KR20170055471A

KR20170055471A - 다수의 골수 공여자의 풀링된 단핵 세포로부터 중간엽 기질 세포 뱅크의 생성

Info

Publication number: KR20170055471A
Application number: KR1020177003453A
Authority: KR
Inventors: 피터 베이더; 셀림 쿠치; 지라페테 쿠치; 할바드 뵈니히
Original assignee: 요한 볼프강 괴테 우니베르시타트, 프랑크프루트 암 마인; 디알케이-블루트스펜데딘스트 바덴-뷔르템버그-헤센 지지엠비에이치
Priority date: 2014-07-16
Filing date: 2015-07-14
Publication date: 2017-05-19
Also published as: EP2975118B1; HRP20201487T1; AU2015289218B2; RS60863B1; EA037412B1; PT3169772T; JP6756701B2; EP3169772B1; WO2016008895A1; MX2017000704A; US20170198257A1; CN106536719B; CA2954505C; DK3169772T3; SG11201700269WA; EP2975118A1; LT3169772T; HUE050579T2; CY1123343T1; BR112017000690A2

Abstract

본 발명은 개선된 중간엽 기질 세포 (MSC) 제제 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 다수의 비관련 (제3자) 골수 공여자의 골수 단핵 세포 (BM-MNC)를 풀링함으로써 BM-MNC로부터 MSC를 단리하는 새로운 전략을 제공한다. 본 발명의 방법론에 따라 제조된 MSC 제제는 개개의 공여자 MSC 제제 또는 다수의 공여자로부터 생성된 개개의 MSC의 풀과 비교시 안정적인 증식 능력 및 증가된 면역억제 가능성을 특징으로 한다. 본 발명에 따라 제조된 MSC는 의학적 적용, 예컨대 재생 의학에서의 세포-기반 요법으로서 및 자가면역 장애 환자, 조혈 줄기 세포 이식 수용자에서 이식편 대 숙주 질환 (GvHD)의 치료에 특히 유용하다.

Description

다수의 골수 공여자의 풀링된 단핵 세포로부터 중간엽 기질 세포 뱅크의 생성 {GENERATION OF A MESENCHYMAL STROMAL CELL BANK FROM THE POOLED MONONUCLEAR CELLS OF MULTIPLE BONE MARROW DONORS}

본 발명은 개선된 중간엽 기질 세포(mesenchymal stromal cell: MSC) 제제 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 다수의 비관련 (제3자) 골수 공여자의 골수 단핵 세포 (bone marrow mononuclear cell: BM-MNC)를 풀링(pooling)함으로써 BM-MNC로부터 MSC를 단리하는 새로운 전략을 제공한다. 본 발명의 방법론에 따라 제조된 MSC 제제는 개개의 공여자 MSC 제제 또는 다수의 공여자로부터 생성된 개개의 MSC의 풀(pool)과 비교시 안정적인 증식 능력 및 증가된 면역억제 가능성(immunosuppressive potential)을 특징으로 한다. 본 발명에 따라 제조된 MSC는 의학적 적용, 예컨대 재생 의학에서의 세포-기반 요법으로서 및 자가면역 장애 환자, 조혈 줄기 세포 이식 수용자에서 이식편 대 숙주 질환 (GvHD)의 치료에 특히 유용하다.

중간엽 줄기 세포 (MSC)는 프리덴슈타인(Friedenstein) 등에 의해 1970년대에 발견된 이래로 시험관내 및 생체내 둘 다에서 그의 면역조정 및 재생 가능성에 관해 광범위하게 연구되어 왔다. 지난 10년 동안, MSC의 동정 및 장래의(prospective) 단리에 대한 특유의 세포 표면 마커의 부족에도 불구하고, 그의 다면발현적 기능을 밝히는데 상당한 진전이 있었다. 상이한 제조업체로부터 임상적으로 사용된 MSC의 효과를 비교할 수 있도록, 국제 세포 치료 협회(International Society for Cellular Therapy)는 MSC를 정의하기 위한 일련의 표현형 및 기능적 기준을 제안하였다. MSC 표면 상에 HLA-클래스 II 항원 및 공-자극 분자의 부재, 면역조정 가능성을 가진 매우 다수의 분자의 파라크린 분비, 뿐만 아니라 많은 조직으로부터 그의 장래의 단리의 용이성은 이들을 광범위한 임상 병태, 예컨대 조직 손상, 염증 과정 및 자가면역 장애에서의 세포-기반 치료 전략을 위한 매우 매력적인 공급원이 되도록 한다. 그러나, 모든 이들 임상 적용을 위해 적시에 많은 수의 "기성품인(off-the-shelf)" MSC를 가질 필요가 있다.

현재까지, 대다수의 임상 연구는 단일 골수 공여자로부터 생성된 중간엽 기질 세포 (MSC)를 사용하여 수행되었다. MSC 제제의 효과가 공여자마다 크게 다르므로, 이들 연구로부터 수득된 결과는 대단히 이질적이었다. 게다가, 발명자들 등은 MSC가 클론 수준에서 광대한 공여자-대-공여자뿐만 아니라 집단내 이질성도 나타냄을 입증하였다. 이러한 현저한 이질성은 동등한 치료 효능을 가진 MSC-생성물을 재현가능하게 제조하는 데 사용될 수 있을, 임상 제조 프로토콜의 개발에서 주요 장애물이 된다.

골수 샘플로부터의 인간 중간엽 기질 세포의 단리 방법은 US 5,486,359에 기재되어 있다. 골수 천자액(aspirate) 또는 분쇄 골 물질로부터 MSC를 정제하기 위해 중간엽 기질 세포에 결합하는 항체가 개발되었다. 골수 샘플은 피콜 구배(Ficoll gradient)를 통해 분리되며, 저밀도 분획은 줄기 세포 단리에 사용된다. US 5,486,359는 줄기 세포가 부착되도록 조직 배양 플라스틱 상에서 1일 동안 정상 배지에서 세포를 배양하였다. 그 후에, 배지를 교환하고 4일마다 배지 교환으로 컨플루언트(confluent)될 때까지 세포를 배양하여 MSC를 수득한다.

WO 2012/048093은 단일 공여자로부터의 골수 유래 MSC의 단리를 개시한다. WO 2012/048093은 단일 공여자로부터 유래된 MSC 제제가 임상 규모 제제로 증대될 수 있음을 교시한다.

MSC 제제의, 비관련 골수 공여자 또는 골 샘플의 개개의 골수 단핵 세포 분획으로부터 그의 생성 후에 풀링은 동종 조혈 줄기 세포 이식(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation)을 받은 골수섬유증을 가진 환자에서 생명을 위협하는 출혈의 치료에 가능한 것으로 알려져 있다 (O Ringden and K LeBlanc, Bone marrow Transplantation, 2011;46:1158-1160). 이 연구에서, 둘의 상이한 공여자로부터 개별적으로 유래된 임상-등급 MSC 제제를 조합하여 반응의 가능성을 증가시켰다.

상기 기재된 선행 기술을 고려하여, 예측가능한 증식 및 면역억제 가능성 및 최소 배치-대 배치(batch-to-batch) 가변성을 가진 임상 등급 MSC 제제를 제조하기 위한 임상에서의 지속적인 필요성이 존재한다. 따라서, 본 발명이 해결하려는 과제는 개선된 특성을 가진 골수 샘플로부터의 MSC의 제조/단리 방법을 제공하는 것이다.

상기 과제는 제1 측면에서 골수 단핵 세포 (BM-MNC)로부터 단리된 중간엽 기질 세포 (MSC)를 포함하는, MSC 제제로서, 상기 MSC 제제가 hTERT 음성이고 다유전자성임을 특징으로 하는, MSC 제제에 의해 해결된다. 바람직한 실시양태에서, 상기 MSC는 포유동물, 바람직하게는 인간 MSC이다.

용어 "일유전자성(monogenic)"은 세포의 샘플 또는 조성물을 기재하는 맥락에서 사용시 공통적인 공급원에서 비롯되거나 동일한 유전적 배경을 갖는 이들 세포를 지칭한다. 다른 한편으로는 용어 "다유전자성(polygenic)"은 상이한 공급원에서 비롯되고 상이한 유전적 배경을 갖는 세포의 조성물을 지칭한다. 본 발명의 맥락에서 "다유전자성 MSC 제제"는 구별되는 유전적 배경을 갖는 MSC, 예를 들어 적어도 2개의 유전적으로 구별되는 골수 공여자에서 비롯된 MSC를 포함하는 조성물이다.

본원에 기재된 발명의 맥락에서 용어 "중간엽 기질 세포" 및 "중간엽 줄기 세포"는 골수 샘플로부터 단리된 동일한 다능성 세포 분획의 동의어의 기재로 이해되어야 한다.

본 발명자들은 그의 동종억제 가능성(allosuppressive potential)에 관해서 공여자간(inter-donor) 가변성을 최소화하기 위해, 8개의 제3자 건강한 공여자의 풀링된 골수 단핵 세포 (BM-MNC)로부터 GMP-호환(compliant), 무 혈청(serum-free) MSC-마스터 세포 뱅크(Master Cell Bank)를 확립하기 위한 특유의 3-단계 기술을 개발하였다: (i) 지역 윤리위원회(local Ethics Committee) 및 헬싱키 선언(Declaration of Helsinki)에 의해 발행된 승인서에 완전한 합의로 8개의 제3자 건강한 공여자로부터 개개의 BM-MNC의 혼합된 다유전자성의 단리 및 냉동보존, (ii) 해동 후에 풀링된 BM-MNC로부터의 MSC의 생성 및 바이알에서 냉동보존 및 (iii) MSC 샘플을 해동하여 그의 무 혈청 증대(expansion) 및 "기성품인" 임상-규모 용량의 생성. 이러한 방식으로, 본 발명자들은 개개의 골수 공여자로부터 생성된 MSC와 비교하여, 끊임없이 보다 높은 동종억제 가능성 및 일정한 증식 능력을 가진 임상-등급 MSC 제제의 생성을 위한 놀랍고 효과적인 프로토콜을 개발하였다. 따라서, 이 프로토콜은 임상 연구자에게 이식편 대 숙주 질환 및 기타 염증성 장애의 치료를 위한 일관된 품질의 임상-등급 MSC를 제공한다. 상당한 선취 비용에도 불구하고, 이 프로토콜은 임상-등급 MSC의 면역억제 성능에서 일관성, 재현성 및 신뢰성을 보장한다.

또 다른 실시양태는 상기 MSC가 TERT 음성인 것을 특징으로 하는 본 발명의 MSC 제제에 관한 것이다. TERT는 텔로머라제 RNA 성분 (TERC)과 함께, 불멸화 세포의 증식 능력을 유지하는데 필수적인, 텔로머라제 복합체의 가장 중요한 유닛을 포함하는, 효소 텔로머라제의 촉매 서브유닛인 텔로머라제 역 전사효소 (인간에서 hTERT, 또는 TERT로 약칭됨)이다. 본 발명의 MSC 제제는 부재하는 hTERT 발현과 일치하는 불멸하지 않는 MSC를 포함하는 것으로 나타났다.

본 발명의 한 추가적 바람직한 실시양태는 본원에 기재된 바와 같은 MSC 제제이고, 여기서 상기 MSC 제제는

(a) 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 95%의 CD73+ 세포, 가장 바람직하게는 적어도 98%, 및/또는

(b) 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 95%의 CD90+ 세포, 가장 바람직하게는 적어도 98%, 및/또는

(c) 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 95%의 CD105+ 세포, 가장 바람직하게는 적어도 98%, 및/또는

(d) 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 95%의 HLA-클래스 I+ 세포, 가장 바람직하게는 적어도 98%, 및/또는

(e) 10% 미만, 바람직하게는 1% 미만의 CD45+ 세포, 가장 바람직하게는 0.1% 미만, 및/또는

(f) 10% 미만, 바람직하게는 1% 미만의 CD14+ 세포, 가장 바람직하게는 0.5% 미만, 및/또는

(g) 10% 미만, 바람직하게는 1% 미만의 CD34+ 세포, 가장 바람직하게는 0.5% 미만, 및/또는

(h) 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만의 HLA-DR+ 세포, 가장 바람직하게는 1% 미만을 포함한다.

한 추가적 실시양태에서 MSC 제제는

(a) 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 95%의 CD73+ 세포, 가장 바람직하게는 적어도 98%, 및

(b) 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 95%의 CD90+ 세포, 가장 바람직하게는 적어도 98%,

(c) 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 95%의 CD105+ 세포, 가장 바람직하게는 적어도 98%를 포함한다.

게다가 본 발명의 MSC 제제는

(e) 10% 미만, 바람직하게는 1% 미만의 CD45+ 세포, 가장 바람직하게는 0.1% 미만, 및

(f) 10% 미만, 바람직하게는 1% 미만의 CD14+ 세포, 가장 바람직하게는 0.5% 미만, 및

(g) 10% 미만, 바람직하게는 1% 미만의 CD34+ 세포, 가장 바람직하게는 0.5% 미만을 포함할 수 있다.

본 발명의 과제는, 더욱이, 적어도 2개의 유전적으로 구별되는 공여자로부터 수득된 골수 샘플을 풀링하여 샘플 세포-풀(cell-pool)을 수득한 후에, 상기 샘플 세포-풀로부터 중간엽 기질 세포를 단리하는 것을 포함하는, 중간엽 기질 세포의 시험관내 단리 방법에 의해 해결된다.

본 발명에 따른 골수 샘플로부터의 MSC의 단리 또는 제조 방법은 유전적으로 구별되는 공여자로부터, 골수로부터 유래된 단핵 세포 분획, 또는 골수를 풀링하는 단계를 포함한다. 따라서, 적어도 2개의 유전적으로 구별되는 골수 샘플, 또는 유전적으로 구별되는 BM-MNC 분획을 본 발명의 방법에서 풀링한다. 중요하게는, 본 발명의 방법은 BM 샘플이 여전히 상이한 세포 유형의 혼합물을 함유하는 단계에서유전적으로 구별되는 BM 샘플의 풀링을 포함한다. 따라서, 바람직하게는 유전적으로 구별되는 BM-MNC 샘플의 풀링은 MSC 분획이 상기 샘플로부터 증대되거나 정제되기 전에 수행된다. MSC의 단리 전에 세포를 풀링하는 것은 놀랍게도 개선된 동종억제 가능성을 가진 MSC 제제를 산출하였다.

한 실시양태에서 본 발명에 따른 방법은

(a) 적어도 2개의 유전적으로 구별되는 공여자로부터 수득된 다수의 골수 샘플을 제공하는 단계,

(b) 상기 골수 샘플을 풀링하여 샘플 세포-풀을 수득하는 단계,

(c) 임의적으로, 상기 샘플 세포-풀을 배양하는 단계, 및

(d) 단계 (b)에서 수득된 상기 샘플 세포-풀로부터 상기 중간엽 기질 세포를 단리하는 단계를 포함한다.

한 바람직한 실시양태에서 방법은 적어도 2개의 유전적으로 구별되는 공여자로부터 수득된 다수의 골수 샘플을 제공하는 단계, 골수 샘플로부터 단핵 세포 분획을 단리하는 단계, 상기 골수 단핵 세포 샘플을 풀링하여 BM-MNC-풀을 수득하는 단계, 임의로, 상기 BM-MNC-풀을 배양하는 단계, 및 상기 BM-MNC-풀로부터 상기 중간엽 기질 세포를 단리하는 단계를 포함한다. 물론 상기 및 이하에 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 방법의 모든 추가적 특수 변형은 골수 샘플로부터 BM-MNC를 단리하는 단계를 포함하는 이 방법론의 동등하게 바람직한 실시양태이다.

본 발명의 맥락에서의 용어 "샘플 세포-풀"은 상이한 유전적 배경을 가진 골수 유래 세포의 혼합물을 지칭하여야 한다. 따라서, 본 발명의 샘플 세포-풀은 다유전자성이다. 가장 바람직하게는 본 발명에 따른 샘플-세포 풀은 MSC가 단지, 바람직하게는 80%, 바람직하게는 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% 미만, 가장 바람직하게는 10% 미만, 훨씬 보다 바람직하게는 5% 미만, 1% 미만, 가장 바람직하게는 0.1% 미만의 작은 백분율로 존재한다는 것을 특징으로 한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "유전적으로 구별되는"은, 게놈 수준에서의 적어도 하나의 차이가 골수 공여자/대상체 사이에 존재함을 나타낸다. 골수는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 또는 그 초과의 공여자로부터 수집될 수 있다. 4 내지 8개의 상이한 공여자 샘플을 사용하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명에 따른 "골수 샘플"은 골수 천자액이나 골 단편(piece), 예컨대 골 해면질(cancellous bone) 단편 중 하나일 수 있다. 바람직한 실시양태에서 골수 샘플은 골수 천자액이다. 골수 샘플을 수집하는 방법은 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 한 바람직한 실시양태에서의 본 발명의 상기 골수 샘플은 상이한 세포 유형의 혼합물을 포함한다. 예를 들어 상기 골수 샘플 각각은 적어도 하나의 비부착성 세포 분획 및 적어도 하나의 부착성 세포 분획을 포함한다. 한 특정한 바람직한 실시양태에서 상기 골수 샘플은 골수 단핵 세포 (BM-MNC) 샘플 또는 분획이다. BM-MNC는 골수로부터 수득된다.

본 발명의 맥락에서 "골수 단핵 세포 분획" (본원에서 "BM-MNC"로도 칭해짐)은, B, T 및 NK 림프구, 초기 골수 세포, 및 매우 적은 수의 내피 전구세포, 조혈 줄기/전구세포 및/또는 중간엽 기질 세포를 함유한다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서 상기 골수 샘플은 포유동물 골수 샘플이고 상기 중간엽 기질 세포는 포유동물 중간엽 기질 세포이다. 보다 바람직한 것은 상기 골수 샘플이 인간 골수 샘플이고 상기 중간엽 기질 세포가 인간 중간엽 기질 세포인 것이다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 MSC의 상기 기재된 단리 방법에 관한 것으로서, 방법은 상기 골수 샘플 각각으로부터 골수 단핵 세포 (BM-MNC)를 추출하여 BM-MNC-샘플을 수득하는 단계 (a')를 추가로 포함하고, 여기서 단계 (b)에서, 상기 BM-MNC-샘플을 풀링하여 상기 샘플 세포-풀을 수득한다. 상기 언급된 바와 같이, BM-MNC 분획/샘플은 단지 작은 수의 MSC를 함유한다. 따라서, 본 발명의 한 바람직한 실시양태에서 풀링되는 상기 BM-MNC 샘플은 80%, 바람직하게는 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% 미만, 가장 바람직하게는 10% 미만, 훨씬 보다 바람직하게는 5% 미만, 1% 미만, 가장 바람직하게는 0.1% 미만의 상기 샘플에서의 총 세포당 중간엽 기질 세포의 백분율을 포함한다.

본원에 기재된 발명의 맥락에서, 그의 실시양태 및 측면 모두에서, 상기 골수 샘플 (또는 BM-MNC 샘플)이 적어도 3, 보다 바람직하게는 적어도 4, 보다 바람직하게는 적어도 5, 보다 바람직하게는 적어도 6, 보다 바람직하게는 적어도 7, 및 가장 바람직하게는 적어도 8개의 유전적으로 구별되는 공여자로부터 수득되는 것이 특히 바람직하다. 다시 말해서, 한 특정한 바람직한 실시양태에서 MSC 세포 제제 및 그의 제조 방법은 적어도 3, 보다 바람직하게는 적어도 4, 보다 바람직하게는 적어도 5, 보다 바람직하게는 적어도 6, 보다 바람직하게는 적어도 7, 및 가장 바람직하게는 적어도 8개의 유전적으로 구별되는 세포 샘플의 풀링을 포함한다.

골수 샘플, 특히 골수 천자액으로부터 BM-MNC의 단리 방법은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 그러나, 본 발명의 한 실시양태에서 BM-MNC가 세포 밀도 분리, 예컨대 피콜 구배를 사용하여 골수 샘플로부터 단리하는 것이 바람직하다.

일단 풀링되면, 본 발명의 수득된 세포-풀을 사용하여 MSC를 단리 및 정제한다. 골수 샘플 또는 BM-MNC로부터 MSC의 단리 방법은 또한 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 본 발명의 바람직한 방법은 일정한 간격으로 배양 용기로부터 세포 배양 배지를 흡인함으로써 부유 세포를 간단히 제거함으로써 비부착성 세포로부터 부착물을 단리하는 것이다. 배지를 다수회 교체함으로써 비부착성 세포의 분획이 끊임없이 감소되며, 한편 부착성 MSC-분획은 컨플루언트될 때까지 계속 성장한다. 이들 부착성 세포는 MSC이다.

따라서, 한 실시양태에서 본 발명의 방법의 단계 (d)가 상기 샘플 세포-풀의 배양물로부터 비부착성 세포를 적어도 1회 제거하는 단계를 포함하거나; 여기서 상기 샘플 세포-풀을 배양한 후에, 적어도 하나의 검출가능한 표면 마커 또는 항체를 상기 MSC의 정제에 사용하는 것이 바람직하다.

게다가 본 발명의 방법은 상기 단리된 중간엽 기질 세포를 저장하거나 상기 단리된 중간엽 기질 세포를 증대시키는 단계를 제공할 수 있다.

한 추가적 측면에서 본 발명은 임상-등급 MSC 제제의 제조 방법을 포함한다.이 방법은 MSC를 단리하는 앞서 언급한 방법 단계를 포함하나, 더욱이 임상에서 적용가능한 MSC의 양을 수령할 때까지 단리된 MSC의 증대를 포함한다. 본 발명의 MSC의 증대는 MSC를 단리한 직후에 행해질 수 있거나, 대안으로 단리된 MSC는 증대 공정을 시작하기 위해 세포의 분취액을 해동시킴으로써, 냉동보존을 통해 저장되었다. MSC가 어떻게 증대되는지는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예로서 본원의 실시예 섹션에서 설명되어 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 적어도 2개의 유전적으로 구별되는 골수 공여자로부터의 골수 샘플을 포함하는 세포 조성물에 관한 것이다. 대안으로 본 발명의 세포 조성물은 적어도 2개의 유전적으로 구별되는 골수 공여자로부터의 BM-MNC을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 세포 조성물은 바람직하게는 다유전자성이다.

한 실시양태에서 본 발명의 세포 조성물은 적어도 2개의 일유전자성의 유전적으로 구별되는 골수 샘플을 풀링한 후에 상기 골수 샘플에 함유된 줄기 세포 분획을 단리하고/거나 증대시킴으로써 수득한다. 따라서, 풀링을 통해 세포 조성물은 다유전자성이 된다.

한 바람직한 실시양태에서 상기 골수 샘플은 골수 단핵 세포 샘플이다.

이 측면의 한 실시양태는

(a) 그 각각이 유전적으로 구별되는 골수 공여자로부터의 것인, 적어도 2개의 골수 샘플을 수득하는 단계,

(b) 상기 골수 샘플 각각으로부터 골수 단핵 세포 분획을 단리하여 일유전자성 골수 단핵 세포 샘플을 수득하는 단계, 및

(c) 각각의 골수 샘플로부터 수득된 상기 일유전자성 골수 단핵 세포 샘플을 풀링하여 다유전자성 세포 조성물을 수득하는 단계

를 포함하는 방법에 의해 수득가능한, 본 발명의 세포 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 맥락에서 "골수 단핵 세포 분획"은 골수로부터 유래된 이 세포 분획으로 공지된 표준 세포 조성물을 포함한다는 것이 이해된다. 이와 관련하여 상기 일유전자성 단핵 세포 샘플을, 세포 정제 또는 증대의 추가 단계를 수행하기 전에, 바람직하게는 그로부터 임의의 MSC를 단리 또는 정제하기 전에, 풀링하는 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 측면은 중간엽 기질 세포를 단리하는 방법에서 적어도 2개의 유전적으로 구별되는 골수 공여자로부터 수득된 골수 단핵 세포의 혼합물의 용도를 제공한다.

중간엽 기질 세포의 정제/단리의 방법에서 앞서 본원에서 기재된 바와 같은 세포 조성물의 용도의 측면이 추가로 제공된다.

본 발명의 과제는 또한 상기에서 본원에 기재된 바와 같은 MSC를 단리/정제하는 방법에 의해 수득가능한 중간엽 기질 세포에 의해 해결된다.

본원에 기재된 MSC 제제 또는 MSC는 바람직하게는 의약에서 사용하기 위한 것이다. MSC는 일반적으로 다종다양한 의학적 적용에서 사용된다. 하기의 예로 제한되는 것을 의도하지 않으면서, 본 발명의 MSC는 바람직하게는 자가면역 질환, 예컨대 다발성 경화증, 제1형 당뇨병, 류마티스 관절염, 포도막염, 자가면역 갑상선 질환, 염증성 장 질환 (IBD), 경피증, 그레이브스병, 루푸스, 크론병, 자가면역 림프증식성 질환 (ALPS), 탈수초성 질환, 자가면역 뇌척수염, 자가면역 위염 (AIG), 및 자가면역 사구체 질환의 치료에서 사용하기 위한 것이다. 특히, 본 발명의 MSC 제제는 이식편 대 숙주 질환 (GVHD)의 치료에서 사용된다.

그러나, 본원에 기재된 발명의 맥락에서, MSC 제제는, 바람직하게는 일시적, 재발 또는 완화형의, 임의의 재생 또는 자가면역 질환에서 유용하다. 본 발명의 MSC 제제의 다른 임상 적용은 상처 치유, 각막 궤양, 뇌졸중에서, 또는 동종 줄기 세포 이식에서의 생착 촉진을 위한 것이다.

MSC 투여를 포함하는 세포 요법은, 예를 들어, MSC-함유 조직 (골수)의 수확 단계, MSC의 단리 및 증대 단계 (본원에 기재된 방법에 따름), 및 MSC의 대상체/환자에의 투여 단계 (생화학적 또는 유전자 조작과 함께 또는 없이)를 기반으로 한다.

한 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따라 제조된 MSC 제제의 치료 용량을 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.

자가면역 질환 또는 이식편 대 숙주 질환에 대한 치료 용량은 약 1×10⁵개 세포/kg 내지 약 1×10⁷개 세포/kg을 함유할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 치료 용량은 약 1×10⁶개 세포/kg 내지 약 5×10⁶개 세포/kg이다. 또 다른 실시양태에서, 치료 용량은 약 2×10⁶개 세포/kg 내지 약 8×10⁶개 세포/kg이다. 또 다른 실시양태에서, 치료 용량은 약 2×10⁶개 세포/kg 또는 약 2×10⁶개±약 10%, 약 20%, 또는 약 30% 세포/kg이다. 또 다른 실시양태에서, 치료 용량은 약 8×10⁶개 세포/kg 또는 약 8×10⁶개±약 10%, 약 20%, 또는 약 30% 세포/kg이고, 그 사이의 임의의 양 또는 범위를 포함한다. 본 발명의 MSC 제제를 고려해 볼 때, 투여되는 중간엽 기질 세포의 수는 환자의 연령, 체중 및 성별, 치료되는 질환, 및 그의 정도 및 중증도를 포함한 다양한 인자에 따라 달라진다.

본 발명의 MSC는 여러 가지의 절차에 의해 투여될 수 있다. MSC는 예컨대 정맥내, 동맥내, 또는 복강내 투여에 의해 전신 투여될 수 있다. 중간엽 기질 세포는 이를 필요로 하는 기관 또는 조직에 직접 주사하여 투여할 수 있다. 중간엽 기질 세포는 국소적으로 적용될 수 있다. 중간엽 기질 세포는 외과 수술 동안에 이를 필요로 하는 조직에 직접 적용될 수 있다.

본 발명에 따른 중간엽 기질 세포는 혈관 신생을 통해 완화, 치료 또는 예방 될 수 있는 임의의 질환 또는 장애의 치료, 완화 또는 예방에서 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 중간엽 기질 세포는 사지, 즉, 팔, 다리, 손 및 발, 뿐만 아니라 목에서 또는 다양한 기관에서의 것들을 포함한 폐색된 동맥을 치료하기 위해 동물에게 투여할 수 있다. 예를 들어, 중간엽 기질 세포는 뇌에 공급되는 폐색된 동맥을 치료하여 뇌졸중을 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다. 또한, 중간엽 기질 세포는 배아 및 출생 후의 각막에서 혈관을 치료하는 데 사용될 수 있으며 사구체 구조화를 제공하는 데 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 중간엽 기질 세포는 내부 및 외부 둘 다의 상처의 치료, 뿐만 아니라 질환, 예컨대 당뇨병 및 겸상 적혈구 빈혈로 인한 피부 궤양을 포함하나 그에 제한되지는 않는, 발, 손, 다리 또는 팔에서 발견되는 피부 궤양의 치료에서 사용될 수 있다.

더욱이, 혈관신생은 배아 이식 및 태반 형성에 관여하기 때문에, 중간엽 기질 세포는 배아 이식을 촉진하고 유산을 방지하는 데 사용될 수 있다.

게다가, 중간엽 기질 세포 세포는 인간을 포함한 태어나지 않은 대상체에게 투여되어, 태어나지 않은 대상체에서 맥관 구조의 발달을 촉진할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 중간엽 기질 세포는 태어나거나 태어나지 않은 대상체에게 투여되어, 연골 재흡수 및 골 형성을 촉진할 뿐만 아니라, 올바른 성장판 형태발생을 촉진하도록 할 수 있다.

중간엽 기질 세포는 치료제를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 유전자적으로 조작될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 적절한 발현 비히클을 통해 중간 엽 조직 세포로 전달될 수 있다. 중간엽 기질 세포를 유전자적으로 조작하기 위해 사용될 수 있는 발현 비히클은 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 및 아데노-연관 바이러스 벡터를 포함하나 그에 제한되지는 않는다. 본 발명의 MSC는 예를 들어 유전자적으로 조작되어 TERT를 과발현시키고, 그로 인해 세포를 불멸화할 수 있다.

또한, 본 발명의 MSC 제제 또는 중간엽 기질 세포는 줄기 세포 이식에서 사용하기 위한 것일 수 있다.

골 대체 물질의 제조에서 본 발명의 MSC 제제 또는 MSC의 용도가 추가로 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면은 MSC의 단리/정제를 위한 본원에 기재된 방법 중 어느 한 방법에 따른 방법 단계를 포함하는, 중간엽 기질 세포를 포함하는 의약의 제조 방법이다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 또는 본 발명의 방법으로 제조된 MSC는 적절한 배양 조건, 예컨대 각각의 세포 분화 유도 조건 하에, 예를 들어 적절한 유도 배지, 예컨대 골 형성, 지방 형성 및 연골 형성 유도 배지 각각으로 배양되는, 골모세포, 지방세포 및/또는 연골세포로 분화할 수 있다. 한 실시양태에서, 적절한 조건 및 적절한 유도 배지는 실시예에 명시된 것들이다. 또 다른 실시양태에서, 적합한 조건 및 배지의 예는 문헌 [Aubin J E. Osteoprogenitor cell frequency in rat bone marrow stromal populations: role for heterotypic cell-cell interactions in osteoblast differentiation. J Cell Biochem. (1999) 72(3):396-410] (골 형성에 관해); [Falconi D, Oizumi K, Aubin J E. Leukemia inhibitory factor influences the fate choice of mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. (2007) 25(2):305-312] (지방 형성에 관해); 및 [Zhang S, Uchida S, Inoue T, Chan M, Mockler E, Aubin J E. Side population (SP) cells isolated from fetal rat calvaria are enriched for bone, cartilage, adipose tissue and neural progenitors. Bone. (2006) 38(5):662-670] (연골 형성에 관해)에 개시되어 있다.

본 발명의 한 측면에서, 본 발명은 다음 중 하나 이상, 즉 배양 배지, 및 이를 사용하기 위한 설명서를 포함하는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 키트를 제공한다. 또 다른 실시양태에서 본 발명은 실험에서 및/또는 이식에서 사용하기 위한, 본 발명의 단리된 중간엽 기질 세포의 샘플 및 임의로 배양 배지 및 또는 설명서를 포함하는 키트를 제공할 수 있다.

본원에 기재된 바와 같은 중간엽 기질 세포 (MSC) 제제는 더욱이, 그것이 골수 단핵 세포 (BM-MNC)로부터 단리된 MSC를 포함하고, 다유전자성이며, 다음 특성 중 적어도 하나를 갖는 것을 특징으로 한다:

(a) 일유전자성 MSC (단일 공여자로부터 생성)에서의 p21 발현과 비교하여 증가된 p21 발현,

(b) 일유전자성 MSC (단일 공여자로부터 생성)에서의 p53 발현과 비교하여 감소된 p53 발현, 및/또는

(c) 일유전자성 MSC (단일 공여자로부터 생성)에서의 c-myc 발현과 비교하여 감소된 c-myc 발현.

이들 특징은 본 발명의 기재된 MSC 제제를 최신식의 제제와 구별하는 대안적인 또는 추가적인 구조적 특징으로 사용될 수 있다. 한 실시양태에서 본 발명의 MSC 제제는 일유전자성 MSC (단일 공여자로부터 생성)에서의 p21 발현과 비교하여 증가된 p21 발현을 가진 MSC를 포함한다. 본 발명의 MSC 제제는 추가로 또는 대안으로, 일유전자성 MSC (단일 공여자로부터 생성)에서의 p53 발현과 비교하여 감소된 p53 발현을 특징으로 한다.

본 발명은 한 실시양태에서 MSC 제제에 관한 것이며, 여기서 상기 MSC는 추가로 또는 대안으로, 일유전자성 MSC (단일 공여자로부터 생성)에서의 c-myc 발현과 비교하여 감소된 c-myc 발현을 특징으로 한다.

구체적 실시양태에서 p21 발현에서의 상기 증가는 적어도 2-배, 바람직하게는 적어도 3배, 보다 바람직하게는 적어도 4배이고/거나; 여기서 p53 발현에서의 상기 감소는 적어도 10-배, 바람직하게는 적어도 20배이고/거나; 여기서 c-myc 발현에서의 상기 감소는 적어도 10-배, 바람직하게는 적어도 20배, 가장 바람직하게는 검출가능하지 않다.

본 발명의 바람직한 MSC 제제는 앞서 언급한 특징 (a) 내지 (c) 모두를 가진 MSC를 포함한다. 본 발명의 단리된 MSC는 본 발명의 MSC의 추가적 특징으로서 사용될 수 있는, 염색체 5와 9 사이의 염색체 전좌를 가진 적어도 하나의 인간 MSC를 포함하였다. 바람직하게는 MSC는 (a) 및 (b), (a) 및 (c), 또는 (b) 및 (c)를 특징으로 한다. 가장 바람직하게는 상기 MSC는 (a), (b) 및 (c)를 특징으로 한다. p21, p53, c-myc 및/또는 hTERT의 발현에서의 차이가 발명된 MSC와 단일 공여자로부터 생성된 일유전자성 MSC 사이의 차이인 것인 MSC 제제가 또한 바직하다.

도면의 간단한 설명

본 발명은 이제 첨부된 도면 및 서열을 참조하지만, 그에 제한되지는 않으면서, 하기 실시예에서 추가로 기재될 것이다. 본 발명의 목적을 위해, 본원에 인용된 모든 참고 문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 도면에서:

도 1: 골수의 수집 및 골수 단핵 세포의 분리. A) 장골능으로부터 양측 천자(bilateral aspiration)에 의한 전신 마취로 8개의 건강한 제3자 공여자로부터 골수를 수집하였다. B) 골수 샘플을 백(bag)에 수집하고 골수 천자액의 ml 당 7-12% ACD-A 및 7-12 i.U.의 헤파린으로 항응고화하였다. C) 세팍스 II 니트셀 프로세스(Sepax II NeatCell process) (바이오세이프(Biosafe), 스위스)를 사용하는 피콜 (지이 헬쓰케어(GE Healthcare), 독일 뮌헨) 밀도 원심분리에 의해 골수 천자액으로부터 골수 단핵 세포가 농축되었다(enriched). D) BM-MNC를 2회 세척하고 10%DMSO/5%HSA/X-비보(vivo)로 이루어진 냉동배지에 재현탁시켰다. E) 냉동배지 중 각각의 골수 공여자로부터의 BM-MNC를 함유하는 백을 사용 때까지 액체 질소의 증기 상 중에서 동결시켰다.

도 2: 골수 단핵 세포로부터 MSC-뱅크의 생성. A) 각각의 공여자의 골수 단핵 세포를 함유하는 백을 +37℃에서 해동시키고, 배지로 2회 세척한 후에, 5% 혈소판 용해물로 보충된 일정 부피의 DMEM 중에서 이들을 풀링하였다. 모든 세포를 1 개의 1-셀스택(CellStack) 세포 배지 및 11개의 2-셀스택 플레이트에 플레이팅하였다. B) 72시간 후에, 비부착성 분획을 제거하고 부착성 세포를 3일마다 배지를 교체함으로써 또 다른 11일 동안 5% PL로 보충된 DMEM 중에서 추가로 배양하였다. MSC가 출현하고 80% MSC의 컨플루언트까지 성장하면 MSC를 트립신 (TrypLE)을 사용하여 분리하고 이들을 배지로 세척한 후에 10% DMSO/5%HSA/DMEM으로 이루어진 냉동배지에 재현탁시켰다. C) MSC를 각각이 계대 P1의 1.5 x 10⁶ MSC를 함유하는 210개의 냉동바이알에 동결시켰다. 본 발명자들은 MSC를 가진 바이알의 이러한 세트를 MSC-뱅크로서 지정하였다.

도 3: MSC-임상 최종 생성물의 생성. A) MSC를 가진 3개의 무작위로 선택된 냉동보존된 바이알을 그의 초기 냉동보존 후 6-8주에 해동시켰다. B) 이들을 1개의 1-셀스택 (636 cm²)에 플레이팅하고 10% 혈소판 용해물을 함유하는 DMEM 중에서 6-7일 동안 배양하였다. 배지를 3일마다 교체하였다. C) 6 또는 7일째에 (이들의 전면 성장(confluent growth)에 따라) MSC (P1의 종료)를 트립신에 의해 분리하고, 세척하고 2x10³개 MSC/1 cm2의 세포 농도에서 8개의 2-셀스택에 플레이팅하고 또 다른 주 동안 증대시켰다. 배지를 3-4일마다 교체하고 그 주의 말 (P2의 종료)에 MSC를 트립신에 의해 분리하고, 2회 세척하고 세포 수를 계수하였다. 이들 MSC를 냉동보존하고 MSC 임상 제품으로서 지정하고, 이들은 2-3주 후에 그의 증식, 분화 및 동종억제 가능성에 관해 검증하였다.

도 4: MSC의 표현형 및 그의 분화 가능성. A) 계대 2의 종료시 MSC-뱅크로부터 분취액의 증대에 의해 생성된 MSC를 표 1에 제시된 바와 같이 형광색소에 접합된 마우스 항-인간 항체로 표지하였다. B) 조직-특이적 배양 배지에서의 MSC의 배양은 지방세포와 골모세포로의 분화를 유도하였다.

도 5: MSC-최종 생성물 및 개개의 공여자로부터의 MSC의 성장 속도론(growth kinetics). A) 각각의 골수 공여자로부터의 4.4x10⁴개 MSC의 초기 수는 1 계대 (P2의 시작부터 종료까지) 동안 증대되었다. 동시에, 모든 8개의 공여자의 MSC뿐만 아니라 MSC-뱅크의 4개의 분취액을 풀링하고 P2의 시작부터 종료까지 증대시켰다 (MSC-풀). 계대 2의 종료시 MSC를 트립신 처리하고 그의 수를 계산하였다; ns = 유의하지 않음. B) MSC-뱅크의 10개의 MSC-냉동바이알을 해동시키고 2 계대에 걸쳐 증대시켜 그의 증식 가능성을 평가하였다. 계대 2의 종료시 모든 증대된 바이알의 평균 세포 수는 5.3x10⁸± 5x10⁷개 MSC이었다. C) MSC는 계대 당 대략 4배의 집단 배가(population doubling: PD)를 나타냈으므로, PD의 누적 수 (CPD)는 8.7 ± 0.4 PD이었다. D) MSC-최종 생성물이 불멸의 세포가 아니라는 것을 입증하기 위해, 본 발명자들은 12 계대에 대한 그의 성장 속도론을 평가하고 PD의 수를 추정하였다. 도에 나타낸 바와 같이 계대 9-12로부터 이들 MSC는 심지어 스스로를 복제할 수 없었다 (n=3).

도 6: MSC-최종 생성물 및 개개의 공여자로부터 생성된 MSC의 동종억제 가능성. A) 8개의 개개의 공여자뿐만 아니라 증대 전에 8개의 공여자의 MSC를 풀링함으로써 생성된 MSC-풀 (MSC-풀), 및 1개의 MSC 최종 생성물 (MSC-140)로부터의 계대 0의 MSC를 계대 2의 종료까지 증대시켰다. 그 후에, MSC를 트립신 처리하고, 배지 중에서 2회 세척하고, 트리판 블루에 의해 세포 수 및 생존율을 측정한 후에 이들을 사용하여 MLR-검정에서 그의 동종억제 가능성을 추정하였다. 6일째에 BrdU를 세포에 제공하고 그 다음날 검정을 수행하여 2개의 HLA-이종 공여자로부터의 동종 혈액 단핵 세포의 증식의 억제를 평가하도록 하였다. B) 6개의 MSC-최종 생성물 (임상 용량)을 해동시키고 세포를 세척한 후에 이들을 MLR-검정에 직접 사용하였다. 이들 실험의 목적은 환자에게 제공된 바와 같은 해동된 MSC-최종 생성물이 두 동종 MNC 공여자로부터의 단핵 세포의 알로겐-유도 증식을 억제할 수 있는지를 밝혀내는 것이었다.

도 7: 임상-규모 MSC-최종 생성물의 유전적 특성화. A) 계대 2의 종료시 임상-등급 MSC-최종 생성물의 정상 염색체도. B) 프로브 세트 5p15 (녹색) 및 5q35 (적색)의 2색 하이브리드화 후에 간기 핵은 염색체 5에 대한 정상 이배체 패턴을 확인하였다. C) MYC 분해 프로브의 3색 하이브리드화 후에 간기 핵은 거의 모든 세포에서 2개의 정상 융합 신호(fusion signal)를 나타냈다. D) 프로브 세트 5p15 및 5q35의 2색 하이브리드화 후에 정상 이배체 및 이수체 패턴을 가진 MSC의 수. 분석된 MSC의 총 수는 396이었다. E) 염색체 8q24에 대한 MYC 분해 프로브의 3색 하이브리드화 후에 정상 이배체 및 이수체 패턴을 가진 MSC의 수. 분석된 MSC의 총수는 356이었다.

도 8: MSC-최종 생성물의 키메라 분석 및 형질전환 유전자의 발현 A) 3 임상-규모 MSC-최종 생성물에서 세포 형질전환에 관여된 유전자의 RT-PCR 분석. 총 RNA를 3개의 MSC-최종 생성물로부터 및 1개의 공여자로부터의 MSC (대조군)로부터 단리하였다. cDNA로의 전사 후에 이를 사용하여 PCR에 의해 p21, p53 및 c-myc의 발현을 정량화하였다. B) 임상-규모 MSC-최종 생성물의 STR-PCR 분석. 임상-등급 MSC-최종 생성물의 MSC로부터 DNA를 단리한 다음에, 이를 사용하여 핵 DNA 상에서 발견되는 특이적 STR-영역을 평가하였다. 모든 8개의 공여자의 유전자형은 풀링된 MNC로부터 생성된 MSC-최종 생성물에서 표시되었다.

실시예

물질 및 방법

원료 수집

골수를 장골능으로부터 양측 천자에 의해 전신 마취로 흡입하였다. 골수를 골수 천자액의 ml 당 7-12% ACD-A 및 7-12 i.U.의 헤파린으로 항응고화하였다.

감염성 질환 시험

감염성 질환 마커 패널은 JACIE 및 독일 줄기 세포 법(German Stem Cell Act)의 최소 요건을 초과하였다. 따라서 공여자 워크-업의 일환으로서, HiV1/2, 항-HBc, HBsAg, 항-HCV, 항-HLVV1/2 (모두 IgM 및 IgG), 항-A형 간염 IgM, 항-톡소플라즈마 IgM, 항-EBV IgM, 항-CMV IgM 및 TPHA에 대한 혈청반응음성, 뿐만 아니라 NAT에 의한 HiV, HAV, HBV, HCV 및 ParvoB 19에 대한 음성(negativity)의 증거가 추구되었고; HiV1/2, 항-HBc, HBsAg, 항-HCV, CMV, TPHA 및 기재된 NAT에 대한 검사를 골수 기증일에 반복하였다. 모든 공여자가 기준을 충족하였다. 더욱이, CMV는 세포-정주 바이러스(cell-resident virus)이기 때문에, 골수 세포 펠렛에서의 CMV 게놈에 대한 음성이 추구되었다 (괴테 대학교의 바이러스학과, 및 바이오릴라이언스(Bioreliance), 영국 글래스고).

가공 설비

모든 공정은 독일 적십자 혈액 서비스(German Red Cross Blood Service)의 일부인 세포 치료/세포 프로세싱(Cellular Therapeutics/Cell Processing)의 부서 (GMP)의 클린 룸 스위트 (B에서 클래스 A)에서 전체 GMP 기준 하에 수행되었으며, 주 정부로부터의 공식 허가를 얻어, 그의 품질 관리 시스템에 전부 포함되었다 (§20b/c (BM 수집 및 시험) 및§13 (MSC 생성 및 시험) 독일 의약품 법(German Medicines Act)에 대한 제조 라이센스 승인(manufacturing licence acc.)).

골수 가공

제조업체에 의해 기재된 바와 같이 세팍스 II 니트셀 프로세스 (바이오세이프, 스위스)를 사용하는 피콜 (지이 헬쓰케어, 독일 뮌헨) 밀도 원심분리에 의해 골수 천자액으로부터 골수 단핵 세포가 농축되었다. 모든 연결은 멸균 튜브 용접 (TSCD, 테루모(Terumo), 독일 뒤셀도르프)에 의해 확립되어, 완전히 폐쇄된 공정이 사용되도록 하였다.

혈소판 농축물의 수집 및 혈소판 용해물 ( PL )의 생성

혈소판 용해물에 대한 출발 물질로서 PASIII 중 대략 10%의 혈장을 함유하는 1일 내지 2일된 연층(buffy coat) 풀 혈소판을 사용하였다. 혈액 생성물에 대한 독일 지침서에 따라 혈소판을 임상적 용도로 청소하였다. 최대 4-6 개의 혈소판 농축물을 풀링하여 1개 배치의 혈소판 용해물을 생성시켰다. 혈소판을 B 중 A 환경에서 멸균 50 ml 팔콘(Falcon) 튜브로 등분하고 -80℃에서 즉시 동결시켰다. 개개의 분취액을 적어도 24시간 후에 해동시키고 제동(brake) (가속(acceleration) 8, 제동 4)으로 3774 x g에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액 (혈소판 용해물)을 수집하고 MSC-증대 및 MSC를 위한 전구세포의 부착을 촉진하는 가능성 및 박테리아 (박트얼러트(BacTAlert), 바이오메리욱스(Biomerieux))로부터의 자유(freedom)를 포함한 연장 방출 시험을 실시하였다.

혈소판 용해물의 시험

a) MSC에 대한 전구 세포의 부착을 촉진하는 혈소판 용해물의 가능성

골수 단핵 세포 (BM-MNC)를 37℃에서 해동시키고, 5% PL로 DMEM으로 2회 세척하고 마지막 세척 후에 세포 펠렛을 5UI 헤파린/ml 및 5% 또는 10% PL로 보충된 DMEM 중에 재현탁시켰다. BM-MNC를 1.71x10e5/1cm2의 밀도로 플레이팅하고 포화 습도 및 5% CO₂로 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 비부착성 세포 분획을 제거하고, 한편 부착성 세포를 또 다른 11일 동안 추가로 배양하였다. 배양 배지를 3-4일마다 교체하였다. 일단 방추형 세포 (MSC)가 70-80%로 컨플루언트되면 이들을 트립신에 의해 효소적으로 분리하고 그의 수를 계수하였다. 이 절차를 배지 둘 다, 즉 5% PL 또는 10% PL 중 어느 하나로 보충된 DMEM으로 수행하였다.

b) MSC를 증대시키는 PL의 가능성

혈소판 용해물의 사양을 7일 내에 적어도 2-배에 의한 MSC의 냉동보존된 분취액의 증대, 박테리아로부터의 자유, 독일 지침서에 제시된 표준에 따르는 IDM으로서 설정하였다. 이들 기준을 충족시키는 혈소판만을 임상 MSC 프로토콜의 생성에 사용하였다.

MSC -뱅크 및 임상-등급 최종 생성물의 생성

a) MSC-뱅크의 생성

각각의 공여자로부터의 골수 단핵 세포를 함유하는 백을 + 37℃에서 플라즈마썸(Plasmatherm)에서 해동시켰다. 이들을 400 g에서 10분 동안 원심분리에 의해 5% PL로 보충된 DMEM으로 2회 세척하고, 규정된 부피의 DMEM+ 5% 혈소판 용해물에서 재현탁시켰다. 이 단계 후에, 각각의 공여자로부터의 세포 현탁액을 함께 풀링하고 세포 계수기 (시스멕스(Sysmex))에 의해 세포의 수를 계수하였다. 그 후에, 세포 현탁액 풀을 11개의 2-셀스택 (1개의 2-셀스택 당: 250x10e6 BM-MNC/260 ml 배지)에서 및 1개의 단일 셀스택 (1-셀스택 당: 125x10e6 BM-MNC/130 ml 배지)에서 플레이팅하였다. 72시간 후에, 배지 교환 백 (마코파르마(Macopharma), 독일 랑엔)을 사용하여 비부착성 세포를 제거하고 부착성 세포를 MSC가 80-90% 컨플루언트될 때까지 5% PL로 보충된 DMEM으로 또 다른 11일 동안 배양하였다. 이 기간에 배지를 3-4일마다 교체하였다. MSC의 분리 전 14일째, 각각의 셀스택으로부터 배양 배지 5 ml를 취하고 이를 호기성 및 혐기성 박테리아 및 진균에 대해 무균 검사될 무균 병에서 풀링하였다. 그 후에, 세포를 합성 TrypLE (라이프 테크놀로지즈(Life Technologies), 독일 다름슈타트)를 사용하여 이들을 분리하고 DMEM + 5% PL로 세척한 후에, 세포를 400 x g에서 7분 동안 원심분리하였다. 세포 펠렛을 규정된 부피의 배지 중에 재현탁시키고 세포를 혈구계에서 트리판 블루로 계수하였다. 본 발명자들은 총 320x10e6 계대 1 MSC를 수득하였다. 2백만개 세포를 유동세포계수법에 의하여 표현형을 결정하는데 사용하였다. 나머지 MSC를 400 x g에서 7분 동안 원심 분리하였다.

세포를 5% HSA/DMEM 중에 재현탁시켜 MSC의 수를 3x10e6 세포/ml로 조정하였다. 1 부피의 세포 현탁액을 20%DMSO/5%HSA/DMEM을 함유하는 1 부피의 냉 냉동 배지와 서서히 혼합하였다. 따라서, MSC의 최종 농도는 1.5x10e6/ml 세포 현탁액이었고, 한편 냉동배지의 최종 농도는 10%DMSO/5%HSA/DMEM이었다. 세포를 210개의 냉동바이알 (계대 1의 각각의 1.5x10e6 MSC)에 분배한 다음에, 확립된 프로토콜에 따라 크리오서브(Cryoserve) 제어-속도 냉동고 (독일 숄크리펜)를 사용하여 냉동보존하였다. 동결된 바이알을 액체 질소의 증기 상에서 보존하였다 (테크-랩(Tec-Lab,), 독일 이트슈타인)에 보관하였다. 게다가, 나머지 MSC를 냉동 배지와 혼합하여 무균 검사하였다 (호기성 및 혐기성 박테리아 및 진균).

b) 임상-규모 MSC-최종 생성물의 생성

임상-규모 MSC-최종 생성물을 생성하고 검증하기 위해, MSC-뱅크 바이알을 그의 냉동보존 후에 무작위 6-8 주마다 연속 해동시켰다. 37℃에서 해동시킨 후에, MSC를 10% PL을 함유하는 배양 배지에서 세척하여, 세포 계수 생존율을 혈구계에서 트립판 블루 염색을 사용하여 평가하였다. 1개의 MSC-뱅크 바이알의 세포를 1개의 1-셀스택 (636 cm²)에 플레이팅하고 헤파린 (5 IU/ml 배지) 및 PL 10%(V/V)로 보충된 DMEM으로 배양하였다. 배지를 4일째에 교체하고 6-7일째에 TrypLe를 사용하여 세포를 분리한 다음에, 2x10³개 세포 /cm²의 밀도로 계대 2로서 8개의 2-셀스택 (각각 1,272 cm²)에서 추가로 플레이팅하였다. 절차를 계대 1에 대해 반복하였고, 6-7일째에 MSC를 수확하였다. 0.5% HSA/0.9% NaCl로 세척한 후에, 생존가능한 MSC를 트립판 블루 염색에 의해 계수하였다. 추가로, 임상-규모 MSC를 최종 계대 2 MSC로서 냉동배지 (0.9% NaCl과 5% HSA 및 10% DMSO) 중에 재현탁시키고 45 ml 냉동 배지의 부피에서 각각 4,2 내지 5.5x10e7 MSC를 함유하는 4-7개의 냉동백에 분배하였다. 샘플을 확립된 프로토콜을 사용하여 크리오서브 제어-속도 냉동고 (독일 숄크리펜)를 사용하여 냉동보존하고 액체 질소의 증기 상에서 저장하였다 (테크-랩, 독일 이트슈타인).

품질 관리 검사

모든 검사는, 이들이 임상 적용을 위해 환자에게 투여되는 것인 상태로, 증대 없이 해동된 MSC-최종 생성물을 사용하여 수행하였다.

a) 해동된 MSC의 세포 수 측정(cell enumeration) 및 생존율

총 세포 수 측정은 노이바우어(Neubauer) 챔버 혈구계를 사용하여 수행되었다. MSC 생존율을 트립판 블루 염색을 사용하여 평가하였다.

b) 표현형 특성화

유동 세포 계측 분석을 MSC에 대한 ISCT 최소 기준을 사용하여 수행하였다. 해동된 MSC의 표현형을 결정하기 위해, 본 발명자들은 표 1에 제시된 바와 같이 하기 형광 염색체-접합 마우스 항-인간 모노클로날 항체를 사용하여 이들을 염색하였다.

d) MSC-최종 생성물의 동종억제 가능성의 평가

동종항원-구동된 반응에 대한 MSC-최종 생성물의 면역억제 효과를 시험하기 위해, 본 발명자들은 혼합 림프구 반응 (MLR)을 사용하였다. 건강한 비관련 공여자로부터의 말초 혈액 단핵 세포 (PB-MNC)를 피콜-구배 (밀도 1.077, 바이오크롬 카게(Biochrom KG), 독일 베를린)를 사용하여 단리하고, PBS로 2회 세척하고 10% FBS (인비트로겐(Invitrogen))를 가진 RPMI-1640 중에 재현탁시켰다. 2개의 비관련 공여자의 PB-MNC를 단독으로 (대조군) 또는 제3자, 치사적으로 조사된 (30 Gy) MSC-최종 생성물과 MSC:PB-MNC 비 1:1 (1×10⁵ MSC: 1×10⁵ PB-MNC)로 혼합하여 6일 동안 흑색 96-웰 플레이트에서 배양하였다. 본 발명자들은 발명자의 마스터 MSC-뱅크의 생성을 위한 공급원으로서 BM-MNC를 풀링하고 제공하는 모든 8개의 공여자의 MSC뿐만 아니라 해동 직후 6개의 MSC-최종 생성물을 평가하였다. 모든 MLR을 96-웰 플레이트에서 삼중으로 수행하였다. 6일째, 세포를 5-브로모-2'-데옥시우리딘 (BrdU) (로슈 다이아그노스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH), 독일 만하임)과 함께 24시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음 날, 루미노미터 1420 멀티레이블 카운터 빅터(Multilabel Counter Victor) 3 (퍼킨 엘머(Perkin Elmer), 독일 로트가우-유게스하임)으로 상대적 광량 단위 (RLU/s)를 측정하였다. PB-MNC의 증식 수준을 BrdU 검정을 사용하여 7일째 측정하였다. 동종 MNC의 증식에 대한 MSC-최종 생성물의 억제 효과는 다음 식을 사용하여 백분율로서 계산되었다: 100 - [(MSC 존재하에 동종 PB-MNC의 증식/MSC 없이 PB-MNC의 증식) × 100].

e) 시험관내 MSC-최종 생성물의 노화 측정

MSC-최종 생성물이 불멸의 세포가 아니라는 것을 입증하기 위해, 본 발명자들은 12 계대에 걸쳐 성장 속도론을 평가하였다. 각각의 계대에 대해 배지를 3-4 일마다 교체하고, 그의 증식 가능성에 따라 TrypLE에 의한 MSC의 분리를 수행하였다. 본 발명자들은 이들의 성장 속도론을 보다 정확하게 추정하기 위해, 다음 식을 사용함으로써 집단 배가 (PD)의 수를 계산하였다:

각각의 계대 배양에 대한 PD : [log10 (NH)-log10 (NI)]/log10(2); 여기서 NH = 세포 수확수, NI = 세포의 접종수.

f) MSC-최종 생성물의 분화 가능성

지방 형성과 골 형성에 따른 분화 가능성을 연구하기 위해, 계대 2의 MSC-2 최종 생성물을 해동시키고 제조업체의 설명서 (밀텐이 바이오텍 게엠베하(Miltenyi Biotec GmbH))에 따라 적절한 조직-특이적 유도 배지에서 직접 배양하였다.

지방 형성

지방세포를 생성하기 위해, 해동된 MSC의 수를 5 x 10e4 세포/1 ml의 NH 아디포디프(AdipoDiff) 배지로 조정하였다. 그 다음에, 1.5 ml의 이러한 세포 현탁액을 5% CO2 및 >95% 습도를 가진 인큐베이터에서 37℃에서 35 mm 세포 배양 접시에서 배양하였다. 배지를 3일마다 교체하고 2-3주 후에 큰 액포가 나타나기 시작하였다. 30일째에 지방세포는 둥글게 되고 지질 방울로 채워졌고, 본 발명자들은 이를 친유성 적색 염료인 오일 레드(Oil Red) O (밀리포어(Millipore), 독일 쉬발바흐)로 염색하였다.

골 형성

간단히 말하면, 해동된 MSC의 농도를 3 x 10e4 세포/1 ml의 NH 오스테오디프(OsteoDiff) 배지로 조정하였다. 그 다음에, 1.5 ml의 이러한 세포 현탁액을 5% CO2 및 >95% 습도를 가진 인큐베이터에서 37℃에서 35 mm 세포 배양 접시에서 배양하였다. 배지를 3일마다 교체하였다. 10일째에 골모세포는 그의 입방체 외관에 의해 그리고 새로 합성된 골 매트릭스와의 그의 회합에 의해 형태학적으로 확인될 수 있다. 이들 세포는 알칼리성 포스파타제 염색 (시그마(Sigma), 독일 다이젠호펜)에 의해 가시화되는데, 그 이유는 얽맨(committed) 골 형성 세포가 높은 수준의 이 효소를 발현시키기 때문입니다. 이 염색의 결과로서 골모세포는 짙은 자주색의 염색된 세포로서 나타난다. 조직-특이적 염색은 소프트 이미징 시스템 F-뷰 II(Soft Imaging System F-View II) 카메라 및 셀센스(cellSens) 차원 영상화 소프트웨어가 장착된 올림푸스 IX71 현미경을 사용하여 평가하였다.

g) 임상-등급 MSC-최종 생성물의 유전자 검사

임상-규모 MSC-최종 생성물의 형질전환 유전자의 발현에 대한 RT-PCR 분석.

RNeasy 미니 키트 (퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 RNA를 추출한 후에, 각각 제조업체의 설명서에 따라 무작위 헥사뉴클레오티드로 베르소(Verso) cDNA 키트 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 사용하여 1 ㎍의 총 RNA로 역전사시켰다. c-myc, p21, p53 및 GAPDH 유전자의 경우 실시간 PCR을 퀀티 텍트(Quanti Tect) SYBRE 그린 qPCR 마스터 믹스 (퀴아젠)를 사용하여 에펜도르프(Eppendorf) 리얼플렉스(realplex) 상에서 수행하였다. hTERT 및 ABL 유전자 전사의 검출은 앱솔루트(Absolute) qPCR ROX 믹스 (써모 사이언티픽)를 사용하여 바이오라드(Biorad) MyiQ 사이클러(Cycler) 상에서 수행하였다. 올리고뉴클레오티드를 유로핀즈(Eurofins) MWG에서 구매하였다. 반응 믹스 특이적 활성화 기간을 제외한 프라이머 서열 및 PCR 조건은 다른 곳에서 상세하게 공개되었다.

h) 계내 하이브리드화에서 간기 형광(Interphase fluorescence in situ hybridization: FISH)

염색체 5 및 8에 대한 다음 프로브를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 간기 FISH 분석을 수행하였다: 염색체 5p15 (hTERT) 및 5q35 (NSD1, 크레아테크(Kreatech), 네델란드 암스테르담)에 대한 2색 프로브뿐만 아니라 염색체 8q24 (MYC, 크레아테크, 네델란드 암스테르담)에 대한 3색 분해 프로브. 자동 스폿 카운팅 시스템(automatic spot counting system) (어플라이드 스펙트랄 이미징(Applied Spectral Imaging), 독일 에딩겐/넥카르하우젠) 상에서 하이브리드화 신호의 평가를 행하였다. 각각의 프로브에 대해 > 300 핵을 스캐닝하고 역치 5%를 사용하여 분류하였다.

문서화

MSC-세포 뱅크, 시험용 임상 견본 및 방출용 임상 견본의 생성에 앞서, 제조 지침서 (SOP), 배치 기록(batch record), 시험 지침서 및 프로토콜을 기반으로 하는 소규모 배양물에서 프로세스가 공식적으로 검증되었을 뿐만 아니라 사양도 공식적으로 정의되었다. MSC-세포 뱅크뿐만 아니라 임상 시험에서 사용하기 위한 임상 견본에 대한 제조 라이센스는 주 정부로부터 수득하였다. 품질 사양은 연방 의약품 국(Federal drug agency), 파울 에를리히 연구소(Pfaul Ehrlich Institute)로부터 얻은 정식 권고(formal advisory) 후에 설정되었다.

통계적 분석

그라프패드 프리즘(GraphPad Prism) 5 소프트웨어 (그라프패드 소프트웨어(GraphPad Software), 미국 캘리포니아주 샌디에이고)를 사용하여 통계적 유의성을 분석하였다. 스튜던트 t 검정 (Student's t test)을 사용하여 유의성을 평가하였다. 0.05 미만의 P 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

실시예 1: 8개의 건강한 제3자 공여자로부터의 골수의 수집 및 BM- MNC의 단리

서면 고지 동의서를 받은 후에, 각각의 골수 공여자로부터 헬싱키 선언에 완전한 합의로 지역 윤리 위원회의 승인으로 MSC 뱅킹을 위해 최대 250 ml의 추가적 골수 천자액을 수집하였다. 총 8개의 공여자로부터 본 발명자들은 1.66 리터의 골수를 수득하였다. 피콜-구배에 의한 골수 단핵 세포의 단리를 위해 본 발명자들은 도 1에 나타낸 바와 같이 세팍스(Sepax) 기계를 사용하였다. 이 단리 절차 후에 1 ml의 골수당 BM-MNC의 무명수(absolute number)는 3.3 x 10⁶ ± 6.3 x 10⁵개 세포이었다. 2회 세척 단계 후에 8개의 공여자로부터 수득된 BM-MNC의 총 수는 9.86 x 10⁹이었다. 이들 세포를 냉동배지 중에 재현탁시키고, 백에 분배하고, 이를 속도-제어 냉동고를 사용하여 동결시킨 다음에 액체 질소의 증기 상 중에 사용 때까지 저장하였다.

실시예 2: 골수 단핵 세포로부터 중간엽 기질 세포의 생성- MSC -뱅크의 확립

MSC-뱅크를 생성하기 위해, 8개의 공여자로부터의 골수 단핵 세포를 해동시키고, 세척하고 5% PL로 보충된 DMEM에서 풀링하였다. MSC의 전구 세포의 부착에 대한 혈소판 용해물의 최적 농도를 밝히기 위해, 본 발명자들은 PL 농도 5% 및 10%의 둘 다를 가진 BM-MNC를 배양하였다. 수득된 결과는 5% 농도의 혈소판 용해물이 10% 농도의 PL보다 BM-MNC의 촉진 및 MSC의 생성에 훨씬 더 효과적이라는 것을 입증하였다 (도 2A). 게다가, 본 발명자들은 이들 2가지 농도의 PL 중 어느 것이 MSC의 임상-규모 증대를 위해 보다 양호한 지를 확인하였다. 본 발명자들은 PL의 10% 농도가 5% PL보다 MSC를 증대시키는데 훨씬 더 효율적이라는 것을 밝혀냈다 (도 2B). 더욱이, 두 경우 모두에서 여과되지 않은 혈소판 용해물은 여과된 것들보다 MSC의 생성 및 증대에 더 효과적이었다 (도 2C). 이들 예비 실험은 MSC-뱅크를 확립하는 길을 마련하였다. 따라서, 본 발명자들은, 방법 섹션에서 기재된 바와 같이, 각각의 공여자로부터의 BM-MNC를 해동시키고, 2회 세척한 후에 이들을 함께 풀링한 후에 14일 동안 배양하였다. 본 발명자들은 9.89x10⁹개 BM-MNC로부터 계대 1의 3.2x 10⁸개 MSC를 생성시킬 수 있었다. 이들 MSC는 MSC의 전형적인 마커, 예컨대 CD73, CD90 및 CD105를 발현시켰으나, 조혈 세포 마커, 예를 들어 CD14, CD34, CD45에 대해서는 음성이었다. 이들은 HLA-클래스 II 항원을 발현시키지 않았으나 높은 수준의 HLA-클래스 I 항원을 발현시켰다. 트립판 블루 염색에 따르면 동결 전에 이들 MSC의 생존율은 95 ± 5%이었다.

총 수의 MSC를 각각 1.5x10e6 MSC P1을 함유하는 210개의 냉동바이알에 분하고, 사용 때까지 액체 질소의 기체 상 중에 최종적으로 동결시켰다. 본 발명자들은 바이알의 이러한 세트를 MSC 뱅크로서 지칭하였다.

실시예 3: 임상-규모 MSC -최종 생성물의 생성 및 검증

a) MSC-뱅크로부터 바이알의 해동

임상-규모 MSC-최종 생성물을 이들의 증식, 분화 및 동종억제 가능성에 관해 생성시키고 시험하기 위해, 본 발명자들은 이들의 냉동보존 후 6-8주에 발명자 뱅크로부터 3개의 무작위로 선택된 MSC-바이알을 해동시켰다. 3개의 해동된 바이알로부터 세포 평균 회수(mean average recovery)는 1.39x10⁶개의 생존가능한 세포/바이알 (범위 1.23x10⁶ 내지 1,48x10⁶)이었으며, 한편 생존율은 95,25% (범위 93,45%-96.9%)이었다. 평균적으로, 계대 2의 종료까지 2주에 걸친 이들 MSC의 증대로 470 x 10⁶개의 생존가능한 MSC (범위 420-548x10⁶ MSC)가 생성되었다. 이들 샘플을 사용 때까지 백에서 동결시키고 임상-규모 MSC-최종 생성물로서 지칭하였다.

b) MSC-최종 생성물의 면역표현형 분석 및 그의 분화 가능성

계대 2의 종료시 임상 최종 생성물의 MSC는 조혈 마커 CD45, CD14, CD34에 대해서는 음성이었고, HLA-DR을 발현시키지 않았다. 그러나, 이들은 높은 수준의 전형적인 MSC-마커, 예컨대 CD73, CD90 및 CD105를 발현시켰다. 이들은 또한 조직-특이적 배지에서 골모세포 및 지방세포를 따라 분화할 수 있었다 (도 4).

d) MSC의 증식 속도론 및 노화

발명자의 MSC-뱅크를 확립하기 위해 8개의 공여자로부터의 골수 단핵 세포를 풀링하는 이론적 근거를 입증하기 위해, 본 발명자들은 8개의 개개의 공여자로부터의 MSC의 시험관내 성장을 동일한 계대 내에 P2 및 4개의 MSC-최종 생성물 내에 각각의 공여자로부터의 풀링된 MSC의 성장과 비교하였다 (도 5A). 예상대로, 각각의 골수 공여자의 MSC는 0.3 x 10⁶ (공여자 7)에서 1.7 x 10⁶개 MSC (공여자 5)까지 상이한 성장 속도론을 나타냈다. 8개의 공여자의 풀링된 BM-MNC로부터 생성된 MSC-생성물의 평균 증식 속도론은 1.0 x 10⁶ ± 0.5x10⁶개 MSC이었으며, 이는 8개의 공여자의 개개의 MSC의 풀로부터 생성된 MSC의 수, 즉 1.1 x 10⁶와 놀랄만큼 양호한 상관관계가 있었다. 보다 흥미롭게도, 두 값 모두 계대 내에 4개의 MSC-최종 생성물의 증대로부터 수득된 MSC의 평균 수, 즉 1.085x10⁶ ± 0.1x10⁶개 MSC와 매우 잘 상관관계가 있었다. 이들 결과는 BM-MNC를 풀링함으로써 양호하고 불충분하게 증식하는 MSC의 "산술 평균"을 생성시키는 것이 가능하다는 발명자의 가정을 입증하였다.

MSC-뱅크로부터의 각각의 MSC-최종 생성물이 거의 동일한 증식 가능성을 보유한다는 기대를 시험하기 위해, 본 발명자들은 이를 임상 적용을 위해 P0에서 계대 2의 종료까지 MSC-뱅크의 증대된 10개의 분취액 중에서 분석하였다. 도 5B에 도시된 바와 같이, 계대 2의 종료시 모든 증대된 최종 생성물의 평균 세포 수는 5.3x10⁸ ± 5x10⁷개 MSC이었으며, 이는 최종 생성물의 고도로 동질의 증식 가능성을 나타내는 것이다. 마찬가지로, P1과 계대 2의 종료시의 집단 배가의 수는 꽤 동일하고 (4.3 PD/계대), PD의 누적 수는 값 9 (8.7±0.4)를 넘지 않았다. MSC가 불멸하지 않는 지를 시험하기 위해 본 발명자들은 12 계대에 걸쳐 발명자의 MSC-뱅크로부터의 3개의 MSC-최종 생성물을 증대시켰다. 도 5D에 나타낸 바와 같이, 계대 5에서 12까지 MSC는 복제적 노화를 겪고 PD의 수가 지체 없이 감소하며, 이는 이들 세포가 실제로 노화를 나타내며 무한정 증식하지 않음을 나타내는 것이다.

e) 혼합 림프구 반응 (MLR)으로 MSC-최종 생성물 및 개개의 공여자로부터 단리된 MSC의 동종억제 가능성

MSC는 시험관내 또는 생체내 중 어느 하나에서 동종억제 특성을 발휘하는 것으로 나타났다. 8개의 공여자의 BM-MNC의 풀로부터 생성된 MSC가 개개의 공여자로부터 생성된 MSC의 평균 동종억제 가능성보다보다 더 높은 동종억제 가능성을 가질 수 있다는 발명자의 가정을 시험하기 위해, 본 발명자들은 MLR에서 8개의 개개의 공여자뿐만 아니라 증대 전에 8개의 공여자의 MSC를 풀링함으로써 생성된 MSC-풀 (MSC-풀), 및 1개의 MSC-최종 생성물 (MNC-풀 유래 MSC-뱅크로부터 생성됨: MSC-140)로부터의 계대 2의 증대된 MSC를 사용하였다. 예상대로, 개개의 MSC의 동종억제 가능성은 매우 이질적이었으며, 즉, 이들 MSC는 2개의 HLA-이종 공여자로부터 혈액 MNC의 동종항원-유도 증식을 완전히 상이하게 억제하였다. 이 효과는 20% (공여자 1 및 8)에서 약 80% 억제 (공여자 2 및 3)의 범위이었다 (도 6A). 8개의 공여자로부터의 MSC의 풀 (MSC-풀)로부터 생성된 MSC의 동종억제 가능성은 함께 8개의 공여자로부터의 MSC의 평균 억제 가능성 (8개의 공여자의 평균)과 동일하였다. 그러나, 발명자의 MSC-뱅크로부터의 증대된 MSC-140 샘플의 동종억제 가능성은 함께 8개의 공여자로부터의 MSC의 평균 동종억제 가능성 및 MSC-풀의 것보다 유의하게 높았다 (P<0.001, P<0.01, 각각). 해동 후에 발명자의 MSC-임상 제품이 동종반응을 억제하는데 동질한 지를 평가하기 위해, 본 발명자들은 MSC를 가진 6개의 백업 바이알을 해동시키고, 이들은 생체내 환자에게 투여되므로, MLR 검정에서 직접 시험하였다. 도 6B에 나타낸 바와 같이, 모든 이들 6개의 임상 MSC-생성물은 시험관내에서 일정한 동종억제 효과를 나타냈고, 이는 동종반응을 억제하는 데 있어서 그의 매우 동질의 가능성을 나타내는 것이다. 여기서 사용된 표적-작동인자 비의 평균 동종억제 가능성은 52%±8.7%이었다.

실시예 4: 임상-등급 MSC -최종 생성물의 유전적 특성

시험관내 배양은 대개 배양된 세포의 염색체 이상(chromosomal aberrations)의 근원일 수 있으므로, 본 발명자들은 발명자의 임상-등급 MSC-최종 생성물이 그러한 변화에 적용되는 지를 확인하였다. 대략 350-400개 밴드의 분해능(resolution)을 가진 25개의 MSC-유사 분열의 염색체 분석에 의하면 이들 모두에서 정상적인 수의 염색체 (배수체)가 나타냈다 (도 7A). 그러나, 대략 300개 밴드의 분해능을 사용함으로써 본 발명자들은 25개의 분석된 유사 분열 중 4개에서 염색체 5의 짧은 아암과 염색체 9의 짧은 아암 사이의 전좌를 밝혀냈다. 분해점(breakdown point)은 밴드 5p13과 19p13.3에 국한되었다. 염색체 5p15 (hTERT) 및 5q35 (NSD1)에 대한 2색 프로브뿐만 아니라 염색체 8q24에 대한 3색 분해 프로브를 사용하는 계내 하이브리드화에서 형광 (FISH) 분석에 의하면 발명자의 MSC-뱅크로부터의 대다수의 임상-등급 MSC-최종 생성물은 염색체 둘 다에 대해 정상 이배체 패턴을 보유하는 것으로 나타났다 (도 7B, C). 프로브 세트 5p15 (녹색)와 5q35 (적색)의 2색 하이브리드화 후에 간기 핵은 97.2%의 세포가 염색체 5에 대해 정상 이배체 패턴을 나타내고 단지 약 2.8%가 사배체 하이브리드화 패턴을 나타냄을 확인하였다 (도 7D). 마찬가지로, MYC 분해 프로브의 3색 하이브리드화 후의 간기 핵 (도 7C)은 97%의 MSC에서 염색체 8q24에 대한 2개의 정상 융합 신호 및 MSC의 3%가 사배체 신호 패턴을 가짐을 나타냈다 (도 7E). 따라서, MSC의 매우 작은 분획은 시험관내에서 염색체 이상을 획득한다.

3개의 임상-규모 MSC-최종 생성물에서 p53, p21 및 Myc 유전자 발현의 분석에 의하면 p21의 발현이 2 내지 5-배 증가하고, p53 유전자 발현이 약 6 내지 10-배 감소하였고, 원발암유전자 c-myc의 발현은 없는 것으로 나타났다 (도 8A). 가장 중요하게는, 발명자 뱅크로부터 MSC의 노화 거동과 일치하여, 본 발명자들은 3개의 MSC-최종 생성물 중 어떤 것도 hTERT를 발현시키지 않았음을 입증하였다 (데이터는 표시되지 않음).

발명자 뱅크의 MSC가 8개의 제3자 공여자의 BM-MNC의 풀로부터 생성되었기 때문에, 본 발명자들은 MSC의 생성 후에 각각의 공여자의 상대적 기여도에 관심이있었다. 일련의 유전자 마커를 사용하는 STR-PCR에 의한 키메라 분석에 의하면 임상-규모 MSC-최종 생성물 내에 상이한 비율로 8개의 공여자가 존재하는 것으로 나타났다 (도 8B). 원칙적으로, 개개의 공여자로부터 생성된 MSC, 즉 개별적으로 보다 양호하게 증대된 MSC의 증식 가능성과 상관관계가 있는 임상 제품 중의 존재의 백분율이 또한 MSC-최종 생성물에서 보다 높은 비율로 밝혀졌다.

실시예 5: 본 발명의 MSC 제제로 치료된 환자의 임상 사례

환자 1 1999년 3월 26일 출생

장애: 종증성(major) 지중해 빈혈

줄기 세포 이식을 받은 후에 환자는, 아마도 이식편 대 숙주 질환 (GvHD)의 맥락에서, 면역 다발장막염으로 인한, 복수, 관절의 팽창, 심낭 삼출이 생겼다. 본 발명의 MSC의 투여는 합병증 없이 1회 진행되었다. 이뇨제와의 병용 치료 하에 복수, 관절의 팽창 및 심낭 삼출이 사라졌다

환자 2 2009년 12월 20일 출생

장애: 중증 무과립구증

줄기 세포 요법 (SCT) 후 12 일째에, 환자는 2 mg/kg의 스테로이드와 55 mg/kg의 모페틸마이코페놀라트를 매일 투여하는 경우 조차도 제어할 수 없는 피부의 급성 전격성 GvHD (등급 IV)를 나타냈다. 2012년 11월 22일에 아동은 본 발명의 MSC를 받았다.

MSC 요법 후에 GvHD는 MSC 투여의 28일 후에 더 이상 검출될 수 없을 때까지, 서서히 그러나 끊임없이 감소하였다. 아동은 MSC를 매우 잘 견뎠으며 투여 후 30일 내에 어떤 바이러스성, 박테리아성 또는 진균 감염도 나타내지 않았다.

환자 3 2010년 3월 25일 출생

장애: 급성 림프구성 백혈병;

SCT는 HLA-비동일성, 관련 공여자로부터 2012년 10월 16일에 행해졌다. 이미 SCT 후 +14일째에, 장 내에서 GvHD의 첫 징후가 나타났다. 모페틸마이코페놀레이트 및 스테로이드를 이용한 즉각적인 치료가 시작되었다. 그로 인해 증상이 상대적으로 개선되었다. 그러나, SCT 후 +35일째에, 장기적인 스테로이드 투여에도 불구하고 장내 GvHD 등급 II가 남아 있었다.

따라서 본 발명의 MSC의 투여에 의한 면역억제 요법을 통합하기 위한 결정이 내려졌다. MSC 투여는 2012년 12월 21일에 합병증 없이 진행되었다. SCT 투여 후에 30일 내에 아무런 감염도 나타나지 않았다. 2013년 1월 15일에 환자의 장내 GvHD의 어떤 징후도 관찰될 수 없었고, 어떤 치료도 필요하지 않은 피부의 단지 약간의 GvHD가 남았다.

환자 4 1999년 3월 25일 출생

장애: 급성 골수성 백혈병;

HLA - 비동일성, 관련 공여자로부터 2012년 9월 19일에 행해진 SCT

줄기 세포 이식 후 5개월에, 환자는 스티븐스-존슨(Stevens-Johnson) 증후군의 임상 증상이 생겼다. 판독 당시에 환자는 이러한 임상적 양태(clinical picture)의 발생과 연관된 여러 약물을 복용했기 때문에, 각각의 약물 치료가 종료되었다 (보리코나졸, 페니실린, 코-트리목사졸). 아데노바이러스 감염의 검출로 인해, 글루코코르티코이드를 이용한 면역억제 치료를 하지 않기로 결정되었다. 환자는 또한 스티븐스-존슨 증후군에 의해 아마도 자극을 받은 전형적 GvHD 피부 병변이 생겼다. 따라서, CSA를 이용한 면역억제 치료가 개시되었다. 염증 현상(inflammatory event)을 완화시키기 위하여, 본 발명의 MSC를 투여하였다. 이러한 MSC 투여는 잘 견뎌졌다. 또한 글루코코르티코이드-함유 크림을 하루에 수회 투여하였다. 이러한 요법 하에, GvHD 피부 병변의 거의 완전한 치유가 있었다.

Claims

적어도 2개의 유전적으로 구별되는 공여자로부터 수득된 골수 샘플을 풀링하여 샘플 세포-풀(cell-pool)을 수득한 후에, 상기 샘플 세포-풀로부터 중간엽 기질 세포 (MSC)를 단리하는 것을 포함하는, MSC의 시험관내 단리 방법.
제1항에 있어서,
(a) 적어도 2개의 유전적으로 구별되는 공여자로부터 수득된 다수의 골수 샘플을 제공하는 단계,
(b) 상기 골수 샘플을 풀링하여 샘플 세포-풀을 수득하는 단계,
(c) 임의적으로, 상기 샘플 세포-풀을 배양하는 단계, 및
(d) 단계 (b)에서 수득된 상기 샘플 세포-풀로부터 상기 중간엽 기질 세포를 단리하는 단계
를 포함하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 골수 샘플이 포유동물 골수 샘플이고 상기 중간엽 기질 세포가 포유동물 중간엽 기질 세포이고; 바람직하게는 여기서 상기 골수 샘플이 인간 골수 샘플이고 상기 중간엽 기질 세포가 인간 중간엽 기질 세포인 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골수 샘플이 골수 단핵 세포 샘플인 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골수 샘플이 적어도 3, 보다 바람직하게는 적어도 4, 보다 바람직하게는 적어도 5, 보다 바람직하게는 적어도 6, 보다 바람직하게는 적어도 7, 가장 바람직하게는 적어도 8개의 유전적으로 구별되는 공여자로부터 수득되는 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 중간엽 기질 세포를 저장하거나 상기 단리된 중간엽 기질 세포를 증대시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
골수 단핵 세포 (BM-MNC)로부터 단리된 중간엽 기질 세포 (MSC)를 포함하는 MSC 제제로서, 상기 MSC 제제가 hTERT 음성이고 다유전자성임을 특징으로 하는, MSC 제제.
제7항에 있어서, 상기 MSC 제제가
(a) 적어도 95%의 CD73+ 세포, 1
및/또는
(b) 적어도 95%의 CD90+ 세포, 1
및/또는
(c) 적어도 95%의 CD105+ 세포, 1
및/또는
(d) 적어도 95%의 HLA-클래스 I+ 세포, 1
및/또는
(e) 1% 미만의 CD45+ 세포,
및/또는
(f) 1% 미만의 CD14+ 세포,
및/또는
(g) 1% 미만의 CD34+ 세포,
및/또는
(h) 5% 미만의 HLA-DR+ 세포
를 포함하는 MSC 제제.
제8항에 있어서, (a), (b) 및 (c), 및/또는 (e), (f) 및 (g)를 포함하는 MSC 제제.
제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능한 MSC 제제.
적어도 2개의 일유전자성의 유전적으로 구별되는 골수 샘플을 풀링한 후에 상기 골수 샘플에 함유된 기질 세포 분획을 단리하고/거나 증대시킴으로써 수득가능한, 적어도 2개의 유전적으로 구별되는 골수 공여자로부터의 골수 샘플을 포함하는 세포 조성물.
중간엽 기질 세포를 단리하는 방법에서, 적어도 2개의 유전적으로 구별되는 골수 공여자로부터 수득된 골수 단핵 세포의 혼합물 또는 제11항에 따른 세포 조성물의 용도.
제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 의약에서 사용하기 위한 MSC 제제.
자가면역 질환, 예컨대 다발성 경화증, 제1형 당뇨병, 류마티스 관절염, 포도막염, 자가면역 갑상선 질환, 염증성 장 질환 (IBD), 경피증, 그레이브스병, 루푸스, 크론병, 자가면역 림프증식성 질환 (ALPS), 탈수초성 질환, 자가면역 뇌척수염, 자가면역 위염 (AIG), 자가면역 사구체 질환, 바람직하게는 이식편 대 숙주 질환 (GvHD)의 치료에서 사용하기 위한, 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 MSC 제제 또는 제11항에 따른 세포 조성물.