CN104487568B - 人胚胎干细胞衍生的间充质样干细胞、方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供的公开内容一般涉及间充质样干细胞“hES‑T‑MiSC”或“T‑MSC”和生产所述干细胞的方法。所述方法包括在以下所述条件培养胚胎干细胞：胚胎干细胞经过中间产物滋养细胞分化而发育，并且培养所述分化的滋养细胞进而向hES‑T‑MSC或T‑MSC分化。也描述了T‑MSC衍生的细胞或细胞系“T‑MSC‑DL”。在此还公开的是溶液和药物组合物，其包括所述的T‑MSC和/或T‑MSC‑DL、制备所述T‑MSC和/或T‑MSC‑DL的方法和使用所述T‑MSC和T‑MSC‑DL治疗和预防疾病的方法，特别是，T‑MSC和T‑MSC‑DL被用作免疫抑制剂来治疗多发性硬化症和自身免疫性疾病。

Description

人胚胎干细胞衍生的间充质样干细胞、方法及其应用
相关应用的参考
本发明要求2012年7月11日提交的美国临时专利申请61/670,192的优先权和2012年8月17日提交的美国临时专利申请61/684,509的优先权。在此以其整体引入作为参考。
1.引言
本文提供的公开内容大体来说涉及间充质样干细胞“hES-T-MSC”或“T-MSC”和制备所述干细胞的方法，所述方法包括在以下条件下培养胚胎干细胞：胚胎干细胞经过中间产物滋养细胞分化而发育，并由滋养细胞向hES-T-MSC或T-MSC分化。本文公开的内容是T-MSC、溶液、药物组合物(包括T-MSC)、制备T-MSC的方法、使用T-MSC治疗和预防疾病的方法，特别是，使用T-MSC作为免疫抑制剂治疗多发性硬化症和其它自身免疫性疾病，应用于组织再生和/或修复，以及使用所述T-MSC穿过血脑屏障以及血脊髓屏障以递送药物的方法。本文公开的内容也包括使用T-MSCs调节免疫系统、抑制对个体自身抗原的免疫反应以及修复受损的中枢神经系统。本文公开的组合物包括用于免疫调节的T-MSCs，因为通过修饰基因的表达提供免疫抑制能力得到提高的修饰的T-MSC。
2.背景技术
人间充质干细胞/基质细胞已被广泛应用于免疫系统调节和组织修复。人胚胎干细胞可作为可靠的来源以诱导产生高质量的人间充质干细胞。目前已经有多种方法诱导人胚胎干细胞向间充质细胞分化，然而目前所用的方法并不能以高效率诱导得到高产量、高纯度的间充质干细胞。
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)，是一种来源于成体小鼠和人类骨髓、脐带脂肪等组织、具有多向分化潜能的成体干细胞，这种干细胞在特定条件下能够诱导发育成脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、神经细胞、成肌细胞、基质细胞和成纤维细胞等成熟细胞。这些诱导技术非常成熟并且受到专利的保护。例如，参照美国专利号5,486,359(人间充质干细胞)。
然而，当前可利用的成体组织来源的间充质干细胞存在着一些缺陷。第一，供体组织如骨髓来源有限并且质量不一，限制了MSCs的研究和应用，以及阻碍MSCs作为医药产品大规模临床使用的标准化。第二，来源于成体组织的MSCs是高度复杂的细胞群，只有其中一部分细胞具有强大的免疫抑制能力。临床应用需要大量的MSCs，通常需要进行体外扩增MSCs，然而体外扩增下降MSCs的免疫抵制和归巢能力(Javazon et al.，2004)。第三，临床应用成体来源MSCs存在安全问题如恶性转化(Wong，2011)以及供体潜在传染性病原体的传播。
为克服以上缺陷，科学家试图通过不同方法将hESCs诱导分化为MSCs，其中包括hESCs与小鼠骨髓基质细胞OP9共培养、使用多重细胞因子和化学试剂诱导并且手动挑选(Barberi et al.，2005；Chen et al.，2012；Liu et al.，2012；Sanchez et al.，2011)。近来研究报道，TGFβ信号通路抑制剂SB431542被应用于诱导hESCs分化为MSCs，该方法简化诱导流程并且提高诱导效率(Chen et al.，2012)，然而MSCs的产量和纯度都很低(参见以下对照试验)。在2010年，先进细胞技术公司的发明者研制出另一种方法，诱导成血管细胞分化为MSCs，尽管该方法使用许多昂贵的细胞因子以及甲基纤维素培养基，但是诱导效率仍然很低。
目前所知的hESCs诱导为MSCs的多种方法具有一种或多种缺点和弱点。其中，hESCs和OP9细胞共培养的诱导方法具有耗时长、产量低、纯度低、使用动物的饲养层细胞和不明确的培养条件等缺点(Barberi et al.，2005)；从重铺板的hESCs形成拟胚体周围过度生长细胞中分化的方法，具有耗时长、细胞产量低、培养条件不明确以及花费昂贵等缺点(Olivier et al.，2006)；从培养在胶原包被平板上的hESCs分化方法具有产量低、培养条件不明确以及耗时长等缺点(Liu et al.，2012)；利用TGFβ信号通路抑制剂处理hESCs的分化方法具有纯度低、产量低、耗时长以及所获得的MSCs免疫抑制能力低下等缺点(Chen etal.，2012；Sanchez et al.，2011)。因此，迫切需要无限制、实全、高稳定性、高诱导效率和相同来源的MSCs治疗和预防各种疾病。
多发性硬化症(Multiple sclerosis，MS)是一种慢性的自身免疫性疾病，发病原因为外围的免疫细胞通过损伤的血脑屏障或血脊髓屏障渗透进入中枢神经系统，导致神经轴突周围的髓鞘发生炎症以及脱髓鞘和轴突形成疤痕(McFarland and Martin(2007))。据美国国家多发性硬化症协会统计，目前美国食品及药物管理局批准治疗多发性硬化症的药物超过70种，包括阿沃纳斯(Avonex，IFNβ-1a)、倍泰龙(Betaseron，IFNβ-1b)、芬戈莫德(Gilenya，鞘氨醇1-磷酸受体调节物)、醋酸格拉替雷(Glatiramer acetate或Copolymer1)、那他珠单抗(Tysabri，人源化的α-整合蛋白抗体)。然而，这些药物仅能缓病情并且产生严重的副作用，包括感染增强、心脏病发作、中风、进行性多病灶脑白质病、心律失常、疼痛、抑郁、疲劳、黄斑水肿和勃起功能障碍(Johnston and So(2012)；Weber et al.(2012))。
由于间充质干细胞具有免疫调节和神经再生的功能(Auletta等，(2012)；Pittenger等，(1999))以及修复血脑屏障的潜能(Chao等，(2009)；Menge等，(2012))，因此移植MSCs治疗多发化硬化症成为一种潜在的、非常具有吸引力的疗法。MSCs具有多能性，能够诱导产生多种细胞系，包括脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞和神经元。MSCs存在于胚胎、新生儿和成体的羊膜、脐带、骨髓和脂肪等组织中。与当前的药物效法相比，MSCs具有多种独特的优点，例如，它们可以做为多重的和潜在的协同治疗因子的载体、以及迁移至损伤的组织通过分泌作用和细胞相互接触发挥局部效应(Uccelli和Prockop(2010a)。重要的是，MSCs已被证明能够可以治疗小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎，这是一种公认的多发性硬化症小鼠模型(Gordon等，2008a；Gordon等，(2010)；Morando等，(2012)；Peron等，(2012)；Zappia等，(2005)；Zhang等，(2005))，同时，MSCs也应用于多发性硬化症的临床试验(Connick等，(2012)；Karussis等，(2010)；Mohyeddin Bonab等，(2007)；Yamout等，(2010))。由于小鼠和人骨髓来源间充质干细胞(bone marrow-derived MSC，BM-MSC)都能够有效减缓小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎恶化，因此，MSCs异种移植并不是问题(Gordon等，(2008a)；Gordon等，(2010)；Morando等，(2012)；Peron等，(2012)；Zappia等，(2005)；Zhang等，(2005))。然而，BM-MSC治疗小鼠EAE模型在不同的报道中疗效不一(Gordon等，(2008a)；Payne等，(2012)；Zappia等，(2005)；Zhang等，(2005))，进而引发对BM-MSC治疗MS功效的怀疑。
因此，迫切需要无限制、实全、高稳定性、高诱导效率和来源一致的MSCs治疗和预防MS以及其它疾病。本文揭示通过一种高效的方法诱导hES分化成hES-T-MSCs，该方法满足以上要求。本文还揭示的内容是通过微阵列分析和其它分析，鉴定hES-T-MSC与BM-MSC相比较的在多个关键因子的不同表达模式，以及hES分化成MSCs的其它方法。
3.发明概述
本文公开了一种通过滋养细胞诱导中间步骤由hESCs衍生间充质样干细胞的方法。通过这种方法获得的间充质干细胞称为“hES-T-MSC”或“T-MSC”。T-MSC经诱导后能分化成脂细胞、成肌细胞、神经元细胞、成骨细胞、成纤维细胞、软骨细胞、间质细胞等多种细胞或细胞系。T-MSC分化的细胞或细胞系称之为“T-MSC衍生的谱系”或“T-MSC-DL”。
本文公开了包括T-MSC和/或T-MSC-DL的组合物，它们都具有免疫抑制的性能。本文公开了基于能够调节免疫应答而选择的T-MSC和/或T-MSC-DL细胞群，和具有调节免疫性能的组合物。本文也公开了，与BM-MSC相比较，具有更强的免疫抑制能力的T-MSC和/或T-MSC-DL。
本文公开了一种能够有效地获得高纯度和高产量的T-MSC的方法。和以前的报道方法相较，所述方法需要更少步骤和更少分化因子。
本文公开了使用人胚胎干细胞(hESCs)通过滋养细胞的中间分化衍生间充质样干细胞的方法。所述滋养层来源的MSC称为“hES-T-MSC”或“T-MSC”。该T-MSC被应用于调节免疫系统。例如，它们能够通过阻遏免疫细胞诱发中枢神经系统的损伤，从而高效地治疗多发性硬化症。
本文公开了由本文公开方法生产的人胚胎衍生的间充质干细胞。
本文公开了诱导T-MSC分化为T-MSC-DL的方法。
本文也公开了应用T-MSC和/或T-MSC-DL治疗哺乳动物特别是人受试者的多发性硬化症以其它人类自身免疫性疾病。
本公开发明的另一个目的是提供一种细胞产品T-MSC以应用于免疫调节。例如，在组织或器官移植中阻止或抑制免疫排斥。所述方法的另一个具体实施例是下调或抑制免疫应答，所述免疫应答是移植物抗宿主病。在另一个具体实施例中，所述免疫应答是自身免疫性疾病，例如糖尿病、红斑狼疮或风湿性关节炎。
本公开发明的进一步目的是提供用于治疗神经系统疾病的细胞产品T-MSC-DL。
所述方法可以采用足够多本文提供的间充质干细胞在免疫应答中产生可检测的抑制作用。例如，用于接触多种免疫细胞的多种本文提供的干细胞可包括1×105T-MSC、1×106T-MSC、1×107T-MSC、1×108T-MSC或更多。
在一个实施方式中，本文所述方法是一种从hESCs衍生(在这里也指生产)MSCs新方法。该方法包括以下步骤：
a.人胚胎干细胞培养在含有至少一种细胞因子的无血清培养基中，该培养基所含的细胞因子量足够诱导胚胎干细胞向滋养细胞分化。在一个实施方式中，分化为滋养细胞的周期需要约2-5天。在一个实施例中，培养基中包含BMP4，同时在TGFβ抑制剂(也就是SB431542、A83-01或ALK5抑制剂等等)存在或不存在的情况下，以提高分化效率。
b.添加至少一种生长因子至含有滋养细胞的培养物中，并且在无血清培养中继续培养，其中所述生长因子的量足够扩增滋养细胞。在一个实施方式中，培养基含有BMP4(这一步骤是任选的)。
c.分离滋养细胞，然后将该细胞重新铺至明胶、层粘连蛋白、纤连蛋白、胶原或基质胶包被的平板上，并且培养在含有或不含有血清的培养基，此培养基的量足够促进滋养细胞通过前-T-MSC向T-MSC细胞分化。在一个实施方式中，分离的滋养细胞培养4-10天后产生T-MSC细胞，其中至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％的细胞表达成体间充干细胞的表面标记。在一个实施方式中，培养基中包含LIF、bFGF或PDGF以提高扩增效率。
在一个具体的实施方式中，人胚胎干细胞衍生的滋养细胞表达Trop-2，但不表达CD73。
在一个具体的实施方式中，前-T-MSC表达Trop-2和/或CD73。
在一个具体的实施方式中，所述T-MSC表达CD73、CD105和CD90。本公开方法的一个目的是诱导hESCs分化为高纯度的MSCs。在一个优选的实施方式中，CD73+、CD105+和CD90+的T-MSC纯度高于90％、95％、96％、97％、98％和99％。
通过检测发现，高比例的T-MSC细胞表达成体间充质细胞的表面标记，证明T-MSC具有很高的纯度。无论在体内或体外，所述间充质干细胞比其它方法获得的间充质干细胞具有更高的免疫抑制能力。当前公开方法衍生的间充质干细胞被命名为人胚胎干细胞－滋养细胞－衍生的间充质干细胞(hES-trophoblast-derived MSCs)和更简洁的称之T-MSC。
在某些实施方式中，所述含血清培养基包含胎牛血清或人AB血清，并添加谷氨酰胺。所所述无血清培养基含有去除血清替代物(knockout serum replacement，KOSR)或牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)。
在某些实施方式中，有一个额外的步骤，该步骤使用从1gy至200gy不等的γ射线辐射获得的T-MSC。
在本发明的另一个的实施方式中，所述的方法能够产生并扩增得到至少10000个T-MSC、至少50000个T-MSC、至少100000个T-MSC、至少500，000个T-MSC、至少1×106个T-MSC、至少5×106个T-MSC、至少1×107个T-MSC、至少5×107个T-MSC、至少1×108个T-MSC、至少5×108个T-MSC、至少1×109个T-MSC、至少5×109T-MSC或至少1×1010T-MSC。这些方法可以获得10000至100亿个T-MSC细胞。在某些实施方式中，至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％人胚胎-间充质干细胞表达一种或更多种hES-MSC差异标记。在某些实施方式中，所述标记是CD73、CD90和CD105。
在一个实施方式中，所述T-MSCs显著性地降低EAE小鼠的疾病评分，同时伴随着减少的脱髓鞘、T细胞渗入和小神经胶质的反应。另外，在体内和体外与骨髓来源间充质干细胞(bone marrow derived MSCs，BM-MSC)相比较，T-MSCs具有更强的免疫抑制活性。还提供了在T-MSC和BM-MSC之间差异表达的关键蛋白质/分子。本文提供了通过测量蛋白质/分子标记的表达水平鉴定具有改善的免疫抑制活性的T-MSCs的方法。还提供了遗传修饰以提高T-MSCs的免疫抑制活性的方法。
本发明的另一个实施方式是一种包含T-MSC的溶液，T-MSC至少包括至少10000个T-MSC、至少50000个T-MSC、至少100000个T-MSC、至少500000个T-MSC、至少1×106个T-MSC、至少5×106个T-MSC、至少1×107个T-MSC、至少5×107个T-MSC、至少1×108个T-MSC、至少5×108个T-MSC、至少1×109个T-MSC、至少5×109T-MSC或者至少1×1010T-MSC。
在某些实施方式中，2ml体积的培养物中包含至少10000个细胞，10ml体积的培养物中包含至少100000个细胞，100ml体积的培养物中包含至少1000000个细胞，1000ml体积的培养物中包含至少10000000个细胞，以及4000ml培养基中达到5×108个细胞。
可以注射这些溶液到受试者。可以冻存这些溶液。可以把这些溶液用于制造成药剂，应用于通过T-MSC给药来治疗疾病。
本发明还提供了一种生产可适合注射入病人体内的T-MSC溶液的方法，所述方法包括以下步骤：利用前面段落描述的方法分离细胞溶液，然后将细胞接种至可适合注射至患者的液体中。本发明还提供了一种可生产适合冷冻的T-MSC溶液的方法，该方法包含以下步骤：利用前面段落所描述的方法分离细胞溶液，然后将细胞接种至可适合冷冻的溶液中。
还有，本发明的另一个实施方式是表达一个或者多个细胞表面标记蛋白或其组合的T-MSC，所述标记蛋白包括CD73、CD90、CD105、CD13、CD29、CD54、CD44、CD146和CD166。在另一个实施方式中，人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞不表达或者低水平表达一个或多个细胞标记蛋白或其组合，所述标记包括CD34、CD31、CD45。在另一个实施方式中，人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞不表达或者低水平表达一个或多个促炎症蛋白标记，或者这些促炎症蛋白的组合，所述促炎症蛋白包括MMP2、RAGE、IFNγR1、IFNγR2、IL-12、TNFα、IL-6和VCAM1。在某些实施方式中，与骨髓间充质干细胞相比，人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞表达上述标记至少一半的水平。
本发明的另一个实施方式是一种包含T-MSC的细胞培养物，其中T-MSC表达一个或多个细胞标记蛋白，包括CD73、CD90、CD105、CD13、CD29、CD54、CD144、CD146和CD44。在另一个实施方式中，细胞培养物中的T-MSC不表达或者低水平表达一个或者多个细胞标记蛋白，包括CD34、CD31和CD45。在另一个实施方式中，细胞培养物中的T-MSC不表达或者低水平表达一个或者多个促炎症蛋白，包括MMP2、RAGE、IFNγR1、IFNγR2、IL-12、TNFα、IL-6和VCAM1。
在某些实施方式中，所述细胞培养物中包含至少1×106个T-MSC，至少1×107个T-MSC，至少1×108个T-MSC，至少1×109个T-MSC，或者至少1×1010个T-MSC。
在另外一些实施方式中，细胞培养物中至少约90％的T-MSC表达CD73蛋白；至少多于90％的T-MSC表达CD73蛋白；至少约95％的T-MSC表达CD73蛋白；或者超过95％的T-MSC表达CD73蛋白。在另一些实施方式中，细胞培养物中至少约96％的T-MSC表达CD73蛋白；至少多于97％的T-MSC表达CD73蛋白；至少约98％的T-MSC表达CD73蛋白；至少多于99％的T-MSC表达CD73蛋白。
在另外一些实施方式中，细胞培养物中至少约75％、80％、85％、90％、5％、99％的T-MSC表达至少一种选自CD90、CD105、CD44和CD29的细胞标蛋白。
在另外一些实施方式中，细胞培养物中至少约80％、85％、90％、95％和99％的T-MSC不表达或者低水平表达至少一种细胞标记蛋白，包括CD34、CD31和CD45。
在另外一些实施方式中，细胞培养物中至少约75％、80％、85％、90％、95％、99％的T-MSC不表达或者低水平表达至少一种促炎蛋白，包括MMP2、RAGE、IFNγR1、IFNγR2、IL-12、TNFα、IL-6和VCAM1。在某些实施方式中，所述T-MSC表达高水平的CD24、TGFβ2或者两者都高水平表达。
在某些实施方式中，使用γ射线辐射本发明所述的T-MSC或细胞培养物。
本发明的另一些实施方式是药物制剂，其中药物制剂包括任何一种本文所述T-MSC或细胞培养物和药学上可接受的载体。
还有，本发明的另外一些的实施方式是任何本文所述T-MSC或细胞培养物的冷冻制剂。
本文还提供一种为有需要其治疗的受试者治疗和预防与T细胞相关的自身免疫性疾病的方法，该方法包括以下步骤：向有需要其的受试者施用治疗有效量的包括先前段落中所描述T-MSC的溶液、细胞培养物或药物制剂。与T细胞相关的自身免疫性疾病包括但不限于克罗恩病、炎症性肠病、移植物抗宿主疾病、系统性红斑狼疮和风湿性关节炎，还有T细胞介导的延迟型超敏反应(属于第四型过敏反应)，即1型糖尿病、MS、RA、桥本甲状腺炎、克罗恩病、接触性皮炎和硬皮病，等等。
在某些实施方式中，优选的受试者为哺乳动物或者鸟类，最为优选的是人类。在某些实施方式中，所述溶液、细胞培养物和药物制剂包括已被辐射或未经辐射的T-MSC。
在某些实施方式中，所述用于治疗和预防疾病的方法包括与一种或多种用于治疗和预防药物的联合治疗。
在其他某些实施方式中，本发明为有需要其的受试者提供一种治疗和预防多发性硬化症的方法，该方法包括以下步骤：向有需要其受试者给予治疗有效量的包括前面段落描述T-MSC的溶液、细胞培养物或药物制剂。所述多发性硬化病可以是复发/持久型多发性硬化症、进展/复发型多发性硬化症、原发性多发性硬化症或继发性多发性硬化症。受试者优选哺乳动物，并且最优选为人类。所描述的溶液、细胞培养物或者药物制剂可以包括辐射或未经辐射的T-MSC。
所述方法包括进一步给予受试者其它治疗药剂，该药剂包括但不限于芬戈莫德、促肾上腺皮质素(ACTH)、甲泼尼龙、地塞米松、IFNβ-1a、IFN-1b、醋酸格拉替雷、环磷酰胺、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、克拉屈滨、环孢菌素、米托蒽醌和柳氮磺胺吡啶。还有，在另外一个实施方式中，为了将治疗药剂递送至中枢神经系统，一种或多种治疗药剂可以连接在T-MSCs上以便穿过血脑屏障和/或血脊髓屏障。
本文提供一种穿过血脑屏障和/或血脊髓屏障递送药剂的方法，该方法包括以下步骤：将药剂连接或缀合至T-MSC，然后给予有需要其的受试者he-MSC和药剂复合物，其中所述的T-MSC能够透过血脑屏障和/或血脊髓屏障，所述药剂能够治疗、预防或诊断有需要其的受试者的疾病或损伤。T-MSC可以是单个细胞、细胞培养物、溶液或药物制剂的形式。所述药剂可以包括但不限于药物、蛋白质、DNA、RNA和小分子物质。
另一个实施方式是包括T-MSC和缀合或连接的药剂的递送系统，该系统的目的是穿过血脑屏障和/或血脊髓屏障。
本文描述的方法有许多优点。该公开方法的一个目的是使hESCs通过中间滋养细胞阶段以实现分化，这种方法和现有的方法不一样，并有以下优点。
本文提供一种选择临床级别T-MSC以治疗自身免疫性疾病的方法，所述T-MSC具有以下特征：(i)含有>95％的细胞表达组-1标记；(ii)含有>80％的细胞表达组-2标记；(iii)含有<5％的细胞表达组-3标记；(iv)表达IL-10和TGFβ；(v)含有<2％的细胞表达IL-6、IL-12和TNFα；(vi)表达高水平的CXCR7、CXCL2和CXCL12，但表达低水平的HOXB2、HOXB3、HOXB5、HOXB7、HOXB9、HOXA5、HOXA9和其它HOX家族的基因；(vii)含有<0.001％的细胞共表达所有组-4标记。其中组-1标记是：CD73、CD90、CD105、CD146、CD166和CD44。组-2标记是：CD13、CD29、CD54和CD49E。组-3标记是：CD45、CD34、CD31和SSEA4。组-4标记是：OCT4、NANOG、TRA-1-60和SSEA4。
本文提供一种修饰的T-MSC生产一群修饰的间充质干细胞的方法，所述修饰的间充质干细胞具有以下特征：(i)含有>95％的细胞表达组-1标记；(ii)含有>80％的细胞表达组-2标记；(iii)含有<5％的细胞表达组-3标记；(iv)表达IL-10和TGFβ；(v)含有<2％的细胞表达IL-6、IL-12和TNFα；(vi)含有少于0.001％的细胞共表达所有组-4的标记。其中组-1标记是：CD73、CD90、CD105、CD146、CD166和CD44。组-2标记是CD13、CD29、CD54和CD49E。组-3标记是CD45、CD34、CD31和SSEA4。组-4标记是：OCT4、NANOG、TRA-1-60和SSEA4。
本文提供条件培养基、条件培养基浓缩液、细胞裂解物或其它其衍生品，其包括由所述T-MSC分泌的一种或多种生物分子。
本文提供了使用T-MSC作为饲养细胞以扩增骨髓造血干细胞和脐带造血干细胞的方法。在某些实施方式中，这些适合公开方法的T-MSC表达Stro3。在某些实施方式中，T-MSC和骨髓造血干细胞和/或脐带造血干细胞共培养。在某些实施方式中，T-MSC是间充质干细胞。这里提供了一种由所述T-MSC和骨髓造血干细胞组成的共培养物。这里提供了一种由所述T-MSC和脐带造血干细胞组成的共培养物。
同样公开了包括本文所述T-MSC的试剂盒。在某些实施方式中，所述试剂盒包括T-MSC和细胞递送载体。
一方面，本文提供了一种抑制或降低免疫反应的方法，该方法包括将多个免疫细胞和多个T-MSC相互接触一段时间，这段时间足够T-MSC可检测地抑制免疫反应，其中，在混合淋巴细胞反应试验中，T-MSC可检测出地抑制T细胞的增殖和/或分化。在另一个具体的实施方式中，细胞相互接触是在体外进行的。在一个更具体的实施方式中，体内的细胞相互接触在哺乳动物如人类中进行。在另一个具体的实施方式中，所述细胞相互接触包括静脉内、肌肉内给予T-MSC或者注射入受试者器官(如胰腺)。
本文提供了生产细胞群的方法，所述细胞群包含T-MSC，对这些T-MSC的选择基于它们具有调控(如抑制)免疫应答的能力。例如，在一个实施方式中，本发明提供了一种选择T-MSC细胞群的方法，这种方法包括：(a)在混合淋巴细胞反应(MLR)试验中分析多个T-MSC；(b)如果多个T-MSC在混合淋巴细胞反应试验中可检测地抑制CD4阳性或CD8阳性T细胞的增殖，选择多个T-MSC。这里所述的T-MSC表达CD73、CD90、CD105、CD13、CD29、CD54和CD 44。在一个实施方式中，T-MSC不表达或者表达低水平的CD34、CD31和CD45。在一实施方式中，T-MSC不表达或表达低水平的MMP2、RAGE、IFNGR2、IL-12A、IL-6和VCAM1。
本文提供了T-MSC分化为多种其它细胞系的方法，所述细胞系包括但不限于脂肪细胞、成肌细胞、神经细胞系、成骨细胞、成纤维细胞、软骨细胞和间质细胞。
本文提供了使用T-MSC及其分化的细胞产物进行组织再生和或组织修复的方法,这些方法包括：给予足够量的T-MSC和/或T-MSC衍生的其他细胞系以促进组织再生。组织生包括但不限于关节再生、肌腱再生、结缔组织再生、神经细胞系再生、脂肪组织再生、骨再生、皮肤再生、肌肉再生、软骨再生、平滑肌再生、心肌再生、上皮组织再生和韧带再生。
在具体的实施方式中，混合淋巴细胞反应试验中T细胞和T-MSC的比例，例如约20:1、15:1、10:1、5:1、2:2、1:1、1:2、1:5、1:10或1:20，优选10:1。
本公开方法的另一个目的是通一种高产量的方法实现高效地产生大量的间充质干细胞。本公开方法可以产生得到是起始hESCs细胞数约10倍的间充质干细胞。在hESCs通过滋养细胞分化的过程中有极少的细胞丢失，然而，其它的方法在起始的分化步骤中有超过90％的起始细胞发生丢失，从而导致得到比本公开方法更少的细胞量。
本公开方法的一个目的是提供一种能够在相对短时间内生产间充质干细胞的方法。完成本文所述方法的整个流程需要不超过6-14天，这依起始hES系而定。
本公开方法的一个目的是提供一种低成本的方法。所述的分化方法仅需要非常少量的培养基，仅仅需要一种细胞因子-BMP4，而且BMP4在本方法的使用浓度非常低。
本公开方法的一个目的是提供一种低成本的方法。本文所述的分化方法仅需要非常少量的培养基，仅仅需要一种细胞因子－BMP4和/或TGFβ抑制剂(如SB431542、A83-01或ALK5抑制剂等等)。
本公开方法的一个目的是提供一种高产量的方法。这里所述分化方法可在30天内从1×105个hESC中生产1-5×1010个T-MSC细胞，然而其它方法在30天内仅能生产达1×108个MSC。
本公开方法的进一步目的是提供具有高免疫抑制效力的间充质干细胞。所述T-MSC比骨髓(BM)和其它组织来源的间充质干细胞具有更高的免疫抑制能力。所述T-MSC比人胚胎干细胞通过其它方法衍生的间充质干细胞具有更高的免疫抑制能力。
在具体的实施方式中，与不含T-MSC的混合淋巴细胞反应试验相比较，含T-MSC的混合淋巴细胞反应试验抑制至少50％、70％、90％或95％CD4阳性或CD8阳性T细胞的增殖。
在另一个具体的实施方式中，上述任何一种组合物包含基质。在一个更具体实施方式中，所述基质是三维的支架。在另一个更具体的实施方式中，所述基质包括胶原、明胶、层粘连蛋白、纤连蛋白、果胶、鸟氨酸或玻连蛋白。在另一个更具体的实施方式中，所述基质是生物材料。在另一个更具体的实施方式中，所述基质包括细胞外膜蛋白质。在另一个更具体的实施方式中，所述基质包括合成化合物。在另一个更具体的实施方式中，所述基质包括生物活性物质。在另一个更具体的实施方式中，所述生物活性物质是生长因子、细胞因子、抗体或小于5000道尔顿的有机分子。
本发明进一步提供冷冻保存的干细胞群，如包含T-MSC的细胞群，其中，所述细胞群具有如这里所述的免疫调控能力。例如，本发明提供了一群经鉴定在混合淋巴细胞反应(MLR)试验中能够可检测性地抑制T增殖和/或分化的T-MSC，其中，所述细胞已经冷冻保存，并且其中所述细胞群被装在容器中。
在一个具体的实施方式中，保存上述任何一种冷冻保存的细胞群的容器是袋子。在各种具体实施方式中，所述细胞群包括约、至少或最多1×106个所述干细胞、5×106个所述干细胞、1×107个所述干细胞、5×107个所述干细胞、1×108个所述干细胞、5×108个所述干细胞、1×109个所述干细胞、5×109个所述干细胞、或1×1010个所述干细胞。在任何上述冷冻保存的细胞群的其它具体实施方式中，所述干细胞已经被传代的次数至少或者不超过5次、不超过10次、不超过15次、不超过20次。在任何上述冷冻保存的细胞群的另一个具体实施方式，所述干细胞是在容器中扩增。
4.附图简述
图1(A-B).(A)hESC经过滋养细胞和前-T-MSC阶段分化为T-MSCs的流程图。每个分化阶段相关的关键生物标记如图所示。(B)对比不同MSC制备方法所得到的MSC的产量和质量：三种不同方法诱导hESCs分化。1)T-MSC：在滋养层分化培养基培养3天后，再在MSC生长培养基培养8-10天。2)SB-MSC：在添加SB431542的分化培养基培养3-10天后，再在MSC生长培养基培养12天。3)HB-MSC：hESC经过中间阶段成血管细胞分化为MSC，hESC在无血清培养基培养10-13天分化为成血管细胞，然后在MSC生长培养基中培养12天。从如图中所示分化方法开始分化后第10天、20天和30天在不同培养基中得到总MSCs数量(百万个细胞)。流式细胞术分析CD73阳性的细胞比率以检测MSC的纯度。
图2(A-C).在hESCs向T-MSCs分化过程中不同时间点观察到的细胞形态变化。(A)第二天：滋养细胞；(B)第5天：pre-MSCs(中胚层细胞)；(C)第9天：MSCs。
图3(A-C).在hESCs向T-MSCs分化过程中不同时间点分析表达滋养细胞标记Trop-2(Trp-2)和表达MSC标记CD73的细胞的比率。(A)第2天：滋养细胞；(B)第5天：pre-MSCs(中胚层细胞)；(C)第9天：MSCs。
图4(A-H).在分化11天后T-MSC表面标记的表达模式。(A)Trp2是滋养细胞的标记；(B)CD31是内皮细胞的标记；(C)CD34是造血干细胞的标记；(D-H)CD73、CD90、CD 105、CD44和CD29是MSC的标记。
图5(A-R).T-MSCs的体外免疫抑制功能。BM-MSCs(G-L)或T-MSCs(M-R)以10：1的比例与标记CFSE的小鼠淋巴细胞混合。以浓度0.3或1μg/ml的CD3的抗体和浓度为1μg/ml的CD28的抗体刺激细胞。经流式细胞术分析通过CFSE的稀释度指示细胞增殖。(A-F)图中所示为不添加BM-MSC或T-MSC(标记比照)的T细胞。
图6.T-MSC减少EAE小鼠模型的疾病评分。MOG35-55加上佐剂和百日咳毒素处理C57BL/6构建EAE小鼠模型。EAE小鼠模型诱导的第6天，T-MSC、BM-MSC和经SB431542方法诱导hESCs得到的MSC(hES-MSC(SB))经腹腔注射小鼠体内。在注射所后的27天记录疾病评分(从无疾病0至严重疾病4)。
图7(A-C).检测T-MSC多能性，分化为：(A)成骨细胞，(B)软骨细胞，(C)脂肪细胞。
图8.hES-HB-MSC(hES-hemagioblast来源的MSC))、T-MSC(hES-trophoblast来源的MSC)和BM-MSC(成体骨髓来源的MSC)基因表达模式比对分析。基因表达标准化，并以任意表达单位展示。
5.详细描述
5.1定义
在本发明的上下文和每个术语应用的特定上下文范围内，本说明书中应用的术语在本领域中一般具有它们的常规含义。在下文或本发明的其他部分对某些术语进行了讨论以对本发明的方法描述及如何使用它们，为实施者提供额外的指导。此外，可以理解为，同样的事情可以以一种以上的方式叙述。因此，对本文所论述的任一个或多个术语都可使用选择性的语言和同义词，无论该术语是否详述或讨论于此，对其都没有任何特殊的意义。本文提供了某些术语的同义词。描述一个或多个同义词并不排除使用其它的同义词。这些或其他在本说明书中任何地方的实施方式的用途仅仅是说明性的，并且决不限制本发明或任何举例说明的术语的范围和含义。
术语hESC是人胚胎干细胞，包括从胚胎、内细胞团、卵裂球或细胞系产生的多能性的干细胞。
本文所使用的术语“hES-MSC”或“hES-MSCs”或“人胚胎间充质干细胞”或“人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞”或“hES-MSC群”指人胚胎干细胞或诱导多能干细胞“iPSCs”使用任何方法衍生的间充质样干细胞、间充质样基质细胞、间充质干细胞或间充质基质细胞。本文使用的hES-MSC包括hES-MSC单细胞、hES-MSC细胞系、一批hES-MSC、大量hES-MSC或hES-MSC群。
术语“T-MSC”指人胚胎干细胞((hESC))或诱导多能干细胞(iPSC)通过中间阶段(该阶段的细胞表达Trop-2，并具有滋养细胞形态)而衍生的MSC或间充质干细胞/间充质基质细胞。术语“hES-T-MSC”指hESC分化的T-MSC。术语““iPS-T-MSC”或“iT-MSC”指iPSC分化的T-MSC。这里所用的术语“T-MSC”不指滋养细胞。如果细胞保持了干细胞中的至少一种属性，例如能分化成至少一种其它类型的细胞，或类似的功能，那么这种细胞被认为是“干细胞”。对这些细胞的描述可基于多种结构和功能特性，包括但不限于，表达或缺乏表达一种或多种标记。T-MSCs，包括hES-T-MSC和iT-MSC，是多能性的并且能分化产生其它类型的细胞或细胞系。
术语“hES-HB-MSC”或“HB-MSC”指包括hESC和iPSCs的人多能干细胞通过成血管细胞或血管集落形成中间步骤而衍生的间充质干细胞。
本文使用的术语“临床级别T-MSC”指具有以下特征的MSC：适合在临床上用于人、鸟类或其它动物。
本文使用的术语“T-MSC群”指一群T-MSC细胞，包括适合用于治疗的T-MSC细胞和不适合用于治疗的T-MSC细胞。
本文使用的术语“T-MSC衍生的细胞系”或“T-MSC-DL”指T-MSC分化的细胞或细胞系，包括但不限于脂肪细胞、成肌细胞、神经细胞谱系细胞、成骨细胞、成纤维细胞、软骨细胞和基质细胞。
本文使用的短语“治疗有效量”指其数量足以引起的改善受试者的临床显著症状，或延迟或最小化或减轻一种或多种与所述疾病有关的症状，或者导致受试者在生理学上所希望的有益改变。
术语“治疗”是指减缓、缓解、改善或减轻至少一种疾病的症状，或在发病后逆转其发作。
术语“预防”指在发病前起作用，以防止形成该疾病或减轻疾病的严重程度或延缓其发展的过程。
本申请中使用的术语“受试者”指具有免疫系统的动物，例如禽类和哺乳动物。哺乳动物包括犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、牛、马、猪、羊和灵长类动物。禽类包括但不限于家禽、鸣禽和猛禽。因此，本发明可用在兽医医学中，例如，为了治疗玩赏动物、农场动物、动物公园的实验动物和在野外动物。本发明特别适合于人类医药应用。
术语“需要其”是受试者已知或怀疑患有或有风险发展成疾病，包括但不限于多发性硬化症和其他T细胞相关的自身免疫疾病，或与中枢神经系统、血-脑屏障或血－脊髓屏障相关的疾病。
一个需要治疗的受治疗者是已经发生疾病的受试者。一个需要预防的受试者是具有发生该疾病的风险因素的受试者。
本文使用的术语“药剂”指一种产生或能够产生效果的物质，可以包括但不限于、化学品、医药品、药品、生物制剂、小分子、抗体、核酸、肽类和蛋白质。
如本文所使用的，干细胞是特定标记“阳性的”，指该标记是可检测时。例如，T-MSC是，例如CD73阳性的，因为在T-MSC中CD73的量是可检测的，高于背景(例如，同种型对照)。细胞也可以是标记阳性的，当所述标记可用于区分至少一种其他类型的细胞，或可用于选择或分离该细胞，其中所述标记是存在或表达于这种细胞的。
如本文所用的，“免疫调节”是指引起或有能力引起免疫反应可检测的变化，以及引起免疫应答的可检测变化的能力。
如本文所用的，“免疫抑制”是指引起或有能力引起免疫反应可检测的下降，以及引起免疫应答的可检测抑制的能力。
本发明是基于首次发现间充质干细胞(MSCs)可以从人类胚胎干细胞衍生的滋养层细胞分化，并且该滋养层来源的MSCs(T-MSC)可用于组织修复和免疫调节作用。这些由本公开方法生产的T-MSC在体外显著地抑制T细胞的增殖和分化，并且在体内减少疾病评分，然而骨髓来源的间充质干细胞(BM-MSC)在体内完全不具有作用，尽管BM-MSC在体外可以部分地下调T细胞增殖和分化。本文所述的T-MSC与BM-MSC相比，具有令人惊奇的更高的免疫抑制活性。本文所公开的方法是高效的，并且能以成本低生产大量高纯度的T-MSC。本文公开的方法是高度可重复的，具有很小的批与批之间差异，并且易于适应临床需要。
因此，本发明通过提供一种人胚胎干细胞在体外产生间充质干细胞(MSC)的方法，克服了上述问题。由本文公开方法产生hES-T-MSC的能力允许这些细胞的生产，这些细胞可用于各种治疗应用，包括多发性硬化症和其它自身免疫性疾病的治疗和预防。另外，由本文所述方法生产的hES-MSC具有穿过血-脑屏障(BBB)和血-脊髓屏障的能力，进而允许它们用于各种治疗应用，包括药物递送。本发明所述的方法提供进一步的效用，因为它们能够大量产生在商业范围内可使用的hES-T-MSC。
5.2胚胎干细胞经过滋养细胞分化获得T-MSC
本文公开一种从胚胎干细胞(hES)洐生的滋养细胞产生得到并扩增间充质样干细胞(MSCs)的方法。这些产生的细胞定义为T-MSC。可分离和/或纯化这些T-MSC。
胚胎干细胞已经被报道经不同的方法诱导得到间充质干细胞样的细胞(Barbieriet al.(2005)；Olivier et al.(2006)；Sanchez et al.(2011)；Brown et al.(2009))。然而，所有这些方法涉及共培养和手工挑选步骤，限制细胞的产量和纯度，因而导致所得细胞的质量不一。
尽管hESC表达低水平的主要组织相容性复合体抗原，但是已经发现这些抗原在hESC分化的多种细胞表达水平更高(Draper et al.，2002；Drukker et al.，2006；Drukkeret al.，2002)，因此，将这些分化的细胞移植至患者体内引起对免疫排斥极大的关注。相反，MSC表达低水平的共刺激分子和主要组织相容性复合体抗原，并且已经被应用于同种或异种移植模型以治疗自身免疫性疾病(Gordon等，2008b；Grinnemo等，2004；Rafei等，2009a；Rafei等，2009b；Tse等，2003)。T-MSC和成体组织来源的MSC一样，表达低水平的共刺激分子和主要组织相容性复合体抗原，并且不需要长期移植就能发挥免疫抑制作用。由于MSC和患者的主要组织相容性复合体抗原不匹配，因此无需担忧免疫排斥。一个hESC系就足以产生无限供应的大规模的T-MSC，并且容易控制质量，适合工业化生产，成为治疗MS和其他以T细胞为基础的自体免疫疾病的患者一种潜在的疗法。
人滋养细胞可以从人胚胎干细胞中产生。这些胚胎干细胞包括来源或使用，例如胚泡、接种的ICMs、一个或多个卵裂球，或者植入前阶段的胚胎或胚胎样组织，无论是否通过受精、体细胞核移植(SCNT)、孤雌生殖、雄核发育无性繁殖的方法产生。
另外或可供选择地，滋养细胞可从其它胚胎衍生的细胞产生。例如，滋养细胞(但不一定需要通过胚胎干细胞这一步骤)可通过来源或使用接种的胚胎、ICMs、胚泡、一个或多个卵裂球、滋养层干细胞、胚胎生殖细胞、或植入前阶段的胚胎或胚胎样组织，无论是否通过受精、体细胞核移植(SCNT)、孤雌生殖、雄核发育无性繁殖的方法产生。相似地，可以使用从胚胎来源细胞分化的部分细胞或细胞系产生滋养细胞。例如，如果一个人胚胎干细胞系被用来生产比滋养细胞发育更原始的细胞，那么就发育潜力和可塑性而言，这种胚胎来源的细胞可以产生滋养细胞。
另外或可供选择地，滋养细胞可从其它分娩前和围产后的原料，包括但不限于脐带、脐带血、羊膜液、羊膜干细胞和胎盘中产生。
胚胎干细胞可以作为这种方法的起始材料。胚胎干细胞可以按本领域目前所熟知的任何一种培养方法，例如有或没有饲养细胞。
在此阐述的实施方式中，共使用了8种hESC细胞系，分别为H9(WiCell ResearchInstitute)(Thomson等.(1998))、CT2(University of Connecticut Stem Cell Core(Lin等.(2010))、ES03-Envy(Envy，带GFP标签的细胞系，ES International)(Costa等.(2005))、ESI-017、ESI-053、ESI-049、ESI-035和ESI-051。
本方法获取T-MSC的第一个步骤中，人胚胎干细胞以小团块或单细胞形式培养在不含bFGF的无血清培养基，然后将细胞重新铺至含BMP4(1-200ng/ml)的培养基中继续培养，选择BMP4是因为仅添加这个细胞因子就能在短时间内(2-5天)获得高纯度的、表达典型滋养层标记Trop2/TACSTD2(Trp2)的滋养细胞。添加TGFβ抑制剂(SB431542(1-20μM)，A83-01(0.2-5μM)或ALK5抑制剂(1-20μM)，等)可以提高滋养细胞的生成率。细胞在2-5天内扩增并分化为具有滋养层形态的滋养细胞。在某些实施方式中，超过90％的细胞表达Trop-2/TACSTD2(Trp-2)(Xu等，2002)。滋养细胞可以依据细胞大小分离或采用抗体纯化，如免疫亲和柱层析。
在一个实施方式中，用胰酶替代物TrypLE、胰酶或胶原酶B将滋养细胞消化成单细胞。获得的单细胞在优化的间充质干细胞培养基中重悬，如含2-20％胎牛血清(FBS)或人AB血清(ABHS)的α-MEM培养基、含2-20％FBS或ABHS的高糖DMEM培养基。可用含5-20％血清替代物(KOSR)或牛血清白蛋白(BSA)、或任何其它可用的商业化无血清MSC培养基替代FBS。在某些实施方式中，培养基中血清、KOSR或BSA的浓度约为5-20％。在某些实施方式中，FBS是优选的。在某些实施方式中，细胞的培养密度约10-1000细胞/cm2。在某些实施方式中，细胞培养在模拟组织的细胞外基质环境，如明胶、玻连蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白和胶原I。在某些实施方式中，MSC的培养基添加LIF(2-20ng/ml)、bFGF(2-100ng/ml)、或PDGF(1-50ng/ml)以提高扩增效率。
在重悬约24小时后，许多细胞(50-90％)贴壁于培养皿。约2-3天后，滋养细胞开始向前-T-MSC分化，这些细胞形态变长并且边缘透明。在某些实施方式中，前-T-MSC同时表达CD73和Trop-2。在6-10天后，超过80-90％的滋养细胞分化为纺锤样形态的间充质样干细胞，也就是所谓的T-MSC。T-MSC可通过检测某些标记的表达鉴定，如表达CD73、CD90、CD105、CD13、CD29、CD54、CD44、CD146和CD166，并且不表达或表达低水平的CD31、CD34和CD45。在某些实施方式中，T-MSC不表达HOX和HLA-G。在某些实施方式中，T-MSC表达高水平的CXCR7、CXCL2和CXCL12，但表达低水平的HOXB2、HOXB3、HOXB5、HOXB7、HOXB9、HOXA5、HOXA9和HOX家族的其它基因。同时T-MSC也具有以下特征：多能性并能化分为脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、神经元、成肌细胞、基质细胞和成纤维细胞。
本文提供一种分离的细胞群，其中，所述细胞群包含多个具有免疫抑制功能的T-MSC。这些T-MSC至少表达一种以下标记：CD73、CD90和CD105。
在本发明进一步的实施方式中，额外添加辐射T-MSCs的步骤。该照射可以采用任何本领域已知的辐射方法，包括但不限于伽马辐射，如铯-137伽马辐射，或X-射线光子辐射。辐射的优选量在5和20000gy之间，更优选的在50和100gy之间，最优选的是80gy。
在一个实施方式中，本文所述的方法是一种新的hESCs衍生(本文也称为生产)T-MSC的方法。该方法包括以下步骤：
a.在无血清培养基中培养包含人胚胎干细胞的细胞培养物，培养基中添加至少一种生长因子，并且含量足以诱导胚胎干细胞分化为滋养细胞。在一个实施方式中，分化为滋养细胞的时间周期约为2-5天。在一个实施方式中，培养基含BMP4、添加或不添加TGFb抑制剂(例如SB431542、A83-01或ALK5抑制剂，等)能提高分化效率。
b.至少添加一种长生因子至含滋养细胞的细胞培养物并继续在无血清培养基中培养，这里添加生长因子的量足够促进滋养细胞扩增。在一个实施方式中，培养基含有BMP4(这一步骤可选)。
c.分离的滋养细胞重新铺至包被明胶、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、胶原或基质胶的培养皿，并培养在含或不含血清的培养基中，其中，这些培养基以的量足以促进滋养细胞通过前-T-MSC中间阶段分化为T-MSC。在一个实施方式中，分离的滋养细胞经培养6-10天后产生表达成体MSCs标记的T-MSC。其中至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％的T-MSC表达成体MSCs的细胞表面标记。在一个实施方式中，培养基中添加LIF、bFGF、PDGF以促进扩增效率。其中，获得的T-MSC至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％表达成体MSCs细胞表面标记。
如图1和图2所示，本公开方法首先将hESC打散为小团块或单细胞，然后将这些细胞重新铺并培养在只含一种细胞因子BMP4和一种TGFβ抑制剂的培养基。添加的TGFβ抑制剂可以在时间内(2-5天)获得高度同质的滋养细胞群，这些细胞群表达典型的滋养细胞标记Trop-2/TACSTD2(Trp-2)(Xu等，2002)。接着将滋养细胞打散，重新铺在包被明胶、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、胶原或基质胶的培养皿，并在MSC生长培养基中培养4-10天产生纺锤状的细胞，这些细胞的形态与典型的MSCs相类似。
本文公开的方法，不同于其它的方法，不需要饲养层细胞、不需要分类拣选或手工挑选细胞。滋养细胞分化的第一步在是成分明确的、不含bFGF的无血清培养基中进行。整个分化流程仅需要2个步骤，总耗时6-14天，就能产生高产量和高纯度的T-MSC(图1)。这是目前报道的hESC分化为MSC方法中时间最短的。与以住的方法相比较，该方法获得的T-MSC的产量和纯度都很高。在30天内，获得的T-MSC数量是初始hESCs的5×105倍，并且CD73阳性细胞的比率很高，其中CD73是MSC所特有的标记。然而，其它方法获得的MSC的数量与起始的hESCs的数量相比，小于100倍，并且所获得的细胞中CD73阳性的比率低。诱导得到的T-MSC中含有CD73/Trp-2双阳性的、中间阶段的细胞，在下文中称为前-T-MSC。在经BMP4和TGFβ抑制剂处理2-3天后，这些细胞首先表达Trp-2，其中Trp-2阳性的细胞比率很高，并且显示滋养细胞形态同质(图2和3)。在5-6天后，细胞同时表达Trp-2和CD73；在6-14后，细胞不再表达Trp2，但表达MSC典型的细胞表面标记CD73、CD90、CD105、CD44和CD29，并且比率很高：CD73(>98％)、CD90(>95％)、CD105(>90％)、CD44(>95％)、CD29(>80％)，同时这些细胞为CD31、CD34和CD45阴性，其中CD31为内皮细胞标记，CD34和CD45为造血干细胞标记(图3和4)。
利用在本公开的方法生产的T-MSC能够分化成下下游的成骨细胞系、软骨细胞系和脂肪细胞系。因此，这些T-MSC从形态和功能都类似于骨髓和其它组织来源的MSC s。
5.3人胚胎干细胞来源的间充质干细胞
骨髓来源的间充质干细胞(BM-MSCs)长期以来被用来治疗许多自身免疫性疾病的动物模型和临床试验。然而，在一些报道中，BM-MSCs的免疫抑制作用并不一致，表明BM-MSCs并不能有效地治疗某些自身免疫性疾病(Tyndall，2011)。本文提供对比BM-MSCs和T-MSC抑制T细胞增殖和后续的T细胞受体激活能力的数据。如图7所示，在抗-CD3抗体以低浓度(0.3ug/ml)处理时，BM-MSCs可以同时抑制CD4和CD8阳性细胞的增殖，与T-MSC的结果相类似。然而，当抗-CD3抗体的浓度提高到1ug/ml时，与T-MSC相比较，BM-MSCs抑制CD4和CD8阳性细胞的增殖的能力更低。这里采用CFSE稀释实验检测T细胞的增殖：T细胞比例的增加伴随着CFSE信号的减弱，表明增殖加快。如图5所示，当抗-CD3抗体的浓度提高到1ug/ml时，检测发现59％CD4阳性的T细胞和46％CD8阳性的T细胞中CFSE的信号下降。在T-MSC组中，CD4和CD8阳性的T细胞的比例都被减少至16％；在BM-MSC组中，CD4和CD8阳性的T细胞的比例分别减少至32％和36％。
和T-MSC体外的免疫抑制活性一致，本公开方法生产的T-MSC能有效地治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)，这是一种多发性硬化症的小鼠模型。如图6所示，与对照组相比较，在EAE小鼠模型诱导后6天注射T-MSC，EAE小鼠的疾病评分显著地下降。
本公开方法生产的细胞另外的特征是：T-MSC比BM-MSCs和来自SB431542处理的hES-MSCs具有更强的免疫抑制活性(Chen et al.，2012)(图6)。在几个重复实验中，BM-MSCs始终不能下调EAE小鼠的疾病评分。因此，在临床上应用本公开方法生产的T-MSC替代BM-MSCs，可以消除侵入性骨髓穿刺所带来的风险，减少等待骨髓捐赠的时间，减少成本，减少为不同病人准备的BM-MSCs的批次差异。
总之，本文提供了一种利用hESCs高效产生间质样细胞或MSCs的细胞的方法，并使用这些MSCs治疗自身免疫性疾病，该方法的特征是，hESCs分化过程中经过滋养细胞这一中间阶段。芯片分析结果表明，尽管T-MSC和BM-MSCs都能分化成同样的下游细胞系(图7)，但是T-MSC的基因表达模式和BM-MSCs的并不一致(数据未给出)。另外，在体内和体外，T-MSC的免疫抑制活性比BM-MSCs的更强。
现有数据表明，本公开方法生产的T-MSC不同于传统的成体MSCs。由于T-MSC具有强大的抑制T细胞增殖的能力，T-MSC在治疗多发性硬化症时可能比使用BM-MSCs有更好的效果。为了解决潜在的安全问题，将T-MSC注射至免疫缺陷的SCID米色小鼠，在小鼠中没有观察到畸胎瘤形成。
本发明产生的T-MSC是独特的，而且具有多种治疗用途和其它用途。因此，本发明包括多种制剂，包括药物制剂和包括T-MSC的组合物。
术语“滋养层-间充质干细胞(T-MSC)”指从人胚胎干细胞(hESC)或诱导多能干细胞(iPSC)经过滋养细胞中间产物衍生的间充质干细胞或间充质干细胞/基质细胞，所述滋养细胞表达Trop-2并且具有滋养细胞样形态。术语“人胚胎干细胞－滋养层－间充质干细胞(hES-T-MSC)”指来源于hESC的T-MSC。术语“iPS-T-MSC”和“iT-MSC”指从诱导多能干细胞分化的间充质干细胞。术语“T-MSC”在这里不是指滋养细胞。如果细胞至少有一种干细胞的属性，那么这种细胞被认为是干细胞。所述属性如，有能力分化为至少一种或其它类型的细胞，诸如此类。对这些细胞的描述基于众多结构和功能特性，包括但不限于：表达或不表达一种或多种标记。特别是，T-MSC具有成纤维细胞形态的小细胞体的特性。T-MSCs包括hES-T-MSC和iT-MSC，具有多能性并且能分化产生其它类型的细胞和细胞系。术语“T-MSC-DL”指T-MSC分化的所有细胞和细胞系。
本文所述的分化方法可以在6-14天内获得从iPS细胞分化的MSC，这是目前报道的最短时间。因此，这些iT-MSC可用于病人特定的iPS疗法，特别是需要在很短时间内生产MSC的紧急情况下，例如急性心脏梗塞、急性心力衰竭、急性脊髓损伤和急性放射/燃烧的治疗等。
可以通过检测一种或多种标记的DNA、RNA或蛋白的表达或不表达鉴定T-MSC。T-MSC的鉴定可通过检测细胞表面标记CD73或表达至少一种或多种以下细胞表面标记：CD90、CD105、CD13、CD29、CD54、CD44、CD146和CD166，或不表达或低水平表达以下至少一种细胞表面标记：CD34、CD31和CD45。
可选择地或额外地，T-MSC的鉴定可根据它们表达低水平的以下一种或多种促炎蛋白：MMP2、RAGE、IFNGR2、TNFα、IL-12A、IL-6和CAM1。以上所述的基因表达模式是与骨髓间充质干细胞相比较的。尤其是，IL-6在BM-MSCs的表达量高于T-MSC。IL-6是一种多效的细胞因子，参与造血细胞、免疫细胞和基质细胞之间的交叉作用，包括炎症的发生和终止。
所述T-MSC的特性还在于：它们有能力在体外抑制受到刺激后的T细胞的增殖。这种特性与BM-MSCs不能在体外抑制受到刺激后的T细胞的增殖形成对比。
因此，这里所描述的T-MSC至少有以下一种特性：(1)分化为脂肪细胞、软骨细胞、神经元、成肌细胞、基质细胞和成纤维细胞；(2)具有成纤维样细胞的形态；(3)不表达或表达低水平的CD34、CD31和/或CD45；(5)不表达或表达低水平的MMP2、RAGE、IFNγR1、IFNγR2、IL-12、TNFα、IL-6和/或VCAM1，特别是IL-6；(6)表达低水平的MHC抗原HLA-G和/或HLA-ABC，或不表达HLA-DR和/或CD80；(7)：在体外抑制受到刺激后的T细胞的增殖。在某些实施方式中，所述T-MSCs具有至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、或所有7种特性。
在某些实施方式中，T-MSC区别于先前报道的HB-MSC。T-MSC的CXCR7、CXCL2和/或CXCL12的表达水平比HB-MSC至少高一倍。但是T-MSC的HOXB2、HOXB3、HOXB5、HOXB7、HOXB9、HOXA5、HOXA9和HOX家族其他基因的表达水平至少比T-MSC少一半。
此外，T-MSC具有独特的、穿过血脑屏障和血脊髓屏障的能力，这种穿透能力使该细胞特别适合治疗和诊断应用。本发明的T-MSC具有迁移进出脊髓的血管、穿过血脊髓屏障的能力，以在中枢神经系统发挥作用，这种作用包括但不限于递送用于治疗和诊断的药物。这与BM-MSCs不具有此功能形成反差。
本发明的另一个实施方式是辐射T-MSC。这个实施方式的特征在于，被辐射的T-MSC具有以上所列举的至少1种特性、至少2种特性、至少3种特性、至少4种特性、至少5种特性、至少6种特性或至少所有7种特性。
在另一个实施方式中，所述细胞培养物包括T-MSC。在某些实施方式中，所述T-MSC分化成脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、神经元、成肌细胞、基质细胞和成纤维细胞。在某些实施方式中，所述T-MSC表达CD73、CD90、CD105、CD13、CD29、CD54、CD44、CD146和/或CD166。在某些实施方式中，所述细胞表达低水平或不表达CD34、CD31和/或CD45。在某些实施方式中，所述细胞表达低水平或不表达MMP2、RAGE、IFNγR1、IFNγR2、IL-12、TNFα、IL-6和/或VCAM1，特别是IL-6。在某些其他的实施方式中，所述细胞表达主要组织相容性复合体抗原HLA-G和/或HLA-ABC，并且表达低水平或不表达HLA-DR和/或CD80。在某些实施方式中，所述细胞在体外抑制受到刺激后的T细胞的增殖。在某些实施方式中，所述细胞可以穿过血脑屏障和血脊髓屏障。在某些实施方式中，所述细胞被辐射。
在另一方面，本文公开一种包括T-MSC.的药物制剂。在某些实施方式中，所述T-MSC分化成脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、神经元、成肌细胞、基质细胞和成纤维细胞。在某些实施方式中，所述T-MSC表达CD73、CD90、CD105、CD13、CD29、CD54、CD44、CD146和/或CD166。在某些实施方式中，这些细胞表达低水平或不表达CD34、CD31和/或CD45。在某些实施方式中，所述细胞表达低水平或不表达MMP2、RAGE、IFNγR1、IFNγR2、IL-12、TNFα、IL-6和/或VCAM1，特别是IL-6。在某些实施方式中，所述细胞表达主要组织相容性复合体抗原HLA-G和/或HLA-ABC，并且表达低水平或不表达HLA-DR和/或CD80。在某些实施方式中，所述细胞可以穿越血脑屏障和血脊髓屏障。在某些实施方式中，所述细胞被辐射。可以使用任何药学可接受的载体和辅药制备所述药物制剂。
本文提供多种T-MSC，其中，这些T-MSC直接从人胚胎干细胞系获得和分离。这些人胚胎干细胞系已经被传代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30或更多代数或其组合。
在某些实施方式中，本文提供一种冷冻的T-MSC、或部分或终末分化的细胞。
在某些实施方式中，本文提供T-MSC的医疗用途，或T-MSC组合物，或T-MSC制剂，包括被辐射的T-MSC。这些细胞和药剂可以用于治疗所述的疾病，也可以应用于递药系统，这些药物需要穿越血脑屏障和血脊髓屏障。
在某些实施方式中，本发明提供制备的冷冻保存的滋养细胞、前-T-MSC、部分或其中终末端分化的T-MSC。
在某些实施方式中，本发明提供了T-MSC的医疗用途，或组合物，或T-MSC制剂，包括被辐射的T-MSC。这些细胞和药剂可以用于治疗任何所述的症状或整个说明书中详述的疾病，也可以应用于递药系统，这些药物需要穿过血脑屏障和血脊髓屏障。
5.4选择和生产T-MSC群
这里提供一种鉴别具有高度免疫抑制效力的T-MSC的方法，其中，通过鉴别T-MSC的生物标记的表达模式，所述的T-MSC是具有高度免疫抑制效力的、临床级别的并且应用于治疗。在某些实施方式中，这些临床级别的T-MSC具有以下特性：(i)包含>95％的细胞表达组-1标记；(ii)包含>80％的细胞表达组-2标记；(iii)包含<5％的细胞表达组-3标记；(iv)表达IL-10和TGFβ；(v)包含<2％的细胞表达IL-6、IL-12和TNFα；(vi)包含<0.001％的细胞共表达所有组-4的标记。这里的组-1标记是：CD73、CD90、CD105、CD146、CD166和CD44。组-2标记是：CD13、CD29、CD54和CD49E。组-3标记是：CD45、CD34、CD31和SSEA4。组-4标记是：OCT4、NANOG、TRA-1-60和SSEA4。
在某些实施方式中，所述方法包含检测编码抗炎症因子(AIF)和促炎症因子(PIF)标记的差异表达。在某些实施方式中，所述抗炎症因子是IL-10和TGFβ2。在某些实施方式中，促炎症因子的表达上调。在某些实施方式中，以上标记在T-MSC的表达量至少是BM-MSC的1.5倍。在某些实施方式中，促炎症因子是IL-6、IL-12、TNFα、CCL2、VCAM1、RAGE和MMP2。在某些实施方式中，促炎症因子的表达下降。在某些实施方式中，以上标记在T-MSC的表达量至少比BM-MSC的少一半。在另一个实施方式中，具有高度免疫抑制能力的T-MSC的IL-6阳性的细胞比率少于5％、4％、3％、2％或1％。在某些实施方式中，T-MSC可能表达高水平的TGFβ2和IL-10。在某些实施方式中，所述标记的表达是以BM-MSC为对照。
这里提供临床级别的T-MSC群的鉴定程序。为了确定T-MSC群是否适合应用治疗，需要检测细胞群特异性生物标记的表达。这些生物标记包括例如，(1)间充质干细胞的标记：CD73、CD90、CD105、CD166和CD44(第一组)；(2)间充质干细胞的标记：CD13、CD29、CD54、CD49E、SCA-1和STRO-1(第二组)；(3)造血干/祖细胞的标记：CD45、CD34，以及内皮细胞的标记CD31；(4)免疫标记：HLA-ABC、HLA-G、CD80和CD86；(5)细胞因子：IL-10、TGFβ、IL-6和IL-12；(6)多能性的标记：OCT4、NANOG、TRA-1-60和SSEA-4。在某些实施方式中，T-MSC群包含超过95％、96％、97％、98％或99％的细胞表达至少一个组-1标记。在某些实施方式中，T-MSC群包含超过80％、85％、90％、95％或99％的细胞表达至少一个组-2标记。在某些实施方式中，在某些实施方式中，T-MSC群包含少于0.1％、0.08％、0.05％、0.03％、0.02％或0.01％的细胞表达至少一个组-3标记。在某些实施方式中，T-MSC群包含超过80％、85％、90％、95％或99％的细胞表达IL-10和/或TGFβ。在某些实施方式中，T-MSC群包含少于5％、4％、3％、2％、1％的细胞群表达IL-6和/或IL-12。在某些实施方式中，T-MSC群包含少于0.001％的细胞表达至少一个第六组标记。在某些实施方式中，临床前级别的T-MSC作为阳性对照，与临床级别的T-MSC相比较。在某些实施方式中，通过多色流式细胞术和/或免疫荧光分析T-MSC的特点。在某些实施方式中，T-MSC群表达CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、TNFα、TGFβ、IFNγ、GM-CSF、G-CSF、bFGF、CXCL5、VEGF、TPO或其组合。在某些实施方式中，也对T-MSC群作以下分析：(1)存在外源性材料如内毒素和残留的细胞因子/生长因子，和/或(2)基因异常(利用核型分析和全基因组测序)。
这里提供另外一种对临床级别T-MSC群的鉴定程序。拥有更好再生潜力和免疫抑制功能的T-MSC可能表达更低水平的CD29。在这里，1-2代T-MSC的CD29的表达量作为本底水平，如果在后续的某一代和程序中，T-MSC的表达水平升高2倍，那么这些细胞将被停止传代。
对T-MSC的基因表达模式的检测方法是本领域已知的。这些方法包括但不限于：流式细胞术、多重芯片、RT-PCR、RNA印迹和蛋白质印迹。在某些实施方式中，对MSC的基因表达模式的分析采用基于多种细胞因子分析的流式微球检测、基于多种细胞因子分析的luminex系统、基因表达的高通量分析、定量RT-PCR、酶联免疫斑点测定法、细胞因子酶联免疫吸附测定、荧光素酶报告系统、流式细胞术、荧光报告系统、组织染色和免疫荧光染色。
5.4.1检测核酸生物标记的方法
在具体的实施方式中，核酸属于生物标记谱中的一种生物标记。这些生物标记和生物标记谱相应的特征可能通过以下所述产生，如检测一个或多个生物标记的基因表达产物(如多核苷酸和多肽)。在一个具体的实施方式中，这些生物标记和生物标记谱相应的特征的获得渠道是：利用本领域所熟知的任何方法检测和/或分析这里公开的一种标记所表达的一种或多种核酸，所述的方法包括但不限于杂交、芯片分析、RT-PCR、核酸酶保护测定和RNA印迹分析。
在某些实施方式中，检测和/或分析核酸的方法和本发明的组合物包括RNA分子，例如表达的RNA分子(包括mRNA分子)、mRNA的可变剪切、调控RNA、cRNA分子(如RNA分子在体外转录为cDNA分子)和其识别片段。
在具体的实施方式中，在体外制备的核酸来自存在细胞培养物核酸，或从细胞培养物分离的、或部分分离的核酸，所述细胞培养物是本领域所熟知的。以上所述一般描述在如，Sambrook等，2001，分子克隆，实验手册，第三版，冷泉港实验室出版社(纽约冷泉港)，该文件全部内容在此引入作为参考。
5.4.1.1核酸阵列
在某些实施方式中，核酸阵列通过检测任何一个或多个这里所述的生物标记，获得生物标记谱的生物标记的特征。在本发明的一个实施方式中，利用微阵列如cDNA微阵列检测生物标记谱的生物标记的特征值。以下描述cDNA微阵列分析的示例方法和实施方式。
在某些实施方式中，通过与阵列上可检测的标记的核酸杂交获取生物标记谱的生物标记的特征值，所述标记的核酸代表生物样本中存在的mRNA转录本的核酸序列，或与这些序列一致。所述生物样品(如合成来自样本的荧光标记的cDNA)与包含一个或多个探针斑点的微阵列相杂交。
有不同的方法制备核酸阵列如微阵列，在本文下面描述其中一些方法。优选地，阵列是可再复制的，允许生产给定阵列的多个拷贝并相互比较。优选地，阵列由在结合(例如，核酸杂交)条件下稳定的材料制造。本领域技术人员将会知道在阵列上杂交测试探针至探针斑点所用的适宜支持物、基质或载体，或将能利用普通实验确定这些适合的载体。
阵列如微阵列在使用时可包括一个或多个测试探针。在某些实施方式中，每一个这样的测试探针包含一个与所要检测的RNA或DNA的亚序列互补的多核苷酸序列。每个探针通常具有不同的核酸序列，并且每个探针在阵列的固体表面上的位置通常是已知的或可确定的。对本发明有用的阵列可包括，例如寡核苷酸微阵列、基于cDNA的阵列、单核苷酸多态性阵列、可变剪切体阵列和任何其他能够提供本文所述的标记的表达的定性、定量或半定量的阵列。某些类型的微阵列是可寻址的阵列。更具体地，一些微阵列是定位的可寻址的阵列。在一些实施方式中，阵列的每一个探针的位置是已知的。已知固体载体上的预定位置，从而每个探针的身份(例如，序列)可以从其在阵列上(例如，载体或表面上)的位置确定。在某些实施方式中，这些阵列是有序的阵列。微阵列一般描述于Draghici，2003，DNA微阵列数据分析工具，Chapman和Hall/CRC，该文件全部内容在此引入作为参考。
5.4.1.2RT-PCR
在某些实施方式中，为确定在一个或多个本文所述标记的表达水平的生物标记谱中的生物标记的特征值，该特征值是通过使用逆转录(RT)，并结合了从样品中扩增RNA的聚合酶链式反应(PCR)。按照该实施方式，反转录可以定量或半定量的。本文所教导的，所述RT-PCR方法可以与上述的微阵列的方法结合使用。例如，可以进行一个批量的PCR反应，并且PCR产物可被解析和用作微阵列上探针斑点。
使用总RNA或mRNA作模板，并且与标记(或多个)转录部分特异性配对的引物用于启动逆转录。RNA逆转录为cDNA的方法是众所周知的，参照上文Sambrook等(2001年)所著。引物设计可以根据已发表的或可从任何可公开获得的序列数据库，如GenBank中的已知核苷酸序列来实现。可设计针对本文所述的任何标记的引物。另外，可利用商购的软件设计引物(例如，Primer Designer 1.0和Scientific Software等)。反转录的产物随后被用作PCR的模板。
PCR提供了一种通过使用由热稳定的、依赖DNA的DNA聚合酶催化的DNA复制的多个循环来扩增感兴趣的靶序列的快速扩增特定核酸序列的方法。PCR反应需要存在：被扩增的核酸、被扩增的核酸侧翼的两条单链寡核苷酸引物、DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸缓冲液和盐离子。PCR技术的方法是本领域所熟知的技术。对PCR的使用可参考如Mullis和Faloona，1987年，酶学方法，155:335。该文件全部内容在此引入作为参考。
PCR扩增需要模板DNA或cDNA(至少10fg，更有效地，1-1000ng)和寡核苷酸引物(至少25pmol)。典型的反应混合物包括：2μl DNA、25pmol的寡核苷酸引物、2.5μl 10M PCR缓冲1(Perkin-Elmer，福斯特城，加利福尼亚州)、0.4μl 1.25M的dNTP、0.15μl(或2.5units)TaqDNA聚合酶(Perkin-Elmer，福斯特城，加利福尼亚州)和添加去离子水至总体积25μl。矿物油覆盖PCR反应体系，在用可编程热循环仪进行PCR反应。
定量RT-PCR(“QRT-PCR”)本质是定量的，也可以提供对标记表达水平的定量测量。QRT-PCR的逆转录和PCR反应可以分两步进行，或者这两个反应可以同时发生。其中一项技术使用特异转录的反义探针，通常有市售的试剂盒，如Applied Biosystems(福斯特城，加利福尼亚州)的Taqman试剂盒(Perkin Elmer，福斯特城，加利福尼亚州)。该探针是特异性的PCR产物(例如，来自基因的核酸片段)，并且含有猝灭基团和络合至所述寡核苷酸5'末端的荧光报告基团。不同的荧光标记连接到不同的探针上，从而允许在一个反应中测量两种探针。当Taq DNA聚合酶被激活时，它利用其5'至3'外切酶活性清除结合于模板上的荧光报告基团。在不存在所述淬灭基团时，报告基团发光。探针颜色的变化与每一个特异性产物的含量成正比，并通过荧光计进行测量。因此，可以测量每种颜色的量以及对PCR产物进生定量。所述PCR反应在96孔板中进行，以便同时检测许多不同来源的样品。所述的Taqman系统具有不需要凝胶电泳的附加优点，并且使用标准曲线时可以定量分析。
第二种技术，使用嵌入染料定量地检测PCR产物。这种染料如市售的QuantiTectSYBR Green PCR(Qiagen公司，瓦伦西亚，加利福尼亚州)。在PCR反应阶段，SYBR Green染料掺入双链的PCR产物中，并且产生的荧光信号与PCR产物的量成正比。
RNA逆转录后都可以使用Taqman和QuantiTect SYBR。逆转录既可以在相同的反应体系作为PCR的步骤(一步法)，也可以在PCR扩增之前完成(两步法)。此外，已知的其它定量检测mRNA表达的系统包括Molecular Beacons，该系统使用的探针具有荧光分子和猝灭剂分子，这种探针可以形成发夹结构，当发夹形成时，荧光分子淬灭；当探针杂交至PCR产物时，发出荧光信号，根据杂交荧光信号的强度定量地检测基因表达。
5.4.1.3RNA印迹试验
本领域任何已知的杂交技术可用于产生生物标记谱的生物标记的特征值。在其他具体实施中，可通过RNA印迹分析获得生物标记谱中的生物标记的特征值，RNA印迹分析和定量特异的RNA分子。一个标准的RNA印迹可用于确定一种RNA转录物的大小，鉴定选择性剪接的RNA转录物，鉴定本文所述的一个或多个基因在样品中的相对量(尤其是mRNA)。按照本领域普通技术人员所知的常规RNA杂交技术，在RNA印迹中，RNA样本首先在变性的琼脂糖凝胶上电泳，根据大小分离RNA，然后将RNA转印至膜上，与标记的探针交联和杂交。可以使用非同位素或高活性的放射性标记的探针，包括随机引发的、缺口翻译的、或PCR产生的DNA探针和在体外转录的RNA探针和寡核苷酸。另外，仅部分同源的序列(例如，来自不同的物种的cDNA或基因组DNA片段可能含有一个外显子)可以用作探针。标记的探针，例如放射性标记的cDNA，要么包含全长、单链的DNA，要么是该DNA序列的片段，其中长度可以是至少20个、至少30个、至少50个或至少连续100个核苷酸。可通过任何本技术领域技术人员所熟知的许多不同方法标记探针。最常用于这些研究的标记是放射性元素、酶、暴露于紫外时会发出荧光的化学物质以及其它。许多荧光物质是已知的并且可以用作标记。这些包括但不限于荧光素、罗丹明、金胺、得克萨斯红、AMCA蓝和荧光黄。放射性标记可以通过任何目前可用的计数方法来检测。同位素包括但不限于3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I和186Re。酶标记也是可用的，并且可以通过任何现有的比色法、分光光度法、荧光光度法、电流分析法或气体定量技术检测。酶通过与桥接分子如碳化二亚胺、二异氰酸酯、戊二醛等反应，偶联于选择的粒子。可以使用本领域技术人员已知的任何一种酶。这些酶的实例包括但不限于过氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶和碱性磷酸酶。可参考美国专利号3654090、3850752和4016043。
5.4.2检测蛋白的方法
在本发明的具体实施方式中，可以通过检测蛋白质获得生物标记谱的生物标记特征值，例如，通过检测本文所述的一种或多种标记的表达产物(如核酸或蛋白质)、或翻译后修饰的蛋白质、或其它修饰的蛋白质、或经加工的蛋白质。在一个具体的实施方式中，可通过检测和/或分析一种或多种蛋白质和/或本文公开的标记表达的识别片段产生生物标记谱，其中，检测蛋白的方法是本领域技术人员所知的任何方法，包括但不限于蛋白质微阵列分析、免疫组织化学和质谱分析。
免疫分析的标准技术可用于检测检测蛋白质的量和细胞培养物中感兴趣的蛋白。例如，先进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后进行蛋白质印迹和免疫共沉淀检测蛋白质的量和样本中感兴趣的蛋白，其它检测方法还有免疫细胞化学等。用于检测目的蛋白质的一种示例性试剂是能够特异性结合到感兴趣的蛋白的抗体。优选可检测标记的抗体，不管是直接还是间接标记。
对于这样的检测方法，利用本领域所熟知的技术很容易分离得到在细胞培养物中想要分析的蛋白质。蛋白质分离方法可参考，例如Harlow和Lane，1988年，抗体：实验室手册，冷泉港实验室出版社(冷泉港，纽约)，该文件全部内容在此引入作为参考。
在某些实施方式中，检测蛋白质或目的蛋白的方法涉及蛋白质－特异性抗体的相互作用。例如，抗体针对感兴趣的蛋白。可以利用本领域熟知的标准技术产生抗体。在具体的实施方式中，抗体可以是多克隆的，或更优选的是单克隆抗体。可以使用完整的抗体或抗体片段(例如，单链抗体，Fab或F(ab')2。
例如，能特异性结合目的蛋白的抗体或片段可以用来定量或定性检测蛋白质的存在。以上所述可以通过例如免疫荧光技术实现。另外，可以使用抗体(或其片段)在组织学中原位检测目的蛋白，如免疫免疫荧光或免疫电镜术。可通过从病人取的生物样本(如活检样本)，并对其添加针对感兴趣蛋白的抗体完成原位检测。施用抗体(或片段)优选使抗体(或片段)覆盖生物样本。通过使用这样的方法，在特定的样本中有可能不仅检测目标蛋白是否存在，还检测其分布。多种已知的组织学的方法(如染色方法)可实现这种原位检测。
检测目的蛋白的免疫测定法通常包括可检测标记的抗体与样本温育，该抗体能够鉴定目的蛋白。此外，免疫测定法还包括利用本领域所熟知的任何技术检测结合的抗体。为下面更详细地讨论，术语“标记”可以指直接标记抗体，如耦合(也就是物理上连接)可检测的物质到抗体上，也可指间接标记抗体，该抗体通过与其它直接标记的物质反应。间接标记的实例包括用荧光标记第二抗体对第一抗体进行检测。
样品可接触固相支持物或载体如硝酸纤维素，或能固定细胞、细胞颗粒或可溶蛋白的其他固相支持物或载体。然后用适宜的缓冲液洗涤所述支持物，接着用可检测标记的指纹基因－特异性抗体处理。紧接着用缓冲液第二次洗涤固相支持物，以除去未结合的抗体。最后可以通过常规的方法来检测结合在固相支持物上标记的量。
“固相支持物或载体”是指能够结合抗原或抗体的任何支持。熟知的支持物或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺和磁铁矿。载体的性质在一定程度上是可溶的，或对于本发明的目的是不可溶的。所述载体材料可以具有任何可能的结构构型，只要偶联的分子能够结合抗原或抗体。因此，支撑结构可以是球形，如珠子、或圆柱形的，如在试管的内表达，或棒的外表面。优选的支持物包括聚苯乙烯珠。那些熟练的技术人员将知道很多其它合适的、用于结合抗体或抗原的载体，或将能够通过常规实验来确定。
特异地针对目的蛋白的抗体能够可检测地标记的一种方法是将该抗体与酶相连，然后用于酶免疫分析(EIA)(可参照Voller，1978，"The Enzyme Linked ImmunosorbentAssay(ELISA)"，Diagnostic Horizons 2:1-7，Microbiological Associates QuarterlyPublication，Walkersville，Md.；Voller et al.，1978，J.Clin.Pathol.31:507-520；Butler，J.E.，1981，Meth.Enzymol.73:482-523；Maggio(ed.)，1980，Enzyme Immunoassay，CRC Press，Boca Raton，Fla.；Ishikawa等，(eds.)，1981，Enzyme Immunoassay，KgakuShoin，Tokyo.每一个文件的全部内容在此引入作为参考)。与抗体结合的酶将与合适的底物反应，优选为显色底物。通过以这样的方式，如过分光光度法、荧光法或视觉手段检测产生可检测的化学物质。可以用于可检测标记抗体的酶包括但不限于苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-磷酸甘油脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。所述检测可以通过使用比色方法完成，该方法采用酶的显色底物。还可以通过将酶与底物反应的程度与类似制备的标准物进行肉眼比较以完成检测。
还可以用任何各种其它免疫方法完成检测。例如，利用放射性标记的抗体或抗体片段，有可能通过使用放射免疫测定法(RIA)来检测目的蛋白(参见，例如，温特劳布，1986，放射免疫测定原理，第七次培训课程放射性检测技术，内分泌学会，在此通过引用将其整体并入本文)。放射性同位素(例如125I、131I、35S或3H)可以通过诸如使用γ计数器或闪烁计数器或通过放射自显影来检测。
另外，也可以用荧光化合物标记抗体。当荧光标记的抗体暴露于适当波长的光，就能通过荧光检测抗体的存在。其中最常用的荧光标记化合物是异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻-苯二醛和荧光胺。
也可以用发出荧光的金属可检测性地标记抗体，如152Eu或其它镧系元素。这些金属可以通过金属螯合基团如二亚乙基三乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)连接到抗体。
还可以通过将抗体偶联到化学发光的化合物上实现可检测性地标记抗体。检测在化学反应过程中产生的光就可以确定化学发光标记的抗体。特别有用的化学发光标记化合物是鲁米诺、异鲁米诺、染色吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。
同样地，生物发光化合物可用于标记本发明的抗体。生物发光是在生物系统中发现的一种化学发光，其中催化性蛋白提高了化学发光反应的效率。可通过检测发光的存在来确定生物发光蛋白的存在。用于标记目的重要的生物发光化合物是萤光素、萤光素酶和水母发光蛋白。
在另一个实施方式中，除了抗体，特异性结合的分子如核酸适配体可用于结合生物标记。在另一个实施方式中，生物标记谱可包括传染性病原体中可检测的部分(例如，脂多糖或病毒蛋白)或其组分。
在某些实施方式中，蛋白质芯片测定法(例如，生物标志物系统，赛弗吉，弗里蒙特，加州)用于检测生物标记谱中的生物标记特征值。也参见，例如，Lin2004，Modern Pathology，1-9；Li，2004，Journal of Urology，171，1782-1787；Wadsworth，2004，Clinical Cancer Research，10，1625-1632；Prieto，2003，Journal of LiquidChromatography&Related Technologies 26，2315-2328；Coombes，2003，ClinicalChemistry 49，1615-1623；Mian，2003，Proteomics 3，1725-1737；Lehre等，2003，BJUInternational 92，223-225；和Diamond，2003，Journal of the American Society forMass Spectrometry，14，760-765。其每一个在此通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方式中，珠测定法用于检测生物标记谱中的生物标记特征值。BectonDickinson公司的流式微球阵列法系统(CBA)就是一个珠测定法。CBA使用一系列颗粒与离散的荧光强度来同时检测多种可溶性分析物。CBA与流式细胞术结合创建多路试验。BectonDickinson公司CBA的系统，具体的例子如Becton Dickinson人炎症试剂盒，在基于颗粒的免疫测定中，使用流式细胞术放大荧光检测的灵敏度检测可溶性分析物。CBA中的每颗珠提供特异性蛋白的捕获表面，类似于一个ELISA平板的、单独包被的孔。BD公司的CBA捕获珠复合物是悬浮的，以致于容许检测多种小体积的化合物。
在一些实施方式中，多重分析方法在美国专利5981180(下称“'180专利”)描述，通过引用将其整体并入，特别是用于教导通用方法、珠技术、系统硬件和抗体检测，并且用来检测生物标记谱的生物标记。为了这种分析，合成微粒的基质，其中所述基质包含由不同组的微粒组成。每组微粒可以有数千个不同的抗体俘获试剂的分子固定在微粒表面并且是颜色便编码的，因为掺入了不同量的两种荧光染料。两种荧光染料的比率为每组微粒提供了一个不同的发射光谱，因此鉴定微粒群中的微粒。美国专利号6268222和6599331也都通过引用的方式整体并入，特别是用于教导标记的微粒进行多重分析的各种方法。
5.4.3使用的其它检测方法
在一些实施方式中，分离方法可以用于检测生物标记谱的生物标记特征值，这样就能分析标本中生物标记的一个子集。例如，被分析的生物标记可以是来自细胞提取物的mRNA。这些细胞提取物已经被分馏，仅仅获得核酸生物标记，或者这些生物标记可以来自样本中蛋白总补体的一部分，这些样本已经通过色谱技术分馏。
生物标记谱的生物标记的特征值也可以通过使用如下所述的一种或多种方法产生。例如，可以包括核磁共振(NMR)波谱、质谱法，如电喷雾电离质谱(ESI-MS)、ESI-MS/MS、ESI-MS/(MS)n(n是一个整数大于零)、激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)、表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)、解吸/电离上硅(DIOS)、二次离子质谱(SIMS)、四极杆飞行时间串联质谱(Q-TOF)、大气压化学电离质谱(APCI-MS)、APCI-MS/MS、APCI-(MS)n、大气压光电离质谱(APPI-MS)、APPI-MS/MS和APPI-(MS)n。其它质谱方法可包括，尤其是四极、傅里叶变换质谱(FTMS)和离子阱。其它合适的方法可包括化学提取分配、柱层析、离子交换层析、疏水(反相)液相色谱法、等电聚焦、一维聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)或其它色谱法，例如薄层、气相或液相色谱法，或其任意组合。在一个实施方式中，所述生物样品可在应用分离方法前先分馏。
在一个实施方式中，激光解吸/电离飞行时间质谱用于检测生物标记谱中的生物标记的特征值，其中所述生物标记是蛋白或蛋白片段，它们被离子化，并被激光辐射而蒸发至固定的支持物。特征值是峰表示存在与否，而所述峰代表这些碎片在质谱的模式。各种激光解吸/离子化技术是本领域所熟知的，可参见Guttman et等，2001，Anal.Chem.73:1252-62和Wei等，1999，Nature 399:243-246。每个内容通过引用的方式将其整体并入。
激光解吸/电离飞行时间质谱能够在一段相对短的时间内生成大量的信息。将生物样品加至不同样的载体上，所述生物样品或其子集结合所有的生物标记。经过或未经过纯化或分馏的细胞裂解物或样品，以体积低至0.5μL直接施加到这些载体表面。在施加至载体表面之前，可将裂解物或样品浓缩或稀释。然后用于生成激光解吸/电离质谱的样本或样品，所用时间只需要短短3小时。
5.4.4数据分析算法
T-MSC生物标记的表达谱是区分临床级别和非临床级别T-MSC的参考因素。这些生物标记的身份及其相对应的功能(例如，表达)可用于建立一个或多个的决策规则。特定数据分析算法建立的一个或多个决策规则，可区分临床级别和非临床级别T-MSC。一旦使用这些典型数据分析算法或本领域中已知的其它技术建立决策规则，这些决策规则将用于将T-MSC群分类为两个或更多的级别(例如临床级别和非临床级别)。这是通过将决策规则应用于从细胞培养物获得的生物标记谱实现的。因些，这样的决策规则在定义T-MSC时具有巨大的价值。
在某个实施方式中，本文提供了一种用于比较从待测和对照细胞培养物获得的生物标记谱的评价方法。在某些实施方式中，从对照群或待测细胞培养物获得的每种生物标记谱构成多个生物标记谱中的其中一项特征值。在某些实施方式中，这种比较是通过：(i)使用对照群的生物标记建立一种决策规则；(ii)将所述决策规则应用于待测细胞培养物的生物标记谱。这样，本发明的一些实施方式中应用的决策规则用于确定待细胞是临床级别或非临床级别。在其它实施方式中，对照群是BM–MSC。
在本发明的一些实施方式中，当应用决策规则鉴定待测细胞培养物是临床级别T-MSC，可用作治疗。如果鉴定结果发现是非临床级别，那么不能用作治疗。
5.5T-MSC的修饰
本文提供一种修饰的间充质干细胞生产一群免疫抑制功能获得提升的改良的MSC群的方法。所述MSC具有以下特征：(i)含有>95％的细胞表达组-1标记；(ii)含有>80％的细胞表达组-2标记；(iii)含有<5％的细胞表达组-3标记；(iv)表达IL-10和TGFβ；(v)含有<2％的细胞表达IL-6、IL-12和TNFα；(vi)含有<0.001％的细胞共表达所有组-1标记。这里所述组-1标记是：CD73、CD90、CD105、CD146、CD166和CD44；组-2标记是：CD13、CD29、CD54和CD49E；组-3标记是CD45、CD34、CD31和SSEA4；组-4标记是：OCT4、NANOG、TRA-1-60和SSEA4。
本文提供一种通过提高AIF表达而提升T-MSC的免疫抑制功能的方法。在一个实施中，所述方法包括PIF的表达下调。在一个实施方式中，所述方法包括IL6、IL12、TNFα、RAGE和其他PIF在T-MSC的表达下调。在一个实施方式中，所述方法包括TGFβ和IL-10在T-MS的表达上调。
在某些实施方式中，所述方法包括T-MSC的遗传和表观遗传修饰，所述修饰是本领域已知的。在某些实施方式中，遗传修饰和表观遗传修饰包括但不限于敲除、小发夹RNA(“shRNA”)、微小非编码RNA(“miRNA”)、非编码RNA(“ncRNA”)、吗啉寡聚核苷酸、诱饵RNA、DNA甲基化调控、组蛋白甲基化调控、翻译抑制和/或抗体封闭。在某些实施方式中，通过转座子、toll样受体配体或小分子修饰MSC。
在某些实施方式中，使用小分子靶向作用IL-6信号通路的任何元件。在某些实施方式中，RN SYP靶标包括但不限于gp130、STAT3、Cathepsin S、NFkappaB和IRF5。在某些实施方式中，通过以下方式使T-MSC的IL-12表达减少：前列腺素E2信号通路激活；胞内环腺苷酸(cAMP)以及cAMP激动剂包括但不限于毛喉素、霍乱毒素、β1和β2肾上腺肾上腺素受体的水平上升；NF-κB Rel-B信号通路被抑制；使用凋亡细胞处理T-MSC；使用磷脂酰丝氨酸处理T-MSC；使用丁酸盐处理T-MSC；使用雷公藤甲素或雷公藤提取物或合成的雷公藤甲素(即Minnelide)处理T-MSC。
在某些实施方式中，可利用重组基因领域所熟知的技术修饰MSC使其表达某一标记。在某些实施方式中，可通过转染编码标记的核酸序列修饰MSC。所述标记可插入至适当的表达载体，即含有对插入的编码序列的转录和翻译所必需的元件的载体。必要的转录和翻译元件也可以存在。调节区和增强子元件可以是各种来源的，天然的和合成的。各种宿主-载体系统可用于表达所述标记。这些包括但不限于感染病毒(如病毒、牛痘病毒、腺病毒等)的哺乳动物细胞系统；感染病毒(如杆状病毒)的昆虫细胞系统；微生物如包含酵母载体的酵母和转化噬菌体、DNA、质粒DNA、粘粒DNA的细菌；通过转化可选择标记的稳定细胞系。载体表达元件的优势和特点各不相同。根据使用的宿主-载体系统，可以使用许多合适的转录和翻译元件中的任何一个。
一旦合成编码合适标记的载体，可将感兴目的载体转化或转染MSC。
可使用标准方法将目的核酸序列引入MSC。任何已知的转化方法可将多核苷酸引入宿主细胞，包括如将多核苷酸包装入病毒并将病毒转导至宿主细胞，或直接摄入多核苷酸。哺乳动物转化(即转染)，可通过磷酸钙沉淀法(参见Graham和Van der Eb，1978，Virol.52:546，)或已知修饰的病毒直接摄入。将重组多核苷酸引入细胞，尤其是哺乳动物细胞的方法，包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙介导的转染、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸包装于脂质体、将多核苷酸在显微镜下直接注射至细胞核。这些方法是本领域技术人员所熟知的。
在一个优选的实施中，含有目的载体的稳定细胞系用于高通量筛选。这种稳定细胞系的制备可通过引入包含选择性的标记载体，允许细胞在完全培养基生长1－2天，然后使细胞生长在选择性培养基中。重组质粒中的选择性标记用于选择，并且允许在染色体中稳定插入该重组质粒的细胞长生，进行形成克隆和扩增为细胞系。
可以使用的选择系统有多种，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(参见Wigle等.，1977，Cell 11:223)、次黄嘌呤-鸟嘌呤转磷酸核糖基酶(参见Szybalska和Szybalski，1962，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:2026)和腺嘌呤转磷酸核糖基酶(参见Lowy，et al.，1980，Cell 22:817)，这些基因可分别在tk敲除、hgprt-敲除或aprt敲除的细胞中使用。另外，可以将抗代谢物抗性用作选择，例如，dhfr能产生氨甲蝶呤的抗性(参见Wigler等.，1980，Natl.Acad.Sci.USA 77:3567；O'Hare，等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1527)；gpt能产生对霉酚酸的抗性(参见Mulligan和Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:2072)；neo能产生对氨基糖苷G418的抗性(Colberre-Garapin等，1981，J.Mol.Biol.150:1)；hygro能产生对潮霉素的抗性(参见Santerre等.，1984，Gene 30:147)。
5.6干细胞采集组合物
干细胞采集组合物可包括任何生理上可接受的适合于收集和/培养干细胞的溶液，例如盐溶液(如磷酸盐缓冲液、Kreb溶液、改良的Kreb溶液、Eagle溶液、0.9％NaCl溶液等)和培养基(如DMEM、H.DME等)，等等。
干细胞采集组合物可包含保护干细胞的一种或多种组分，即从收集到培养之间，防止干细胞免于死亡，或延迟干细胞的死亡，减少死亡细胞群的干细胞的数量，等等。这样的组件可以是，例如凋亡抑制剂(例如半胱天冬酶抑制剂或JNK抑制剂)；血管扩张剂(例如硫酸镁、抗高血压药物、心房利钠肽(ANP)、促肾上腺皮质激素、促肾上腺皮质激素释放激素、硝普钠、肼苯哒嗪、三磷酸腺苷、腺苷、吲哚美辛或硫酸镁、磷酸二酯酶抑制剂等)；坏死抑制剂(例如，2-(1H-吲哚-3-基)-3-戊氨基-马来酰亚胺、吡咯烷二硫代氨基甲酸酯或氯硝西泮)；TNF-α抑制剂；携氧全氟化碳(如全氟辛基溴、全氟癸基溴等)。
干细胞采集组合物可包含一种或多种组织降解酶，例如金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、中性蛋白酶、核糖核酸酶或脱氧核糖核酸酶，等等。这类酶包括但不限于胶原酶(例如胶原酶I、II、III或IV，来自溶组织梭菌的胶原酶等)、分散酶、嗜热菌蛋白酶、弹性蛋白酶、胰蛋白酶、释放酶、透明质酸酶，等等。
干细胞采集组合物可包括杀菌或抑菌有效量的抗生素。在某些非限制性的实施方式中，所述抗生素是大环内酯(例如妥布霉素)、头孢菌素(例如头孢氨苄、头孢拉定、头孢呋辛、头孢丙烯、头孢克洛、头孢克肟或头孢羟氨苄)、克拉霉素、红霉素，青霉素(例如青霉素V)或喹诺酮类(例如氧氟沙星、环丙沙星或诺氟沙星)、四环素、链霉素等。
干细胞采集组合物还可以包括以下的一种或多种化合物：腺苷(约1mM至约50mM)；D-葡萄糖(约20mM至约100mM)；镁离子(约1mM至约50mM)；分子量大于20000道尔顿的大分子。在一个实施方式中，以下物质的含量足以维持内皮完整性和细胞活性，例如，合成的或天然的胶体，多糖例如葡聚糖或聚乙二醇，约25g/l至约100g/L，或约40g/L至约60克/L；抗氧化剂，例如丁基羟基苯甲醚、丁基羟基甲苯、谷胱甘肽、维生素C或维生素E约25μM至约100μM；还原剂，例如约0.1mM至约5mM的N-乙酰半胱氨酸；阻止钙离子进入细胞的药剂，例如维拉帕米，约2微米至约25微米；抗凝血剂。在一个实施方式中，以下物质的含量足以帮助防止残留的血液凝固，例如肝素或水蛭素，约1000单位/l至约100000单位/l；或含阿米洛利化合物，例如阿米洛利、乙基异丙基氨氯吡咪、六亚甲基氨氯吡脒、二甲基氨氯吡咪或异丁基氨氯吡咪，约1.0μM至约5μM。
5.7使用T-MSC免疫调节
本文提供一个或多个免疫细胞活性的调节(例如，下调细胞增殖、降低细胞存活、阻碍细胞迁移至受炎症位点、下调细胞促进或延长炎症的能力、提高细胞促进健康组织或器官的恢复体内平衡的功能)。这是通过免疫细胞(或细胞群)与多个T-MSC或iT-MSC接触实现的。在一个实施方式中，调节免疫应答的方法，包括多个免疫细胞和多个T-MSC或iT-MSC接触足够长的时间以使T-MSC或iT-MSC可检测地抑制免疫反应。其中，在混合淋巴细胞反应(MLR)中，T-MSC或iT-MSC可检测地抑制T细胞增殖。
因为BM-MSC或其它成体组织来源的MSC已经被用来治疗许多自身免疫性疾病，BM-MSC还通过限制炎症、分泌生长因子、分泌保护因子和替换受损组织应用于组织修复。如后面的例子所示，T-MSC比BM-MSC具有更优良的免疫抑制功能。因此，T-MSC可以应用于当前BM-MSC应用的所有领域和疾病。
用于免疫调节的T-MSC或的iPS-MSC可以分别从胚胎干细胞系或诱导的多能干细胞系衍生或获得。用于免疫调节的T-MSC或的iPS-MSC还可以来自与活性要被调节的免疫细胞相同的物种；或者来自与活性要被调节的免疫细胞不同的物种。
本方法的上下文中，“免疫细胞”是指免疫系统中任何的细胞，特别是T细胞和NK(自然杀伤)细胞。因此，在本方法的不同实施方式中，T-MSC和多个细胞细胞接触。其中所述的多个细胞，是或者包括多个T细胞(例如，多个的CD3+T细胞，CD4+T细胞和/或CD8+T细胞)和/或自然杀伤细胞。在方法的上下文中，“免疫应答”可以是免疫细胞对由免疫细胞发出的通常可感知刺激的任何反应，例如对抗原出现的反应。在各种实施方式中，免疫应答可以是T细胞增殖应答外来抗原。其中，T细胞例如CD3+T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞；外来抗原例如在自身免疫性疾病中，输血或移植物的抗原。免疫应答也可以是包含在移植物内的T细胞的增殖。免疫应答也可以是自然杀伤细胞任何活性、树突细胞的成熟，等等。免疫应答也可以是活跃的一种或多种免疫细胞在局部、组织或器官中特异性的或系统性的作用。免疫应答可以是移植物抗宿主病、炎症、形成炎症相关瘢痕组织、自身免疫症状(例如类风湿性关节炎、I型糖尿病、系统性红斑狼疮等)，等等。
在此上下文中的“接触”包括：把T-MSC细胞和免疫细胞一起放在单个容器(例如培养皿、烧瓶、小瓶等)或在体内，例如同一个体(例如哺乳动物，例如人)。在一个优选实施方式中，接触的时间是足够长的，并且T-MSC细胞和免疫细胞数量足够多，以致免疫细胞的免疫功能的改变是可检测的。更优选地，在各种实施方式中，所述接触足以抑制免疫功能(如T细胞增殖响应抗原例)，与不存在T-MSC相比较，T-MSC至少抑制50％、60％、70％、80％、90％或95％的免疫功能。这种在体内的抑制可在体外测定，也就是说，可以在体外的试验中推测特定数量的T-MSC在接受者体内对若干免疫细胞的抑制程度，。
在一些实施方式中，本发明提供使用T-MSC在体外调节一种或多种类型免疫细胞的多个免疫反应或活性的方法。T-MSC和多个免疫细胞接触可以包括T细胞和免疫细胞在同样的实体空间，这样，至少多个T-MSC的其中一部分和多个免疫细胞的其中一部分相互作用；或可以包括，来自T-MSC或免疫细胞培养物的培养基和其它类型细胞接触(例如，从T-MSC的培养物得到的培养基和在这个培养基中重新悬浮的分离免疫细胞)。在一个具体实施方式，接触是一个混合淋巴细胞反应(MLR)。
例如，这样的接触可以发生在一个检测T-MSC免疫调节(如免疫抑制)程度的试验装置。这样的试验装置可以是，例如混合淋巴细胞反应(MLR)或回归分析。混合淋巴细胞反应和回归分析是本领域所熟知的，可参见如：Schwarz，"The Mixed Lymphocyte Reaction:An In Vitro Test for Tolerance，"J.Exp.Med.127(5):879-890(1968)；Lacerda等，"Human Epstein-Barr Virus(EBV)-Specific Cytotoxic T Lymphocytes HomePreferentially to and Induce Selective Regressions of Autologous EBV-InducedB Lymphoproliferations in Xenografted C.B-17Scid/Scid Mice，"J.Exp.Med.183:1215-1228(1996)。在一个优选的实施方式中，混合淋巴细胞反应在多个T-MSC和多个免疫细胞(如淋巴细胞，例如CD3+CD4+和/或CD8+的T淋巴细胞)接触中进行。
该MLR可用来測定多个T-MSC的免疫抑制能力。例如，可以在MLR中检测多个T-MSC，该MLR包括按，例如约10:1:2的比率结合CD4+或CD8+T细胞、树突细胞(DC)以及T-MSC，其中利用染料，例如分配进入子细胞的CFSE(作为举例)，对该T细胞染色，以及其中允许该T细胞增殖约6天。如果存在T-MSC时6天的T细胞増殖，与存在DC以及不存在T-MSC时的T细胞増殖相比，可检测到是降低的，则该多个T-MSC受到免疫抑制。在这样的混合淋巴细胞反应中，T－MSC可以是解冻的，也可以是从培养物中收集的。约10000个T-MSC重悬在100ml培养基中(RPMI1640，1mM HEPES缓冲液、抗生素和5％混合人血清)，并使其附着到皿底2小时。利用免疫磁珠从全外周血单核细胞分离CD4+和/或CD8+T细胞。这些细胞是CFSE染色的，并且总共100000个T细胞(仅添加CD4+，仅添加CD8+，或等量的CD4+和CD8+T细胞)添加至每个孔。每个孔液体的体积补至200μl，并允许进行混合淋巴细胞反应。
在一个实施方式中，因此，本发明提供一种抑制免疫细胞反应的方法，其中，在混合淋巴细胞反应中，多个免疫细胞和多个T-MSC接触足够长的时间以使T-MSC可检测地抑制T细胞增殖。
从不同胚胎干细胞系获得的T-MSC群的可以在调节免疫细胞活性的能力方面有所不同，例如可以在抑制T细胞活性或増殖或NK细胞活性的能力方面不同。因此，需要在使用前測定特定的T-MSC群的免疫抑制能力。这类能力可以，例如在MLR或回归分析中通过检测该羊膜来源贴壁细胞群的样本来測定。在一个实施方式中，用所述样本执行MLR以及在所述分析中测定该T-MSC群引起的免疫抑制程度。然后，可以将该免疫抑制程度归因于所取样的T-MSC群。因此，该MLR可以用作一种测定特定的T-MSC群抑制免疫功能的绝对和相对能力的方法。MLR參数可以是多祥化，以提供更多数据或更好地測定T-MSC样本的免疫抑制能力。例如，因为T-MSC产生的免疫抑制看起来以与该分析中存在的T-MSC的数量成比例的方式粗略增长，因此，在一个实施方式中，可以用两种或更多数量的T-MSC群(例如每个反应1×103、3×103、1×104和/或3×104个T-MSC)执行该MLR。该分析中，T-MSC与T细胞的相对数量还可以是多变的。例如，虽然可以使用相对大量的T-MSC或T细胞，但是，该分析中，T-MSC和T细胞可以按任何比率(例如约100:1至约1:100，优选地约1:5)存在。
本发明也提供在体内使用T-MSC调节免疫反应或调节一种或多种免疫细胞的多个活性的方法。T-MSC和免疫细胞可以，例如在作为多个T-MSC的接受者的个体中接触。当该接触在个体中进行时，在一个实施方式中，该接触发生在T-MSC(也就是，T-MSC并非来源于该个体)和对该个体来说是内源性的多个免疫细胞之间。在具体的实施方式中，该个体的免疫细胞是CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞和/或自然杀伤细胞。
使用T-MSC带来的免疫抑制对于任何情况引起的或恶化的、或相关的、或不期望的免疫反应是有好处的。T-MSC介导的免疫调节，如免疫抑制，将，例如有利于抑制不适当的免疫反应，该免疫反应是由个体免疫系统对抗一个或多个它自己的组织所引起。因此，本发明提供了一种抑制免疫反应的方法，其中，所述免疫反应是自身免疫性疾病，如全身性红斑狼疮、糖尿病、风湿性关节炎或多发性硬化症。
多个T-MSC和一种或多种类型的多个免疫细胞的接触可发生在接受者个体内，该接受者被嫁接或移植一种或多种组织，或者这些细胞作为附加物一并嫁接或移植。这些组织可以是，例如骨髓或血液、器官、特异的组织(如皮肤移植)、复合组织(如移植物包含二种或多种组织)等等。就这一点而言，T-MSC可以用于抑制一个或多个免疫细胞的一个或多个免疫反应，所述免疫细胞包含在接受者个体、或移植组织、或嫁接组织或两个组织。这种接触可发生在嫁接或移植之前、期间和/或之后。例如，可以在移植或嫁接的时候给予T-MSC处理。或可选择性地，也可在移植或嫁接给予T-MSC处理，例如约移植或嫁接前1、2、3、4、5、6、7天。优选地，在免疫反应的任何可检测的信号或症状出现前，就要使多个T细胞和多个T-MSC相接触。这种可检测信号或症状可以是接受者个体或移植组织或嫁接物的，如移植物抗宿主病或可检测的炎症的可检测的信号或症状。
在另一个实施方式中，在个体内的接触主要是外源的T-MSC和内源的祖细胞或干细胞，如内源的祖细胞或干细胞分化成的免疫细胞。例如，处于部分或全部的免疫净化疗法或骨髓细胞清除的个体，可接受T-MSC结合一种或多种类型的干细胞或祖细胞作为癌症治疗的附属物。例如，T-MSC可结合多个CD34+细胞，如CD34+造血干细胞。这些CD34+细胞可以是例如来自组织，比如周边血液、脐带血、胎盘血或骨髓。这些CD34+细胞可从以上所述组织分离，或来源整个组织(例如，整个脐带血或骨髓)或组织的部分纯化的样品(例如来自脐带的白细胞)，这些细胞可与T-MSC结合。
该T-MSC可以施用至个体，其中该T-MSC与该个体中已知或期望的免疫细胞(例如T细胞)数量的比率从约10:1至约1:10，优选地约1:5。然而，在非限制性实施方式中，多个T-MSC可以按，约10，000:1、约1,000:1、约100:1、约10:1、约1:1、约1:10、约1:100、约1:1,000或约1:10,000的比率施用至个体。一般地，可以施用约1×105至约1×108个T-MSC/kg(接受者体重)，优选地约1×106至约1×107个T-MSC/kg(接受者体重)，以产生免疫抑制。在各种实施方式中，施用至个体或对象的T-MSC包括至少、约或不多于，1×105、3×105，1×106，3×106，1×107，3×107，1×108，3×108，1×109，3×109个T-MSC或更多。
T-MSC也可和一种或多种第二类型的干细胞一起施用，如骨髓间充质干细胞。这种第二类型的干细胞可施用给个体，它们和T-MSC的比例如约1:10至约10:1。
为了便于T-MSC和免疫细胞接触，该T-MSC可以按任何足以使该T-MSC和免疫细胞彼此接触的途径施用至个体。例如，该T-MSC可以通过，例如静脉内、肌内、腹膜内、眼内、肠胃外、鞘内或直接进入器官(例如胰脏)的途径施用至个体。对于体外施用，T-MSC可作药物制剂而执行。
所述免疫抑制方法还可以包括加入一种或多种免疫抑制剂，特别是在体内环境。在一个实施方式中，多个T-MSC在个体体内接触多个免疫细胞，并且组合物包括免疫抑制药物施用给个体。免疫抑制药物是本领域所熟知的，包括但不限于抗T细胞受体抗体(如单克隆或多克隆抗体，或抗体片段或其衍生物)、抗IL-2受体抗体(例如，巴利昔单抗或赛尼哌抗T细胞受体抗体(例如莫罗单抗CD3)、硫唑嘌呤、皮质类固醇、环孢霉素、他克莫司、霉酚酸酯、西罗莫司、钙调磷酸酶抑制剂等。在一个具体实施方式中，所述免疫抑制剂是针对巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-1α和MIP-1β的中和抗体。
5.8T-MSC和/或T-MSC-DL的保存
T-MSC和/或T-MSC-DL可以被保存，也就是将它们长期存储，或者抑制由例如凋亡或坏死引起的细胞死亡。可以使用化合物保存T-MSC和/或T-MSC–DL，这些化合物包含凋亡抑制剂和坏死抑制剂。在一个实施方式中，本发明提供一种保存干细胞群的方法，其中，干细胞群接触含有凋亡抑制剂的干细胞采集组合物，其中所述凋亡抑制剂存在的量存在和存在的时间足以减少或阻止干细胞群凋亡(与没有接触该凋亡抑制剂的细胞群相比)。在一个具体的实施方式中，凋亡抑制剂是半胱天冬酶抑制剂。在另一个实施方式中，凋亡抑制剂是JNK抑制剂。在更进一步的实施方式中，JNK抑制剂不调控所述干细胞的增殖和分化。在另一实施方式中，所述细胞收集组合物包括所述凋亡抑制剂以及分离相的所述携氧全氟化碳。在另一实施方式中，所述细胞收集组合物包括所述凋亡抑制剂以及含于乳剂的所述携氧全氟化碳。在另一实施方式中，该细胞收集组合物附加地包括乳化剂，例如卵磷脂。在另一实施方式中，所述凋亡抑制剂和所述全氟化碳在接触该细胞时，处于约0℃到约25℃之间。在另一更具体的实施方式中，所述凋亡抑制剂和所述全氟化碳在接触该细胞时，处于约2℃到10℃之间或约2℃到约5℃之间。在另一更具体的实施方式中，所述接触在移送所述细胞群期间执行。在另一更具体的实施方式中，所述接触在冷冻和融解所述干细胞群期间执行。
在另一个实施方式中，本发明提供一种保存T-MSC和/或T-MSC–DL群的方法，其中，干细胞群接触凋亡抑制剂和保存器官的组合物，其中，凋亡抑制剂存在的量和时间足以下调减少和阻止干细胞群的凋亡(相比于干细胞群未接触凋亡抑制剂)。
通常，在T-MSC和/或T-MSC-DL收集、富集和分离期间，优选最小化或消除由于缺氧和机械应力引起的细胞应激。因此，在该方法的另一个实施方式中，在干细胞或干细胞群保存期间，干细胞或干细胞群暴露于低氧环境中，对它们的收集、富集和分离的时间不超过6小时。其中，低氧环境指氧气的浓度度低于正常血氧的浓度。在一个更具体的实施方式中，干细胞在保存期间暴露于低氧环境少于2小时。在另一个更具体的实施方式中，干细胞群在保存期间暴露于低氧环境少于1小时或少于30分钟，或在收集期间、富集期间或分离期间不暴露于低氧环境。在另一个更具体的实施方式中，干细胞群在收集、富集或分离期间不暴露于剪应力。
T-MSC和/或T-MSC–DL可冷冻保存在含如冷冻保存培养基的小容器(例如安瓶)。合适的冷冻保存培养基包括但不限于，包括如下的培养基：例如，生长培养基或细胞冻存培养基，例如，商购的细胞冻存培养基，如C2695、C2639或C6039(Sigma)。冷冻保存培养基优选包含浓度例如约10％(V/V)的二甲基亚砜(DMSO)。冷冻保存培养基可以包含其它试剂，例如甲基纤维素和/或甘油。T-MSC和/或T-MSC–DL在冷冻保存过程中，优选的冷却速度是约1℃/分钟。优选的冷冻保存温度为约-80℃至约-180℃。在融化使用之前，优选地，约-125℃至约-140℃冻存的细胞可以转移到液氮中。在一些实施方式中，例如，一旦安瓶的温度达至约-90℃，将它们转移至含液氮储存区域。冷冻保存的细胞解冻时优选约在25℃至约40℃的温度下，优选的温度约37℃。
5.9冷冻保存的T-MSC和/或T-MSC-DL
本文公开的T-MSC和/或T-MSC-DL可以被保存，例如冷冻保存以备后用。冷冻保存细胞，例如干细胞的方法是本领域所熟知的。T-MSC和/或T-MSC-DL能以一种方便施用给个体的方法保存。例如，本文提供装在容器里的T-MSC和/或T-MSC-DL，该容器适用于医疗用途。这种容器可以是，例如无菌的塑料袋、烧瓶、罐，或其它可容易处置T-MSC和/或T-MSC-DL的容器。例如，所述容器可以是血袋或其它塑料的、适合用于给受体静脉内输送液体的医学上可接受的袋。该容器优选允许冷冻保存干细胞群。冷冻保存的T-MSC和/或T-MSC-DL可包括T-MSC和/或T-MSC-DL来自一个捐赠者或来自多个捐赠者。T-MSC和/或T-MSC-DL可以是和预期接受者完全HLA匹配的，或部分或完全HLA不匹配的。
在另一个具体的实施方式中，所述容器是袋、瓶或罐。在一个更具体的实施方式中，所述袋是无菌塑料袋。在一个更具体的实施方式中，所述袋适合、允许或有助于T-MSC和/或T-MSC-DL静脉内给药。该袋子可以包括多个腔或室，给药之前或期间，所述腔或室相互连接，以允许该细胞以及一种或多种其他溶液(例如药物)相混合。在另一个具体的实施方式中，这种组合物包含一种或多种化合物，促进组合的干细胞群冷冻促存。在另一个具体的实施方式中，T-MSC和/或T-MSC-DL被包含在生理学可接受的水性溶液中。在一个更具体的实施方式中，这种生理学可接受的水性溶液是0.9％NaCl溶液。在另一个具体的实施方式中，hES-MSC和接受者的干细胞群是HLA匹配的。在另一个具体的实施方式中，所述组合的干细胞群包含hES-MSC，这些hES-MSC至少部分和接受者的干细胞群HLA匹配。
5.10T-MSC分化为多种细胞系
T-MSC可以分化成多种细胞系，包括神经元谱系细胞或神经元、或脂肪细胞、或肌细胞、或成纤维细胞、或成骨细胞、或软骨细胞。除非特别说明，T-MSC可被接种于包被明胶、胶原蛋白、纤连蛋白、基质胶、层粘连蛋白、玻连蛋白、或聚(赖氨酸)的细胞培养板。T-MSC可以以浓度1×103细胞/cm2至1×104细胞/cm2接种至无血清培养基或含FBS或ABHS的血清培养基。根据以上所述条件接种T-MSC可以按以下的其中一种方法分化。
在一个实施方式中，T-MSC可分化的培养基中含有1-50ng/m成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)(最佳为10ng/ml)加1-50ng/ml表皮细胞生长因子(EGF)(最佳为10ng/ml)加0.5-5ng/ml血小板源生长因子(PDGF)(最佳为1ng/ml)。每2－3天更换培养基，并且2-4星期后收获细胞，预期产量为每1×106T-MSC产生0.5×106-2×106神经细胞元谱系细胞。
在另一个实施方式中，T-MSC接种在包被多聚-L-鸟氨酸和层粘连蛋白的培养板，可分化为神经元谱系细胞。T-MSC的分化分为3个阶段。阶段1：1-50ng/ml FGF-2(最佳为10ng/ml)和1-50ng/ml EGF(最佳为10ng/ml)，使hMSCs朝神经细胞方向分化。阶段2：10-200ng/ml音猬因子(SHH)(最佳为100ng/ml)，1-50ng/ml FGF-8(人)(最佳为10ng/ml)和50-500μM AAP(最佳为200μM)，开始向中脑分化。阶段3：5-500ng/ml胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)(最佳为50ng/ml)和50-500μM AAP(最佳为200μM)，以诱导分化和成熟多巴胺能神经元。每个阶段需要一个星期，并且在每个阶段之间，使用胰酶或TrypLE/分散酶解离粘连细胞以传代。每天补充生长因子以及每2天更换培养基。预期产量为每1×106T-MSC产生0.5×106–4x 106神经细胞元谱系细胞。
在另一个实施方式中，T-MSC可在神经基质培养基中(Gibco)分化为神经元谱系细胞，该培养基包含0.25×B-27补充物，加10-200ng/ml音猬因子(SHH)(最佳为100ng/ml)，加1-50ng/ml FGF-8(小鼠)(最佳为10ng/ml)，加1-200ng/ml FGF-2(最佳为50ng/ml)。在第6天和第12天收集细胞，在这期间不更换培养基。预期产量为每1×106T-MSC产生0.5×106–4x106神经细胞元谱系细胞。
在另一个实施方式中，T-MSC可经两个阶段分化为神经元谱系细胞。阶段1：T-MSC在含2mM谷氨酰胺、1-20U/ml(最佳为12.5U/ml)制霉菌素、N2补充物、2-50ng/ml(最佳为20ng/ml)成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)和1-50ng/mL EGF(最佳为10ng/ml)的无血清DMEM培养基中培养48-72小时。阶段2：细胞在含B27补充物、0.1-10mM(最佳为1mM)二丁酰环腺苷酸(dbcAMP)、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、10-500μM(最佳为200μM)抗坏血酸、1-100ng/ml BDNF(最佳为50ng/ml)、1-50ng/ml胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF，最佳为10ng/ml)、0.2-10ng/ml转化生长因子-β3(TGF-β3，最佳为2ng/ml)、0.05-5μM全反式视黄酸(RA，最佳为0.1μM)。每个阶段需要一个星期，并且在每个阶段之间，使用胰酶或TrypLE/分散酶解离粘连细胞以传代。每2天更换培养基，预期产量为每1×106T-MSC产生0.5×106-4×106神经细胞元谱系细胞。
在另一个实施方式中，T-MSC可被培养以诱导成骨分化。T-MSC将在含10％FCS、1-150uM(最佳为80μM)、2-磷酸抗坏血酸、0.5-5μM(最佳为1μM)地塞米松和1-100mM(最佳为20mM)β-甘油磷酸盐的低糖DMEM培养基中。每2-3天更换培养基，在2星期后，预期产量为每1×106T-MSC产生0.5×106-4x 106神经细胞元谱系细胞。
在另一个实施方式中，T-MSC可被培养以诱导分化为脂肪细胞。T-MSC将在含20％FCS，1-10μg/ml(最佳为5μg/ml)胰岛素、0.5-10μM(最佳为2μM)地塞米松、0.1-1mM(最佳为0.5mM)异丁基甲基黄嘌呤和1-100μM(最佳为60μM)吲哚美辛的低糖DMEM培养基中培养。每2-3天更换培养基，在4星期后，预期产量为每1×106T-MSC产生0.5×106-4×106神经细胞元谱系细胞。
在另一个实施方式中，T-MSC可被培养以诱导分化为软骨细胞。T-MSC将在含0.5-10mM(最佳为1mM)丙酮酸钠、0.05-1mM(最佳为0.1mM)2-磷酸抗坏血酸、0.05-1μM(最佳为0.1μM)地塞米松、0.2-2％(最佳为1％)ITS和1-50ng/ml(最佳为10ng/mL)TGF-β3的高糖DMEM培养基中以小球状生长。每2-3天更换培养基，在20天后，预期产量为每1×106T-MSC产生0.5×106-4×106神经细胞元谱系细胞。
在另一个实施方式中，T-MSC可被培养以诱导分化为成肌细胞。T-MSC将在含10％FBS、1-20μM(最佳为10μM)5-氮胞苷和1-50ng/ml(最佳为10ng/ml)碱性FGF的低糖DMEM培养基中培养。24小时后，含10％FBS和1-50ng/ml(最佳为10ng/ml)碱性FGF的成肌诱导培养基替换DMEM培养基。每2-3天更换培养基，在2星期后，预期产量为每1×106T-MSC产生0.5×106-4×106神经细胞元谱系细胞。
在另一人实施方式中，T-MSC可被培养以诱导分化为成纤维细胞。T-MSC将在含10％FBS、50-200ng/ml(最佳为100ng/ml)重组人结缔组织生长因子(CTGF)、1-100μg/ml(最佳为50μg/ml)抗坏血酸的DMEM培养基中培养，该培养基是用来培养hMSCs的。每3-4天更换培养基，在4星期后，预期产量为每1×106T-MSC产生0.5×106-4×106神经细胞元谱系细胞。
利用任何分化方法从T-MSC衍生的所有细胞系和细胞类型包括但不限于，上述被称为T-MSC-DL全部方法。
5.11药物制剂
在一个实施方式中，这里提供一种药物组合物，其中，包括治疗有效量的T-MSC和药学上都接受的载体。
所述药物组合物可包括任何数量的T-MSC和/或T-MSC-DL。例如，1个单位剂量的T-MSC可包括，在不同的实施方式中，约至少，或不超过1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011或更多的T-MSC和/或T-MSC-DL。
本文公开的药物组合物包括细胞群，这些细胞群包含50％或更多的活细胞(即是，细胞群中至少50％的细胞是有功能的或存活的)。优选地，细胞群中至少60％的细胞是活的。更优选地，在药物组合物里，细胞群中至少70％、80％、90％、95％或99％的细胞是活的。
本文公开的药物组合物包括一种或多种化合物，比如有利于移植的化合物，例如，抗T细胞受体抗体、免疫抑制剂等；也可以是稳定剂，例如白蛋白、葡聚糖40、明胶、羟乙基淀粉等。
短语“药学上可以接受的”是指分子实体和组合物具有生理容许性而且在施用于人后通常不会产生过敏或者相类似的反应，如胃部不适，头晕等。并且由联邦或州政府管理部门批准的，或在美国药典或其它公认的用于动物，更特别地用于人的药典中列出的。载体”是指药剂批准的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。此类药物载体可以是无菌液体，例如水的盐水溶液和油，包括石油、动物油、植物油或合成油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物静脉给药时，盐水溶液是优选的载体。盐水溶液和含水葡萄糖以及甘油溶液也可用作液体载体，特别是注射用液体。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，这些组合物还包含极小量的湿润剂、乳化剂和/或pH缓冲剂。
这些组合物可以采用以下形式：溶液、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、持续释放制剂、扁囊剂、锭剂、锭剂、分散剂、栓剂、软膏剂、巴布剂(泥敷剂)、糊剂、敷料、霜剂、硬膏剂、贴剂、气雾剂、凝胶剂。液体剂型适于胃肠外施用至患者，以及灭菌固体制剂(如晶体或无定形固体)被重构成液体剂型以适于非肠道给药患者。这样的组合物应该包含治疗有效量的所述化合物(优选纯化的形式)以及适量的载体，以便向患者提供适当的给药形式。
适于口服给药的药物组合物可以是胶囊、片剂、粉剂、颗粒剂、溶液剂、糖浆剂、悬浮液(在非水或水性液体)或乳剂。片剂或硬明胶胶囊可以包括乳糖、淀粉或其衍生物、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁、硬脂酸或其盐。软明胶胶囊可以包括植物油、蜡、脂肪、半固体、或液体多元醇。溶液和糖浆可以包含水、多元醇和糖。设计用于口服给药的活性药剂可用延迟该活性药剂在胃肠道的崩解和/或吸收的物包衣或者与其混合。因此，可实现活性剂持续释放多个小时，并且如果需要，可将活性剂保护以防止在胃中降解。配制用于口服给予的药物组合物，而便于活性剂在特定的胃肠位置释放。可配制口服施用的药物组合物以帮助活性剂在特定胃肠道位置(由于特殊pH或酶条件)的释放。
适合透皮给药的制剂可以为不连续的贴剂，以长时间与受治者表皮保持紧密接触。
适合对鼻腔和肺用药的药物组合物可包含固态载体如可以快速通过鼻子给药的粉剂。用于鼻腔黏膜给药的药物组合物可以包括液体载体，例如鼻喷雾剂或滴鼻剂。另外，可通过深吸一口气或安装吹管以实现直接吸入肺部。这些组合物可以包含活性成分的水或油溶液。用于通过吸入给药的组合物可以装在专门配套的设备中，包括但不限于加压气溶胶、喷雾器或吹入器，可以制造这样的装置，以便提供预定剂量的活性成分。
适于肠胃外给药的药物组合物包括水性和非水性无菌注射溶液或悬浮液，所述溶液或混悬剂可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂以及使所述组合物变得与预定接受者的血液大体上等渗的溶质。这类组合物中可以存在的其他成分包括，例如水、醇、多元醇、甘油和植物油。适于肠胃外给药的组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶，并且可以储存在冷冻干燥(冻干)条件下。对于这种情况，在临用前仅需迅速加入无菌液体载体。临时注射溶液和悬浮液可以由无菌粉末、颗粒和片剂制备。可用于提供本发明肠胃外剂型的合适载体是本领域技术人员所熟知的。实例包括：USP注射用水；水性载体，例如氯化钠注射液、林格氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液和乳酸林格注射液；水可混溶的媒介物诸如乙醇、聚乙二醇和聚丙二醇；和非水性载体，如玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。
有效剂量的选择将由本领域技术人员根据对本领域普通技术人员周知的几个因素的考虑来确定。这些因素包括抑制剂的特定形式及其药物动力学参数如生物利用度、代谢、半衰期等，这些因素将在常规的开发程序中被确立，通常运用这些程序才能获得对药物化合物的按规定的批准。与剂量有关的另一些因素包括，将要治疗的病症或疾病，或者对正常人将要获得的益处，病人的体重，用药的途径，用药是急性或是慢性，伴随给药，以及影响所给药剂效率的其它周知因素。因此精确的剂量应当根据医师的判断和每位患者的具体情况来定。
在某些实施方式中，给患者施用解热和/或抗组胺剂(对乙酰氨基酚和盐酸苯海拉明)，以减少与hES-MSC治疗时所含的冷冻元件有关的任何可能的DMSO输注毒性。
5.12T-MSC条件培养基和衍生物
本文公开的T-MSC可用于生产免疫抑制的条件培养基，也就是该培养基包含一种或多种由干细胞分泌或排泄的生物分子。所述干细胞对多个一种或多种类型的免疫细胞有可检测的免疫抑制能力。在各种实施方式中，所述条件培养基包括T-MSC已经生长了至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天数的培养基。在其它的实施方式中，所述条件培养基包括T-MSC已经生长到汇合度至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或达到100％的培养基。这种条件培养基可用于支持单个T-MSC群的培养，或其它类型的干细胞的培养。在另一个实施方式中，所述条件培养基包括T-MSC已经分化成熟细胞的培养基。在另一个实施方式中，本发明的条件培养基包括已经培养过T-MSC和非T-MSC的培养基。
因此，在一个实施方式中，本发明提供了一种包括培养基、细胞裂解物和/或其它T-MSC衍生物的组合物，其中所述T-MSC(a)粘附在基质上；(b)表达CD73、CD105、CD90、CD29、CD44、CD146、IL-10、TGFb2、HGF，但是不表达IL-6、TNFα、IL-12和/或RAGE。在另一个具体的实施方式中，该组合物包括抗增殖试剂，如抗-MIP-1α或抗-MIP-1β抗体。
本文提供一种使用本文所述T-MSC作为饲养细胞扩增骨髓造血干细胞、外周血造血干细胞和脐带造血干细胞的方法。在某些实施方式中，适合于本公开方法的T-MSC表达Stro-3、Stro-1、DL1和/或Nestin。所述T-MSC也可被本文第5.5节公开的方法修饰或改造以表达高水平的Stro-3、Stro-1、DL1、Nestin和/或Frizzle。在某些实施方式中，所述T-MSC是间充质干细胞。本文提供如本文所述T-MSC和骨髓造血干细胞的共培养物。本文提供如本文所述T-MSC和脐带造血干细胞的共培养物。
5.13包括T-MSC和/或T-MSC衍生细胞系的基质
本发明还包括基质、水凝胶、支架和类似的包含T-MSC和/或T-MSC-DL。T-MSC和/或T-MSC-DL可接种在天然基质，如生物材料。在某些实施方式中，通过3维打印获得所述支架。T-MSC和/或T-MSC-DL可悬浮在适合如注射的水凝胶溶液。对于这样的组合物的合适的水凝胶包括自组装肽，例如RAD16。在一个实施方式中，包含细胞的水凝胶溶液可允许变硬，例如在模具中，以形成具有细胞分散在其中的用于移植的基质。T-MSC和/或T-MSC-DL可培养在这样的基质，使细胞在移植前进行有丝分裂扩增。所述水凝胶是，例如有机聚合物(天然的或合成的)，通过共价、离子或氢键交联以创建三维开放的晶格结构，其俘获的水分子，以形成凝胶。水凝胶形成材料包括多糖，例如褐藻胶及其盐、多肽、聚膦嗪和聚丙烯酸酯，它们是通过离子键、或嵌段聚合物交联，嵌段聚合物包括例如聚环氧乙烷－聚丙二醇嵌段共聚物，它们是分别通过温度或pH值交联。在一些实施方式中，本发明的水凝胶或基质是可生物降解的。在本发明的一些实施方式中，所述制剂包含原位聚合的凝胶(见，例如，美国专利申请公开2002/0022676；Anseth等，J.Control Release，78(1-3):199-209(2002)；Wang等.，Biomaterials，24(22):3969-80(2003)。
在一些实施方式中，所述聚合物至少可部分溶解于具有带电荷侧基或其单价离子盐的水溶液例如水，或含水醇溶液中。具有酸性侧基的聚合物的实例，聚合物可以与阳离子反应的是聚(磷腈)、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、丙烯酸和甲基丙烯酸、聚(乙酸乙烯酯)的共聚物、以及磺化的聚合物，例如作为磺化聚苯乙烯。也可以使用具有由丙烯酸或甲基丙烯酸与乙烯醚单体或聚合物反应形成的酸性侧基的共聚物。酸性基团的实例是羧酸基团、磺酸基团、卤代(优选氟代)醇基团、酚OH基团和酸性OH基团。
T-MSC、T-MSC-DL和/或共培养物可以接种至三维框架或支架，并移植入体内。这种框架可以和任何一个或多个生长因子、细胞、药物或其它组分一起移植，以刺激组织形成或以其它方式增强或改善本发明的实施。
可在本发明中使用的支架的实例包括非织造垫、多孔泡沫、或自组装多肽。可以用纤维形成无纺布衬垫，该纤维由乙醇和乳酸合成的可吸收的共聚物构成(如PGA/PLA)VICRYL，Ethicon，Inc.，Somerville，N.J.)。泡沫也可以用作支架，该泡沫由如通过聚(ε-己内酯)/聚(乙醇酸)(PCL/PGA)共聚物构成。该共聚物通过例如冷冻干燥或冻干工艺形成(见，例如，美国专利号6355699)。
T-MSC和/或T-MSC-DL也可以接种在或接触生理上可接受的陶瓷材料，包括但不限于，单-、二-、三-、α-三-、β-三和四磷酸钙、羟基磷灰石、氟磷灰石、硫酸钙、钙氟化物、氧化钙、碳酸钙、镁钙磷酸盐、生物活性玻璃如以及它们的混合物。目前市售的多孔生物相容的陶瓷材料包括(CanMedica Corp.，加拿大)，(Merck Biomaterial France，法国)、(Mathys，AG，贝特拉赫，瑞士)和矿化胶原骨移植产品，例如HEALOSTM(DePuy，Inc.，雷纳姆，马萨诸塞州)和RHAKOSSTM和(Orthovita，Malvern，Pa.)。该框架可以是一个混合物、共混物或天然和/或合成材料的复合物。
在另一个实施方式中，T-MSC和/或T-MSC-DL可以接种在或接触毛毡，该毛毡可以由，如复丝构成。该复丝可由生物吸收的材料如PGA、PLA、PCL共聚物或共混物，或透明质酸制成。
在另一个实施方式中，T-MSC和/或T-MSC-DL可以接种在泡沫支架，该支持可以是复合结构。此类泡沫支架可以模制成有用的形状，例如，待修复、替换或补充的身体特定结构的一部分。在一些实施方式中，所述框架在接种本发明的细胞之前，使用例如0.1M乙酸处理，然后在聚赖氨酸、PBS和/或胶原蛋白温育，以增强细胞粘附。基质的外部表面可以被修饰以改善细胞和组织的分化，例如离子体包被基质，或添加一种或多种蛋白质(例如胶原、弹性纤维、网状纤维)、糖蛋白、葡糖氨基葡聚糖(例如硫酸肝素、软骨素-4-硫酸盐、软骨素-6-硫酸盐、硫酸皮肤素、硫酸角质素等)、细胞外基质和/或其它基质，如但不限于明胶、藻酸盐、琼脂、琼脂糖和植物胶等。
在一些实施方式中，所述支架包括不使其形成血栓的材料，或支架被这种材料处理。这些处理和材料也可以促进和维持内皮生长、迁移和细胞外基质沉积。这些材料和治疗的实施方式包括但不限于天然材料例如基底膜蛋白，如层粘连蛋白和IV型胶原，合成材料，例如EPTFE和分段的聚氨酯脲硅酮，例如PURSPANTM(The Polymer Technology Group，Inc.，伯克利分校，加州)。所述支架还可以包含抗血栓形成剂，例如肝素。在接种干细胞前，该支架也可以被处理，以改变表面电荷(例如，包被等离子体)。
5.14永生化的T-MSC和/或T-MSC-DL
哺乳动物的T-MSC和/或T-MSC-DL可通过转染含有生长促进基因的任何合适的载体以实现有条件的永生化。这些基因编码的蛋白质在适当条件下促进转染的细胞生长，使得所述生长促进蛋白质的产量和/或活性听上去像是外界因素。在一个优选的实施方式中，生长促进基因是癌基因，例如但不限于v-myc、N-myc、c-myc、p53、SV40大T抗原、多瘤病毒大T抗原、E1a的腺病毒或E7蛋白人乳头状瘤病毒。
促生长蛋白调节的实例可以通过下以实现，将促生长基因置于外界可调控的启动子上，例如，启动子的活性受控于，例如被转染细胞温度或与细胞接触培养基的成分改变。在一个实施方式中，可使用四环素(tet)控制的基因表达系统(参照Gossen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547-5551，1992；Hoshimaru等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:1518-1523，1996)。当不存在tet时，载体中tet控制的反式作用因子(tTA)强激活phCMV*-1的转录，其中phCMV*-1是融合至tet操纵子序列的最小人巨细胞病毒启动子。tTA的是大肠杆菌的转座子-10来源的tet抗性操纵子和单纯疱疹病毒的VP16的酸性结构域的阻遏(四面体)的融合蛋白。低、无毒浓度的tet(例如，0.01～1.0μg/mL)几乎完全消除tTA的反式激活。
在一个实施方式中，载体还包含编码选择标记(例如赋予药物抗性的蛋白质)的基因。该细菌新霉素抗性基因(neoR)就是这样一种标记，该标记也可以用于本发明中。可通过对于本领域的普通技术人员已知的方法选择携带neoR的细胞，例如，在生长培养基中添加100-200μg/mL G418。
可通过本领域中普通技术人员已知的各种方法中任何一种方法实现转染，包括但不限于反转录病毒感染。通常，对细胞培养物转染可通过与条件培养基和包含N2补充物的DMEM/F12形成的混合物温育。其中，条件培养基来自针对所述载体的生产细胞系。例如，通过在1倍体积条件培养基和2倍体积含有N2补充物的DMEM/F12的混合物中温育约20小时，如上所述制备的干细胞培养物可在体外被感染，例如5天。接着可按如上所述的方法选择携带可选择标记的转染细胞。
转染后，培养物传代到允许增殖的表面，例如，允许至少30％的细胞在24小时周期内倍增。优选地，所述基质是聚鸟氨酸/层粘连蛋白基质，包括组织培养塑料涂有聚鸟氨酸(10μg/mL)和/或层粘连蛋白(10μg/mL)、聚赖氨酸/层粘连蛋白基质、或用纤粘连蛋白处理的表面。然后，每3-4天用生长培养基饲养培养物，生长培养基中可以或可以不补充1个或多个增殖增强因子。当培养物的汇合度少于50％时，可在生长培养基中添加增殖增强因子。
可使用标准技术传代所述条件永生化的T-MSC和/或T-MSC-DL细胞系，如当80-95％汇合度时，使用胰蛋白酶消化细胞。在一些实施方式中，高达约20代有利于维持选择(例如，在含有新霉素抗性基因的细胞中添加G418)。细胞还可以在液氮中冷冻以进行长期储存。
可从如上所述的条件永生化的人T-MSC细胞系中分离克隆细胞系。通常，可使用标准技术分离这种克隆细胞系，如通过有限稀释法或使用克隆环和扩增。通常可按如上所述饲养和传代克隆细胞系。
条件永生化的人T-MSC细胞系可以是，但不需要是纯系的。通常可通过在促进分化的培养条件下抑制生长促进蛋白的生产或活性而诱导条件永生化的人T-MSC细胞系分化。例如，如果编码生长促进蛋白的基因被外部调节的启动子的控制，可以改变条件，例如温度或培养基的组合物，从而抑制生长促进基因的转录。对于上面讨论的四环素控制的基因表达系统，可以通过加入四环素抑制生长促进基因的转录而实现分化。通常1μg/mL四环素处理4-5天足以引发分化。为了促进进一步分化，可在生长培养基中加入额外的药剂。
5.15试验
T-MSC和/或T-MSC-DL可应用于试验以确定培养条件、环境因素、分子(例如，生物分子、小无机分子等)等对干细胞增殖、扩增和/或分化的影响，基于与T-MSC和/或T-MSC-DL不暴露于这样的条件相比较。
在一个优选的实施方式中，T-MSC和/或T-MSC-DL可用于分析一旦细胞接触分子，增殖、扩大或分化的变化。在一个实施方式中，例如，本发明提供了一种鉴定调节多个T-MSC和/或T-MSC-DL增殖的化合物，其中，在允许增殖的条件下，T-MSC和/或T-MSC-DL接触该化合物，其中与T-MSC和/或T-MSC-DL未与该化合物接触相比较，如果该化合物引起对T-MSC和/或T-MSC-DL的增殖可检测的变化，那么该化合物被鉴定为调节T-MSC和/或T-MSC-DL增殖的化合物。在一个具体的实施方式中，所述化合物被鉴定是增殖抑制剂。在另一个具体实施方式中，所述化合物被鉴定是增殖增强剂。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种鉴定调节多个T-MSC和/或T-MSC-DL扩增的化合物，其中，在允许扩增的条件下，T-MSC和/或T-MSC-DL接触该化合物，其中与T-MSC和/或T-MSC-DL未与该化合物接触相比较，如果该化合物引起对T-MSC和/或T-MSC-DL扩增可检测的变化，那么该化合物被鉴定为调节T-MSC和/或T-MSC-DL扩增的化合物。在一个具体的实施方式中，所述化合物被鉴定是扩增抑制剂。在另一个具体实施方式中，所述化合物被鉴定是扩增增强剂。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种鉴定调节多个T-MSC和/或T-MSC-DL分化的化合物，其中，在允许分化的条件下，T-MSC和/或T-MSC-DL接触该化合物，其中与T-MSC和/或T-MSC-DL未与该化合物接触相比较，如果该化合物引起对T-MSC和/或T-MSC-DL分化可检测的变化，那么该化合物被鉴定为调节T-MSC和/或T-MSC-DL分化的化合物。在一个具体的实施方式中，所述化合物被鉴定是分化抑制剂。在另一个具体实施方式中，所述化合物被鉴定是分化增强剂。
5.16人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞的治疗应用
来源于骨髓的间充质干细胞(BM-MSCs)已经被用于基于T细胞相关的自身免疫性疾病的治疗，包括多发性硬化症(MS)，但由于来源有限、质量不稳定和对使用来自成体组织细胞生物安全的担忧，使骨髓间充质干细胞作为辅助治疗剂受到了限制。
本文所述的从胚胎干细胞产生间充质干细胞的新方法，和使用这种方法产生的新T-MSC，提供了针对T细胞相关的自身免疫性疾病，特别是多发性硬化症的新疗法，
在某些实施方式中，向EAE发病的小鼠施用T-MSC，显著地降低这些动物的疾病评分。所述评分降低伴随着降低脱髓鞘、T细胞的浸润和中枢神经系统的小胶质细胞反应，以及在体外抑制免疫细胞增殖和分化。
在某些实施方式中，向疾病发作后的EAE小鼠施用T-MSC，也可观察到疾病评分逐渐下降。在某些实施方式中，T-MSC同时具有对该疾病预防性和治疗性效果。
在某些实施方式中，T-MSC的免疫抑制活性导致被辐射过的T-MSC对这些疾病预防性效果，这些被辐射过的T-MSC不大可能替换受损的髓磷脂，但是有效地下降疾病评分。在一个实施方式中，辐射并未缩短T-MSC的寿命。
在某些实施方式中，T-MSC的治疗效果涉及免疫抑制、神经修复和再生。
在某些实施方式中，T-MSC处理的EAE小鼠在它们的中枢神经系统存在更少炎症性T细胞以及更少T细胞渗透至脊髓。所述T-MSC可以减少由炎症性T细胞引起的损伤和症状，使得它们有用于所有与T细胞相关的自身免疫性疾病的治疗和预防。T-MSC也减少脱髓鞘。
T-MSC的特性全都和骨髓来源的间充质干细胞获得的结果形成鲜明对比。BM-MSCs仅抑制T细胞响应于体外低剂量抗-CD3抗体刺激的增殖，而且甚至增强Th1和Th17细胞渗透到中枢神经系统。已经发现自体反应的效应CD4+T细胞与一些自身免疫疾病的发病机理有关，包括多发性硬化症、克罗恩氏病和类风湿性关节炎。这些CD4+T细胞包括Th1和Th17细胞。人BM-MSCs对EAE小鼠的治疗仅具有微弱或可以忽略的效果(Gordon等.2008a；Zhang等.2005；Payne等.2012)。最近的报道显示，使用人脐带来源的间充质干细胞治疗EAE小鼠，疾病评分仅从3.5下调至3.0(Liu et al.2012)。本文的结果和来自这些研究的结果突出了本发明T-MSC的新颖性和实用性。
另外，BM-MSC和T-MSC具有非常相似的整体转录谱，但差异表达一些促炎和抗炎因子。在这些因子中，BM-MSCs的IL-6的表达水平高于T-MSC。此外，在体外经IFNγ刺激后，BM-MSCs的IL-6的表达升高1倍，然而T-MSC的IL-6表达仍保持低水平。
IL-6是一种多效性细胞因子，涉及造血/免疫细胞和基质细胞之间的串扰，包括炎症的开始和终止。IL-6可促进Th17细胞的分化和功能(Dong，2008)。多发性硬化症病人血液和脑组织的单核细胞的IL-6水平升高(Patanella等，2010)，IL-6水平在老年人的血清中也升高(Sethe et al，2006)。缺少IL-6受体α的小鼠在T细胞致敏时是抵抗EAE的(Leech等，2012)。CNS产生的位点特异性IL-6可重新定位和增强EAE的免疫反应(Quintana等，2009)，然而，IL-6中和抗体可减少EAE小鼠的炎症反应(Gijbels et，1995)。因此，IL-6已成为治疗多发性硬化症有前途的治疗靶标。
在MSC治疗MS和EAE时，外周T细胞活性的免疫调节、神经细胞再生和神经细胞修复是被广泛认可的治疗作用(Al Jumah and Abumaree，2012；Auletta等，2012；Morando等，2012)。然而，MS病人的长期功能神经恢复和持续缓解病情需要修复受损的血-脑屏障和血脊髓屏障(Correale and Villa，2007；Minagar等，2012)。换句话说，MS是一种炎症性、神经变性和血管性疾病，而且有效的治疗需要针对所有三个部分。
T-MSC的特性使它们特别适用于治疗T细胞相关的自身免疫疾病，尤其是多发性硬化。特别地，T-MSC可降低EAE小鼠的疾病评分，而且还减少脱髓鞘和降低Th1和Th17细胞的增殖，并且IL-6低表达。后两个特性使它们适合于治疗其它的T细胞相关的自身免疫性疾病。此外，T-MSC穿过血-脑屏障和血脊髓屏障的能力，使得它们在治疗和预防多发性硬化症和其它与中枢神经系统相关的自身免疫性疾病具有更大的优势。
在一个实施方式中，本发明提供了一种治疗和预防与T细胞相关的自身免疫性疾病的方法，其中，包括给有需要其的受试者施用药的步骤，所述药是包括MSC的治疗有效量的溶液、细胞培养物或药物制剂。T细胞相关的自身免疫疾病包括但不限于多发性硬化症、炎性肠病、克罗恩病、移植物抗宿主病、系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎。受试者是哺乳动物，最优选的是人。所述溶液、细胞培养物或药物制剂可以包括被辐射或未经辐射的T-MSC。所述溶液、细胞培养物或药物制剂优选通过注射给药。
多发性硬化症已被划分成四个亚型：复发性/持久性；继发进行性；原发进行性；和进行性复发。该复发性/持久性亚型的特征是不可预测复发继之以长时间缓解。继发进行性MS个体往往以复发性/持久性MS开始，然后是没有缓解期的进行性衰退。原发进行性MS描述了少数出现症状后从未有缓解的个体。进行性复发是最常见的亚型，具有稳定神经衰退，并且遭受急性发作的特征。
本文为有此需要的受试者提供一种治疗或预防多发性硬化症的方法，其中，该方法包括向有需要其的受试者施用药的步骤，所述药是包括MSC的治疗有效量的溶液、细胞培养物或药物制剂。所述多发性硬化症可以是复发性/缓解性多发性硬化症、进行性/复发性多发性硬化症、原发性多发性硬化症、或继发性多发性硬化症。所述溶液、细胞培养物或药物制剂可以包括被辐射或未经辐射的T-MSC。所述溶液、细胞培养物或药物制剂优选通过注射给药。
多发性硬化症中出现的一系列症状包括四肢感觉障碍、视神经功能障碍、锥体束功能障碍、膀胱功能障碍、肠功能障碍、性功能障碍、共济失调和复视攻击。
本发明的另一个实施方式是一种治疗多发性硬化症的方法，其中，包括向有需要其的受试者施用药的步骤，所述药是包括MSC的治疗有效量的溶液、细胞培养物或药物制剂。其中可检测的改善有至少一种症状、至少两种症状、至少三种症状、至少四种症状、至少五种症状或所有这些症状。
扩展残疾状态量表(EDSS)是最常用的评价患有多发性硬化临床状态的评价标准。它根据多个单独的参数测量残疾：强度、感觉、脑干功能(语言和吞咽)、协调、视觉、认知和肠/膀胱失禁。它是一个公认的MS残疾测量表。并且执行起来不是特别困难或耗时。该EDSS量化残疾的八个功能系统(FS)并且允许神经专家分配这些中的每一个功能系统评分(Kurtzke 1983)。
Kurtzke如下定义功能系统：
·锥体状
·小脑
·脑干
·感觉
·肠和膀胱
·视觉
·大脑
·其它
EDSS评分1.0至4.5指完全不卧床的多发性硬化症患者。EDSS通过损伤到行走定义5.0至9.5。每个可能结果的临床意义如下：
0.0：神经检查正常；
1.0：无残疾，一个功能系统中最小异常体征；
1.5：无残疾，2/7功能系统中最小异常体征；
2.0：1/7功能系统中有最低能力丧失；
2.5：两个功能系统中有最低能力丧失；
3.0：一个功能系统中有中度能力丧失；或三个或四个功能系统中有轻度能力丧失，尽管完全能走动；
3.5：完全能走动，但是一个功能系统中有中度能力丧失和1或2个功能系统轻微能力丧失，或2个功能系统中度能力丧失，或5个功能系统轻微能力丧失；
4.0：尽管有相对重度的能力丧失，在没有帮助的情况下，完全能走动、自立，长达约12h/天；没有帮助或不休息的情况下，能够行走约500m；
4.5：在没有帮助的情况下，一天中约大部分的时间完全能走动，能工作一整天，另外可能在充分活动方面受ー些限制或需要基本的帮助；以相对重度的能力丧失为特点；没有帮助或不休息的情况下，能行走约300m；
5.0：不需要帮助能行走约200米。残疾妨碍所有日常活动；
5.5：能走动100米，残疾妨碍所有日常活动；
6.0：不管是否休息，需要间歇性或单侧持续援助(手杖、拐杖或支架)行走100米；
6.5：需要持续的双边支持(手杖、拐杖或支架)以不休息地行走20米；
7.0：即使在有帮助时也不能行走超过5米，基本上限制在轮椅，自己操作标准轮椅走动；一天在轮椅中待的时间长达约12h；
7.5：不能多走几步，限制在床，转移时可能需要帮助。可自已上轮椅，但可能需要电动椅以完成所有日常活动；
8.0：基本上限制在床、椅子或轮椅，但可以不卧床；
8.5：一天大部分时间基本上限制在床，能有效地使用手臂，保留了一些自理能力；
9.0：在床无助的病人，可以交流和饮食；
9.5：不能有效交流或饮食/吞咽；
10；因MS而死亡。
本文提供一种用于治疗需要其受试者的多发性硬发症的方法，该方法包括向有需要其的受试者施用药的步骤，所述药是包括T-MSC的治疗有效量的溶液、细胞培养物或药物制剂。其中，所述受试者扩展残疾状态量表(EDSS)的评分至少改善一分，而且优选至少改善2分。
还有其它已经用于治疗和预防多化性硬化症的治疗药物，包括但不限于芬戈莫德、促肾上腺皮质激素(ACTH)、甲基强的松龙、地塞米松、IFNβ-1a、IFN-1b、醋酸格拉替雷、环磷酰胺、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、克拉屈滨、环孢菌素、米托蒽醌和柳氮磺吡啶。
因此，本发明的方法还可进一步包括向受试者给予一种或多种其它治疗药剂，所述药剂包括但不限于芬戈莫德、促肾上腺皮质激素(ACTH)、甲基强的松龙、地塞米松、IFNβ-1a、IFN-1b、醋酸格拉替雷、环磷酰胺、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、克拉屈滨、环孢菌素、米托蒽醌和柳氮磺吡啶。在另一个实施方式中，所述其它治疗药剂可在T-MSC施用后再施用，或和T-MSC同时施用，或可共轭或连接至T-MSC。
除了T细胞，T-MSC也具有对B细胞、树突细胞、嗜中性粒细胞、NK细胞、巨噬细胞强大的免疫抑制功能和其它炎症性和免疫相关功能。因此，与T细胞、B细胞、炎症性和/或先天免疫相关的自身免疫性疾病都可以用公开的T-MSC治疗，所述自身免疫性疾病包括但不限于，斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性阿狄森氏病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病、自身免疫性淋巴增生综合征(ALPS)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、白塞氏病、大疱性类天疱疮、心肌病、乳糜泻-皮炎、慢性疲劳综合征性免疫缺陷综合症(CFIDS)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、瘢痕性类天疱疮、冷凝集素病、CREST综合征、克罗恩病、波德戈里察病、皮肌炎、青少年型皮肌炎、盘状红斑狼疮、特发性混合冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、格雷夫斯病、吉兰-巴雷综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、免疫球蛋白A肾病、胰岛素依赖性糖尿病(I型)、II型糖尿病、幼年型关节炎、狼疮、美尼尔氏病、混合性结缔组织病、多发性硬化、重症肌无力、寻常型天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎和皮肌炎、原发性丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、雷诺氏现象、瑞特氏综合症、风湿热、类风湿关节炎、结节病、硬皮病、干燥综合征、僵人综合症、多发性大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜风、韦格纳氏肉芽肿或任何急性或慢性炎症有关的燃烧、手术损伤和过敏。
T-MSC可分化成多种细胞系，包括但不限于脂肪细胞、成肌细胞、神经细胞谱系细胞、成骨细胞、成纤维细胞、软骨细胞、间质细胞。这些T-MSC衍生的细胞(T-MSC-DL)可用于治疗多种组织损伤，并且可用于组织工程、组织修复、组织再生、关节修复、腱愈合、结缔组织愈合、神经宗族组织和细胞修复、脂肪组织愈合、骨愈合、皮肤愈合、其它伤口愈合、肌肉愈合、愈合软骨、平滑肌愈合、心肌愈合、上皮组织愈合、韧带愈合、基质修复等。
具体地，T-MSC可以分化成神经细胞谱系细胞，用于治疗许多神经疾病，包括但不限于失写症、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化症、失语、失用症、蛛网膜炎、共济失调毛细血管扩张症、注意力缺陷多动症、听觉处理障碍、自闭症、酒精中毒、阿斯伯格综合症、双相情感障碍、贝尔氏麻痹、臂丛神经损伤、脑损伤、脑损伤、脑肿瘤、卡纳万病、卡普格拉综合症、灼痛、中枢性疼痛综合征、脑桥中央髓鞘溶解症、中央核肌病、头部失调症、脑动脉瘤、脑动脉硬化、脑萎缩、大脑性巨人症、脑性麻痹、脑血管炎、颈椎椎管狭窄、腓骨肌萎缩症、阿齐畸形、舞蹈病、慢性疲劳综合征、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性疼痛、科勒二氏综合征、昏迷、复杂区域疼痛综合征、压缩性神经病变、先天性面瘫、皮质基底变性、颅动脉炎、颉缝早闭、克罗伊茨费尔特-雅各布病、累积创伤性疾病、库欣综合征、巨细胞包涵体病(CIBD)、巨细胞病毒感染、丹迪-沃克综合征、道森病、德Morsier综合征、Dejerine-Klumpke麻痹、Dejerine-索塔斯疾病、睡眠时相延迟综合症、老年痴呆症、皮肌炎、发育运动障碍、糖尿病神经病变、弥漫性硬化、唐氏综合症、德摩西埃综合征、自律神经失调、计算障碍、书写困难、阅读障碍、肌张力障碍、空蝶鞍综合征、脑炎、脑膨出、脑三叉神经血管瘤病、大便失禁、癫痫、欧勃氏麻痹、红斑性肢痛症、特发性震颤、法布里病、法尔氏综合征、晕厥、家族性痉挛性瘫痪、高热惊厥、费雪症候群、弗里德共济失调、纤维肌痛、福维尔氏综合征、胎儿酒精效应、高歇病、格氏综合征、巨细胞动脉炎、巨细胞包涵体病、球形细胞脑白质营养不良、灰质异位、格林-巴利综合征、HTLV-1相关性脊髓病、哈勒沃登-斯帕茨疾病、头部外伤、头痛、面肌痉挛、遗传性痉挛性截瘫、多神经炎型遗传性运动失调、耳部带状疱疫、带状疱疹、平山综合征、前脑无裂畸形、亨廷顿氏病、积水性无脑、脑积水、皮质醇增多症、缺氧、免疫介导性脑脊髓炎、包涵体肌炎、色素失禁症、小儿植烷酸贮积病、小儿雷弗素姆病、婴儿痉挛症、炎症性肌病、颅内囊肿、颅内压增高、朱伯特综合征、卡拉克综合征、卡恩斯-塞尔综合征、甘乃迪病、金斯布林纳综合征、克利佩尔-费尔综合征、克拉伯病、库格尔贝格-韦兰德病、拉福拉病、兰伯特-伊顿肌无力综合征、伴发癫痫的获得性失语、延髓外侧(沃伦贝格)综合症、学习障碍、利氏病、伦-加斯托二氏综合征、自毁容貌综合征、脑白质营养不良、路易体痴呆、无脑回畸形、闭锁综合征、卢伽雷氏症(见肌萎缩侧索硬化症)、腰椎间盘突出症、腰椎管狭窄症、莱姆病-神经系统后遗症、马查多-约瑟夫病(3型脊髓小脑性共济失调)、巨脑、视物显大症、巨脑、梅-罗综合征、美尼尔氏病、脑膜炎、门克斯病、异脑白质营养不良、小头畸形、视物显小症、偏头痛、米勒费雪症候群、小中风(短暂性脑缺血发作)、恐音症、线粒体脑肌病、莫比斯综合症、单肢肌萎缩、运动神经元病、运动技能障碍、烟雾病、粘多糖贮积病、多发性脑梗塞性痴呆、多灶性运动神经病、多发性硬化、多系统萎缩症、肌肉萎缩症、肌痛性脑脊髓炎)、重症肌无力、髓鞘破坏弥漫性硬化症、婴儿肌阵挛性脑病、肌阵挛、肌病、肌小管性肌病、先天性肌强直、嗜眠发作、神经纤维瘤病、恶性精神抑制药综合征、AIDS的神经表现、狼疮的神经后遗症、神经性肌强直、神经元蜡样质脂褐质沉积症、神经元移位异常、尼曼-皮克病、非24小时睡眠-觉醒综合征、非言语型学习障碍、奥沙利文-麦克劳德综合征、枕神经痛、隐性脊柱神经管闭合不全序列征、大田原综合征、橄榄体脑桥小脑萎缩、眼球斜视疫挛综合征、视神经炎、直立性低血压、过度使用综合、持续后像、感觉异常、帕金森氏症、先天性肌强直病、副肿瘤性疾病、阵发性发作、帕-罗二氏综合征、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、周期性麻痹、周围神经病、广泛性发育障碍、旋光性喷嚏反射、植烷酸贮积症、皮克氏病、捏神经、垂体瘤、PMG、多发性神经病、小儿麻痹症、多小脑回、多发性肌炎、脊髓灰质炎后综合症、带状疱疹后遗神经痛(PHN)、体位性低血压、普拉德-威利综合征、原发性侧索硬化、朊病毒疾病、进行性面部偏侧萎缩、进行性多灶性脑白质病、进行性核上性麻痹、假性脑瘤、四肢瘫痪、狂犬病、拉姆齐·亨特综合征I型、拉姆齐-亨特综合征II型、拉姆齐-亨特综合征III型(见拉姆齐-亨特综合征)、拉斯姆脑炎、反射神经血管营养不良、雷弗素姆病、重复性压力损伤、不宁腿综合征、逆转录病毒相关性脊髓病、雷特氏综合症、瑞氏综合征、节律性运动障碍、雷尔氏综合症、圣维特斯舞蹈病、桑德霍夫病、希尔德病、脑裂畸形、感觉统合失调、隔-视神经发育不良、摇晃婴儿综合症、带状疱疹、夏-德综合征、干燥综合征、睡眠呼吸暂停、睡眠病、饱食(Snatiation)、索托斯综合征、痉挛、脊柱裂、脊髓损伤、脊髓肿瘤、脊髓性肌萎缩、脊髓小脑性共济失调、脑裂、斯蒂尔-理查德森-欧斯祖斯基病、僵人综合征、中风、斯特奇-韦伯综合征、亚急性硬化性全脑炎、皮层下动脉硬化性脑病、表面铁质沉着症、西德纳姆舞蹈症、晕厥、共感觉、脊髓空洞症、踝管综合征、迟发性运动障碍、迟发性精神障碍、Tarlov囊肿、泰萨二氏病、颞动脉炎、破伤风、脊髓栓系综合征、肌强直性白内障、胸廓出口综合征、三叉神经痛、托德氏瘫痪、妥瑞症、中毒性脑病、短暂性脑缺血发作、传染性海绵状脑病、横断性脊髓炎、脑外伤、震颤、三叉神经痛、热带痉挛性截瘫、锥虫病、结节性硬化、Ubisiosis、单相抑郁、希林二氏病(VHL)、威流斯科脑脊髓炎(VE)、瓦伦堡氏综合征、沃尼克-霍夫曼症、韦斯特综合征、挥鞭样损伤、威廉斯综合征、威尔逊氏病。
5.17使用T-MSC作为递送系统
因为本发明的T-MSC已经展示穿过血-脑屏障和血-脊髓屏障独特的能力，本发明的另一个实施方式是一种使用T-MSC穿过血-脑屏障和/或血-脊髓屏障以递送药剂的方法，该方法的药剂和T-MSC连接或缀合以形成复合物，并将T-MSC–药剂复合物施用给受试者，其中T-MSC穿过血-脑屏障和/或血-脊髓屏障以递送药剂至中枢神经系统。T-MSC可以是单细胞、细胞培养物、溶液或药物制剂的形式。药剂将包括但不限于化学品、药物、蛋白质、DNA、RNA、抗体和小分子。
本发明的另一个实施方式是一种穿过血-脑屏障和/或血-脊髓屏障以递送药剂的递送系统，该系统包括药剂和T-MSC缀合或连接。
所述透过血-脑屏障和血-脊髓屏障的能力将可用于治疗和预防疾病，包括但不限于多发性硬化、癌症、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、脑膜炎、脑炎、狂犬病、癫痫、痴呆、莱姆病、中风、肌萎缩性侧索硬化、脑和脊髓损伤。因此，有需要其的受试者将患有或有风险患上涉及血-脑屏障和血-脊髓屏障的疾病。因此，本发明的另一个实施方式是一种治疗疾病或损伤的方法，所述方法的药剂缀合或连接至T-MSC以形成复合物，并且给有需要其的受试者施用T-MSC-药剂复合物，其中，T-MSC穿过血-脑屏障和/或血-脊髓屏障并将药剂递送至中枢神经系统，所述药剂用于治疗或预防受试者的疾病或损伤。由于T-MSC具有强大的迁移能力和渗透能力，它也可用作载体以运送抗肿瘤药物和蛋白以治疗肿瘤/癌症。所述T-MSC可以是单细胞、细胞培养物、溶液或药物制剂的形式。药物包括但不限于化学品、药物、蛋白、DNA、RNA、微-RNA、非编码RNA、抗体、小分子和/纳米分子。
用于治疗和预防疾病的有用药剂包括但不限于抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂、类固醇、化学治疗剂、抗炎剂、细胞因子和/或合成肽。
与T-MSC缀合的蛋白质和多肽也将是有用的T-MSC，所述蛋白质和多肽包括促红细胞生成素(EPO)、抗β淀粉样蛋白肽、组织纤溶酶原激活剂(TPA)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、干扰素(IFN)、生长因子/激素、抗血管内皮生长因子肽、抗肿瘤坏死因子肽、神经生长因子、肝细胞生长因子、IL-2、CX3CL1、GCV、CPT-11、胞嘧啶脱氨酶、HSV-TK、羧酸酯酶、溶瘤病毒、TSP-1、TRAIL、FASL、IL-10以及TGFb。结合于特异的受体并封闭这些受体的蛋白质和多肽，也将是有用的并且是本发明计划连接T-MSCs的。
编码治疗蛋白和多肽的DNA和RNA也可与T-MSC缀合形成缀合物，以穿过血-脑屏障和/或血-脊髓屏障递送。
术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体、人源化或嵌合抗体、单链Fv抗体片段、Fab片段和F(ab')2片段。多克隆抗体针对抗原内包含的特定抗原表位的异源群抗体，而单克隆抗体指针对抗原所含特定表位的同质群抗体。单克隆抗体是本发明中特别有用的。
有效地阻止疾病信号通路中分子或受体分子活化、表达和/或作用的任何药剂可用于连接或缀合T-MSC，所述疾病指涉及穿过血-脑屏障和/或血-脊髓屏障的任何疾病。这种药剂包括但不限于化学品、植物化学品、药物、生物制剂、有机小分子、抗体、核酸、肽类和蛋白质。
也可以使用“诱饵”分子抑制信号通路，该“诱饵”分子模拟靶分子在通路中结合和激活的区域。活化的分子会结合代替靶标的诱饵，并且不可能发生活化。
还可以使用“显性干扰”分子或活化分子(活化分子是缩短了的，缺少激活域)保留的结合域抑制。这些分子在信号通路中结合受体，但是不能生产的，并且阻止受体结合至所述活化分子。这种诱饵分子和显性干扰分子可通过本领域内已知的方法进行制造，并且通过连接或缀合至T-MSC以穿过血-脑屏障或血-脊髓屏障递送。
穿过血-脑屏障和/或血-脊髓屏障以递送药剂的方法也用于诊断剂，包括但不限于化学品、抗体、多肽、蛋白、DNA、RNA。这种为了应用于诊断的药剂必须有被可视化和/或定量的方法。这种方法包括但不限于荧光、生物标记、染料、放射性同位素标记和/或纳米颗粒。
这样的递送方法和递送系统将有利于诊断神经障碍、多发性硬化、癌症、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、脑膜炎、脑炎、狂犬病、癫痫、痴呆、莱姆病、中风、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、以及脑和脊髓损伤。因此，本发明的另一个实施方式是一种诊断疾病或损伤的方法，该方法通过将药剂连接或缀合至T-MSC以形成复合物；并且把T-MSC-药剂复合物施用于疑患病的受试者，其中，所述T-MSC穿过血-脑屏障和/或血-脊髓屏障并将所述药剂递送至中枢神经系统。所述T-MSC可以是单细胞、细胞培养物、溶液或药物制剂的形式。药剂包括但不限于化学品、药物、蛋白、DNA、RNA、抗体和小分子。
不论什么类型和是否用于治疗、预防、诊断的试剂，可通过本领域已知的任何方法缀合或连接到T-MSC，包括但不限于合成细胞外基质、藻酸-聚-L-赖氨酸胶囊和/或容器。
在某些实施方式中，工业制造的大规模生产水平被包括在本发明，这样的方法是本领域熟知的。在某些实施方式中，大规模生产包括使用Hyper-STACK2D培养系统和/或微载体3D生物反应器。
6.实施例
实施例1.T-MSC的衍生
材料和方法
以下试剂和材料从以下所述厂商获得：
定制的mTeSR1培养基：干细胞技术有限公司
BMP4：Stemgent或其他供应商
SB431542：Cayman Chemical或其他供应商
A83-01：Stemgent或其他供应商
ALK5抑制剂：Stemgent或其他供应商
DMEM/F12：GIBCO美国生命技术公司
alpha-MEM：GIBCO美国生命技术公司
胎牛血清：GIBCO美国生命技术公司或其他供应商
hESC细胞系CT2来自康涅狄格大学干细胞中心，在已被辐射的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)作饲养细胞的条件下培养2代，然后所述hESC接种在包被基质胶的培养皿并培养在mTeSR1培养基中(Ludwig等，2006)(干细胞技术公司，温哥华，加拿大)。人胚胎干细胞ESI-017、ESI-05、ESI-053、ESI-049和ESI-35从生物时代公司购买(加利福尼亚州)。
T-MSC的衍生
如图1所示，将在基质胶包被培养皿上汇合度达约80％的hESCs被1mg/ml分散酶消化5-10分钟。然后该细胞经mTESR1培养基清洗1次并以小块或单细胞接种在包被基质胶的培养皿并在mTESR1培养基中培养12小时。接着培养基被换成滋养细胞形成培养基，该培养基包含BMP4(2-100ng/ml)，或可选A83-01(0.1-1μM)。在培养48-72小时后，所述细胞从hESC样形态变成滋养细胞形态，滋养细胞形态的特征为扁平、细胞尺寸增大、核/胞质溶胶比例小和弥漫性细胞边界。所述细胞被Tryp-LE消化并用MSC生长培养基清洗，MSC生长培养是包含20％FBS和非必需氨基酸的α-MEM。然后该细胞以5000细胞/cm2的密度接种在包被基质胶的培养皿。24小时后更换培养基，接着每3-4天更换培养基。再过6天，该细胞分化成纺锤样细胞，类似典型的MSCs的形态。第2天滋养细胞的形态如图2A所示。第5天前-T-MSC的形态如图2B所示。T-MSC的形态如图2C所示。
HB-MSC的衍生
hESC细胞系CT2分化成EB细胞，然后按以前所述方法富集HB(Lu et等，2008)。在包被基质胶培养皿上汇合度达50-80％的hEC细胞用分散酶(1mg/ml，5至10分钟)消化，然后使用如下培养基清洗：EB形成基础培养基或HPGM(Lonza，Walksville，马里兰)或STEMLINE I/II造血干细胞扩增培养基(Sigma，St.Louis，密苏里)、或StemSpan H3000(Stem CellTechnologies，温哥华，加拿大)或含10％FBS的IMDM或含10％FBS的DMEMM/F12。然后细胞培养在EB形成培养基中，该培养基补充了50ng/ml VEGF(Peprotech)和50ng/ml of BMP4(Stemgent)。以约2-3百万细胞/ml的密度在超低培养皿中培养48小时。48小时后，一半的培养基被更换成添加了25-50ng/ml bFGF的新鲜EB形成培养基。
4天后，收集在培养基中形成的EB细胞并且在37℃使用C rypLE消化2-3分钟，把EB细胞分散成单细胞。细胞被清洗并以1-5百万细胞/ml的密度重悬在EB形成基础培养基。所述单细胞悬液以1:10的比例和成血管细胞生长培养基(Stem Cell Technologies，温哥华，加拿大)混合。
母细胞生长培养基的配制如下：在总量为100ml的无血清的甲基纤维素CFU培养基中添加如下，VEGF、TPO、FLT3-配体至浓度50ng/ml、bFGF至浓度20-50ng/ml、1ml EX-CYTE生长增强培养基补充物和1ml Pen/Strap，混合均匀。
混合物经涡旋后穿过16G针接种在超低培养皿并在37℃、CO2环境中培养5-9天。
单细胞在MSC培养基中重悬，该培养基包括：1)含10-20％FBS的α-MEM(Invitrogen)，或2)含10-20％KOSR的α-MEM，3)含10-20％FBS的高糖DMEM，或4)含10-20％KOSR的高糖DMEM。细胞以100-5000细胞/cm2的密度培养在包被基质胶、明胶、玻连蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白或胶原I的培养皿。在24小时后更换该培养基并且每2-4天更新。在6-12天后，所述细胞逐渐分化成纺缍状细胞，形态类似典型的MSC。
通过使用SB431542衍生MSC
这种方法先前已发表(Chen等，2012)。
结果
已经发现，所述产生T-MSC的方法具有高效率、高产量和高纯度的特点。如图1底部所示，在第10天，T-MSC已经产生>90％纯度的MSC并且细胞数提高了10倍，而其它方法要么不产生任何MSC，要么产生的MSCs纯度非常低。在第20天，T-MSC已经产生>99％纯度的MSC并且细胞数量扩增了300倍，而其它方法最多仅扩增20倍。在第30天，10万个hESC 69{10143/003371-WO0/01055509.1}产生500亿个T-MSC，也就是说，原初的hESC扩增了500000倍，然而其它方法最多仅扩增3000倍。
实施例2.T-MSC的表征
进一步采用流式细胞术免疫荧光染色分析从实施例1中获得的T-MSC。
材料和方法
使用流式细胞术分析T-MSC的特征。使用含2％的BSA的PBS清洗和封闭细胞，并根据厂商说明书使用抗体对各种细胞表面标记染色，所述标记有Trop-2(Trp-2，eBioscience)、CD31、CD34、CD29、CD73、CD90、CD105、CD44、CD45、CD146、CD166、HLA-ABCHLA-DR、HLA-G(BD Bioscience或eBioscience)。在nFACS LSR II流式细胞仪中使用FACSDiva软件(BD Bioscience)收集数据。使用FlowJo软件(Treestar)分析收集的数据。
结果
第2天获得的贴壁滋养细胞、第5天的贴壁前-T-MSC和第9天贴壁T-MSC进行CD73和Tro-2染色。所述滋养细胞仅表达高水平的Tro-2(大于95％)，但表达少于1％的CD73(图3A)；在第5天，所述前-T-MSC有多于50％的细胞同时表达Trop-2和CD73，40％的细胞仅表达CD73(图3B)；在hESC分化第9天获得的T-MSC有少于1％的细胞表达Trop-2并且99％的细胞仅表达CD73(图3C)。
进一步采用流式细胞术染色分析T-MSC的多个细胞表面标记，结果显示T-MSC中<3％细胞表达Trop-2，<1％细胞表达CD31和CD34，>99％细胞表达CD73，>95％细胞表达CD90，>90％细胞表达CD105，>99％细胞表达CD44，>80％细胞表达CD29(图4A-H)。
实施例3.T-MSC在体外比BM-MSC对T细胞功能有更强的抑制能力
比较hEs-MSCs和BM-MSCs在体外抑制抗原刺激的T细胞增殖的能力。
材料和方法
BM-MSCs的培养
BM-MSCs来源于骨髓单核细胞(BMMNCs)或从AllCells公司(阿拉米达)和Lonza(巴塞尔，瑞士)获得BMMNCs。为了衍生，解冻BMMNCs并接种在组织培养用的塑料皿，培养基为含MEM+20％FBS。在前4-5天内开始出现粘附细胞，并且每隔2-3天喂养细胞，直到约10-12天，这时收集细胞并以3000-5000细胞/cm2重新铺。
使用从小鼠外周淋巴结分离的淋巴细胞进行T细胞增殖的体外试验。这些淋巴细胞在37℃温度下被5μM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记10钟，通过观测CFSE在子代细胞的稀释追踪细胞增殖。10000T-MSC或BM-MSC和100000淋巴细胞混合在96孔板的一个孔，并且连接在培养板的抗-CD3抗体(0.3，1μg/ml)和可溶的抗-CD28抗体(1μg/ml，eBioscience，加利福尼亚州)刺激该细胞增殖。在刺激后第3天收集该细胞，接着进行染色抗-CD4和抗-CD8抗体(BD Bioscience，加利福尼亚州)的FACS。CFSE稀释分别作CD4+和CD8+T细胞的门控。
结果
通过小鼠淋巴细胞的体外试验，发现在抗-CD3抗体(0.3和1μg/ml)刺激时，T-MSC抑制小鼠CD4+和CD8+T细胞的增殖，然而BM-MSC仅在低剂量(例如0.3μg/ml)抗-CD3抗体刺激时才具有抑制作用(图5)
实施例4.T-MSCs降低EAE小鼠的疾病评分
因为已经证明BM-MSCs能够减缓多发性硬化症小鼠模型－实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的疾病发展，将实施例1中获得的T-MSC注射入EAE小鼠以确定它们是否具有相同的效果。
材料和方法
使用SB431542衍生MSC；来源于这种方法的MSC将被称为hES-MSC(SB)。这种方法已经发表(Chen et等，2012)。
该EAE小鼠模型的诱导如以前所述(Stromnes和Goverman，2006)。C57BL/6小鼠皮下由注射髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽35-55(MOG35-55)、弗氏佐剂和百日咳毒素组成的混合物，以上药剂包含在EAE诱导试剂盒中(Hooke Laboratories公司，MA，(Cat.#EK-0114))。诱导的操作流程根据厂商的说明书并且在Ge等(2012)中描述。
BM-MSC、T-MSC或hES-MSC(SB)/小鼠或PBS(赋形剂对照)通过皮下注射(i.p.)，其中，在免疫后第6天注射以诱导预发病模型，在免疫后第18天注射以诱导发病后模型。每天监测小鼠的疾病评分，直至31天。
疾病评分系统如下：
0：没有疾病的迹象
1：完全尾巴瘫痪
2：部分后肢瘫痪
3：完全后肢瘫痪
4：前肢体瘫痪；
5：垂死
(Stromnes和Goverman，2006)
结果
如图6所示，在注射后6天或预发病，所述T-MSC显著地减少每日的疾病评分，展现出T-MSC的预防效果。注射BM-MSC的小鼠并没有减少疾病评分，hES-MSC(SB)部分有效地减少疾病评分，但效果不如T-MSC好。
实施例5.T-MSC的多谱系分化
材料和方法
T-MSC的成骨形成、软骨形成和脂肪形成
STEMPRO成骨和软骨分化试剂盒(Invitrogen公司，格兰德岛，NY)用于成骨和软骨形成，并且Hyclone公司AdvanceSTEM脂肪分化试剂盒(Thermo Scientific，洛根，犹他州)用于脂肪分化，根据制造商的说明进行操作。
结果
如图7所示，T-MSC具有良好的潜能分化成中胚层组织的所有3个细胞系：成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。因此，T-MSC可作为细胞源以应用于组织再生、组织工程和组织修复。
实施例6.T-MSC不同于hES-HB-MSC和BM-MSC
通过微阵列分析比较T-MSC、hES-HB-MSC和BM-MSCs的基因表达模式
材料和方法
为了进行微阵列分析，根据制造商说明书操作，用Trizol(Invitrogen，CA)提取第2-4代hES-MSC或第3代BM-MSC的RNA。使用人HT-12v4表达微珠芯片阵列(Illumina，圣地亚哥，加利福尼亚)分析所述细胞的基因表达谱。使用Genome Studio V2011.1分析数据。2株来源不同的BM-MSC细胞系被使用，2株来源于H9和MA09的hES-MSC系被使用。
结果
如图8所示，3种不同MSCs的一些重要细胞因子、转录因子、细胞表面标记的整体表达谱大不相同。T-MSC可以在免疫抑制和组织再生中起不同的作用。
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尽管参考优选实施例对本发明进行了描述，但本领域普通技术人员应该理解，可进行各种变化，并且可用等同物对其要素进行替代，而不超出本发明的范围。此外，在不偏离本发明的实质范围和精神的条件下，根据本发明的教导，可以作出许多修改以适应特定用途、应用、制造条件、使用条件、组合物、介质、尺寸和/或材料。因此，本发明不局限于所述的特定实施例和如本文所述最佳实施方式。这种修改将落入所附权利要求的范围内。
这里引用的所有参考文献的全部内容为所有目的并入这里作为参考，如同每个出版物或专利或专利申请的全部内容被专门地单独指出为所有目的并入作为参考一样。

Claims (18)

1.一种从人胚胎干细胞(hESCs)或诱导多能干细胞(iPSCs)生产滋养层来源的间充质干细胞(T-MSCs)的方法，所述方法包括：
(a)在包含骨形态发生蛋白4(BMP4)的培养基中培养hESCs或iPSCs2-5天，足以使hESCs或iPSCs分化成滋养层；
(b)把滋养层细胞分散成单细胞；
(c)将所述滋养层细胞重新铺在包被明胶、玻连蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、基质胶或胶原的板上；以及
(d)在包含20％FBS和非必需氨基酸的α-MEM的间充质干细胞(MSC)生长培养基中培养所述滋养层细胞4-10天，所述培养基的量足够诱导所述滋养层细胞分化成间充质干细胞，其中至少90％所述间充质干细胞表达CD73；所述方法产生1×106至5×1010间充质干细胞。
2.权利要求1所述的方法，其中，步骤(d)培养所述滋养层细胞是6天至8天。
3.权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)中所述培养基进一步包含TGFβ抑制剂以提高分化效率。
4.权利要求3所述的方法，其中，所述TGFβ抑制剂是SB431542或A83-01抑制剂。
5.权利要求3所述的方法，其中，所述TGFβ抑制剂是ALK5抑制剂。
6.权利要求1所述的方法，其中，在步骤(a)之前，hESCs培养包括以下步骤：
(i)在基质胶包被的培养板上培养至80％汇合度；
(ii)分散细胞；
(iii)分离；和
(iv)清洗。
7.权利要求1所述的方法，其中，所述BMP4的浓度是1ng/ml至100ng/ml。
8.权利要求1所述的方法，其中，所述BMP4的浓度是2ng/ml至100ng/ml。
9.权利要求1所述的方法，其中，所述BMP4的浓度是1ng/ml至10ng/ml。
10.权利要求4所述的方法，其中，所述A83-01的浓度是0.1μM至5μM。
11.权利要求4所述的方法，其中，所述SB431542的浓度是1μM至20μM。
12.权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，所述的间充质干细胞是CD105+和/或CD90+，并且纯度至少90％。
13.滋养层来源的间充质干细胞，其通过权利要求1～12任一项所述的方法生产。
14.权利要求13所述的间充质干细胞，其中，所述细胞至少95％是CD73+。
15.权利要求13或14所述的间充质干细胞，其中，所述细胞是>98％CD73+，>95％CD90+，>90％CD105+，>95％CD44+和/或>80％CD29+。
16.权利要求13或14所述的间充质干细胞，其中，所述细胞是内皮标记CD31阴性和造血标记CD34阴性。
17.权利要求15所述的间充质干细胞，其中，所述细胞是内皮标记CD31阴性和造血标记CD34阴性。
18.权利要求13～17任一项所述的间充质干细胞在产生脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、神经细胞谱系细胞、成肌细胞、基质细胞或成纤维细胞中的用途。
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