩气、H2S或氦气)、通过升华而释放的气体(例如，凭借干冰的CO2)或者通过蒸发而提供的气体(例如，凭借液氮的氮气)，使(缺少低温防护剂溶液的)封闭容器中的压力增加至高于760mmHg，从而气体渗入尸体骨中。本文公开的任何方法可以被适应性修改成包括以下初始步骤：将尸体骨置于缺少低温防护剂溶液的封闭容器中，以及通过导入压缩气体、通过升华而释放的气体或者通过蒸发而提供的气体，使封闭容器中的压力增加至高于760mmHg；在随后步骤中，将低温防护剂溶液添加至封闭容器。在实施方案中，所述气体是CO2，例如，压缩CO2。在一些实施方案中，所述气体是氮气，例如，压缩氮气。
在不希望受理论约束的情况下，通过导入压缩气体(例如，氮气、氙气、CO2、氩气、H2S或氦气)、通过升华而释放的气体(例如，凭借干冰的CO2)或者通过蒸发而提供的气体(例如，凭借液氮的氮气)使封闭容器中的压力增加，促进低温防护剂溶液渗入尸体骨中。
在一些情况中，封闭容器包含固体材料，例如，金属、塑料或其他聚合物。在一些情况中，封闭容器包含泡沫材料，例如，Styro泡沫。
在可替代的方面中，在不使用真空的情况下低温防护剂渗入尸体骨中。在此，在足以允许低温防护剂溶液渗入尸体骨中的时间段期间和条件下将完整椎体、已被二等分、切成四等份或者更多地分割的椎体浸没在低温防护剂溶液。
骨或骨碎片被置于(例如，浸没在)低温防护剂溶液中，并且在约4℃下孵育1小时。在一些实施方案中，孵育期为约1小时至约3小时。在一些实施方案中，孵育期为约1小时至约1.5小时、约1小时至约2小时、约1小时至约2.5小时、约1小时至约3小时、约1.5小时至约2小时、约1.5小时至约2.5小时、约1.5小时至约3小时、约2小时至约2.5小时、约2小时至约3小时，或者约2.5小时至约3小时。在一些实施方案中，孵育期为约1小时、约1.5小时、约2小时、约2.5小时或者约3小时。在一些实施方案中，孵育期是至少约1小时、约1.5小时、约2小时或约2.5小时。在一些实施方案中，孵育期是至多约1.5小时、约2小时、约2.5小时或约3小时。
任何合适的低温防护剂可以用于低温防护剂溶液中。低温防护剂的实例包括二甲基亚砜(也称为DMSO、C2H6OS和ME2SO)；1,2丙烷二醇(也称为丙二醇)；乙二醇；甘油；甲酰胺；乙烷二醇、丁烷2,3二醇；羟乙基淀粉(HES)；葡聚糖；蔗糖；海藻糖；乳糖；棉子糖；核糖醇；甘露醇；和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。在一些实施方案中，低温防护剂是DMSO。低温防护剂溶液可以包含约5％DMSO至约100％DMSO，例如，约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％DMSO。低温防护剂溶液可以包含约20％DMSO。在一些实施方案中，低温防护剂溶液可以包含约40％DMSO或60％DMSO。在一些实施方案中，优选较高百分比的低温防护剂，例如，等效细胞悬浮液值的两倍的百分比有助于驱动渗透性渗入。
低温防护剂溶液可以具有作为基础的水或盐水。在一些实施方案中，盐水对于人组织是等渗的。在实施方案中，盐水是0.9％盐水溶液。可以使用任何商业上可获得的盐水溶液：氯化钠溶液、PBS、HEPES、林格液或乳酸盐。盐水可以是0.9％氯化钠。
低温防护剂溶液还可以包含蛋白质。作为实例，所述蛋白质可以是人白蛋白(例如，HSA)或人血小板裂解物的成分。商业上可获得的人血小板裂解物产品的实例是StemulateTM(来自Regentec)。
在一些实施方案中，低温防护剂溶液包含约10％蛋白质，例如，10％人血小板裂解物或10％白蛋白。
在一个实例中，低温防护剂溶液包含约20％DMSO和约10％人血小板裂解物在0.9％NaCl中。
在另一实例中，低温防护剂溶液包含约40％DMSO和约10％人血小板裂解物在0.9％NaCl中。
在又一实例中，低温防护剂溶液包含约60％DMSO和约10％人血小板裂解物在0.9％NaCl中。
在另一实例中，低温防护剂溶液包含约80％DMSO和约10％人血小板裂解物在0.9％NaCl中。
在另一实例中，低温防护剂溶液包含约100％DMSO在0.9％NaCl中。
对尸体骨的两步骤冷却
一旦低温防护剂渗入尸体骨中(在使用或未使用真空的情况下)，尸体骨随后就经受初始冷却期。为此，将尸体骨置于静态-80冷冻机中，其设定在低于约-60℃，例如，约-70℃至约-80℃，或者低于约-100℃的温度。如此，尸体骨经受初始冷却期。在一些实施方案中，尸体骨初始在静态-80冷冻机中冷却，该冷冻机设定在约-86℃的温度。显示初始冷却期的动态的数据示于PCT/US2021/042064在图6A中。
在一些情况中，静态冷冻机被设定在一系列的温度：约-60℃、约-65℃、约-70℃、约-75℃、约-80℃、约-82℃、约-84℃、约-86℃、约-88℃、约-90℃、约-95℃或约-100℃。在一些情况中，冷冻机可以被设定在一系列的温度：至少约-60℃、约-65℃、约-70℃、约-75℃、约-80℃、约-82℃、约-84℃、约-86℃、约-88℃、约-90℃或约-95℃。在一些情况中，冷冻机可以被设定在一系列的温度：至多约-65℃、约-70℃、约-75℃、约-80℃、约-82℃、约-84℃、约-86℃、约-88℃、约-90℃、约-95℃或约-100℃。
尸体骨可以在约-0.3℃/min至约-5℃/min的速率下初始冷却。在一些实施方案中，尸体骨在约-0.4℃/min至约-0.9℃/min的速率下初始冷却。作为实例，初始冷却速率可以为约-0.3℃/min、-0.4℃/min、-0.5℃/min、-0.6℃/min、-0.7℃/min、-0.8℃/min、-0.9℃/min，至约-1℃/min。在其他实例中，初始冷却速率可以是为-1℃/min、-2℃/min、-3℃/min、-4℃/min或约-5℃/min。在这些速率中，负号(“-”)意指温度下降陈述的量。
初始冷却期的持续时间可以在数小时至过夜变化。该时间应足够使尸体骨达到低于约-50℃的温度，例如，-60℃至-80℃。在一些实施方案中，骨在约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时或约12小时中达到期望的温度。在一些实施方案中，尸体骨在-80冷冻机中进行初始冷却至少12小时或至少过夜。
在不希望受理论约束的情况下，在细胞外冰的存在下，初始冷却期使细胞内溶质浓度增加至允许在后续冷却中细胞内玻璃化的量。
尸体骨可以暂时地获得约-5℃至约-15℃的温度，但是这发生在尸体骨的温度连续地下降趋向期望的温度，例如，低于约-50℃的温度。即使在初始冷却期期间，尸体骨未被保持在温度设定为约-5℃至约-15℃的静态冷冻机中约1至约30分钟的时期，尸体骨也会达到约-5℃至约-15℃的温度(随着骨继续冷却至期望的温度。
一旦尸体骨已经达到期望的温度，尸体骨就经受后续冷却期。为此，将尸体骨置于液氮或液氮蒸气中，例如，在约-200℃的温度。显示后续冷却期的动态的数据示于PCT/US2021/042064在图6B中。在一些实施方案中，后续冷却期可以发生在合适的静态冷冻机中，该静态冷冻机能够维持与液氮等同的温度而不使用液氮，例如，低温冷冻机。
在后续冷却期期间，尸体骨在约-2℃/min至约-6℃/min的速率下被冷却。在一些实施方案中，尸体骨在约-2℃/min、-2.2℃/min、-2.4℃/min、-2.6℃/min、-2.8℃/min、-3℃/min、-3.2℃/min、-3.4℃/min、-3.6℃/min、-3.8℃/min、-4℃/min、-4.2℃/min、-4.4℃/min、-4.6℃/min、-4.8℃/min、-5℃/min、-5.2℃/min、-5.4℃/min、-5.6℃/min、-5.8℃/min或约-6℃/min的速率下被初始冷却。在这些速率中，负号(“-”)意指温度下降陈述的量。
低温保藏的尸体骨可以无限期地保存在液氮、液氮蒸气或合适的静态冷冻机中。作为实例，低温保藏的尸体骨可以被保存至少一天、至少一周、至少一个月、至少一年、至少五年或至少20年。低温保藏的尸体骨可以保存在液氮、液氮蒸气或合适的静态冷冻机中数百年或数千年。
在不希望受理论约束的情况下，如本文公开的对尸体骨的两步骤冷却方法，相对于不使用两步骤冷却法的方法，改进提取的骨髓细胞(造血干细胞(HSC；CD34+细胞)和/或间充质基质/干细胞(MSC))的存活率。因此，相对于标准方法，通过使用本公开内容的方法，获得更大量的存活的细胞(HSC和/或MSC)。
在一些情况中，与不使用本文公开的两步骤冷却法的方法相比，本公开内容的方法提供多约1％的存活的细胞到多约100％更的存活的细胞，例如，多约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％的存活的细胞。
在一些情况中，与不使用本文公开的两步骤冷却法的方法相比，本公开内容的方法提供多约101％的存活的细胞到多约200％的存活的细胞，例如，多约101％、102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％、10％、111％、112％、113％、114％、115％、116％、117％、118％、119％、120％、121％、122％、123％、124％、125％、126％、127％、128％、129％、130％、131％、132％、133％、134％、135％、136％、137％、138％、139％、140％、141％、142％、143％、144％、145％、146％、147％、148％、149％、150％、151％、152％、153％、154％、155％、156％、157％、158％、159％、160％、161％、162％、163％、164％、165％、166％、167％、168％、169％、170％、171％、172％、173％、174％、175％、176％、177％、178％、179％、180％、181％、182％、183％、184％、185％、186％、187％、188％、189％、190％、191％、192％、193％、194％、195％、196％、197％、198％、199％或约200％的存活的细胞。
在一些情况中，与不使用本文公开的两步骤冷却法的方法相比，本公开内容的方法提供约2倍的存活的细胞至约10倍的存活的细胞，例如，约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、约10倍或介于其间的任何倍的存活的细胞。作为实例，与不使用本文公开的两步骤冷却法的方法相比，本公开内容的方法提供2倍至3倍、3倍至4倍、4倍至5倍、5倍至6倍、6倍至7倍、7倍至8倍、8倍至9倍或9倍至10倍的存活的细胞。
在一些情况中，与不使用本文公开的两步骤冷却法的方法相比，本公开内容的方法提供约10倍的存活的细胞至约100倍的存活的细胞，例如，约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、约100倍或介于其间的任何倍的存活的细胞。作为实例，与不使用本文公开的两步骤冷却法的方法相比，本公开内容的方法提供10倍至20倍、20倍至30倍、30倍至40倍、40倍至50倍、50倍至60倍、60倍至70倍、70倍至80倍、80倍至90倍或者90倍至100倍的存活的细胞。
在一些情况中，与不使用本文公开的两步骤冷却法的方法相比，本公开内容的方法提供约100倍的存活的细胞至约1000倍的存活的细胞，例如，约100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、约1000倍或介于其间的任何倍的存活的细胞。作为实例，与不使用本文公开的两步骤冷却法的方法相比，本公开内容的方法提供100倍至200倍、200倍至300倍、300倍至400倍、400倍至500倍、500倍至600倍、600倍至700倍、700倍至800倍、800倍至900倍或900倍至1000倍的存活的细胞。
在一些情况中，与不使用本文公开的两步骤冷却法的方法相比，本公开内容的方法提供约1000倍的存活的细胞至约10000倍的存活的细胞，例如，约1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、约10000倍或介于其间任何倍的存活的细胞。作为实例，与不使用本文公开的两步骤冷却法的方法相比，本公开内容的方法提供1000倍至200倍、2000倍至3000倍、3000倍至4000倍、4000倍至5000倍、5000倍至6000倍、6000倍至7000倍、7000倍至8000倍、8000倍至9000倍或者9000倍至10000倍的存活的细胞。
用于快速温热低温保藏的尸体骨的方法
在一些情况中，本公开内容提供了一种用于快速温热尸体骨以提供骨髓或其衍生物的方法。PCT/US2021/042064公开了用于快速温热低温保藏的骨的方法；其内容通过引用而以其整体并入。这些公开的方法可以用于本公开内容的方法中。
在一些情况中，用于快速温热尸体骨的方法包括以下步骤：获得低温保藏的尸体骨；分割低温保藏的尸体骨以获得低温保藏的骨的碎片；将低温保藏的骨的碎片转移至具有约35℃至约45℃的温度的研磨介质中持续足够的时间以使尸体骨碎片变暖至约20℃的表面温度。
在一些实施方案中，低温保藏的尸体骨在尚未被分割成碎片的情况下转移至研磨介质(如本文公开的)中。优选地，低温保藏的尸体骨当转移至研磨介质中时具有至少低于0℃的温度。
在替代实施方案中，所述方法包括分割低温保藏的尸体骨以获得低温保藏的骨的碎片。优选地，低温保藏的尸体骨当分割成碎片时具有低于0℃的温度。
为了简化该过程并且为了增加对加工人员的安全性，如US 2019/0343112(其通过引用而以其整体并入本文中)中所述的定制骨切割工具用来将低温保藏的尸体骨分割成较小块。另一种骨切割工具可以与如US 2019/0343112中所述的定制骨切割工具组合或代替后者使用。
骨切割工具的元件由医用级不锈钢形成。该钢优选地是能够承受切穿冷冻骨所需的力的硬化钢。在洁净过程中，对工具进行蒸汽灭菌，由此可能有害于钢。因此，在本公开内容的一个特征中，不锈钢元件的表面钝化以防止在灭菌期间该钢元件的氧化。
当施加小于50lbf时，用于分割低温保藏的尸体骨的手动骨切割装置能够产生高达1000lbf。这种手动骨切割装置包括：力传动机构，其中所述力传动机构包含与齿轮机构枢转联接的细长力传导构件；以及与细长力传导构件的端部联接的手动可操作式柄，其中该端部与齿轮机构相对。手动骨切割装置包括上切割元件和/或下切割元件。它的上切割元件和/或下切割元件各自包括一个或多个切割刀片，其从所述上切割元件和/或下切割元件的中央部分向外伸展。当一个或多个切割刀片将低温保藏的尸体骨分割成大致扇形的碎片。
手动骨切割装置将低温保藏的尸体骨分割成低温保藏的骨的碎片。低温保藏的骨的碎片转移至具有约35℃至45℃的温度的研磨介质中持续足够的时间以使尸体骨碎片变暖至约20℃的表面温度。或者，尚未被分割的整体低温保藏的骨转移至具有约35℃至45℃的温度的研磨介质中持续足够的时间以使尸体骨碎片变暖至约20℃的表面温度。在一些实施方案中，尸体骨碎片的表面温度高于20℃，例如，25℃或更高。
使合适体积的研磨介质变暖并且保持在约35℃至约45℃的温度，例如，通过将容纳研磨介质的容器置于加热板上或水浴中。在一些实例中，300ml、500ml或1升的研磨介质用于使尸体骨变暖。优选地，当低温保藏的骨的碎片被转移至研磨介质时，研磨介质具有约37℃至约40℃的温度。
使尸体骨碎片在约100℃/min至约500℃/min的速率下变暖至约20℃的表面温度。在一些实施方案中，变暖速率大于约300℃/min，例如，约300℃/min、310℃/min、320℃/min、330℃/min、340℃/min、350℃/min、360℃/min、370℃/min、380℃/min、390℃/min、400℃/min、410℃/min、420℃/min、430℃/min、440℃/min、450℃/min、460℃/min、470℃/min、480℃/min、490℃/min和约500℃/min。在一些实施方案中，变暖速率为约400℃/min至约500℃/min。在一些情形中，使尸体骨碎片在小于1分钟中变暖至约20℃的表面温度。在一些情况中，在约1分钟或更多，例如，约1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟或约10分钟，使尸体骨碎片变暖至约20℃的表面温度。显示快速温热的动态的数据示于PCT/US21/42064的图15中。
当整体尸体骨在研磨介质中变暖时，变暖速率与在骨碎片变暖时相比将更慢。作为实例，尸体骨在约100℃/min至约250℃/min的速率下变暖至约20℃的表面温度。
在不希望受理论约束的情况下，本公开的方法的快速温热速率防止在骨碎片(或整体尸体骨)的解冻期间冰重结晶。
在不希望受理论约束的情况下，相对于不使用所述快速温热法的方法，本文公开的快速温热尸体骨的方法改进提取的骨髓细胞(造血干细胞(HSC；CD34+细胞)和/或间充质基质/干细胞(MSC))的存活率。因此，相对于标准方法，通过使用本公开内容的方法，获得更大量的存活的细胞(HSC和/或MSC)。
在一些情况中，与不使用本文公开的快速温热法的方法相比，本公开内容的方法提供多约1％的存活的细胞到多约100％的存活的细胞，例如，多约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％的存活的细胞。
在一些情况中，与不使用本文公开的快速温热法的方法相比，本公开内容的方法提供多约101％的存活的细胞到多约200％的存活的细胞，例如，多约101％、102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％、10％、111％、112％、113％、114％、115％、116％、117％、118％、119％、120％、121％、122％、123％、124％、125％、126％、127％、128％、129％、130％、131％、132％、133％、134％、135％、136％、137％、138％、139％、140％、141％、142％、143％、144％、145％、146％、147％、148％、149％、150％、151％、152％、153％、154％、155％、156％、157％、158％、159％、160％、161％、162％、163％、164％、165％、166％、167％、168％、169％、170％、171％、172％、173％、174％、175％、176％、177％、178％、179％、180％、181％、182％、183％、184％、185％、186％、187％、188％、189％、190％、191％、192％、193％、194％、195％、196％、197％、198％、199％或约200％的存活的细胞。
在一些情况中，与不使用本文公开的快速温热法的方法相比，本公开内容的方法提供约2倍的存活的细胞至约10倍的存活的细胞，例如，约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、约10倍或介于其间任何倍的存活的细胞。作为实例，与不使用本文公开的快速温热法的方法相比，本公开内容的方法提供2倍至3倍、3倍至4倍、4倍至5倍、5倍至6倍、6倍至7倍、7倍至8倍、8倍至9倍或者9倍至10倍的存活的细胞。
在一些情况中，与不使用本文公开的快速温热法的方法相比，本公开内容的方法提供约10倍的存活的细胞至约100倍的存活的细胞，例如，约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、约100倍或介于其间任何倍的存活的细胞。作为实例，与不使用本文公开的快速温热法的方法相比，本公开内容的方法提供10倍至20倍、20倍至30倍、30倍至40倍、40倍至50倍、50倍至60倍、60倍至70倍、70倍至80倍、80倍至90倍或者90倍至100倍的存活的细胞。
在一些情况中，与不使用本文公开的快速温热法的方法相比，本公开内容的方法提供约100倍的存活的细胞至约1000倍的存活的细胞，例如，约100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、约1000倍或介于其间任何倍的存活的细胞。作为实例，与不使用本文公开的快速温热法的方法相比，本公开内容的方法提供100倍至200倍、200倍至300倍、300倍至400倍、400倍至500倍、500倍至600倍、600倍至700倍、700倍至800倍、800倍至900倍或900倍至1000倍的存活的细胞。
在一些情况中，与不使用本文公开的快速温热法的方法相比，本公开内容的方法提供约1000倍的存活的细胞至约10000倍的存活的细胞，例如，约1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、约10000倍或介于其间任何倍的存活的细胞。作为实例，与不使用本文公开的快速温热法的方法相比，本公开内容的方法提供1000倍至200倍、2000倍至3000倍、3000倍至4000倍、4000倍至5000倍、5000倍至6000倍、6000倍至7000倍、7000倍至8000倍、8000倍至9000倍或9000倍至10000倍的存活的细胞。
提取骨髓
将骨从袋和PLASMA-LYTETM取出，并且使用无菌纱布或海绵吸收VB上残留的任何液体。在一种方法中，使用锯子和/或砧剪将VB切割成较小块，例如1.5cm2块，其足够小以便用骨研磨机碎裂。为了简化该过程并且为了增加对加工人员的安全性，提供了如US 2019/0343112(其通过引用而以其整体并入本文中)中所述的定制骨切割工具来将VB切割成较小块。另一种定制骨切割工具可以与如US 2019/0343112中所述的定制骨切割工具组合使用或代替后者。其他骨切割工具描述在US 2020/0325451中，其通过引用而以其整体并入本文中。
在一些实施方案中，骨是从尸体新鲜获得的。或者，骨先前已被冷冻和/或低温保藏。
骨切割工具的元件由医用级不锈钢形成。该钢优选地是能够承受切穿骨所需的力的硬化钢。在洁净过程中，对工具进行蒸汽灭菌，由此可能有害于钢。因此，在本公开内容的一个特征中，不锈钢元件的表面钝化以防止在灭菌期间该钢元件的氧化。
将由骨切割工具产生的块立即置于无菌罐中并且浸没在300-500ml的研磨介质中。在本系统和方法的一个方面中，研磨介质使用PLASMA-LYTETM-A作为基础成分与肝素、人血清白蛋白(HSA)和核酸酶(Merck KGAA Corporation)一起使用。肝素用作抗凝剂。还可以以各种量使用其他抗凝剂。HSA提供蛋白质来源以防止细胞粘附和吸附至表面以及反应性氧清除。注意到，常规研磨介质使用DNA酶，但是对于本公开内容，或试剂替代DNA酶TM试剂(Qiagen Sciences LLC)。然而DNA酶仅对DNA有效，现代制药生物技术加工依赖于可以切割所有形式的DNA和RNA的酶，并且可以降低细胞悬浮于其中的溶液的粘度。注意到，IMDM(Iscove改良的Dulbecco培养基)可以替代PLASMA-LYTETM-A，是因为IMDM适合用于快速增殖高密度细胞培养物并且理想地用于支持T淋巴细胞和B淋巴细胞。还注意到，Denarase试剂(C-Lecta GmbH)与本过程中相同量的Benzonase试剂等效。
在一些实施方案中，在研磨介质中肝素的量为约5U/ml至约15U/ml。在一些实施方案中，在研磨介质中肝素的量为约5U/ml、约6U/ml、约7U/ml、约8U/ml、约9U/ml、约10U/ml、约11U/ml、约12U/ml、约13U/ml、约14U/ml或约15U/ml。在一些实施方案中，在研磨介质中肝素的量为约5U/ml至约6U/ml、约5U/ml至约7U/ml、约5U/ml至约8U/ml、约5U/ml至约9U/ml、约5U/ml至约10U/ml、约5U/ml至约11U/ml、约5U/ml至约12U/ml、约5U/ml至约13U/ml、约5U/ml至约14U/ml、约5U/ml至约15U/ml、约6U/ml至约7U/ml、约6U/ml至约8U/ml、约6U/ml至约9U/ml、约6U/ml至约10U/ml、约6U/ml至约11U/ml、约6U/ml至约12U/ml、约6U/ml至约13U/ml、约6U/ml至约14U/ml、约6U/ml至约15U/ml、约7U/ml至约8U/ml、约7U/ml至约9U/ml、约7U/ml至约10U/ml、约7U/ml至约11U/ml、约7U/ml至约12U/ml、约7U/ml至约13U/ml、约7U/ml至约14U/ml、约7U/ml至约15U/ml、约8U/ml至约9U/ml、约8U/ml至约10U/ml、约8U/ml至约11U/ml、约8U/ml至约12U/ml、约8U/ml至约13U/ml、约8U/ml至约14U/ml、约8U/ml至约15U/ml、约9U/ml至约10U/ml、约9U/ml至约11U/ml、约9U/ml至约12U/ml、约9U/ml至约13U/ml、约9U/ml至约14U/ml、约9U/ml至约15U/ml、约10U/ml至约11U/ml、约10U/ml至约12U/ml、约10U/ml至约13U/ml、约10U/ml至约14U/ml、约10U/ml至约15U/ml、约11U/ml至约12U/ml、约11U/ml至约13U/ml、约11U/ml至约14U/ml、约11U/ml至约15U/ml、约12U/ml至约13U/ml、约12U/ml至约14U/ml、约12U/ml至约15U/ml、约13U/ml至约14U/ml、约13U/ml至约15U/ml，或者约14U/ml至约15U/ml。在一些实施方案中，在研磨介质中肝素的量为至少约5U/ml、约6U/ml、约7U/ml、约8U/ml、约9U/ml、约10U/ml、约11U/ml、约12U/ml、约13U/ml或约14U/ml。在一些实施方案中，在研磨介质中肝素的量为至多约6U/ml、约7U/ml、约8U/ml、约9U/ml、约10U/ml、约11U/ml、约12U/ml、约13U/ml、约14U/ml或约15U/ml。
在多种实施方案中，肝素从研磨介质中被略去。
在一些实施方案中，在研磨介质中的量为约1U/ml至约10U/ml。在一些实施方案中，在研磨介质中Benzonase的量为约1U/ml、约2U/ml、约3U/ml、约4U/ml、约5U/ml、约6U/ml、约7U/ml、约8U/ml、约9U/ml或约10U/ml。在一些实施方案中，在研磨介质中Benzonase的量为约1U/ml至约2U/ml、约1U/ml至约3U/ml、约1U/ml至约4U/ml、约1U/ml至约5U/ml、约1U/ml至约6U/ml、约1U/ml至约7U/ml、约1U/ml至约8U/ml、约1U/ml至约9U/ml、约1U/ml至约10U/ml、约2U/ml至约3U/ml、约2U/ml至约4U/ml、约2U/ml至约5U/ml、约2U/ml至约6U/ml、约2U/ml至约7U/ml、约2U/ml至约8U/ml、约2U/ml至约9U/ml、约2U/ml至约10U/ml、约3U/ml至约4U/ml、约3U/ml至约5U/ml、约3U/ml至约6U/ml、约3U/ml至约7U/ml、约3U/ml至约8U/ml、约3U/ml至约9U/ml、约3U/ml至约10U/ml、约4U/ml至约5U/ml、约4U/ml至约6U/ml、约4U/ml至约7U/ml、约4U/ml至约8U/ml、约4U/ml至约9U/ml、约4U/ml至约10U/ml、约5U/ml至约6U/ml、约5U/ml至约7U/ml、约5U/ml至约8U/ml、约5U/ml至约9U/ml、约5U/ml至约10U/ml、约6U/ml至约7U/ml、约6U/ml至约8U/ml、约6U/ml至约9U/ml、约6U/ml至约10U/ml、约7U/ml至约8U/ml、约7U/ml至约9U/ml、约7U/ml至约10U/ml、约8U/ml至约9U/ml、约8U/ml至约10U/ml，或者约9U/ml至约10U/ml。在一些实施方案中，在研磨介质中Benzonase的量为至少约1U/ml、约2U/ml、约3U/ml、约4U/ml、约5U/ml、约6U/ml、约7U/ml、约8U/ml或约9U/ml。在一些实施方案中，在研磨介质中Benzonase的量为至多约2U/ml、约3U/ml、约4U/ml、约5U/ml、约6U/ml、约7U/ml、约8U/ml、约9U/ml或约10U/ml。
在一些情况中，在研磨介质中的量为约3U/ml并且在研磨介质中肝素的量为约10U/ml。
在一些实施方案中，在研磨介质中或/>的量为约11U/ml至约55U/ml。在一些实施方案中，在研磨介质中Benzonase的量为约11U/ml、约15U/ml、约20U/ml、约25U/ml、约30U/ml、约35U/ml、约40U/ml、约45U/ml、约50U/ml或约55U/ml。在一些实施方案中，在研磨介质中Benzonase的量为至少约11U/ml、约15U/ml、约20U/ml、约25U/ml、约30U/ml、约35U/ml、约40U/ml、约45U/ml或约50U/ml。在一些实施方案中，在研磨介质中Benzonase的量为约11U/ml至约15U/ml、约11U/ml至约20U/ml、约11U/ml至约25U/ml、约11U/ml至约30U/ml、约11U/ml至约35U/ml、约11U/ml至约40U/ml、约11U/ml至约45U/ml、约11U/ml至约50U/ml、约11U/ml至约55U/ml、约15U/ml至约20U/ml、约15U/ml至约25U/ml、约15U/ml至约30U/ml、约15U/ml至约35U/ml、约15U/ml至约40U/ml、约15U/ml至约45U/ml、约15U/ml至约50U/ml、约15U/ml至约55U/ml、约20U/ml至约25U/ml、约20U/ml至约30U/ml、约20U/ml至约35U/ml、约20U/ml至约40U/ml、约20U/ml至约45U/ml、约20U/ml至约50U/ml、约20U/ml至约55U/ml、约25U/ml至约30U/ml、约25U/ml至约35U/ml、约25U/ml至约40U/ml、约25U/ml至约45U/ml、约25U/ml至约50U/ml、约25U/ml至约55U/ml、约30U/ml至约35U/ml、约30U/ml至约40U/ml、约30U/ml至约45U/ml、约30U/ml至约50U/ml、约30U/ml至约55U/ml、约35U/ml至约40U/ml、约35U/ml至约45U/ml、约35U/ml至约50U/ml、约35U/ml至约55U/ml、约40U/ml至约45U/ml、约40U/ml至约50U/ml、约40U/ml至约55U/ml、约45U/ml至约50U/ml、约45U/ml至约55U/ml，或者约50U/ml至约55U/ml。在一些实施方案中，在研磨介质中Benzonase的量为至多约15U/ml、约20U/ml、约25U/ml、约30U/ml、约35U/ml、约40U/ml、约45U/ml、约50U/ml或约55U/ml。
注意到，试剂(C-Lecta GmbH)与本过程中相同量的/>试剂等效。
显著地，已发现在研磨介质中的量与肝素的量之间存在着关系，以至随着肝素的量减少，可以使用逐步更低量的Benzonase。在不希望受理论约束的情况下，肝素可能通过与钙螯合而有助于防止细胞聚集；然而，更重要地，肝素与镁螯合。镁对于Benzonase是重要的辅助因子。因此，在肝素的存在下，溶液中镁的存在和/或相对量减少，并且镁量的此减少降低Benzonase活性。因此，在一些实施方案中，肝素的量降低，而在一些实施方案中，肝素被省略。
在一些实施方案中，HSA以约0.5％至约5％存在于研磨介质中。在一些实施方案中，HSA以约0.5％至约1％、约0.5％至约1.5％、约0.5％至约2％、约0.5％至约2.5％、约0.5％至约3％、约0.5％至约3.5％、约0.5％至约4％、约0.5％至约4.5％、约0.5％至约5％、约1％至约1.5％、约1％至约2％、约1％至约2.5％、约1％至约3％、约1％至约3.5％、约1％至约4％、约1％至约4.5％、约1％至约5％、约1.5％至约2％、约1.5％至约2.5％、约1.5％至约3％、约1.5％至约3.5％、约1.5％至约4％、约1.5％至约4.5％、约1.5％至约5％、约2％至约2.5％、约2％至约3％、约2％至约3.5％、约2％至约4％、约2％至约4.5％、约2％至约5％、约2.5％至约3％、约2.5％至约3.5％、约2.5％至约4％、约2.5％至约4.5％、约2.5％至约5％、约3％至约3.5％、约3％至约4％、约3％至约4.5％、约3％至约5％、约3.5％至约4％、约3.5％至约4.5％、约3.5％至约5％、约4％至约4.5％、约4％至约5％、或约4.5％至约5％存在于研磨介质中。在一些实施方案中，HSA以约0.5％、约1％、约1.5％、约2％、约2.5％、约3％、约3.5％、约4％、约4.5％或约5％存在于研磨介质中。在一些实施方案中，HSA以至少约0.5％、约1％、约1.5％、约2％、约2.5％、约3％、约3.5％、约4％或约4.5％存在于研磨介质中。在一些实施方案中，HSA以至多约1％、约1.5％、约2％、约2.5％、约3％、约3.5％、约4％、约4.5％或约5％存在于研磨介质中。
在研磨之后保留另一罐300-500ml的研磨介质以收集骨碎片，并且保留另外供给约100ml的研磨介质以供在研磨过程期间冲洗研磨机以防止骨碎片粘附于研磨部件的罐表面。在一些实施方案中，与初始研磨介质相比，附加的研磨介质可能具有不同量的肝素、HSA和Benzonase。
可以在ISO-7洁净室内在ISO-5环境中使用电动骨研磨机或专门设置的骨研磨机，例如Biorep Technologies Inc,(Miami,FL)的研磨机。如果加工来自相同供体的VB和髂骨，则使骨类型保持分开。在研磨过程期间和之后的所有时间，使骨保持浸没在研磨介质中。一旦供体骨块全部被研磨，就用新鲜的加工介质彻底地冲洗骨研磨机的腔室。将骨碎片从研磨机中排放至包含研磨介质的罐中。
在一些情况中，骨髓和骨研磨屑在150RPM下震摇10分钟。
将罐的内容物转移至无菌袋。接着，将无菌袋的内容物过滤以提取固体组分。在一个实施方案中，使每袋的内容物通过一系列不锈钢筛。在此实施方案中，将425μm或500μm筛叠置于177μm或200μm筛上，此筛坐落在捕集盘上方以接收液体过滤内容物。将包含来自研磨机的输出物的无菌袋旋转，然后均匀地倾倒在筛堆栈或过滤器组上。观察过滤过程以确保不发生过量的聚集，其可以显示软组织或其他污染物的存在。在筛表面上保留的骨碎片均匀地分布在筛上，并且用250ml新鲜的加工介质进行冲洗。在一个实施方案中，用于冲洗的加工介质是上述研磨介质或含有2.5％HSA的PLASMA-LYTETM。将筛过的骨髓产品(在良好执行的过程中可能为大约1000ml)转移至无菌包装中以供后续加工和分析。对每袋的内容物进行目视检查以证实该内容物不包含任何可见的骨碎片或软组织。
在一些实施方案中，如关于研磨介质所述，冲洗介质可以包含各种量的HSA。在一些实施方案中，冲洗介质还可以包含肝素和/或Benzonase。
在一些情况中，在冲洗介质中的量为约3U/ml并且在冲洗介质中肝素的量为约10U/ml。
在另一实施方案中，使每袋的内容物通过骨髓过滤单元，如图1中所示。在此实施方案中，系统150包括支架154，该支架配置成支撑无菌收集袋152，其容纳来自上述研磨操作的骨碎片和介质。支架包括容器悬架155，该悬架配置成接合无菌袋的盖153以悬挂容器。袋的底部包括排放组装件160，其包括伸出至收集袋主体中的前置过滤器162。在一个具体实施方案中，前置过滤器162是850μm过滤器。在一些实施方案中，骨髓首先通过800μm前置过滤器。过滤器162连接至输出管164，该输出管通过容器要求(claim)166而与第一在线过滤器170的输入管线171连接。在该具体实施方案中，第一在线过滤器是200μm或500μm过滤器。第一在线过滤器的输出管线172与第二在线过滤器175的输入管线176连接。第二在线过滤器是200μm或500μm过滤器。这两个在线过滤器初始都是500μm以便首次通过过滤器系统150。然后，对研磨屑进行第二冲洗，这两个在线过滤器是200μm。此双通过滤导致更洁净的悬浮液，并且增强从该悬浮液中去除脂肪。第二在线过滤器175具有输出管线177，其可以接合至无菌袋例如袋152以进行第二次过滤通过。在第二次通过系统时，第二在线过滤器175的输出管线177可以与转移包装容器180的容器夹具181接合。转移包装容器可以是600-2000ml袋以容置经过滤的骨髓产品，其在良好执行的过程中可以是大约1000ml。
来自经过滤的骨髓产品的总成核计数(TNC)可以如下进行计算：TNC(×103个细胞/μL)＝细胞计数(×103个细胞/μL)×骨髓提取物的总质量(g)×1000)
搅动骨研磨屑和/或骨研磨滤液
在一些实施方案中，本文描述了一种用于加工骨髓或其衍生物的方法，所述方法包括在加工骨髓的研磨和过滤部分期间机械地搅动骨研磨屑和/或骨研磨滤液。在一些情形中，骨髓可以从死亡供体获得。在一些情况中，骨髓可以从先前已冷却的样品(例如骨或VB)中获得。在一些情况中，骨髓可以从先前已冷却但未冷冻的样品(例如骨或VB)中获得。在一些情况中，骨髓可以从解冻的样品(例如骨或VB)中获得。在一些情况中，骨髓可以被加工以获得骨髓细胞。在一些实施方案中，骨髓细胞可以是造血干细胞(HSC)。在一些实施方案中，骨髓细胞可以是间充质干细胞(MSC)。
本公开内容公开的方面包括一种用于加工骨髓或其衍生物的方法，其中所述骨髓或其衍生物源自于死亡供体，所述方法包括：从死亡供体中获得骨或骨碎片，任选地将所述骨加工成骨碎片；在研磨溶液存在下机械地研磨骨或骨碎片以产生多个骨研磨屑；将多个骨研磨屑置于约100至约200转/分钟(“RPM”)的摇床上约1至约20分钟；以及从该摇床取下该溶液，其中该溶液包含骨髓或其衍生物，并且其中骨髓或其衍生物包含至少约1,500,000个CD34+细胞/ml骨髓或其衍生物。在一些实施方案中，所述方法还包括使所述溶液与冲洗介质接触，以及重复将骨研磨屑置于摇床上和随后从该摇床取下该溶液。在一些实施方案中，所述方法还包括一次或多次重复将骨研磨屑置于摇床上和随后从该摇床取下该溶液的步骤。在一些实施方案中，至少约1,500,000个CD34+细胞/ml骨髓或其衍生物包含至少85％存活的CD34+细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括至少约1,500,000个CD34+细胞/ml骨髓或其衍生物，其包含至少90％存活的CD34+细胞。
机械搅动可以包括以线型方式搅动骨研磨屑。在一些实施方案中，机械搅动可以包括以三维方式搅动骨研磨屑。在一些情况中，机械搅动骨研磨屑可以包括(通过轨道式摇床)轨道式震摇，例如将骨研磨屑置于摇床上。在一些情况中，骨研磨屑可以通过摇床在至少约10转/分钟(RPM)、20RPM、30RPM、40RPM、50RPM、60RPM、70RPM、80RPM、90RPM、100RPM、110RPM、120RPM、130RPM、140RPM、150RPM、160RPM、170RPM、180RPM、190RPM、200RPM、210RPM、220RPM、230RPM、240RPM、250RPM或更大的速率下进行机械地搅动。在一些情况中，骨研磨屑可以通过离心(例如旋转)进行机械地搅动。在一些实施方案中，骨研磨屑可以以至少10RPM、20RPM、30RPM、40RPM、50RPM、60RPM、70RPM、80RPM、90RPM、100RPM、110RPM、120RPM、130RPM、140RPM、150RPM、160RPM、170RPM、180RPM、190RPM、200RPM、210RPM、220RPM、230RPM、240RPM、250RPM或更大进行旋转。在一些实施方案中，骨研磨屑可以以至少300RPM、400RPM、500RPM、600RPM或更大进行旋转。在一些实施方案中，骨研磨屑可以通过震摇和旋转二者进行机械地搅动。在一些实施方案中，对骨研磨屑的机械搅动可以持续至少1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟或更长。
在一些实施方案中，对骨研磨屑的机械搅动增加获得的骨髓细胞的产量。在一些情形中，与在没有机械搅动的情况下获得的骨髓细胞的产量相比，通过对骨研磨屑的机械搅动而获得的骨髓细胞的产量增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或更大。
在一些实施方案中，对骨研磨屑的机械搅动增加获得的骨髓细胞的存活率。在一些情形中，与在没有机械搅动的情况下获得的骨髓细胞的存活率相比，通过对骨研磨屑的机械搅动而获得的骨髓细胞的存活率增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或更大。
在一些实施方案中，对骨研磨屑的机械搅动增加获得的表达CD34的骨髓细胞数。在一些情形中，与在没有机械搅动的情况下获得的表达CD34的骨髓细胞数相比，通过对骨研磨屑的机械搅动而获得的表达CD34的骨髓细胞数增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或更大。
在一些实施方案中，对骨研磨屑的机械搅动增加通过本文所述的方法而获得的表达CD45的骨髓细胞数。在一些情形中，与在没有机械搅动的情况下获得的表达CD45的骨髓细胞数相比，通过对骨研磨屑的机械搅动而获得的表达CD45的骨髓细胞数增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或更大。
上述搅动可以发生在前述过滤步骤之前。
在某些实施方案中，获得的骨髓或其衍生物的CD34+细胞/ml的量为至少约100,000、150,000、200,000、250,000、300,000、350,000、400,000、450,000、500,000、550,000、600,000、650,000、700,000、750,000、800,000、850,000、900,000、950,000、1,000,000、1,050,000、1,100,000、1,150,000、1,200,000、1,250,000、1,300,000、1,350,000、1,400,000、1,450,000、1,500,000、1,550,000、1,600,000、1,650,000、1,700,000、1,750,000、1,800,000、1,850,000、1,900,000、1950,000、2,000,000或大于2,000,000个CD34+细胞/ml。在一些实施方案中，获得的骨髓或其衍生物的CD34+细胞/ml的量为至少约1,500,000个CD34+细胞/ml至约2,000,000个CD34+细胞/ml。在一些实施方案中，获得的骨髓或其衍生物的CD34+细胞/ml的量为至少约1,500,000个CD34+细胞/ml至约1,750,000个CD34+细胞/ml、约1,500,000个CD34+细胞/ml至约2,000,000个CD34+细胞/ml，或者约1,750,000个CD34+细胞/ml至约2,000,000个CD34+细胞/ml。在一些实施方案中，获得的骨髓或其衍生物的CD34+细胞/ml的量为至少约1,500,000个CD34+细胞/ml、约1,750,000个CD34+细胞/ml，或者约2,000,000个CD34+细胞/ml。在一些实施方案中，获得的骨髓或其衍生物的CD34+细胞/ml的量为至少约1,500,000个CD34+细胞/ml，或者约1,750,000个CD34+细胞/ml。在一些实施方案中，获得的骨髓或其衍生物的CD34+细胞/ml的量为至多约1,750,000个CD34+细胞/ml，或者约2,000,000个CD34+细胞/ml。
在一些实施方案中，CD34+细胞的存活率为至少约70％至约95％。在一些实施方案中，CD34+细胞的存活率为至少约70％至约75％、约70％至约80％、约70％至约85％、约70％至约90％、约70％至约95％、约75％至约80％、约75％至约85％、约75％至约90％、约75％至约95％、约80％至约85％、约80％至约90％、约80％至约95％、约85％至约90％、约85％至约95％，或者约90％至约95％。在一些实施方案中，CD34+细胞的存活率为至少约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，CD34+细胞的存活率是至少约70％、约75％、约80％、约85％或约90％。在一些实施方案中，CD34+细胞的存活率为至多约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。
为了质量控制，在注射部位157使用注射器从无菌包装152中提取少量(例如0.3mL)骨髓，并且在抽出样品之前进行翻转混合。样品可以通过血液分析仪例如Sysmex血液分析仪来测试以确定该样品的总成核细胞(TNC)含量，作为经后续加工的骨髓的TNC含量的指示。
脂肪去除和浓缩
从过滤收集的骨髓产品基本上是脂肪乳液。从以上公开的筛过滤法获得的悬浮液的脂肪含量大于从双通过滤系统150获得的悬浮液的脂肪含量。然而，在两种情况中，需要从悬浮液中去除脂肪含量。从过滤获得的悬浮液被回收至250ml袋中，将该袋用接管机不透气地密封。将成对的无菌袋和配衡棒(taring stick)安置在离心机内，袋口朝下，并且进行平衡。体积补偿板用于防止在离心期间袋的折皱。在一个实施方案中，将袋以500xg在室温下离心15分钟以浓缩细胞，优选地至2-3x108个/ml。在完成离心之后，将每袋单独地吊挂在环支架上。袋内的不同层是可见的，脂肪层清楚地描绘在上清液顶部，骨髓沉淀在底部，如图2中所示。将新的无菌袋焊接至从离心机取出的袋。将袋夹具或夹子190安置在袋上，在脂肪层正下方，如图3中所示，以夹紧或挤压袋以在脂肪层下方闭合。然后将沉淀从离心机袋排出到新的无菌袋中，用袋夹子防止脂肪层通过。在排出时搅动沉淀以使所有沉淀重悬。在约一半的沉淀已被排出到新袋中之后，将管道用止血器或管密封器封闭。然后将第二离心机袋焊接至包含沉淀的新袋，并且将此第二离心机袋的内容物排出到新袋中。
结果是新无菌袋包含经离心以去除脂肪的骨髓。然后，将脱脂肪的骨髓的这些袋在室温下以500xg离心15分钟，用体积补偿板来防止袋的折皱。将每袋取出并且悬挂在环支架上，将废物袋焊接至该袋，血浆提取器用于将上清液去除到废物袋中，如图4中所示。当沉淀上升或破碎时，将管道用止血器夹紧。然后，将管道密封和切断以便从废物袋去除包含沉淀的袋，将废物袋弃去。Luer接头被焊接至包含沉淀的袋。通过使用大注射器将来自每袋中的沉淀合并到散装袋中。通过使用冲洗介质将包含沉淀的袋冲洗到散装袋中。将散装袋颠倒数次以确保所有沉淀重悬。少量(例如0.5mL)经加工的BM可以被取出以供测试密度和细胞计数来进行质量控制。还可以评估测试样品的人白细胞抗原、CCR5δ32突变和载脂蛋白(APOE)等。
在一些实施方案中，可以在一个或多个步骤增加离心机设定。在一些实施方案中，离心机在约400g至约650g下旋转。在一些实施方案中，离心机在约400g至约450g、约400g至约500g、约400g至约550g、约400g至约600g、约400g至约650g、约450g至约500g、约450g至约550g、约450g至约600g、约450g至约650g、约500g至约550g、约500g至约600g、约500g至约650g、约550g至约600g、约550g至约650g或者约600g至约650g下旋转。在一些实施方案中，离心机在约400g、约450g、约500g、约550g、约600g或约650g下旋转。在一些实施方案中，离心机在至少约400g、约450g、约500g、约550g或约600g下旋转。在一些实施方案中，离心机在至多约450g、约500g、约550g、约600g或约650g下旋转。在一些实施方案中，离心机旋转约10分钟至约40分钟。在一些实施方案中，离心机旋转约10分钟至约15分钟、约10分钟至约20分钟、约10分钟至约25分钟、约10分钟至约30分钟、约10分钟至约35分钟、约10分钟至约40分钟、约15分钟至约20分钟、约15分钟至约25分钟、约15分钟至约30分钟、约15分钟至约35分钟、约15分钟至约40分钟、约20分钟至约25分钟、约20分钟至约30分钟、约20分钟至约35分钟、约20分钟至约40分钟、约25分钟至约30分钟、约25分钟至约35分钟、约25分钟至约40分钟、约30分钟至约35分钟、约30分钟至约40分钟，或者约35分钟至约40分钟。在一些实施方案中，离心机旋转约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟或约40分钟。在一些实施方案中，离心机旋转至少约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟或约35分钟。在一些实施方案中，离心机旋转至多约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟或约40分钟。在一些情况中，包含提取的骨髓的袋可以通过以600x g(约2315rpm)离心30分钟来浓缩。通过使用血浆提取器，将上清液从骨髓沉淀中除去并且进入废物袋中。通过使用标准生物危害协议，将废物弃去。然后，将沉淀合并到预先称重的散装袋中并且通过使用冲洗介质而重悬。在一些实施方案中，在不使用制动器的情况下使离心机停止。在一些实施方案中，用制动器使离心机停止。在一些实施方案中，离心机制动器被设定在约25％至约100％。在一些实施方案中，离心机制动器被设定在约25％至约50％、约25％至约75％、约25％至约100％、约50％至约75％、约50％至约100％，或者约75％至约100％。在一些实施方案中，离心机制动器被设定在约25％、约50％、约75％或约100％。在一些实施方案中，离心机制动器被设定在至少约25％、约50％或约75％。在一些实施方案中，离心机制动器被设定在至多约50％、约75％或约100％。
在一些情况中，脂肪去除可以使用商业细胞加工装置(例如，2991细胞加工器，TerumoBCT)进行。参见万维网terumobct.com/2991。这种商业细胞加工装置还可以浓缩细胞产品。
细胞产品被等分成一个或多个第二体积，即隔离小瓶。
低温保藏骨髓
本方法提供一种根据上述加工方法提取和储存骨髓以供未来临床使用的系统，如图6的流程图中概述。此方法可以消除现有方法将骨髓供体与难以匹配的组(例如某些少数群体)匹配的失败。一旦骨髓被低温保藏和储存，关于骨髓的来源就不存在不确定性，未来接受者无需等待并且骨髓可大量可重复地获得。
本公开内容的方法还提供用于给定骨髓产品的不同容器，第一(较大)体积包含要向有需要的对象提供的细胞，第二(较小)体积充当第一体积的代用品，第二体积(即代用品)的细胞用于测定法以确定第一体积施用于有需要的对象的适合性。
设想到，基于从供体获得的十个椎骨和/或髂骨，通过上述过程，每个骨供体可以产生三袋或更多袋的骨髓。如果对于给定的供体在该过程结束时未获得三袋骨髓，则该供体可以被标示为潜在地未通过整体质量控制。设想到在每袋中预定体积的骨髓，例如在250ml袋中包含70ml。此预定体积用于计算对骨髓沉淀的有效低温保藏所需的冷冻介质组分的体积。冷冻介质是冲洗介质的溶液和低温保藏组合物。低温防护剂可以是细胞可渗透性介质，例如二甲基亚砜(DMSO)；1,2丙烷二醇(也称为丙二醇)；乙二醇；甘油；甲酰胺；乙烷二醇或丁烷2,3二醇；和/或不可渗透性介质，例如羟乙基淀粉(HES)、葡聚糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、棉子糖、核糖醇、甘露醇或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。每个骨供体还可以提供至少三个代用小瓶，例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个代用小瓶。从供体中获得的低温保藏袋的数量越多，可制备的代用小瓶的数量越多，以至每个低温保藏袋具有至少一个小瓶，优选地，两个、三个、四个或更多个小瓶/低温保藏袋。
HAS还通过胶体渗透压、细胞表面蛋白质稳定化和反应性氧清除来提供低温防护。在优选的实施方案中，低温防护剂是DMSO。冲洗介质可以是电解质介质，例如PlasmaLyte、Isolyte、IMDM或适合于输注的其他电解质溶液。冷冻介质还可以包含去氧酶(oxyrase)浓度以使氧含量降低至低于大气浓度，例如小于大气浓度的3％。去氧酶的添加产生可促进低温保藏的低压组合物。
在一些实施方案中，对于本文提供的方法，骨髓产品被低温保藏在冷冻介质中，其中所述冷冻介质包含电解质制剂、人血清白蛋白(HSA)、二甲基亚砜(DMSO)或其任何组合。
在一些实施方案中，所述冷冻介质和/或冲洗介质包含约1％至约10％、约1％至约9％、约1％至约8％、约1％至约7％、约1％至约6％、约1％至约5％、约1％至约4％、约1％至约3％、约1％至约2％、约2％至约10％、约2％至约9％、约2％至约8％、约2％至约7％、约2％至约6％、约2％至约5％、约2％至约4％、约2％至约3％、约3％至约10％、约3％至约9％、约3％至约8％、约3％至约7％、约3％至约6％、约3％至约5％、约3％至约4％、约4％至约10％、约4％至约9％、约4％至约8％、约4％至约7％、约4％至约6％、约4％至约5％、约5％至约10％、约5％至约9％、约5％至约8％、约5％至约7％、约5％至约6％、约6％至约10％、约6％至约9％、约6％至约8％、约6％至约7％、约7％至约10％、约7％至约9％、约7％至约8％、约8％至约10％、约8％至约9％或者约9％至约10％HSA。在一些实施方案中，所述冷冻介质和/或冲洗介质包含约1％至约5％HSA。在一些实施方案中，所述冷冻介质和/或冲洗介质包含约2.5％HSA。
在一些实施方案中，所述冷冻介质包含约1％至约10％、约1％至约9％、约1％至约8％、约1％至约7％、约1％至约6％、约1％至约5％、约1％至约4％、约1％至约3％、约1％至约2％、约2％至约10％、约2％至约9％、约2％至约8％、约2％至约7％、约2％至约6％、约2％至约5％、约2％至约4％、约2％至约3％、约3％至约10％、约3％至约9％、约3％至约8％、约3％至约7％、约3％至约6％、约3％至约5％、约3％至约4％、约4％至约10％、约4％至约9％、约4％至约8％、约4％至约7％、约4％至约6％、约4％至约5％、约5％至约10％、约5％至约9％、约5％至约8％、约5％至约7％、约5％至约6％、约6％至约10％、约6％至约9％、约6％至约8％、约6％至约7％、约7％至约10％、约7％至约9％、约7％至约8％、约8％至约10％、约8％至约9％或者约9％至约10％DMSO。在一些实施方案中，所述冷冻介质包含约1％至约10％DMSO。在一些实施方案中，所述冷冻介质包含约2.5％DMSO、约5％DMSO或约10％DMSO。
在一些实施方案中，所述电解质制剂是Plasmalyte A。
在多种实施方案中，冲洗介质和/或冷冻介质缺少肝素。
在一些实施方案中，冲洗介质是新鲜的。
在一些情况中，在冷冻介质添加至骨髓散装袋之前，冷冻介质≤25℃。
冷冻介质可以基于下式以预定速率(10％的冷冻介质体积/分钟)添加至骨髓散装袋：
要添加的冷冻介质的体积/分钟＝冷冻介质的总体积(mL)×0.1优选地，将低温防护剂添加至骨髓散装袋的消耗时间不超过9-11分钟。
根据收集的骨髓的体积所需的冷冻介质的计算总体积，通过将低温防护剂和冲洗介质混合来制备冷冻介质。将包含骨髓的袋置于震摇器上以进行混合，并且通过注射器而将冷冻介质导入袋中。在预定时间期间以特定速率导入冷冻介质。在一个实施方案中，在10分钟的时间期间以10％的介质/分钟的速率添加冷冻介质。一旦该介质已经与浓缩的骨髓混合，就通过注射器提取测试样品。以预定量将冷冻介质和骨髓的剩余混合物注射到单独的低温保藏袋(和代用小瓶)中。在一个实施方案中，将70ml的骨髓混合物导入每个低温保藏袋中并且将空气用注射器抽出。在该过程结束时，可以取出8ml样品以供无菌测试。将每个低温保藏袋密封而产生四个隔室，然后将其分隔以贮藏在待贮藏在低温冷冻机中的盒中。在另一实施方案中，分隔的隔室贮藏在被动冷却箱中，例如图5中所示的冷却箱200或US7,604,930中所述的冷却箱，其通过引用而以其整体并入本文。有或无箱架的标准冷冻机箱可以用于这些实施方案中。在一些实施方案中，盒未被贮藏在被动冷却箱中。在一些实施方案中，盒被排布在低温冷冻机内呈特定的配置以引发特定的冷冻速率。在一些实施方案中，排布是图14或图15中所示的排布。如所示，盒优选地不触及冷冻机搁架的内壁。另外，优选地，盒未被堆叠在彼此上方。
本公开内容的方面提供了低温保藏的细胞产品，其被分成两体积，第一体积(例如，低温保藏袋)包含用于移植到有此需要的对象中的细胞产品，第二体积充当第一体积的代用品。如本文使用的，代用小瓶通常是较小体积的细胞产品，可以按照需要对代用品进行解冻和测定例如细胞存活率(尤其通过解冻后增殖而确定的“功能存活率”)。对代用小瓶的测定结果代表对第一(较大)体积的预期测定结果；然而，通过使用代用品，不需要为了测定而解冻第一体积，而是在需要使用时解冻，例如，用于移植到有需要的对象中。
在不希望受理论约束的情况下，对于给定的细胞类型，需要特定的最佳冷却速率以便该细胞类型或细胞产品存活于低温保藏。此最佳冷却速率使细胞内冰形成(IIF)所致的损伤与由细胞外冰形成产生的高溶质浓度所致的损伤平衡。如果细胞被过快地冷却，则致损性IIF是可能的；如果细胞被过慢地冷却，则致损性溶质效应是可能的。为了代用小瓶准确地代表第一体积，在两体积中细胞应在大约相同的速率(即优化的速率)下被冷冻；此共同速率在两体积中导致细胞的等同的存活和存活率。重要地，第二体积可以与第一体积贮藏在相同的长期贮藏系统中，因此将在长期贮藏持续时间期间暴露于相同条件，故此，促进了代用小瓶准确地代表容纳用于移植的细胞的低温保藏袋的能力。这些最终允许测试第二体积以至少确定对低温保藏袋的贮藏是否适当地维持并且不必操纵和测试第一体积的细胞。更具体地，通过测定代用小瓶，低温保藏袋在其即刻使用之前不需要被升温和/或处理。此特征以两种方式特别有助于对象的结果和健康。第一，用于移植的细胞仅在准备施用于对象(并且优选地在施用的部位处)时才被解冻，而不是在使用之前大约两周时被解冻以便可以进行测定以确保细胞产品适合于使用；这两周延迟(在此期间使细胞保持在室温下、在冰上、或者在37℃，或者更糟地重新冷冻并恢复至冷贮藏)可能一旦移植时不利地影响它们的存活率和效用。第二，因为对象可能在移植之前经受清髓性预处理，所以患者可能预先阻止清髓性预处理直至细胞产品已经被测定和确定为适合于使用为止，这通常耗时约两周；由于具有代用小瓶，所以一旦已经鉴定适合的产品，对象就开始清髓性预处理，从而缩短该对象保持免疫受损的时间长度。
本公开内容提供了用于确保所述两体积在相同速率下冷却的方法。至少基于物理定律，细胞产品的较小体积相比于细胞产品的较大体积将在更快速率下冷却。于是，相对于具有较慢的冷却速率的较大体积，具有较快的冷却速率的较小体积应具有增加的IIF。本公开内容的方法促进第一(较大)体积与第二(较小)体积之间细胞冷却的等同速率，以至每个体积将具有相似量的IFF，于是，代用小瓶(较小体积)将准确地代表较大的第一体积。在不希望受理论约束的情况下，本公开内容的方法部分地基于使用直接容纳或间接容纳第一体积或第二体积的不同类型的容器和/或使容器就位在相同冷冻机(例如，静态温度冷冻机)内，将第二(较小)体积的冷却速率减慢至第一(较大)体积经受的速率。因此，较小体积(即，第二体积/代用小瓶)中的细胞与较大体积(即，第一体积/低温保藏袋)中的细胞当处于相同静态冷冻机(例如，-86℃静态冷冻机)中时经受相似的冷却速率(例如，约-1℃/分钟)。重要地，为了减慢较小的第二体积的冷却速率，将代用小瓶直接置于隔热的小瓶容器(例如，冷冻贮藏系统)中，该容器当置于低于-80℃的静态冷冻机(例如，-86℃静态冷冻机)中时，代用小瓶中的细胞经受约-1℃/分钟速率的冷冻速率；在不使用隔热的小瓶容器的情况下，代用小瓶中的细胞可能经受约-10℃/分钟速率的冷冻速率，由此可能导致IIF所致的损伤。在另一方面，较大的第一体积(低温保藏袋)不需要直接置于隔热的容器中，反而当该袋置于非隔热(以避免减慢该袋的冷却速率)的盒中并被移动至-86℃静态冷冻机时，低温保藏袋中的细胞优选地经受约-1℃/分钟的冷冻速率。“直接置于”意味着每个小瓶都紧邻于隔热容器的隔热材料。这些操纵使第一体积和第二体积的细胞具有细胞内水向细胞的细胞外空间大致等同的渗透；此渗透增加细胞内溶质浓度，并且有助于避免形成(有害的)细胞内冰晶并且促进细胞外冰形成(其对细胞的有害性较小)。一旦(在-86℃静态冷冻机中)冷冻的第一步骤，就将低温保藏袋和代用小瓶置于相同的长期贮藏装置(例如，液氮贮藏罐)中并且在长期贮藏装置内就位在大致相似的位置。
因此，本公开内容的方法允许生产细胞产品的代用样品，该代用样品预期准确地代表要向有需要的对象施用的细胞产品的部分，并且提供了细胞产品，该细胞产品不仅在治疗性上有益于对象，而且促进对象的结果和健康，当低温保藏的细胞产品仅仅被容纳在单个袋中并且没有代用小瓶时，其方式是不可实现的。
在一些情况中，第一体积(即，低温保藏袋)和第二体积(即，代用品冷冻小瓶)被置于-86℃静态冷冻机中。袋被置于盒中，该盒可以缺少隔热，而代用小瓶分别地置于冷冻贮藏系统中，而后在盒的箱前方置于冷冻机中。
当来自特定骨髓批次的测试样品已被验证细胞计数和无菌性时，低温保藏的骨髓的低温保藏袋和代用小瓶可以进一步被冷却以供长期贮藏。在一个实施方案中，将袋和小瓶以受控的速率冷却以防止对骨髓和细胞的损伤。产生最佳量的存活的骨髓和细胞的最佳冷却方案包括在冷却过程的不同阶段改变冷却速率。在一些实施方案中，冷却过程的阶段称为“超冷冻”(约17℃至成核点)和“亚冷冻”(约-10℃至-40℃)。通常，成核发生在约7℃至约15℃。
一旦冷冻的第一步骤(例如在相同-86℃静态冷冻机中)，就将低温保藏袋和代用小瓶被置于相同的长期贮藏装置(例如，液氮贮藏罐)中并且在长期贮藏装置内就位在大致相似的位置。
本公开内容中描述的方面包括一种用于加工骨髓或其衍生物(例如骨髓源性细胞组合物)的方法，其中所述骨髓或其衍生物源自于死亡供体，所述方法包括：从死亡供体中获得骨或骨碎片，任选地将所述骨加工成骨碎片；从骨或骨碎片中提取骨髓或其衍生物；以及低温保藏骨髓或其衍生物，其中所述低温保藏包括在静态冷冻机中以大于约-1℃/min的冷冻速率降低骨髓或其衍生物的温度。在一些实施方案中，低温保藏包括在约-2.5℃/min至约-5℃/min的超冷冻速率下冷却骨髓或其衍生物，直至至少骨髓或其衍生物的至少一个细胞成核。在一些实施方案中，低温保藏包括在约-2.5℃/min至约-4℃/min的超冷冻速率下冷却骨髓或其衍生物，直至至少骨髓或其衍生物的至少一个细胞成核。在一些实施方案中，低温保藏包括在约-2.5℃/min至约-3.5℃/min的超冷冻速率下冷却骨髓或其衍生物，直至至少骨髓或其衍生物的至少一个细胞成核。在一些实施方案中，低温保藏包括在约-1℃/min至约-2℃/min的亚冷冻速率下冷却骨髓或其衍生物。在一些实施方案中，在不使用被动冷却箱的情况下保持超冷冻速率和亚冷冻速率。在一些实施方案中，低温保藏包括将骨髓或其衍生物的一个或多个等分试样布置在静态冷冻机内，使得等分试样不接触静态冷冻机的壁。在一些实施方案中，骨髓或其衍生物包含CD34+细胞群。在一些实施方案中，在骨髓或其衍生物解冻之后CD34+细胞群包含至少70％的存活的CD34+细胞。在一些实施方案中，在骨髓或其衍生物解冻之后CD34+细胞群包含至少80％的存活的CD34+细胞。在一些实施方案中，静态冷冻机被设定在约-70℃至-90℃。在一些实施方案中，静态冷冻机被设定在-86℃。在一些实施方案中，静态冷冻机被设定在低于-80℃。
在一个具体实施方案中，将低温保藏袋和代用小瓶在-1至-40℃/分钟的速率下冷却，直至袋已经达到适合于将袋浸入液氮中的温度。优选地，将袋在-1℃至-5℃的速率下冷却。适合的温度在-40至-100℃的范围。一旦已达到该温度，将袋以更快的速率进一步冷却至低于-130℃的温度以进行贮藏。一旦冷冻的第一步骤(例如，在相同-86℃静态冷冻机中)，就将低温保藏袋和代用小瓶置于相同的长期贮藏装置(例如，液氮贮藏罐)中并且在长期贮藏装置内就位在大致相似的位置。
在一些实施方案中，用于冷冻骨髓或骨髓细胞的温度包括实施例5中所示的温度和冷冻速率。在一些实施方案中，可以将骨髓或骨髓细胞在超冷冻速率或超冷冻范围下低温保藏。在一些实施方案中，可以将骨髓或骨髓细胞通过在超冷冻速率和亚冷冻速率下冷冻进行低温保藏。例如，可以将骨髓或骨髓细胞如下进行低温保藏：首先在超冷冻速率下冷冻，直至达到预定温度为止，其后将冷冻骨髓或骨髓细胞切换至亚冷冻速率。在一些实施方案中，在超冷冻期间可以达到骨髓或骨髓细胞的成核温度。在一些实施方案中，在亚冷冻期间可以达到骨髓或骨髓细胞的成核温度。在一些实施方案中，在超冷冻和亚冷冻之间的切换期间可以达到骨髓或骨髓细胞的成核温度。
在一些情形中，首先可以将骨髓或骨髓细胞在超冷冻下低温保藏。例如，当骨髓或骨髓细胞刚被加工并且在室温下时，可以将骨髓或骨髓细胞低温保藏。在一些情形中，与亚冷冻速率相比，超冷冻速率通常更高(例如以更快的速率降低温度)。在一些实施方案中，超冷冻速率为约-6℃/min至约-0.5℃/min。在一些实施方案中，超冷冻速率为约-0.5℃/min至约-1℃/min、约-0.5℃/min至约-1.5℃/min、约-0.5℃/min至约-2℃/min、约-0.5℃/min至约-2.5℃/min、约-0.5℃/min至约-3℃/min、约-0.5℃/min至约-3.5℃/min、约-0.5℃/min至约-4℃/min、约-0.5℃/min至约-4.5℃/min、约-0.5℃/min至约-5℃/min、约-0.5℃/min至约-5.5℃/min、约-0.5℃/min至约-6℃/min、约-1℃/min至约-1.5℃/min、约-1℃/min至约-2℃/min、约-1℃/min至约-2.5℃/min、约-1℃/min至约-3℃/min、约-1℃/min至约-3.5℃/min、约-1℃/min至约-4℃/min、约-1℃/min至约-4.5℃/min、约-1℃/min至约-5℃/min、约-1℃/min至约-5.5℃/min、约-1℃/min至约-6℃/min、约-1.5℃/min至约-2℃/min、约-1.5℃/min至约-2.5℃/min、约-1.5℃/min至约-3℃/min、约-1.5℃/min至约-3.5℃/min、约-1.5℃/min至约-4℃/min、约-1.5℃/min至约-4.5℃/min、约-1.5℃/min至约-5℃/min、约-1.5℃/min至约-5.5℃/min、约-1.5℃/min至约-6℃/min、约-2℃/min至约-2.5℃/min、约-2℃/min至约-3℃/min、约-2℃/min至约-3.5℃/min、约-2℃/min至约-4℃/min、约-2℃/min至约-4.5℃/min、约-2℃/min至约-5℃/min、约-2℃/min至约-5.5℃/min、约-2℃/min至约-6℃/min、约-2.5℃/min至约-3℃/min、约-2.5℃/min至约-3.5℃/min、约-2.5℃/min至约-4℃/min、约-2.5℃/min至约-4.5℃/min、约-2.5℃/min至约-5℃/min、约-2.5℃/min至约-5.5℃/min、约-2.5℃/min至约-6℃/min、约-3℃/min至约-3.5℃/min、约-3℃/min至约-4℃/min、约-3℃/min至约-4.5℃/min、约-3℃/min至约-5℃/min、约-3℃/min至约-5.5℃/min、约-3℃/min至约-6℃/min、约-3.5℃/min至约-4℃/min、约-3.5℃/min至约-4.5℃/min、约-3.5℃/min至约-5℃/min、约-3.5℃/min至约-5.5℃/min、约-3.5℃/min至约-6℃/min、约-4℃/min至约-4.5℃/min、约-4℃/min至约-5℃/min、约-4℃/min至约-5.5℃/min、约-4℃/min至约-6℃/min、约-4.5℃/min至约-5℃/min、约-4.5℃/min至约-5.5℃/min、约-4.5℃/min至约-6℃/min、约-5℃/min至约-5.5℃/min、约-5℃/min至约-6℃/min，或者约-5.5℃/min至约-6℃/min。在一些实施方案中，超冷冻速率为约-0.5℃/min、约-1℃/min、约-1.5℃/min、约-2℃/min、约-2.5℃/min、约-3℃/min、约-3.5℃/min、约-4℃/min、约-4.5℃/min、约-5℃/min、约-5.5℃/min或约-6℃/min。在一些实施方案中，超冷冻速率为至少约-0.5℃/min、约-1℃/min、约-1.5℃/min、约-2℃/min、约-2.5℃/min、约-3℃/min、约-3.5℃/min、约-4℃/min、约-4.5℃/min、约-5℃/min或约-5.5℃/min。在一些实施方案中，超冷冻速率为至多约-1℃/min、约-1.5℃/min、约-2℃/min、约-2.5℃/min、约-3℃/min、约-3.5℃/min、约-4℃/min、约-4.5℃/min、约-5℃/min、约-5.5℃/min或约-6℃/min。在一些实施方案中，超冷冻速率为-3.2℃。在一些实施方案中，超冷冻速率为约-2.54℃/min至约-4.09℃/min。
在一些实施方案中，可以将骨髓或骨髓细胞在亚冷冻速率或亚冷冻范围下低温保藏。在一些实施方案中，亚冷冻速率为约-2.5℃/min至约-0.1℃/min。在一些实施方案中，亚冷冻速率为约-0.1℃/min至约-0.2℃/min、约-0.1℃/min至约-0.4℃/min、约-0.1℃/min至约-0.6℃/min、约-0.1℃/min至约-0.8℃/min、约-0.1℃/min至约-1℃/min、约-0.1℃/min至约-1.2℃/min、约-0.1℃/min至约-1.4℃/min、约-0.1℃/min至约-1.6℃/min、约-0.1℃/min至约-1.8℃/min、约-0.1℃/min至约-2℃/min、约-0.1℃/min至约-2.5℃/min、约-0.2℃/min至约-0.4℃/min、约-0.2℃/min至约-0.6℃/min、约-0.2℃/min至约-0.8℃/min、约-0.2℃/min至约-1℃/min、约-0.2℃/min至约-1.2℃/min、约-0.2℃/min至约-1.4℃/min、约-0.2℃/min至约-1.6℃/min、约-0.2℃/min至约-1.8℃/min、约-0.2℃/min至约-2℃/min、约-0.2℃/min至约-2.5℃/min、约-0.4℃/min至约-0.6℃/min、约-0.4℃/min至约-0.8℃/min、约-0.4℃/min至约-1℃/min、约-0.4℃/min至约-1.2℃/min、约-0.4℃/min至约-1.4℃/min、约-0.4℃/min至约-1.6℃/min、约-0.4℃/min至约-1.8℃/min、约-0.4℃/min至约-2℃/min、约-0.4℃/min至约-2.5℃/min、约-0.6℃/min至约-0.8℃/min、约-0.6℃/min至约-1℃/min、约-0.6℃/min至约-1.2℃/min、约-0.6℃/min至约-1.4℃/min、约-0.6℃/min至约-1.6℃/min、约-0.6℃/min至约-1.8℃/min、约-0.6℃/min至约-2℃/min、约-0.6℃/min至约-2.5℃/min、约-0.8℃/min至约-1℃/min、约-0.8℃/min至约-1.2℃/min、约-0.8℃/min至约-1.4℃/min、约-0.8℃/min至约-1.6℃/min、约-0.8℃/min至约-1.8℃/min、约-0.8℃/min至约-2℃/min、约-0.8℃/min至约-2.5℃/min、约-1℃/min至约-1.2℃/min、约-1℃/min至约-1.4℃/min、约-1℃/min至约-1.6℃/min、约-1℃/min至约-1.8℃/min、约-1℃/min至约-2℃/min、约-1℃/min至约-2.5℃/min、约-1.2℃/min至约-1.4℃/min、约-1.2℃/min至约-1.6℃/min、约-1.2℃/min至约-1.8℃/min、约-1.2℃/min至约-2℃/min、约-1.2℃/min至约-2.5℃/min、约-1.4℃/min至约-1.6℃/min、约-1.4℃/min至约-1.8℃/min、约-1.4℃/min至约-2℃/min、约-1.4℃/min至约-2.5℃/min、约-1.6℃/min至约-1.8℃/min、约-1.6℃/min至约-2℃/min、约-1.6℃/min至约-2.5℃/min、约-1.8℃/min至约-2℃/min、约-1.8℃/min至约-2.5℃/min，或者约-2℃/min至约-2.5℃/min。在一些实施方案中，亚冷冻速率为约-0.1℃/min、约-0.2℃/min、约-0.4℃/min、约-0.6℃/min、约-0.8℃/min、约-1℃/min、约-1.2℃/min、约-1.4℃/min、约-1.6℃/min、约-1.8℃/min、约-2℃/min或约-2.5℃/min。在一些实施方案中，亚冷冻速率为至少约-0.1℃/min、约-0.2℃/min、约-0.4℃/min、约-0.6℃/min、约-0.8℃/min、约-1℃/min、约-1.2℃/min、约-1.4℃/min、约-1.6℃/min、约-1.8℃/min或约-2℃/min。在一些实施方案中，亚冷冻速率为至多约-0.2℃/min、约-0.4℃/min、约-0.6℃/min、约-0.8℃/min、约-1℃/min、约-1.2℃/min、约-1.4℃/min、约-1.6℃/min、约-1.8℃/min、约-2℃/min或约-2.5℃/min。在一些实施方案中，亚冷冻速率可以为-1.36℃/min。在一些实施方案中，亚冷冻速率包括-1.13℃/min至-1.62℃/min的范围。
在一些实施方案中，用于低温保藏本文所述的骨髓或骨髓细胞的冷冻速率包括确定成核温度。在一些实施方案中，成核温度为约-24℃至约-2℃。在一些实施方案中，成核温度为约-2℃至约-4℃、约-2℃至约-6℃、约-2℃至约-8℃、约-2℃至约-10℃、约-2℃至约-12℃、约-2℃至约-14℃、约-2℃至约-16℃、约-2℃至约-18℃、约-2℃至约-20℃、约-2℃至约-22℃、约-2℃至约-24℃、约-4℃至约-6℃、约-4℃至约-8℃、约-4℃至约-10℃、约-4℃至约-12℃、约-4℃至约-14℃、约-4℃至约-16℃、约-4℃至约-18℃、约-4℃至约-20℃、约-4℃至约-22℃、约-4℃至约-24℃、约-6℃至约-8℃、约-6℃至约-10℃、约-6℃至约-12℃、约-6℃至约-14℃、约-6℃至约-16℃、约-6℃至约-18℃、约-6℃至约-20℃、约-6℃至约-22℃、约-6℃至约-24℃、约-8℃至约-10℃、约-8℃至约-12℃、约-8℃至约-14℃、约-8℃至约-16℃、约-8℃至约-18℃、约-8℃至约-20℃、约-8℃至约-22℃、约-8℃至约-24℃、约-10℃至约-12℃、约-10℃至约-14℃、约-10℃至约-16℃、约-10℃至约-18℃、约-10℃至约-20℃、约-10℃至约-22℃、约-10℃至约-24℃、约-12℃至约-14℃、约-12℃至约-16℃、约-12℃至约-18℃、约-12℃至约-20℃、约-12℃至约-22℃、约-12℃至约-24℃、约-14℃至约-16℃、约-14℃至约-18℃、约-14℃至约-20℃、约-14℃至约-22℃、约-14℃至约-24℃、约-16℃至约-18℃、约-16℃至约-20℃、约-16℃至约-22℃、约-16℃至约-24℃、约-18℃至约-20℃、约-18℃至约-22℃、约-18℃至约-24℃、约-20℃至约-22℃、约-20℃至约-24℃，或者约-22℃至约-24℃。在一些实施方案中，成核温度为约-2℃、约-4℃、约-6℃、约-8℃、约-10℃、约-12℃、约-14℃、约-16℃、约-18℃、约-20℃、约-22℃或约-24℃。在一些实施方案中，成核温度为至少约-2℃、约-4℃、约-6℃、约-8℃、约-10℃、约-12℃、约-14℃、约-16℃、约-18℃、约-20℃或约-22℃。在一些实施方案中，成核温度为至多约-4℃、约-6℃、约-8℃、约-10℃、约-12℃、约-14℃、约-16℃、约-18℃、约-20℃、约-22℃或约-24℃。在一些实施方案中，成核温度可以为约-12.31℃/min。在一些实施方案中，成核温度可以包括约-7.24℃至约-17.52℃的范围。
在一些实施方案中，可以将要被低温保藏的骨髓或骨髓细胞置于容器或袋例如低温保藏袋中。在一些情况中，可以将低温保藏袋后续置于缺少隔热的冷却箱中以进行冷冻。或者，低温保藏袋未被置于冷却箱中。在一些情况中，低温保藏袋可以被置于盒中并且后续置于冷冻环境(例如置于冷冻机例如-86℃静态冷冻机)中。在一些情况中，低温保藏袋可以被置于液氮或源于液氮的蒸气的冷冻环境中。在一些情况中，低温保藏袋可以被置于冷冻机中搁架的不同隔室或不同水平中或在液氮或液氮蒸气中。在一些实施方案中，包含骨髓或骨髓细胞的低温保藏袋可以被置于如图14或图15中所示的位置。
低温保藏袋被置于冷却箱200的对应隔室201-203内，并且重叠盖205闭合在隔室上以提供密封的环境以供低温保藏该袋的内容物。冷却箱被置于低温冷冻机中，使得冷却箱产生-0.5至-5C°/min，通常-1C°/min的冷却速率，成核温度高于-20℃。冷冻过程在指定的速率下继续，直至骨髓的温度达到适合的温度。适合于贮藏所述袋的温度是温度<-80℃或<-150℃。
在另一实施方案中，与上述受控速率的低温保藏相反，将袋在静态腔室温度下冷却。在被动冷却法中，将冷却箱置于-86℃冷冻机中，直至袋达到稳定的温度。在一些情况中，冷冻机可以被设定在约-100℃至约-60℃的温度范围。在一些情况中，冷冻机可以被设定在以下温度范围：约-60℃至约-65℃、约-60℃至约-70℃、约-60℃至约-75℃、约-60℃至约-80℃、约-60℃至约-82℃、约-60℃至约-84℃、约-60℃至约-86℃、约-60℃至约-88℃、约-60℃至约-90℃、约-60℃至约-95℃、约-60℃至约-100℃、约-65℃至约-70℃、约-65℃至约-75℃、约-65℃至约-80℃、约-65℃至约-82℃、约-65℃至约-84℃、约-65℃至约-86℃、约-65℃至约-88℃、约-65℃至约-90℃、约-65℃至约-95℃、约-65℃至约-100℃、约-70℃至约-75℃、约-70℃至约-80℃、约-70℃至约-82℃、约-70℃至约-84℃、约-70℃至约-86℃、约-70℃至约-88℃、约-70℃至约-90℃、约-70℃至约-95℃、约-70℃至约-100℃、约-75℃至约-80℃、约-75℃至约-82℃、约-75℃至约-84℃、约-75℃至约-86℃、约-75℃至约-88℃、约-75℃至约-90℃、约-75℃至约-95℃、约-75℃至约-100℃、约-80℃至约-82℃、约-80℃至约-84℃、约-80℃至约-86℃、约-80℃至约-88℃、约-80℃至约-90℃、约-80℃至约-95℃、约-80℃至约-100℃、约-82℃至约-84℃、约-82℃至约-86℃、约-82℃至约-88℃、约-82℃至约-90℃、约-82℃至约-95℃、约-82℃至约-100℃、约-84℃至约-86℃、约-84℃至约-88℃、约-84℃至约-90℃、约-84℃至约-95℃、约-84℃至约-100℃、约-86℃至约-88℃、约-86℃至约-90℃、约-86℃至约-95℃、约-86℃至约-100℃、约-88℃至约-90℃、约-88℃至约-95℃、约-88℃至约-100℃、约-90℃至约-95℃、约-90℃至约-100℃，或者约-95℃至约-100℃。在一些情况中，冷冻机可以被设定在以下温度范围：约-60℃、约-65℃、约-70℃、约-75℃、约-80℃、约-82℃、约-84℃、约-86℃、约-88℃、约-90℃、约-95℃或约-100℃。在一些情况中，冷冻机可以被设定在以下温度范围：至少约-60℃、约-65℃、约-70℃、约-75℃、约-80℃、约-82℃、约-84℃、约-86℃、约-88℃、约-90℃或约-95℃。在一些情况中，冷冻机可以被设定在以下温度范围：至多约-65℃、约-70℃、约-75℃、约-80℃、约-82℃、约-84℃、约-86℃、约-88℃、约-90℃、约-95℃或约-100℃。
在一些情况中，当置于设定在-80℃的静态冷冻机中时，冷冻低温保藏袋和代用小瓶的效果较差。反而，当静态冷冻机设定为低于-80℃的温度(例如，-86℃)时获得更好的结果。
设想到低温保藏贮藏可以以许多形式。例如，低温保藏的骨髓可以被容纳在1ml至5ml体积的袋或0.1至15ml体积的小瓶中。在优选的实施方案中，具有70ml骨髓的袋贮藏在低温冷冻机内的冷却箱中。
低温保藏的骨髓被低温储存以供以后解冻和提取期望的细胞。解冻的骨髓可以被提供用于广泛的治疗，包括治疗白血病、脑瘤、乳腺癌、霍奇金病、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、血癌、卵巢癌、肉瘤、睾丸癌、其他实体器官癌、类风湿性关节炎、多发性硬化、糖尿病、囊性纤维化(cystic fibrosus)、阿尔茨海默病、遗传性免疫缺陷、代谢紊乱、骨髓衰竭综合征和HIV。骨髓也可以用于诱导免疫耐受性，以减轻对从器官供体获得的植入物的潜在排斥。还表明，骨髓治疗可以用于由辐射和某些生物武器造成的伤亡。
本公开内容的另一方面包括一种用于加工包含细胞或其衍生物的生物样品的方法，所述方法包括：产生包含细胞或其衍生物的生物样品的第一体积，其中所述第一体积包含细胞或其衍生物的第一浓度；产生包含细胞或其衍生物的生物样品的第二体积，其中所述第二体积小于所述第一体积并且包含细胞的第二浓度，其中细胞的所述第二浓度与细胞的所述第一浓度相差不超过30％；以及以第一冷却速率冷却所述第一体积并且以第二冷却速率冷却所述第二体积，其中所述第一冷却速率与所述第二冷却速率大约相同；其中第一体积中细胞的解冻后细胞增殖速率与第二体积中细胞的解冻后细胞增殖速率相差不超过30％。在一些实施方案中，第一体积被容纳在第一容器中，其中第二体积被容纳在第二容器中，并且其中所述第一容器和所述第二容器暴露于共同温度。
绝大多数文献表明低于水的玻璃化转变温度(-130℃)贮藏的细胞是无限稳定的，基于生物物理特性估计200-30000年(参见，例如，Woods等人，“Off the shelf cellulartherapeutics:Factors to consider during cryopreservation and storage of humancells for clinical use”.Cytotherapy 18(6):697-711.(2016)，其内容通过引用而以其全部并入)。主要的潜在损伤来源是由于不适当的贮藏所致的热循环。本公开内容的方法允许检测要向有需要的对象施用的生物样品的不适当贮藏和相关损伤。然而，优选地，每天24小时对贮藏单元进行警报监测，每周手动地检查以确保温度保持不变。
具有至少两体积的生物样品允许测试生物样品的子集(第二体积)而不必操纵要向对象施用的生物样品部分(第一样品)，第二体积充当第一体积的代用品。如本文中使用的，代用小瓶通常是细胞产品的较小体积，并且可以按照需要对代用品进行解冻和测定例如细胞存活率。对代用小瓶的测定结果代表对第一(较大)体积的预期测定结果；然而，通过使用代用品，不需要为了测定而解冻第一体积，而是在需要使用时解冻，例如，用于移植到有需要的对象中。为了代用小瓶准确地代表第一体积，两体积中的细胞应在相同的速率下被冷冻；此共同速率在两体积中导致细胞的等同的功能存活率。在一些情况中，第一体积(即，低温保藏袋)和第二体积(即，代用品冷冻小瓶)被置于-86℃静态冷冻机中。将袋置于盒中，该盒可以缺少隔热，而代用小瓶分别地置于冷冻贮藏系统中，而后在盒的箱前方置于冷冻机中。
在一些实施方案中，第二体积是第一体积的小于约0.5％至第一体积的约50％。在一些实施方案中，第二体积是第一体积的小于约50％至第一体积的约40％、第一体积的约50％至第一体积的约30％、第一体积的约50％至第一体积的约20％、第一体积的约50％至第一体积的约10％、第一体积的约50％至第一体积的约5％、第一体积的约50％至第一体积的约1％、第一体积的约50％至第一体积的约0.5％、第一体积的约40％至第一体积的约30％、第一体积的约40％至第一体积的约20％、第一体积的约40％至第一体积的约10％、第一体积的约40％至第一体积的约5％、第一体积的约40％至第一体积的约1％、第一体积的约40％至第一体积的约0.5％、第一体积的约30％至第一体积的约20％、第一体积的约30％至第一体积的约10％、第一体积的约30％至第一体积的约5％、第一体积的约30％至第一体积的约1％、第一体积的约30％至第一体积的约0.5％、第一体积的约20％至第一体积的约10％、第一体积的约20％至第一体积的约5％、第一体积的约20％至第一体积的约1％、第一体积的约20％至第一体积的约0.5％、第一体积的约10％至第一体积的约5％、第一体积的约10％至第一体积的约1％、第一体积的约10％至第一体积的约0.5％、第一体积的约5％至第一体积的约1％、第一体积的约5％至第一体积的约0.5％或第一体积的约1％至第一体积的约0.5％。在一些实施方案中，第二体积是第一体积的小于约50％、第一体积的约40％、第一体积的约30％、第一体积的约20％、第一体积的约10％、第一体积的约5％、第一体积的约1％或第一体积的约0.5％。在一些实施方案中，第二体积是第一体积的小于至少约50％、第一体积的约40％、第一体积的约30％、第一体积的约20％、第一体积的约10％、第一体积的约5％或第一体积的约1％。在一些实施方案中，第二体积是第一体积的小于至多约40％、第一体积的约30％、第一体积的约20％、第一体积的约10％、第一体积的约5％、第一体积的约1％或第一体积的约0.5％。在一些实施方案中，第二体积是第一体积的小于50％。在一些实施方案中，第二体积是第一体积的小于40％。在一些实施方案中，第二体积是第一体积的小于37.5％。在一些实施方案中，第二体积是第一体积的小于35％。在一些实施方案中，第二体积是第一体积的小于30％。在一些实施方案中，第二体积是第一体积的小于20％。在一些实施方案中，第二体积是第一体积的小于15％。在一些实施方案中，第二体积是第一体积的小于10％。在一些实施方案中，第二体积是第一体积的小于5％。在一些实施方案中，第二体积是第一体积的小于1％。
在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后存活率(例如，功能存活率)与第二体积中细胞的解冻后存活率相差不超过约0.5％至与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约30％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后存活率与第二体积中细胞的解冻后存活率相差不超过约30％至与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约25％、与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约30％至与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约20％、与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约30％至与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约15％、与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约30％至与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约10％、与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约30％至与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约5％、与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约30％至与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约1％、与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约30％至与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约0.5％、与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约25％至与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约20％、与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约25％至与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约15％、与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约25％至与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约10％、与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约25％至与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约5％、与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约25％至与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约1％、与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约25％至与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约0.5％、与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约20％至与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约15％、与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约20％至与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约10％、与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约20％至与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约5％、与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约20％至与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约1％、与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约20％至与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约0.5％、与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约15％至与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约10％、与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约15％至与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约5％、与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约15％至与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约1％、与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约15％至与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约0.5％、与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约10％至与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约5％、与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约10％至与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约1％、与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约10％至与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约0.5％、与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约5％至与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约1％、与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约5％至与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约0.5％，或者与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约1％至与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约0.5％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后存活率与第二体积中细胞的解冻后存活率相差不超过约30％、与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约25％、与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约20％、与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约15％、与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约10％、与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约5％、与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约1％，或者与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约0.5％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后存活率与第二体积中细胞的解冻后存活率相差不超过至少约30％、与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约25％、与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约20％、与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约15％、与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约10％、与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约5％，或者与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约1％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后存活率与第二体积中细胞的解冻后存活率相差不超过至多约25％、与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约20％、与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约15％、与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约10％、与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约5％、与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约1％，或者与第二体积中细胞的解冻后存活率相差约0.5％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后存活率与第二体积中细胞的解冻后存活率相差不超过30％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后存活率与第二体积中细胞的解冻后存活率相差不超过25％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后存活率与第二体积中细胞的解冻后存活率相差不超过20％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后存活率与第二体积中细胞的解冻后存活率相差不超过15％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后存活率与第二体积中细胞的解冻后存活率相差不超过13.6％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后存活率与第二体积中细胞的解冻后存活率相差不超过10％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后存活率与第二体积中细胞的解冻后存活率相差不超过5％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后细胞增殖速率与第二体积中细胞的解冻后细胞增殖速率相差不超过25％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后细胞增殖速率与第二体积中细胞的解冻后细胞增殖速率相差不超过20％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后细胞增殖速率与第二体积中细胞的解冻后细胞增殖速率相差不超过15％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后细胞增殖速率与第二体积中细胞的解冻后细胞增殖速率相差不超过13.6％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后细胞增殖速率与第二体积中细胞的解冻后细胞增殖速率相差不超过10％。在一些实施方案中，第一体积中细胞的解冻后细胞增殖速率与第二体积中细胞的解冻后细胞增殖速率相差不超过5％。在一些实施方案中，细胞的解冻后存活率为至少50％。存活率可以涉及功能存活率(其衡量细胞增殖的能力)和常规存活率(其涉及活细胞的数量或百分比，例如，如通过台盼蓝(Trypan Blue)测量)之一或二者。
在一些实施方案中，细胞的解冻后增殖速率(其代表细胞的功能存活率)为至少1CFU-GM/105个细胞。在一些实施方案中，细胞的解冻后增殖速率为至少约1CFU-GM/105个细胞至约200CFU-GM/105个细胞。在一些实施方案中，细胞的解冻后增殖速率为至少约1CFU-GM/105个细胞至约10CFU-GM/105个细胞、约1CFU-GM/105个细胞至约20CFU-GM/105个细胞、约1CFU-GM/105个细胞至约30CFU-GM/105个细胞、约1CFU-GM/105个细胞至约40CFU-GM/105个细胞、约1CFU-GM/105个细胞至约50CFU-GM/105个细胞、约1CFU-GM/105个细胞至约60CFU-GM/105个细胞、约1CFU-GM/105个细胞至约70CFU-GM/105个细胞、约1CFU-GM/105个细胞至约80CFU-GM/105个细胞、约1CFU-GM/105个细胞至约90CFU-GM/105个细胞、约1CFU-GM/105个细胞至约100CFU-GM/105个细胞、约1CFU-GM/105个细胞至约200CFU-GM/105个细胞、约10CFU-GM/105个细胞至约20CFU-GM/105个细胞、约10CFU-GM/105个细胞至约30CFU-GM/105个细胞、约10CFU-GM/105个细胞至约40CFU-GM/105个细胞、约10CFU-GM/105个细胞至约50CFU-GM/105个细胞、约10CFU-GM/105个细胞至约60CFU-GM/105个细胞、约10CFU-GM/105个细胞至约70CFU-GM/105个细胞、约10CFU-GM/105个细胞至约80CFU-GM/105个细胞、约10CFU-GM/105个细胞至约90CFU-GM/105个细胞、约10CFU-GM/105个细胞至约100CFU-GM/105个细胞、约10CFU-GM/105个细胞至约200CFU-GM/105个细胞、约20CFU-GM/105个细胞至约30CFU-GM/105个细胞、约20CFU-GM/105个细胞至约40CFU-GM/105个细胞、约20CFU-GM/105个细胞至约50CFU-GM/105个细胞、约20CFU-GM/105个细胞至约60CFU-GM/105个细胞、约20CFU-GM/105个细胞至约70CFU-GM/105个细胞、约20CFU-GM/105个细胞至约80CFU-GM/105个细胞、约20CFU-GM/105个细胞至约90CFU-GM/105个细胞、约20CFU-GM/105个细胞至约100CFU-GM/105个细胞、约20CFU-GM/105个细胞至约200CFU-GM/105个细胞、约30CFU-GM/105个细胞至约40CFU-GM/105个细胞、约30CFU-GM/105个细胞至约50CFU-GM/105个细胞、约30CFU-GM/105个细胞至约60CFU-GM/105个细胞、约30CFU-GM/105个细胞至约70CFU-GM/105个细胞、约30CFU-GM/105个细胞至约80CFU-GM/105个细胞、约30CFU-GM/105个细胞至约90CFU-GM/105个细胞、约30CFU-GM/105个细胞至约100CFU-GM/105个细胞、约30CFU-GM/105个细胞至约200CFU-GM/105个细胞、约40CFU-GM/105个细胞至约50CFU-GM/105个细胞、约40CFU-GM/105个细胞至约60CFU-GM/105个细胞、约40CFU-GM/105个细胞至约70CFU-GM/105个细胞、约40CFU-GM/105个细胞至约80CFU-GM/105个细胞、约40CFU-GM/105个细胞至约90CFU-GM/105个细胞、约40CFU-GM/105个细胞至约100CFU-GM/105个细胞、约40CFU-GM/105个细胞至约200CFU-GM/105个细胞、约50CFU-GM/105个细胞至约60CFU-GM/105个细胞、约50CFU-GM/105个细胞至约70CFU-GM/1055个细胞、约50CFU-GM/105个细胞至约80CFU-GM/105个细胞、约50CFU-GM/105个细胞至约90CFU-GM/105个细胞、约50CFU-GM/105个细胞至约100CFU-GM/105个细胞、约50CFU-GM/105个细胞至约200CFU-GM/105个细胞、约60CFU-GM/105个细胞至约70CFU-GM/105个细胞、约60CFU-GM/105个细胞至约80CFU-GM/105个细胞、约60CFU-GM/105个细胞至约90CFU-GM/105个细胞、约60CFU-GM/105个细胞至约100CFU-GM/105个细胞、约60CFU-GM/105个细胞至约200CFU-GM/105个细胞、约70CFU-GM/105个细胞至约80CFU-GM/105个细胞、约70CFU-GM/105个细胞至约90CFU-GM/105个细胞、约70CFU-GM/105个细胞至约100CFU-GM/105个细胞、约70CFU-GM/105个细胞至约200CFU-GM/105个细胞、约80CFU-GM/105个细胞至约90CFU-GM/105个细胞、约80CFU-GM/105个细胞至约100CFU-GM/105个细胞、约80CFU-GM/105个细胞至约200CFU-GM/105个细胞、约90CFU-GM/105个细胞至约100CFU-GM/105个细胞、约90CFU-GM/105个细胞至约200CFU-GM/105个细胞，或者约100CFU-GM/105个细胞至约200CFU-GM/105个细胞。在一些实施方案中，细胞的解冻后增殖速率为至少约1CFU-GM/105个细胞、约10CFU-GM/105个细胞、约20CFU-GM/105个细胞、约30CFU-GM/105个细胞、约40CFU-GM/105个细胞、约50CFU-GM/105个细胞、约60CFU-GM/105个细胞、约70CFU-GM/105个细胞、约80CFU-GM/105个细胞、约90CFU-GM/105个细胞、约100CFU-GM/105个细胞或约200CFU-GM/105个细胞。在一些实施方案中，细胞的解冻后增殖速率为至少约1CFU-GM/105个细胞、约10CFU-GM/105个细胞、约20CFU-GM/105个细胞、约30CFU-GM/105个细胞、约40CFU-GM/105个细胞、约50CFU-GM/105个细胞、约60CFU-GM/105个细胞、约70CFU-GM/105个细胞、约80CFU-GM/105个细胞、约90CFU-GM/105个细胞或约100CFU-GM/105个细胞。在一些实施方案中，细胞的解冻后增殖速率为至多约10CFU-GM/105个细胞、约20CFU-GM/105个细胞、约30CFU-GM/105个细胞、约40CFU-GM/105个细胞、约50CFU-GM/105个细胞、约60CFU-GM/105个细胞、约70CFU-GM/105个细胞、约80CFU-GM/105个细胞、约90CFU-GM/105个细胞、约100CFU-GM/105个细胞或约200CFU-GM/105个细胞。确定功能存活率的测定法可能需要约10天至约2周的培养。培养与本公开内容相关的细胞产品的方法是本领域中熟知的。
在一些实施方案中，第一冷却速率和第二冷却速率包括约-0.1℃/min至约-5℃/min的超冷冻速率，直至至少冰已经在冷冻介质中成核。在一些情形中，首先可以将生物样品或其衍生物在超冷冻下低温保藏。例如，当生物样品或其衍生物刚被加工并且在室温下时，可以将生物样品或其衍生物低温保藏。在一些情形中，与亚冷冻速率相比，超冷冻速率通常更高(例如以更快的降温速率)。在一些实施方案中，超冷冻速率为约-6℃/min至约-0.5℃/min。在一些实施方案中，超冷冻速率为约-0.5℃/min至约-1℃/min、约-0.5℃/min至约-1.5℃/min、约-0.5℃/min至约-2℃/min、约-0.5℃/min至约-2.5℃/min、约-0.5℃/min至约-3℃/min、约-0.5℃/min至约-3.5℃/min、约-0.5℃/min至约-4℃/min、约-0.5℃/min至约-4.5℃/min、约-0.5℃/min至约-5℃/min、约-0.5℃/min至约-5.5℃/min、约-0.5℃/min至约-6℃/min、约-1℃/min至约-1.5℃/min、约-1℃/min至约-2℃/min、约-1℃/min至约-2.5℃/min、约-1℃/min至约-3℃/min、约-1℃/min至约-3.5℃/min、约-1℃/min至约-4℃/min、约-1℃/min至约-4.5℃/min、约-1℃/min至约-5℃/min、约-1℃/min至约-5.5℃/min、约-1℃/min至约-6℃/min、约-1.5℃/min至约-2℃/min、约-1.5℃/min至约-2.5℃/min、约-1.5℃/min至约-3℃/min、约-1.5℃/min至约-3.5℃/min、约-1.5℃/min至约-4℃/min、约-1.5℃/min至约-4.5℃/min、约-1.5℃/min至约-5℃/min、约-1.5℃/min至约-5.5℃/min、约-1.5℃/min至约-6℃/min、约-2℃/min至约-2.5℃/min、约-2℃/min至约-3℃/min、约-2℃/min至约-3.5℃/min、约-2℃/min至约-4℃/min、约-2℃/min至约-4.5℃/min、约-2℃/min至约-5℃/min、约-2℃/min至约-5.5℃/min、约-2℃/min至约-6℃/min、约-2.5℃/min至约-3℃/min、约-2.5℃/min至约-3.5℃/min、约-2.5℃/min至约-4℃/min、约-2.5℃/min至约-4.5℃/min、约-2.5℃/min至约-5℃/min、约-2.5℃/min至约-5.5℃/min、约-2.5℃/min至约-6℃/min、约-3℃/min至约-3.5℃/min、约-3℃/min至约-4℃/min、约-3℃/min至约-4.5℃/min、约-3℃/min至约-5℃/min、约-3℃/min至约-5.5℃/min、约-3℃/min至约-6℃/min、约-3.5℃/min至约-4℃/min、约-3.5℃/min至约-4.5℃/min、约-3.5℃/min至约-5℃/min、约-3.5℃/min至约-5.5℃/min、约-3.5℃/min至约-6℃/min、约-4℃/min至约-4.5℃/min、约-4℃/min至约-5℃/min、约-4℃/min至约-5.5℃/min、约-4℃/min至约-6℃/min、约-4.5℃/min至约-5℃/min、约-4.5℃/min至约-5.5℃/min、约-4.5℃/min至约-6℃/min、约-5℃/min至约-5.5℃/min、约-5℃/min至约-6℃/min，或者约-5.5℃/min至约-6℃/min。在一些实施方案中，超冷冻速率为约-0.5℃/min、约-1℃/min、约-1.5℃/min、约-2℃/min、约-2.5℃/min、约-3℃/min、约-3.5℃/min、约-4℃/min、约-4.5℃/min、约-5℃/min、约-5.5℃/min或约-6℃/min。在一些实施方案中，超冷冻速率为至少约-0.5℃/min、约-1℃/min、约-1.5℃/min、约-2℃/min、约-2.5℃/min、约-3℃/min、约-3.5℃/min、约-4℃/min、约-4.5℃/min、约-5℃/min或约-5.5℃/min。在一些实施方案中，超冷冻速率为至多约-1℃/min、约-1.5℃/min、约-2℃/min、约-2.5℃/min、约-3℃/min、约-3.5℃/min、约-4℃/min、约-4.5℃/min、约-5℃/min、约-5.5℃/min或约-6℃/min。在一些实施方案中，超冷冻速率为-3.2℃。在一些实施方案中，超冷冻速率为约-2.54℃/min至约-4.09℃/min。在一些实施方案中，第一冷却速率和第二冷却速率包括约-2.5℃/min至约-4℃/min的超冷冻速率，直至至少冰已经在冷冻介质中成核。在一些实施方案中，第一冷却速率和第二冷却速率包括约-2.5℃/min至约-3.5℃/min的超冷冻速率，直至至少冰已经在冷冻介质中成核。优选地，第一冷却速率和第二冷却速率为约-1℃至约-5℃。
在一些实施方案中，第一冷却速率和第二冷却速率相差约1％至约500％。第一冷却速率和第二冷却速率可以相差约1％至约100％，例如，1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。第一冷却速率和第二冷却速率可以相差约100％至约200％，例如，100％、102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％、110％、111％、112％、113％、114％、115％、116％、117％、118％、119％、120％、121％、122％、123％、124％、125％、126％、127％、128％、129％、130％、131％、132％、133％、134％、135％、136％、137％、138％、139％、140％、141％、142％、143％、144％、145％、146％、147％、148％、149％、150％、151％、152％、153％、154％、155％、156％、157％、158％、159％、160％、161％、162％、163％、164％、165％、166％、167％、168％、169％、170％、171％、172％、173％、174％、175％、176％、177％、178％、179％、180％、181％、182％、183％、184％、185％、186％、187％、188％、189％、190％、191％、192％、193％、194％、195％、196％、197％、198％、199％或200％。第一冷却速率和第二冷却速率可以相差约200％至约300％，例如，200％、202％、203％、204％、205％、206％、207％、208％、209％、210％、211％、212％、213％、214％、215％、216％、217％、218％、219％、220％、221％、222％、223％、224％、225％、226％、227％、228％、229％、230％、231％、232％、233％、234％、235％、236％、237％、238％、239％、240％、241％、242％、243％、244％、245％、246％、247％、248％、249％、250％、251％、252％、253％、254％、255％、256％、257％、258％、259％、260％、261％、262％、263％、264％、265％、266％、267％、268％、269％、270％、271％、272％、273％、274％、275％、276％、277％、278％、279％、280％、281％、282％、283％、284％、285％、286％、287％、288％、289％、290％、291％、292％、293％、294％、295％、296％、297％、298％、299％或300％。第一冷却速率和第二冷却速率可以相差约400％至约500％，例如，300％、302％、303％、304％、305％、306％、307％、308％、309％、310％、311％、312％、313％、314％、315％、316％、317％、318％、319％、320％、321％、322％、323％、324％、325％、326％、327％、328％、329％、330％、331％、332％、333％、334％、335％、336％、337％、338％、339％、340％、341％、342％、343％、344％、345％、346％、347％、348％、349％、350％、351％、352％、353％、354％、355％、356％、357％、358％、359％、360％、361％、362％、363％、364％、365％、366％、367％、368％、369％、370％、371％、372％、373％、374％、375％、376％、377％、378％、379％、380％、381％、382％、383％、384％、385％、386％、387％、388％、389％、390％、391％、392％、393％、394％、395％、396％、397％、398％、399％或400％。第一冷却速率和第二冷却速率可以相差约400％至约500％，例如，400％、402％、403％、404％、405％、406％、407％、408％、409％、410％、411％、412％、413％、414％、415％、416％、417％、418％、419％、420％、421％、422％、423％、424％、425％、426％、427％、428％、429％、430％、431％、432％、433％、434％、435％、436％、437％、438％、439％、440％、441％、442％、443％、444％、445％、446％、447％、448％、449％、450％、451％、452％、453％、454％、455％、456％、457％、458％、459％、460％、461％、462％、463％、464％、465％、466％、467％、468％、469％、470％、471％、472％、473％、474％、475％、476％、477％、478％、479％、480％、481％、482％、483％、484％、485％、486％、487％、488％、489％、490％、491％、492％、493％、494％、495％、496％、497％、498％、499％或500％。
在一些实施方案中，第一冷却速率和第二冷却速率包括约-1℃/min至约-2℃/min的亚冷冻速率。在一些实施方案中，亚冷冻速率为约-2.5℃/min至约-0.1℃/min。在一些实施方案中，亚冷冻速率为约-0.1℃/min至约-0.2℃/min、约-0.1℃/min至约-0.4℃/min、约-0.1℃/min至约-0.6℃/min、约-0.1℃/min至约-0.8℃/min、约-0.1℃/min至约-1℃/min、约-0.1℃/min至约-1.2℃/min、约-0.1℃/min至约-1.4℃/min、约-0.1℃/min至约-1.6℃/min、约-0.1℃/min至约-1.8℃/min、约-0.1℃/min至约-2℃/min、约-0.1℃/min至约-2.5℃/min、约-0.2℃/min至约-0.4℃/min、约-0.2℃/min至约-0.6℃/min、约-0.2℃/min至约-0.8℃/min、约-0.2℃/min至约-1℃/min、约-0.2℃/min至约-1.2℃/min、约-0.2℃/min至约-1.4℃/min、约-0.2℃/min至约-1.6℃/min、约-0.2℃/min至约-1.8℃/min、约-0.2℃/min至约-2℃/min、约-0.2℃/min至约-2.5℃/min、约-0.4℃/min至约-0.6℃/min、约-0.4℃/min至约-0.8℃/min、约-0.4℃/min至约-1℃/min、约-0.4℃/min至约-1.2℃/min、约-0.4℃/min至约-1.4℃/min、约-0.4℃/min至约-1.6℃/min、约-0.4℃/min至约-1.8℃/min、约-0.4℃/min至约-2℃/min、约-0.4℃/min至约-2.5℃/min、约-0.6℃/min至约-0.8℃/min、约-0.6℃/min至约-1℃/min、约-0.6℃/min至约-1.2℃/min、约-0.6℃/min至约-1.4℃/min、约-0.6℃/min至约-1.6℃/min、约-0.6℃/min至约-1.8℃/min、约-0.6℃/min至约-2℃/min、约-0.6℃/min至约-2.5℃/min、约-0.8℃/min至约-1℃/min、约-0.8℃/min至约-1.2℃/min、约-0.8℃/min至约-1.4℃/min、约-0.8℃/min至约-1.6℃/min、约-0.8℃/min至约-1.8℃/min、约-0.8℃/min至约-2℃/min、约-0.8℃/min至约-2.5℃/min、约-1℃/min至约-1.2℃/min、约-1℃/min至约-1.4℃/min、约-1℃/min至约-1.6℃/min、约-1℃/min至约-1.8℃/min、约-1℃/min至约-2℃/min、约-1℃/min至约-2.5℃/min、约-1.2℃/min至约-1.4℃/min、约-1.2℃/min至约-1.6℃/min、约-1.2℃/min至约-1.8℃/min、约-1.2℃/min至约-2℃/min、约-1.2℃/min至约-2.5℃/min、约-1.4℃/min至约-1.6℃/min、约-1.4℃/min至约-1.8℃/min、约-1.4℃/min至约-2℃/min、约-1.4℃/min至约-2.5℃/min、约-1.6℃/min至约-1.8℃/min、约-1.6℃/min至约-2℃/min、约-1.6℃/min至约-2.5℃/min、约-1.8℃/min至约-2℃/min、约-1.8℃/min至约-2.5℃/min，或者约-2℃/min至约-2.5℃/min。在一些实施方案中，亚冷冻速率为约-0.1℃/min、约-0.2℃/min、约-0.4℃/min、约-0.6℃/min、约-0.8℃/min、约-1℃/min、约-1.2℃/min、约-1.4℃/min、约-1.6℃/min、约-1.8℃/min、约-2℃/min或约-2.5℃/min。在一些实施方案中，亚冷冻速率为至少约-0.1℃/min、约-0.2℃/min、约-0.4℃/min、约-0.6℃/min、约-0.8℃/min、约-1℃/min、约-1.2℃/min、约-1.4℃/min、约-1.6℃/min、约-1.8℃/min或约-2℃/min。在一些实施方案中，亚冷冻速率为至多约-0.2℃/min、约-0.4℃/min、约-0.6℃/min、约-0.8℃/min、约-1℃/min、约-1.2℃/min、约-1.4℃/min、约-1.6℃/min、约-1.8℃/min、约-2℃/min或约-2.5℃/min。在一些实施方案中，亚冷冻速率可以为-1.36℃/min。在一些实施方案中，亚冷冻速率包括-1.13℃/min至-1.62℃/min的范围。
在一些实施方案中，其中给定生物样品的超冷冻速率、亚冷冻速率和成核温度是未知的，本文所述的低温储存方法还包括确定生物样品的超冷冻速率、亚冷冻速率和成核温度。在一些实施方案中，超冷冻速率、亚冷冻速率和成核温度从生物样品的冷冻曲线得出。在一些实施方案中，通过使用计算机对冷冻曲线进行建模。在一些实施方案中，按照本文所述的程序和方法根据经验来确定冷冻曲线(例如实施例5)。
在一些实施方案中，细胞的解冻后存活率(例如，细胞的功能存活率)为至少约60％至约95％。在一些实施方案中，细胞的解冻后存活率为至少约60％至约70％、约60％至约80％、约60％至约90％、约60％至约95％、约70％至约80％、约70％至约90％、约70％至约95％、约80％至约90％、约80％至约95％，或者约90％至约95％。在一些实施方案中，细胞的解冻后存活率为至少约60％、约70％、约80％、约90％或约95％。在一些实施方案中，细胞的解冻后存活率为至少约60％、约70％、约80％或约90％。在一些实施方案中，细胞的解冻后存活率为至多约70％、约80％、约90％或约95％。在一些实施方案中，细胞的解冻后存活率为至少60％。在一些实施方案中，细胞的解冻后存活率为至少70％。在一些实施方案中，细胞的解冻后存活率为至少80％。在一些实施方案中，细胞的解冻后存活率为至少90％。存活率可以涉及功能存活率(其衡量细胞增殖的能力)和常规存活率(其涉及活细胞的数量或百分比，例如，如通过台盼蓝测量)之一或二者。
在一些实施方案中，(c)发生在一个或多个冷冻机中。在一些实施方案中，第一容器和第二容器设置在一个或多个冷冻机中的第一冷冻机中。在一些实施方案中，第一容器被容纳在一个或多个冷冻机中的第一冷冻机中，并且第二容器被容纳在一个或多个冷冻机中的第二冷冻机中。在一些实施方案中，一个或多个冷冻机包括静态冷冻机。在一些实施方案中，第一冷冻机、第二冷冻机或二者是静态冷冻机。前述权利要求中任一项所述的方法，其中一个或多个冷冻机包括控速冷冻机。在一些实施方案中，第一冷冻机、第二冷冻机或二者是控速冷冻机。在一些实施方案中，一个或多个冷冻机被设定在约-70℃至-90℃。在一些实施方案中，一个或多个冷冻机被设定在-80℃。在一些实施方案中，一个或多个冷冻机被设定在-86℃。在一些情况中，一个或多个冷冻机可以被设定在约-100℃至约-60℃的温度范围。在一些情况中，冷冻机可以被设定在以下温度范围：约-60℃至约-65℃、约-60℃至约-70℃、约-60℃至约-75℃、约-60℃至约-80℃、约-60℃至约-82℃、约-60℃至约-84℃、约-60℃至约-86℃、约-60℃至约-88℃、约-60℃至约-90℃、约-60℃至约-95℃、约-60℃至约-100℃、约-65℃至约-70℃、约-65℃至约-75℃、约-65℃至约-80℃、约-65℃至约-82℃、约-65℃至约-84℃、约-65℃至约-86℃、约-65℃至约-88℃、约-65℃至约-90℃、约-65℃至约-95℃、约-65℃至约-100℃、约-70℃至约-75℃、约-70℃至约-80℃、约-70℃至约-82℃、约-70℃至约-84℃、约-70℃至约-86℃、约-70℃至约-88℃、约-70℃至约-90℃、约-70℃至约-95℃、约-70℃至约-100℃、约-75℃至约-80℃、约-75℃至约-82℃、约-75℃至约-84℃、约-75℃至约-86℃、约-75℃至约-88℃、约-75℃至约-90℃、约-75℃至约-95℃、约-75℃至约-100℃、约-80℃至约-82℃、约-80℃至约-84℃、约-80℃至约-86℃、约-80℃至约-88℃、约-80℃至约-90℃、约-80℃至约-95℃、约-80℃至约-100℃、约-82℃至约-84℃、约-82℃至约-86℃、约-82℃至约-88℃、约-82℃至约-90℃、约-82℃至约-95℃、约-82℃至约-100℃、约-84℃至约-86℃、约-84℃至约-88℃、约-84℃至约-90℃、约-84℃至约-95℃、约-84℃至约-100℃、约-86℃至约-88℃、约-86℃至约-90℃、约-86℃至约-95℃、约-86℃至约-100℃、约-88℃至约-90℃、约-88℃至约-95℃、约-88℃至约-100℃、约-90℃至约-95℃、约-90℃至约-100℃，或者约-95℃至约-100℃。在一些情况中，冷冻机可以被设定在以下温度范围：约-60℃、约-65℃、约-70℃、约-75℃、约-80℃、约-82℃、约-84℃、约-86℃、约-88℃、约-90℃、约-95℃或约-100℃。在一些情况中，冷冻机可以被设定在以下温度范围：至少约-60℃、约-65℃、约-70℃、约-75℃、约-80℃、约-82℃、约-84℃、约-86℃、约-88℃、约-90℃或约-95℃。在一些情况中，冷冻机可以被设定在以下温度范围：至多约-65℃、约-70℃、约-75℃、约-80℃、约-82℃、约-84℃、约-86℃、约-88℃、约-90℃、约-95℃或约-100℃。
在一些情况中，当置于设定在-80℃的静态冷冻机中时，冷冻低温保藏袋和代用小瓶的效果较差。反而，当静态冷冻机设定为低于-80℃的温度(例如，-86℃)时获得更好的结果。
在一些实施方案中，第二体积被直接置于隔热容器中，使得每个小瓶紧邻于隔热容器的隔热材料。在一些实施方案中，所述方法还包括将第一体积布置在静态冷冻机内，使得第一体积与一个或多个冷冻机的壁不接触。在一些实施方案中，第一体积中的包含细胞或其衍生物的生物样品和第二体积中的包含细胞或其衍生物的生物样品经受相同的冷却速率。在一些实施方案中，细胞是干细胞或免疫细胞。在一些实施方案中，干细胞包括造血干细胞(HSC)、间充质干细胞(MSC)或二者。在一些实施方案中，生物样品包含全骨髓。在一些实施方案中，生物样品包含动员的骨髓细胞，即，由用骨髓动员剂(例如，集落刺激因子(CSF))处理供体而产生。在一些实施方案中，生物样品包含一种或多种器官、血液或二者。在一些实施方案中，免疫细胞包括T细胞。在一些实施方案中，血液是脐带血或外周血。在一些实施方案中，生物样品包含血浆或血清。在一些实施方案中，HSC包括CD34+细胞。设想到容器可以是多种形式。例如，生物样品或其衍生物可以被容纳在1ml至5ml体积的袋或0.1至15ml体积的小瓶中。在优选的实施方案中，含有小于15ml的生物样品的样品贮藏在冷冻机内的隔热容器(例如冷却箱)中。
在一些实施方案中，本文描述了一种用于低温保藏骨髓或骨髓细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法利用本文所述的系统。在一些实施方案中，所述方法包括加工骨以获得骨髓或其衍生物，从而获得骨髓细胞。在一些情况中，骨髓细胞可以是可从骨髓中分离的任何细胞。在一些实施方案中，骨髓细胞可以是造血干细胞。在一些实施方案中，骨髓细胞可以是间充质干细胞。在一些实施方案中，骨髓或骨髓细胞在包括以下的冷冻速率下被低温保藏：至少-0.1℃/min、-0.2℃/min、-0.5℃/min、-1℃/min、-1.5℃/min、-2℃/min、-2.5℃/min、-3℃/min、-3.5℃/min、-4℃/min、-4.5℃/min、-5℃/min、-5.5℃/min、-6℃/min、-7℃/min、-7.5℃/min、-8℃/min、-8.5℃/min、-9℃/min、-9.5℃/min、-10℃/min、-11℃/min、-12℃/min、-13℃/min、-14℃/min、-15℃/min、-20℃/min或更高速率。优选地，低温保藏袋和代用小瓶在-1℃至-5℃的速率下冷却。
在一些实施方案中，冷冻速率包括通过使骨髓或骨髓细胞与温度计直接接触而测量的温度下降。在一些实施方案中，冷冻速率包括在与骨髓或骨髓细胞紧邻的微环境或环境中测量的温度下降。在一些实施方案中，冷冻速率包括在冷冻设备(例如冷冻袋、低温保藏袋、冷冻管、低温槽、冷冻盒、冷冻机或容纳液氮的容器)中测量的温度下降。
在一些实施方案中，与未通过本文所述的冷冻速率低温保藏的骨髓细胞相比，本文所述的低温保藏骨髓或骨髓细胞的方法增加解冻后骨髓细胞的产量。在一些情形中，与未通过本文所述的冷冻速率低温保藏的骨髓细胞的产量相比，通过本文所述的冷冻速率低温保藏的骨髓细胞的产量增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或更高。在一些实施方案中，与未通过本文所述的冷冻速率低温保藏的骨髓细胞相比，本文所述的低温保藏骨髓或骨髓细胞的方法增加解冻后骨髓细胞的存活率。在一些情形中，与未通过本文所述的冷冻速率低温保藏的骨髓细胞的存活率相比，通过本文所述的冷冻速率低温保藏的骨髓细胞的存活率增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％.90％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或更高。在一些实施方案中，与未通过本文所述的冷冻速率低温保藏的CD34+骨髓细胞的数量相比，本文所述的低温保藏骨髓或骨髓细胞的方法增加解冻后CD34+骨髓细胞的数量。在一些情形中，与未通过本文所述的冷冻速率低温保藏的CD34+骨髓细胞的数量相比，通过本文所述的冷冻速率低温保藏的CD34+骨髓细胞的数量增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％.90％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或更高。在一些实施方案中，与未通过本文所述的冷冻速率低温保藏的CD45+骨髓细胞的数量相比，本文所述的低温保藏骨髓或骨髓细胞的方法增加解冻后CD45+骨髓细胞的数量。在一些情形中，与未通过本文所述的冷冻速率低温保藏的CD45+骨髓细胞的数量相比，通过本文所述的冷冻速率低温保藏的CD45+骨髓细胞的数量增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或更高。
在一些实施方案中，与已知的低温保藏方案相比，在解冻利用本文所述的方案冷冻的样品(例如实施例5)后，样品包含增加量的存活的CD34+细胞。在一些实施方案中，在解冻的样品中存活的CD34+细胞的百分比为至少约70％至约95％。在一些实施方案中，在解冻的样品中存活的CD34+细胞的百分比为至少约70％至约75％、约70％至约80％、约70％至约85％、约70％至约90％、约70％至约95％、约75％至约80％、约75％至约85％、约75％至约90％、约75％至约95％、约80％至约85％、约80％至约90％、约80％至约95％、约85％至约90％、约85％至约95％，或者约90％至约95％。在一些实施方案中，在解冻的样品中存活的CD34+细胞的百分比为至少约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，在解冻的样品中存活的CD34+细胞的百分比为至少约70％、约75％、约80％、约85％或约90％。在一些实施方案中，在解冻的样品中存活的CD34+细胞的百分比为至多约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。
用于获得、生产、低温保藏和/或贮藏用于本公开内容的方法中的包含造血干细胞的骨髓产品的示例性方法可以在PCT/US2020/025778和在Woods等人，“Ischemiaconsiderations for the development of an organ and tissue donor derived bonemarrow bank.”J Transl Med 18,300(2020)中描述；其各自的内容通过引用而以其整体并入。
用于回收骨髓的自动化系统
本公开内容设想了一种用于回收骨髓以及甚至从骨髓中选择细胞的自动化过程。在一个方面，自动化系统209包括如图7A-7B所描述的顺序站。自动化过程的第一站210对VB进行清理，以去除所有软组织。与每次对一个VB进行操作的手动过程相反，自动化过程被配置为清理整个供体VB组(其可以是至少十个椎体)。VB被安置在架子或托盘212上，后者被配置为支撑来自给定供体的椎体组。如图8A-8B所示，托盘212被置于外壳215的转移轨道216上，托盘自动或手动地推进到外壳的内部。外壳215支撑多个液力喷射220，将高压和高速的盐水喷射引导到VB上。在已知的手动过程中，手动液力喷射以较低的速度和压力运行，将洗涤剂流引导到VB上。在手动过程中，需要洗涤剂来清除VB的软组织。相反，本公开内容的自动化清洁站210使用盐水介质，水喷射的速度和压力足以将所有软组织从VB上去除。本公开内容的自动化清洁站包括被配置为产生在不同距离处产生高集中冲击力的直接流或窄“V”水/盐水喷射的喷射器。为了实现对VB的良好覆盖，该装置包括许多直接喷射器，其在相对于VB的不同方向上紧密间隔，由此允许独立于该装置中VB的位置而实现均匀清洁。在图8A的说明性实施方案中，液力喷射被设置在上排220和下排221。"V"形喷射器以不同的角度排列，以实现对VB表面的全面覆盖。附加地或可替代地，液力喷射220、221可以被配置成在VB的托盘上方摆动，以确保完全覆盖。
如图8B所示，在清理站210的出口处布置了可视化装置225，该装置可操作以可视化和解释离开清理站的VB，以确定是否已经去除所有的软组织。如果否，则VB就沿着轨道216返回到外壳中，以便进一步进行液力喷射加工。设想了可以设置控制器(未显示)来控制托盘212沿着轨道216的移动，并解释由可视化设备225产生的信号。可视化装置可以包括获得VB图像的照相机，控制器可以包括能够识别所获取图像中的软组织的成像软件。在液力喷射清理过程结束时，可以将染料施加于经清洁的VB，其中染料被软组织吸收，而不被骨吸收。因此，该染料可以提供对比度，以促进从骨辨别任何剩余的软组织。可视化装置225可以被配置为移动拍摄VB各处，例如通过沿着框架226平移，以及通过平移框架，以便从所有角度观察VB。
回到图9A-9B，一旦确定VB被清除了所有的软组织，然后就将经清理的VB通过传送机230供至自动化研磨站240，以产生适当尺寸的碎片以便翻滚和最终细胞提取。上述手动的“切块”过程可能是可变的、耗时的，而且对操作者而言可能不安全。该自动化系统包括研磨站，其组合将VB“切块”(即，将VB切成小块)和研磨切块的VB以将VB减小到2-3mm碎片。轨道216和托盘212可以被连接，以将经清理的VB沉积到传送机230上，其然后自动将VB转移到研磨站240的输入料斗242，更详细地显示在图9A-9B。如图9A所示，VB被引导通过初磨切割器模块244，然后通过漏斗246到达精磨切割器模块248。如图9B所示，初磨切割器模块242包括相对的旋转研磨机245，它们分隔开预定的间隙，例如5-8mm间隙，以便将进入的VB研磨成粗尺寸的段。粗磨段被供至细磨切割器模块248，其中设有较小直径的研磨机249。细磨机249分隔开较小的间隙，大约2-3mm，以产生细磨的VB段。如图9A所示，漏斗246将粗磨的段传送到第二研磨机248，而漏斗250将细磨的VB段引导到支撑在板253上的收集盘252。在研磨操作期间，可以将测量体积的含有DNA酶的加工/重悬介质引导通过上料斗，到达研磨切割器上。这种介质可以在研磨站240的操作期间被手动地导入，或者可以通过纳入料斗242中的喷嘴自动实施。
细磨的VB段和加工介质被收集在收集盘252中，并且板253可以被移动到筛分站260(图8A-8B)，无论手动地或是自动地。一旦在筛分站260，盘252的内容物落入筛筒单元中，其包括两个12"直径过滤筛，40号筛262在上面，后随更细的80号筛264，如图10所描述。漏斗266将过滤的内容物导向收集容器268。将由过滤器保留的研磨屑在筛分站260内用不包含DNA酶的加工/重悬介质进行冲洗。可以对收集容器268中的液态骨髓产品进行分析，以确定细胞含量，然后被浓缩和包装在适当的体积中以进行低温保藏，如下文所述。或者，部分或全部经加工的骨髓可以通过使用自动化细胞选择方法来进一步加工用于专门的细胞产品，例如CD34+细胞。因为用这种方法可以从单个器官供体中回收大体积的细胞，一个供体可以产生多种产品类型。此外，由于来源是原始骨髓(相对于G-CSF动员的外周血而言)，细胞产品将耐受低温保藏加工。
在一种修改方案中，来自研磨站240或筛分站260的输出物可以自动地供至收集袋以进行低温处理。在此修改方案中，下层漏斗250可以被配置为将内容物导向与无菌袋连接的流体管线。蠕动泵可以与流体管线接合，以将输出物从研磨站泵送到无菌袋中。类似的装置可以与筛分站的漏斗266接合。
收集容器268的内容物(其基本上是骨髓浆料)被手动或自动地传送到相邻的滚筒站270，该滚筒站包括机械滚筒272和一次性大容器274，该容器可容纳10个经加工的VB和相关的加工/重悬介质的全部内容物。滚筒272具有用于搅动研磨浆料的桨，以机械地释放细胞。当翻滚循环完成时，滚筒的内容物通过筛仓倒入容器274中。容器274的内容物可以被进一步加工或准备以供低温贮藏。
关于包装的其他教导公开在Woods,E.J.和S Thirumala.“Packagingconsiderations for biopreservation.”Transfusion Medicine and Hemotherapy 38:149-156(2011)中；其内容通过引用而以其整体并入。
分离CD34+细胞
在一些方面中，本文描述了一种加工(例如分离)从骨髓或骨髓衍生物中获得的CD34+细胞的方法。在一些情况中，骨髓或骨髓衍生物可以是新鲜(例如从未被冷冻)的或从先前冷冻状态解冻的。在一些实施方案中，骨髓或骨髓衍生物可以通过本文所述的方法和系统进行研磨。在一些实施方案中，经研磨的骨髓或骨髓细胞可以与本文所述的稳定化缓冲剂接触。在一些实施方案中，稳定化防止骨髓细胞的聚集体的形成。在一些情形中，在稳定化缓冲剂中接触和悬浮的骨髓细胞可以通过附接至抗体例如缀合的抗体而被分离。例如，表达CD34+的骨髓细胞可以通过使骨髓细胞接触与铁缀合的CD34抗体而被分离和富集，其中表达CD34的骨髓细胞随后被磁性分离柱(例如)捕集。不表达CD34的骨髓细胞可以被洗去。捕集的CD34+骨髓细胞可以通过消除磁场和洗脱靶向的CD34+骨髓细胞来收集。这种方法不需要用Ficoll梯度来分离骨髓细胞。
本公开内容中描述的方面包括一种用于加工从骨髓或其衍生物中获得的CD34+细胞群的方法，其中所述骨髓或其衍生物源自于死亡供体，所述方法包括：从死亡供体中获得骨或骨碎片，任选地将所述骨加工成骨碎片；从骨或骨碎片中提取骨髓或其衍生物；以及使骨髓或其衍生物与稳定化缓冲剂接触，其中所述稳定化缓冲剂包含大于约3U/ml的核酸酶；进行CD34+细胞分离测定法以产生包含CD34+细胞群的细胞组合物，其中包含CD34+细胞群的组合物包含至少约80,000个CD34+细胞/750μl的与稳定化缓冲剂接触的骨髓或其衍生物。在一些实施方案中，至少约80,000个CD34+细胞/750μl的与稳定化缓冲剂接触的骨髓或其衍生物包含至少70％的存活的CD34+细胞。在一些实施方案中，至少约80,000个CD34+细胞/750μl的与稳定化缓冲剂接触的骨髓或其衍生物包含至少80％的存活的CD34+细胞。在一些实施方案中，至少约80,000个CD34+细胞/750μl的与稳定化缓冲剂接触的骨髓或其衍生物包含至少90％的存活的CD34+细胞。
本公开内容的另一方面包括一种稳定化缓冲剂，其包含：至少5U/ml的抗凝剂；和大于3U/ml的核酸酶。在一些实施方案中，稳定化缓冲剂包含大于约5U/ml的核酸酶。在一些实施方案中，稳定化缓冲剂包含大于约10U/ml的核酸酶。在一些实施方案中，稳定化缓冲剂包含大于约15U/ml的核酸酶。在一些实施方案中，稳定化缓冲剂包含大于约20U/ml的核酸酶。在一些实施方案中，稳定化缓冲剂包含约20U/ml的核酸酶。在一些实施方案中，核酸酶是或/>在一些实施方案中，稳定化缓冲剂还包含大于约10U/ml的抗凝剂。在一些实施方案中，稳定化缓冲剂还包含约10U/ml的抗凝剂。在一些实施方案中，抗凝剂是肝素。在一些实施方案中，稳定化缓冲剂还包含人血清白蛋白(HSA)。在一些实施方案中，稳定化缓冲剂包含0.5％HSA。
在一些实施方案中，稳定化缓冲剂包含核酸酶。在一些实施方案中，核酸酶是或/>在一些实施方案中，稳定化缓冲剂包含约3U/ml、4U/ml、5U/ml、6U/ml、7U/ml、8U/ml、9U/ml、10U/ml、11U/ml、12U/ml、13U/ml、14U/ml、15U/ml、16U/ml、17U/ml、18U/ml、19U/ml、20U/ml、21U/ml、22U/ml、23U/ml、24U/ml、25U/ml、26U/ml、27U/ml、28U/ml、29U/ml、30U/ml、50U/ml、100U/ml、200U/ml或更多U/ml的核酸酶。在一些实施方案中，稳定化缓冲剂包含抗凝剂。在一些情况中，抗凝剂是肝素。在一些情形中，稳定化缓冲剂包含约0.1U/ml、0.2U/ml、0.3U/ml、0.4U/ml、0.5U/ml、0.6U/ml、0.7U/ml、0.8U/ml、0.9U/ml、1.0U/ml、2.0U/ml、3.0U/ml、4.0U/ml、5.0U/ml、6.0U/ml、7.0U/ml、8.0U/ml、9.0U/ml、10U/ml、11U/ml、12U/ml、13U/ml、14U/ml、15U/ml、16U/ml、17U/ml、18U/ml、19U/ml、20U/ml、21U/ml、22U/ml、23U/ml、24U/ml、25U/ml、26U/ml、27U/ml、28U/ml、29U/ml、30U/ml、50U/ml、100U/ml、200U/ml或更多U/ml的抗凝剂。
在多种实施方案中，稳定化缓冲剂缺少肝素。
在一些实施方案中，稳定化缓冲剂包含约0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％HSA、0.1％HSA、0.2％HSA、0.3％HSA、0.4％HSA、0.5％HSA、0.6％HSA、0.7％HSA、0.8％HSA、0.9％HSA、1.0％HSA、1.5％HSA、2％HSA、2.5％HSA、5％HSA、10％HSA、20％HSA或更多HSA。
在一些实施方案中，本文描述了一种用于加工骨髓以获得骨髓细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使骨髓或骨髓细胞与本文所述的稳定化缓冲剂接触。
本公开内容的另一方面包括一种用于加工骨髓或其衍生物中包含的CD34+细胞群的方法，其中所述骨髓或其衍生物源自于死亡供体，所述方法包括：从死亡供体中获得骨或骨碎片，任选地将所述骨加工成骨碎片；从骨或骨碎片中提取骨髓或其衍生物；以及使骨髓或其衍生物与稳定化缓冲剂接触，其中所述稳定化缓冲剂包含大于约3U/ml的核酸酶；进行CD34+细胞分离测定法以产生包含CD34+细胞群的细胞组合物，其中包含CD34+细胞群的组合物包含至少约80,000个CD34+细胞/750μl的与稳定化缓冲剂接触的骨髓或其衍生物。
在一些实施方案中，与在不存在稳定化缓冲剂的情况下加工的骨髓细胞的产量相比，本文所述的用稳定化缓冲剂加工或接触骨髓或骨髓细胞增加了从本文所述的方法获得的骨髓细胞的产量。在一些情形中，与在不存在稳定化缓冲剂的情况下加工的骨髓细胞的产量相比，本文所述的用稳定化缓冲剂加工或接触骨髓或骨髓细胞使骨髓细胞的产量增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或更高。在一些实施方案中，与在不存在稳定化缓冲剂的情况下加工的骨髓细胞的存活率相比，本文所述的用稳定化缓冲剂加工或接触骨髓或骨髓细胞增加了从本文所述的方法获得的骨髓细胞的存活率。在一些情形中，与在不存在稳定化缓冲剂的情况下加工的骨髓细胞的存活率相比，本文所述的用稳定化缓冲剂加工或接触骨髓或骨髓细胞使骨髓细胞的存活率增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％.90％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或更高。
在一些实施方案中，与在不存在稳定化缓冲剂的情况下加工的CD34+骨髓细胞的数量相比，本文所述的用稳定化缓冲剂加工或接触骨髓或骨髓细胞增加CD34+骨髓细胞的数量。在一些情况中，与在不存在稳定化缓冲剂的情况下加工而获得的CD34+骨髓的数量相比，用稳定化缓冲剂加工而获得的CD34+骨髓的数量增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或更高。在一些实施方案中，与在不存在稳定化缓冲剂的情况下加工的CD45+骨髓细胞的数量相比，本文所述的用稳定化缓冲剂加工或接触骨髓或骨髓细胞增加CD45+骨髓细胞的数量。在一些情况中，与在不存在稳定化缓冲剂的情况下加工而获得的CD45+骨髓的数量相比，用稳定化缓冲剂加工而获得的CD45+骨髓的数量增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或更高。
在一些实施方案中，与从已知CD34+分离方法产生的细胞组合物相比，本文所述的包含从用稳定化缓冲剂加工的骨髓样品而得的CD34+细胞的细胞组合物具有增加量的CD34+细胞。在一些实施方案中，从与本文所述的稳定化缓冲剂接触的骨髓样品中分离的CD34+细胞量为至少约70,000个CD34+细胞/750μl的与本文所述的稳定化缓冲剂接触的骨髓或其衍生物。在一些实施方案中，从与本文所述的稳定化缓冲剂接触的骨髓样品中分离的CD34+细胞量为至少约70,000个细胞/750μl至约100,000个细胞/750μl。在一些实施方案中，从与本文所述的稳定化缓冲剂接触的骨髓样品中分离的CD34+细胞量为至少约70,000个细胞/750μl至约75,000个细胞/750μl、约70,000个细胞/750μl至约80,000个细胞/750μl、约70,000个细胞/750μl至约85,000个细胞/750μl、约70,000个细胞/750μl至约90,000个细胞/750μl、约70,000个细胞/750μl至约95,000个细胞/750μl、约70,000个细胞/750μl至约100,000个细胞/750μl、约75,000个细胞/750μl至约80,000个细胞/750μl、约75,000个细胞/750μl至约85,000个细胞/750μl、约75,000个细胞/750μl至约90,000个细胞/750μl、约75,000个细胞/750μl至约95,000个细胞/750μl、约75,000个细胞/750μl至约100,000个细胞/750μl、约80,000个细胞/750μl至约85,000个细胞/750μl、约80,000个细胞/750μl至约90,000个细胞/750μl、约80,000个细胞/750μl至约95,000个细胞/750μl、约80,000个细胞/750μl至约100,000个细胞/750μl、约85,000个细胞/750μl至约90,000个细胞/750μl、约85,000个细胞/750μl至约95,000个细胞/750μl、约85,000个细胞/750μl至约100,000个细胞/750μl、约90,000个细胞/750μl至约95,000个细胞/750μl、约90,000个细胞/750μl至约100,000个细胞/750μl，或者约95,000个细胞/750μl至约100,000个细胞/750μl。在一些实施方案中，从与本文所述的稳定化缓冲剂接触的骨髓样品中分离的CD34+细胞量为至少约70,000个细胞/750μl、约75,000个细胞/750μl、约80,000个细胞/750μl、约85,000个细胞/750μl、约90,000个细胞/750μl、约95,000个细胞/750μl或约100,000个细胞/750μl。在一些实施方案中，从与本文所述的稳定化缓冲剂接触的骨髓样品中分离的CD34+细胞量为至少约70,000个细胞/750μl、约75,000个细胞/750μl、约80,000个细胞/750μl、约85,000个细胞/750μl、约90,000个细胞/750μl或约95,000个细胞/750μl。在一些实施方案中，从与本文所述的稳定化缓冲剂接触的骨髓样品中分离的CD34+细胞量为至多约75,000个细胞/750μl、约80,000个细胞/750μl、约85,000个细胞/750μl、约90,000个细胞/750μl、约95,000个细胞/750μl或约100,000个细胞/750μl。
在一些实施方案中，与从已知CD34+分离方法产生的细胞组合物相比，本文所述的从用稳定化缓冲剂加工的骨髓样品而得的CD34+细胞还表现出更高的存活率。
在一些实施方案中，从与本文所述的稳定化缓冲剂接触的骨髓样品中分离的CD34+细胞量包含至少约70％至约95％的存活率百分比。在一些实施方案中，从与本文所述的稳定化缓冲剂接触的骨髓样品中分离的CD34+细胞量包含至少约70％至约95％的存活率百分比。在一些实施方案中，从与本文所述的稳定化缓冲剂接触的骨髓样品中分离的CD34+细胞量包含至少约70％至约75％、约70％至约80％、约70％至约85％、约70％至约90％、约70％至约95％、约75％至约80％、约75％至约85％、约75％至约90％、约75％至约95％、约80％至约85％、约80％至约90％、约80％至约95％、约85％至约90％、约85％至约95％或者约90％至约95％的存活率百分比。在一些实施方案中，从与本文所述的稳定化缓冲剂接触的骨髓样品中分离的CD34+细胞量包含至少约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％的存活率百分比。在一些实施方案中，从与本文所述的稳定化缓冲剂接触的骨髓样品中分离的CD34+细胞量包含至少约70％、约75％、约80％、约85％或约90％的存活率百分比。在一些实施方案中，从与本文所述的稳定化缓冲剂接触的骨髓样品中分离的CD34+细胞量包含至多约75％、约80％、约85％、约90％或约95％的存活率百分比。存活率可以涉及功能存活率(其衡量细胞增殖的能力)和常规存活率(其涉及活细胞的数量或百分比，例如，如通过台盼蓝测量)之一或二者。
在本公开内容的方面中，提供了一种通过使用密度减小的Ficoll和免疫磁性CD34+细胞分离试剂盒从死亡供体骨髓中选择表达CD34的(CD34+)细胞的方法。出人意料地，已发现在CD34选择之前通过使用密度减小的Ficoll进行细胞分离有益于从新鲜制备的死亡供体骨髓中获得高纯度和活力的CD45/CD34+细胞。在另一方面，已发现，对于从解冻的低温保藏的死亡供体骨髓中选择CD45/CD34+细胞，Ficoll在常规密度下是最佳的。
如上所述加工从最近死亡供体中获得的椎骨切片。因此，在一个实施方案中，将骨清除掉所有软组织，而后切成小块，随即将其浸没在500ml研磨介质中。研磨介质可以是PLASMA-LYTETM A注射液，pH 7.4，多种电解质，注射液1型USP(PLASMA-LYTETM)，其包含2.5％人血清白蛋白(HSA)、3U/ml denarase和10U/ml肝素。将切片的VB通过使用骨研磨机进行研磨，过滤以及用冲洗介质(例如PLASMA-LYTETM，含有2.5％HAS)冲洗。将整个细胞悬浮液离心以使细胞浓缩至2-3x108/ml并将细胞浓缩物提取。所得BM制剂的部分或全部可以立即用于CD34选择，同时可以将剩余物准备进行低温保藏。低温保藏的部分涉及向BM细胞添加终浓度10％的DMSO和5％的HSA，以及通过被动冷却或通过在约-1℃/min的速率下受控冷却而使该制剂达到-86℃，其后，将低温保藏的部分浸入液氮中。
为了选择CD34+细胞，使用新加工的BM制剂，或者将先前低温保藏的部分解冻以供使用。将Ficoll-Paque PLUS添加至BM制剂以分离骨髓的期望的CD34+细胞组分。已发现，为了从低温保藏的骨髓中选择细胞，Ficoll的常规密度1.077g/ml产生可接受的结果。然而，在本公开内容的一个方面，为了从新鲜制备的死亡供体骨髓中选择细胞，将Ficoll密度从常规密度减小。具体地，减小该密度是通过将Ficoll-Paque PLUS(密度1.077g/mL,GECompany)与Plasma Lyte-A Injection pH 7.4(Baxter Healthcare 2B2544X)以特定比例混合而获得小于1.077g/ml，特别是1.063-1.052g/ml的总密度。在一个具体实施方案中，考虑到CD34+细胞的量、存活率和纯度，对于分离CD34+细胞而言，已发现1.063g/ml的密度是最佳的。
在一个实施方案中，将5ml的1.063g/ml密度Ficoll溶液移液至15-ml离心管中，并使从死亡供体的VB中产生的BM溶液小心地在Ficoll梯度上分层。将所述管在室温下以400g无中断离心30min。在离心之后，小心地收集血沉棕黄层细胞，将细胞在包含0.5％HSA和2mM乙二胺四乙酸(EDTA)(MACS缓冲剂，Miltenyi)的磷酸盐缓冲的盐水(PBS)中洗涤。在一个具体实施方案中，在400g下进行离心5min，使所得细胞沉淀重悬在10ml PBS中，然后在400g下第二次离心5min。
可以使用Sysmex XP-300对分离的血沉棕黄层中的成核细胞进行计数。Cellometer Vision(Nexcellom)或流式细胞仪可以用于确定纯化的CD34细胞的细胞计数。可以将20微升的AOPI添加至20微升的细胞，在混合后，可以确定总存活细胞。可以根据生产商的方案，使用CliniMACS系统(Miltenyi,Bergisch Gladbach,Germany)或EasySep CD34试剂盒(Stemcell Technologies,Vancouver,BC,Canada)通过阳性免疫分离法来选择CD34+细胞。出人意料地，根据在各种Ficoll密度下测试，已确定本公开内容中设想的较低Ficoll密度(即，1.063-1.052gm/ml相比于常规1.077gm/ml密度)导致更加优化的细胞回收。优化是基于所选择的CD34细胞的纯度、存活率和产量。优选目标>90％纯度和>90％的存活的CD34+细胞。虽然较低的Ficoll密度导致更大的纯度和更少的死亡细胞，但是出人意料地发现，通过使用较低Ficoll密度来制备血沉棕黄层，选择之前死亡供体全骨髓中存在的CD34+细胞中的大部分会损失。因此，在常规Ficoll密度梯度下达成的CD45/CD34+细胞的高存活率和纯度还导致产量的大损失(输入CD34+细胞的约60％损失)。
因此，根据本公开内容的一个方面，对于新鲜制备的，用于选择>90％纯度和存活率的CD45/CD34+的Ficoll的最佳密度为077，特别是1.063-1.052。在与常规Ficoll密度法相似的纯度和细胞存活率下，该Ficoll密度提供更高的CD45/CD34+细胞产量。
在本公开内容的另一方面，利用上述减小的密度Ficoll-Paque，可以从新鲜制备的死亡供体骨髓中初始地获取CD34+细胞。BM可以被低温冷冻，然后可以利用常规密度Ficoll-Paque而随后获取CD34+细胞。在冷冻之前使用修改的Ficoll密度或者在冷冻和解冻之后使用常规Ficoll密度，此方法基本上允许从死亡供体骨髓中选择性回收细胞。
从经加工的骨髓中回收MSC
骨髓是间充质基质/干细胞(MSC)的熟知来源，其可以从使用上述方法获得的骨髓中收集。MSC是自我更新的多能祖细胞，具有分化为中胚层起源的细胞类型(诸如脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞)的多谱系潜力。此外，MSC可以迁移至炎症部位并且通过与固有免疫系统和适应性免疫系统二者相关的淋巴细胞之间的相互作用而发挥有效的免疫抑制性和抗炎性效果。MSC可用于治疗成骨不全、软骨缺陷、心肌梗塞、克罗恩病、多发性硬化、自身免疫性疾病，例如红斑狼疮、肝硬化、骨关节炎和类风湿性关节炎。匹配的HSC/MSC单位，可用于共移植以治疗移植物抗宿主病(GVHD)，并用于造血干细胞移植支持。
在本文公开的系统和方法的另一个特征中，提供了一种从酶解的椎体(VB)骨碎片中回收间充质干细胞(MSC)的方法，该骨碎片是本文所述方法的VB研磨和洗脱的副产品。在这种方法中，胶原酶和中性蛋白酶的混合物用来获得椎骨粘附的MSC(vBA-MSC)的可能的最高产量。MSC可以从根据本公开内容随后加工的低温保藏的VB骨碎片中回收。在一个具体方面，包含两种活性异形体的重组溶组织梭菌(Clostridium histolyticum)胶原酶以有效量用于MSC提取过程中。在Mesencult培养基的存在下，将通过消化VB骨碎片而释放的细胞混合物在组织包被的塑料上进行培养，以选择增殖性vBA-MSC。新鲜消化的制剂以及不同传代的vBA-MSC可以通过流式细胞术、成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)潜力、群体倍增时间(PDT)和体外三谱系(成脂肪、成软骨和成骨)分化进行表征。在一些实施方案中，间充质干细胞可以在增补有人血小板裂解物和表皮生长因子和/或成纤维细胞生长因子的Alpha-MEM中进行回收或培养。
因此，本公开内容设想了一种使用纯化的胶原酶和中性蛋白酶的组合来优化对椎骨碎片的消化和MSC回收的方法。在一个具体实施方案中，胶原酶是DE胶原酶(Vitacyte)，其由纯化的溶组织梭菌胶原酶和多粘类芽孢杆菌(Paneibacillus polymyxa)中性蛋白酶构成。根据本公开内容的一个方面，确定了最佳中性蛋白酶浓度和胶原酶浓度(C1和C2胶原酶)以及溶液体积(ml)与骨碎片重量(mg)的最佳比例。
在一些实施方案中，胶原酶可以包括溶组织梭菌，其还包括两种活性异形体C1和C2。在一些实施方案中，包括异形体C1和C2的一种或多种胶原酶可以按照包含比胶原酶异形体C2更多的胶原酶异形体C1的比例存在于消化溶液中。在一些实施方案中，胶原酶异形体C1与胶原酶异形体C2的比例可以为约30至约70:约10至约29。在一些实施方案中，胶原酶异形体C1与胶原酶C2的比例可以为35:15。在一些实施方案中，对于每种浓度，C1和C2的质量比可以为70:30、54:46、37:63、82:18、54:46，以及90:10。
在一些实施方案中，中性蛋白酶可以是多粘类芽孢杆菌中性蛋白酶。在一些实施方案中，中性蛋白酶浓度可以为约2U/ml至约21U/ml。在一些实施方案中，中性蛋白酶浓度可以为约2U/ml至约7U/ml、约2U/ml至约12U/ml、约2U/ml至约17U/ml、约2U/ml至约21U/ml、约7U/ml至约12U/ml、约7U/ml至约17U/ml、约7U/ml至约21U/ml、约12U/ml至约17U/ml、约12U/ml至约21U/ml，或者约17U/ml至约21U/ml。在一些实施方案中，中性蛋白酶浓度可以为约2U/ml、约7U/ml、约12U/ml、约17U/ml或约21U/ml。在一些实施方案中，中性蛋白酶浓度可以为至少约2U/ml、约7U/ml、约12U/ml或约17U/ml。在一些实施方案中，中性蛋白酶浓度可以为至多约7U/ml、约12U/ml、约17U/ml或约21U/ml。在一些实施方案中，消化溶液可以包含约19.6U/ml的活性的中性蛋白酶。
在一些实施方案中，胶原酶浓度为约0.05U/ml至约1.6U/ml。在一些实施方案中，胶原酶浓度为约0.05U/ml至约0.1U/ml、约0.05U/ml至约0.15U/ml、约0.05U/ml至约0.2U/ml、约0.05U/ml至约0.25U/ml、约0.05U/ml至约0.3U/ml、约0.05U/ml至约0.35U/ml、约0.05U/ml至约0.4U/ml、约0.05U/ml至约0.8U/ml、约0.05U/ml至约1.2U/ml、约0.05U/ml至约1.6U/ml、约0.1U/ml至约0.15U/ml、约0.1U/ml至约0.2U/ml、约0.1U/ml至约0.25U/ml、约0.1U/ml至约0.3U/ml、约0.1U/ml至约0.35U/ml、约0.1U/ml至约0.4U/ml、约0.1U/ml至约0.8U/ml、约0.1U/ml至约1.2U/ml、约0.1U/ml至约1.6U/ml、约0.15U/ml至约0.2U/ml、约0.15U/ml至约0.25U/ml、约0.15U/ml至约0.3U/ml、约0.15U/ml至约0.35U/ml、约0.15U/ml至约0.4U/ml、约0.15U/ml至约0.8U/ml、约0.15U/ml至约1.2U/ml、约0.15U/ml至约1.6U/ml、约0.2U/ml至约0.25U/ml、约0.2U/ml至约0.3U/ml、约0.2U/ml至约0.35U/ml、约0.2U/ml至约0.4U/ml、约0.2U/ml至约0.8U/ml、约0.2U/ml至约1.2U/ml、约0.2U/ml至约1.6U/ml、约0.25U/ml至约0.3U/ml、约0.25U/ml至约0.35U/ml、约0.25U/ml至约0.4U/ml、约0.25U/ml至约0.8U/ml、约0.25U/ml至约1.2U/ml、约0.25U/ml至约1.6U/ml、约0.3U/ml至约0.35U/ml、约0.3U/ml至约0.4U/ml、约0.3U/ml至约0.8U/ml、约0.3U/ml至约1.2U/ml、约0.3U/ml至约1.6U/ml、约0.35U/ml至约0.4U/ml、约0.35U/ml至约0.8U/ml、约0.35U/ml至约1.2U/ml、约0.35U/ml至约1.6U/ml、约0.4U/ml至约0.8U/ml、约0.4U/ml至约1.2U/ml、约0.4U/ml至约1.6U/ml、约0.8U/ml至约1.2U/ml、约0.8U/ml至约1.6U/ml，或者约1.2U/ml至约1.6U/ml。在一些实施方案中，胶原酶浓度为约0.05U/ml、约0.1U/ml、约0.15U/ml、约0.2U/ml、约0.25U/ml、约0.3U/ml、约0.35U/ml、约0.4U/ml、约0.8U/ml、约1.2U/ml或约1.6U/ml。在一些实施方案中，胶原酶浓度为至少约0.05U/ml、约0.1U/ml、约0.15U/ml、约0.2U/ml、约0.25U/ml、约0.3U/ml、约0.35U/ml、约0.4U/ml、约0.8U/ml或约1.2U/ml。在一些实施方案中，胶原酶浓度为至多约0.1U/ml、约0.15U/ml、约0.2U/ml、约0.25U/ml、约0.3U/ml、约0.35U/ml、约0.4U/ml、约0.8U/ml、约1.2U/ml或约1.6U/ml。
根据本公开内容的一个方面，确定了中性蛋白酶浓度和胶原酶浓度(C1和C2胶原酶)以及溶液体积(ml)与骨碎片重量(mg)的比例。
在一些实施方案中，总胶原酶浓度(C1和C2胶原酶)为约25μg/ml至约100μg/ml。在一些实施方案中，总胶原酶浓度为约25μg/ml至约32.5μg/ml、约25μg/ml至约47.5μg/ml、约25μg/ml至约42.5μg/ml、约25μg/ml至约50μg/ml、约25μg/ml至约65μg/ml、约25μg/ml至约77.5μg/ml、约25μg/ml至约85μg/ml、约25μg/ml至约100μg/ml、约32.5μg/ml至约47.5μg/ml、约32.5μg/ml至约42.5μg/ml、约32.5μg/ml至约50μg/ml、约32.5μg/ml至约65μg/ml、约32.5μg/ml至约77.5μg/ml、约32.5μg/ml至约85μg/ml、约32.5μg/ml至约100μg/ml、约47.5μg/ml至约42.5μg/ml、约47.5μg/ml至约50μg/ml、约47.5μg/ml至约65μg/ml、约47.5μg/ml至约77.5μg/ml、约47.5μg/ml至约85μg/ml、约47.5μg/ml至约100μg/ml、约42.5μg/ml至约50μg/ml、约42.5μg/ml至约65μg/ml、约42.5μg/ml至约77.5μg/ml、约42.5μg/ml至约85μg/ml、约42.5μg/ml至约100μg/ml、约50μg/ml至约65μg/ml、约50μg/ml至约77.5μg/ml、约50μg/ml至约85μg/ml、约50μg/ml至约100μg/ml、约65μg/ml至约77.5μg/ml、约65μg/ml至约85μg/ml、约65μg/ml至约100μg/ml、约77.5μg/ml至约85μg/ml、约77.5μg/ml至约100μg/ml，或者约85μg/ml至约100μg/ml。在一些实施方案中，总胶原酶浓度为约25μg/ml、约32.5μg/ml、约47.5μg/ml、约42.5μg/ml、约50μg/ml、约65μg/ml、约77.5μg/ml、约85μg/ml或约100μg/ml。在一些实施方案中，总胶原酶浓度为至少约25μg/ml、约32.5μg/ml、约47.5μg/ml、约42.5μg/ml、约50μg/ml、约65μg/ml、约77.5μg/ml或约85μg/ml。在一些实施方案中，总胶原酶浓度为至多约32.5μg/ml、约47.5μg/ml、约42.5μg/ml、约50μg/ml、约65μg/ml、约77.5μg/ml、约85μg/ml或约100μg/ml。
在一些实施方案中，对于每种浓度，C1和C2的质量比分别为70:30、54:46、37:63、82:18和90:10。
消化溶液与捕获的研碎骨的体积与重量比为约1:1至约15:1，例如，约5:1。在一些实施方案中，比例可以为1:1、2.5:1、5:1、7.5:1、10:1以及15:1(体积:重量)。在一些实施方案中，孵育期为约1小时至约4小时。在一些实施方案中，孵育期为约1小时至约1.5小时、约1小时至约2小时、约1小时至约2.5小时、约1小时至约3小时、约1.5小时至约2小时、约1.5小时至约2.5小时、约1.5小时至约3小时、约2小时至约2.5小时、约2小时至约3小时，或者约2.5小时至约3小时。在一些实施方案中，孵育期为约1小时、约1.5小时、约2小时、约2.5小时或约3小时。在一些实施方案中，孵育期为至少约1小时、约1.5小时、约2小时或约2.5小时。在一些实施方案中，孵育期是至多约1.5小时、约2小时、约2.5小时、约3小时或约4小时。在一些情况中，消化溶液与捕获的研碎骨接触多达约4小时。
在一些情况中，已经发现在2.5小时的最佳孵育时间，最佳的体积与重量比为5:1。最佳蛋白酶产生19.6U/ml的中性蛋白酶活性。在另一方面，发现总存活的MSC细胞计数一般对胶原酶浓度不敏感。还发现无论Cl/C2比例如何，重组胶原酶异形体Cl和C2产生的产量与纯化的胶原酶的产量相似。本公开内容的MSC回收过程的进一步细节在Johnstone等人的技术文章中查到，“Identification and characterization of a large source ofprimary mesenchymal stem cells tightly adhered to bone surfaces of humanvertebral body marrow cavities”bioRxiv 2020.05.04.076950；doi.org/10.1101/2020.05.04.076950，其全部公开内容通过引用而并入本文中。
根据该过程，将VB骨的碎片(新鲜碎片或低温保藏的碎片)置于低温防护剂溶液(其包含PLASMA-LYTETM、2.5％人血清白蛋白和10％二甲基亚砜(DMSO))中，在4℃下孵育1小时。将该溶液取出，将骨碎片以约1°/min的速率冷却到-86℃，然后浸入液氮中。在液氮中24-48小时后，将骨碎片在设定于37℃的水浴中快速解冻，然后在盐水洗涤，并用上述胶原酶/蛋白酶溶液进行消化。
基于缺血时间预测细胞存活率
如上所述，供体骨的缺血时间影响使用上述过程提取的细胞的存活率。根据本公开内容，总缺血被定义为起始于死亡时间(供体的动脉系统被交叉夹紧并停止循环的时间点)并终止于开始从骨中回收细胞的间隔。为了统计建模的目的，此总间隔可以被分成三个连续的并且相互排斥的时间部分：(a)热缺血时间(Warm Ischemia Time，WIT)—起始于死亡时间并终止于将骨回收并包装在冰上时或终止于将身体置于冷却器中时；(b)身体冷却时间(Body Cooling Time，BCT)—起始于将身体置于冷却器中时并且终止于将骨包装在冰上时；和(c)冷缺血时间(Cold Ischemia Time，CIT)—起始于将骨包装在冰上时并且终止于加工开始以提取细胞(例如HSPC)时。因此，总缺血时间＝(WIT)+(BCT)+(CIT)。对于不使用全身冷却的情况，BCT为零，并且总缺血时间＝(WIT)+(CIT)。
除了总缺血时间之外，还可以将与加工经验对应的变量纳入存活率确定中。已知道学习曲线对结果施加显著影响，因此为了控制此事实，可以将变量EXP定义为在当前供体之前加工的供体数量，即对于第i个供体，EXP＝i-1。其他变量可以包括骨类型(例如椎体和髂骨)、供体性别和供体年龄。
在一个方面，结果变量是：存活的特定细胞群(例如CD34+细胞)的比例，细胞加工后每105个成核细胞中检测到的集落形成单位(CFU)的总数，以及每105个成核细胞中检测到的CFU粒细胞巨噬细胞(CFU-GM)的数量。
根据本公开内容，普通最小二乘法(OLS)β回归模型可用于预测结果变量，线性回归模型用于CFU和CFU-GM，β回归模型用于存活的CD34+细胞的比例，或％CD34+，其中0<(％CD34+)<1。用于预测％CD34+的β回归等式是：
回归模型是基于未调整的模型，只考虑了基于缺血的变量，而没有考虑经验、骨类型、供体性别和供体年龄变量。％CD34+的完全调整的模型，考虑了所有的变量。这些模型的结果在表1-3中描述。
表1.％CD34+系数值
表2.CFU系数值
系数β1试图量化加工的供体数量(即经验)对细胞数量和存活率的影响。在完全调整的CFU模型中，基于设施可能具有不同学习轨迹的假设，系数β2对应于在特定设施的经验。这些系数中的任何一个或两个都可以被修改，或者甚至消去。
表3.CFU-GM系数值
将这些模型应用于观察到的数据可以用于确定缺血时间变量对％CD34+的影响，如图11A-11C所示的表中反映的，对总CFU的影响，如图12A-12C的表中所示的，以及对CFU-GM量的影响，如图13A-13C的表中所示的。这些表中的数据可以用于决定特定的供体骨是否可以产生足够的细胞以保证对供体骨的进一步加工。换言之，预测性模型可以用于建立缺血耐受限度和HSPC质量验收标准。例如，关于％CD34+结果变量，为了考虑特定的供体骨，可能需要超过80％的预测值。
上述模型和图11A-11C的表中所示的实例表明，尽管在必须由地理上分散的OPO采购骨并长距离运送到加工中心时不可避免地延长缺血时间，但是可接受的HSPC质量水平仍然是可实现的。即使在这种条件下，也可以实现热缺血时间和冷缺血时间的有利组合，从而使％CD34+存活率能够在80-90％的范围。这些模型还表明，在骨回收之前冷藏身体(这是在回收组织时普遍的实践)在骨髓回收的背景中有益性较小。例如，当使用全身冷却时，CD34+存活率平均为72.75％，而当不使用身体冷却时，平均值略低于90％。这些模型表明，最佳实践可以免去身体冷却，并尽快将回收的骨移动到冷缺血环境中。这些模型进一步表明，将WIT(热缺血时间)限制在小于八(8)小时并将CIT(冷缺血时间)限制在小于40小时优化了从供体骨中回收有意义量的存活细胞的机会。
本文公开的模型预测了存活率，其中80％CD34+细胞存活率阈值被确定为可接受的。如图表中反映的，从WIT为10小时并且CIT为18小时所在的点到WIT为1小时并且CIT为27小时所在的点，热缺血时间和冷缺血时间之间的关系遵循曲线。
本公开内容的预测细胞存活率的方法的进一步细节在Woods等人，“Ischemiaconsiderations for the development of an organ and tissue donor derived bonemarrow bank.”J Transl Med 18,300(2020).doi.org/10.1186/s12967-020-02470-1中查到，其全部公开内容通过引用而并入本文中。
储存尸体BM
通常，等待同种异体骨髓(BM)移植的患者中不到一半能接受所需移植。活供体BM登记、BM低温保藏和自体移植以及脐带血储存已经为数千名至少患有血液病的患者提供了拯救生命的解决方案；然而，这些方法仍然受到与供应和物流相关的严重限制，并将受益于本公开内容的系统和方法。此外，虽然罕见，但是来自活体骨髓捐赠的不良事件也是可能的(即，与骨髓捐赠相关的死亡风险为1:10,000)，虽然目前更多地利用外周血干细胞捐赠，但是几乎所有这些供体都将经受骨痛，1/4的供体将有明显的头痛、恶心或柠檬酸中毒，1/5,000的供体将经受脾破裂或其他致命性并发症。此外，尚不清楚在捐赠期间向供体施用干细胞动员剂的长期效果。已在原理上证明尸体BM储存的技术可行性；然而，这其中仍有许多挑战。这些挑战通过本公开内容来直接解决。
本文公开的储存BM提供了一种向尚未鉴定活供体匹配的患者提供BM的现成机制。此外，它还提供了一种向存在活供体匹配的患者提供BM的更有效的方法，因为至少与鉴定供体匹配、定位供体匹配以及安排捐赠相关的延迟减少。因此，对于患有快速进行性疾病和预后不良的许多患者，通过允许按需移植并使这些患者的等待时间从多个月缩短至仅1-2天，储存BM可以大幅增加移植后的生存率。重要地，此方法从单个供体提供大量BM，足以允许造血干细胞和祖细胞(HSPC)植入若干患者，并在需要时能够实现立即重复BM移植。此外，由于单个供体提供足够的BM以供移植，因此不需要从多个供体汇集BM，或者为不同供体提供后续的捐赠，其每一种都会增加由于异体移植所致的不良反应的可能性。
本文公开的方法和系统能够实现为国家应急准备工作提供大量的按需骨髓(BM)供应。HHS、BARDA的数十亿美元的Project Bioshield和美国国防部已经充分记录了对按需BM和干细胞移植作为核事故或攻击的医疗对策的未满足的迫切需求。本公开内容还为例如免疫耐受诱导等新兴应用提供了所需的BM。对此方法而言，关键在于从已故器官供体中加工和储存BM并在延长时间段期间保藏BM的方案。此外，对于现今接受死亡供体器官移植的患者，如果来自这些供体的BM被储存，则在将来此疗法变得可利用时可能受益于此疗法，使得这种方法立即有益于重要器官移植接受者。换言之，与目前利用的方法相比，本公开内容中所述的系统和方法允许收集和储存增加量的骨髓或骨髓细胞。如果成功，则正在研究的其他有前景的方法和治疗有可能大大增强尸体BM采购和使用提议的方法进行储存的价值，使储存的骨髓的大量供应立即可用于需要快速BM移植的大多数接受者，特别是解决自身免疫性病症、遗传性疾病、多发性硬化和1型糖尿病的严重形式。
本公开内容提供了一种临床导向的研究方案和系统，其被修改为在最先进的洁净室中在工业环境中实施。本公开的系统的一个方面包括，除了其他之外，对进入的供体骨进行清理，使用定制的手术不锈钢切割器进行初始碎片化，以及将破碎的骨研磨成大约3mm尺寸的骨碎片。这些改进提供了一种系统，其中熟练的组织加工技术人员可以在6小时窗口内加工供体骨组，以产生大量的存活的骨髓。
在本文所述的过程中，是对死亡供体骨髓的潜在来源的评估。在加工供体的长骨例如胫骨时，已经发现，由于红骨髓随着年龄而转化为黄骨髓，红骨髓限于长骨的端部，并且在不同的供体之间差异很大。还已经确定，与完全的红骨髓(例如来自椎体或髂骨的骨髓)相比，混合的黄骨髓-红骨髓品质不良，而且混合的黄骨髓-红骨髓包含脂肪浸润，由此使后续加工复杂化。在某些临床实验中，最好的供体长骨，与从同一供体的髂骨中获得的细胞相比，只产生1/100的BM细胞/kg。因此，已经确定，长骨加工优选地只在特殊情况下进行，例如涉及额外有价值的“通用”HLA型或具有HIV抗性δ32(CCR5-δ32)突变的骨髓。
相比之下，椎体和髂骨代表了高品质红骨髓的最大的持续性储备。利用一个或两个来源已优化了骨髓的回收，特别是在实施本文公开的工业化的可扩展性GMP过程。本文公开的过程的完成导致最终产品配置的低温保藏，其是在标准血袋中以1-1.5亿个总成核细胞(TNC)/ml的目标贮藏60-70ml体积，类似于已经用于自体移植的低温保藏的BM的产品配置。
本公开内容应被视为说明性而非限制性的。应理解，仅呈现了某些实施方案，并且要求保护落在本公开内容的精神内的所有变化、修改和进一步应用。
虽然在本文中已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但是对本领域技术人员而言将显而易见，仅通过举例的方式提供这样的实施方案。本发明旨在不限于说明书内提供的具体实例。虽然已经参考以上说明而描述了本发明，但是本文中对实施方案的描述和说明并非意在以限制性含义进行解释。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在可想到许多变型、改变和替代。此外，应理解，本发明的所有方面不限于本文中根据各种条件和变量陈述的具体的描述、配置或相对比例。应当理解，在实践本发明时可以采用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。因此，考虑到本发明还将覆盖任何此类替代、修改、改变或等同方案。所附权利要求旨在界定本发明的范围，并且由此覆盖这些权利要求的范围内的方法和结构及其等同方案。
为了促进对本公开内容的原理的理解，现在将提及在附图中示出的以及在以下书面说明书中描述的实施方案。应理解，由此旨在不限制本公开内容的范围。还应理解，本公开内容包括对图示的实施方案的任何改变和修改，并包括本公开内容所属领域的技术人员通常可想到的本文公开的原理的进一步应用。
本文所述的任何方面或实施方案可以与本文公开的任何其他方面或实施方案组合。
定义
虽然在本文中已经示出和描述了本公开内容的优选实施方案，但是对本领域技术人员而言显而易见的是，这样的实施方案仅通过举例的方式提供。在不脱离本公开内容的情况下，本领域技术人员现在可想到许多变型、改变和替代。应当理解，在实践本公开内容时可以采用本文所述的本公开内容的实施方案的各种替代方案。所附权利要求旨在界定本公开内容的范围，并且因此覆盖这些权利要求的范围内的方法和结构及其等同方案。
使用绝对或顺序术语，例如“将”、“将不”、“应”、“不应”、“必须”、“一定不”、“第一”、“初始”、“接着”、“随后”、“前”、“后”、“最后”和“最终”，意在不限制本文公开的本实施方案的范围，而是作为示例性的。
如本文使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一种”、“一个”和“所述”旨在也包括复数形式。此外，就在详细描述和/或权利要求中使用术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或其变体而言，这些术语旨在以类似于术语“包括”的方式被包含在内。
如本文使用的，短语“至少一种”、“一种或多种”和“和/或”是开放式表述，其在操作中是连词和选词。例如，表述“A、B和C中的至少一种”、“A、B或C中的至少一种”、“A、B和C中的一种或多种”、“A、B或C中的一种或多种”和“A、B和/或C”各自都意指单独的A、单独的B、单独的C、A和B一起、A和C一起、B和C一起，或者A、B和C一起。
如本文使用的，“或”可以是指“和”、“或”或者“和/或”，并且可以排他地和包含地使用。例如，术语“A或B”可以是指“A或B”、“A而非B”、“B而非A”和“A和B”。在一些情况中，上下文可以决定具体的含义。
本文描述的任何系统、方法、软件和平台都是模块化的。因此，术语诸如“第一”和“第二”不一定意味着优先性、重要性顺序或操作的顺序。
当提及数值或数值范围时，术语“约”是指所提及的数值或数值范围是实验变异性(或统计实验误差)内的近似值，并且该数值或数值范围可以在例如所述数值或数值范围的1％至15％变化。在实例中，术语“约”是指所述数或值的±10％。
“从1至10”中的术语“从”包括叙述的初始的和最终的数值。因此，“从1至10”包括整数1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，并包括其分数，(例如，约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8和约0.9)。
本文使用的术语“增加”、“增大”或“增高”通常是指相对于参考水平或历史对照增加统计上显著的量。历史对照涉及从另一对象或对象群体中获得的数据，所述另一对象未接受根据本公开内容的方法所述的治疗，并且在各种特征(例如，年龄、性别、健康状态、合并症、血液癌症类型和癌症严重性)上与本对象相似。在一些方面，术语“增加”或“增高”是指与参考水平或历史对照相比增加至少10％，例如，与参考水平、标准或历史对照相比增加至少约10％，至少约20％，或至少约30％，或至少约40％，或至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％，或者高达并包括100％增加或介于10-100％之间的任何增加。“增加”的其他实例包括与参考水平或历史对照相比，增加至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍或更多。
术语“下降”、“减少”或“降低”在本文中一般用来意指相对于参考水平或历史对照值的下降。历史对照涉及从另一对象或对象群体中获得的数据，所述另一对象未接受根据本公开内容的方法所述的治疗，并且在各种特征(例如，年龄、性别、健康状态、共病、血液癌症类型和癌症严重性)上与本对象相似。在一些方面，“下降”或“减少”是指与参考水平或历史对照相比减少至少10％，例如，减少至少约20％，或至少约30％，或至少约40％，或至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％，或高达并包括100％减少(例如，与参考水平相比没有水平或不可检测到的水平)，或与参考水平或历史对照相比介于10-100％之间的任何减少。在标志物或症状的背景下，这些术语是指这种水平在统计学上显著的下降。例如，该下降可以是至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或更多，优选地下降到被接受为对无给定疾病的个体而言的正常范围内的水平。
“有效量”或“治疗有效量”是指本文所述的骨髓产品和/或骨髓产品中含有的HSC的量，该量当施用于对象(例如人类)时，足以促进治疗疾病，例如血液癌症。构成“治疗有效量”的骨髓产品和/或骨髓产品中含有的HSC的量将根据细胞制剂、病况及其严重性、给药方式和待治疗对象的年龄而不同，但可以由本领域的普通技术人员在考虑到自己的知识和本公开内容例行地确定。
CD34：骨髓和血液中在未成熟的造血前体细胞和所有造血集落形成细胞上存在的抗原。某些非造血(即CD45阴性)细胞群也表达CD34。在造血细胞(即CD45+细胞)中，CD34抗原表达在早期祖细胞上最高，并随着细胞的成熟而减少。在完全分化的造血细胞上不存在CD34抗原。正常外周血淋巴细胞、单核细胞、粒细胞和血小板不表达CD34抗原。
本文中使用的章节标题仅用于组织目的，不应解释为限制所描述的主题。
附加实施方案
在另一方面中，本公开内容的方法提供用于从死亡供体骨髓中回收细胞，该方法包括以下步骤：从死亡供体中获得骨；加工骨以从骨中提取骨髓细胞；获得具有1.063-1.052gm/mL的密度的密度降低的Ficoll溶液；将密度降低的Ficoll溶液导入离心管中而形成Ficoll梯度；在离心管中的Ficoll梯度上使提取的骨髓细胞分层；将包含Ficoll梯度和骨髓细胞的管离心；从离心管内收集血沉棕黄层细胞；以及洗涤收集的细胞以供后续使用或加工。在一些实施方案中，骨是椎体。在一些实施方案中，收集的细胞是CD34+细胞。在一些实施方案中，对骨的加工包括：对骨清除软组织；将骨切成碎片并且研磨该碎片；过滤和冲洗骨的研磨碎片；以及将经过滤和冲洗的骨碎片的悬浮液离心以浓缩骨髓细胞。在一些实施方案中，获得密度降低的Ficoll包括将1.077g/mL的密度的Ficoll-Paque与PLASMA-LYTETM按照比例混合以获得1.063-1.052g/mL的密度。在一些实施方案中，将管离心包括在400g下将管离心30分钟。在一些实施方案中，洗涤收集的细胞包括在包含0.5％人血清白蛋白(HSA)和2mM乙二胺四乙酸(EDTA)的磷酸盐缓冲的(PBS)中洗涤细胞。
本公开内容的另一方面包括一种用于从死亡供体骨中获得骨髓细胞的方法，该方法包括：从死亡供体中获得骨；对骨清除软组织；将骨研磨成骨碎片；过滤和冲洗研磨的骨而产生液体组合物；将经过滤和冲洗的研碎骨的液体组合物离心而将骨髓细胞浓缩成骨髓细胞组合物；以及将骨髓细胞组合物提取到无菌容器中。在一些实施方案中，供体骨是死亡供体的一个或多个椎体和/或髂骨。在一些实施方案中，供体骨是新鲜获得的并且未冷冻。在一些实施方案中，将供体骨在冷冻之后解冻以转移至加工设施。在一些实施方案中，对骨清除软组织包括：使用工具将软组织从骨中去除；以及将骨浸没在一种或多种溶液中，溶液适应于从骨中去除软组织和软组织细胞。在一些实施方案中，将骨浸没在一种或多种溶液中包括：将骨浸没在漂白剂溶液中；以及将骨浸没在过氧化氢溶液中。在一些实施方案中，将骨浸没在一种或多种溶液中包括：将骨浸没在容器中；检测该容器内的泡沫水平；以及至少重复将骨浸没在过氧化氢溶液中的步骤，直至未检测到泡沫为止。在一些实施方案中，将惰性造影染料添加至过氧化氢溶液以增强容器中的任何泡沫的可见度。在一些实施方案中，对骨的研磨包括：将骨切成碎片；以及在骨研磨机中将骨碎片与研磨介质一起研磨。在一些实施方案中，研磨介质包含作为基础的PLASMA-LYTETM，以及10U/mL肝素、2.5％人血清白蛋白(HSA)和3U/mL 试剂。在一些实施方案中，过滤和冲洗研碎骨包括：将研碎骨浸没在研磨介质中；使研碎骨和研磨介质通过一系列筛；其后将筛用研磨介质冲洗；将通过筛的液体组合物接收在容器中；以及将液体组合物转移至无菌容器。在一些实施方案中，一系列筛包括第一40号筛(425μm)和随后的第二80号筛(177μm)。在一些实施方案中，过滤和冲洗研碎骨包括：将研碎骨浸没在第一收集袋内的研磨介质中；悬挂第一收集袋并将第一收集袋的底部连接至一系列在线过滤器和第二收集袋；使第一收集袋的内容物通过在线过滤器进入第二收集袋中。在一些实施方案中，使骨髓首先通过800μm前置过滤器。在一些实施方案中，一系列在线过滤器包括具有200μm过滤器或500μm过滤器的两个过滤器。在一些实施方案中，第一收集袋的内容物第一次通过时，两个过滤器是200μm过滤器，第二收集袋的内容物第二次通过进入第三收集袋时，两个过滤器是500μm过滤器。在一些实施方案中，过滤和冲洗研碎骨包括去除研碎骨的脂肪含量。在一些实施方案中，去除研碎骨的脂肪含量包括：将研碎骨的悬浮液置于收集袋中；将收集袋离心，从而当悬挂时脂肪层形成在收集袋的顶部；以及将骨髓的沉淀从悬挂的收集袋的底部取出。在一些实施方案中，在取出沉淀之前，将夹子置于袋上在脂肪层下方以夹紧袋并且防止脂肪层随着取出沉淀而通过。在一些实施方案中，所述方法还包括低温保藏骨髓细胞组合物。在一些实施方案中，低温保藏骨髓细胞组合物包括：将预定体积的冷冻介质制备为冲洗介质和低温保藏组合物的溶液；以及在预定速率下将冷冻介质引入包含骨髓细胞组合物的无菌容器中。在一些实施方案中，无菌容器包含60-70mL的骨髓细胞组合物，并且将预定体积的冷冻介质针对骨髓细胞组合物的体积进行校准。在一些实施方案中，预定速率是冷冻介质的预定体积的百分之十(10％)/分钟。在一些实施方案中，低温防护剂可以是选自包括以下各项的组中的一种或多种组成部分：二甲基亚砜(DMSO)；1,2丙烷二醇(也称为丙二醇)；乙二醇；甘油；甲酰胺；乙烷二醇或丁烷2,3二醇；羟乙基淀粉(HES)、葡聚糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、棉子糖、核糖醇、甘露醇和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。在一些实施方案中，冲洗介质可以是选自包括以下各项的组中的一种或多种组成部分：PlasmaLyte；Isolyte；和IMDM。在一些实施方案中，冷冻介质还包含去氧酶。
本公开内容的另一方面包括一种骨切割工具，该骨切割工具包括：固定柄，该固定柄具有被配置为由用户抓握的端部以及相对的钳口端，该固定柄在钳口端处界定骨接合凹部；杠杆柄，该杠杆柄在第一枢轴处可枢转地连接至固定柄，以朝向和远离固定柄枢转，并被配置为由用户在抓握固定柄时抓握，以连续地使杠杆柄朝向固定柄枢转；刀元件，该刀元件在第二枢轴处可枢转地连接至固定柄，并包括刀刃，该刀刃面向在固定柄的钳口端处的骨接合凹部，该刀元件包括设置在固定柄和杠杆柄之间的棘轮部件，该棘轮部件包括多个齿；棘爪部件，该棘爪部件在第三枢轴处可枢转地连接至杠杆柄，并被布置成由用户在杠杆柄的每个连续枢轴处使多个齿中的每个齿接合至固定柄，其中每个第一枢轴包括细长销，该细长销穿过固定柄和杠杆柄中的开口，第二枢轴包括细长销，该细长销穿过固定柄和刀元件中的开口，以及第三枢轴包括细长销，该细长销穿过枢轴柄和棘爪部件中的开口，并且其中每个销通过至少一个可拆卸的挡圈而被可拆卸地保留在相应的第一、第二和第三枢轴中，以便固定柄、枢轴柄、刀元件和棘爪部件可以容易地拆卸以进行清洁，并在清洁后重新组装。在一些实施方案中，刀元件包括整体式连杆；并且该工具进一步包括自由式连杆，该自由式连杆在第四枢轴处可枢转地连接至杠杆柄，并且可枢转地连接至整体式连杆，第四枢轴包括细长销，该细长销穿过枢轴柄和自由式连杆中的开口，以便拆卸。在一些实施方案中，固定柄、刀元件、枢轴柄、棘爪部件和自由式连杆由不锈钢形成，并且其表面被钝化。在一些实施方案中，该不锈钢是硬化不锈钢。
本公开内容的另一方面包括一种用于从尸体骨或尸体骨碎片中高产量回收干细胞的方法，所述方法包括：获得尸体骨或尸体骨碎片；加工骨或骨碎片以提取骨髓细胞；将提取的骨髓细胞与具有1.063-1.052gm/mL的密度的密度降低的Ficoll溶液合并；将提取的骨髓细胞离心，从而分离出包含干细胞的血沉棕黄层细胞；以及收集血沉棕黄层细胞，从而回收干细胞。
本公开内容的另一方面包括一种用于从尸体骨或尸体骨碎片中高产量回收干细胞的方法，所述方法包括：获得尸体骨或尸体骨碎片，任选地将尸体骨加工成尸体骨碎片；将尸体骨碎片与介质合并，该介质包含核酸酶、人血清白蛋白(HSA)、肝素、电解质介质和生长培养基中的两种或更多种，从而获得经介质处理的尸体骨碎片；加工经介质处理的尸体骨碎片以提取骨髓细胞；以及收集提取的骨髓细胞，从而回收干细胞。在一些实施方案中，核酸酶是 或DNA酶。在一些实施方案中，电解质介质是Plasma-Lyte A或Isolyte。在一些实施方案中，生长培养基是Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)。在一些实施方案中，加工介质包含核酸酶、HAS、肝素、电解质介质和生长培养基中的三种或更多种。在一些实施方案中，加工介质包含核酸酶、HAS、肝素、电解质介质和生长培养基中的四种或更多种。在一些实施方案中，加工介质包含/>HAS、肝素和Plasma-Lyte A.1。一种用于从尸体骨或尸体骨碎片中高产量回收干细胞的方法，所述方法包括：获得尸体骨或尸体骨碎片；加工骨或骨碎片以提取骨髓细胞；将提取的骨髓细胞与具有1.063-1.052gm/mL的密度的密度降低的Ficoll溶液合并；将提取的骨髓细胞离心，从而分离出包含干细胞的血沉棕黄层细胞；以及收集血沉棕黄层细胞，从而回收干细胞。
本公开内容的另一方面包括一种用于优化从尸体骨中回收干细胞的方法，所述方法包括：将热缺血时间(WIT)限制在小于八小时并将冷缺血时间(CIT)限制在小于40小时。在一些实施方案中，WIT起始于死亡时并且终止于当尸体骨被回收并置于冷却环境或条件中时或者当尸体被置于冷却环境或条件中时。在一些实施方案中，CIT起始于当尸体骨被置于冷却环境中时并且终止于当开始加工以从尸体中提取细胞时。在一些实施方案中，在将尸体置于冷却环境或条件中之前从尸体中获得骨。
本公开内容的另一方面包括一种用于从尸体骨或尸体骨碎片中回收椎骨粘附的间充质基质/干细胞(vBA-MSC)的方法，所述方法包括：获得尸体骨、尸体骨碎片或研碎的尸体骨，任选地从尸体骨或尸体骨碎片中制备研碎的尸体骨；将研碎的尸体骨在包含胶原酶或中性蛋白酶的消化溶液中孵育，从而获得消化的骨产品；加工消化的尸体骨产品以提取骨髓细胞；以及收集提取的骨髓细胞，从而回收vBA-MSC。在一些实施方案中，溶液与研碎的尸体骨重量的体积与重量比为约5至约1。在一些实施方案中，孵育多达约2.5小时。在一些实施方案中，中性蛋白酶的量为约19.6U/ml。在一些实施方案中，消化溶液包含胶原酶和中性蛋白酶。在一些实施方案中，在研碎的尸体骨在消化溶液中孵育之前，已经从研碎的尸体骨中分离骨髓。
本公开内容的另一方面包括一种用于优化从尸体骨或尸体骨碎片中回收干细胞的方法，所述方法包括：获得尸体骨或尸体骨碎片；任选地将尸体骨加工成尸体骨碎片；将尸体骨或尸体骨碎片浸没在包含漂白剂的溶液中，从而获得经漂白的骨产品；以及随后将经漂白的骨产品浸没在包含过氧化氢的溶液中，从而获得经处理的骨产品；加工经处理的骨产品以提取骨髓细胞；以及收集提取的骨髓细胞，从而回收干细胞。
援引并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请都通过援引而并入本文中，在程度上就如同每件单独的出版物、专利或专利申请被明确地且单独地指明通过援引而并入。就通过援引并入的出版物和专利或专利申请与本说明书中包含的公开内容相矛盾而言，本说明书旨在取代和/或优先于任何这种矛盾的材料。
实施例
以下说明性实施例代表本文所述的刺激、系统和方法的实施方案，并且绝不意在限制性。
实施例1.组织加工
本文描述了示例性组织加工方案。在一些情况中，被加工的组织可以是椎体。在一些情况中，组织加工方案可以产生本文所述的骨髓细胞。
A.组织清创
1.用70％异丙醇喷洒新鲜VB的外袋的表面。在通风橱中，去除外层无菌袋并处理掉。打开内袋并处理袋。
2.从蓝色毛巾和剖腹手术海绵上解开样本。针对以下记录包装材料的存在和脊柱的状况：最少2层无菌袋；蓝色毛巾；手术巾；组织水分维持；和椎弓根的存在。
3.记录组织清创的开始时间。
4.移除椎弓根周围的软组织，以显示正确的锯切位置。用骨凿刮掉外部组织。
5.如果存在，锯透椎弓根。保留前VB，并且丢弃椎弓根和后部元件。避免暴露松质骨组织。
6.通过使用剔骨刀切开椎间盘来分离VB。
7.使用剪刀、小刀和骨凿的组合，从每个单独的VB表面去除剩余的软组织。记录回收期间的任何解剖病理或损伤(例如骨刺、椎间盘突出和椎间盘退化、回收过程中的VB切割或其他损伤，如脆骨)。
8.对整个VB的数量进行计数并确定回收的水平(例如T8-L5)。丢弃在回收期间受损的任何VB并暴露松质骨组织。
9.用70％的IPA喷洒天平(CS-5000型号)，并放置在生物安全柜(BSC)内的干净区域中。用无菌袋平衡皮重。将待进一步处理的VB放入无菌袋中，并记录质量。记录用于BM提取的VB的数目。
B.表面去污
1.记录VB的温度。
2.将VB放入无菌袋中，然后向袋中加入1L的10％漂白剂溶液，并确保所有VB都被浸没。一旦将漂白剂添加到VB袋中，立即启动计时器持续10分钟。在进行B.4之前，允许10分钟的接触时间。
3.从通风橱中取出所有使用的处理设备和盖布，并取下弄脏的手套。用70％IPA清洗BSC，并允许在继续之前干燥。
4.在10分钟的漂白剂溶液接触时间之后，立即开始使用一对无菌的长柄镊子将VB转移到新的无菌袋中。
5.向袋中加入1L的3％过氧化氢溶液。确保VB被完全浸没。封闭袋，并轻轻摇晃。
6.使用新的无菌的长柄镊子将VB转移到新的无菌袋中。
7.用1L的Plasma-Lyte填充袋。封闭袋，并轻轻摇晃。
8.使用新的无菌长柄镊子将VB转移到新的无菌袋中。
9.用1L的Plasma-Lyte填充袋。封闭袋，并轻轻摇晃。
10.使用长柄镊子将VB转移到无菌盘中。如果需要，使用无菌纱布或手术巾吸收多余的液体。
11.记录表面去污的结束时间。
C.骨研磨
1.记录用于研磨VB的装置，并根据骨研磨机操作和维护或CCF骨研磨机进行设置。
2.记录研磨开始时间。
3.获得在工艺开始时制备的1L研磨介质。
4.将300mL的研磨介质倒入一个无菌的不锈钢罐中。该罐将被称为“罐1”，并且将包含切割的VB块。将300mL的研磨介质倒入另一个名为“罐2”的罐或收集盘中，以收集研磨物。另外300mL将用于在研磨时冲洗研磨机。剩余的100mL研磨介质将放置在一边，用于在研磨完所有块之后对研磨机和罐2进行最终冲洗。
5.将罐2放置在研磨机头下方。
6.使用干净的盖布并戴上手套，使用手动切割工具将VB切割成适合研磨机的大小的块。应立即将切割的块浸没在具有研磨介质的罐1中。
7.验证1L的研磨介质是否已被使用并且在罐2中。关闭研磨机并记录研磨结束时间。
D.过滤
1.打开骨髓收集试剂盒，并使用VWR-3000P天平记录一个空的600mL TRANSFER-PACK的质量。600mL TRANSFER-PACK的空质量。
2.组装骨髓过滤试剂盒，并在实施例1的骨髓收集和过滤之后，使用总共1000mL的冲洗介质(2×500mL)进行骨髓提取。注意：之后的总介质体积为2L(1L研磨介质和1L冲洗介质)。
3.记录每个填充的600mL TRANSFER-PACK的质量(g)，并计算所有6个TRANSFER-PACK的总质量。
4.计算骨髓(BM)提取物的总质量：总质量(g)(D.3[B])、空质量(g)(D.1[A])、所有TRANSFER-PACK的空质量(g)(A×6)和骨髓提取物的总质量(g)(B-C)。
5.中间问责：BM提取物的总质量>1800g(如果是，继续；如果不是，通知主管)。
6.关闭额外2000mL TRANSFER-PACK上的夹具，并保存以供以后使用。
7.目视检查每个TRANSFER-PACK中的骨髓(BM)，以确认不存在可见的研磨物或软组织。如果在过滤期间观察到过多的结块，则通知区域管理人员。
8.识别过滤的第一TRANSFER-PACK。通过倒置混合TRANSFER-PACK，然后使用1mL注射器在BSC中取出0.3mL的BM。将样品放入到带有ISBT编号和“QC 1”以及日期和时间的预先标记的管中。将样品提交给QC，以用于在Sysmex血液分析仪上进行测试。记录下面的结果并计算TNC(使用相同数量的来自QC1 Sysmex WBC浓度的有效数字)。处理可以在获得该结果之前进行。注意：假设密度为1g/ml。
9.在收集的六个TRANSFER-PACK中的每一个的端部上的连接器附近密封管道，并贴上ISBT编号标签。
10.记录过滤结束时间。
E.脂肪去除
1.将TRANSFER-PACK配对并使用配衡棒，使得离心机在操作前保持平衡。使用体积补偿板防止离心期间袋的起皱。
2.在室温下将离心机设置为500x g持续15分钟，其中制动器设置为4。离心TRANSFER-PACK，其中管道向下。
3.当TRANSFER-PACK在离心机中时，从BSC上取下所有盖布和供应品，并用70％异丙醇(IPA)清洁所有表面。
4.小心地从离心机中取出TRANSFER-PACK，一次一个，并且悬挂在环形支架上。
5.将空的、新的600mL Fenwal袋(脂肪后(post-fat)中间袋)焊接到离心的TRANSFER-PACK上。在新的后脂肪中间袋上贴上ISBT编号标签。在继续之前，检查焊缝。
6.将离心的TRANSFER-PACK挂在一个环形支架上，将袋夹具放在脂肪正下方，并且打开管道上的焊缝，并将沉淀物排入到新的后脂肪中间袋。轻轻地搅动沉淀物和掺料端口(spike port)，以重新悬浮所有沉淀物。在继续之前，允许来自离心袋的至少一半的体积排入到后脂肪中间袋中。注意：最好不要让所有液体从夹具上方排出。如果液体似乎在快速排出，则使用一只手压紧夹具，以减缓液体的排出。
7.用止血钳或管密封器封闭管道。
8.将下一个离心的TRANSFER-PACK焊接到在E.6中用于收集沉淀物的同一个后脂肪中间袋上。在该袋上留有足够的管道，以用于将来焊接。
9.重复E.6.-E.7。
10.对于接下来的两个离心的TRANSFER-PACK，重复E.4.-E.9.，创建第二个后脂肪中间袋。
11.对于最后两个离心的袋重复E.4.-E.9.，创建第三个后脂肪中间袋。
F.浓缩
1.在室温下将离心机设置为500x g持续15分钟，其中制动器设置为4。离心后脂肪中间袋，其中管道朝上。使用体积补偿板，以防止离心期间袋的起皱。
2.小心地从离心机中取出后脂肪中间袋，并悬挂在血浆压机上。一次只能从离心机中取出一个袋。
3.对于离心的每个袋，焊接在1000mL的废物袋(标签为“废物”)上，并使用血浆提取器以将上清液转移到废物袋中。一旦沉淀物破裂或当沉淀物升至接近顶部时，使用止血钳夹住管道。
4.密封管道并切开，以从废物袋中取出后脂肪中间袋，留下附接的足够的管道用于焊接。焊接在母鲁尔延伸部(female lure extension)上。
5.对每个后脂肪中间袋重复F.2.-F.4.。
6.将废物袋丢弃在生物危害垃圾袋中。
7.将来自BM过滤试剂盒的新的空的2L散装袋贴上ISBT编号标签，然后测量并记录质量。如果从BSC中取出袋用于称重，则在返回BSC之后，用无菌酒精清洁鲁尔接头。在继续之前，等待直到干燥。
8.对于以下材料，用70％IPA喷雾，置于BSC内，并在继续之前，等待直到干燥：50mL注射器(3)、30mL注射器、50mL锥形管和支架、冲洗介质。
9.使用新的50mL注射器将来自三个小袋中的每一个的沉淀物混合到预先称重的散装袋中。注意：缓慢地按下注射器的柱塞，并避免产生气泡。
10.将25mL的冲洗介质无菌地转移到50mL的锥形管中。使用新的30mL注射器，用20mL的冲洗介质连续地冲洗每个袋，并加入到散装袋中。注意：如果30mL注射器太小，则可以使用50mL注射器在袋之间运送体积。
G.抽样和责任
1.在散装袋上，打开夹具，并将管道中的BM提取物排回袋中。将袋倒置最少三次以混合，确保所有沉淀物被重新悬浮。使用1mL注射器在BSC内取出约0.5mL的BM提取物。将样品体积放置在具有ISBT编号和“QC2”以及样品采集的日期和时间的预先标记的无菌样品管中。将样品连同至少50mL的冲洗介质一起提交给QC用于测试。记录提交样品用于测试的时间。
2.测量并记录散装袋的骨髓提取物的质量。从填充的质量中减去空质量，以得到BM提取物的质量(小数点后一位)，包括空质量[G](g)、填充的质量[H](g)、BM提取物的质量[H-G](g)。
3.记录来自以下QC2打印输出的结果，并计算QC2浓度和QC2TNC计数(使用来自QC2Sysmex WBC浓度的相同数量的有效数字用于QC2 TNC计数)。注意：假设密度为1g/mL，包括QC2 Sysmex WBC浓度(细胞/μL)；QC2稀释因子；QC2浓度(细胞/mL)(K×L×1000)；和QC2TNC计数[M×G.2(J)]。
4.针对QC2 TNC计数计算TNC％产率，精确到的小数点后一位(G.3[N])；QC1(D.8[F])；并且产率％＝(N÷F)×100。
H.确定袋的数量
1.记录来自[G.3(N)]的QC2 TNC计数。计算所需的总体积(小数点后一位)，所需的总体积(mL)[N÷(140×106)]。注意：如果体积小于228.9mL，则通知生产主管。
2.使用之前所需的总体积确定要准备的袋和小瓶的数量。
3.计算所需的冷冻介质的体积、冲洗介质的体积和要添加的DMSO的体积。将计算的数字四舍五入至小数点后一位(所需的总体积
(H.1[P])；BM提取物的质量[G.2.J](g为大约ml)；冷冻介质的总体积(Q-R)；DMSO的体积(Q×0.1)；和冲洗介质的体积(S-T)。注意：假设BM提取物的密度为1g/ml。
I.冷冻保护剂添加
1.使用根据B-6制备的冲洗介质和100％DMSO制备冷冻介质。将在H.3[U]中计算的冲洗介质的体积添加到标有“冷冻介质”和制备日期的无菌瓶中。
2.将在H.3[T]中计算的DMSO的体积添加到冷冻介质瓶中。轻轻倒置瓶一次以混合。
3.记录冷冻介质的温度。
4.如果冷冻介质的温度>25.0℃，则等待直到冷冻介质的温度降至<25.0℃。如果可以，在使用前记录冷冻介质的新温度。
5.在BSC内，将BM散装袋放置在摇杆上用于混合。取下大注射器的柱塞，并连接到散装袋上的鲁尔端口。在整个添加期间保持注射器直立。
6.计算每分钟添加到散装袋中的冷冻介质的体积，如通过冷冻介质的体积(H.3.[S])和每分钟添加的体积(S×0.1)所确定的。
7.设置计时器持续10分钟，并且开始通过注射器以每分钟10％冷冻介质体积的速度添加冷冻介质，如在I.6中计算的。
8.记录DMSO添加的开始和结束时间。目标是经过的时间在约9至约11分钟之间。
J.冷冻保存
1.参考H.2.来确定所需的冷冻保存袋和替代小瓶的数量。关闭夹具，并在冷冻保存袋上贴上准备好的产品标签，包括ISBT编号、产品名称和处理的日期。注意：标签放在每个袋的右上角的口袋内。使用管密封器将口袋固定，使得标签不会掉出来。
2.使用10ml注射器来抽取所需的替代小瓶的全部体积，并填充骨髓(每小瓶1ml)。
3.对于每个冷冻保存袋，在BSC内，使用新的100ml注射器向袋中填充65ml的骨髓。
4.拧开注射器，以允许管道排放回袋中，然后重新连接注射器，并将空气从袋中抽出，同时保持系统直立。
5.当骨髓填充管道时，紧临通过Y型连接器之前，夹紧管道。丢弃注射器并更换盖子。
6.在移除更多的体积之前，通过倒置混合散装袋。对要制备的产品的每个冷冻保存袋重复J.3-J.5。
7.记录制备的袋的实际数量。
8.如果在散装袋中存在骨髓，则可以准备用于研究使用的小瓶。给所需数量的5mL冷冻小瓶贴上标签，并通过注射器或移液管向每个小瓶填充5mL的BM。
9.使用管密封器来密封管道，以在每个产品袋上创建四个区段，用于冷冻保存。
10.记录用于装袋的结束时间。注意：在加入DMSO之后，产品和样品必须尽快冷冻。
11.通知QC袋已准备好用于冷冻保存。注意：QC将在冷冻产品袋之前进行包装检查。
12.对于每个冷冻保存袋，切开管道中的密封件，以取出4个区段。
13.将低温保藏袋置于盒中和/或直接置于搁架上(参见图14和图15)放入Styrofoam箱中并且将代用小瓶分隔地置于冷冻贮藏系统中并在盒的箱子前方置于冷冻机中。
14.记录盒和样品被置于冷冻机中的日期和时间。
15.记录小瓶被置于冷冻机中的日期和时间。
K.库存
1.根据Freezerworks库存管理，将检疫状态的供体材料输入Freezerworks中。注意：确保每个被动冷却容器的数量匹配Freezerworks中的箱数。
实施例2.漂白剂浸泡椎体
此实验的范围涵盖在将椎体在5,000ppm漂白剂溶液中浸泡不同时间长度之后测试骨髓提取物以评价在该过程中对细胞存活率变化的潜在影响，具体地，在实施例1的“骨研磨”步骤之前将采用所述的漂白方案。通过基于CD45和CD34的细胞表面表达而分选细胞来确定细胞的存活率。CD45是在所有人白细胞(包括淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)上存在的抗原。它在信号转导中发挥作用并且在造血祖细胞上弱表达。CD34是骨髓和血液中在未成熟的造血前体细胞和所有造血集落形成细胞上存在的抗原。某些非造血(即CD45阴性)细胞群也表达CD34。在造血细胞(即CD45+细胞)中，CD34抗原表达在早期祖细胞上最高，并随着细胞的成熟而减少。在完全分化的造血细胞上不存在CD34抗原。正常外周血淋巴细胞、单核细胞、粒细胞和血小板不表达CD34抗原。
根据实施例1的组织加工的B-2对椎体进行清理。制备了10％漂白剂溶液和3％过氧化氢溶液。对于10、15、20和25分钟的每个时间点将VB分离至无菌袋并且在指定的时间中浸泡在漂白剂中。在已经过设定时间之后，将VB快速转移至过氧化氢无菌袋中，然后短暂震摇。然后，将VB转移至Plasma-Lyte袋中，短暂震摇，然后转移至最终Plasma-Lyte袋中。根据实施例1的组织加工的B-3将VB研磨。然后，对于每个时间点将研磨屑置于单独的筛中并将3ml骨髓样品用于测试。
从加工的每组VB而来的骨髓通过流式细胞术进行测试以评估存活率。如表4中所示，此实验的结果表明，当椎骨被浸泡多达25分钟时细胞存活率没有显著差异。从10分钟的当前方案增加时间可能不影响细胞的存活率。
表4.漂白剂浸泡椎体
实施例3.使用CliniMACS plus从来自死亡供体的新鲜的或解冻的BM中进行CD34选择
本文描述了从来自死亡供体的新鲜的或解冻的骨髓(BM)中分离表达CD34的细胞的方案。
缓冲剂和袋制备
如下将5个600ml Transfer-Pack袋加上标签，并且记录每袋的重量：
1)细胞制备袋1(可能超过1袋)
2)血浆废物
3)废物1
4)废物2
缓冲剂：
A.在生物安全操作柜(BSC)中制备
B.标记缓冲剂(2袋)：
1)获得2袋Plasma Lyte(1L)
2)获得固定有18号针的2个30cc注射器。
3)使用注射器和针，将20ml Benzonase(1000U/ml)和20mlHSA(25％)注射至每个1L Plasma Lyte袋。
4)每次注射使用新的注射器和针。
5)通过倒转至少5次而充分混合。
6)向每袋加上“标记缓冲剂”标签。
7)终浓度为20U/ml Benzonase和0.5％HSA。
C.选择缓冲剂：
1)获得1L袋Plasma Lyte。
2)获得固定有18号针的30cc注射器。
3)使用注射器和针，将20ml HSA(25％)注射至1L PlasmaLyte袋中。
4)通过倒转至少5次而充分混合。
5)向袋加上“选择缓冲剂”标签。
6)终浓度为0.5％has。
准备标记新鲜的(A)或冷冻的(B)骨髓产品
A.用于新鲜骨髓产品的方案：
1)在研磨和去除脂肪之后，将骨髓细胞悬浮液在血液收集袋中在300xg下离心15分钟。
2)在BSC中进行以下。
3)将所有骨髓细胞沉淀合并到细胞制备袋1中
4)将所有血液收集袋用50ml冲洗介质冲洗并且转移至细胞制备袋1。
5)称量袋。
6)通过从此部分的步骤5中获得的重量减去初始重量来确定细胞制备袋1中细胞悬浮液的总体积。使用下式将重量换算为体积：1克＝1ml。
7)以旋转运动温和地混合细胞制备袋1。
8)使用1.0ml注射器通过采样部位联接器而抽取0.5ml骨髓并转移至1.5mlEppendorf管中以通过使用流式细胞术对CD34+
细胞和T细胞计数。
9)向细胞制备袋1填充大约400ml标记缓冲剂并且在室温下以300g离心15分钟，制动器设定在4。
10)如表5中所示基于总T细胞和CD34+细胞计数而将细胞制备袋1中的体积减小至期望体积。
表5.对于选择CD34+细胞而言优化的标记体积和管线设定确定
B.用于解冻的骨髓的方案：
1)将2个低温保藏袋中的细胞在37℃水浴中解冻。
2)将所有袋转移至BSC。
3)无菌清洁每个袋的端口和尖刺。
4)使用固定有针的5cc注射器，立即将Benzonase(1000U/ml)注射到每个低温保藏袋中以达到20U/mL的终浓度(例如，对于70ml骨髓产品，注射1.4mL Benzonase)并且充分混合。
5)通过使用附接至转移端口的100mL注射器抽取而将来自2个解冻的低温保藏袋中的内容物合并到细胞制备袋1中。
6)将每袋用50ml标记缓冲剂冲洗并且缓慢转移至相同细胞制备袋1。
7)记录细胞制备袋1的重量。
8)通过从步骤7中获得的重量(1gram＝1mL)减去初始重量来记录细胞制备袋1中细胞悬浮液的总体积(应不超过200mL)。
9)通过在摇床上震摇时添加10％体积/分钟而缓慢地向细胞制备袋1填充等体积的标记缓冲剂。
10)将另一体积的标记缓冲剂快速添加至细胞制备袋1。
11)在充分混合之后，取出0.5ml样品以便通过流式细胞术对T细胞和CD34+细胞计数。
12)任选步骤：如果存在聚集，则插入标准血液过滤器，过滤细胞并转移至第二细胞制备袋。
13)在室温下以300g离心15分钟，制动器设定在4。
14)吸取上清液，温和地混合细胞沉淀并将所有细胞合并到一个袋中。
15)洗涤袋并且根据表5用标记缓冲剂将体积调整至目标体积。
细胞标记和选择
A.以终浓度1.5mg/ml将人IVIG添加到细胞制备袋。
B.添加的IVIG的计算体积应被包括在最终标记重量中，取决于制备规模，不超过95g或190g(表5)。
C.使用固定有0.2微米过滤器的100ml注射器将100ml无菌空气注射到袋中
D.将细胞制备袋置于轨道式旋转器上并且在室温下温和地震摇5分钟。
E.在5分钟后，使用20ml注射器，通过采样部位联接器对于标准规模将1小瓶(7.5ml)CD34+试剂或者对于大规模将2小瓶(15ml)注射到细胞制备袋。
F.将袋在轨道式旋转器上在室温下孵育30分钟。
G.在BSC中，使用100ml注射器，去除细胞制备袋中的空气。将500±10ml(g)的标记缓冲剂添加至细胞制备袋。在室温下以300g离心15分钟，制动器设定在4。
H.使用血浆压力机从细胞制备袋中去除尽可能多的上清液(对于标准规模，至少500ml，对于大规模，450ml)。小心地不去除细胞。
I.记录去除的上清液的量。
J.将500±10ml(g)标记缓冲剂添加至细胞制备袋。
K.在室温下以300g离心15分钟，制动器设定在4。
L.使用血浆压力机从细胞制备袋中去除尽可能多的上清液(对于标准规模，至少500ml，对于大规模，450ml)。
M.温和地混合细胞沉淀，并且用标记缓冲剂1使沉淀重悬，对于标准规模制备，至目标体积140ml，或者对于大规模，265ml。
N.在BSC内，使用1mL注射器将0.5ml骨髓转移至1.5mlEppendorf管以进行前-CliniMACS QC，包括细胞计数、T细胞和CD34+细胞计数。
O.根据生产商的说明书，产品已准备好在CliniMACS plus仪器上加工，例外之处在于使用定制选择缓冲剂替代MACS缓冲剂。
P.在结束时选择的细胞的体积，对于标准选择管线设定，预期为约40-50ml，而对于大规模选择，预期为约75-80ml。
Q.获得样品用于产品QC。
R.选择的细胞已准备好用于立即输注或低温保藏。
实施例4.HPC骨髓摇床研磨屑
此实验的范围涵盖使用不同的研磨和过滤方法测试骨髓提取物，添加摇床以确定和比较细胞浓度，从而在过滤之前通过使用摇床来评价骨髓提取物的细胞浓度(WBC)。在从填充的第一600mL袋中第二次过滤之后进行“质量控制1”(QC1)。“CD34+HSC”是这样的细胞，其具有与淋巴细胞相似的前向散射和侧向散射特征；表达CD45和CD34二者并且表现出黯淡的CD45表达和低侧向散射特征。(也被ISHAGE称为"True Blasts")。CD45是在所有人白细胞(包括淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)上存在的抗原。它在信号转导中发挥作用并且在造血祖细胞上弱表达。
根据实施例1的B-2和B-3，并且使用所附的用于研磨和过滤的方案，从尸体椎体(VB)中生产骨髓提取物。研磨方案包括：
A.在去污染下将VB分到两个单独无菌袋中。记录标签袋编号1和编号2重量。
B.研磨方案：
1)在去污染下将VB分到两个单独无菌袋中。记录重量。标记袋编号1和编号2。
2)组装研磨机。踩下脚踏板来启动。
3)将133mL的研磨介质倒入一个无菌不锈钢罐中。此罐将被称为“罐1”并且将容纳VB切块。将133mL的研磨介质倒入另一个罐(称为“罐2”)中以捕集研磨屑。另外133mL将用于在研磨时冲洗研磨机。剩余100mL的研磨介质将被留出用于在研磨所有碎片之后最终冲洗研磨机。
4)使用手动切割工具将VB切成不大于1.5cm。将VB碎片置于“罐1”中。
5)使用无菌钳子，小心地夹住一个VB块并且将其投入研磨机的入口容器中。不要用钳子将VB块强行放入研磨机中。按照需要使用柱塞。
6)研磨屑将被捕集在“罐2”中。偶尔用另外133mL的研磨介质冲洗研磨机头。确保所有研磨屑被完全回收在研磨介质中。
7)小心地将剩余100mL研磨介质倒入入口容器中以冲洗研磨屑。
8)当所有研磨屑已被洗涤通过研磨机时，通过踩下脚踏板而终止研磨机。
9)使用剩余500mL研磨介质对实验(袋编号2)重复B.3-B.7。C.过滤方案包括：
1)用70％IPA彻底地喷洒无菌的白盖容器或不锈钢瓶和2个骨髓(BM)过滤套件并将其置于BSC内。
2)对于袋编号1(对照)，使用总500ml冲洗介质(2x 250ml)按照实施例1的骨髓收集和过滤进行相同BM提取。
3)对于袋编号2(实验)，无菌地将研磨介质和BM研磨屑从罐中倒至白盖容器或不锈钢瓶。
4)将无菌容器置于摇床板上在150RPM下持续10分钟。
5)打开收集容器盖并插入大无菌漏斗。
6)使用大无菌漏斗，小心地将研磨介质和BM研磨屑倒入收集容器中(不要将骨添加到收集容器中)。
7)取下无菌漏斗。关闭收集容器盖。
8)将250mL冲洗介质倒入含有骨研磨屑的白盖容器或不锈钢瓶中。稍微旋转。
9)将无菌容器置于摇床板上在120RPM下持续5分钟。
10)在摇床正在运行时，打开收集容器和TRANSFER-PACK容器上的夹具。允许骨髓通过重力而流入TRANSFER-PACK中。
11)一旦所有介质已被排入TRANSFER-PACK中，闭合所有夹具。
12)打开收集容器盖并插入无菌漏斗。小心地将冲洗介质和BM研磨屑倒入收集容器漏斗中(不要将骨添加到收集容器中)。
13)重复C.8-C.12。
14)小心地将冲洗介质和骨研磨屑倒入收集容器漏斗中，使用钳子来帮助将研磨屑推入收集容器中。
15)闭合夹具并且从过滤器组中取出2000mL TRANSFER-PACK。弃去用过的过滤器和收集容器。
16)用70％IPA和两个1mL注射器喷洒微量离心管的容器。将其置于BSC中并且取出2个微量离心管。将一个管标记编号1而将另一个标记编号2。
17)根据TSCD II无菌管线焊接操作，将公鲁尔延伸部无菌焊接到2000mLTRANSFER-PACK上。
18)使用无菌1mL注射器，从袋编号1袋中取出1mL的BM。向袋编号1微量离心管标记上时间和日期。对袋编号2重复步骤。
19)按照实施例1的骨髓收集和过滤继续BM提取和过滤编号2。D.对于袋编号1和编号2，对QC1样品进行Sysmex和流动测试。供体之一W437520000047违反了原始方案。仅使用一个过滤套件而不进行过滤编号2。不具有彼此相连的两个500gm过滤单元，用于此供体的单个过滤套件被设置为其中一个500gm过滤器和一个200gm过滤器相互连接。尽管使用仅一个过滤套件，但是在500和200gm过滤单元中没有凝集的迹象。
结果
将来自3个不同供体的骨髓收集用于此实验，其全部具有不同年龄。所有供体在研究实验室中被加工用于非临床开发目的。从QC1收集数据。(表6)对照浓缩的骨髓提取物的平均细胞浓度是17.3x 103g/ml，而实验骨髓提取物的细胞浓度是26.4x 103g/ml。对照和实验的细胞浓度之间的差异是9.1x 103g/ml。两组之间计算的p值是0.0237。
表6.HPC骨髓摇床研磨屑的总结
从3个不同供体，进行流式细胞术并在对照和实验之间进行分析(表7)。检查了absCD45+和CD34+的具体数据以及CD45+和CD34+的存活率百分比。
表7.流式细胞术检查CD45和CD34+细胞
表8显示了利用本文所述的加工技术和附加的震摇或附加的震摇和旋转而分离的骨髓细胞之间的比较。从仅震摇或者从震摇和旋转分离的细胞表现出相似的特征例如存活率、CD34表达、CD45表达或CD3表达。
表8.震摇或摇床和旋转比较
在此研究中，将椎体分成两组以便在研磨和过滤期间测试新方法。该方法将包括使用摇床用于骨研磨屑。在此方案之前，在收集容器中除了揉擦研磨屑之外，不使用搅动。此研究的目的是在使用摇床的情况下增加骨髓提取物中的细胞产量。预期由于在三个不同阶段中以一致的速度搅动骨研磨屑而可能增加细胞浓度。相似的研究在匹兹堡大学癌症研究所的造血干细胞实验室(Donnenberg等人，2011)完成。搅动骨研磨屑的构思是将大量骨髓从供体提取到介质中。
使用Sysmex和流式细胞术来测试HPC骨髓提取物。当将方案与对照比较时，在使用摇床的方法中，数据表现出较高细胞浓度计数、abs CD45+和CD34+HSPC增加以及CD45+和CD34+HSPC的较高存活率百分比的一致模式。进行t-检验以代表两个测试组之间的差异。计算出的p值较小，表明实验结果偶然发生的概率仅为2.37％。使用Sysmex的目的是获得每个供体的加工中的血液计数，但是此计数包括成核红细胞。在此，集中在通过流式细胞术获得的白血球(白细胞)计数，尤其CD34+细胞的数量，因为它们是将植入患者中的干细胞。
执行流式细胞术是为了评价和分析CD45+和CD34+细胞计数和存活率。在实验方法中CD45+显示出计数和存活率的增加，然而，在细胞类型方面可能存在变异性，例如，在低温保藏期间急剧下降的粒细胞。类似地，CD34+的计数、细胞浓度及其存活率百分比增加。基于来自匹兹堡大学的文献，如此的程序可以在临床应用期间使用。此外，随着CD45和CD34+细胞的数量增加，其将增加可以被储存的单元的数量。
实施例5.仅在-86℃的浸入温度使用盒被动冷却的HPC骨髓
此研究的目的是为了评价模拟的HPC骨髓和HPC骨髓产品的冷却曲线以改进低温保藏加工。通过实施例1的被动低温保藏，将65ml HPC骨髓在Cryostore 250EVA冷冻袋中置于冷冻盒以进行2-步骤低温保藏过程，包括在机械冷冻机中被动冷却至-86℃，随后浸入LN2蒸气相中以进行细胞内玻璃化和长期贮藏。虽然此方法已被验证并且实现令人满意的结果，但已注意到就存活率测试而言解冻后QC小瓶经常胜过袋。在初始验证时，注意到，与小瓶相比，箱的热阻导致更慢的冷却速率。对于相对溶质不敏感的CD34+细胞，这未被确定为问题。此过程改进工作是基于观察到：HPC骨髓产品中的其他细胞(即中性粒细胞)可能是更加溶质敏感的，因此在非常慢的冷却速率下可能表现并不好，并且由于溢出细胞内内容物而可能附带性地损伤CD34+细胞。
因此，此实验的目的是确定-86℃静态腔室温度是否可能产生一种被动冷却方法，该方法通过消除箱而产生一致的冷却速率，从而在解冻后产生更高的存活率。对于第一实验，模拟的HPC骨髓(冷冻介质)可以仅利用盒而加载至-86℃，并且可以利用袋内的热电偶来测量冷却曲线。第二实验可以利用在袋外侧的热电偶来评价仅利用盒在-86℃的HPC骨髓的冷却曲线。如果冷却速率以大约-1℃/min从低于初始冰成核至-40℃成功地实现，则后续单独的评价可以基于流式细胞术考虑解冻后细胞存活率，从而确定仅利用盒冷却如何影响CD34+细胞的解冻后存活率。
定义：CD34：存在于骨髓和血液中的未成熟的造血前体细胞和所有造血集落形成细胞上的抗原。某些非造血(即CD45阴性)细胞群也表达CD34。在造血细胞(即CD45+细胞)中，CD34抗原表达在早期祖细胞上最高，并随着细胞的成熟而减少。在完全分化的造血细胞上不存在CD34抗原。正常外周血淋巴细胞、单核细胞、粒细胞和血小板不表达CD34抗原。CD45：存在于所有人白细胞(包括淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)上的抗原。它在信号转导中发挥作用并且在造血祖细胞上弱表达。DMSO(C2H6OS)：二甲基亚砜。用作低温防护剂。Plasma Lyte-A：一种无菌、无热原的等渗溶液，其接近地模拟人血浆。人血清白蛋白(HSA)：一种水溶性单体蛋白质，具有转运激素、脂肪酸及其他化合物，缓冲pH以及维持胶体渗透压等功能。它是人血浆中存在的主要蛋白质。冲洗介质：一种由Plasma Lyte-A和2.5％HSA组成的溶液。冷冻介质：一种由冲洗介质和10％DMSO组成的溶液。BSC：生物安全操作柜。
HPC库被开发用于源自已故器官和组织供体的骨髓。HPC骨髓被贮藏在冷冻袋(Cryostore 250EVA冷冻袋)中置于盒中。对此材料的低温保藏包括在专用-86℃Eppendorf CryoCube型号F740hi中被动冷却HPC骨髓，然后转移至低温贮藏在蒸气氮低温罐中的永久位置。对于实验的第一阶段，冷冻介质用来模拟HPC骨髓。为了将冷冻袋准备用于实验，使用加热的螺丝刀在袋子最中心的钉孔上钻了一个洞。T型热电偶通过新钻的孔插入冷冻袋的中间。然后使用低温加热枪和环氧树脂胶棒将孔密封，由此也将热电偶保持就位。然后，向冷冻袋填充65±5mL冷冻介质。将从袋中去除过量空气并且将所有端口密封。然后，将这些冷冻袋置于冷冻盒中并且在温度板上标记每个相应的端口(C0H/C0L-C7H/C7L)。用于此实验的温度板是Omega OM-USB-TC温度板。
与温度板联合使用的软件是TracerDAQ，软件版本2.3.4.0。与温度板一起使用的计算机型号是安装有Microsoft Windows Home 10的型号20F13CT01WW联想台式机。TracerDAQ中所用的设置被设置为扫描速率调整至0.05Hz，导致每20秒1个数据点。在“显示设置”中，选择摄氏度作为标签。上限和下限分别被选择在30℃和-190℃。数据采集的持续时间是6小时和10分钟。
初步实验表明，如果盒被安置成直接紧靠冷冻机的壁，则冷却速率可能更快，但在搁架的主体各处是一致的(数据未示出)。出于这些原因，将盒安置在专用-86℃ EppendorfCryoCube型号F740hi(资产0144)的顶部搁架中搁架的特定位置。根据用户手册，-86℃Eppendorf Cryocube型号F740hi中搁架的长度和宽度分别为86.5×62.1cm。盒的长度和宽度分别为20.0×14.0cm。将盒安置成每排4个的两排，与冷冻机的两侧相距15cm，并且与冷冻机的背部相距11cm(图15)。这使得盒处于冷冻机的最中心位置中。注意在安置和关闭冷冻机门期间不要拉扯热电偶导线以保持它们就位。在完成时，将数据保存为excel csv文件，然后将格式设置为xlsx文件。将所有Excel工作表打印并且存档在ProcessImprovement Experimental Report:HPC,Marrow Passively Cooled Using CassettesOnly Binder中。
使用来自供体ISBT:W437520000044-W437520000046的HPC骨髓进行第二实验。所有供体批次记录和测试记录可以在供体文件中查找。年龄、性别、热缺血时间和冷缺血时间总结在表9中。
表9.所用供体的年龄、性别和缺血时间。
为了跟踪冷冻介质的温度，Omega OM-USB-TC温度板与T型热电偶一起使用。在接收HPC骨髓之前，使计算机的自动更新设置暂停以避免数据采集的中断。节能设置也设置为在数据采集期间不允许计算机关闭或睡眠。
根据当前加工方法，从每个供体中收集容纳65±5mL HPC骨髓的三个低温保藏袋。将热电偶居中安置在袋的外表面上并且通过胶带保持就位。然后，将每个袋置于盒中，并且将热电偶按从C0H/C0L开始到C2H/C2L结束的升序放置在热电偶的端口中。然后，向盒加上供体ID、日期、袋编号的标签，并且插入温度板端口热电偶。
与温度板联合使用的软件是TracerDAQ。TracerDAQ中所用的设置被设置为扫描速率调整至0.05Hz，导致每20秒1个数据点。在“显示设置”中，选择摄氏度作为标签。上限和下限分别被选择在30℃和-190℃。数据采集的持续时间是6小时和10分钟。
当在TracerDaq中按压"开始"时，就开始数据采集，将盒安置在-86℃ EppendorfCryoCube型号F740hi的顶部搁架(搁架1)。它们相对于搁架的位置如图14或图15中所示。对于供体W437520000044，将冷冻小瓶与顶部搁架上的盒一起在-86℃浸入。对于剩余供体，将冷冻小瓶在-86℃浸入在底部搁架上(搁架3)。用于所有供体的盒的位置保持相同以维持一致性。
每个冷冻袋，由1个PT QC小瓶、2个保藏小瓶和1个代用小瓶组成的HPC骨髓小瓶通过实施例1的被动低温保藏进行低温保藏。供体W437520000045-W437520000046从实施例1的被动低温保藏偏离之处在于浸入在-86℃ Eppendorf CryoCube型号F740hi的底部搁架中而不是在顶部搁架。
当数据采集完成时，就将盒从-86℃ Eppendorf CryoCube型号F740hi的顶部搁架(搁架1)转移至中央搁架(搁架2)。当允许盒在中央搁架中经过最少6小时时，将盒和冷冻小瓶转移至气相氮冷却罐，在其中它们被贮藏直至解冻后存活率测试为止。供体W437520000044、W437520000045和W437520000046的解冻后结果参见表16-表18。
通过Omega OM-USB-TC温度板获取的数据被保存为excel.csv文件，然后重新设定格式为excel.xlsx文件。为了给出每个盒的总体数据的可视化表示，绘制由温度(℃)相对于时间(min)、超冷冻数据和亚冷冻数据以及成核点组成的散点图。示例性冷冻曲线参见图16。将超冷冻和亚冷冻图表和成核点叠加在每个端口(C0H/C0L-C7H/C7L)的总体数据的散点图上。
为了确定超冷冻检查/冷却速率，从大约17℃至成核点绘制(℃/min)散点图。使用excel，线性趋势线用于确定斜率以及决定系数。此方法用于确定所有超冷冻冷却速率。
为了确定亚冷冻检查/冷却速率，从-10℃至-40℃绘制(℃/min)散点图。使用excel，线性趋势线用于确定斜率以及决定系数。此方法用于确定所有亚冷冻冷却速率。
随着冰形成，熔化潜热被释放，导致温度增加。因此，为了确定成核时的温度，在温度增加之前记录的最低温度是成核温度。使用由Microsoft Excel 2004版提供的数据分析工具进行统计学分析。实验1的结果报告在表10-表12中。对于表10中所有三个模拟的骨髓试验，平均超冷冻冷却速率为-3.2℃(在-2.54至-4.09℃/min的范围)。对于表11中所有三个模拟的骨髓试验，平均亚冷冻冷却速率为-1.36℃/min(在-1.13至-1.62℃/min的范围)。对于表12中所有三个模拟的试验，平均成核温度为-12.31(在-7.24至-17.52℃的范围)。
表10.模拟的HPC骨髓超冷冻速率(℃/min)
| 通道 | 试验1 | 试验2 | 试验3 |
| C0H/C0L | -3.49 | -3.53 | -3.37 |
| C1H/C1L | -3.11 | -3.62 | -3.1 |
| C2H/C2L | -2.59 | -2.54 | -2.91 |
| C3H/C3L | -3.49 | -3.24 | -3.28 |
| C4H/C4L | -3.02 | -3.45 | -3.36 |
| C5H/C5L | -3.3 | -4.09 | -3.1 |
| C6H/C6L | -2.95 | -2.85 | -3.16 |
| C7H/C7L | -3.57 | -3.52 | -3.16 |
表11.模拟的HPC骨髓亚冷冻速率
表12.模拟的HPC骨髓成核温度(℃)
对于W437520000045和W437520000046，对C2H/C2L未记录温度板数据。
对于HPC骨髓的所有三个供体，平均超冷冻速率为-3.90℃/min(在-3.52至-4.23℃/min的范围，表13)。
表13:HPC骨髓超冷冻速率(℃/min)
| 通道 | W437520000044 | W437520000045 | W437520000046 |
| C0H/C0L | -3.78 | -3.52 | -4.12 |
| C1H/C1L | -4.23 | -3.84 | -3.77 |
| C2H/C2L | -4.01 |
对于HPC骨髓的所有三个供体，平均亚冷冻速率为-1.5157℃/min(在-1.3178至-1.6448℃/min的范围，表14)。
表14:HPC骨髓亚冷冻速率(℃/min)
| 通道 | W437520000044 | W437520000045 | W437520000046 |
| C0H/C0L | -1.5553 | -1.3178 | -1.6339 |
| C1H/C1L | -1.6448 | -1.3693 | -1.5309 |
| C2H/C2L | -1.5578 |
对于HPC骨髓的所有三个供体，平均成核温度为-13.7032℃(在-10.9017℃至-18.3652℃的范围，表15)。
表15:HPC骨髓成核温度(℃)
| 通道 | W437520000044 | W437520000045 | W437520000046 |
| C0H/C0L | -10.9017 | -12.7773 | -18.3652 |
| C1H/C1L | -12.3823 | -13.2287 | -17.005 |
| C2H/C2L | -11.2624 |
关于造血干细胞/祖细胞产品的成功低温保藏的主要文献表明-1至-5℃的冷却速率产生等效的优化的产量。如果静态腔室被动冷冻系统与盒中的袋一起使用而不使用进一步隔热器(并且将袋置于不直接紧靠冷冻机的壁)，则冷却曲线看起来一致并且满足高存活率所需的冷却速率需求。在这些实验中测试的方法适合于后续验证。
实施例6.在无SmartCool箱的情况下冷冻的HPC骨髓的解冻后结果
为了评价在无SmartCool箱的情况下在Cryostore 250EVA冷冻袋中冷冻HPC骨髓如何影响解冻后存活率和增殖。在CoolCells中冷冻的小瓶以及在无SmartCool箱的情况下冷冻的袋的解冻后存活率应满足50％的解冻后CD34+HSC存活率以及至少1CFU-GM/105。SmartCool箱的免除应消除袋与小瓶之间的系统性差异，以便解冻后小瓶可以用作袋的代用品。在袋与小瓶之间观察到的变异性应相当于测试人供体样品时预期的变异性。该实验及其数据将用于确定在不使用被动冷却箱的情况下在Cryostore 250EVA冷冻袋中冷冻HPC骨髓袋是否适合，以及解冻后小瓶是否可以作为袋的代用品。
根据当前批次记录和测试方法，将三个供体加工，在无被动冷却箱的情况下冷冻，解冻和测试(表16-18)。如本文中所述，将样品解冻。
实施例7.根据本文所述的方法进行集落形成单位测定。
在CoolCells中冷冻的所有小瓶以及在无SmartCool箱的情况下冷冻的袋满足50％的解冻后CD34+HSC存活率并且具有至少1CFU-GM/105。在无SmartCool箱的情况下冷冻的袋与在CoolCells中冷冻的小瓶之前的变异性是从测试人供体而预期的变异性。SmartCool箱的免除没有显示出袋与小瓶之前的系统性差异。因此，SmartCool箱的免除将是积极改变，由此将允许解冻后小瓶用作袋的代用品。
表16.供体W437520000044解冻数据
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表17.供体W437520000045解冻数据
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表18.供体W437520000046解冻数据
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实施例8.CD34+细胞富集和缓冲剂优化
Miltenyi CD34试剂系统最常用于临床干细胞分离，其利用位于磁场中的分离柱来捕集与抗体标记的细胞缀合的磁珠。在使用如CliniMACS用户手册中指导的标准方法加工期间，来自死亡供体的(新鲜或解冻的)BM易于产生若干细胞聚集体。聚集体可能堵塞前置系统过滤器或分离柱并且导致CliniMACS装置的仪器相关的停止。聚集体还可能导致目标细胞的损失。
死亡供体骨髓在加工之前不可避免地被冷却。低于10℃冷却导致血小板激活，并且加速粒细胞半衰期，在溶液中产生游离DNA的球团，导致细胞聚集。MACS缓冲剂被设计用于从非冷却的干细胞动员的和单采的(apheresed)外周血单位中选择CD34。MACS缓冲剂包含EDTA，以处理比在死亡供体所得的骨中观察的更高浓度的血小板，有助于防止凝结(其还导致细胞聚集但是通过不同的过程)。Benzonase添加至MACS缓冲剂清除游离DNA至MACS缓冲剂无效果，因为对于酶，没有足够的Mg++。Benzonase和Mg++(例如葡萄糖酸)的添加仍然无法克服EDTA。内部的缓冲剂(列表上的编号4)是稳定化细胞以供分离而不引起细胞聚集的一种方式。这主要是为了制备用于器官耐受性研究的CD34+细胞。目标是每kg患者体重1MCD34+细胞的充足细胞产量，所靶向的CD3+数量非常低。
这需要开发一种缓冲剂以防止聚集体的形成。
缓冲剂1：MACS缓冲剂(PBS+0.5％HSA+2mM EDTA)
缓冲剂2：MACS缓冲剂+20U/ml Benzonase；
缓冲剂3：MACS缓冲剂+20U/ml Benzonase+1.5mMMg葡萄糖酸盐
缓冲剂4：内部的标记稳定化缓冲剂(Plasmalyte+0.5％HSA+10U/ml肝素+20U/mlBenzonase)
表19显示了利用缓冲剂1、2、3或4从冷却的或冷冻的/解冻的样品中加工的骨髓细胞的存活率、CD45表达和CD34表达。通过缓冲剂2、3或4分离的骨髓细胞已显示出存活率或CD45表达的各种改进。每种缓冲剂使用750μl的骨髓样品。
表19.用缓冲剂1、2、3和4加工的骨髓细胞的比较
图18显示了当用稳定化缓冲剂从冷却的样品中加工骨髓细胞时防止了聚集体的形成。图17A显示了抗体标记之后的骨髓细胞浆料。数字编号对应于所用的缓冲剂。用稳定化缓冲剂(4)加工的骨髓细胞样品显示出不存在聚集体。图17B示出了在用稳定化缓冲剂加工的骨髓细胞样品中过滤之后缺乏截留的聚集体。图17C和图17D显示了用CliniMACS缓冲剂加工的骨髓细胞的聚集体形成(图17C)，或者用稳定化缓冲剂加工的骨髓细胞的聚集体不存在(图17D)。图17E显示用稳定化缓冲剂加工的骨髓细胞表现出骨髓细胞的增加的产量、存活率和CD34表达。
实施例9.低温保藏的骨髓样品的解冻
本文描述了用于解冻低温保藏的骨髓(BM)的示例性程序。在一些情况中，该程序可以用于解冻低温保藏的BM袋和小瓶以供测试。在一些情形中，当解冻袋或小瓶时(例如临床过程验证、临床开发等)，其可以用于解冻骨髓产品或解冻骨髓小瓶。
A.制备
1)按照实施例1制备冲洗介质。获得至少5mL冲洗介质/样品。
2)准备生物安全操作柜(BSC)。在开始解冻之前确保所有供应在BSC中。对150mL瓶或50mL锥形管加上ISBT供体编号、袋编号和最终稀释因子(DF＝3)的标签。
3)确保水浴具有足够的水(与顶部相距1英寸)并且预热至37±1℃。将水浴置于贮藏位置的数英尺内。
B.解冻
1)启动和完成对骨髓产品或骨髓小瓶的解冻。
2)在贮藏位置找到期望的低温保藏样品，并指出样品将从哪个位置取出(-86℃或蒸气氮气)。使一次解冻的小瓶和袋的数量最小化以确保及时且准确地完成该程序。
3)从库存中取出样品。
4)对于袋，将样品从盒中取出并且立即浸没在水浴中。
5)对于袋：在浸没时温和地接触袋。避免用力碎裂袋中的冰。继续进行直至少量小块冰剩余时为止。从水浴中取出。记录从水浴中取出时的时间并且立即使用IR温度计测量温度。
6)对于小瓶：在浸没时旋转和混合样品以确保均匀地解冻。继续进行直至最后可见的冰融化时为止。从水浴中取出。从不允许样品在解冻后位于浴中。
C.稀释
1)用乙醇喷洒样品容器并且置于BSC中。所有剩余步骤都将在BSC中进行。
2)对于袋：从瓶或锥形管去除盖。用70％乙醇喷洒和擦拭剪刀。切割BM袋管线并且排放到瓶或管中。用微量移液器取出1mL样品并且转移至5mL或15mL锥形管。
3)对于小瓶：使用微量移液器转移整个1mL样品体积并且转移至5mL或15mL锥形管。
4)启动计时器。使用冲洗介质，每分钟添加1mL样品体积的10％(100μL)持续10分钟。
5)将另外1mL冲洗介质一起添加至相同的上述样品。最终稀释样品体积为3mL(DF＝3)。
D.采样
1)流式细胞术样品
1.在微量离心管中，添加200μl解冻的稀释细胞(DF＝3)和400μl冲洗介质。加上供体ID、样品ID、流量、非无菌(NS)和DF＝9的标签。
2.根据使用Sysmex XP-300血液分析仪对解冻的骨髓的TNC量化对NS样品计数，以在Sysmex XP-300上获得计数。
3.记录解冻骨髓产品或解冻骨髓小瓶的Sysmex结果。
4.使用剩余NS样品进行流式细胞术分析，使用流式细胞术，针对CD45、CD34和CD3标志物进行骨髓染色。
2)CFU样品
1.在15mL锥形管中，添加100μL细胞和9.9mL冲洗介质。加上供体ID、样品ID、CFU、无菌和DF＝300的标签。
2.取出500μL等分试样并且加上供体ID、样品ID、CFU、NS和DF-300的标签。
3.对NS样品计数。记录计数并且计算体积。
4.根据低温保藏的骨髓的集落形成单位测定进行CFU测定。
实施例10.用于尸体供体HPC骨髓产品的加工设计
本文描述了一种从死亡供体椎体中产生HPC骨髓的加工改进的示例性设计。
科罗拉多州定制Fab(CCF)骨研磨机：对HPC骨髓的验证的加工利用由Biorep生产的骨松质研磨机。此研磨机具有大发动机，其将在BSC中占据工作空间的一半。定制BSC被设计成发动机在BSC外部在推车上并且仅具有切割附件的前部被推进穿过BSC侧部的开口。Biorep研磨机是专门设置的原型装置，其不足以用于持续的工业规模用途并且需要更加防护性维护。在常规使用期间，Biorep附件易于损坏。CCF研磨机，虽然也是专门设置的，但却是基于一个在全球范围内用于工业cGMP环境中骨骼加工的平台。对CCF进行评价并且与Biorep研磨机比较以证明从来自相同供体的VB的每件设备回收相当的细胞数(参见随附的报告)。这是积极改变，因为CCF研磨机将更加便宜并且可以在最小维护下承受重复的使用。它们与Biorep研磨机相比较小且重量较轻，通过使它们易于移进和移出BSC而促进人类因素工程。CCF研磨机可以在使用期间在BSC内，而且可以在使用后容易地移出而释放工作空间以进行其余加工。CCF研磨机也更有效地研磨VB，从而减少骨髓提取的加工时间。
冷冻方法：目前在HPC骨髓的验证的加工中，将65±5mL袋的HPC骨髓置于冷冻盒中，然后置于Smartcool箱中以进行2-步骤低温保藏加工，其包括被动冷却至-86℃冷冻机，随后浸入LN2蒸气相以进行长期贮藏。将HPC骨髓的小瓶置于预先冷却的Instapak箱中的CoolCell LX被动冷却容器中，然后置于-86℃冷冻机中。已注意到，就存活率测试而言解冻后QC小瓶经常胜过袋，这可能因为体积和容器差异而影响冷却速率。为了增加HPC骨髓产品的解冻后存活率以及袋和小瓶之间的存活率一致性，进行实验，其中在无SmartCool箱的情况下将袋置于仅盒中，然后直接置于-86℃冷冻机的搁架上。执行几轮试验表明，增加的冷却速率导致增加的解冻后细胞存活率并且在袋和小瓶之间更具一致性(参见随附的报告)。这是积极改变，因为它将增加解冻后细胞存活率，导致袋和小瓶之间更一致的存活率，从而小瓶可以用作袋的代用品，并且免除对使用和维护SmartCool箱的需要。
轨道式摇床：在验证的HPC骨髓加工中，在研磨完成之后，将所有骨研磨屑倒入骨髓收集套件的收集容器中。揉擦骨髓收集套件的收集容器以在每次冲洗下搅动研磨屑；然而，此方法是固有地可变的并且不确保最大产量。在此步骤为了最大化细胞产量，将使用定轨摇床在每次冲洗时以特定时间和速度搅动研磨屑。这是积极改变，因为它将最大化产量并且增加每个供体产生的平均袋数(参见随附的报告)。
组织清理和表面去污染的工作流程改变：目前，对HPC骨髓的整个验证的加工在单个洁净室(洁净室A)中完成。自初始验证完成以来，对结果进行了跟踪和趋势分析。在一些情况中，相同的生物体存在于OPO拭子上和最终产品中，但是在表面去污染之后不在拭子上。这些情况表明，在VB浸泡在漂白剂中之后，骨研磨屑或骨髓提取物被再污染。为了减轻此风险，椎体将在一个洁净室(洁净室C，参见图18和表20)中被清理，处于含有10％漂白剂溶液的无菌袋的两层中，然后转移至不同洁净室(洁净室A)以进行过氧化氢冲洗和剩余加工。VB的内袋和外袋在离开第一个洁净室之前用Peridox清洁，然后在放置到在第二洁净室中的BSC中之前用70％IPA清洁。图19显示支持技术人员将VB的袋从洁净室C物料入口带到洁净室A物料入口采取的路径。这是积极改变，因为它将允许该加工的预先表面去污染部分由单独人员在单独室中完成并且降低产品受污染的设备或罩衣再污染的可能性。
表20.洁净室C采样位置
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增加的离心速度和持续时间：为了进一步优化细胞产量，离心机将被设定至较高速度(600xg替代500xg)并且将离心时间增加至每轮30分钟而不是15分钟。与仅摇床改进的组相比，在新的离心机参数下在试运行时加工的供体导致每克骨的平均TNC增加(表21)。由于TNC和CD34+绝对计数和存活率在供体之间存在固有的差异，因此在过程更改后跟踪这些结果并进行趋势分析，以确认使用更大的数据集对细胞生存力没有负面影响。
表21.增加的离心速度和持续时间的试运行数据
确立用于加工对照的策略：
1)实施例1中确立的加工知识形成总体加工对照策略的基础。在先前加工设计和验证中设计用于加工对照的策略以减小起始物料(死亡供体椎体)的变异以及加工期间的变异(定制设备的设计、进行中的计算以解释供体之间可变的细胞产量等)，从而减小最终产品的变异性。这些加工的改进进一步减小加工期间的变异：
1.减小了职员之间由于多少次和如何有力地揉擦研磨屑所致的细胞产量的变异。轨道式摇床将确保在每次冲洗期间研磨屑被充分搅动以最大化细胞产量。
2.通过在无Smartcool箱的情况下冷冻盒而减小袋和小瓶之间细胞存活率的变异。
2)生产人员在除了离心机参数之外的所有改变下进行3轮试运行，然后在此报告中所述的所有改变下进行3轮附加的运行。这些试运行向职员提供关于加工的改变的充分训练。除了试运行之外，员工单独地接受关于操作、清洁和维护CCF研磨机和轨道式摇床的训练。
实施例11.向受辐射的NSG小鼠异种移植HPC骨髓CD34+细胞
本文描述了在免疫受损的NOD.Cg-Prkdcscid IL2rγtm1Wjl/Sz(NSG)小鼠模型中评价植入HPC骨髓CD34-选择的造血干细胞和祖细胞的示例性实验。该实验及其数据确定HPC骨髓是否具有能够长期植入并产生成熟血液细胞的造血细胞。
首字母缩写词
NSG小鼠：NOD.Cg-Prkdcscid IL2rγtm1Wjl/Sz。一种小鼠品系，其被基因工程化为缺少功能性IL2受体，导致无法产生成熟淋巴细胞。该品系由Jackson Laboratories开发和分销。
CD34：人造血干细胞和祖细胞上存在的细胞表面表位
HSPC：造血干细胞和祖细胞的首字母缩写词。
EasySep系统：包被有对CD34蛋白特异性的抗体的免疫磁性微珠。由Stem CellTechnologies生产。
CliniMACs：一种用于免疫磁性选择CD34+细胞的半自动化的封闭系统。
Ficoll-Paque PLUS：一种无菌培养基，其包含Ficoll PM400、泛影酸钠和EDTA二钠钙，具有1.077g/mL的密度。Ficoll由GE Healthcare公司生产。
HSA：人血清白蛋白。
Plasma-Lyte A：Plasma-Lyte A Injection pH 7.4(多电解质注射液，1型，USP)是无菌的、无热原的等渗溶液。
DMSO：一种10％DMSO、2.5％HAS在Plasma-Lyte A中的溶液。
低温保藏介质：研磨并用1体积的研磨介质稀释。
脐带血CD34+细胞：常用于NSG异种移植研究中的功能性人CD34+HSPC的阳性对照。
在免疫受损的NOD.Cg-Prkdcscid IL2rγtm1Wjl/Sz(NSG)小鼠模型进行骨髓植入研究。NSG小鼠是广泛用于研究人细胞的体内功能的模型。将HPC骨髓从两个供体的VB中回收并且通过免疫磁性珠分离加工以富集CD34+细胞。使用EasySep系统(Stem CellTechnologies)对供体AGGU049 BM进行新鲜加工。将供体AGEJ150 BM从低温保藏进行解冻并且使用CliniMACS系统进行加工。使用EasySep系统从来自供体C141019000564(获自GenCure)的脐带血(UCB)中选择对照CD34+细胞。选择的细胞通过流式细胞术来表征以确保CD34+细胞纯度和存活率都>90％。将选择的CD34+细胞重悬在低温保藏介质中，以受控速率冷却至-86℃并且在蒸气相液氮中低温保藏。因此，将来自供体AGGU049的CD34-选择的细胞低温保藏一次，而将来自供体AGEJ150的CD34-选择的细胞低温保藏两次，然后测试。
将总计25只雌性NSG小鼠(6-10周龄)用亚致死剂量(300cGy)辐射。将小鼠分配为接受来自BM(2组，各10只小鼠)或脐带血(1组，5只小鼠)的CD34-选择的细胞。第三未受辐射组(3只小鼠)未受处理而用作抗体染色对照。将CD34+细胞解冻并且在辐射后大约4小时时通过静脉内施用。CD34+细胞的剂量为5x105(BM)和1.5x105(UCB)。在8周时抽取外周血，用于使用人特异性CD45抗体对人细胞植入进行中期分析。研究的终点可以是16周，届时所有动物都将被放血并处死以收集骨髓、脾脏和胸腺以供分析人细胞植入和功能。
第8周中期分析的结果表明，人CD34+细胞稳固地植入在NSG小鼠中，如通过对人特异性CD45抗体染色呈阳性的循环白细胞的水平确定的(表22)。结果表明，在用BM CD34+细胞处理的小鼠中平均47.5％和61.4％循环白细胞是人源的，相比之下，对于人UCB CD34+细胞(阳性对照)，则为43％。在未受辐射的未经处理的对照中观察到人CD45抗体的低水平(10％)的非特异性结合。图20中示出了在用每种CD34+细胞制剂处理的动物的血液中人CD45+百分比的代表性流式细胞术图。
表22.在CD34+细胞处理后8周时小鼠血液中嵌合性的水平
实施例12.HPC骨髓与活供体抽吸的骨髓的比较
本文描述了比较来自选择的活供体和死亡供体的新鲜全骨髓中造血干细胞和祖细胞的数量和活性的示例性实验。该实验及其数据可以用于确定与活供体BM相比HPC骨髓是否具有功能性造血细胞。
首字母缩写词
7-氨基放线菌素D(7-AAD)：一种被存活细胞排除但穿过坏死细胞和凋亡细胞的膜的膜不通透性染料。一旦该染料在细胞内，它就嵌入在DNA内，并且易于通过流式细胞术使用氩气(488nm)激光器和红色波长检测器(约647nm)来鉴定。
BM：骨髓。
CD3：T淋巴细胞上存在的细胞表面表位。
CD34：人造血干细胞和祖细胞上存在的细胞表面表位。
CD45：在所有人白细胞(包括淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)上存在的抗原。它在信号转导中发挥作用并且在造血祖细胞上弱表达。
HSPC：造血干细胞和祖细胞的首字母缩写。
CFU：集落形成单位。
CFU-GM：CFU-粒细胞/巨噬细胞。
CFU-总：总CFU，包含CFU-GM、CFU-粒细胞/红细胞系/巨噬细胞/巨核细胞(GEMM)和红系爆式集落形成单位(BFU-E)。
实验方法/结果
从六个死亡供体的VB中回收HPC骨髓。全骨髓是从三个活供体髂骨中抽吸的和购自Lonza(Walkersville,MD,USA)。供体信息示于表23中。
表23.与活供体抽吸的骨髓相比用于研究HPC骨髓的供体
将细胞用针对CD45、CD34和CD34的荧光染料缀合的抗体染色并且通过流式细胞术来分析。门控策略示于图21中。平均数量和细胞类型百分比示于图22和表24中。与3个死亡供体BM样本(供体AGEJ150、AGCA414和AGDQ072)相比，来自3个活供体的BM中CD45+白细胞和CD34+HSPC的绝对数量和相对数量没有显著不同。相对于死亡供体BM，观察到的仅有显著差异是活供体中CD3+T细胞的较高相对百分比(图22)。
表24.HPC骨髓与活供体骨髓的流式细胞术比较(示出平均和标准偏差(SD))
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将另外3个HPC骨髓供体(AGB2425、AGDZ004、AGBE058)与来自活供体的BM比较(表23)。相比于活供体BM，在HPC骨髓中CFU以及BFU-E的总数量显著更高(图23和表25)。
表25.HPC骨髓和活供体BM的平均集落形成潜力(每个供体的祖细胞百分比示为“反算的祖细胞％”)
实施例13.开发用于医学目的的器官和组织供体源性BM和BM源性造血干细胞/祖细胞(HSPC)、间充质干细胞/基质细胞(MSC)和成熟细胞库
从死亡供体中回收功能性BM在概念上类似于获取器官和组织。发表的研究已确认，已故器官供体BM内的干细胞和祖细胞是高度存活的，并且与活供体细胞相当(图24)。本公开内容显示了开发优化的回收系统，其包括专用的套件和运输者以便由多个OPO合作方统一回收并且表征热缺血和冷缺血时间用于最佳细胞产量。本文所述的加工方法从死亡供体BM中产生高度功能性的存活的细胞，每105个铺板的总成核细胞中，集落形成单位-粒细胞/巨噬细胞(CFU-GM)平均为170±40，并且总CFU平均为417±50，相比之下活供体对照分别产生140±18和205±17(平均值±SEM；n＝4实验和2对照；活供体BM购自Lonza)，并且在人源化免疫受损的小鼠模型中稳定的植入。
为了终端用户方便，本公开内容显示了将70mL体积的HPC骨髓包装在250mL低温贮藏袋中。从每个供体中可以制备多个此类单元，基于供体尺寸和回收结果，范围在3至12个。为了该库服务最大数量的患者，低温保藏是必需的。骨髓或动员的干细胞已经被利用不同方案低温保藏和移植了几十年，这些方案主要包括在10％DMSO的低温防护剂中缓慢冷却(1-2℃/min)和在蒸气相或液氮中储存直到通过快速升温(通常在37℃水浴)来准备使用。受控速率冷却和被动低温保藏方法都已经成功地使用。为了开发如本公开内容中所述使用的方案，初始地考虑了2种受控速率冷却方法和被动方法。VIA Freeze Quad(Cytiva,Marlborough,MA,USA)和CryoMed(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA,USA)被评估为受控速率冷却选项，并使用“箱中箱(box in box)”方法评估了被动方法。VIA Freeze被适配成同时低温保藏6袋以满足本文所述的需求。此初始研究表明方法之间无差异，各自都获得高解冻后存活，在方法之间平均解冻后CD34存活率和CFU-GM等效。
考虑到生产规模，每天有多个供体，每个产生3至12个低温贮藏袋，并且过程相对简单，进一步研究了被动冷却方法的一个版本，并随后验证了常规使用。为此，对超冷机械冷冻机(CryoCube F740,Eppendorf,Enfield,NC,USA)使用符合第11部分的数据捕集系统(Ellab Denver,CO,USA)进行了温度映射。初步实验表明，对于在3个冷冻机搁架中的每一个的均匀温度而言，-86℃的腔室设置是最佳的。制备仅包含低温防护剂(含2.5％人血清白蛋白的盐水中的10％DMSO)的代用品袋，置于铝盒中并进一步用于初步实验，其表明，如果盒被定位成直接紧靠冷冻机的壁，则冷却速率将更快，但是在搁架的主体各处是一致的(数据未示出)。设计了一个实验，其中准备了代用品袋，其包括放置在低温防护剂溶液中的T型热电偶，并使用Omega OM-USB-TC数据捕集系统(Omega,Norwalk,CT,USA)记录冷冻曲线。将袋置于盒中，将该盒随后置于冷冻机的每个搁架上，保持与壁相距最小11cm距离，并且保持最小6小时。所得的冷冻曲线非常一致。对于在-10℃至40℃的范围的每个袋，平均冷却速率(MCR)分别确定为-1.39±0.13℃(顶部搁架)、-1.38±0.16℃(中间搁架)和-1.30±0.14℃(底部搁架)(平均值±SD)。
接着，用3个器官供体骨髓产品进行实验。对于这些实验，使用相同的方案和温度监测系统，但是将热电偶胶粘到袋的外部以避免污染产品，在-86℃下6-24小时后，将盒转移至蒸气LN2贮藏。将热电偶贴在袋子上允许近似实际的冷冻曲线，但不如浸入法准确，并且容易因分离而故障。另外，冷冻曲线非常一致，MCR分别是-1.50±0.17℃(n＝3袋)、-1.52±0.14℃(n＝3袋)和1.56℃(由于热电偶故障，仅测量了一袋)(平均值±SD)。
在贮藏>1周之后，将袋解冻并且评价CD34+细胞存活率和CFU-GM潜力。全部供体都表现出高存活率和稳固的集落生长(表26)。表26.通过流式细胞术(USP<127>)和集落形成测定来评估解冻后存活率
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在没有温度监测的情况下用3个额外的供体重复该实验，确认了结果，解冻后CD34+存活率为86.81±8.35％，平均CFU-GM为51±29个集落/105个铺板的细胞(平均值±SD)。
对于较小体积的产品(例如，以25mL体积低温保藏的脐带血)，将盒直接置于静态-86℃腔室中可能导致冷却速率比预期更快。较大体积的单元携带足够的热阻，因此可以轻松调节腔室温度以获得理想的冷却速率。此稳固的方法对于用户误差和设备故障相对不敏感。为了临床生产，储存的所有单元都被测试解冻后存活率，用于100％验证以允许将此方法用于进行中的临床生产。
实施例14：低温保藏的选择的CD34细胞的解冻后功能特征
细胞分离
从全骨髓中分离细胞子集可能需要部分地纯化目标细胞。最常用的分离方法是Ficoll密度梯度离心。通过改变Ficoll的密度，确定由于在热缺血和冷缺血的可变时间期间骨髓中发生的变化，小于100％Ficoll的百分比对于死亡供体HPC骨髓是最佳的。
CD34选择
使用了标准商业方法，其利用与单克隆CD34抗体偶联的顺磁性珠。为了研究目的，初始方法使用Miltenyi MACS系统。由于速度和方便性，用Stem Cell TechnologiesEasySep系统(目录编号17856)进行后续研究分离，使用以上实施例8中所述的稳定化缓冲剂。在一个实例中，CliniMACS+系统用于选择。来自此制剂的低温保藏的细胞用于NSG小鼠异种移植模型中。在每种情况中，遵循生产商的方案。新鲜选择的CD34+细胞通过流式细胞术(存活率)和集落形成单位测定(功能)来表征。
低温保藏加工
在将冷冻管转移到液氮的气相之前，使用放置在-86℃的经过验证的控速冷冻装置(Cool Cell)，将所有选择的细胞低温保藏在CS-10(Biolife Solutions)中。
将细胞保持在液氮中6-64天，然后解冻和分析(表27)。在一些情况中，细胞用于小鼠植入研究，其需要在所示的后续时间点解冻。
解冻和分析
将管从液氮贮藏中取出并且在37℃水浴中随着旋转快速解冻。
取出等分试样进行流式细胞术和集落形成单位(CFU)测定。
通过流式细胞术确定的存活率表明，选择的CD34+细胞在低温保藏期间保持高存活率(表28)。低温保藏的细胞还保留分化成功能性细胞类型的能力(表29)。
这些数据表明，通过任一方法选择的CD34+细胞当低温保藏多达64天时保持高解冻后存活率和功能。
用选择的CD34+植入小鼠
选择的人CD34+细胞的植入在受辐射的(300cGy)免疫受损的NOD.Cg-PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/Sz(NSG)小鼠模型中评价。将细胞在注射当日(N＝10小鼠/组)解冻。对CD34+细胞的选择是用新鲜(AGGU049和AHAB005-1)或冷冻而后解冻的(AGEJ150和AHAB005-2)HPC骨髓进行。后者意在确定多个冷冻-解冻循环对存活率和功能的影响。将从脐带血中选择的对照CD34+细胞注射到单独的小鼠组(N＝5)。
对小鼠进行300cGy全身辐射，并且4小时后IV注射HPC骨髓CD34+细胞(5x105；10小鼠/供体)或脐带血(CB)CD34+细胞(1x105；5小鼠/供体)。附加的3个未受辐射的NSG用作背景抗体染色的模拟对照。
在16周时评价骨髓、外周血和脾脏中植入的水平。使用对人造血细胞(CD45)特异性的抗体来确定骨髓嵌合体的水平。将骨髓从接受初级移植AGEJ150和AGGU049的小鼠中收集并用于在受辐射的NSG小鼠的新组(N＝10)中评价次级移植潜力。将次级移植NSG小鼠如上所述进行处理，例外之处在于注射1x107个全骨髓细胞。此次级移植程序常用于显示在原始移植物中造血干细胞长期再群体化的存在。
用来自每个供体的HPC骨髓CD34+细胞观察到人CD45+细胞的长期骨髓植入(图25)。在6周时在外周血(PB)和脾脏中也以高频率检测到这些细胞以及CD34+子集(图26)。
进行来自供体AGEJ150和AGGU049的人CD34+细胞的次级植入，作为长期潜在造血干细胞的确定性测试。平均植入>8％，表明原始骨髓包含原始干细胞(图27)。
在骨髓(BM)、外周血和脾脏样品中分析的每种人血液细胞类型的平均值和标准偏差示于表30中(作为总细胞计数的百分比)。
表30：血液细胞类型中植入的值和标准偏差
从此研究得出结论，HPC骨髓具有高度存活的和功能性CD34+HSPC，其稳定地植入受辐射的小鼠骨髓并且分化成各种血液系细胞。通过多次低温保藏和解冻，进一步确定这些特征是稳定的。
实施例15：尸体供体HPC骨髓生产
供体纳入：根据表31中的数据筛选每个供体，并视为可接受的以进行洁净室加工。
供体加工如前所述进行。这三个批次记录上包括的步骤是连续进行的，不超过12小时的总加工时间。表32中描述了供体验收标准。
冷冻前样品按照针对新鲜、从未冷冻的骨髓的集落形成单位测定，针对CD45、CD34和CD3计数的ISHAGE门控，针对使用流式细胞术的CD45、CD34和CD3计数的骨髓染色以及使用Sysmex XP-300血液分析仪对浓缩骨髓的TNC定量来测试。制备上清液，并根据Benzonase检测在骨髓上清液中使用Benzonase ELISA试剂盒II进行测试。将结果报告在测试程序中指定的表格上并保存在供体的测试文件中。
根据低温保藏的骨髓样品的解冻(本文中如前所述)，在≥6小时的被动冷却(<-70℃)和最终贮藏在蒸气氮气(<-130℃)中后解冻袋和小瓶。解冻程序按照其进行如实记录，并且将所有可适用的时间都记录在袋和小瓶上。在稀释后，根据使用Sysmex XP-300血液分析仪对解冻的骨髓的TNC量化，取出样品进行Sysmex计数、流式细胞术和CFU测定。根据低温保藏的骨髓的集落形成单位测定，测试样品。
所有结果连同供体测试记录被保留。下表对于铺板的CFU-GM/105个细胞报告的结果是高板的结果。
W437520000180数据总结在表33中。
W437520000183数据总结在表34中。
W437520000188数据总结在表35中。
所有样品都满足验收标准。
实施例16：HPC骨髓的生产方法
椎体回收和运输
OPO通过无菌技术并根据标准手术方案回收VB，包括回收顺序和区域以及仪器隔离。椎骨段必需小心地回收，优选地从胸椎和腰椎回收。使用骨凿和木槌而切开并取出骨段。将尽可能多的脊髓取出。将尽可能多的脊髓取出。有执照的外科医生可以监督这些步骤，以确保有效地回收VB并防止疾病传播和细菌移位。
椎骨段一旦回收就被擦拭以进行微生物培养测试，并置于具有用盐水浸透的无菌的垫的无菌的带标签袋中。然后将这些置于冷却器中在湿冰袋之间以进行运输。对VB的回收发生在最小的热缺血时间(≤8小时)。运输和加工的启动必须在最小的冷缺血时间(≤40小时)内完成。包装最终运输至Ossium中心加工设施(Indianapolis,IN)以用于供体纳入。
VB料被包裹并装入双袋。将袋子置于隔热的托运箱中，以袋装的湿冰包围它们。托运箱被密封并通过医疗快递送到加工位置。当到达时，检查包装是否符合协议，并测量椎体温度以确保符合运输要求。
组织清理
在洁净室的准备之后，将供体样本小心地拆开以供加工，注意包装材料和脊柱的状况。清理包括去除椎骨段的不需要组分，包括VB表面上和周围的软组织。如果椎弓根存在，将它们锯下并且弃去椎骨的后部元件，而同时确保松质组织(在前部椎体中海绵状的网状结构)不露出。保留此供体以供以后进一步加工。
记录回收的VB的数量、骨的总质量和VB温度。然后，在表面去污染之前，将清理的VB擦拭以进行微生物培养测试。
清洁
在组织清理之后，对洁净室、BSC和设备进行彻底清洁以确保使用70％异丙醇和广谱的EPA登记的洗涤剂和清洁剂去污染。
介质制备
漂白剂溶液
这是10％漂白剂溶液制剂(0.5％次氯酸钠/无菌水)，以用作用于加工椎体的表面去污染的部分。
过氧化氢溶液
这是过氧化氢溶液制剂(3％过氧化氢在Plasma-Lyte A)，以用作表面去污染的部分。
冲洗介质
在整个生产过程中使用的冲洗溶液由Plasma-Lyte A和人血清白蛋白(HSA)构成。Plasma-Lyte A Injection pH 7.4(多电解质注射液，1型，USP)是无菌的、无热原的等渗溶液，其是细胞水和电解质平衡晶体的基本来源。HSA(25％，USP)是稳定化剂和贮藏剂，并且被稀释至2.5％HAS用于冲洗介质。
研磨介质
用于洗涤骨研磨屑的研磨溶液由肝素和Benzonase组成。肝素(肝素钠注射液，USP)是cGMP级，高纯度抗凝剂，用于减少粘度。研磨介质包含10U/mL肝素。此组分用于生产过程中用于初始贮藏大量低温保藏的HPC骨髓。然而，然而，作为工艺改进的一部分，目前正在验证在制造过程中完全去除肝素以用于未来的生产批次。是cGMP级，高纯度核酸内切酶，以纳量级用于减少初始制剂的凝结。研磨介质在冲洗介质中包含3U/mLBenzonase。
冲洗和研磨
表面去污染包括将经清理的VB浸泡在无菌袋中的10％漂白剂溶液(次氯酸钠)中15-25分钟，然后将它们转移至另一无菌袋，并用3％过氧化氢溶液冲洗。其后，将VB转移至另一无菌袋中，并用Plasma-Lyte A冲洗。将VB在另一无菌袋中用Plasma-Lyte冲洗第二时间。然后将它们擦拭以进行去污染后微生物培养测试。
使用VB切碎机或手动切割工具，将表面去污染的VB切碎成较小块。将它们立即浸没至填充大约300mL研磨介质(其先前在上一步骤中制备)的罐中。然后，将切块插入骨研磨机的入口进行研磨，并交替用另外300mL的新鲜研磨介质洗涤，直至所有骨已经被加工。将骨研磨屑通过第二罐的300mL研磨介质来捕获，确保所有碎片总是被浸没。剩余100mL的研磨介质作为最终冲洗用于洗涤骨研磨机和柱塞。含有骨碎片的第二罐应在此加工结束时包含总计1L研磨介质。
过滤
使用具有柔性前置过滤器和在线串联过滤器的组装的一次性骨髓收集套件，立即对来自上一步骤的包含骨髓的研碎骨碎片进行过滤(图1)。
首先，将来自上一步骤的骨髓和骨研磨屑在150RPM下震摇10分钟。同时，组装600-mL骨髓收集套件(参见SOP OHC-SOP-0079：骨髓收集和过滤)。在初始震摇后，然后将骨髓提取物转移至收集袋并通过一系列500-微米过滤器在重力作用下洗脱到套件随附的大转移袋中。在洗脱过程期间，冲洗介质用于洗涤骨髓提取物的剩余骨研磨屑。(注意：经洗涤的骨研磨屑可以被无菌地保留在无菌袋中以供进一步加工或研究使用)。
将大转移包装袋内的骨髓提取物连接至第二BM收集套件，并且通过一系列200-微米过滤器通过重力过滤到数个小转移包装袋中。所用的总加工体积应是2L，在研磨介质和冲洗介质之间等分。
对每个600-mL转移包装(总计6个)称重，并且计算所有袋的总质量。骨髓提取物的总质量如此进行计算：
骨髓提取物的总质量(g)＝所有填充的转移包装的总质量(g)–(空转移包装的质量(g)×6)
骨髓提取物的总质量必须大于或等于1800g。超出规格的结果将触发QA警报。
从填充的第一转移包装中，将1.3mL的经过滤的骨髓取出以便在血液分析仪上进行QC测试。对细胞的浓度进行计数和记录。总成核计数(TNC)因此如下进行计算：
TNC(×103个细胞/μL)＝细胞计数(×103个细胞/μL)×骨髓提取物的总质量(g)×1000)
对每个转移包装内的骨髓提取物进行目视检查以证实没有可注意到的组织、骨研磨屑或过量凝集。然后将袋离心30分钟。
脂肪去除
通过大部分排空经离心的转移包装来除去脂肪，其中将夹子置于脂肪层下方，同时允许剩余的沉淀排出到脂肪后中间收集袋中。
浓度
然后将脂肪后中间袋以600x g(约2315rpm)离心30分钟。通过使用血浆提取器将上清液从骨髓沉淀中除去并进入废物袋中。通过使用标准生物危害方案将废物弃去。然后，将沉淀合并到预先称重的散装袋中并且使用冲洗介质重悬。
采样和责任审计
从沉淀中取出0.5mL的骨髓提取物并提交用于QC测试。对样品进行微生物测试、CFU、存活率和效力(CD34+、CD45+和CD3+)和残余Benzonase的测试。还使用血液分析仪测试了细胞浓度。计算了以下测量值：
BM提取物的质量(g)＝BM提取物的散装袋的质量(g)–预先称重的散装袋浓度的质量(×103个细胞/μL)＝细胞计数(×103个细胞/μL)×稀释因子×1000)
TNC(×103个细胞/μL)＝细胞计数(×103个细胞/μL)×BM提取物的总质量(g)×1000)
产量百分比(％)＝(过滤TNC计数(×103个细胞/μL)/浓缩TNC计数(×103个细胞/μL))×100
确定袋的数量
准备用于低温保藏的袋和小瓶的数量对应于总成核细胞(TNC)计数和产量，基于在上一步骤中所得的浓缩HPC骨髓中间物料。通过使用下式计算所得的所需总体积：
所需总体积(mL)＝过滤TNC计数(×103个细胞)/(140×103)
结果决定了每批低温保藏的HPC骨髓的低温保藏产品袋的数量和QC样品的数量，如表36所示。
表16：所需的总体积与确定每批产品袋和小瓶的数量的相关性
添加低温防护剂
一批低温保藏的HPC骨髓由容纳有冷冻介质中的浓缩的骨髓的低温保藏袋和代用小瓶构成。冷冻介质由100％二甲基亚砜(DMSO)以及冲洗介质的组分(Plasma-Lyte A和HSA)组成。通过使用在先前的袋确定步骤中计算的体积来制备冷冻介质。
冷冻介质的总体积(质量和体积近似相等，即，g≈mL)、DMSO的体积、冲洗介质的体积以及无菌样品的体积按照下式进行计算：
冷冻介质的总体积(mL)＝所需总体积–BM提取物的质量(g)
DMSO的体积(mL)＝所需总体积×0.1
冲洗介质的体积(mL)＝冷冻介质的总体积–DMSO的体积无菌样品的体积(mL)＝过滤TNC计数(×103个细胞)/(140×103)
将计算的冲洗介质的体积无菌地移液至加有“冷冻介质”标签的无菌瓶。将DMSO的体积添加至冲洗介质中并且温和地混合。冷冻介质必须≤25℃，然后基于下式以预定速率(冷冻介质体积的10％/分钟)将冷冻介质添加至骨髓散装袋：
要添加的冷冻介质的体积/分钟＝冷冻介质的总体积(mL)×0.1
将低温防护剂添加至骨髓散装袋所需的消耗时间必须不超过9-11分钟。注意，在添加DMSO之后，产品和样品必须尽快地被冷冻。
HPC骨髓填充
从散装袋中向所有容器无菌地填充骨髓+低温防护剂。基于根据表3计算的袋数准备低温保藏袋，并为无菌取样准备额外的低温保藏袋。还准备了QC测试微量离心管和用于保留的储备冷冻小瓶。
抽取QC测试和保留样品。将预期用于临床用途的低温保藏袋的管线的四个区段密封。记录填充的袋的实际数量，不包括无菌袋。袋中剩留的额外骨髓可以制备在小瓶中，并且若被授权，可用于研究用途。
低温贮藏
将每个低温保藏袋和代表性代用品冷冻小瓶置于-86℃检疫冷冻机中。将袋置于盒中和/或直接置于搁架上(参见图14和图15)，而将冷冻小瓶单独置于冷冻贮藏系统中，然后置于冷冻机中在盒的箱的前方。Ossium使用/>来管理库存。
虽然在本文中已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但是对本领域技术人员而言将显而易见，仅通过举例的方式提供这种实施方案。本发明旨在不限于说明书内提供的具体实例。虽然已经参考以上说明而描述了本发明，但是本文中对实施方案的描述和说明并非意在以限制性含义进行解释。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在可想到许多变型、改变和替代。此外，应理解，本发明的所有方面不限于本文中根据各种条件和变量陈述的具体的描述、配置或相对比例。应当理解，在实践本发明时可以采用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。因此，考虑到本发明还将覆盖任何此类替代、修改、改变或等同方案。所附权利要求旨在界定本发明的范围，并且由此覆盖这些权利要求的范围内的方法和结构及其等同方案。
Claims (113)
1.一种用于加工包含细胞或其衍生物的生物样品的方法，所述方法包括：
(a)产生所述包含细胞或其衍生物的生物样品的第一体积，其中所述第一体积包含细胞或其衍生物的第一浓度；
(b)产生所述包含细胞或其衍生物的生物样品的第二体积，其中所述第二体积小于所述第一体积并且包含所述细胞的第二浓度，其中所述细胞的所述第二浓度与所述细胞的所述第一浓度相差不超过30％；以及
(c)以第一冷却速率冷却所述第一体积并且以第二冷却速率冷却所述第二体积，其中所述第一冷却速率与第二冷却速率大约相同；
其中所述第一体积中所述细胞的解冻后细胞增殖速率与所述第二体积中所述细胞的解冻后增殖速率相差不超过30％。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一体积被容纳在第一容器中，其中所述第二体积被容纳在第二容器中，并且其中所述第一容器和所述第二容器在所述第一冷却速率和所述第二冷却速率的时期期间位于相同的冷冻机中。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述第二体积小于所述第一体积的50％、小于所述第一体积的40％、小于所述第一体积的37.5％、小于所述第一体积的35％、小于所述第一体积的30％、小于所述第一体积的20％、小于所述第一体积的15％、小于所述第一体积的10％、小于所述第一体积的5％，或者小于所述第一体积的1％。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述第一体积中所述细胞的解冻后存活率与所述第二体积中所述细胞的解冻后存活率相差不超过30％、不超过25％、不超过20％、不超过15％、不超过13.6％、不超过10％，或者不超过5％。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第一体积中所述细胞的解冻后细胞增殖速率与所述第二体积中所述细胞的解冻后增殖速率相差不超过25％、不超过20％、不超过15％、不超过13.6％、不超过10％，或者不超过5％。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述细胞的所述解冻后存活率为至少50％。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述细胞的所述解冻后增殖速率为至少1CFU-GM/105个细胞。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述第一冷却速率和所述第二冷却速率包括约-0.1℃/min至约-5℃/min的超冷冻速率，直至至少冰已经在冷冻介质中成核。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述第一冷却速率和所述第二冷却速率包括约-2.5℃/min至约-4℃/min、约-2.5℃/min至约-3.5℃/min或者约-1℃/min至约-2℃/min的超冷冻速率，直至至少当冰已经在冷冻介质中成核时。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述第一冷却速率和所述第二冷却速率包括约-1℃/min的超冷冻速率。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述细胞的所述解冻后存活率为至少60％、至少70％、至少80％或者至少90％。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中步骤(c)发生在一个冷冻机中。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述第一容器和所述第二容器设置在所述冷冻机的搁架中。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述冷冻机是静态冷冻机。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述冷冻机包括控速冷冻机。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述冷冻机被设定在约-70℃至-90℃。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述冷冻机被设定在低于-80℃。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述冷冻机被设定在-86℃。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述第二体积被直接置于隔热容器中。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述方法还包括将所述第一体积和/或所述第二体积布置在所述静态冷冻机内，使得所述第一体积和/或所述第二体积不接触所述冷冻机的壁。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中在所述第一体积中的所述包含细胞或其衍生物的生物样品和在所述第二体积中的所述包含细胞或其衍生物的生物样品经历相同的冷却速率。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述细胞是干细胞或免疫细胞。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述干细胞包括造血干细胞(HSC)、间充质干细胞(MSC)或二者。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含一种或多种器官、血液或二者。
25.根据权利要求22所述的方法，其中所述免疫细胞包括T细胞。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述血液是脐带血或外周血。
27.根据权利要求24或权利要求26所述的方法，其中所述血液是脐带血或外周血。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含血浆或血清。
29.根据权利要求23所述的方法，其中所述HSC包括CD34+细胞。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，还包括将所述第一体积和所述第二体积转移至长期贮藏容器的步骤。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述长期贮藏容器低于-86℃。
32.一种用于加工包含细胞或其衍生物的生物样品的方法，所述方法包括：
(a)产生所述包含细胞或其衍生物的生物样品的第一体积，其中所述第一体积包含细胞或其衍生物的第一浓度；
(b)产生所述包含细胞或其衍生物的生物样品的第二体积，其中所述第二体积小于所述第一体积并且包含所述细胞的第二浓度，其中所述细胞的所述第二浓度与所述细胞的所述第一浓度相差不超过30％；
(c)产生对所述细胞特定的冷冻曲线；
(d)以第一冷却速率冷却所述第一体积，其中所述第一冷却速率根据所述冷冻曲线而产生；以及
(e)以第二冷却速率冷却所述第二体积，其中所述第一冷却速率根据所述冷冻曲线而产生；
其中所述第一冷却速率与所述第二冷却速率大约相同，并且其中所述第一体积中所述细胞的解冻后细胞增殖速率与所述第二体积中所述细胞的解冻后增殖速率相差不超过30％。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述第一体积被容纳在第一容器中，其中所述第二体积被容纳在第二容器中，并且其中所述第一容器和所述第二容器在所述第一冷却速率和所述第二冷却速率的时期期间位于相同的冷冻机中。
34.根据权利要求32或权利要求33所述的方法，其中所述第二体积小于所述第一体积的50％、小于所述第一体积的40％、小于所述第一体积的37.5％、小于所述第一体积的35％、小于所述第一体积的30％、小于所述第一体积的20％、小于所述第一体积的15％、小于所述第一体积的10％、小于所述第一体积的5％，或者小于所述第一体积的1％。
35.根据权利要求32至34中任一项所述的方法，其中所述第一体积中所述细胞的解冻后存活率与所述第二体积中所述细胞的解冻后存活率相差不超过30％、不超过25％、不超过20％、不超过15％、不超过13.6％、不超过10％，或者不超过5％。
36.根据权利要求32至35中任一项所述的方法，其中所述第一体积中所述细胞的解冻后细胞增殖速率与所述第二体积中所述细胞的解冻后增殖速率相差不超过25％、不超过20％、不超过15％、不超过13.6％、不超过10％，或者不超过5％。
37.根据权利要求32至36中任一项所述的方法，其中所述细胞的所述解冻后存活率为至少50％。
38.根据权利要求32至37中任一项所述的方法，其中所述细胞的所述解冻后增殖速率为至少1CFU-GM/105个细胞。
39.根据权利要求32至38中任一项所述的方法，其中所述第一冷却速率和所述第二冷却速率包括约-0.1℃/min至约-5℃/min的超冷冻速率，直至至少冰已经在冷冻介质中成核。
40.根据权利要求32至39中任一项所述的方法，其中所述第一冷却速率和所述第二冷却速率包括约-2.5℃/min至约-4℃/min、约-2.5℃/min至约-3.5℃/min或者约-1℃/min至约-2℃/min的超冷冻速率，直至至少当冰已经在冷冻介质中成核时。
41.根据权利要求32至40中任一项所述的方法，其中所述第一冷却速率和所述第二冷却速率包括约-1℃/min的超冷冻速率。
42.根据权利要求32至41中任一项所述的方法，其中所述细胞的所述解冻后存活率为至少60％、至少70％、至少80％或者至少90％。
43.根据权利要求32至42中任一项所述的方法，其中步骤(c)发生在一个冷冻机中。
44.根据权利要求32至43中任一项所述的方法，其中所述第一容器和所述第二容器设置在所述冷冻机的搁架中。
45.根据权利要求32至44中任一项所述的方法，其中所述冷冻机是静态冷冻机。
46.根据权利要求32至45中任一项所述的方法，其中所述冷冻机包括控速冷冻机。
47.根据权利要求32至46中任一项所述的方法，其中所述冷冻机被设定在约-70℃至-90℃。
48.根据权利要求32至47中任一项所述的方法，其中所述冷冻机被设定在低于-80℃。
49.根据权利要求32至48中任一项所述的方法，其中所述冷冻机被设定在-86℃。
50.根据权利要求32至49中任一项所述的方法，其中所述第二体积被直接置于隔热容器中。
51.根据权利要求32至50中任一项所述的方法，其中所述方法还包括将所述第一体积和/或所述第二体积布置在所述静态冷冻机内，使得所述第一体积和/或所述第二体积不接触所述冷冻机的壁。
52.根据权利要求32至51中任一项所述的方法，其中在所述第一体积中的所述包含细胞或其衍生物的生物样品和在所述第二体积中的所述包含细胞或其衍生物的生物样品经历相同的冷却速率。
53.根据权利要求32至52中任一项所述的方法，其中所述细胞是干细胞或免疫细胞。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述干细胞包括造血干细胞(HSC)、间充质干细胞(MSC)或二者。
55.根据权利要求32至54中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含一种或多种器官、血液或二者。
56.根据权利要求53所述的方法，其中所述免疫细胞包括T细胞。
57.根据权利要求55所述的方法，其中所述血液是脐带血或外周血。
58.根据权利要求55或权利要求57所述的方法，其中所述血液是脐带血或外周血。
59.根据权利要求32至58中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含血浆或血清。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述HSC包括CD34+细胞。
61.根据权利要求32至60中任一项所述的方法，还包括一系列将所述第一体积和所述第二体积转移至长期贮藏容器。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述长期贮藏容器低于-86℃。
63.一种用于加工骨髓或其衍生物的方法，其中所述骨髓或其衍生物源自于死亡供体，所述方法包括：
(a)从死亡供体中获得骨或骨碎片，任选地将所述骨加工成骨碎片；
(b)从所述骨或骨碎片中提取所述骨髓或其衍生物；以及
(c)低温保藏所述骨髓或其衍生物，其中所述低温保藏包括在静态温度冷冻机中以大于约-1℃/min的冷冻速率降低所述骨髓或其衍生物的温度。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述低温保藏包括在-0.1℃/min至约-5℃/min的超冷冻速率下冷却所述骨髓或其衍生物，直至至少冰已经在冷冻介质中成核。
65.根据权利要求63或权利要求64所述的方法，其中所述低温保藏包括在约-2.5℃/min至约-4℃/min、约-2.5℃/min至约-3.5℃/min或者约-1℃/min至约-2℃/min的超冷冻速率下冷却所述骨髓或其衍生物，直至至少当冰已经在冷冻介质中成核时。
66.根据权利要求63至65中任一项所述的方法，其中所述低温保藏包括在约-1℃/min的超冷冻速率下冷却所述骨髓或其衍生物。
67.根据权利要求63至66中任一项所述的方法，其中在不使用被动冷却箱的情况下保持所述超冷冻速率和亚冷冻速率。
68.根据权利要求63至67中任一项所述的方法，其中所述低温保藏包括将所述骨髓或其衍生物的一个或多个等分试样布置在所述静态冷冻机内，使得等分试样不接触所述静态冷冻机的壁。
69.根据权利要求63至68中任一项所述的方法，其中在所述静态冷冻机内，所述骨髓或其衍生物的等分试样没有直接贮藏在所述骨髓或其衍生物的另一等分试样上方。
70.根据权利要求63至69中任一项所述的方法，其中所述骨髓或其衍生物包含CD34+细胞群。
71.根据权利要求70所述的方法，其中在所述骨髓或其衍生物解冻之后所述CD34+细胞群包含至少70％的存活的CD34+细胞。
72.根据权利要求70或权利要求71所述的方法，其中在所述骨髓或其衍生物解冻之后所述CD34+细胞群包含至少80％的存活的CD34+细胞。
73.根据权利要求63至72中任一项所述的方法，其中所述静态冷冻机被设定在约-70℃至-90℃。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述静态冷冻机被设定在低于-80℃。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述静态冷冻机被设定在-86℃。
76.一种用于加工骨髓或其衍生物的方法，其中所述骨髓或其衍生物源自于死亡供体，所述方法包括：
(a)从死亡供体中获得骨；
(b)使所述骨与漂白剂溶液接触至少约10分钟至至少约25分钟，其中所述骨浸没在所述漂白剂溶液中；
(c)使所述骨与包含过氧化氢的溶液接触，其中所述骨浸没在所述过氧化氢溶液中；以及
(d)从所述骨中提取所述骨髓或其衍生物，其中所述骨髓或其衍生物中包含的CD34+细胞的至少90％是存活的。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述骨髓或其衍生物与所述漂白剂溶液接触至少约25分钟。
78.根据权利要求76或权利要求77所述的方法，其中所述漂白剂溶液包含10％漂白剂。
79.根据权利要求76至78中任一项所述的方法，其中所述骨是椎体。
80.根据权利要求76至79中任一项所述的方法，其中所述过氧化氢是3％过氧化氢溶液。
81.根据权利要求76至80中任一项所述的方法，还包括将所述经漂白的骨产物从包含所述漂白剂溶液的容器中转移至包含所述过氧化氢溶液的容器。
82.根据权利要求76至81中任一项所述的方法，还包括将所述经漂白的骨产物在所述过氧化氢溶液内搅动。
83.根据权利要求76至82中任一项所述的方法，其中(c)中所述经漂白的骨产物浸没在包含过氧化氢的溶液中包括：
(i)将所述经漂白的骨产物浸没在包含所述过氧化氢溶液的容器中；
(ii)检测与所述经漂白的骨产物相关的泡沫或泡沫状物；以及
(iii)重复(i)和/或(ii)直至未检测到泡沫或泡沫状物为止。
84.根据权利要求76至83中任一项所述的方法，还包括手动地从经漂白的骨产物中去除与(ii)中的泡沫或泡沫状物相关的软组织。
85.根据权利要求76至84中任一项所述的方法，其中将惰性造影染料添加至所述包含过氧化氢的溶液中以增强与所述经漂白的骨产物相关的任何泡沫或泡沫状物的可见度。
86.一种用于加工骨髓或其衍生物的方法，其中所述骨髓或其衍生物源自于死亡供体，所述方法包括：
(a)从死亡供体中获得骨或骨碎片，任选地将所述骨加工成骨碎片；
(b)在研磨溶液的存在下，机械地研磨所述骨或骨碎片以产生多个骨研磨屑；
(c)将所述多个骨研磨屑置于约100至约200转/分钟(“RPM”)的摇床上约1至约20分钟；以及
(d)从所述摇床取下所述溶液，其中所述溶液包含所述骨髓或其衍生物，并且其中所述骨髓或其衍生物包含至少约1,500,000个CD34+细胞/ml的所述骨髓或其衍生物。
87.根据权利要求86所述的方法，还包括使所述溶液与冲洗介质接触以及重复步骤(c)，以及随后从所述摇床取下所述溶液。
88.根据权利要求86或权利要求87所述的方法，还包括一次或多次重复步骤(c)以及随后从所述摇床取下所述溶液。
89.根据权利要求86至88中任一项所述的方法，其中所述至少约1,500,000个CD34+细胞/ml所述骨髓或其衍生物包含至少85％的存活的CD34+细胞。
90.根据权利要求86至89中任一项所述的方法，其中所述至少约1,500,000个CD34+细胞/ml所述骨髓或其衍生物包含至少90％的存活的CD34+细胞。
91.一种用于加工从骨髓或其衍生物中获得的CD34+细胞群的方法，其中所述骨髓或其衍生物源自于死亡供体，所述方法包括：
a.从死亡供体中获得骨或骨碎片，任选地将所述骨加工成骨碎片；
b.从所述骨或骨碎片中提取所述骨髓或其衍生物；以及
c.使所述骨髓或其衍生物与稳定化缓冲剂接触，其中所述稳定化缓冲剂包含超过约3U/ml的核酸酶；
d.进行CD34+细胞分离测定法以产生包含所述CD34+细胞群的细胞组合物，
其中包含所述CD34+细胞群的所述组合物包含至少约80,000个CD34+细胞/750μl的与所述稳定化缓冲剂接触的所述骨髓或其衍生物。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述至少约80,000个CD34+细胞/750μl的与所述稳定化缓冲剂接触的所述骨髓或其衍生物包含至少70％的存活的CD34+细胞、至少80％的存活的CD34+细胞或者至少90％的存活的CD34+细胞。
93.根据权利要求91或权利要求92所述的方法，其中所述稳定化缓冲剂包含大于约5U/ml的核酸酶、大于约10U/ml的核酸酶，或者大于约15U/ml的核酸酶。
94.根据权利要求91至93中任一项所述的方法，其中所述稳定化缓冲剂包含约20U/ml的核酸酶。
95.根据权利要求91至94中任一项所述的方法，其中所述稳定化缓冲剂包含大于约20U/ml的核酸酶。
96.根据权利要求91至95中任一项所述的方法，其中所述核酸酶是或
97.根据权利要求91至96中任一项所述的方法，其中所述稳定化缓冲剂还包含大于约5U/ml的抗凝剂或者大于约10U/ml的抗凝剂。
98.根据权利要求91至97中任一项所述的方法，其中所述稳定化缓冲剂还包含约10U/ml的抗凝剂。
99.根据权利要求91至98中任一项所述的方法，其中所述抗凝剂是肝素。
100.根据权利要求91至98中任一项所述的方法，其中所述抗凝剂不是肝素。
101.根据权利要求91至100中任一项所述的方法，其中所述稳定化缓冲剂还包含人血清白蛋白(HSA)。
102.根据权利要求101所述的方法，其中所述稳定化缓冲剂包含0.5％HSA。
103.一种稳定化缓冲剂，其包含：
至少5U/ml的抗凝剂；和
大于3U/ml的核酸酶。
104.根据权利要求103所述的稳定化缓冲剂，其中所述稳定化缓冲剂包含大于约5U/ml的核酸酶。
105.根据权利要求103或权利要求104所述的稳定化缓冲剂，其中所述稳定化缓冲剂包含大于约10U/ml的核酸酶、大于约15U/ml的核酸酶或者大于约20U/ml的核酸酶。
106.根据权利要求103至105中任一项所述的稳定化缓冲剂，其中所述稳定化缓冲剂包含约20U/ml的核酸酶。
107.根据权利要求103至106中任一项所述的稳定化缓冲剂，其中所述核酸酶是或/>
108.根据权利要求103至108中任一项所述的稳定化缓冲剂，其中所述稳定化缓冲剂还包含大于约10U/ml的抗凝剂。
109.根据权利要求103至108中任一项所述的稳定化缓冲剂，其中所述稳定化缓冲剂还包含约10U/ml的抗凝剂。
110.根据权利要求103至109中任一项所述的稳定化缓冲剂，其中所述抗凝剂是肝素。
111.根据权利要求103至109中任一项所述的稳定化缓冲剂，其中所述抗凝剂缺乏肝素。
112.根据权利要求103至111中任一项所述的稳定化缓冲剂，其中所述稳定化缓冲剂还包含人血清白蛋白(HSA)。
113.根据权利要求112所述的稳定化缓冲剂，其中所述稳定化缓冲剂包含0.5％HSA。
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