CN106432263A - 瑞香狼毒总二萜的制备方法及其在制药中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于中药制药领域，涉及一种从草原毒草瑞香狼毒中富集瑞香烷型总二萜类成分的方法及其在制备抗艾滋病毒药物中的用途。本发明从瑞香科植物瑞香狼毒(Stellera chamaejasme L.)中富集总二萜类成分，对所得各组分进行了抗HIV活性测试及主要活性成分含量测定，结果显示，随着瑞香烷型二萜类成分在各个组分中含量的增加，抗HIV活性呈明显上升趋势。当富集组分的总二萜含量大于27％时即显示极强的抗HIV活性，EC50值可以达到0.005μg/mL以下，同时选择指数SI大于2000，高效低毒。本发明建立了从瑞香狼毒中快速富集瑞香烷型总二萜的方法，且富集的总二萜可用于制备抗艾滋病毒药物。

Description

瑞香狼毒总二萜的制备方法及其在制药中的用途
技术领域
本发明属于中药制药领域，涉及瑞香狼毒总二萜的制备方法及其在制药中的用途，具体涉及一种从瑞香狼毒中富集瑞香烷型总二萜类成分的制备方法及其在制备抗艾滋病毒药物中的用途。
背景技术
瑞香狼毒(Stellera chamaejasme L.)俗称断肠草、馒头花、山萝卜等，为瑞香科(Thymelaeaceae)狼毒属(Stelleralinn)多年生草本植物，其药用部位为根，广泛分布在我国东北、西北、西南，及尼泊尔等地，其性平，味苦辛，有毒，有逐水祛痰、破积杀虫之功效。民间长期用于治疗芥藓、顽固性皮肤病、慢性支气管炎和结核病等。现代药理研究表明：瑞香狼毒具有抗肿瘤、抗艾滋病毒、抗菌、杀虫等功效，尤其是抗艾滋病毒作用，已经引起国内外学者的广泛关注。据报道，瑞香狼毒中的瑞香烷型二萜类成分具有极强的抗艾滋病毒活性，且无明显的细胞毒性，但此类成分在瑞香狼毒中的含量极低，通常不超过0.05％，而化学合成途径又因其复杂的多环结构尚无法实现，同时，瑞香狼毒作为草原常见的毒草之一，由于生命力强，资源非常丰富，也被视为草原荒漠化的“警示灯”，对我国草地危害严重，且瑞香狼毒同时含有一些毒性较强的化学成分，因此，若建立能从瑞香狼毒中快速富集瑞香烷型二萜的方法将对研制高效低毒的抗艾滋病毒新药及这一草原毒草的“变害为宝”将有非常重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供瑞香狼毒总二萜的制备方法及其在制药中的用途，具体涉及从瑞香狼毒中富集瑞香烷型总二萜类成分的制备方法及其在制备抗艾滋病毒药物中的用途。
本发明为实现上述目的采用的技术方案是：
一种从瑞香狼毒中制备抗艾滋病毒的瑞香烷型总二萜的方法，包括以下步骤：
(1)将瑞香狼毒粗粉与中小极性提取溶剂(乙醇、或甲醇、或乙腈、或丙酮)按适当的比例混合置于提取器中(加热回流提取器、或闪式提取器、或超声提取器、或渗漉提取器)，提取数次，合并滤液，将滤液浓缩，蒸干，得浸膏；
(2)将步骤(1)中所得的浸膏，以水混悬，然后用有机溶剂萃取(环己烷、或正己烷、或石油醚、或二氯甲烷、或乙酸乙酯)，萃取2-5次，合并萃取液，浓缩；
(3)将步骤(2)中所得的萃取物，进行硅胶柱色谱分离，用5-8倍柱体积的低极性的溶剂(环己烷：丙酮＝10:1，3:1，1:1；或石油醚：丙酮＝10:1，3:1，1:1)洗脱，分别合并环己烷：丙酮或石油醚：丙酮＝10:1，3:1，1:1的洗脱部分，浓缩，蒸干，得到不同洗脱部位；本发明的一个实施例中，优选收集合并环己烷：丙酮或石油醚：丙酮＝3:1的洗脱部位；
(4)将步骤(3)中环己烷：丙酮或石油醚：丙酮＝3:1的洗脱部分，进行Sephadex LH-20凝胶柱色谱，用6-10倍柱体积的有机溶剂(环己烷：二氯甲烷：甲醇＝4:5:1，或二氯甲烷：甲醇＝1:1)洗脱，洗脱1-2个柱体积时得到第一组分，洗脱2-4个柱体积时得到第二组分，洗脱4-6个柱体积时得到第三组分，洗脱6-10个柱体积时得到第四组分；本发明的一个实施例中，优选收集合并洗脱4-10个柱体积时的组分(第三组分)，或分别收集洗脱4-6个柱体积(第三组分)及洗脱6-10个柱体积时(第四组分)的两个组分。
(5)将上述步骤(1)-(4)所得的各个样品进行抗艾滋病毒(HIV)活性测试和stelleralide C、subtoxin A、huratoxin、wikstrolide B等主要活性成分的含量测定，结果显示，本发明的富集方法逐渐提高了总瑞香烷型二萜的含量，同时抗艾滋病毒活性明显增强，其EC50由最初醇提物的0.25μg/mL降低到0.0022μg/mL，活性增强100倍，同时选择指数(SI)也提高100倍以上，尤其步骤(3)和(4)对瑞香烷二萜抗HIV活性成分的富集效果良好，其所得活性部位或组分的总二萜含量在27％以上，活性EC50值均达到低于0.005μg/mL的强度，可以用于制备抗艾滋病毒药物。
本发明的有益效果：
本发明提供的富集方法简便、快捷，所得的瑞香烷型二萜组分主成分明确、含量高，抗艾滋病毒活性强、毒性低，适合于工业化制备。本方法可以用于瑞香狼毒中瑞香烷总二萜类化合物的大规模富集，所得总二萜组分可用于制备抗艾滋病药物。
附图说明
图1为实施例2的富集方法流程图。
图2为stelleralide C(1)、subtoxin A(2)、huratoxin(3)、wikstrolide B(4)的结构。
图3为样品DFC-GYSL-T、DFC-GYSL-H、DFC-GYSL-H2的液相色谱图。
图4为样品DFC-GYSL-H23、DFC-GYSL-H24的液相色谱图。
具体实施方式
实施例1：瑞香烷型二萜小试富集方法
瑞香狼毒根干燥、粉碎，得瑞香狼毒粉末；称取瑞香狼毒粉末(5kg)，加入10L 95％的乙醇加热提取3次，过滤，合并3次所得滤液，将滤液浓缩、蒸干得乙醇浸膏500g(DFC-GYSL-T)，将乙醇浸膏(490g)分散到2L的水中，然后用2L的环己烷萃取，萃取4次，合并4次所得环己烷部位的萃取液，浓缩蒸干，得环己烷部位40g(DFC-GYSL-H)，将环己烷部位(40g)经过减压柱色谱，用环己烷：丙酮(10:1，3:1，1:1)洗脱，得到3个组分，分别为DFC-GYSL-H1(24g)，DFC-GYSL-H2(2g)，DFC-GYSL-H3(8g)。将DFC-GYSL-H2(2g)经过Sephadex LH-20凝胶柱色谱，用环己烷：二氯甲烷：甲醇(4:5:1)洗脱，每3mL收集1次，分别合并1-23，24-55，56-73，74-85，得到4个组分，分别为DFC-GYSL-H21(700mg)，DFC-GYSL-H22(650mg)，DFC-GYSL-H23(126mg)，DFC-GYSL-H24(143mg)。
实施例2：瑞香烷型二萜中试富集方法
瑞香狼毒根干燥、粉碎，得瑞香狼毒粉末；称取瑞香狼毒粉末(10kg)，加入60L 95％的乙醇，用闪式提取器提取6次，每次1.5min，过滤，合并6次所得滤液，将滤液浓缩蒸干得乙醇浸膏1466.8g(DFC-GYSL-E)。将乙醇浸膏(1460g)分散于4.5L水中，然后用4.5L石油醚萃取，萃取5次，合并5次所得的石油醚部位的萃取液，浓缩蒸干，得石油醚部位118.0g(DFC-GYSL-P)，将石油醚部位用118g硅胶拌样，经过减压柱色谱，用石油醚：丙酮(10:1，3:1，1:1)洗脱，每500mL收集1次，分别合并1-35，36-48，49-58瓶，得到3个组分，分别为DFC-GYSL-P1(101.4g)，DFC-GYSL-P2(4.4g)，DFC-GYSL-P3(3.3g)；将DFC-GYSL-P2(4.4g)经过Sephadex LH-20凝胶柱色谱，用二氯甲烷：甲醇(1:1)洗脱，每5mL收集1次，合并第1-28，29-38，39-75，76-140，得到4个组分，分别为DFC-GYSL-P21(0.5173g)，DFC-GYSL-P22(0.8146g)，DFC-GYSL-P23(1.351g)，DFC-GYSL-P24(1.4492g)。
实施例3：富集方法得到的各样品中主要活性成分的含量测定
取上述实施例1和2中得到的关键活性组分DFC-GYSL-H、DFC-GYSL-H2、DFC-GYSL-H23、DFC-GYSL-H24、DFC-GYSL-P、DFC-GYSL-P2、DFC-GYSL-P23、DFC-GYSL-P24分别配成约0.5mg/mL的样品，采用UPLC-MS的方法对各个样品中主要活性成分stelleralide C(C1)、subtoxin A(C2)、huratoxin(C3)、wikstrolide B(C4)进行含量测定；含量测定的方法采用标准曲线法，液相色谱条件为：0～2min，乙腈:水(53:47～56:44)；2～32min乙腈：水(56:44)；32～35min，乙腈：水(56:44～71:29)；35～50min，乙腈：水(71:29～100:0)；流速0.3mL/min；柱温25℃；检测波长233nm；各个样品的含量如下表1所示。
表1富集工艺中各样品的得率及其中二萜类成分的含量(％)
实施例4：富集方法得到的各样品的抗艾滋病毒活性测试
应用HIV-1NL4-3病毒株感染MT4细胞(感染倍数＝0.001)，同时加入不同浓度的药物，感染48小时后加入含适宜浓度药物的新鲜基质以维持细胞的正常生长，4天后采用P24ELISA试剂盒分析病毒的复制情况；实验以齐多夫定(AZT)为阳性对照药物；化合物的EC50指药物抑制HIV-1P24抗原产生降低至50％时的药物浓度，采用线性回归分析法求得EC50(Biosoft software)，结果显示，随着瑞香烷型二萜类成分在各个组分中含量的增加，抗HIV活性呈明显上升趋势。当富集组分的总二萜含量大于27％时即显示极强的抗HIV活性，EC50值可以达到0.005μg/mL以下，同时选择指数SI大于2000，高效低毒(如表2所示)。
表2富集方法中得到的各样品的抗HIV活性结果

Claims (7)

1.一种瑞香狼毒总二萜的制备方法，其特征在于，其包括步骤：
(1)将瑞香狼毒粗粉与中小极性提取溶剂按适当的比例混合置于提取器中提取数次，合并滤液，将滤液浓缩，蒸干，得浸膏；
(2)将步骤(1)中所得的浸膏，以水混悬，然后用有机溶剂萃取，萃取2-5次，合并萃取液，浓缩；
(3)将步骤(2)中所得的萃取物，进行硅胶柱色谱分离，用5-8倍柱体积的低极性的溶剂，环己烷：丙酮＝10:1，3:1，1:1；或石油醚：丙酮＝10:1，3:1，1:1，洗脱，分别合并环己烷：丙酮或石油醚：丙酮＝10:1，3:1，1:1的洗脱部分，浓缩，蒸干，得到不同洗脱部位；
(4)将步骤(3)中环己烷：丙酮或石油醚：丙酮＝3:1的洗脱部分，进行Sephadex LH-20凝胶柱色谱，用6-10倍柱体积的有机溶剂洗脱，洗脱1-2个柱体积时得到第一组分，洗脱2-4个柱体积时得到第二组分，洗脱4-6个柱体积时得到第三组分，洗脱6-10个柱体积时得到第四组分。
2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述提取溶剂为乙醇、或甲醇、或乙腈、或丙酮。
3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述有机溶剂为环己烷、或正己烷、或石油醚、或二氯甲烷、或乙酸乙酯。
4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的洗脱部位为收集合并环己烷：丙酮或石油醚：丙酮＝3:1的洗脱部位。
5.按权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述的6-10倍柱体积的有机溶剂为环己烷：二氯甲烷：甲醇＝4:5:1，或二氯甲烷：甲醇＝1:1。
6.按权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述的6-10倍柱体积的有机溶剂洗脱的组分为收集合并洗脱4-10个柱体积时的组分，或收集洗脱4-6个柱体积的组分或洗脱6-10个柱体积时的组分。
7.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所制得的瑞香狼毒总二萜用于制备抗艾滋病毒药物中的用途。
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