ES2817848T3

ES2817848T3 - Generación de un banco de células estromales mesenquimales a partir de células mononucleares agrupadas demúltiples donantes de médula ósea

Info

Publication number: ES2817848T3
Application number: ES15736516T
Authority: ES
Inventors: Peter Bader; Selim Kuci; Zyrafete Kuci; Halvard Bönig
Original assignee: Goethe Universitaet Frankfurt am Main; DRK Blutspendedienst Baden Wuerttermberg Hessen gGmbH
Current assignee: Goethe Universitaet Frankfurt am Main; DRK Blutspendedienst Baden Wuerttermberg Hessen gGmbH
Priority date: 2014-07-16
Filing date: 2015-07-14
Publication date: 2021-04-08
Anticipated expiration: 2035-07-14
Also published as: MX2017000704A; EP3736328A1; DK3169772T3; EP3169772A1; EP2975118B1; WO2016008895A1; PT3169772T; RS60863B1; LT3169772T; EA201790025A1; CY1123343T1; AU2015289218A1; BR112017000690B1; CN106536719A; SA517380722B1; KR102408357B1; IL249916B; UA122562C2; EP2975118A1; CN106536719B

Abstract

Un metodo in vitro para la produccion de una preparacion de celulas estromales mesenquimales (MSC), el metodo comprende: agrupar muestras de medula osea obtenidas de al menos dos donantes geneticamente distintos para obtener una muestra de celulas agrupadas y luego aislar las celulas estromales mesenquimales a partir de dicha muestra de celulas agrupadas.

Description

DESCRIPCIÓN

Generación de un banco de células estromales mesenquimales a partir de células mononucleares agrupadas de múltiples donantes de médula ósea

La presente invención se refiere a un método para la producción de una preparación mejorada de células estromales mesenquimales (MSC) de acuerdo con el conjunto de reivindicaciones adjuntas. La invención proporciona una nueva estrategia para aislar MSC a partir de células mononucleares de médula ósea (BM-MNC) al agrupar las BM-MNC de múltiples donantes de médula ósea no emparentados (de terceros). La preparación de MSC fabricada de acuerdo con la metodología de la invención se caracteriza por una capacidad proliferativa estable y un potencial inmunosupresor aumentado en comparación con las preparaciones de MSC de donantes individuales o con un grupo de MSC individuales generadas de múltiples donantes. Las MSC preparadas de acuerdo con la invención son particularmente útiles para las aplicaciones médicas tales como el tratamiento de la enfermedad de injerto contra huésped (GvHD) en receptores con trasplantes de células madre hematopoyéticas, pacientes con trastornos autoinmunitarios y como terapia basada en células en la medicina regenerativa.

Descripción

Las células estromales mesenquimales (MSC) desde su descubrimiento en la década de 1970 por Friedenstein y otros se han investigado ampliamente en relación con su potencial inmunomodulador y regenerativo tanto in vitro como in vivo. En la última década, se ha logrado un progreso considerable en el esclarecimiento de la función pleiotrópica de las MSC a pesar de la falta de un marcador único de superficie celular para su identificación y posible aislamiento. Con el fin de permitir una comparación del efecto de las MSC utilizadas clínicamente de fabricantes diferentes, la Sociedad Internacional para la Terapia Celular propuso un conjunto de criterios fenotípicos y funcionales para definir a las MSC. La ausencia de moléculas antigénicas de clase II del HLA y de moléculas coestimuladoras en la superficie de las MSC, la secreción paracrina de una amplia gama de moléculas con potencial inmunomodulador, así como la facilidad de su posible aislamiento de muchos tejidos, las convierte en una fuente muy atractiva para las estrategias terapéuticas basadas en células en una amplia gama de condiciones clínicas tales como las lesiones tisulares, los procesos inflamatorios y los trastornos autoinmunitarios. Sin embargo, para todas estas aplicaciones clínicas, es necesario disponer en el momento adecuado de un gran número de MSC listas para usar.

Hasta la fecha, la mayor parte de la investigación clínica se ha realizado con el uso de células estromales mesenquimales (MSC) generadas de un solo donante de médula ósea. Como los efectos de las preparaciones de MSC varían notablemente de un donante a otro, los resultados obtenidos de estos estudios fueron en gran medida muy heterogéneos. Además, los inventores y otros han demostrado que las MSC exhiben no solo una gran heterogeneidad de donante a donante, sino también dentro de la población a nivel individual.

Esta notable heterogeneidad plantea el obstáculo principal en el desarrollo de protocolos de fabricación clínica, que podrían utilizarse para generar de forma reproducible productos a base de MSC con una potencia terapéutica equivalente.

Un proceso de aislamiento para las células estromales mesenquimales humanas a partir de muestras de médula ósea se describe en el documento US 5,486,359. Se desarrolló un anticuerpo que se une a las células estromales mesenquimales con el fin de purificar las MSC de aspirados de médula ósea o de material óseo molido. Las muestras de médula ósea se separan mediante un gradiente de Ficoll y la fracción de baja densidad se utiliza para el aislamiento de células madre. En el documento US 5,486,359 las células se cultivaron en medio normal durante 1 día sobre plástico de cultivo de tejidos para permitir que las células madre se adhirieran. Posteriormente, el medio se cambia y las células se cultivan hasta confluencia con cambios de medio cada 4 días para obtener las MSC.

El documento WO 2012/048093 describe el aislamiento de las MSC derivadas de médula ósea a partir de donantes únicos. El documento WO 2012/048093 enseña que las preparaciones de MSC derivadas de un solo donante pueden expandirse a preparaciones a escala clínica.

Se sabe que el agrupamiento de las preparaciones de MSC después de su generación a partir de fracciones individuales de células mononucleares de médula ósea de donantes de médula ósea no emparentados o de muestras de hueso es posible para el tratamiento de hemorragias potencialmente mortales en un paciente con mielofibrosis que se sometió a un trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas (O Ringdén y K LeBlanc, Bone Marrow Transplantation, 2011; 46:1158-1160). En este estudio, las preparaciones de MSC de grado clínico derivadas de dos donantes diferentes por separado se agruparon para aumentar la probabilidad de la respuesta.

El documento WO 2011/064733 A1 describe un método para el aislamiento de las células madre mesenquimales, agrupamiento de las células madre mesenquimales aisladas y purificadas y además el cultivo de las células madre mesenquimales.

En vista del estado de la técnica descrita anteriormente, existe una necesidad continua en la clínica de preparar preparaciones de MSC de grado clínico con un potencial predecible de proliferación e inmunosupresión y una mínima variabilidad de lote a lote. Por lo tanto, el problema que la presente invención busca resolver es proporcionar un proceso para la producción/aislamiento de las MSC de muestras de médula ósea con características mejoradas.

El término "monogénico" cuando se usa en contexto para describir una muestra o composición de células se refiere a estas células que se originan de una fuente común o que tienen el mismo trasfondo genético. El término "poligénico", por otro lado, se refiere a una composición de células que se originan de fuentes diferentes y tienen trasfondos genéticos diferentes. En el contexto de la presente invención, una "preparación de MSC poligénica" es una composición que comprende MSC que tienen trasfondos genéticos distintos, por ejemplo, las MSC que se originan a partir de al menos dos donantes de médula ósea genéticamente distintos.

En el contexto de la invención descrita en el presente documento, los términos "células estromales mesenquimales" y "células madre mesenquimales" se entenderán como descripciones sinónimas de la misma fracción de células multipotentes aislada de muestras de médula ósea.

Con el fin de minimizar la variabilidad entre donantes así como su potencial alosupresor, los inventores desarrollaron una técnica única de tres etapas para el establecimiento de un Banco de Células Maestras de MSC libre de suero y que cumple con las GMP a partir de las células mononucleares de médula ósea agrupadas (BM-MNC) de 8 donantes sanos de terceros: (i) aislamiento del poligénico mixto y criopreservación de las BM-MNC individuales de 8 donantes sanos de terceros en total acuerdo con la aprobación emitida por el Comité de Ética local y la Declaración de Helsinki, (ii) generación de las MSC de las BM-MNC agrupadas después de descongelamiento y criopreservación en viales y (iii) descongelamiento de las muestras de MSC para su expansión libre de suero y generación de dosis a escala clínica listas para usar. De esta manera, los inventores desarrollaron un protocolo sorprendentemente eficaz para la generación de las preparaciones de MSC de grado clínico con un potencial alosupresor constantemente mayor y una capacidad proliferativa constante, en comparación con las MSC generadas de donantes individuales de médula ósea. Por lo tanto, este protocolo proporciona a los investigadores clínicos MSC de grado clínico de una calidad constante para el tratamiento de la enfermedad de injerto contra huésped y de otros trastornos inflamatorios. A pesar de los considerables costos iniciales, este protocolo garantiza la consistencia, la reproducibilidad y la confiabilidad en el desempeño inmunosupresor de las MSC de grado clínico.

El problema de la presente invención se resuelve mediante un método in vitro para la producción de una preparación de células estromales mesenquimales (MSC), el método comprende: agrupar las muestras de médula ósea obtenidas de al menos dos donantes genéticamente distintos para obtener una muestra de células agrupadas, y posteriormente aislar las células estromales mesenquimales de dicha muestra de células agrupadas.

El proceso para la preparación de MSC de las muestras de médula ósea de acuerdo con la presente invención implica una etapa de agrupamiento de la médula ósea, o de una fracción de células mononucleares derivada de la médula ósea, de donantes genéticamente distintos. Por lo tanto, al menos dos muestras de médula ósea genéticamente distintas, o fracciones de BM-MNC genéticamente distintas, se agrupan en el método de la presente invención. Es importante destacar que el método de la invención comprende el agrupamiento de las muestras de BM genéticamente distintas en una etapa en la que las muestras de BM contienen todavía una mezcla de diferentes tipos celulares. Por lo tanto, preferentemente el agrupamiento de las muestras de BM-MNC genéticamente distintas se realiza antes de que se purifique o expanda la fracción de MSC de dichas muestras. El agrupamiento de las células antes del aislamiento de MSC dio lugar a preparaciones de MSC con un potencial alosupresor sorprendentemente mejorado.

En una modalidad, el método de acuerdo con la invención comprende las etapas de:

(a) Proporcionar una cantidad de muestras de médula ósea obtenidas de al menos dos donantes genéticamente distintos,

(b) Agrupar dichas muestras de médula ósea para obtener una muestra de células agrupadas,

(c) Opcionalmente, cultivar dicha muestra de células agrupadas y

(d) Aislar de dicha muestra de células agrupadas obtenida en la etapa (b) dichas células estromales mesenquimales.

En una modalidad preferida, el método comprende las etapas de: proporcionar una cantidad de muestras de médula ósea obtenidas de al menos dos donantes genéticamente distintos, aislar la fracción de células mononucleares de muestras de médula ósea, agrupar dichas muestras de células mononucleares de médula ósea para obtener una agrupación de BM-MNC, opcionalmente, cultivar dicha agrupación de BM-MNC, y aislar de dicha agrupación de BM-MNC dichas células estromales mesenquimales. Por supuesto, todas las variaciones especiales adicionales del método de la invención como se describió anteriormente y debajo en el presente documento son modalidades igualmente preferidas de esta metodología que incluye una etapa de aislamiento de las BM-MNC de muestras de médula ósea.

El término "muestra de células agrupadas" en el contexto de la invención se referirá a una mezcla de células derivadas de la médula ósea con diferentes trasfondos genéticos. Por lo tanto, la muestra de células agrupadas de la invención es poligénica. Con mayor preferencia, una muestra de células agrupadas de acuerdo con la invención se caracteriza porque las MSC están presentes solo en un porcentaje minoritario preferentemente menor del 80 %, preferentemente 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 % y con la máxima preferencia menos del 10 %, incluso con mayor preferencia menos del 5 %, menos del 1 %, con la máxima preferencia menos del 0,1 %.

El término "genéticamente distinto" como se usa en el presente documento, indica que existe al menos una diferencia a nivel genómico entre los donantes/sujetos de médula ósea. La médula ósea se puede recolectar de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más donantes. Lo más preferido es el uso de 4 a 8 muestras de donantes diferentes.

Una "muestra de médula ósea" de acuerdo con la presente invención puede ser un aspirado de médula ósea o trozos de hueso, tales como los trozos de huesos esponjosos. En una modalidad preferida, una muestra de médula ósea es un aspirado de médula ósea. El experto en la técnica conoce cómo recoger una muestra de médula ósea. Dichas muestras de médula ósea de la invención en una modalidad preferida comprenden una mezcla de diferentes tipos celulares. Por ejemplo, cada una de dichas muestras de médula ósea comprende al menos una fracción de células no adherentes y al menos una fracción de células adherentes. En una modalidad preferida particular, dicha muestra de médula ósea es una muestra o fracción de células mononucleares de médula ósea (BM-MNC). Las BM-MNC se obtienen de la médula ósea.

En el contexto de la presente invención, una "fracción de células mononucleares de médula ósea" (también denominada en el presente documento como "BM-MNC"), contiene linfocitos B, T y NK, células mieloides tempranas y un número muy bajo de progenitores endoteliales, progenitor/madre hematopoyético(a) y/o células estromales mesenquimales.

En una modalidad preferida de la invención, dicha muestra de médula ósea es una muestra de médula ósea de mamífero y dicha célula estromal mesenquimal es una célula estromal mesenquimal de mamífero. Se prefiere más que dicha muestra de médula ósea sea una muestra de médula ósea humana y dicha célula estromal mesenquimal sea una célula estromal mesenquimal humana.

Además, otra modalidad de la invención se refiere al proceso descrito anteriormente para el aislamiento de MSC, el método comprende además una etapa (a') de extracción de las células mononucleares de médula ósea (BM-MNC) de cada una de dichas muestras de médula ósea para obtener muestras de BM-MNC, y en donde en la etapa (b), dichas muestras de BM-MNC se agrupan para obtener dicha muestra de células agrupadas. Como se mencionó anteriormente, la fracción/muestra de BM-MNC solo contiene una pequeña cantidad de MSC. Por lo tanto, en una modalidad preferida de la invención, dichas muestras de BM-MNC a agrupar comprenden un porcentaje de células estromales mesenquimales por células totales en dicha muestra de menos del 80 %, preferentemente 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 % y con la máxima preferencia menos del 10 %, incluso con mayor preferencia menos del 5 %, menos del 1 %, con la máxima preferencia menos del 0,1 %.

En el contexto de la invención descrita en el presente documento, en todas sus modalidades y aspectos, se prefiere particularmente que dichas muestras de médula ósea (o muestras de BM-MNC) se obtengan de al menos tres, con mayor preferencia de al menos cuatro, con mayor preferencia de al menos cinco, con mayor preferencia de al menos seis, con mayor preferencia de al menos siete y con la máxima preferencia de al menos ocho donantes genéticamente distintos. En otras palabras, la preparación de células MSC y el método para su producción en una modalidad particularmente preferida comprende el agrupamiento de al menos tres, con mayor preferencia de al menos cuatro, con mayor preferencia de al menos cinco, con mayor preferencia de al menos seis, con mayor preferencia de al menos siete, y con la máxima preferencia de al menos ocho muestras celulares distintas genéticamente.

Los métodos para el aislamiento de las BM-MNC de una muestra de médula ósea, en particular de aspirado de médula ósea, son bien conocidos por el experto en la técnica. Sin embargo, en una modalidad de la presente invención, se prefiere que las BM-MNC se aíslen de una muestra de médula ósea con el uso de una separación por densidad celular tal como el gradiente de Ficoll.

Una vez agrupadas, la muestra de células agrupadas obtenida de la invención se usa para aislar y purificar las MSC. Los métodos para el aislamiento de las MSC a partir de muestras de médula ósea o de las BM-MNC también son bien conocidos en la técnica. Un método preferido de la invención es la separación de las células adherentes de las no adherentes simplemente por eliminación de las células flotantes al aspirar el medio de cultivo celular del recipiente de cultivo a intervalos regulares. Al cambiar el medio varias veces, la fracción de las células no adherentes se reduce constantemente, mientras que la fracción de MSC adherente continúa creciendo hasta la confluencia. Estas células adherentes son las MSC.

De este modo, se prefiere una modalidad en la que la etapa (d) del método de la invención comprenda una etapa de eliminar al menos una vez las células no adherentes de un cultivo de dicha muestra de células agrupadas; o en donde después de cultivar dicha muestra de células agrupadas, se use al menos un marcador de superficie o anticuerpo detectable para la purificación de dichas MSC.

Además, el método de la invención puede proporcionar una etapa adicional de almacenamiento de dichas células estromales mesenquimales aisladas o de expansión de dichas células estromales mesenquimales aisladas.

En un aspecto adicional, la invención incluye un método in vitro para la producción de las preparaciones de MSC de grado clínico. Este método incluye las etapas del método antes mencionadas para aislar las MSC, pero además incluye la expansión de las MSC aisladas hasta recibir una cantidad de MSC aplicable en la clínica. La expansión de las m Sc de la invención puede seguir inmediatamente después del aislamiento de las MSC o alternativamente, las MSC aisladas se almacenaron mediante criopreservación, al descongelar una alícuota de células para iniciar el proceso de expansión. Se conoce en la técnica cómo se expanden las MSC y se explica como un ejemplo en la sección de ejemplos de la presente solicitud.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición celular que comprende muestras de médula ósea de al menos dos donantes de médula ósea genéticamente distintos, en donde cada una de dichas muestras de médula ósea comprende al menos una fracción de células no adherentes y al menos una fracción de células adherentes. Por lo tanto, la composición celular de la invención es preferentemente poligénica.

La composición celular de la invención se puede obtener al agrupar al menos dos muestras de médula ósea genéticamente distintas y monogénicas antes de aislar y/o expandir una fracción de células madre contenida en dichas muestras de médula ósea. Por lo tanto, mediante el agrupamiento, la composición celular se vuelve poligénica.

En una modalidad preferida, dichas muestras de médula ósea son muestras de células mononucleares de médula ósea.

También se describe una composición celular de la invención, que se puede obtener mediante un método que comprende las etapas

(a) Obtención de al menos dos muestras de médula ósea, cada una de ellas de un donante de médula ósea genéticamente distinto,

(b) Aislamiento de cada una de dichas muestras de médula ósea de la fracción de células mononucleares de médula ósea para obtener muestras de células mononucleares monogénicas de médula ósea y

(c) Agrupamiento de dichas muestras de células mononucleares monogénicas de médula ósea obtenidas de cada muestra de médula ósea para obtener la composición celular poligénica.

Se entiende que, en el contexto de la presente descripción, una "fracción de células mononucleares de médula ósea" comprende la composición celular común que se conoce para esta fracción de células derivada de la médula ósea. A este respecto, se prefiere que dichas muestras de células mononucleares monogénicas se agrupen antes de realizar una etapa adicional de purificación o expansión celular, preferentemente antes de aislar o purificar cualquier MSC de las mismas.

Las preparaciones de MSC o las MSC descritas en el presente documento son preferentemente para utilizar en la medicina. Las MSC se utilizan generalmente en una amplia variedad de aplicaciones médicas. Sin pretender limitarse a los siguientes ejemplos, las MSC de la invención son preferentemente para utilizar en el tratamiento de las enfermedades autoinmunitarias tales como la esclerosis múltiple, la diabetes Tipo 1, la artritis reumatoide, la uveítis, la enfermedad tiroidea autoinmunitaria, la enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), la esclerodermia, la enfermedad de Graves, el lupus, la enfermedad de Crohn, la enfermedad linfoproliferativa autoinmunitaria (ALPS), la enfermedad desmielinizante, la encefalomielitis autoinmunitaria, la gastritis autoinmunitaria (AIG) y las enfermedades glomerulares autoinmunitarias. En particular, la preparación de MSC de la invención se usa en el tratamiento de la enfermedad de injerto contra huésped (GvHD).

Sin embargo, en el contexto de la invención descrita en este documento, las preparaciones de las MSC son útiles en cualquier enfermedad autoinmunitaria o regenerativa, preferentemente transitoria, recidivante o remitente. Otras aplicaciones clínicas de las preparaciones de las MSC de la invención se encuentran en la cicatrización de las heridas, úlcera corneal, accidente cerebrovascular o para facilitar el injerto en el trasplante alogénico de células madre.

Una terapia celular que implica la administración de MSC se basa, por ejemplo, en las siguientes etapas: recolectar el tejido que contiene MSC (médula ósea), aislar y expandir las MSC de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento, y administrar las MSC al sujeto/paciente, con o sin manipulación bioquímica o genética.

Una dosis terapéutica para una enfermedad autoinmunitaria o para la enfermedad de injerto contra huésped puede contener aproximadamente de 1 x 105 células/kg a aproximadamente 1 x 107 células/kg. En otra modalidad, una dosis terapéutica es de aproximadamente 1 x 106 células/kg a aproximadamente 5 x 106 células/kg. En otra modalidad, una dosis terapéutica es de aproximadamente 2 x 106 células/kg a aproximadamente 8 x 106 células/kg. En otra modalidad, una dosis terapéutica es de aproximadamente 2 x 106 células/kg o aproximadamente de 2 x 106 ± aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 20 % o aproximadamente el 30 % de células/kg. En otra modalidad, una dosis terapéutica es de aproximadamente 8 x 106 células/kg o aproximadamente de 8 x 106 ± aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 20 % o aproximadamente el 30 % de células/kg e incluyen cualquier cantidad o rango entre los mismos. Dada una preparación de MSC obtenida con el método de la presente invención, el número de las células estromales mesenquimales que se administrarán depende de una variedad de factores, que incluyen la edad, el peso y el sexo del paciente, la enfermedad que se va a tratar y la extensión y gravedad de la misma.

Las MSC obtenidas con el método de la invención pueden administrarse mediante una variedad de procedimientos. Las MSC se pueden administrar sistémicamente, tales como mediante administración intravenosa, intraarterial o intraperitoneal. Las células estromales mesenquimales se pueden administrar mediante inyección directa a un órgano o tejido que lo necesite. Las células estromales mesenquimales se pueden aplicar tópicamente. Las células estromales mesenquimales se pueden aplicar directamente a un tejido que lo necesite durante un procedimiento quirúrgico.

Las células estromales mesenquimales, obtenidas de acuerdo con la presente invención, se pueden emplear en el tratamiento, alivio o prevención de cualquier enfermedad o trastorno que se pueda aliviar, tratar o prevenir mediante angiogénesis. De este modo, por ejemplo, las células estromales mesenquimales se pueden administrar a un animal para tratar arterias bloqueadas, incluidas las de las extremidades, es decir, brazos, piernas, manos y pies, así como el cuello o en varios órganos. Por ejemplo, las células estromales mesenquimales se pueden usar para tratar arterias bloqueadas que irrigan al cerebro, para tratar o prevenir así un accidente cerebrovascular. Además, las células estromales mesenquimales pueden usarse para tratar vasos sanguíneos en córneas embrionarias y posnatales y pueden usarse para proporcionar estructuración glomerular. En otra modalidad, las células estromales mesenquimales se pueden emplear en el tratamiento de las heridas, tanto internas como externas, así como en el tratamiento de las úlceras dérmicas que se encuentran en los pies, manos, piernas o brazos, que incluyen, pero no se limitan a, las úlceras dérmicas causadas por enfermedades como la diabetes y la anemia de células falciformes.

Además, debido a que la angiogénesis está implicada en la implantación del embrión y en la formación de la placenta, las células estromales mesenquimales se pueden emplear para promover la implantación del embrión y prevenir el aborto espontáneo.

Además, las células estromales mesenquimales se pueden administrar a un sujeto nonato, incluidos los seres humanos, para promover el desarrollo de la vasculatura en el sujeto nonato.

En otra modalidad, las células estromales mesenquimales se pueden administrar a un sujeto, nacido o nonato, con el fin de promover la resorción del cartílago y la formación de hueso, así como promover la correcta morfogénesis de la placa de crecimiento.

Las células estromales mesenquimales pueden modificarse mediante ingeniería genética con uno o más polinucleótidos que codifican a un agente terapéutico. Los polinucleótidos pueden administrarse a las células estromales mesenquimales mediante un vehículo de expresión apropiado. Los vehículos de expresión que pueden emplearse para modificar genéticamente a las células estromales mesenquimales incluyen, pero no se limitan a, vectores retrovirales, vectores adenovirales y vectores de virus adenoasociados. Las MSC de la invención pueden, por ejemplo, modificarse mediante ingeniería genética para sobreexpresar TERT y así inmortalizar las células.

Además, la preparación de MSC de la invención o la célula estromal mesenquimal puede usarse en el trasplante de células madre.

Se describe además un uso de la preparación de MSC o las MSC de la invención en la producción de material de reemplazo óseo.

En otra modalidad, las MSC producidas con los métodos de la invención pueden diferenciarse en osteoblastos, adipocitos y/o condrocitos en condiciones de cultivo apropiadas, tales como las respectivas condiciones inductoras de la diferenciación celular, por ejemplo, cultivadas con el medio inductor apropiado, tales como el medio de inducción osteogénico, adipogénico y condrogénico, respectivamente. En una modalidad, las condiciones de cultivo apropiadas y los medios inductores apropiados son los especificados en los Ejemplos. En otra modalidad, se describen los ejemplos de las condiciones y de los medios adecuados en Aubin J E. Osteoprogenitor cell frequency in rat bone marrow stromal populations: role for heterotypic cell-cell interactions in osteoblast differentiation. J Cell Biochem. (1999) 72(3):396-410 (para osteogénesis); Falconi D, Oizumi K, Aubin J E. Leukemia inhibitory factor influences the fate choice of mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. (2007) 25(2):305-312 (para adipogénesis); y Zhang S, Uchida S, Inoue T, Chan M, Mockler E, Aubin J E. Side population (SP) cells isolated from fetal rat calvaria are enriched for bone, cartilage, adipose tissue and neural progenitors. Bone. (2006) 38(5):662-670 (para condrogénesis).

La presente invención ahora se describirá aún más en los siguientes ejemplos con referencia a las figuras y secuencias adjuntas, sin embargo, sin limitarse a las mismas. En las Figuras:

Figura 1: Recolección de médula ósea y separación de las células mononucleares de médula ósea. A) Se recolectaron las médulas óseas de 8 donantes sanos de terceros en anestesia general mediante aspiración bilateral de la cresta ilíaca. B) Se recolectaron las muestras de médula ósea en bolsas y se añadió como anticoagulante 7-12 % de ACD-A y 7-12 UI de heparina por ml de aspirado de médula. C) Se enriquecieron las células mononucleares de médula ósea de aspirado de médula ósea mediante centrifugación en densidad de Ficoll (GE Healthcare, Munich, Alemania) con el uso del proceso Sepax II NeatCell (Biosafe, Suiza). D) Las BM-MNC se lavaron dos veces y se resuspendieron en el criomedio que consiste en DMSO al 10 %/ HSA al 5 %/X-vivo. E) Las bolsas que contienen a las BM-MNC de cada donante de médula ósea en criomedio se congelaron en la fase de vapor del nitrógeno líquido hasta su uso.

Figura 2: Generación del banco de MSC a partir de células mononucleares de médula ósea. A) Las bolsas que contienen a las células mononucleares de médula ósea de cada donante se descongelaron a 37 °C y después de lavarse dos veces con medio se agruparon en un volumen definido de DMEM suplementado con lisado de plaquetas al 5 %. Todas las células se sembraron en una placa 1-CellStack y once placas 2-CellStack B) Después de 72 horas, se eliminó la fracción no adherente y las células adherentes se cultivaron adicionalmente en DMEM suplementado con lisado de plaquetas al 5 % durante otros 11 días cambiando el medio cada tres días. Una vez que las MSC aparecieron y crecieron hasta una confluencia del 80 %, las MSC se separaron con el uso de tripsina (TrypLE) y después de lavarlas con medio los sedimentos celulares se resuspendieron en criomedio que consiste en Dm s O al 10 %/HSA al 5 %/DMEM. C) Las MSC se congelaron en 210 crioviales, cada uno de los cuales contiene 1,5 x 106 MSC del pase P1. Los inventores designaron este conjunto de viales con MSC como un banco de MSC.

Figura 3: Generación de productos finales clínicos de MSC A) Se descongelaron tres viales criopreservados elegidos al azar con MSC después de 6-8 semanas de su criopreservación inicial B) Se sembraron en una placa 1-CellStack (636 cm2) y se cultivaron durante 6-7 días en DMEM que contiene 10 % de lisado de plaquetas. El medio se cambió cada tres días. C) Al día 6 o 7 (de acuerdo con su crecimiento confluente), las MSC (el final del PI) se separaron con tripsina, se lavaron y se sembraron en ocho placas 2-CellStacks a una concentración celular de 2 x 103 MSC/1 cm2 y se expandieron durante otra semana. El medio se cambió cada 3-4 días y al final de la semana (el final del p2) las MSC se separaron con tripsina, se lavaron dos veces y se contó el número de células. Estas MSC se criopreservaron y se designaron como producto clínico MSC, que después de 2-3 semanas se sometieron a validación en cuanto a su potencial proliferativo, de diferenciación y alosupresor.

Figura 4: Fenotipo de las MSC y su potencial de diferenciación. A) Las MSC generadas por la expansión de las alícuotas del banco de MSC al final del pase 2 se marcaron con los anticuerpos antihumanos de ratón conjugados con los fluorocromos como se presenta en la tabla 1. B) El cultivo de las MSC en los medios de cultivo específicos de tejido indujo su diferenciación en adipocitos y osteoblastos.

Figura 5: Cinética de crecimiento de las MSC de donantes individuales y los productos finales de las MSC. A) El número inicial de 4,4 x 104 MSC de cada donante de médula ósea se expandió para un pase (desde el comienzo hasta el final del P2). Al mismo tiempo, las MSC de los 8 donantes se agruparon y expandieron desde el inicio hasta el final del P2 (MSC-Pool), así como 4 alícuotas del banco de m Sc . Al final del pase 2, se tripsinizaron las MSC y se calculó su número; ns = no significativo B) Diez crioviales de MSC del banco de MSC se descongelaron y expandieron durante dos pases para evaluar su potencial de proliferación. El número promedio de células de todos los viales expandidos al final del pase 2 fue 5,3 x 108 ± 5 x 107 MSC. C) Las MSC mostraron aproximadamente 4 duplicaciones de la población (PD) por pase, por lo que el número acumulado de PD (CPD) fue de 8,7 ± 0,4 PD. D) Para demostrar que los productos finales de las MSC no son células inmortales, los inventores evaluaron su cinética de crecimiento durante 12 pases y estimaron el número de PD. Como se muestra en la figura del pase 9-12, estas MSC no pudieron ni siquiera duplicarse (n=3).

Figura 6: Potencial alosupresor de las MSC generadas de los donantes individuales y de los productos finales de las MSC. A) Se expandieron hasta el final del pase 2 a las MSC de pase 0 de 8 donantes individuales, así como la agrupación de MSC que se generó al agrupar las MSC de 8 donantes antes de la expansión (MSC-Pool) y un producto final de MSC (MSC-140). Posteriormente, las MSC se tripsinizaron, se lavaron dos veces en el medio y después de la determinación de los recuentos celulares y la viabilidad con azul de tripano, se utilizaron para estimar su potencial alosupresor en el ensayo MLR. Al día 6 se ofreció BrdU a las células y al día siguiente se realizó el ensayo para evaluar la inhibición de la proliferación de las células mononucleares sanguíneas alogénicas de dos donantes con HLA distintos. B) Se descongelaron seis productos finales de las MSC (dosis clínicas) y después de lavar las células, se usaron directamente para el ensayo MLR. El objetivo de estos experimentos fue averiguar si los productos finales de las MSC descongelados, tal como se administran a los pacientes, pueden suprimir la proliferación inducida por los alógenos de las células mononucleares de dos donantes alogénicos de MNC.

Figura 7: Caracterización genética del producto final de la MSC a escala clínica A) Cariograma normal de los productos finales de las MSC de grado clínico al final del pase 2. B) Los núcleos en interfase después de la hibridación de dos colores del conjunto de sondas 5p15 (verde) y 5q35 (rojo) identificaron un patrón diploide normal para el cromosoma 5. C) Los núcleos en interfase después de la hibridación de tres colores de una sonda de ruptura MYC mostraron en casi todas las células dos señales de fusión normales. D) El número de las MSC con patrón diploide normal y aneuploide después de la hibridación de dos colores del conjunto de sondas 5p15 y 5q35. El número total de MSC analizadas fue 396. E) El número de las MSC con patrón diploide normal y aneuploide después de la hibridación de tres colores de una sonda de separación MYC para el cromosoma 8q24. El número total de las MSC analizadas fue 356.

Figura 8: Expresión de los genes transformantes y análisis quimérico de los productos finales de las MSC A) Análisis por r T-PCR de los genes implicados en la transformación celular en 3 productos finales de las MSC a escala clínica. El ARN total se aisló a partir de tres productos finales de las m Sc y las MSC de un donante (control). Después de la transcripción a ADNc, este se utilizó para cuantificar la expresión de p21, p53 y c-myc mediante PCR. B) Análisis por STR-PCR del producto final de MSC a escala clínica. A partir de las MSC del producto final de MSC de grado clínico, se aisló ADN, que luego se utilizó para evaluar las regiones STR específicas que se encuentran en el ADN nuclear. El genotipo de los ocho donantes estaba representado en el producto final de MSC generado a partir de MNC agrupadas.

Ejemplos

Materiales y Métodos

Recolección del material crudo

La médula ósea se aspiró con anestesia general mediante aspiración bilateral de la cresta ilíaca. A la médula se le añadió como anticoagulante 7-12 % de ACD-A y 7-12 UI de heparina por ml de aspirado de médula.

Ensayo de enfermedades infecciosas

El panel de marcadores de enfermedades infecciosas superó los requisitos mínimos de JACIE y la Ley de Células Madre Alemana. De este modo, como parte del estudio del donante, se buscó evidencia de seronegatividad para VIH1/2, anti-HBc, HBsAg, anti-HCV, anti-HTLV1/2 (IgM e IgG para todos), IgM anti-Hepatitis A, IgM anti-Toxoplasma, IgM anti-EBV, IgM anti-CMV y TPHA, así como negatividad por NAT para VIH, HAV, HBV, HCV y ParvoB 19; los ensayos de VIH1/2, anti-HBc, HBsAg, anti-HCV, CMV, TPHA y la NAT descrita se repitieron el día de la donación de médula. Todos los donantes cumplieron los criterios. Además, dado que el CMV es un virus que reside en las células, se buscó la negatividad al genoma del CMV en el sedimento de células de la médula ósea (Departamento de Virología, Universidad Goethe y Bioreliance, Glasgow, Reino Unido).

Instalación de procesamiento

Todos los procesos se realizaron bajo los criterios completos de GMP en la sala limpia (clase A en B) del Departamento de Terapéuticos Celulares/Procesamiento Celular (GMP) que forma parte del Servicio de Sangre de la Cruz Roja Alemana y está completamente integrado en el sistema de gestión de calidad del mismo, con permiso formal del gobierno estatal (licencia de fabricación según §20b/c (recolección y ensayo de BM) y §13 (generación y ensayo de MSC) Ley de Medicamentos de Alemania).

Procesamiento de médula ósea

Las células mononucleares de médula ósea se enriquecieron a partir de aspirado de médula ósea mediante centrifugación en densidad de Ficoll (GE Healthcare, Munich, Alemania) con el uso del proceso Sepax II NeatCell (Biosafe, Suiza) como describe el fabricante. Todas las conexiones se realizaron mediante soldadura de tubos estériles (TSCD, Terumo, Düsseldorf, Alemania), por lo que se utilizó un proceso completamente cerrado.

Recolección de concentrados de plaquetas y generación de lisados de plaquetas (PL)

Como material de partida para los lisados de plaquetas, se utilizaron plaquetas del grupo de la capa leucocitaria de uno a dos días de edad que contenían aproximadamente un 10 % de plasma en PASIII. Las plaquetas se autorizaron para uso clínico de acuerdo con las directrices alemanas para productos sanguíneos. Se agruparon hasta 4-6 concentrados de plaquetas para generar un lote de lisado de plaquetas. Las plaquetas se dividieron en alícuotas en un ambiente A en B en tubos Falcon estériles de 50 ml y se congelaron inmediatamente a -80 °C. Las alícuotas individuales se descongelaron después de al menos 24 horas y se centrifugaron durante 10 minutos a 3774 x g con freno (aceleración 8, freno 4). Los sobrenadantes (lisados de plaquetas) se recogieron y se sometieron a ensayo de liberación prolongada, incluida la ausencia de bacterias (BacTAlert, Biomerieux) y el potencial para promover la adherencia de las células progenitoras por MSC y la expansión de las MSC.

Ensayo de lisados de plaquetas

a) Potencial de los lisados de plaquetas para promover la adherencia de las células progenitoras a las MSC

Las células mononucleares de médula ósea (BM-MNC) se descongelaron a 37 °C, se lavaron dos veces con DMEM suplementado con PL al 5 % y después del último lavado, el sedimento celular se resuspendió en el DMEM suplementado con 5 UI de heparina/ml y PL al 5 % o 10 %. Las BM-MNC se sembraron a una densidad de 1,71 x 105/1 cm2 y se incubaron durante 72 horas a 37 °C con 5 % de CO²y humedad saturada. Se eliminó la fracción de células no adherentes, mientras que las células adherentes se cultivaron durante otros 11 días. El medio de cultivo se cambió cada 3-4 días. Una vez que las células fusiformes (MSC) confluyeron al 70-80 %, se separaron enzimáticamente mediante tripsina y se contó su número. Este procedimiento se realizó con ambos medios, es decir, DMEM complementado con PL al 5 % o PL al 10 %.

b) Capacidad del PL para expandir a las MSC

La especificación de los lisados de plaquetas se estableció como conforme a IDM a las normas establecidas en las directrices alemanas, ausencia de bacterias, expansión de una alícuota criopreservada de MSC al menos 2 veces en 7 días. Solo se utilizaron plaquetas que cumplían estos criterios para la generación de protocolos clínicos de MSC.

Generación de los productos finales de grado clínico y del banco de MSC

a) Generación del banco de MSC

Se descongelaron las bolsas que contenían las células mononucleares de médula ósea de cada donante en Plasmatherm a 37 °C. Se lavaron dos veces con DMEM suplementado con PL al 5 % mediante centrifugación durante 10 minutos a 400 g y se resuspendieron a un volumen definido de DMEM lisado de plaquetas al 5 %. Después de esta etapa, se agruparon las suspensiones de células de cada donante y se contó el número de células mediante un contador de células (Sysmex). Posteriormente, la agrupación de suspensión celular se sembró en once 2-CellSTACKs (por un 2-CellSTACK: 250 x 106 BM-MNC/260 ml de medio) y en 1 CellSTACK individual (por 1-Cell-STACK: 125 x106 Bm -MNC/130 ml de medio). Después de 72 h, se eliminaron las células no adherentes con el uso de bolsas de cambio de medio (Macopharma, Langen, Alemania) y las células adherentes se cultivaron durante otros 11 días con DMEM suplementado con PL al 5 % hasta que las MSC fueron confluentes en un 80-90 %. En este período, el medio se cambió cada 3-4 días. El día 14 antes de la separación de las MSC, de cada CellSTACK se tomaron 5 ml de medio de cultivo que se agrupó en una botella estéril para ensayar la esterilidad a bacterias aeróbicas y anaeróbicas y hongos. Posteriormente, las células se separaron con el uso de TrypLE sintética (Life Technologies, Darmstadt, Alemania) y después de lavarlas con DMEM PL al 5 %, las células se centrifugaron durante 7 minutos a 400 x g. Los sedimentos celulares se resuspendieron en un volumen definido de medio y las células se contaron con azul de tripano en un hemacitómetro. Los inventores obtuvieron en total 320 x 106 m Sc de pase 1. Se utilizaron dos millones de células para la determinación del fenotipo mediante la citometría de flujo. El resto de las MSC se centrifugaron durante 7 minutos a 400 x g.

Las células se resuspendieron en HSA al 5 %/DMEM, por lo que el número de MSC se ajustó a 3 x 106 células/ml. Se mezcló lentamente un volumen de la suspensión celular con un volumen de medio de congelación frío que contenía DMSO al 20 %/HSA al 5 %/DMEM. Por lo tanto, la concentración final de MSC fue de 1,5 x 106/ml de suspensión celular, mientras que la concentración final del criomedio fue de DMSO al 10 %/HSA al 5 %/DMEM. Las células se distribuyeron en 210 crioviales (cada uno con 1,5 x 106 MSC del pase 1) y luego se criopreservaron con el uso de un congelador de velocidad controlada Cryoserve (Schollkrippen, Alemania) de acuerdo con los protocolos establecidos. Los viales congelados se almacenaron en la fase de vapor del nitrógeno líquido (Tec-Lab, Idstein, Alemania). Además, el resto de las MSC se mezcló con medio de congelación y se ensayó su esterilidad (bacterias aeróbicas y anaeróbicas y hongos).

b) Generación de productos finales de las MSC a escala clínica

Para generar y validar los productos finales de las MSC a escala clínica, los viales del banco de MSC se descongelaron sucesivamente al azar de 6 a 8 semanas después de su criopreservación. Después de descongelar a 37 °C, las MSC se lavaron en medio de cultivo que contenía PL al 10 %, por lo que se evaluó la viabilidad del recuento celular con el uso de la tinción con azul de tripano en un hemacitómetro. Las células de un vial del banco de MSC se sembraron en una 1-CellStack (636 cm2) y se cultivaron con DMEM suplementado con heparina (5 UI /ml de medio) y PL al 10 % (V/V). El medio se cambió al día 4 y al día 6-7 las células se separaron con el uso de TrypLe y luego se sembraron adicionalmente en ocho 2-CellStacks (cada una de 1272 cm2) como pase dos a una densidad de 2 x 103 células/cm2. El procedimiento se repitió como para el pase 1 y al día 6-7 se cosecharon las MSC. Después de lavar con HSA al 0,5 %/NaCl al 0,9 %, se contaron las MSC viables mediante tinción con azul de tripano. Además, las MSC a escala clínica se resuspendieron en criomedio (NaCl al 0,9 % con HSA al 5 % y DMSO al 10 %) como las MSC finales del pase 2 y se distribuyeron en 4-7 bolsas criogénicas que contenían cada una de 4,2 a 5,5 x 107 MSC en un volumen de 45 ml de medio de congelación. Las muestras se criopreservaron con el uso de un congelador de velocidad controlada Cryoserve (Schollkrippen, Alemania) con el uso de los protocolos establecidos y se almacenaron en la fase de vapor del nitrógeno líquido (Tec-Lab, Idstein, Alemania).

Ensayos de control de calidad

Todos los ensayos se realizaron con productos finales de las MSC descongelados sin expansión, en un estado en el que se administran a los pacientes para la aplicación clínica.

a) Enumeración celular y viabilidad de las MSC descongeladas

La enumeración celular total se realizó con el uso de un hemacitómetro de cámara de Neubauer. La viabilidad de las MSC se evaluó mediante tinción con azul de tripano.

b) Caracterización fenotípica

El análisis por citometría de flujo se realizó con el uso de los criterios mínimos ISCT para las MSC. Para determinar el fenotipo de las MSC descongeladas, los inventores las tiñeron con los siguientes anticuerpos monoclonales antihumanos de ratón conjugados con fluorocromos como se presenta en la tabla 1.

Tabla 1 Anticuerpos utilizados para la determinación del fenotipo de las MSC

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d) Evaluación del potencial alosupresor de los productos finales de las MSC

Para probar el efecto inmunosupresor de los productos finales de las MSC sobre la reacción dirigida por los aloantígenos, los inventores utilizaron la reacción de linfocitos mixtos (MLR). Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PB-MNC) de donantes sanos no emparentados con el uso de un gradiente de Ficoll (densidad 1,077, Biochrom KG, Berlín, Alemania), se lavaron dos veces con PBS y se resuspendieron en RPMI-1640 con FBS al 10 % (Invitrogen). Las PB-MNC de 2 donantes no emparentados se cultivaron en placas negras de 96 pocillos durante seis días, ya sea solas (grupo de control) o mezcladas con productos finales de las MSC irradiados letalmente (30 Gy) de terceros en una proporción de MSC:PB-MNC de 1:1 (1 x 105 MSC: 1 x 105 PB-MNC). Los inventores evaluaron seis productos finales de las MSC directamente después de la descongelación, así como las MSC de los ocho donantes, cuyas BM-MNC se agruparon y sirvieron como fuente para la generación del banco maestro de MSC del inventor. Todas las MLR se realizaron por triplicado en una placa de 96 pocillos. Al día 6, las células se incubaron con 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) durante 24 h. Al día siguiente, se midieron las unidades relativas de luz (RLU/s) con un luminómetro 1420 Multilabel Counter Victor 3 (Perkin Elmer, Rodgau-Jügesheim, Alemania). Los niveles de proliferación de las PB-MNC se determinaron al día 7 con el uso de un ensayo de BrdU. El efecto inhibidor de los productos finales de las MSC sobre la proliferación de MNC alogénicas se calculó como un porcentaje con el uso de la siguiente fórmula: 100-[(proliferación de las PB-MNC alogénicas en presencia de MSC/proliferación de las PB-MNC sin MSC) x 100].

e) Determinación de la senescencia de los productos finales de las MSC in vitro

Para demostrar que los productos finales de las MSC no son células inmortales, los inventores evaluaron su cinética de crecimiento durante 12 pases. Para cada pase, el medio se cambió cada 3 a 4 días y se realizó la separación de las MSC mediante TrypLE de acuerdo con su potencial de proliferación. Para estimar con mayor precisión su cinética de crecimiento, los inventores calcularon el número de duplicaciones de la población (PD) con el uso de la siguiente fórmula:

PD para cada subcultivo: [log 10(NH)-log 10(NI)]/log 10(2); donde NH = número de células en la cosecha, NI = número de células del inóculo.

f) Potencial de diferenciación de los productos finales de las MSC

Para estudiar el potencial de diferenciación a lo largo de la adipogénesis y la osteogénesis, se descongelaron los productos finales de las MSC del pase 2 y se cultivaron directamente en los medios de inducción específicos de tejido de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotec GmbH).

Adipogénesis

Para generar adipocitos, el número de las MSC descongeladas se ajustó a 5 x 104 células/1 ml de medio NH AdipoDiff. Luego, se cultivaron 1,5 ml de dicha suspensión celular en placas de cultivo celular de 35 mm a 37 °C en una incubadora con 5 % de CO²y > 95 % de humedad. El medio se cambió cada tres días y después de 2-3 semanas comenzaron a aparecer grandes vacuolas. Al día 30, los adipocitos se redondearon y se llenaron con gotitas de lípidos, que los inventores tiñeron con Oil Red O (Millipore, Schwalbach, Alemania), un tinte rojo lipófilo.

Osteogénesis

Brevemente, la concentración de las MSC descongeladas se ajustó a 3 x 104 células/1 ml de medio NH OsteoDiff. Luego, se cultivaron 1,5 ml de dicha suspensión celular en placas de cultivo celular de 35 mm a 37 °C en una incubadora con 5 % de CO²y > 95 % de humedad. El medio se cambió cada tres días. Al día 10, los osteoblastos pueden identificarse morfológicamente por su aspecto cuboidal y por su asociación con la matriz ósea recién sintetizada. Estas células se visualizan mediante tinción con la fosfatasa alcalina (Sigma, Deisenhofen, Alemania), ya que las células osteogénicas comprometidas expresan niveles elevados de esta enzima. Como resultado de esta tinción, los osteoblastos aparecen como células teñidas de color púrpura oscuro. Las tinciones específicas de tejido se evaluaron con el uso de un microscopio Olympus IX71 equipado con la cámara Soft Imaging System F-View II y el software de imágenes cellSens Dimension.

g) Análisis genético de los productos finales de las MSC de grado clínico

Análisis por RT-PCR de la expresión de genes transformantes de los productos finales de las MSC a escala clínica. El ARN se extrajo con el uso del miniequipo de reactivos RNeasy (Qiagen) seguido de la transcripción inversa con 1 |jg de ARN total con el uso del Verso cADN Kit (Thermo Scientific) con hexanucleótidos aleatorios de acuerdo con las instrucciones del fabricante, respectivamente. La PCR en tiempo real para los genes c-myc, p21, p53 y GAPDH se realizó en un Eppendorf realplex con el uso de la mezcla maestra de qPCR Quanti Tect SYBRE green (Qiagen). La detección de la transcripción de los genes hTERT y ABL se realizó en un ciclador Biorad MyiQ con el uso de la mezcla Absolute qPCR ROX (Thermo Scientific). Los oligonucleótidos se adquirieron en Eurofins MWG. Las secuencias de los cebadores y las condiciones de la PCR, excepto los períodos de activación específicos de la mezcla de reacción se han publicado en detalle en otra parte.

h) Hibridación de fluorescencia in situ en interfase (FISH)

El análisis FISH de interfase se realizó de acuerdo con los protocolos del fabricante con el uso de las siguientes sondas para los cromosomas 5 y 8: una sonda de dos colores para el cromosoma 5p15 (hTERT) y 5q35 (NSD1, Kreatech, Amsterdam, NL), así como una sonda de separación de tres colores para el cromosoma 8q24 (MYC, Kreatech, Amsterdam, NL). La evaluación de las señales de hibridación se realizó en un sistema de recuento de puntos automático (Applied Spectral Imaging, Edingen/Neckarhausen, Alemania). Para cada sonda, se escanearon y clasificaron > 300 núcleos con el uso de un umbral del 5 %.

Documentación

Antes de la generación del banco de células MSC, de la muestra clínica para el ensayo y de la muestra clínica para la liberación, el proceso se había validado formalmente en cultivos a pequeña escala, según las instrucciones de fabricación (SOP), se definieron formalmente los registros de lotes, las instrucciones de los ensayos y protocolos, así como las especificaciones. Se obtuvo del gobierno estatal una licencia de fabricación para un banco de células MSC, así como para las muestras clínicas para su uso en ensayos clínicos. Las especificaciones de calidad se establecieron después de los consejos formales obtenidos de la agencia federal de medicamentos, el Instituto Paul Ehrlich.

Análisis estadístico

La significación estadística se analizó con el uso del software GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.). La significación se evaluó mediante el ensayo t de Student. Se consideró estadísticamente significativo un valor de P inferior a 0,05.

Ejemplo 1: Recolección de médula ósea de 8 donantes sanos de terceros y aislamiento de las BM-MNC

Después de obtener un consentimiento informado por escrito de cada donante de médula ósea se recolectaron hasta 250 ml adicionales de aspirado de médula ósea con el propósito de almacenarlos en el banco de MSC con la aprobación del Comité de Ética local en total acuerdo con la Declaración de Helsinki. Los inventores obtuvieron 1,66 litros en total de las médulas óseas de los 8 donantes. Para el aislamiento de células mononucleares de médula ósea mediante gradiente de Ficoll, los inventores utilizaron la máquina Sepax como se muestra en la Figura 1. El número absoluto de las BM-MNC por 1 ml de médula ósea después de este procedimiento de aislamiento fue de 3,3 x 106 ± 6,3 x 105 células. El número total de las BM-MNC que se obtuvo de los ocho donantes después de dos etapas de lavado fue de 9,86 x 109. Estas células se resuspendieron en criomedio y se distribuyeron en las bolsas, que se congelaron con el uso de un congelador de velocidad controlada y luego se almacenaron en la fase de vapor del nitrógeno líquido hasta su uso.

Ejemplo 2: Generación de células estromales mesenquimales a partir de células mononucleares de médula ósea: establecimiento del banco de MSC

Para generar el banco de MSC, se descongelaron células mononucleares de médula ósea de 8 donantes, se lavaron y se agruparon en DMEM complementado con PL al 5 %. Para averiguar la concentración óptima del lisado de plaquetas para la adherencia de las células progenitoras de las MSC, los inventores cultivaron a las BM-MNC con ambas concentraciones de PL: 5 % y 10 %. Los resultados obtenidos han demostrado que la concentración del 5 % del lisado de plaquetas es mucho más eficaz en la promoción de las BM-MNC y en la generación de las MSC que la concentración del 10 % de PL (Figura 2A). Además, los inventores se preguntaron cuál de estas dos concentraciones de PL es mejor para la expansión a escala clínica de las MSC. Los inventores encontraron que la concentración del 10 % de PL es significativamente más eficaz para expandir a las MSC que el 5 % de PL (Figura 2B). Además, en ambos casos, los lisados de plaquetas sin filtrar fueron más efectivos para la generación y expansión de las MSC que los filtrados (Figura 2C). Estos experimentos preliminares allanaron el camino para establecer el banco de MSC. Por lo tanto, los inventores descongelaron las BM-MNC de cada donante y después de lavarlas dos veces, se agruparon y luego se cultivaron durante 14 días, como se describe en la sección de métodos. Los inventores fueron capaces de generar a partir de 9,89 x 109 BM-MNC, 3,2 x 108 MSC del pase 1. Estas MSC expresaron los marcadores típicos de las MSC, tales como CD73, CD90 y CD105, pero fueron negativas para los marcadores de células hematopoyéticas, por ejemplo, CD14, CD34, CD45. No expresaron las moléculas antigénicas de clase II de1HLA, pero expresaron altos niveles de las moléculas antigénicas de clase I del HLA. De acuerdo con la tinción con azul de tripano, la viabilidad de estas MSC antes de la congelación fue del 95 ± 5 %.

El número total de las MSC se distribuyó en 210 crioviales que contenían cada uno 1,5 x 106 MSC P1 y finalmente se congeló en la fase gaseosa del nitrógeno líquido hasta su uso. Los inventores se refirieron a este conjunto de viales como el banco de MSC.

Ejemplo 3: Generación y validación de los productos finales de las MSC a escala clínica

a) Descongelación de viales del banco de MSC

Para generar y probar productos finales de las MSC a escala clínica con respecto a su potencial proliferativo, de diferenciación y alosupresor, los inventores descongelaron tres viales de MSC elegidos aleatoriamente del banco del inventor 6-8 semanas después de su criopreservación. La recuperación promedio de la media celular de tres viales descongelados fue de 1,39 x 106 células viables/vial (rango de 1,23 x 106 a 1,48 x 106), mientras que la viabilidad fue del 95, 25 % (rango de 93, 45 %-96,9 %). En promedio, la expansión de estas MSC durante 2 semanas hasta el final del pase 2 resultó en la generación de 470 x 106 MSC viables (rango de 420-548 x 106 MSC). Estas muestras se congelaron en bolsas hasta su uso y se denominaron los productos finales de las MSC a escala clínica.

b) Inmunofenotipificación del producto final de MSC y su potencial de diferenciación

Las MSC del producto clínico final al final del pase 2 fueron negativas para los marcadores hematopoyéticos CD45, CD14, CD34 y no expresaron HLA-DR. Sin embargo, expresaron altos niveles de los marcadores típicos de las MSC como CD73, CD90 y CD105. También se pudieron diferenciar en osteoblastos y adipocitos en los medios específicos de tejido (Figura 4).

d) Cinética de proliferación y senescencia de las MSC

Para demostrar el fundamento de agrupar las células mononucleares de médula ósea de 8 donantes para establecer el banco de MSC de los inventores, los inventores compararon el crecimiento in vitro de las MSC de 8 donantes individuales con el crecimiento de las MSC agrupadas de cada donante dentro del P2 y de 4 productos finales de las MSC dentro del mismo pase (Figura 5A). Como era de esperar, las MSC de cada donante de médula ósea mostraron diferentes cinéticas de crecimiento que variaban de 0,3 x 106 (donante 7) a 1,7 x 106 MSC (donante 5). La cinética de proliferación promedio del producto de MSC que se generó a partir de las BM-MNC agrupadas de 8 donantes fue de 1,0 x 106 ± 0,5 x 106 MSC, que se correlacionó sorprendentemente bien con el número de MSC generadas del grupo de MSC individuales de 8 donantes: 1,1 x 106. Más interesante aún, ambos valores se correlacionaron muy bien con el número promedio de MSC obtenidas a partir de la expansión de 4 productos finales de las MSC dentro de un pase: 1,085 x 106 ± 0,1 x 106 MSC. Estos resultados demostraron la suposición del inventor de que al agrupar a las BM-MNC es posible generar una "media aritmética" de las MSC poco proliferantes y buenas.

Con el fin de probar la expectativa de que cada producto final de MSC del banco de MSC posee casi el mismo potencial de proliferación, los inventores lo analizaron en diez alícuotas expandidas del banco de MSC desde P0 hasta el final del pase 2 para la aplicación clínica. Como se muestra en la Figura 5B, el número promedio de células de todos los productos finales expandidos al final del pase 2 fue 5,3 x 108 ± 5 x 107 MSC, lo que indica un potencial de proliferación altamente homogéneo de los productos finales. Asimismo, el número de las duplicaciones de la población en P1 y al final del pase 2 fue el mismo (4,3 PD/pase) y el número acumulado de PD no excedió el valor 9 (8,7 ± 0,4). Para probar que las MSC no son inmortales, los inventores expandieron 3 productos finales de las MSC del banco de m Sc del inventor durante 12 pases. Como se muestra en la Figura 5D, del pase 5 al 12 las MSC experimentan senescencia replicativa y el número de PD disminuyó rápidamente, lo que indica que estas células son de hecho senescentes y no proliferan indefinidamente.

e) Potencial alosupresor de las MSC aisladas de donantes individuales y productos finales de las MSC en la reacción mixta de linfocitos (MLR)

Se ha demostrado que las MSC ejercen propiedades alosupresoras in vitro o in vivo. Para probar la suposición del inventor de que las MSC generadas a partir del agrupamiento de las BM-MNC de 8 donantes pueden tener un potencial alosupresor más alto que el potencial alosupresor promedio de las MSC generadas a partir de donantes individuales, los inventores utilizaron las MSC expandidas del pase 2 al 8 de donantes individuales, así como el grupo de MSC que se generó al agrupar las MSC de 8 donantes antes de la expansión (MSC-Pool) y un producto final de las MSC (generado a partir del banco de MSC derivado del agrupamiento de las MNC: MSC-140) en MLR. Como era de esperar, el potencial alosupresor de las MSC individuales era muy heterogéneo, es decir, estas MSC inhibían de forma muy diferente la proliferación inducida por los aloantígenos de las MNC sanguíneas de dos donantes con HLA distintos. Este efecto varió desde el 20 % (donantes 1 y 8) hasta aproximadamente el 80 % de inhibición (donantes 2 y 3) (Figura 6A). El potencial alosupresor de las MSC generadas a partir del agrupamiento de las MSC de 8 donantes (MSC-Pool) fue igual al potencial inhibitorio promedio de las MSC de 8 donantes juntos (promedio de 8 donantes). Sin embargo, el potencial alosupresor de la muestra expandida MSC-140 del banco de MSC del inventor fue significativamente mayor que el de MSC-Pool y el potencial alosupresor promedio de las MSC de 8 donantes juntos (P <0,001, P <0,01, respectivamente). Para evaluar si los productos clínicos de las MSC del inventor después de la descongelación son homogéneos en la supresión de la alorreacción, los inventores descongelaron 6 viales de respaldo con las MSC y se probaron directamente en el ensayo MLR, como se administran a los pacientes in vivo. Como se muestra en la Figura 6B, todos estos 6 productos clínicos de las MSC demostraron un efecto alosupresor constante in vitro, lo que indica su potencial homogéneo para suprimir la alorreacción. El potencial alosupresor promedio en las proporciones efectorblanco utilizadas aquí fue 52 % ± 8,7 %.

Ejemplo 4: Caracterización genética de los productos finales de las MSC de grado clínico

Como el cultivo in vitro puede ser normalmente la fuente de aberraciones cromosómicas de las células cultivadas, los inventores se preguntaron si los productos finales de las MSC de grado clínico del inventor están sujetos a tales cambios. El análisis cromosómico de 25 mitosis de las MSC con una resolución de aproximadamente 350-400 bandas demostró un número normal de cromosomas (euploidía) en todos ellos (Figura 7A). Sin embargo, con el uso de una resolución de aproximadamente 300 bandas, los inventores encontraron una translocación entre el brazo corto del cromosoma 5 y el brazo corto del cromosoma 9 en 4 de las 25 mitosis analizadas. Los puntos de ruptura se localizaron en la banda 5p13 y 19p13.3. El análisis de hibridación fluorescente in situ (FISH) con el uso de una sonda de dos colores para el cromosoma 5p15 (hTERT) y 5q35 (NSD1), así como una sonda de separación de tres colores para el cromosoma 8q24, demostró que la mayoría de los productos finales de las MSC de grado clínico del banco de MSC del inventor poseen un patrón diploide normal para ambos cromosomas (Figura 7B, C). Los núcleos en interfase después de la hibridación de dos colores del conjunto de sondas 5p15 (verde) y 5q35 (rojo) identificaron que el 97,2 % de las células demostraron un patrón diploide normal para el cromosoma 5 y solo alrededor del 2,8 % mostró un patrón de hibridación tetraploide (Figura 7D). Del mismo modo, los núcleos en interfase después de la hibridación de tres colores de la sonda de separación MYC (Figura 7C) mostraron en el 97 % de las MSC dos señales de fusión normales para el cromosoma 8q24 y el 3 % de las MSC con un patrón de señal tetraploide (Figura 7E). De este modo, una fracción muy pequeña de las MSC adquiere aberraciones cromosómicas in vitro.

El análisis de la expresión de los genes p53, p21 y Myc en 3 productos finales de las MSC a escala clínica demostró un aumento de 2 a 5 veces en la expresión de p21, una reducción de aproximadamente 6 a 10 veces de la expresión del gen p53 y ninguna expresión del protooncogén c-myc (Figura 8A). Lo que es más importante, de acuerdo con el comportamiento senescente de las MSC del banco del inventor, los inventores demostraron que ninguno de los 3 productos finales de las MSC expresaba hTERT (datos no mostrados).

Dado que las MSC del banco del inventor se generaron a partir del agrupamiento de las BM-MNC de 8 donantes de terceros, los inventores estaban interesados en la contribución relativa de cada donante después de la generación de las MSC. El análisis quimérico por STR-PCR al utilizar una serie de marcadores genéticos demostró la presencia de 8 donantes en diferentes proporciones dentro del producto final de las MSC a escala clínica (Figura 8B). En principio, el porcentaje de presencia en el producto clínico se correlacionó con el potencial de proliferación de las MSC generadas a partir de los donantes individuales, es decir, las MSC que se expandieron mejor individualmente también se encontraron en proporciones más altas en el producto final de las MSC.

Ejemplo 5: Casos clínicos de pacientes tratados con preparaciones de las MSC de la invención

Paciente 1 nacido el 26.03.1999

Trastorno: Talasemia mayor

Después de recibir un trasplante de células madre, el paciente desarrolló ascitis, una inflamación de las articulaciones, derrame pericárdico, causado por una poliserositis inmunológica, posiblemente en el contexto de la enfermedad de injerto contra huésped (GvHD). La administración de MSC de la invención procedió una vez sin complicaciones. Con el tratamiento concomitante con un diurético desapareció la ascitis, la hinchazón de las articulaciones y el derrame pericárdico.

Paciente 2 nacido el 20.12.2009

Trastorno: agranulocitosis grave

Al día 12 después de la terapia con células madre (SCT), el paciente presentó una GvHD aguda fulminante de la piel (grado IV), que incluso con 2 mg/kg de esteroide y 55 mg/kg de Mofetilmicofenolato diario fue incontrolable. El 22.11.2012 el niño recibió MSC de la invención.

Después de la terapia con MSC, la GvHD disminuyó lenta pero constantemente, hasta que ya no se pudo detectar después del día 28 de la administración de las m Sc . El niño ha tolerado muy bien las MSC y no mostró ninguna infección viral, bacteriana o fúngica en los 30 días posteriores a la administración.

Paciente 3 nacido el 25.03.2010

Trastorno: leucemia linfoblástica aguda;

La SCT fue el 16.10.12 de un donante emparentado con HLA no idéntico. Ya en el día 14 después de la SCT, se observaron los primeros signos de GvHD en el intestino. Se inició tratamiento inmediato con Mofetilmicofenolato y esteroides. Eso condujo a una mejora relativa de los síntomas. Sin embargo, el día 35 después de la SCT, se mantuvo un grado II de GVHD intestinal a pesar de la administración de esteroides a largo plazo.

Por tanto, se tomó la decisión de consolidar la terapia inmunosupresora mediante la administración de las MSC de la invención. La administración de las MSC se realizó sin complicaciones el 21.12.12. No se presentaron infecciones en los 30 días posteriores a la administración de la SCT. El día 15.1.2013 no se pudieron observar signos de GvHD intestinal en el paciente y solo quedó una GvHD leve de la piel que no requirió ningún tratamiento.

Paciente 4 nacido el 25.03.1999

Trastorno: leucemia mieloide aguda;

La SCT fue el 19.09.12 de un donante emparentado con HLA no idéntico

5 meses después del trasplante de células madre, el paciente desarrolló síntomas clínicos del síndrome de Stevens-Johnson. Dado que el paciente en el momento del registro tomaba varios medicamentos que se asocian con el desarrollo de este cuadro clínico, se suspendió la medicación respectiva (voriconazol, penicilina, cotrimoxazol). Debido a la detección de una infección por adenovirus, se decidió no realizar una terapia inmunosupresora con glucocorticoides. El paciente desarrolló también lesiones cutáneas típicas del GvHD que probablemente fueron estimuladas por el síndrome de Stevens-Johnson. Por lo tanto, se inició la terapia inmunosupresora con CSA. Con el fin de atenuar los eventos inflamatorios, se administraron las MSC de la invención. Esta administración de las MSC fue bien tolerada. También se administró una crema que contenía glucocorticoides varias veces al día. Bajo esta terapia, hubo una curación casi completa de las lesiones cutáneas ocasionadas por el GvHD.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método in vitro para la producción de una preparación de células estromales mesenquimales (MSC), el método comprende: agrupar muestras de médula ósea obtenidas de al menos dos donantes genéticamente distintos para obtener una muestra de células agrupadas y luego aislar las células estromales mesenquimales a partir de dicha muestra de células agrupadas.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende las etapas de:

(c) Opcionalmente, cultivar dicha muestra de células de agrupadas y

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde dicha muestra de médula ósea es una muestra de médula ósea de mamífero y dicha célula estromal mesenquimal es una célula estromal mesenquimal de mamífero; preferentemente en donde dicha muestra de médula ósea es una muestra de médula ósea humana y dicha célula estromal mesenquimal es una célula estromal mesenquimal humana.

4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dichas muestras de médula ósea son muestras de células mononucleares de médula ósea.

5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dichas muestras de médula ósea se obtienen de al menos tres, con mayor preferencia de al menos cuatro, con mayor preferencia de al menos cinco, con mayor preferencia de al menos seis, con mayor preferencia de al menos siete, y con la máxima preferencia de al menos ocho donantes genéticamente distintos.

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además una etapa de almacenamiento de dichas células estromales mesenquimales aisladas o de expansión de dichas células estromales mesenquimales aisladas.

7. Un método in vitro para la producción de preparaciones de células estromales mesenquimales (MSC) de grado clínico, el método comprende

(i) agrupar las muestras de médula ósea obtenidas de al menos dos donantes genéticamente distintos para obtener una muestra de células agrupadas,

(ii) posteriormente, aislar las células estromales mesenquimales de dicha muestra de células agrupadas, y (iii) expandir las MSC aisladas hasta recibir una cantidad de MSC aplicable en la clínica.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde las MSC se expanden inmediatamente después de aislar las MSC, o en donde las MSC aisladas se expanden después de descongelar una alícuota almacenada en crioconservación de las MSC aisladas.

9. Una composición celular que comprende muestras de médula ósea de al menos dos donantes de médula ósea genéticamente distintos, en donde cada una de dichas muestras de médula ósea comprende al menos una fracción de células no adherentes y al menos una fracción de células adherentes.

10. La composición celular de acuerdo con la reivindicación 9, en donde cada una de dichas muestras de médula ósea comprende una fracción de células mononucleares de médula ósea.

11. La composición celular de acuerdo con la reivindicación 9 o 10, para el uso en medicina.

12. La composición celular para el uso de acuerdo con la reivindicación 11, para el uso en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias tales como la esclerosis múltiple, la diabetes Tipo 1, la artritis reumatoide, la uveítis, la enfermedad tiroidea autoinmunitaria, la enfermedad inflamatoria intestinal (IDB), esclerodermia, la enfermedad de Graves, el lupus, la enfermedad de Crohn, la enfermedad linfoproliferativa autoinmunitaria (ALPS), la enfermedad desmielinizante, la encefalomielitis autoinmunitaria, la gastritis autoinmunitaria (AIG), las enfermedades glomerulares autoinmunitarias y preferentemente la enfermedad de injerto contra huésped (GvHD).