CN106536719A - 来自多名骨髓供体的合并的单核细胞的间充质基质细胞库的产生 - Google Patents

来自多名骨髓供体的合并的单核细胞的间充质基质细胞库的产生 Download PDF

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Abstract

本发明涉及改良的间充质基质细胞(MSC)制备物以及用于制备它们的方法。本发明提供通过合并多名不相关的(第三方)骨髓供体的骨髓单核细胞(BM‑MNC)而从BM‑MNC中分离MSC的新策略。根据本发明的方法制备的MSC制备物的特征在于，与个人供体的MSC制备物或由多名供体产生的个人MSC的合并物相比时，稳定的增殖能力和增加的免疫抑制潜能。根据本发明制备的MSC尤其可用于医学应用，如治疗具有造血干细胞移植的接受者中的移植物抗宿主病(GvHD)、患有自身免疫性病症的患者以及作为再生医学中的基于细胞的疗法。

Description

来自多名骨髓供体的合并的单核细胞的间充质基质细胞库的 产生
发明领域
本发明涉及改良的间充质基质细胞(MSC)制备物以及用于制备它们的方法。本发明提供通过合并多名不相关的(第三方)骨髓供体的骨髓单核细胞(BM-MNC)而从BM-MNC中分离MSC的新策略。当与个人供体的MSC制备物或由多名供体产生的个人MSC的合并物相比时，根据本发明的方法制备的MSC制备物的特征在于稳定的增殖能力和增加的免疫抑制潜能。根据本发明制备的MSC尤其可用于医学应用，如治疗具有造血干细胞移植的接受者中的移植物抗宿主病(GvHD)、患有自身免疫性病症的患者以及作为再生医学中的基于细胞的疗法。
描述
自从Friedenstein等人在20世纪70年代发现间充质基质细胞(MSC)以来，关于它们的免疫调节和再生潜能已经在体外和体内进行了广泛的研究。在过去的十年中，尽管缺乏用于MSC识别和预期分离的独特细胞表面标志物，但已经在阐明MSC的多效性功能中做出了相当大的进步。为了允许比较来自不同制造商的临床上使用的MSC的效果，国际细胞治疗协会(International Society for Cellular Therapy)提出了一套限定MSC的表型和功能标准。MSC表面上没有HLA-II类抗原和共刺激分子、旁分泌大量具有免疫调节潜能的分子以及容易从许多组织中预期分离，使其成为范围广泛的临床状况，如组织损伤、炎症过程和自身免疫性病症中的基于细胞的治疗策略的非常吸引人的来源。然而，对于所有这些临床应用，在适当的时候需要大量“现成的”MSC。
迄今为止，使用由单一骨髓供体产生的间充质基质细胞(MSC)进行大多数临床研究。由于MSC制备物的效果在供体间变化明显，所以从这些研究获得的结果在很大程度上是非常多样化的。另外，发明人和其他人已经证明MSC在克隆水平上不仅显示出巨大的供体间异质性，而且还显示出群体内异质性。这种显著的异质性构成临床制备方案发展中的主要障碍，该临床制备方案可以用于重复产生具有等同治疗效能的MSC-产物。
US 5,486,359中描述了来自骨髓样品的人间充质基质细胞的分离方法。开发了结合间充质基质细胞的抗体以便从骨髓抽取液或磨碎骨材料中纯化MSC。经由Ficoll梯度分离骨髓样品，并且将低密度部分用于干细胞分离。US 5,486,359在组织培养塑料制品上于正常培养基中培养细胞1天以允许干细胞贴壁。此后，更换培养基并且培养细胞直至汇合，其中每4天更换培养基以获得MSC。
WO 2012/048093公开了来自单一供体的骨髓来源的MSC的分离。WO 2012/048093教导：可以将来源于单一供体的MSC制备物扩增至临床规模制备物。
已知由不相关的骨髓供体或骨样品的个人骨髓单核细胞部分产生MSC制备物之后，所述MSC制备物的合并对于治疗患有骨髓纤维化的患者中的危及生命的出血是可能的，所述患者经历了同种异体造血干细胞移植(O Ringdén and K LeBlanc,Bone MarrowTransplantation,2011；46:1158–1160)。在本研究中，将分别来源于两名不同供体的临床级MSC制备物组合以增加应答的可能性。
鉴于上文所述的现有技术，临床中存在对制备具有可预测增殖潜能和免疫抑制潜能以及最小的批次间变化性的临床级MSC制备物的持续需求。因此，本发明寻求解决的问题是提供从骨髓样品制备/分离具有改善特性的MSC的方法。
在第一方面，上述问题由间充质基质细胞(MSC)制备物来解决，所述间充质基质细胞(MSC)制备物包含分离自骨髓单核细胞(BM-MNC)的MSC，特征在于所述MSC制备物是hTERT阴性的和多基因的。在优选的实施方案中，所述MSC是哺乳动物细胞，优选是人MSC。
当在上下文中用于描述样品或细胞组合物时，术语“单基因的”是指源于共同来源或具有相同遗传背景的这些细胞。另一方面，术语“多基因的”是指源于不同来源且具有不同遗传背景的细胞组合物。在本发明的上下文中，“多基因的MSC制备物”是包含具有不同遗传背景的MSC，例如源于至少两名遗传上不同的骨髓供体的MSC的组合物。
在本文所述发明的上下文中，术语“间充质基质细胞”和“间充质干细胞”应被理解是分离自骨髓样品的同一专能细胞部分的同义描述。
为了使供体间变化性在异体抑制潜能方面最小化，本发明人研发了由8名第三方健康供体的合并的骨髓单核细胞(BM-MNC)建立符合GMP的、无血清MSC-主细胞库的独特的三步技术：(i)在完全符合当地伦理委员会发布的批准和赫尔辛基宣言的情况下，来自8名第三方健康供体的个人BM-MNC的混合多基因的分离和冻存，(ii)在小瓶中解冻和冻存之后从合并的BM-MNC中产生MSC，以及(iii)解冻MSC样品用于它们的无血清扩增和产生“现成的”临床规模剂量。以此方式，本发明人研发了用于产生临床级MSC制备物的出奇有效的方案，与由个人骨髓供体产生的MSC相比，所述MSC制备物具有持续更高的异体抑制潜能和恒定的增殖能力。因此，该方案为临床研究人员提供用于治疗移植物抗宿主病和其它炎性病症的一致质量的临床级MSC。尽管进行了相当大的前期投入，但该方案确保临床级MSC的免疫抑制性能的一致性、再现性和可靠性。
然而另一实施方案涉及本发明的MSC制备物，其进一步特征在于所述MSC是TERT阴性的。TERT是端粒酶逆转录酶(缩写为TERT，或者hTERT(在人中))，其是端粒酶的催化亚基，连同端粒酶RNA组分(TERC)一起构成维持永生细胞的增殖能力所必需的端粒酶复合体的最重要的单元。本发明的MSC制备物显示出包含并非永生的MSC，这与不存在hTERT表达一致。
本发明的一个另外的优选实施方案是如本文所述的MSC制备物，其中所述MSC制备物包含：
(a)至少80％，优选地至少95％的CD73+细胞，最优选地至少98％，和/或
(b)至少80％，优选地至少95％的CD90+细胞，最优选地至少98％，和/或
(c)至少80％，优选地至少95％的CD105+细胞，最优选地至少98％，和/或
(d)至少80％，优选地至少95％的HLA-I类+细胞，最优选地至少98％，和/或
(e)小于10％，优选地小于1％的CD45+细胞，最优选地小于0.1％，和/或
(f)小于10％，优选地小于1％的CD14+细胞，最优选地小于0.5％，和/或
(g)小于10％，优选地小于1％的CD34+细胞，最优选地小于0.5％，和/或
(h)小于10％，优选地小于5％的HLA-DR+细胞，最优选地小于1％。
在一个另外的实施方案中，MSC制备物包含：
(a)至少80％，优选地至少95％的CD73+细胞，最优选地至少98％，和
(b)至少80％，优选地至少95％的CD90+细胞，最优选地至少98％，和
(c)至少80％，优选地至少95％的CD105+细胞，最优选地至少98％。
另外，本发明的MSC制备物可以包含
(e)小于10％，优选地小于1％的CD45+细胞，最优选地小于0.1％，和
(f)小于10％，优选地小于1％的CD14+细胞，最优选地小于0.5％，和
(g)小于10％，优选地小于1％的CD34+细胞，最优选地小于0.5％。
此外，本发明的问题通过用于分离间充质基质细胞的体外方法来解决，所述方法包括：合并从至少两名遗传上不同的供体获得的骨髓样品以获得样品细胞-合并物，然后从所述样品细胞-合并物分离间充质基质细胞。
根据本发明的从骨髓样品制备或分离MSC的方法涉及合并来自遗传上不同的供体的骨髓或来源于骨髓的单核细胞部分的步骤。因此，在本发明的方法中合并至少两个遗传上不同的骨髓样品或遗传上不同的BM-MNC部分。重要的是，本发明的方法包括在BM样品仍含有不同细胞类型混合物的阶段合并遗传上不同的BM样品。因此，优选地，在从所述样品纯化或扩增MSC部分之前，进行遗传上不同的BM-MNC样品的合并。在分离MSC之前合并细胞产生具有出奇改善的异体抑制潜能的MSC制备物。
在一个实施方案中，根据本发明的方法包括以下步骤：
(a)提供从至少两名遗传上不同的供体获得的多个骨髓样品，
(b)合并所述骨髓样品以获得样品细胞-合并物，
(c)任选地，培养所述样品细胞-合并物，以及
(d)从步骤(b)中获得的所述样品细胞-合并物中分离所述间充质基质细胞。
在一个优选实施方案中，方法包括以下步骤：提供从至少两名遗传上不同的供体获得的多个骨髓样品，从骨髓样品分离单核细胞部分，合并所述骨髓单核细胞样品以获得BM-MNC-合并物，任选地，培养所述BM-MNC-合并物以及从所述BM-MNC-合并物分离所述间充质基质细胞。当然，如本文上文和下文所述的本发明方法的所有另外的特别变型是该方法同等可取的实施方案，所述方法包括从骨髓样品分离BM-MNC的步骤。
在本发明的上下文中的术语“样品细胞-合并物”应指具有不同遗传背景的骨髓来源的细胞的混合物。因此，本发明的样品细胞-合并物是多基因的。最优选地，根据本发明的样品细胞-合并物的特征在于MSC仅以优选地小于80％、优选地70％、60％、50％、40％、30％、20％且最优选地小于10％、甚至更优选地小于5％、小于1％、最优选地小于0.1％的较小百分比存在。
本文使用的术语“遗传上不同的”表明骨髓供体/对象之间在基因组水平上存在至少一个差异。可以从2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多名供体采集骨髓。最优选的是使用4至8个不同的供体样品。
根据本发明的“骨髓样品”可以是骨髓抽取液或来自骨块，如松质骨块。在优选的实施方案中，骨髓样品是骨髓抽取液。本领域技术人员已知如何采集骨髓样品。在一个优选实施方案中，本发明的所述骨髓样品包含不同细胞类型的混合物。例如各个所述骨髓样品包含至少一种非贴壁细胞部分和至少一种贴壁细胞部分。在一个特别优选的实施方案中，所述骨髓样品是骨髓单核细胞(BM-MNC)样品或部分。BM-MNC获得自骨髓。
在本发明的上下文中，“骨髓单核细胞部分”(在本文中也被称为“BM-MNC”)包含B淋巴细胞、T淋巴细胞和NK淋巴细胞、早期骨髓性细胞以及非常低数目的内皮祖细胞、造血干细胞/祖细胞和/或间充质基质细胞。
在本发明的优选实施方案中，所述骨髓样品是哺乳动物骨髓样品并且所述间充质基质细胞是哺乳动物间充质基质细胞。更优选的是所述骨髓样品是人骨髓样品并且所述间充质基质细胞是人间充质基质细胞。
然而，本发明的另一实施方案涉及分离MSC的前述方法，所述方法进一步包括从各个所述骨髓样品提取骨髓单核细胞(BM-MNC)以获得BM-MNC-样品的步骤(a′)，并且其中在步骤(b)中，合并所述BM-MNC-样品以获得所述样品细胞-合并物。如上文所提及的，BM-MNC部分/样品仅含有少量的MSC。因此，在本发明的一个优选实施方案中，所述待合并的BM-MNC样品包含小于80％、优选地70％、60％、50％、40％、30％、20％且最优选地小于10％、甚至更优选地小于5％、小于1％、最优选地小于0.1％的所述样品中的间充质基质细胞/总细胞的百分比。
在本文所述发明的上下文中，在其所有实施方案和方面中，特别优选的是所述骨髓样品(或BM-MNC样品)从至少三名、更优选地至少四名、更优选地至少五名、更优选地至少六名、更优选地至少七名且最优选地至少八名遗传上不同的供体获得。换言之，在一个特别优选的实施方案中，MSC细胞制备物以及其制备方法包括合并至少三个、更优选地至少四个、更优选地至少五个、更优选地至少六个、更优选地至少七个且最优选地至少八个遗传上不同的细胞样品。
从骨髓样品，特别是骨髓抽取液中分离BM-MNC的方法对于技术人员是众所周知的。然而，在本发明的一个实施方案中，优选的是使用诸如Ficoll梯度的细胞密度分离从骨髓样品分离BM-MNC。
一旦合并，本发明的获得的样品细胞-合并物被用于分离和纯化MSC。从骨髓样品或BM-MNC分离MSC的方法在本领域也是众所周知的。本发明的优选方法是以定期间隔从培养容器抽吸细胞培养基通过仅去除漂浮细胞来分离贴壁细胞与非贴壁细胞。通过多次更换培养基，非贴壁细胞部分不断减少，而贴壁MSC-部分继续生长直至汇合。这些贴壁细胞是MSC。
因此，在一个实施方案中，优选的是本发明的方法的步骤(d)包括以下步骤：从所述样品细胞-合并物的培养物中去除非贴壁细胞至少一次；或者其中在培养所述样品细胞-合并物之后，至少一种可检测的表面标志物或抗体被用于所述MSC的纯化。
另外，本发明的方法可以提供储存所述分离的间充质基质细胞或扩增所述分离的间充质基质细胞的其它步骤。
在一个另外方面，本发明包括用于制备临床级MSC制备物的方法。该方法包括分离MSC的前述方法步骤，此外还包括扩增分离的MSC直至得到可适用于临床的MSC的量。本发明的MSC的扩增可以在分离MSC之后立即进行，或者可选地，经由冻存储存分离的MSC，通过解冻细胞的等分试样，用于开始扩增过程。MSC如何扩增是本领域已知的，并且作为本申请的实施例部分中解释的一个实例。
本发明的另一方面涉及细胞组合物，其包含来自至少两名遗传上不同的骨髓供体的骨髓样品。可选地，本发明的细胞组合物可以包含来自至少两名遗传上不同的骨髓供体的BM-MNC。因此，本发明的细胞组合物优选是多基因的。
在一个实施方案中，本发明的细胞组合物是可通过在分离和/或扩增所述骨髓样品中包含的干细胞部分之前合并至少两个单基因的和遗传上不同的骨髓样品获得的。从而，经由合并，细胞组合物变为多基因的。
在一个优选实施方案中，所述骨髓样品是骨髓单核细胞样品。
本方面的一个实施方案涉及本发明的可通过包括以下步骤的方法获得的细胞组合物：
(a)获得至少两个骨髓样品，其中的每一个来自遗传上不同的骨髓供体，
(b)从各个所述骨髓样品分离骨髓单核细胞部分以获得单基因的骨髓单核细胞样品，以及
(c)合并从各个骨髓样品获得的所述单基因的骨髓单核细胞样品以获得多基因的细胞组合物。
应理解，在本发明的上下文中，“骨髓单核细胞部分”包含该来源于骨髓的细胞部分已知的标准细胞组合物。在这方面，优选的是，在进行细胞纯化或扩增的其它步骤之前，优选地在从其分离或纯化任何MSC之前，合并所述单基因的单核细胞样品。
然而，本发明的另一方面提供了从至少两名遗传上不同的骨髓供体获得的骨髓单核细胞的混合物在分离间充质基质细胞的方法中的用途。
进一步提供了在纯化/分离间充质基质细胞的方法之前如本文所述的细胞组合物的用途的方面。
本发明的问题也通过如上文所述的分离/纯化MSC的方法可获得的间充质基质细胞来解决。
本文所述的MSC制备物或MSC优选地用于医学。MSC通常用于多种医学应用。不希望受下述实例的限制，本发明的MSC优选地用于治疗自身免疫性疾病，如多发性硬化、1型糖尿病、类风湿性关节炎、葡萄膜炎、自身免疫性甲状腺病、炎性肠病(IBD)、硬皮病、格雷夫斯氏病、狼疮、克罗恩病、自身免疫性淋巴细胞增生病(ALPS)、神经脱髓鞘病、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性胃炎(AIG)和自身免疫性肾小球病。特别地，本发明的MSC制备物用于移植物抗宿主病(GVHD)的治疗。
然而，在本文所述发明的上下文中，MSC制备物可用于任何再生或自身免疫性疾病，优选地短暂的、复发的或缓解的。本发明MSC制备物的其它临床应用是创伤修复、角膜溃疡、中风或用于促进同种异体干细胞移植的植入。
涉及MSC施用的细胞疗法基于例如下述步骤：根据本文所述的方法收获含有MSC的组织(骨髓)、分离和扩增MSC以及在利用或未用生化或遗传操作下将所述MSC施用于对象/患者。
在一个方面，本发明提供治疗有需要的对象的方法，其包括施用治疗剂量的根据本发明制备的MSC制备物的步骤。
自身免疫性疾病或移植物抗宿主病的治疗剂量可以含有约1×105个细胞/kg至约1×107个细胞/kg。在另一实施方案中，治疗剂量是约1×106个细胞/kg至约5×106个细胞/kg。在另一实施方案中，治疗剂量是约2×106个细胞/kg至约8×106个细胞/kg。在另一实施方案中，治疗剂量是约2×106个细胞/kg或约2×106±约10％、约20％或约30％个细胞/kg。在另一实施方案中，治疗剂量是约8×106个细胞/kg或约8×106±约10％、约20％或约30％个细胞/kg，并且包括于其间的任何量或范围。考虑到本发明的MSC制备物，待施用的间充质基质细胞的数目取决多种因素，其包括患者的年龄、体重和性别、待治疗的疾病及其程度和严重性。
可以通过多种程序施用本发明的MSC。可以全身施用，如通过静脉内、动脉内或腹膜内施用MSC。可以通过直接注入有需要的器官或组织施用间充质基质细胞。可以局部应用间充质基质细胞。在外科手术期间，间充质基质细胞可以直接应用于有需要的组织。
根据本发明的间充质基质细胞可以用于治疗、减轻或预防能够通过血管生成而减轻、治疗或预防的任何疾病或病症。因此，例如，间充质基质细胞可以施用于动物以治疗动脉阻塞，其包括在四肢，即臂、腿、手和足以及颈或在多个器官中的那些动脉阻塞。例如，间充质基质细胞可以用于治疗供给脑的动脉阻塞，从而治疗或预防中风。此外，间充质基质细胞可以用于治疗胚胎角膜和出生后角膜中的血管并且可以用于提供肾小球结构化。在另一实施方案中，间充质基质细胞可以用于治疗内部和外部创伤，以及治疗足、手、腿或臂中发现的皮肤溃疡，其包括但不限于由诸如糖尿病和镰状细胞性贫血的疾病引起的皮肤溃疡。
此外，因为血管生成参与胚胎植入和胎盘形成，所以间充质基质细胞可以用于促进胚胎植入并预防流产。
另外，间充质基质细胞可以施用于未出生对象(包括人)以促进未出生对象中脉管系统的发育。
在另一实施方案中，间充质基质细胞可以施用于出生或未出生对象以便促进软骨再吸收和骨形成，以及促进正确的生长板形态发生。
可以用一种或多种编码治疗剂的多核苷酸遗传改造间充质基质细胞。多核苷酸可以经由适当的表达媒介物递送至间充质基质细胞。可以用于遗传改造间充质基质细胞的表达媒介物包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。可以例如遗传改造本发明的MSC以过表达TERT，从而使细胞永生化。
此外，本发明的MSC制备物或间充质基质细胞可以用于干细胞移植。
进一步提供的是本发明的MSC制备物或MSC在制备骨替代材料中的用途。
本发明的另一方面是用于制备包含间充质基质细胞的药物的方法，其包括根据本文所述的用于分离/纯化MSC的方法中任一个的方法步骤。
在另一实施方案中，本发明的MSC或用本发明的方法制备的MSC能够在适当的培养条件，如各自的诱导细胞分化的条件，例如用适当的诱导培养基，如分别为成骨、脂肪形成和软骨形成诱导培养基下培养分化成成骨细胞、脂肪细胞和/或软骨细胞。在一个实施方案中，适当的培养条件和适当的诱导培养基为实施例中指定的那些。在另一实施方案中，合适的条件和培养基的实例公开在Aubin J E.Osteoprogenitor cell frequency in ratbone marrow stromal populations:role for heterotypic cell-cell interactionsin osteoblast differentiation.J Cell Biochem.(1999)72(3):396-410(对于骨生成)；Falconi D,Oizumi K,Aubin J E.Leukemia inhibitory factor influences the fatechoice of mesenchymal progenitor cells.Stem Cells.(2007)25(2):305-312(对于脂肪形成)；和Zhang S,Uchida S,Inoue T,Chan M,Mockler E,Aubin J E.Side population(SP)cells isolated from fetal rat calvaria are enriched for bone,cartilage,adipose tissue and neural progenitors.Bone.(2006)38(5):662-670(对于软骨形成)中。
在本发明的一个方面，本发明提供进行本发明方法的试剂盒，其包含下述的一个或多个：培养基和使用它们的说明书。在另一实施方案中，本发明可以提供试剂盒，其包含本发明的分离的间充质基质细胞的样品以及任选地培养基和/或用于实验和/或移植中的说明书。
此外，如本文所述的间充质基质细胞(MSC)制备物的特征在于其包含分离自骨髓单核细胞(BM-MNC)的MSC，其是多基因的并且具有至少一种下述特性：
(a)与单基因的MSC(由单一供体产生的)中的p21表达相比，p21表达增加，
(b)与单基因的MSC(由单一供体产生的)中的p53表达相比，p53表达降低，和/或
(c)与单基因的MSC(由单一供体产生的)中的c-myc表达相比，c-myc表达降低。
这些特性可以用作区别本发明所述的MSC制备物与现有技术的制备物的替代的或另外的结构特征。在一个实施方案中，与单基因的MSC(由单一供体产生的)中的p21表达相比，本发明的MSC制备物包含具有增加的p21表达的MSC。与单基因的MSC(由单一供体产生的)中的p53表达相比，本发明的MSC还可以或可选地以降低的p53表达为特征。
在一个实施方案中，本发明涉及MSC制备物，其中与单基因的MSC(由单一供体产生的)中的c-myc表达相比，所述MSC进一步或可选地以降低的c-myc表达为特征。
在特定实施方案中，所述p21表达的增加为至少2-倍，优选地至少3倍，更优选地至少4倍；和/或其中所述p53表达的降低为至少10-倍，优选地至少20倍；和/或其中所述c-myc表达的降低为至少10-倍，优选地至少20倍，且最优选地不可检测的。
本发明的优选MSC制备物包含具有所有前述特性(a)至(c)的MSC。本发明的分离的MSC包含至少一种在第5号染色体与第9号染色体之间具有染色体易位的人MSC，其可以用作本发明的MSC的另外的特性。优选地，MSC的特征在于(a)和(b)、(a)和(c)或(b)和(c)。最优选地，所述MSC的特征在于(a)、(b)和(c)。MSC制备物也为优选的，其中p21、p53、c-myc和/或hTERT的表达的差异在本发明的MSC与由单一供体产生的单基因的MSC之间。
现将参考附图和序列在以下实施例中进一步描述本发明，然而，本发明不限于此。出于本发明的目的，本文引用的所有参考文献通过引用以其整体并入。在图中：
图1：骨髓的采集和骨髓单核细胞的分离。A)通过从髂嵴两侧抽吸从8名全身麻醉的健康第三方供体采集骨髓。B)将骨髓样品收集于袋中，并且用7-12％的ACD-A和7-12i.U.肝素/ml骨髓抽取液抗凝。C)使用Sepax II NeatCell方法(Biosafe,Switzerland)通过Ficoll(GE Healthcare,Munich,Germany)密度离心从骨髓抽取液中富集骨髓单核细胞。D)将BM-MNC洗涤两次并且重悬于由10％DMSO/5％HSA/X-vivo组成的冷冻培养基(cryomedium)中。E)将含有在冷冻培养基中的来自各名骨髓供体的BM-MNC的袋在气相液氮中冷冻直至使用。
图2：来自骨髓单核细胞的MSC-库的产生。A)将含有各名供体的骨髓单核细胞的袋在+37℃解冻，并且在用培养基洗涤两次之后，将其在确定体积的补充有5％血小板裂解物的DMEM中合并。将所有细胞在1个1-CellStack和11个2-CellStack板中铺板。B)在72小时之后，去除非贴壁部分，并且通过每三天更换一次培养基，将贴壁细胞在补充有5％PL的DMEM中进一步培养另外11天。一旦出现MSC并且其生长至80％的汇合度，使用胰蛋白酶(TrypLE)分离MSC，并且在用培养基洗涤之后，将细胞团重悬于由10％DMSO/5％HSA/DMEM组成的冷冻培养基中。C)将MSC在210个冷冻管中冷冻，每个含有1.5x 106个P1代MSC。本发明人将该套含有MSC的小瓶称为为MSC-库。
图3：MSC-临床终产物的产生。A)在最初冻存之后6-8周，将3个随机选择的冻存的含有MSC的小瓶解冻。B)将它们在1个1-CellStack(636cm2)中铺板，并且在含有10％血小板裂解物的DMEM中培养6-7天。每三天更换一次培养基。C)在第6天或第7天(根据它们的汇合生长)，通过胰蛋白酶分离MSC(P1结束)，洗涤，以2x103个MSC/1cm2的细胞浓度在8个2-CellStacks中铺板并且再扩增一周。每3-4天更换一次培养基，在该周结束时(P2结束)，通过胰蛋白酶分离MSC，洗涤两次，并且对细胞数目进行计数。将这些MSC冻存并且称为MSC临床产物，在2-3周之后，就其增殖、分化和异体抑制潜能，进行确认。
图4：MSC的表型及其分化潜能。A)将来自MSC-库的等分试样在第2代结束时的扩增产生的MSC用如表1所呈现的与荧光染料缀合的小鼠抗人抗体标记。B)在组织特异性培养基中培养MSC诱导其分化成脂肪细胞和成骨细胞。
图5：来自个人供体的MSC和MSC-终产物的生长动力学。A)将来自各名骨髓供体的最初数目为4.4x104个的MSC扩增一代(从P2开始至结束)。同时，将所有8名供体的MSC合并，并且从P2开始扩增直至结束(MSC-合并物)，来自MSC-库的4个等分试样也同样扩增。在第2代结束时，使MSC胰蛋白酶化并且计算其数目；ns＝不显著。B)将MSC-库的10个MSC-冷冻管解冻并经两代扩增以便评估其增殖潜能。在第2代结束时所有扩增小瓶的平均细胞数目为5.3x108±5x107个MSC。C)MSC显示出大约4次群体倍增(PD)/代，因此PD的累积数(CPD)为8.7±0.4PD。D)为证明MSC-终产物不是永生细胞，本发明人评估其生长动力学持续12代并且估算PD的数目。如图中所示，从9-12代，这些MSC甚至不能自我复制(n＝3)。
图6：由个人供体产生的MSC和MSC-终产物的异体抑制潜能。A)将来自8名个人供体的0代MSC以及扩增之前通过合并8名供体的MSC产生的MSC-合并物(MSC-合并物)和1个MSC-终产物(MSC-140)扩增至第2代结束。此后，使MSC胰蛋白酶化，在培养基中洗涤两次，以及在通过台盼蓝测定细胞计数和活力之后，在MLR-分析中用于估算它们的异体抑制潜能。在第6天，向细胞提供BrdU，第二天，进行分析以便评价来自两名HLA-不同供体的同种异体血液单核细胞的增殖的抑制。B)将6个MSC-终产物(临床剂量)解冻，并且在洗涤细胞之后，将其直接用于MLR-分析。这些实验的目标是发现解冻的MSC-终产物(当其被给予患者时)是否能够抑制同种异体-诱导的来自两名同种异体MNC供体的单核细胞的增殖。
图7：临床规模MSC-终产物的基因特性。A)在第2代结束时临床级MSC-终产物的正常染色体组型。B)在探针组5p15(绿色)和5q35(红色)的两色杂交之后的间期细胞核确定5号染色体的正常二倍体模式。C)在MYC分裂探针(break apart probe)的三色杂交之后的间期细胞核在几乎所有细胞中显示出两个正常的融合信号。D)在探针组5p15和5q35的两色杂交之后具有正常二倍体和非整倍体模式的MSC的数目。分析的MSC的总数为396。E)在针对染色体8q24的MYC分裂探针的三色杂交之后具有正常二倍体和非整倍体模式的MSC的数目。分析的MSC的总数为356。
图8：MSC-终产物的转化基因的表达和嵌合分析。A)在3个临床规模MSC-终产物的细胞转化中涉及的基因的RT-PCR分析。总RNA分离自来自一名供体的3个MSC-终产物和MSC(对照)。在转录成cDNA之后，通过PCR将其用于定量p21、p53和c-myc的表达。B)临床规模MSC-终产物的STR-PCR分析。从临床级MSC-终产物的MSC分离DNA，然后将其用于评价细胞核DNA中存在的特异性STR-区。由合并的MNC产生的MSC-终产物中表现所有8名供体的基因型。
实施例
材料和方法
原材料采集
在全身麻醉下通过从髂嵴两侧抽吸来抽吸骨髓。将骨髓用7-12％的ACD-A和7-12i.U.肝素/ml骨髓抽取液抗凝。
传染病测试
传染病标志物组超出JACIE和德国干细胞法案的最低需求。因此，作为供体处理的一部分，寻求HiV1/2、抗-HBc、HBsAg、抗-HCV、抗-HTLV1/2(所有均为IgM和IgG)、抗-肝炎AIgM、抗-弓形虫IgM、抗-EBV IgM、抗-CMV IgM和TPHA呈血清阴性，以及HiV、HAV、HBV、HCV和ParvoB 19呈NAT阴性的证据；在骨髓捐赠当天重复对HiV1/2、抗-HBc、HBsAg、抗-HCV、CMV、TPHA和所述NAT的测试。所有供体符合标准。此外，由于CMV为细胞寄宿的病毒，所以寻求在骨髓细胞团中CMV基因组呈阴性(Dept.of Virology,Goethe University,andBioreliance,Glasgow,UK)。
处理设施
所有过程在细胞治疗学/细胞处理部门的洁净室套间(A类于B中)(GMP)中于完全的GMP标准下进行，这为德国红十字会血液服务中的一部分，并且在来自州政府的正式许可(根据§20b/c(BM采集和测试)和§13(MSC产生和测试)德国药品法的制造许可证)下，完全嵌入到其质量管理系统中。
骨髓处理
使用如制造商所述的Sepax II NeatCell方法(Biosafe,Switzerland)通过Ficoll(GE Healthcare,Munich,Germany)密度离心从骨髓抽取液中富集骨髓单核细胞。通过无菌焊管(TSCD,Terumo,Düsseldorf,Germany)建立所有连接，以便使用完全密闭的过程。
血小板浓缩物的采集和血小板裂解物(PL)的产生
作为血小板裂解物的起始材料，使用含有大约10％血浆的PASIII的1至2天血沉棕黄层汇集的血小板。根据德国的血液制品指南，清除血小板用于临床使用。将多达4-6份血小板浓缩物合并以产生一批血小板裂解物。在B环境下的A中，将血小板等分至无菌50mlFalcon管中，并立即冷冻于-80℃。在至少24h之后，将单独的等分试样解冻并以3774x g离心10分钟(含有制动)(加速8次，制动4次)。收集上清液(血小板裂解物)并进行延长的释放测试，其包括没有细菌(BacTAlert,Biomerieux)以及促进MSC祖细胞的粘附性和MSC-扩增的潜能。
血小板裂解物的测试
a)血小板裂解物促进MSC祖细胞的粘附性的潜能
将骨髓单核细胞(BM-MNC)在37℃解冻，用补充有5％PL的DMEM洗涤两次并在最后一次洗涤之后，将细胞团重悬于补充有5UI肝素/ml和5％或10％PL的DMEM中。将BM-MNC以1.71x10e5/1cm2的密度铺板，并且在37℃，5％CO2和饱和湿度下孵育72小时。去除非贴壁细胞部分，同时将贴壁细胞进一步培养另外11天。每3-4天更换一次培养基。一旦梭状细胞(MSC)汇合70-80％，将其通过胰蛋白酶酶促分离并且对其数目进行计数。用两种培养基，即补充有5％PL或10％PL的DMEM进行该程序。
b)PL扩增MSC的能力
血小板裂解物的规范设定为符合德国指南中列出的IDM标准、没有细菌、冻存的MSC等分试样在7天内扩增至少2-倍。仅满足这些标准的血小板用于临床MSC方案的产生。
MSC-库和临床级终产物的产生
a)MSC-库的产生
将含有来自各名供体的骨髓单核细胞的袋在+37℃下于Plasmatherm中解冻。通过在400g离心10分钟，用补充有5％PL的DMEM将其洗涤两次，并且在确定体积的DMEM+5％血小板裂解物中重悬。在该步骤之后，将来自各名供体的细胞悬液合并在一起并且通过细胞计数器(Sysmex)对细胞的数目进行计数。此后，将细胞悬液合并物在11个2-CellSTACK(每一个2-CellSTACK：250x10e6个BM-MNC/260ml培养基)和1个单一CellTACK(每1-CellSTACK：125x10e6个BM-MNC/130ml培养基)中铺板。在72h之后，使用培养基更换袋(Macopharma,Langen,Germany)去除非贴壁细胞，并且用补充有5％PL的DMEM将贴壁细胞进一步培养另外11天直至MSC为80-90％汇合的。在该期间，每3-4天更换一次培养基。在MSC分离之前第14天，从各个Cell-STACK取出5ml培养基，将其在待测试针对需氧和厌氧细菌和真菌的无菌性的无菌瓶中合并。此后，使用合成的TrypLE(Life Technologies,Darmstadt,Germany)分离细胞，并且在用DMEM+5％PL洗涤之后，将细胞在400x g下离心7分钟。将细胞团重悬于确定体积的培养基中，并且在血细胞计数器中用台盼蓝对细胞进行计数。本发明人总计获得320x10e6个1代MSC。凭借流式细胞术，将两百万个细胞用于表型的确定。将剩余的MSC在400x g离心7分钟。
将细胞重悬于5％HSA/DMEM中，由此将MSC的数目调节至3x10e6个细胞/ml。将1体积的细胞悬液与1体积冷冻的含有20％DMSO/5％HSA/DMEM的培养基缓慢地混合。因此，MSC的终浓度为1.5x10e6个/ml细胞悬液，而冷冻培养基的终浓度为10％DMSO/5％HSA/DMEM。将细胞分配到210个冷冻管中(每个1.5x10e6个1代MSC)，然后根据建立的方案，通过使用Cryoserve速率受控的冷冻机(Germany)冻存。将冷冻小瓶储存在气相液氮(Tec-Lab,Idstein,Germany)中。另外，将剩余的MSC与冷冻的培养基混合并且测试无菌性(需氧的和厌氧的细菌和真菌)。
b)临床规模MSC-终产物的产生
为产生和确认临床规模MSC-终产物，在冻存之后每一随机的6-8周将MSC-库小瓶相继解冻。在37℃解冻之后，将MSC在含有10％PL的培养基中洗涤，由此在血细胞计数器中使用台盼蓝染色评估细胞计数活力。将1个MSC-库小瓶的细胞在1个1-CellStack(636cm2)中铺板，并且用补充有肝素(5IU/ml培养基)和PL 10％(V/V)的DMEM培养。在第4天和第6-7天更换培养基，使用TrypLe分离细胞，然后以2x103个细胞/cm2的密度在8个2-CellStacks(各为1,272cm2)中进一步铺板作为第2代。同第1代一样重复该程序，并且在第6-7天收获MSC。在用0.5％HSA/0.9％NaCl洗涤之后，通过台盼蓝染色对活的MSC进行计数。此外，将临床规模MSC重悬于冷冻培养基(0.9％NaCl以及5％HAS和10％DMSO)作为第2代结束的MSC并且分配到4-7个冷冻袋中，所述低温袋含有在体积为45ml冷冻培养基中的各4,2-5.5x10e7个MSC。使用建立的方案利用Cryoserve速率受控的冷冻机(Germany)将样品冻存并且储存在气相液氮(Tec-Lab,Idstein,Germany)中。
质量控制测试
用解冻的没有扩增的MSC-终产物以将其施用于患者用于临床应用的状态下进行所有测试。
a)解冻MSC的细胞枚举和活力
使用Neubauer室血细胞计数器进行总细胞枚举。使用台盼蓝染色评估MSC活力。
b)表型表征
使用针对MSC的ISCT最低标准进行流式细胞术分析。为测定解冻的MSC的表型，本发明人利用下述如表1所呈现的荧光染料-缀合的小鼠抗-人单克隆抗体对所述解冻的MSC进行染色。
表1.用于测定MSC表型的抗体
d)MSC-终产物的异体抑制潜能的评价
为测试MSC-终产物对异体抗原-驱动的反应的免疫抑制效果，本发明人使用混合淋巴细胞反应(MLR)。使用Ficoll-梯度(密度1.077,Biochrom KG,Berlin,Germany)分离来自健康不相关的供体的外周血单核细胞(PB-MNC)，用PBS洗涤两次并且重悬于具有10％FBS(Invitrogen)的RPMI-1640中。将2名不相关的供体的PB-MNC在黑色96-孔板中单独(对照组)或者与第三方致死量辐照的(30Gy)MSC-终产物以1:1的MSC:PB-MNC比率(1×105个MSC:1×105个PB-MNC)混合培养六天。本发明人直接评估6个解冻之后的MSC-终产物以及所有8名供体的MSC，将所述供体的BM-MNC合并并且充当产生本发明人的主MSC-库的来源。在96孔板中以一式三份进行所有MLR。在第6天，将细胞与5-溴-2′-脱氧尿苷(BrdU)(RocheDiagnostics GmbH,Mannheim,Germany)孵育24h。第二天，用光度计1420 MultilabelCounter Victor 3(Perkin Elmer,Rodgau-Jügesheim,Germany)测量相对光单位(RLU/s)。在第7天使用BrdU分析测定PB-MNC的增殖水平。MSC-终产物对同种异体MNC的增殖的抑制效果使用下式计算为百分比：100-[(在存在MSC的情况下同种异体PB-MNC的增殖/没有MSC时PB-MNC的增殖)×100]。
e)MSC-终产物的体外衰老的测定
为证明MSC-终产物不是永生细胞，本发明人评估其在12代内的生长动力学。对于各代，每3-4天更换一次培养基并且通过TrypLE对MSC的分离根据其增殖潜能进行。为更精确地估算其生长动力学，本发明人通过使用下式计算群体倍增(PD)的数目：
对于各个传代培养的PD：[log 10(NH)-log 10(NI)]/log 10(2)；其中NH＝细胞收获数目，NI＝细胞的接种数目。
f)MSC-终产物的分化潜能
为研究沿脂肪生成和骨生成的分化潜能，将第2代的MSC-终产物解冻并根据制造商的说明书(Miltenyi Biotec GmbH)直接培养在适当的组织特异性诱导培养基中。
脂肪生成
为了产生脂肪细胞，将解冻的MSC的数目调整至5x10e4个细胞/1ml NH AdipoDiff培养基。然后，在37℃下于含有5％CO2和>95％湿度的培养箱中，将1.5ml此类细胞悬液培养在35mm细胞培养皿中。每3d更换一次培养基，在2-3周之后，开始出现大的液泡。在第30天，脂肪细胞为圆形的并且填充有脂肪滴，本发明人用油红O(Millipore,Schwalbach,Germany)(亲脂性红色染料)对其进行染色。
骨生成
简言之，将解冻的MSC的浓度调整至3x10e4个细胞/1ml NH OsteoDiff培养基。然后，在37℃下于含有5％CO2和>95％湿度的培养箱中，将1.5ml此类细胞悬液培养在35mm细胞培养皿中。每3d更换一次培养基。在第10天，成骨细胞可以通过其立方形外观以及通过其与新合成的骨基质的缔合在形态学上进行鉴定。通过碱性磷酸酶染色(Sigma,Deisenhofen,Germany)使这些细胞可视化，因为定型的成骨细胞表达高水平的该酶。由于该染色，成骨细胞表现为深紫色染色的细胞。使用配备有Soft Imaging System F-View II照相机和cellSens Dimension成像软件的Olympus IX71显微镜评价组织特异性染色。
g)临床级MSC-终产物的基因分析
临床规模MSC-终产物的转化基因的表达的RT-PCR分析。分别根据制造商的说明书，使用RNeasy微型试剂盒(Qiagen)提取RNA，随后利用随机的六核苷酸，使用Verso cDNA试剂盒(Thermo Scientific)，用1μg总RNA进行逆转录。对于c-myc、p21、p53和GAPDH基因，使用Quanti Tect SYBRE green qPCR主体混合物(Qiagen)在Eppendorf realplex上进行实时PCR。使用Absolute qPCR ROX混合物(Thermo Scientific)在Biorad MyiQ Cycler上进行hTERT和ABL基因转录的检测。在Eurofins MWG购买寡核苷酸。除了反应混合物特异的激活期之外，引物序列和PCR条件已经在别处详细公开。
h)间期荧光原位杂交(FISH)
使用下述针对5号和8号染色体的探针根据制造商的方案进行间期FISH分析：针对染色体5p15(hTERT)和5q35(NSD1)的两色探针(Kreatech,Amsterdam,NL)以及针对染色体8q24的三色分裂探针(MYC,Kreatech,Amsterdam,NL)。在自动点计数系统(AppliedSpectral Imaging,Edingen/Neckarhausen,Germany)上进行杂交信号的评价。对于各个探针，扫描>300个核酸并且使用5％的阈值进行分类。
证明文件
在产生MSC-细胞库、用于测试的临床样本和用于发布的临床样本之前，已经在小规模培养物中正式验证该过程，基于该过程，正式确定制造说明(SOP)、批次记录、测试说明和方案以及技术参数。MSC-细胞库以及用于临床试验的临床样本的制造许可证从州政府获得。在从联邦药品局的Paul Ehrlich研究所(Federal drug agency,the Paul EhrlichInstitute)获得正式报告之后，设置质量规范。
统计分析
使用GraphPad Prism 5软件(GraphPad Software,San Diego,CA,USA)分析统计显著性。使用学生t检验评估显著性。P值小于0.05被认为是统计学上显著的。
实施例1：来自8名健康第三方供体的骨髓的采集和BM-MNC的分离
出于完全符合赫尔辛基宣言由当地伦理委员会批准的MSC建库的目的，在获得书面的知情同意之后，从各名骨髓供体收集多达250ml另外的骨髓抽取液。本发明人从8名供体总共获得1.66升骨髓。为了通过Ficoll-梯度分离骨髓单核细胞，本发明人使用如图1所示的Sepax机器。在该分离程序之后，BM-MNC/1ml骨髓的绝对数目为3.3x106±6.3x105个细胞。在两次洗涤步骤之后从8名供体获得的BM-MNC的总数目为9.86x109。将这些细胞重悬于冷冻培养基中，并且分配到袋中，其使用速率受控的冷冻机冷冻，然后储存在气相液氮中直至使用。
实施例2：来自骨髓单核细胞的间充质基质细胞的产生-MSC-库的建立
为产生MSC-库，将来自8名供体的骨髓单核细胞解冻，洗涤并在补充有5％PL的DMEM中合并。为发现对于MSC祖细胞的粘附性最佳的血小板裂解物浓度，本发明人用两种浓度的PL-5％和10％培养BM-MNC。获得的结果已经证明，5％浓度的血小板裂解物在促进BM-MNC和产生MSC中比10％浓度的PL有效得多(图2A)。另外，本发明人问及这两个浓度的PL中的哪个对于MSC的临床规模扩增更好。本发明人发现10％浓度的PL在扩增MSC中比5％PL显著更有效(图2B)。此外，在两种情况下，未过滤的血小板裂解物对于MSC的产生和扩增比过滤的血小板裂解物更有效(图2C)。这些初步实验为建立主MSC-库做好准备。因此，本发明人解冻来自各名供体的BM-MNC，并且在洗涤两次之后，将其合并在一起，然后培养14天，如方法部分中所述。本发明人能够由9.89x109个BM-MNC产生3.2x108个1代MSC。这些MSC表达MSC的典型标志物，如CD73、CD90和CD105，但对造血细胞标志物，例如CD14、CD34、CD45呈阴性。它们不表达HLA-II类抗原，但表达高水平的HLA-I类抗原。根据台盼蓝染色，在冷冻之前的这些MSC的活力为95±5％。
将总数目的MSC分配到210个冷冻管中，各冷冻管含有1.5x10e6个MSC P1，并且最终在气相液氮中冷冻直至使用。本发明人将该套小瓶称为MSC-库。
实施例3：临床规模MSC-终产物的产生和确认
a)来自MSC-库的小瓶的解冻
为产生和测试关于临床规模MSC-终产物的增殖、分化和异体抑制潜能，在冻存之后6-8周，本发明人解冻3个随机选择的来自本发明人的库中的MSC-小瓶。来自3个解冻小瓶的细胞平均恢复率为1.39x106个活细胞/小瓶(范围为1.23x106至1,48x106)，而活力为95,25％(范围为93,45％-96.9％)。平均地，这些MSC在2周内直至第2代结束的扩增导致470x106个活MSC(范围为420-548x106个MSC)的产生。将这些样品在袋中冷冻直至使用并且被称为临床规模MSC-终产物。
b)MSC-终产物的免疫表型分型及其分化潜能
在第2代结束时临床终产物的MSC对于造血标志物CD45、CD14、CD34呈阴性，并且不表达HLA-DR。然而，它们表达高水平的典型MSC-标志物，如CD73、CD90和CD105。它们也能够在组织特异性培养基中沿成骨细胞和脂肪细胞分化(图4)。
d)MSC的增殖动力学和衰老
为显示合并来自8名供体的骨髓单核细胞以便建立本发明人的MSC-库的基本原理，本发明人将来自8名个人供体的MSC的体外生长与来自各名供体的P2内的合并的MSC和同一代数内的4个MSC-终产物的生长进行比较(图5A)。如所预期的，各名骨髓供体的MSC显示出从0.3x106(供体7)至1.7x106个MSC(供体5)的不同的生长动力学。由8名供体合并的BM-MNC产生的MSC-产物的平均增殖动力学为1.0x106±0.5x106个MSC，这与8名供体的个人MSC合并物产生的MSC的数目(1.1x106)具有令人惊讶的优良相关性。更有趣地是，这两个数值均与由4个代内MSC-终产物的扩增获得的MSC的平均数(1.085x106±0.1x106个MSC)具有极好的相关性。这些结果证明了本发明人的设想：通过合并BM-MNC，产生优良和不良增殖性的MSC的“算术平均数”是可能的。
为了测试这样的预期，即来自MSC-库的各个MSC-终产物几乎具有相同的增殖潜能，本发明人在从P0至用于临床应用的第2代结束的MSC-库的扩增的10份等分试样中对其进行分析。如图5B所示，在第2代结束时所有扩增的终产物的平均细胞数目为5.3x108±5x107个MSC，这表明终产物的高度均一的增殖潜能。同样地，P1和第2代结束时群体倍增的数目相当同一(4.3PD/代)，并且PD的累积数不超过数值9(8.7±0.4)。为测试MSC不是永生的，本发明人将来自本发明人的MSC-库的3个MSC-终产物经12次传代扩增。如图5D所示，从第5代至第12代，MSC经历复制衰老，并且PD的数目迅速减少，这表明这些细胞确实衰老，并且不会无限增殖。
e)分离自个人供体的MSC和MSC-终产物在混合淋巴细胞反应(MLR)中的异体抑制潜能
MSC已经被证实在体外或体内发挥异体抑制性能。为测试发明人的设想：由8名供体的BM-MNC合并物产生的MSC可具有比由个人供体产生的MSC的平均异体抑制潜能高的异体抑制潜能，本发明人在MLR中使用来自8名个人供体的扩增的第2代MSC以及扩增之前通过合并8名供体的MSC产生的MSC-合并物(MSC-合并物)和一个MSC-终产物(由MNC-合并物来源的MSC-库产生的：MSC-140)。如所预期的，个人MSC的异体抑制潜能非常多样化，即这些MSC完全不同地抑制异体抗原-诱导的来自两名HLA-不同供体的血液MNC的增殖。该效果的范围为20％(供体1和供体8)至约80％的抑制(供体2和供体3)(图6A)。由8名供体的MSC的合并物(MSC-合并物)产生的MSC的异体抑制潜能等于来自总共8名供体的MSC的平均抑制潜能(8名供体的平均值)。然而，来自本发明人的MSC-库的扩增的MSC-140样品的异体抑制潜能显著高于MSC-合并物的异体抑制潜能和来自总共8名供体的MSC的平均异体抑制潜能(分别为P<0.001，P<0.01)。为了评估本发明人的MSC-临床产物在解冻之后在抑制同种异型反应(alloreaction)中是否为均一的，本发明人解冻6个含有MSC的备用小瓶，并且当将其施用于患者体内时，在MLR分析中直接测试。如图6B所示，所有这6个临床MSC-产物在体外显示出恒定的异体抑制效果，这表明它们在抑制同种异型反应中非常均一的潜能。在此处使用的靶标-效应细胞比率下的平均异体抑制潜能为52％±8.7％。
实施例4：临床级MSC-终产物的基因表征
因为体外培养通常可为培养的细胞的染色体畸变的来源，所以本发明人问及本发明人的临床级MSC-终产物是否经受此种变化。具有大约350-400条带的分辨率的25个MSC-有丝分裂的染色体分析在其全部当中均显示出的正常数目的染色体(整倍体)(图7A)。然而，通过使用大约300条带的分辨率，本发明人发现在25个分析的有丝分裂中有4个存在5号染色体的短臂与9号染色体的短臂之间的易位。断裂点位于条带5p13和19p13.3。使用针对染色体5p15(hTERT)和5q35(NSD1)的两色探针以及针对染色体8q24的三色分裂探针的荧光原位杂交(FISH)分析显示：来自本发明人的MSC-库的大多数临床级MSC-终产物具有两套染色体的正常二倍体模式(图7B、图7C)。在探针组5p15(绿色)和5q35(红色)的两色杂交之后，间期细胞核确定97.2％的细胞显示出5号染色体的正常二倍体模式，并且仅约2.8％显示出四倍体杂交模式(图7D)。同样地，在MYC分裂探针的三色杂交之后，间期细胞核(图7C)显示出97％的MSC中有染色体8q24的两个正常融合信号以及3％的MSC具有四倍体信号模式(图7E)。因此，非常小部分的MSC在体外获得染色体畸变。
在3个临床规模MSC-终产物中的p53、p21和Myc基因表达的分析显示出p21表达增加2至5-倍，p53基因表达降低约6至10-倍以及原癌基因c-myc未表达(图8A)。最重要的是，与来自本发明人的库中的MSC的衰老表现一致，本发明人证明3个MSC-终产物均不表达hTERT(数据未显示)。
因为本发明人的库中的MSC由8名第三方供体的BM-MNC合并物产生，所以本发明人对MSC产生之后各名供体的相对贡献感兴趣。使用一系列的基因标志物通过STR-PCR的嵌合分析显示临床规模MSC-终产物中8名供体以不同比例存在(图8B)。原则上，临床产物中存在的百分比与个人供体产生的MSC的增殖潜能相关，即单独扩增较好的MSC也以较高比例发现于MSC-终产物中。
实施例5：用本发明的MSC制备物治疗的患者的临床病例
1999年03月26日出生的患者1
病症：重型地中海贫血
在接受干细胞移植之后，患者出现由免疫学多浆膜炎引起的腹水、关节肿胀、心包积液(可能在移植物抗宿主病(GvHD)的情况下)。进行一次本发明的MSC的施用而无并发症。在用利尿剂伴随治疗下，腹水、关节肿胀和心包积液消失。
2009年12月20日出生的患者2
病症：严重的粒细胞缺乏症
在干细胞疗法(SCT)之后第+12天，患者显示出急性爆发的皮肤GvHD(IV级)，即使每天利用2mg/kg类固醇和55mg/kg Mofetilmycophenolat，也无法对其进行控制。在2012年11月22日，该儿童接受本发明的MSC。
在MSC疗法之后，GvHD缓慢地但不断地衰退，直至在MSC施用第28天之后，其不再能被检测到。该儿童对MSC具有非常好的耐受性，并且在施用之后30天未显示出病毒、细菌或真菌感染。
2010年03月25日出生的患者3
病症：急性淋巴母细胞性白血病；
在12年10月16日进行了来自HLA-不同的相关供体的SCT。在SCT之后已经第+14天，注意到肠中GvHD的最初迹象。启动利用Mofetilmycophenolat和类固醇的立即治疗。这导致症状的相对改善。然而，在SCT之后的第+35天，尽管长期的类固醇施用，仍保持肠GvHD II级。
因此，采取通过施用本发明的MSC巩固免疫抑制疗法的决定。在12年12月21日进行MSC施用而无并发症。在SCT施用之后30天未出现感染。在2013年1月15日，在患者中未观察到肠GvHD的迹象，并且仅剩下不需要任何治疗的轻微的皮肤GvHD。
1999年03月25日出生的患者4
病症：急性骨髓性白血病；
在12年09月19日进行来自HLA-不同的相关供体的SCT。
在干细胞移植之后5个月，患者出现史蒂文斯–约翰逊综合征的临床症状。由于在记录时，患者服用了若干种与该临床表现的发展相关的药物，所以停用各个药物(伏立康唑、青霉素、复方新诺明(co-trimoxazole))。由于检测到腺病毒感染，所以决定不再用糖皮质激素进行免疫抑制疗法。患者也出现典型的GvHD皮肤损害，其可能受到史蒂文斯–约翰逊综合征的刺激。因此，启动利用CSA的免疫抑制疗法。为了抑制炎症性事件，施用了本发明的MSC。该MSC施用为良好耐受的。另外，一天施用含有糖皮质激素的霜剂若干次。在该疗法下，GvHD皮肤损害几乎完全治愈。

Claims (14)

1.分离间充质基质细胞(MSC)的体外方法，所述方法包括：合并从至少两名遗传上不同的供体获得的骨髓样品以获得样品细胞-合并物，然后从所述样品细胞-合并物分离间充质基质细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其包括以下步骤：
(a)提供从至少两名遗传上不同的供体获得的多个骨髓样品，
(b)合并所述骨髓样品以获得样品细胞-合并物，
(c)任选地，培养所述样品细胞-合并物，以及
(d)从步骤(b)中获得的所述样品细胞-合并物分离所述间充质基质细胞。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述骨髓样品是哺乳动物骨髓样品，并且所述间充质基质细胞是哺乳动物间充质基质细胞；优选地，其中所述骨髓样品是人骨髓样品，并且所述间充质基质细胞是人间充质基质细胞。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述骨髓样品是骨髓单核细胞样品。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述骨髓样品从至少三名、更优选至少四名、更优选至少五名、更优选至少六名、更优选至少七名且最优选至少八名遗传上不同的供体获得。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其还包括保存所述分离的间充质基质细胞或者扩增所述分离的间充质基质细胞的步骤。
7.间充质基质细胞(MSC)制备物，其包含分离自骨髓单核细胞(BM-MNC)的MSC，特征在于，所述MSC制备物是hTERT阴性的且多基因的。
8.如权利要求7所述的MSC制备物，其中所述MSC制备物包含
(a)至少95％的CD73+细胞，1
和/或
(b)至少95％的CD90+细胞，1
和/或
(c)至少95％的CD105+细胞，1
和/或
(d)至少95％的HLA-I类+细胞，1
和/或
(e)小于1％的CD45+细胞，
和/或
(f)小于1％的CD14+细胞，
和/或
(g)小于1％的CD34+细胞，
和/或
(h)小于5％的HLA-DR+细胞。
9.如权利要求8所述的MSC制备物，其包含(a)、(b)和(c)，和/或(e)、(f)和(g)。
10.如权利要求7至9中任一项所述的MSC制备物，其可通过权利要求1至6中任一项所述的方法获得。
11.细胞组合物，其包含来自至少两名遗传上不同的骨髓供体的骨髓样品，可通过在分离和/或扩增包含于所述骨髓样品中的基质细胞部分之前合并至少两个单基因的且遗传上不同的骨髓样品获得。
12.从至少两名遗传上不同的骨髓供体获得的骨髓单核细胞的混合物或权利要求11所述的细胞组合物在分离间充质基质细胞的方法中的用途。
13.如权利要求7至10中任一项所述的MSC制备物，其用于医学。
14.如权利要求7至10中任一项所述的MSC制备物，或者如权利要求11所述的细胞组合物，其用于治疗自身免疫性疾病，如多发性硬化、1型糖尿病、类风湿性关节炎、葡萄膜炎、自身免疫性甲状腺病、炎性肠病(IBD)、硬皮病、格雷夫斯氏病、狼疮、克罗恩病、自身免疫性淋巴细胞增生病(ALPS)、神经脱髓鞘病、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性胃炎(AIG)、自身免疫性肾小球病、以及优选地移植物抗宿主病(GvHD)。
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