CN115785221B - 一种转录因子hoxb9磷酸化位点的特异性抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种转录因子HOXB9磷酸化位点的特异性抗体及其制备方法和应用，所述特异性抗体的制备方法包括：合成PGELLKQGTPEYS序列多肽，并将T位点进行磷酸化处理；利用合成的多肽免疫获得多克隆抗血清，对抗体进行纯化处理，即得到所述特异性抗体。通过本发明所述方法制备得到的特异性抗体，可特异性的识别肿瘤标本和小鼠标本中HOXB9第133位氨基酸的磷酸化的量，从而判断肺癌的预后，也可指征由糖代谢通路变化引发的异常代谢情况。

Description

一种转录因子HOXB9磷酸化位点的特异性抗体及其制备方法 和应用

技术领域

本发明属于肿瘤预后判断技术领域，涉及一种转录因子HOXB9磷酸化位点的特异性抗体及其制备方法和应用。

背景技术

同源异形盒基因最初是在研究黑腹果蝇胚胎发育时发现的，该类基因的突变可导致真核生物某一器官异位生长。人类HOX基因在结构和功能上与果蝇的同源异形复合体高度同源，共有39个基因，根据序列的相似性及在染色体上的位置可以分为HOXA、HOXB、HOXC和HOXD四簇。HOXB9基因主要在胚胎发育晚期开放，主要控制体轴远端和神经外胚层末端的发育，促进细胞的分化和凋亡。异常表达的HOXB9正向调控肺癌、甲状腺癌、乳腺癌、淋巴瘤等多种恶性肿瘤的发生、侵袭和转移。然而HOXB9在胃癌中却被认为是一种保护因素，HOXB9高表达是胃癌和结肠癌预后良好的一个重要的指标。HOXB9在不同类型恶性肿瘤中发挥多面性的调节作用引起我们的关注。

发明内容

为了克服现有技术的问题，本发明提出了一种一种转录因子HOXB9磷酸化位点的特异性抗体及其制备方法和应用，通过本发明所述方法制备得到的抗体，可特异性的识别肿瘤标本和小鼠标本中HOXB9第133位氨基酸的磷酸化的量，从而判断肺癌的预后，也可指征由糖代谢通路变化引发的异常代谢情况。

本发明的目的是这样实现的：

一种多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1：PGELLKQGTPEYS所示，且其中T位点进行磷酸化处理。

进一步的，所述T位点磷酸化处理使用的磷酸激酶为AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)。

本发明的另一方面：

所述多肽的应用，其中，所述多肽用于制备转录因子HOXB9磷酸化位点的特异性抗体。

本发明的第三方面：

一种转录因子HOXB9磷酸化位点的特异性抗体的制备方法，包括以下步骤：

1)人工合成序列如SEQ ID NO.1：PGELLKQGTPEYS多肽，并将T位点进行磷酸化处理；

2)利用步骤1)合成的多肽免疫兔获得多克隆抗血清，酶联免疫吸附试验法(ELISA)测定血清中抗体滴度，并对抗体进行纯化处理，即得到所述特异性抗体。

进一步的，步骤2)中免疫兔的具体方法为：

于初次免疫后，分别进行2～3次加强免疫，每次免疫均用如权利要求1或2所述的多肽与等体积的佐剂混匀，背部皮下多点注射；最后一次加强免疫前取耳血，分离血清作为免疫后血清，采用ELISA测定血清中的抗体效价，当抗体滴度达到10⁶数量级时，颈动脉放血，收集血清，即获得所述的多克隆抗血清。

进一步的，步骤2)中ELISA测定血清中抗体滴度的具体方法为：

吸取适量碳酸缓冲液，稀释如权利要求1或2所述多肽，加入酶标板中，4℃包被过夜；第二天移去包被液，稀释缓冲液清洗；加入牛血清白蛋白，37℃封闭，依次与梯度稀释的兔抗血清、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗，37℃分别反应，而后稀释缓冲液再次清洗；底物液避光显色后，每孔加入硫酸终止反应，酶联免疫吸附试验检测仪读取吸光度值进行分析。

进一步的，步骤2)中所述抗体进行纯化处理的具体方法为：

取Protein A珠子加入兔抗血清中充分混合，室温孵育，PBS清洗；加入甘氨酸、静置，洗脱至预先加有Tris缓冲液的管中，立即颠倒混匀，重复洗脱后，即得到所述特异性抗体。

本发明的第四方面：

一种转录因子HOXB9磷酸化位点的特异性抗体，所述特异性抗体由上述制备方法制得。

本发明的第五方面：

上述转录因子HOXB9磷酸化位点的特异性抗体的应用，其中，所述特异性抗体可用于制备判断肿瘤预后情况及由糖代谢通路变化引发的异常代谢情况的试剂盒。

进一步的，所述肿瘤包括肺癌肿瘤。

本发明的优点和有益效果是：

1、本发明发现HOXB9唯一的磷酸化位点为苏氨酸T133位，且筛选出AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)能够特异性磷酸化HOXB9；

2、本发明所制备得到的抗体，可特异性识别肺癌肿瘤标本中HOXB9第133位氨基酸的磷酸化的量，从而肺癌肿瘤的预后情况；

3、本发明所制备得到的抗体，可特异性识别肺癌肿瘤标本中HOXB9第133位氨基酸的磷酸化的量，且HOXB9磷酸化与AMPK磷酸化在肺腺癌患者的表达存在正相关性，因此AMPK-pHOXB9能够共同且更加精准的判断肺癌肿瘤的预后情况；

4、本发明所制备得到的抗体，可特异性识别小鼠标本(成体各器官及全组织胚胎)中HOXB9第133位氨基酸的磷酸化的量，因此可以指征由AMPK通路变化引发的代谢异常情况。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1为用磷酸化抗体IP发现细胞中的HOXB9存在丝苏氨酸磷酸化修饰的结果图；

图2为确定HOXB9磷酸化位点在第133位苏氨酸的检测结果图；

图3为p-T133-HOXB9特异性抗体在多种细胞系的定位以及与AMPK的共定位情况结果图；

图4为免疫组织化学法检测肺腺癌患者p-T133-HOXB9的表达水平情况结果图；

图5为p-T133-HOXB9与p-AMPK表达关系结果图；

图6为实施例三动物实验分组示意图；

图7为p-T133-HOXB9在小鼠肺组织中的表达结果示意图；

图8为全组织胚胎的免疫组织化学法检测结果示意图。

具体实施方式

本发明下述各实施例中所采用的材料：浓盐酸、浓硫酸、氢氧化钠、二甲苯、碳酸氢钠、异丙醇、三氯甲烷、丙三醇、无水乙醇、甲醇、冰醋酸、葡萄糖、无水乙酸钠、氯化钙等购自北京化工厂；对苯二酚、2-巯乙基磺酸钠、多聚甲醛、二磷酸氯喹盐、过硫酸铵、焦碳酸二乙酯(DEPC)、结晶紫、考马斯亮蓝R250、氯化镁六水合物、氯化锰、氯化钠、硼酸、氢氧化钠、十二烷基硫酸钠(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、脱氧胆酸钠、硝普钠、乙二胺四乙酸(EDTA)、原钒酸钠盐、HEPES、二甲基亚砜(DMSO)、戊巴比妥钠、二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇、溴酚蓝、CHAPS、Tris、Tween-20、NP-40、Triton X-100、dNTP、氯霉素(Cam)等购自Sigma公司；氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kana)等购自北京鼎国昌盛生物技术公司。

本发明下述各实施例涉及的检测方法包括：

一、Western Blot检测方法

1)SDS-PAGE凝胶的配制：配置分离胶浓度取决于要检测的蛋白质分子量，检测蛋白的分子量越大，所配置的分离胶浓度越低。配置下层分离胶时需充分搅匀后倒入玻璃板中，用异丙醇或蒸馏水压平液面。待分离胶完全凝固后，倒掉异丙醇，用蒸馏水清洗干净并吸干。再配制浓缩胶，充分搅匀后倒入玻璃板中，插入适合孔径和孔数的配胶梳子，至浓缩胶完全凝固时竖直拔出梳子；

2)电泳准备：配制1×电泳液，在电泳槽中架好SDS-PAGE胶板；

3)上样：根据要检测的蛋白含量及抗体效价调整蛋白上样量，按照实验要求上样；

4)电泳：起始电压为80V，待蛋白样品完全进入到分离胶后将电压上调至120V，直至Loading完全跑出SDS-PAGE胶底部；

5)转膜(湿转)：提前裁好PVDF膜(8.5cm×5.5cm)和滤纸(9cm×6cm)。首先将3张滤纸重叠放入电转液中，使之浸湿，再置于转膜海绵上，排净气泡；将PVDF膜放入甲醇中浸泡激活30s左右，随后放在滤纸之上，排净气泡。打开SDS-PAGE胶板，裁去多余胶，倒扣于PVDF膜上，排净气泡；再将3张滤纸重叠放入电转液中使之浸湿，并置于胶上，排净气泡，再放一层海绵，扣紧电转夹(即“黑胶白膜”)，放入电转槽后倒满电转液。200mA恒流进行转膜，转膜时间取决于目的蛋白分子量和SDS-PAGE胶浓度；

6)封闭：先配制封闭液(5％的脱脂牛奶或5％的BSA)，现用现配。转膜结束后取出PVDF膜，用镊子夹取PVDF膜并用剪刀减去右上角作为标记，再置于放有封闭液的孵育盒中，室温条件下在水平摇床上封闭1h或4℃封闭过夜；

7)一抗孵育及清洗：按所需目的蛋白分子量对PVDF膜进行裁剪，放入配制好的溶有一抗的TBST或BSA等试剂中，抗体稀释比例及稀释试剂依据抗体说明书进行，室温孵育1h以上或4℃孵育6h以上。后将PVDF膜从孵育管中取出，置于TBST中清洗，在水平摇床上清洗3次，每次8min；

8)二抗孵育及清洗：根据所孵一抗的种属，用封闭液配制相应的二抗溶液，配置比例根据二抗说明书进行。室温孵育45min或4℃孵育1-2h。后将PVDF膜从孵育管中取出，置于TBST中，在水平摇床上清洗3次，每次6min；

9)曝光：按说明书配制发光液，用滤纸吸去PVDF膜上残留的TBST缓冲液，均匀滴加发光液，孵育30s后置于曝光机进行曝光。

二、全蛋白裂解液配比及配制：

三、10×电泳液配比及配制(1L)：

加入适量蒸馏水，用磁力搅拌器充分搅拌至完全溶解，蒸馏水定容至1L，使用前稀释至1×。

四、1×电转液配比及配制(1L)：

加入适量蒸馏水，用磁力搅拌器充分搅拌至完全溶解，蒸馏水定容至1L。

五、SDS-PAGE凝胶配比及配制：

1)分离胶配方(两块量)

2)浓缩胶配方(两块量)

六、免疫共沉淀的检测方法(Co-IP)：

以一个100mm培养皿的细胞量为例：

1)提取细胞全蛋白；

2)预清除：提前加入Protein-A/G Agarose及兔/鼠源IgG，清除与抗体和琼脂糖凝胶非特异结合的成分，按照每500μg蛋白加50μL琼脂糖凝胶及50μg IgG抗体进行反应。4℃，旋转摇床上颠倒混匀2h。若加入的是Flag-M2亲和性琼脂糖凝胶则不需要预清除，直接进行步骤5)；

3)4℃，12000rpm离心30s，吸取上清至全新、提前预冷的1.5mL Ep管中；

4)实验组蛋白溶液加入特定抗体，阴性对照组蛋白溶液加入相同抗性等量的IgG，4℃，旋转摇床颠倒混匀过夜；

5)第二天加入Protein-A/G Agarose 40-50μL，4℃，旋转摇床颠倒混匀4h以上；

6)用全蛋白裂解液或PBS清洗琼脂糖凝胶除去非特异蛋白。4℃，12000rpm离心30s，弃上清，轻轻加入1mL全蛋白裂解液或PBS，轻柔地上下颠倒，再次离心，重复3-4次；

7)最后一次离心后必须吸净上清，每管加入50μL的2×Loading Buffer，100℃金属浴煮10min，每隔4-5min轻轻弹拨一次；

8)样本制备完成后可直接进行western blot检测，或放置-80℃冰箱进行保存，避免反复冻融加速蛋白降解。

七、斑点印迹实验检测

1)将定制磷酸化多肽及非磷酸化多肽按照0.1，1，10，100进行倍比稀释；

2)裁剪合适尺寸的醋酸纤维化膜(NC膜)，用移液枪吸取不同浓度的多肽溶液1μL，滴在NC膜上，等待液滴完全风干；

3)将NC膜放入5％脱脂牛奶或5％BSA中常温封闭1h；

4)一抗孵育：将NC膜放入溶有抗体的TBST孵育盒中，常温水平摇床上孵育2h或4℃水平摇床上孵育6h以上；

5)后续操作参见“Western Blot”步骤。

八、免疫荧光检测实验

1)将预先准备好的细胞爬片用4％多聚甲醛室温固定15min。

2)用PBS振荡清洗3次，每次5min。

3)用0.1％的NP-40室温通透10min。

4)再次用PBS振荡清洗3次，每次5min。

5)用5％的BSA室温封闭30min-1h。

6)不清洗，直接滴加稀释好的一抗置于4℃过夜，一抗稀释比例为1:100左右。

7)从一抗移出后用PBS振荡清洗3次，每次5min。

8)根据一抗种属来源选择滴加相应的荧光二抗，室温避光孵育1-2h，二抗稀释比例为1:200，用5％的BSA或PBS稀释。

9)移除二抗，用PBS振荡清洗三遍，每次5min。

10)滴加DAPI染核10min。

11)用PBS洗干净多余染料，可以多洗几次，使用封片剂封片，在confocal下观察并且拍照。

实施例一：

本实施例用泛苏丝氨酸磷酸化特异性抗体下拉，发现细胞内HOXB9是一种能够被磷酸化的蛋白，且AMPK是其磷酸激酶，同时HOXB9与AMPK两者的相互作用是基于AMPK对HOXB9的磷酸化。

如图1所示，其中图1中(A)在HEK293T细胞中共转染HA-AMPKα1/2以及Flag-HOXB9，在Co-IP复合物中进行CIP(碱性磷酸酶抑制剂)处理。发现加入CIP组相比于对照组，AMPKα1/2与HOXB9的相互作用会大大减弱，说明二者之间的相互作用很可能是磷酸化依赖的。图1中(B)在H1299细胞中共转染Flag-AMPKα1/2以及Flag-HOXB9，IP实验后进行泛丝苏氨酸磷酸化抗体的检测，并用泛酪氨酸磷酸化抗体作为阴性对照。检测结果显示，高表达AMPKα1/2能够明显提高HOXB9丝苏氨酸磷酸化水平，但是对酪氨酸磷酸化没有影响。

接下来本实施例通过共转Flag-HOXB9和Flag-AMPK，并经LC-MS/MS分析，发现HOXB9唯一可磷酸化位点为T133，此位点包含在AMPK下游底物保守的motif内，且T133A突变显著下调HOXB9被AMPK的磷酸化。

具体的，图2中(A)为进行AMPK底物二级结构域预测及HOXB9潜在位点物种保守性鉴定，发现HOXB9潜在的磷酸化位点为第133位苏氨酸，且该位点在多物种中保守；图2中(B)为电离质谱(m/z 79.96633)分析结果，发现HOXB9磷酸化位点在第133位苏氨酸；图2中(C-D)示出了突变133位苏氨酸为丙氨酸显著降低HOXB9的磷酸化程度；图2中(E)p-T133-HOXB9抗体特异性用Dot blot方法，以HOXB9磷酸化肽(-PGELLKQGT(p)PEYS-)，四种浓度和HOXB9非磷酸化肽为对照；图2中(F-H)用p-T133-HOXB9抗体特异性检测AMPK对HOXB9 T133位点在体内、体外的磷酸化情况。

本实施例提供了一种转录因子HOXB9第133位磷酸化位点的特异性抗体的制备方法，包括以下步骤：

1)人工合成如SEQ ID NO.1：PGELLKQGTPEYS序列多肽，并利用AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)将T位点进行磷酸化处理；所述序列由北京嘉暄智瑞生物科技公司合成。

2)利用步骤1)合成的多肽免疫兔获得多克隆抗血清，具体过程为：分别于初次免疫28天后、42天后、56天后进行三次加强免疫，用250μg 133p-HOXB9多肽与等体积的弗氏不完全佐剂混匀，背部皮下多点注射；第三次加强免疫前取耳血，分离血清作为免疫后血清，采用ELISA测定血清中的抗体效价，当抗体滴度达到10⁶数量级时，颈动脉放血，收集血清，即获得所述的多克隆抗血清。

3)酶联免疫吸附试验法(ELISA)测定血清中抗体滴度，具体方法为：吸取适量0.1mol/L，pH 9.5的碳酸缓冲液，稀释步骤1)所述多肽至5mg/L，每孔50μl加入96孔板，4℃包被过夜；第二天移去包被液，稀释缓冲液(0.01mol/L PBS，0.05％Tween-20，pH 7.0)洗3次，每次5min；3％牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)，37℃封闭2h，依次与梯度稀释的兔抗血清(稀释液为1％牛血清白蛋白)、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗，37℃分别反应1h；稀释缓冲液洗3次，每次5min；底物液避光显色15min后，每孔加入50μl，2mol/L硫酸终止反应，酶联免疫吸附试验检测仪读取490nm吸光度值进行分析。

4)对上述获得的抗体进行纯化处理，具体方法为：取Protein A珠子加入兔抗血清2ml中充分混合，室温孵育2h，PBS洗三次；加入450μl的甘氨酸(0.1mol/L，pH 2.8)，静置2min，洗脱至预先加有50μl Tris缓冲液(1mol/L，pH 8.0)的管中，立即颠倒混匀，重复洗脱5管，即得到所述特异性抗体——兔抗p-T133-HOXB9多克隆抗体。

通过Dot blotting方法检测本实施例制备得到的兔抗p-T133-HOXB9多克隆抗体的有效性和特异性。

图3示出了p-T133-HOXB9特异性抗体在多种细胞系(肺腺癌细胞系A549、H1299；Hela细胞；以及胚胎成纤维细胞MEFs)的定位以及与AMPK的共定位情况，说明磷酸化HOXB9与其上游激酶AMPK在细胞核内存在极好的共定位现象。并且这种现象在多种细胞系存在普遍现象，指示p-T133-HOXB9与AMPK能够共同指征肿瘤的预后情况。

实施例二：

在本实施例中收集了包含81例肺腺癌病理组织切片。收集齐全的病例资料：包括档案号、姓名、性别、年龄、病理诊断(类型及分化程度)、TNM分级和生存期等。

免疫组织化学法检测133p-HOXB9的表达水平，以中位数分界Kaplan-Meier分析高表达与地表达组之间的生存差异，免疫组织化学方法检测实施例一所得特异性抗体p-T133-HOXB9的组织检测有效性与特异性，具体步骤如下：

1)石蜡切片免疫组织化学染色(Envision二步法)

①石蜡切片脱蜡水化：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10min；100％酒精Ⅰ、Ⅱ各5min；95％酒精Ⅰ、Ⅱ各5min；90％酒精5min；80％酒精5min，70％酒精5min；

②3％H₂O₂封闭内源性过氧化物酶，室温下，10min；

③自来水冲洗2min，蒸馏水冲洗2次；

④抗原修复(抗原修复液分为pH 6.0)：水浴锅煮沸10min，之后自然冷却到室温；

⑤PBS缓冲液冲洗3次，每次3min；

⑥加一抗(即实施例一制备得到的所述兔抗p-T133-HOXB9多克隆抗体)4℃冰箱中过夜；以PBS代替一抗做阴性对照；

⑦PBS缓冲液冲洗3次，每次3min；

⑧滴加相应二抗，室温孵育30min；

⑨PBS缓冲液冲洗3次，每次3min；

⑩DAB显色，苏木精复染细胞核，逐级酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片；镜检。

结果如图4、图5所示：图4示出了肺腺癌患者p-T133-HOXB9的表达水平情况，其中低水平p-T133-HOXB9预示不良肺腺癌的预后，且由图5可知，p-T133-HOXB9与p-AMPK表达存在正相关。

实施例三：

如图6所示，本实施例对周龄为6个月的雄性且遗传背景为C57野生型、Prkaa1&Prkaa2双杂合型(双纯合胚胎致死)以及Prkaa2敲除型小鼠进行饥饿16小时或二甲双胍6天的喂药处理，随后进行了免疫组织化学法检测。

如图7所示，经免疫组织化学法检测各组小鼠肺组织及小鼠全组织胚胎p-T133-HOXB9的表达水平，检测到野生型小鼠在进行饥饿或者二甲双胍喂药处理后，磷酸化HOXB9的蛋白水平明显上升，且不论是否进行加药处理，基因敲除小鼠的磷酸化HOXB9水平明显低于野生型。

同时对Prkaa1&Prkaa2基因敲除(DKO)的10.5天胚胎(DKO胚胎10.5天致死)进行全组织胚胎的免疫组织化学法检测，如图8统计结果显示，敲除组(DKO)的p-T133-HOXB9蛋白水平明显低于野生型。

上述检测结果说明在动物体内，当AMPK激活时，p-T133-HOXB9升高；当AMPK敲除时，p-T133-HOXB9降低；再次证实了在动物体内AMPK与磷酸化HOXB9的关联性；同时也预示在生理条件下(饥饿或者使用二甲双胍；也相当一种抑癌的环境)时，磷酸化HOXB9的指征作用以及对肿瘤的预测效应。

最后应说明的是，以上仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳布置方案对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1. 一种多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1：PGELLKQGTPEYS所示，且其中T位点进行磷酸化处理。

2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述T位点磷酸化处理使用的磷酸激酶为AMP依赖的蛋白激酶（AMPK）。

3.如权利要求1或2所述多肽的应用，其特征在于，所述多肽用于制备转录因子HOXB9磷酸化位点的特异性抗体。

4.一种转录因子HOXB9磷酸化位点的特异性抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）人工合成如权利要求1或2所述的多肽；

2）利用步骤1）合成的多肽免疫兔获得多克隆抗血清，酶联免疫吸附试验法（ELISA）测定血清中抗体滴度，并对抗体进行纯化处理，即得到所述特异性抗体。

5.根据权利要求4所述特异性抗体的制备方法，其特征在于，步骤2）中免疫兔的具体方法为：

于初次免疫后，分别进行2~3次加强免疫，每次免疫均用如权利要求1或2所述的多肽与等体积的佐剂混匀，背部皮下多点注射；最后一次加强免疫前取耳血，分离血清作为免疫后血清，采用ELISA测定血清中的抗体效价，当抗体滴度达到10⁶数量级时，颈动脉放血，收集血清，即获得所述的多克隆抗血清。

6.根据权利要求4所述特异性抗体的制备方法，其特征在于，步骤2）中ELISA测定血清中抗体滴度的具体方法为：

吸取适量碳酸缓冲液，稀释如权利要求1或2所述多肽，加入酶标板中，4℃包被过夜；第二天移去包被液，稀释缓冲液清洗；加入牛血清白蛋白，37℃封闭，依次与梯度稀释的兔抗血清、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔二抗，37℃分别反应，而后稀释缓冲液再次清洗；底物液避光显色后，每孔加入硫酸终止反应，酶联免疫吸附试验检测仪读取吸光度值进行分析。

7.根据权利要求4所述特异性抗体的制备方法，其特征在于，步骤2）中所述抗体进行纯化处理的具体方法为：

取Protein A珠子加入兔抗血清中充分混合，室温孵育，PBS清洗；加入甘氨酸、静置，洗脱至预先加有Tris缓冲液的管中，立即颠倒混匀，重复洗脱后，即得到所述特异性抗体。

8.一种转录因子HOXB9磷酸化位点的特异性抗体，其特征在于，所述特异性抗体由如权利要求4~7任一项所述制备方法制得。

9.一种如权利要求8所述转录因子HOXB9磷酸化位点的特异性抗体的应用，其特征在于，所述特异性抗体用于制备判断肿瘤预后情况及由糖代谢通路变化引发的异常代谢情况的试剂盒。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括肺癌肿瘤。

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