CN110283151A - 一种中药鹅不食草二倍半萜类单体的制备及其应用 - Google Patents

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韦锦斌
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Abstract

本发明公开了一种中药鹅不食草二倍半萜类单体心菊内酯的制备及其应用。通过运用先进的植化提取、分离方法，从中药鹅不食草中分离出二倍半萜类单体心菊内酯，并通过实验证明其可有效减轻肝脏病理损伤、抑制胶原沉积、抗炎、抗脂质过氧化，对肝纤维化具有明显的保护作用。

Description

一种中药鹅不食草二倍半萜类单体的制备及其应用
技术领域
本发明涉及一种药物的制备方法及应用，具体来说，涉及鹅不食草二倍半萜类单体心菊内酯的提取、分离方法；心菊内酯的抗炎、抗脂质过氧化及对肝纤维化的保护作用。
背景技术
鹅不食草(Centipedae Minima(L.)A.Braun et Aschers.)系菊科石胡荽属植物的干燥全草。本发明对鹅不食草进行了大量的药学、药效学研究，发现鹅不食草二倍半萜类单体心菊内酯对四氯化碳(CCl4)诱导的大鼠肝纤维化具有明显的保护作用。进一步地研究发现，心菊内酯能够显著改善肝脏病理学改变；减少肝脏胶原沉积；降低白细胞介素-6(IL-6)、人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、髓过氧化氢酶(MPO)等炎症因子表达；增强超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和谷胱甘肽还原酶(GSH-GR)的活性；其机制可能与上调miR-200a基因表达有关。
目前，尚未发现有把鹅不食草活性部位制成药学制剂并用于临床的报告。
发明内容
本发明是对中药鹅不食草的深度开发，通过中药现代化的思维模式，以药理活性为靶点，运用先进的提取、分离技术获得鹅不食草二倍半萜类单体心菊内酯，并进一步明确其作用机制，为肝纤维化治疗提供了化学结构明确、高效的新型化合物。
本发明采用的技术方案如下：
1、从中药鹅不食草中提取、分离出二倍半萜类单体心菊内酯，
2、鹅不食草二倍半萜类单体心菊内酯对肝纤维化的保护作用的实验；
3、中药鹅不食草二倍半萜类单体心菊内酯在制备治疗肝纤维化药中的应用。
4、中药鹅不食草二倍半萜类单体心菊内酯在制备治疗炎症药中的应用。
本发明通过运用先进的植化提取、分离方法，从中药鹅不食草中分离出二倍半萜类单体心菊内酯，并证明其可有效减轻肝脏病理损伤、能够显著改善抑制胶原沉积、抗炎、抗脂质过氧化，对肝纤维化具有明显的保护作用。
具体实施方式
一、鹅不食草二倍半萜类单体心菊内酯的制备
提取分离方法：取5kg鹅不食草干燥全草，粉碎，95％乙醇加热回流提取3次，每次2h，合并3次乙醇提取液，减压除去乙醇，得到鹅不食草乙醇浸膏880g。取乙醇浸膏加适量蒸馏水重悬，0.45um滤头过滤，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得乙酸乙酯萃取物126.8g。以硅胶(1.5kg，200-300目)柱色谱柱分离，PE：EtOAc(7:1,4:1，3:1，2:1，1:1，1:2)，EtOAc，EtOAc(5％MeOH)，EtOAc(10％MeOH)，EtOAc(20％MeOH)梯度洗脱，薄层色谱收集相同馏分，其中，第八馏分再经硅胶柱(氯仿：甲醇，90:10)和Sephadex LH-20柱(甲醇：水，1:1)进一步分离纯化，最后得到白色晶体25.8mg。
光谱检测数据：1H-NMR(CDCl3,500MHz)δ:7.69(1H,dd,J＝1.5,6.0Hz,H-2),6.36(1H,d,J＝3.5,6.0Hz,H-13a),6.09(1H,dd,J＝3.0,6.0Hz,H-3),5.81(1H,d,J＝2.5Hz,H-13b),4.96(1H,m,H-8),4.47(1H,br-s,H-6),3.56(1H,m,H-7),3.06(2H,m,H-1),2.25(1H,m,H-9a),2.06(1H,m,H-10),1.85(1H,m,H-9b),1.27(3H,d,J＝6.5Hz,H-14),0.96(3H,s,H-15),13C-NMR(CDCl3,150MHz)δ:51.3(C-1),163.6(C-2),129.6(C-3),212.3(C-4),57.8(C-5),74.0(C-6),50.6(C-7),78.1(C-8),40.2(C-9),26.1(C-10),137.8(C-11),169.1(C-12),123.3(C-13),20.1(C-14),18.7(C-15)。以上数据表明，该化合物是鹅不食草二倍半萜类单体心菊内酯，其分子式和分子量分别为C15H18O4和262.38。
二、鹅不食草二倍半萜类单体心菊内酯对肝纤维化的保护作用
1.动物模型的制备、分组及处理
雄性SD大鼠(180±10g)，适应性饲养1w后，随机分为正常对照组、模型组、秋水仙碱组，以及鹅不食草心菊内酯低剂量组(Helenalin-L)、高剂量组(Helenalin-H)，每组10只。除正常组外，其余各组大鼠灌胃给予50％CCl4(2ml/kg，溶于橄榄油中)，每周2次，总共8周；与此同时，秋水仙碱组大鼠灌胃给秋水仙碱(0.2mg/kg/d)，鹅不食草心菊内酯治疗组大鼠分别灌胃给予鹅不食草心菊内酯(0.25、0.5mg/kg/d)。正常对照组大鼠灌胃给予等容量的生理盐水。8周后，处死大鼠，取血，4000r/min离心5min后，用抗凝管(50U/ml)分别收集血清与血浆；取出肝脏，清洗干净。血清、血浆及肝组织均贮存在-80℃冰箱待用。
2.检测指标
①肝组织病理学观察；
②检测ALT、AST、ALP和ALB水平；
③检测IL-6、IL-10、TNF-α和MPO水平；
④检测MDA、SOD、CAT、GSH-Px和GSH-GR水平；
⑤检测HA、Hyp和LN水平；
⑥检测miR-200a基因水平。
3.实验结果
(1)心菊内酯显著减轻肝脏病理学改变
正常组大鼠肝小叶结构清晰且完整，以中央静脉为中心，向四周呈放射状排列，肝细胞未见变性或坏死。模型组大鼠肝细胞出现肿胀、气球样变，淋巴细胞浸润，肝局灶性坏死以及肝小叶被破坏的现象。Helenalin-L组和Helenalin-H组大鼠均可观察到肝组织病理损伤较模型组明显减轻。
(2)心菊内酯明显降低ALT、AST和ALP活性，升高ALB活性
与正常组相比，模型组大鼠血清中ALT、AST和ALP含量明显升高，秋水仙碱或心菊内酯干预均能显著降低血清中ALT、AST和ALP含量(p＜0.01)；同时，模型组大鼠血清中ALB含量显著降低，药物干预均显著升高血清中ALB含量(p＜0.01)。结果见表1。
表1心菊内酯对肝纤维化大鼠血清ALT、AST、ALP和ALB含量的影响
注：与正常对照组相比，#P<0.05，##P<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。
(3)心菊内酯显著抑制胶原生成
与正常组相比，模型组大鼠HA、Hyp和LN含量显著升高(p＜0.01)。秋水仙碱组或心菊内酯干预均能显著降低HA、Hyp和LN含量(p＜0.05或p＜0.01)。结果见表2。
表2心菊内酯对肝纤维化大鼠HA、Hyp和LN含量的影响
注：与正常对照组相比，#P<0.05，##P<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。
(4)心菊内酯显著抑制炎症因子释放
与正常组相比，模型组大鼠肝组织IL-6、TNF-α和MPO含量明显升高，IL-10含量明显降低(p＜0.01)。经药物干预后，Helenalin-L组和Helenalin-H组大鼠肝组织中IL-6、TNF-α和MPO的含量显著降低(p＜0.05或p＜0.01)，同时大鼠肝组织中IL-10的含量显著升高(p＜0.05或p＜0.01)。结果见表3。
表3心菊内酯对肝纤维化大鼠IL-6、IL-10、TNF-α和MPO含量的影响
注：与正常对照组相比，#P<0.05，##P<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。
(5)心菊内酯显著改善脂质过氧化
与正常组相比，模型组大鼠SOD、CAT、GSH-Px和GSH-GR含量显著降低，MDA含量显著升高(p＜0.01)。经药物干预后，SOD、CAT、GSH-Px和GSH-GR的含量显著升高(p＜0.05或p＜0.01)，MDA含量显著降低(p＜0.01)。结果见表4。
表4心菊内酯对肝纤维化大鼠MDA、SOD、CAT、GSH-Px和GSH-Rd活性的影响
注：与正常对照组相比，#P<0.05，##P<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。
(6)心菊内酯上调miR-200a表达
与正常组相比，模型组大鼠miR-200a基因表达显著降低(p＜0.01)；心菊内酯干预后，显著上调miR-200a基因表达(p＜0.01)。结果见表5。
表5心菊内酯对肝纤维化大鼠miR-200a基因表达的影响
注：与正常对照组相比，#P<0.05，##P<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。
4.结论
鹅不食草二倍半萜类单体心菊内酯能够显著改善胶原沉积、抗炎、抗脂质过氧化，对肝纤维化具有明显的保护作用，其机制可能与上调miR-200a基因表达有关。

Claims (3)

1.一种中药鹅不食草二倍半萜类单体心菊内酯的制备方法，其特征是：
取鹅不食草干燥全草，粉碎，95％乙醇加热回流提取3次，每次2h，合并3次乙醇提取液，减压除去乙醇，得到鹅不食草乙醇浸膏；取乙醇浸膏加适量蒸馏水重悬，0.45um滤头过滤，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得乙酸乙酯萃取物；以硅胶柱色谱柱分离，PE：EtOAc为7:1,4:1，3:1，2:1，1:1，1:2，EtOAc梯度洗脱，薄层色谱收集相同馏分，其中，第八馏分再经硅胶柱和Sephadex LH-20柱进一步分离纯化，最后得到心菊内酯白色晶体。
2.中药鹅不食草二倍半萜类单体心菊内酯在制备治疗肝纤维化药中的应用。
3.中药鹅不食草二倍半萜类单体心菊内酯在制备治疗炎症药中的应用。
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