CN104840457B

CN104840457B - 一种鹅不食草提取物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN104840457B
Application number: CN201510120700.9A
Authority: CN
Inventors: 李药兰; 王国才; 和君; 李满妹; 张晓丽; 张玉波; 李国强
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2015-03-19
Filing date: 2015-03-19
Publication date: 2017-12-26
Anticipated expiration: 2035-03-19
Also published as: CN104840457A

Abstract

本发明涉及中药技术领域，具体公开了一种鹅不食草提取物及其制备方法和应用。所述的鹅不食草提取物，含有山金车内酯C、6‑O‑惕各酸‑11α,13‑二氢堆心菊灵、短叶老鹳草素、千里光酰二氢堆心菊灵、小堆心菊素B和山金车内酯B六种成分。本发明的原料鹅不食草资源广泛、制备工艺简单、易于大规模生产；制备得到的鹅不食草提取物的抗病毒作用强于阳性对照药利巴韦林，选择指数大于利巴韦林。

Description

一种鹅不食草提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及中药技术领域，具体涉及一种鹅不食草提取物及其制备方法和应用。

背景技术

流感病毒是人类健康的一大威胁。由流感病毒所引起的呼吸道疾病被称为流行性感冒（流感），具有流行面广、传染性强、发病率高等特点。根据统计，全球每年的流感病例为6-12亿，其中重症流感为300-500万例，死亡25-50万人，重症流感的病死率可达10%。

由于流感病毒抗原变异，常规疫苗目前尚不能有效预防流感的暴发与流行，因此抗流感病毒药物的研究在流感治疗中具有重要的意义。目前市场上的抗流感药物根据作用机制大体可以分为两类: 一类是M2离子通道阻断剂，如金刚烷胺和金刚乙胺，只对A 型流感病毒有预防和治疗作用；另一类是神经氨酸酶(neuraminidase, NA)抑制剂，以扎那米韦和奥司他韦(达菲)为代表，可以抑制子代病毒从感染细胞的表面释放从而防止病毒进一步感染其它细胞。但目前多数流感病毒都已对金刚烷胺类和奥司他韦类药物产生了耐药性。2008-2009年，在美国几乎100％的季节性H1N1病毒对奥司他韦产生了耐药性，同时几乎所有的H3N2病毒对金刚烷胺具有耐药性。因此，开发新作用机制的抗流感药物已成为目前流感防治的迫切需求，尤其是能在病毒感染早期发挥作用而抑制流感病毒进入宿主细胞的药物，具有广阔的市场前景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，为了克服上述现有技术的不足，提供一种鹅不食草提取物。

本发明所要解决的上述技术问题通过以下技术方案予以解决：

一种鹅不食草提取物，含有山金车内酯C（Arnicolide C）、6-O-惕各酸-11α,13-二氢堆心菊灵（6-O-tigloxl-11α,13-dihydrohelenalin）、短叶老鹳草素、千里光酰二氢堆心菊灵（6-O-senesioylplenolin）、小堆心菊素 B（Microhelenin B）和山金车内酯 B（Arnicolide B）六种成分。

本发明通过了一系列的色谱手段及现代药理技术，开发出了上述成分明确且具有优异抗流感病毒作用的鹅不食草提取物，此外，由于该提取物主要成分明确，有利于用药安全。

优选地，所述六种成分总重量占鹅不食草提取物总重量的50%以上。

更优选地，所述六种成分总重量占鹅不食草提取物总重量的50%~80%。

最优选地，所述鹅不食草提取物，由包含如下重量百分比的成分组成：山金车内酯C（Arnicolide C） 10~20%；6-O-惕各酸-11α,13-二氢堆心菊灵（6-O-tigloxl-11α,13-dihydrohelenalin） 5~10%；短叶老鹳草素 20~40%；千里光酰二氢堆心菊灵（6-O-senesioylplenolin） 10~20%；小堆心菊素 B（Microhelenin B） 10~20%；山金车内酯 B（Arnicolide B） 5~10%。

所述化合物的化学结构如下：

所述的鹅不食草提取物的制备方法，包含如下步骤：

S1.将鹅不食草的干燥全草粉碎，采用超临界二氧化碳萃取法萃取得到鹅不食草超临界二氧化碳萃取物；

S2.将鹅不食草超临界二氧化碳萃取物上硅胶柱，然后用混合溶剂洗脱，收集混合溶剂洗脱部位；

S3.将混合溶剂洗脱部位上凝胶柱，用有机溶剂洗脱，用GC-MS分析跟踪检测，收集保留时间在80min~120min之间的流份，减压浓缩、干燥得鹅不食草提取物。

优选地，S1.中所述的超临界二氧化碳萃取法的具体条件为：萃取压力为20～30兆帕，萃取温度为30～40℃，流速为15～25 升/ 小时，萃取时间为1～3小时。

优选地，S2.中所述的混合溶剂为石油醚和乙酸乙酯组成的混合溶剂，其体积比为9:1~8:2。

优选地，S3.中所述的凝胶柱的型号为 Sephadex LH-20，所述的有机溶剂为甲醇。

本发明鹅不食草提取物在制备具有抗流感病毒作用的药物中的应用。

优选地，所述的流感病毒为H1N1、H5N1和H9N2型禽流感病毒。

有益效果：（1）本发明首次提供了有效成分明确的具有抗流感病毒作用的鹅不食草提取物；（2）本发明制备得到的鹅不食草提取物的抗病毒作用强于利巴韦林，选择指数也大于利巴韦林；（3）本发明的原料鹅不食草资源广泛、制备工艺简单、易于大规模生产。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。

以下实施方式采用的气相色谱-质谱（GC-MS）分析的条件如下：实验仪器为Agilent 6890N系列气质联用仪，柱子为HP-5毛细管柱 (30 m × 0.25 mm × 25 µm)，载气为氦气，流量为1.5 mL/min，检测器温度为300 °C。分析条件如下：色谱柱初始温度60 °C，以3 °C/min的速度程序升温到150 °C维持5 min，再以1.5 °C/min的速度程序升温到240°C维持10 min，最后以2 °C/min的速度程序升温到300 °C维持10 min。电离方式：EI，能量：70 eV。

以下实施例采用的高效液相色谱法（HPLC-DAD）分析条件如下：色谱柱为AgilentZorbax SB-C₁₈柱（4.6 x 250 mm, 5μm），流动相为甲醇-水溶液梯度洗脱，流速1.0ml/min，柱温30℃，采用Agilent 1200 Series HPLC泵，Agilent 1200 Series自动进样器，紫外光检测器，检测波长210nm。

实施例1

将200g鹅不食草的干燥全草粉碎，过80目筛，置于超临界CO₂萃取仪中，萃取压力为30兆帕、萃取温度为40˚C、流速为20升/小时、提取时间为2小时，得到鹅不食草超临界二氧化碳萃取物10.8g；

将鹅不食草超临界二氧化碳萃取物用乙酸乙酯溶解后，用12g硅胶（100～200目）拌样，减压蒸干，得到样品；另取90g硅胶（200～300目）干法装柱（内径×长度=3.5×50cm），将样品装入柱上，再覆上一层硅胶，先用石油醚洗脱，再用石油醚和乙酸乙酯（体积比为8:2）组成的混合溶剂洗脱，搜集混合溶剂洗脱部位浓缩干燥得混合溶剂洗脱部位2.1g；

用2ml甲醇溶解混合溶剂洗脱部位，上柱体积为50ml的Sephadex LH-20凝胶柱，用甲醇洗脱，用GC-MS分析跟踪检测，收集保留时间在80min～110min之间的流份，减压浓缩，干燥得到鹅不食草提取物0.9g。

经HPLC检测，所述鹅不食草提取物中各成分含量为：Arinicolide C 10%；6-O-tigloxl-11α,13-dihydrohelenalin 6%；短叶老鹳草素 22%；6-O-senesioylplenolin12%；Microhelenin B 14%；Arnicolide B 8%。

实施例2

将200g鹅不食草的干燥全草粉碎，过80目筛，置于超临界CO₂萃取仪中，萃取压力为20兆帕、萃取温度为30˚C、流速为15升/小时、提取时间为2小时，得到鹅不食草超临界二氧化碳萃取物9.9g；

将鹅不食草超临界二氧化碳萃取物用乙酸乙酯溶解后，用12g硅胶（100～200目）拌样，减压蒸干，得到样品；另取90g硅胶（200～300目）干法装柱（内径×长度=3.5×50cm），将样品装入柱上，再覆上一层硅胶，先用石油醚洗脱，再用石油醚和乙酸乙酯（体积比为7.5:1.5）组成的混合溶剂洗脱，搜集混合溶剂洗脱部位浓缩干燥得混合溶剂洗脱部位1.8g；

用2ml甲醇溶解混合溶剂洗脱部位，上柱体积为50ml的Sephadex LH-20凝胶柱，用甲醇洗脱，用GC-MS分析跟踪检测，收集保留时间在80min～110min之间的流份，减压浓缩，干燥得到鹅不食草提取物0.78g。

经HPLC检测，所述鹅不食草提取物中各成分含量为：Arinicolide C 14%；6-O-tigloxl-11α,13-dihydrohelenalin 8%；短叶老鹳草素 30%；6-O-senesioylplenolin10%；Microhelenin B 12%；Arnicolide B 6%。

实施例3

将200g鹅不食草的干燥全草粉碎，过80目筛，置于超临界CO₂萃取仪中，萃取压力为30兆帕、萃取温度为30˚C、流速为25升/小时、提取时间为2小时，得到鹅不食草超临界二氧化碳萃取物11.4g；

将鹅不食草超临界二氧化碳萃取物用乙酸乙酯溶解后，用12g硅胶（100～200目）拌样，减压蒸干，得到样品；另取90g硅胶（200～300目）干法装柱（内径×长度=3.5×50cm），将样品装入柱上，再覆上一层硅胶，先用石油醚洗脱，再用石油醚和乙酸乙酯（体积比为9:1）组成的混合溶剂洗脱，搜集混合溶剂洗脱部位浓缩干燥得混合溶剂洗脱部位1.7g；

用2ml甲醇溶解混合溶剂洗脱部位，上柱体积为50ml的Sephadex LH-20凝胶柱，用甲醇洗脱，用GC-MS分析跟踪检测，收集保留时间在80min～110min之间的流份，减压浓缩，干燥得到鹅不食草提取物0.81g。

经HPLC检测，所述鹅不食草提取物中各成分含量为：Arinicolide C 20%；6-O-tigloxl-11α,13-dihydrohelenalin 8%；短叶老鹳草素 26%；6-O-senesioylplenolin10%；Microhelenin B 10%；Arnicolide B 5%。

实施例4 鹅不食草提取物抗甲型流感病毒活性测试

取长满单层MDCK细胞层的96孔细胞培养板，弃去上清液，用PBS洗两遍，加入100TCID₅₀病毒液100 µL/孔，吸附1 h，然后每孔分别加入用MEM倍比稀释的药液100 µL，另外设细胞对照组、病毒对照组、空白对照组，利巴韦林作为阳性对照药。置于37℃、饱和湿度、5% CO₂培养箱中孵育。48 h后，将96孔板中的旧液吸弃，CCK8原溶液稀释十倍分别按每孔100 µL加入被测试孔中。培养箱孵育1 h后，用酶标仪在450 nm测吸光度。IC₅₀计算方式如下：细胞存活率=（加药孔OD值－病毒对照组OD值）/（细胞对照组OD值－病毒对照组OD值）×100%；以药物浓度为X轴，细胞存活率为Y轴，在Origin作图，求出50%细胞存活率对应的浓度则为IC₅₀。

用四唑盐（MTT）比色法测定化合物的细胞毒性：

MDCK细胞以1.5 1.3×104/孔接种于96孔板中，置于37℃、饱和湿度、5% CO₂培养箱中孵育24 h待细胞长成单层后，将旧液弃去，加入用MEM培养基稀释的不同浓度的样品100 μL /孔，每个浓度设三个重复孔，其中加入DMEM不含样品的孔设为正常对照孔，没有细胞的孔设为空白孔。置于37℃、饱和湿度、5% CO₂培养箱中孵育48 h后，每孔加入10 μL 5mg/mL MTT，继续放入培养箱中培养4 h，将96孔板的液体吸弃，加入DMSO 100 μL/孔，在摇床上摇晃15 min后用酶标仪在570 nm为测定波长，630 nm为参比波长下测OD值。细胞存活率（%）=（实验孔OD值/对照空OD值）×100%。

选择性指数（SI）＝CC₅₀/IC₅₀。

将实施例1~3制备得到的鹅不食草提取物进行抗甲型流感病毒活性测试，结果见表1，实施例1~3制备得到的鹅不食草提取物对H1N1、H5N1和H9N2这三种流感病毒的半数抑制浓度（IC₅₀）比阳性对照药物利巴韦林的要小很多，说明本发明制备得到的鹅不食草提取物的抗病毒作用强于利巴韦林。实施例1~3制备得到的鹅不食草提取物对H1N1、H5N1和H9N2这三种流感病毒的选择性指数大于阳性对照药物利巴韦林。此外，由表1还可以看出，实施例1~3制备得到的鹅不食草提取物的SI值为阳性对照药物利巴韦林的数倍作用，说明本发明制备得到的鹅不食草提取物更有利于成药。

Claims

1.一种具有抗流感病毒作用的鹅不食草提取物，其特征在于，由包含如下重量百分比的成分组成：山金车内酯C 10~20% ；6-O- 惕各酸-11α,13- 二氢堆心菊灵 5~10% ；短叶老鹳草素 20~40% ；千里光酰二氢堆心菊灵 10~20% ；小堆心菊素 B 10~20% ；山金车内酯 B5~10%；

所述的流感病毒为H1N1、H5N1 和H9N2 型禽流感病毒；

所述的鹅不食草提取物通过包含如下步骤的方法制备得到：

S1. 将鹅不食草的干燥全草粉碎，采用超临界二氧化碳萃取法萃取得到鹅不食草超临界二氧化碳萃取物；

S2. 将鹅不食草超临界二氧化碳萃取物上硅胶柱，然后用混合溶剂洗脱，收集混合溶剂洗脱部位；

S3. 将混合溶剂洗脱部位上凝胶柱，用有机溶剂洗脱，用GC-MS 分析跟踪检测，收集保留时间在80min~120min 之间的流份，减压浓缩、干燥得鹅不食草提取物；

S1. 中所述的超临界二氧化碳萃取法的具体条件为：萃取压力为20 ～ 30 兆帕，萃取温度为30 ～ 40℃，流速为15 ～ 25 升/ 小时，萃取时间为1 ～ 3 小时；

S2. 中所述的混合溶剂为石油醚和乙酸乙酯组成的混合溶剂，其体积比为9:1~8:2；

S3. 中所述的凝胶柱的型号为Sephadex LH-20，所述的有机溶剂为甲醇。