CN109055307B - 一种bmp-2激活剂及在干细胞诱导分化方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种BMP‑2激活剂及在干细胞诱导分化方面的应用。碱性磷酸酶(ALP)为早期成骨标志，主要分布于细胞膜，促进细胞钙化，ALP的定量检测可以反映成骨细胞的分化水平，其活性越高，说明前成骨细胞向成熟的成骨细胞分化的越明显。ALP活性的高表达是成骨细胞分化成熟的早期标志，ALP活性增强时，骨形成增强，并促进骨基质矿化形成，故ALP的活性是反映成骨细胞分化程度和功能状态的良好指标。待测化合物1～3通过激活hBMSCs中BMP‑2蛋白表达促进hBMSCs成骨分化，待测化合物4、5通过激活hBMSCs中VEGF‑165蛋白表达促进hBMSCs成骨分化。

Description

一种BMP-2激活剂及在干细胞诱导分化方面的应用
技术领域
本发明涉及干细胞领域，尤其涉及干细胞成骨分化。
背景技术
巨大骨缺损一直是临床上常见的难题，骨移植是其主要治疗方法，但存在感染、免疫排斥等诸多缺点。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具有多向分化潜能，可在不同诱导条件下向成骨细胞、成软骨细胞、神经细胞等细胞分化，由于其提取方便、增殖活跃、低免疫原性以及能向成骨细胞分化，无疑成为理想的组织工程种子细胞。
骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)是一种多功能蛋白，可以诱导新骨形成和骨折愈合，在胚胎发育过程中调节干细胞增殖分化方面有着重要的作用，且在体外能够诱导干细胞成骨和成软骨分化。
VEGF是目前认为成血管性能最强的因子，它在成骨过程中也是一个不可缺少的因子。VEGF常见有VEGF-121、145、206、189、165这5种异构体，其中VEGF-165以其含量最多、生物作用性最强而被广泛研究。VEGF-165可以增加血管的通透性，更利于骨形成区域各类养分、因子及修复细胞的渗透并发挥作用；VEGF-165可直接作用于血管内皮细胞，促进其分裂同时抑制其凋亡；它又能促进新的血管形成，使无血管区域的组织工程骨产生新的血管；它也能促进BMSCs向成骨细胞分化。
以BMP-2或VEGF-165为靶标筛选BMSCs成骨分化促进剂是公认可行的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种BMP-2激活剂及在干细胞诱导分化方面的应用。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
山金车内酯C用作骨形态发生蛋白2激活剂的用途。
山金车内酯C用于制备促进间充质干细胞成骨分化的药物的用途。
进一步地，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞。
碱性磷酸酶(ALP)为早期成骨标志，主要分布于细胞膜，促进细胞钙化，ALP的定量检测可以反映成骨细胞的分化水平，其活性越高，说明前成骨细胞向成熟的成骨细胞分化的越明显。ALP活性的高表达是成骨细胞分化成熟的早期标志，ALP活性增强时，骨形成增强，并促进骨基质矿化形成，故ALP的活性是反映成骨细胞分化程度和功能状态的良好指标。待测化合物1～3通过激活hBMSCs中BMP-2蛋白表达促进hBMSCs成骨分化，待测化合物4、5通过激活hBMSCs中VEGF-165蛋白表达促进hBMSCs成骨分化。
附图说明
图1是待测化合物的化学结构式。
图2是待测化合物1～3对hBMSCs中BMP-2蛋白表达水平的影响。
图3是待测化合物4～6对hBMSCs中VEGF-165蛋白表达水平的影响。
图4是各化合物对hBMSCs中ALP活性的影响。
具体实施方式
一、实验材料
待测化合物分别为飞蓬属倍半萜内酯(待测1，CAS号：54999-07-4)、山金车内酯C(待测2，CAS号：34532-67-7)、旋覆花内酯C(待测3，CAS号：79383-83-8)、异淡红乳菇素(待测4，CAS号：62024-77-5)、3β,8β,5,13-二环氧-5,7(13)-乳菇二烯(待测5，CAS号：72601-36-6)、5,13-环氧-3β-羟基乳菇-2(9),5,7(13)-三烯-4,8-二酮(待测6，CAS号：135010-63-8)，结构式如图1所示。
胎牛血清购自美国Thermo公司；DMEM培养基购自美国Gibco公司；ALP、CCK-8检测试剂盒、总蛋白定量测试盒(BCA法)和RIPA细胞裂解液均购自南京建成生物工程研究所；BMP-2单克隆抗体购自北京中杉金桥，VEGF-165单克隆抗体购自Abcam公司。
二、实验方法
1、hBMSCs的分离培养
于健康志愿者签署知情同意书后，在髂后上棘穿刺采集志愿者的骨髓液5mL，将骨髓液肝素抗凝后，加等量PBS混匀，使之成为单细胞悬液，2500r/min离心15min。吸出试管中间骨髓单个核细胞层，加入PBS 3mL，1000r/min离心5min，共洗2次。弃PBS，加入含有10％胎牛血清的DMEM培养基混匀，移至塑料细胞培养瓶中，置于37℃、5％CO2培养箱内培养48h后弃除悬浮细胞半量换液，之后每2d换液1次，利用hBMSCs可黏附于塑料培养瓶壁生长这一特性进行分离纯化。细胞传代2次后基本除去非贴壁的球形骨髓造血干细胞，得到纯化的hBMSCs，提取生长良好的第3代细胞进行实验。
2、细胞分组和给药
将处于对数生长期的hBMSCs接种于含有10％胎牛血清DMEM培养基的培养皿中，37℃、5％CO2的细胞培养箱中常规培养。细胞分为对照组和给药组。
对照组：连续用含10％胎牛血清的DMEM培养液培养；
给药组：含10％胎牛血清的DMEM培养液加终浓度为10μM的药物培养。
3、Western blotting法检测hBMSCs中BMP-2和VEGF-165蛋白表达水平
hBMSCs以5×104/mL的密度接种于6孔板中，每孔2mL，对照组及给药组诱导培养9d(每3d更换一次培养基)后回收，PBS漂洗2次，加入细胞裂解液RIPA，冰上静置15min后收集裂解液，将裂解产物反复冻融裂解3次，12000r/min离心30min，按照BCA蛋白定量试剂盒说明书进行蛋白定量，取20μg蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳分离后，转移至PVDF膜5％脱脂牛奶封闭2h后，孵育一抗(1:500)4℃过夜。0.1％TBST洗涤3次，每次5min；加入用0.1％TBST稀释的二抗(1:1000稀释)，室温孵育1h。0.1％TBST洗5次，每次5min。以ECL化学发光法检测蛋白印迹，并进行曝光、显影和定影。数码相机拍照，Image J2X软件进行分析，以BMP-2或VEGF-165蛋白与β-actin蛋白的灰度值比值表示蛋白表达水平。蛋白表达水平＝BMP-2或VEGF-165蛋白灰度值/β-actin蛋白灰度值。
4、ALP活性检测
hBMSCs以5×104/mL的密度接种于96孔板，24h待其铺满孔底后，对照组及给药组使用对应的培养基诱导培养9d(每3d更换一次培养基)后弃培养液，采用ALP试剂盒测定细胞的ALP活性，酶联免疫检测仪测定420nm处吸光度(A)值，以A值表示ALP活性。
5、统计学方法
使用SPSS 20.0软件对各组数据比较进行成组设计的F检验，所有参数均用均值±标准差表示，P<0.05为差异有显着性意义。
三、实验结果
1、待测化合物1～3对hBMSCs中BMP-2蛋白表达水平的影响
Western blotting检测结果如图2所示。从图2可见，待测化合物1、2、3可以显著提高hBMSCs中BMP-2蛋白表达水平。
2、待测化合物4～6对hBMSCs中VEGF-165蛋白表达水平的影响
Western blotting检测结果如图3所示。从图3可见，待测化合物4、5可以显著提高hBMSCs中VEGF-165蛋白表达水平，而待测化合物6作用不明显。
3、各化合物对hBMSCs中ALP活性的影响
测定结果如表1和图4所示。结果可见，待测化合物1～5可以显著提高hBMSCs中ALP活性，而待测化合物6作用不明显。
表1各组ALP活性检测结果(A值)
A值(均值±标准差)
对照组 8.9±0.2
待测化合物1给药组 16.2±0.1
待测化合物2给药组 15.7±0.2
待测化合物3给药组 16.4±0.2
待测化合物4给药组 17.8±0.1
待测化合物5给药组 17.5±0.2
待测化合物6给药组 9.1±0.2
碱性磷酸酶(ALP)为早期成骨标志，主要分布于细胞膜，促进细胞钙化，ALP的定量检测可以反映成骨细胞的分化水平，其活性越高，说明前成骨细胞向成熟的成骨细胞分化的越明显。ALP活性的高表达是成骨细胞分化成熟的早期标志，ALP活性增强时，骨形成增强，并促进骨基质矿化形成，故ALP的活性是反映成骨细胞分化程度和功能状态的良好指标。
由此可见，待测化合物1～3通过激活hBMSCs中BMP-2蛋白表达促进hBMSCs成骨分化，待测化合物4、5通过激活hBMSCs中VEGF-165蛋白表达促进hBMSCs成骨分化。

Claims (1)

1.山金车内酯C用于制备促进间充质干细胞成骨分化的药物的用途，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞。
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