CN104873560A - 一种植物总黄酮及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中药领域，具体涉及一种植物总黄酮及其制备方法与应用。所述的植物总黄酮的制备方法，包含如下步骤：(1)通过将大蓟根上部分粉碎过筛，然后用乙醇溶液加热回流提取，提取液过滤，然后减压浓缩蒸干至膏状，得到大蓟乙醇粗提物；(2)大蓟乙醇粗提物采用石油醚脱脂，然后上大孔树脂，水洗脱至无色，然后用乙醇溶液洗脱，洗脱液减压浓缩蒸干，得到植物总黄酮；所述的植物总黄酮在体外能显著抑制肝癌细胞HepG2的增殖，而且能保护人肝细胞L02不受四氯化碳的损伤，可作为新型的护肝药物，用药途径简单，易操作。
Description
技术领域
本发明属于中药领域，具体涉及一种植物总黄酮及其制备方法与应用。
背景技术
大蓟为菊科(Composite)管状花亚科菜蓟族(Cvnareae)蓟属(Cirsium Mill.)植物C.japonicum DC.的干燥地上部分或根。菊科蓟属植物是广泛分布于北温带的一个大属，全世界约有300种蓟属植物，我国约有50种，全国各地都产，其中常用作药用植物的有10余种。大蓟是凉性植物，其味甘、苦，归经于心、肝，常用作凉血止血药，并有祛疲痛，治吐血、尿血、衄血、血淋、血崩、肠风、带下、肠痈、疔疮、痈疡肿毒、高血压等功效。
肝脏是人体最大的实质性器官，担负消化、解毒、分泌和生物合成功能，其功能障碍直接影响人体健康,甚至危及生命。我国是肝病发生率较高的国家之一，各种肝病严重危害着人们的身体健康，寻找和开发治疗肝病的有效药物是目前国内外肝病领域研究中的热点。引起肝病发生的因素很多，主要有病毒、酒精和化学物质三大因素，而肝细胞损伤是各型肝病共同的病理基础。其中，在我国以肝炎病毒和化学物质导致的肝病居多。化学性肝损伤是由化学性肝毒性物质所造成的肝损伤。这些化学物质和药物包括四氯化碳(CC14)、乙醇、半乳糖胺、扑热息痛及抗结核药物等。它们能通过生成氧自由基和前致炎因子，从诱导氧化应激和炎症反应，造成细胞膜和酶类破坏，进而引起肝细胞功能障碍，导致肝细胞凋亡或坏死，进一步引起整个肝脏功能的障碍。化学性肝损伤的起始靶部位都是质膜，质膜一经破坏就引起连锁反应,形成恶性循环降。在各种化学性肝病中，CC14所致的肝损伤是最常见的。
近年来研究发现，天然药物在肝病治疗方面有良好的效果和巨大潜力。天然药物治疗肝损伤作用主要为改善肝功能，降低转氨酶活性、降低血清总胆红素；促进肝糖元合成，保护肝细胞，防止急慢性肝损伤造成的糖元合成障碍；改善肝组织病理,对急性肝损伤能减轻细胞肿胀，防止细胞坏死、减少炎性细胞浸润，对慢性肝损伤能减轻细胞肿胀，防止脂肪变性；抑制肝胶原纤维、网状纤维增生，防止肝纤维化发生。天然药物抗肝损伤的作用机制主要为两方面：①抗氧化和②减少炎症因子生成。多种天然药物被认为能清除自由基，阻止肝细胞脂质过氧化，同时减少前炎症因子生成，抑制炎症反应，从而维持细胞膜的正常结构，避免细胞的损害。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种植物总黄酮的制备方法。
本发明的另一目的在于提供上述制备方法制备得到的植物总黄酮。
本发明的再一目的在于提供上述植物总黄酮的应用。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种植物总黄酮的制备方法，包含如下步骤：
(1)将大蓟根上部分粉碎过筛，然后用乙醇溶液加热回流提取，提取液过滤，然后减压浓缩蒸干至膏状，得到大蓟乙醇粗提物；
(2)对步骤(1)制备得到的大蓟乙醇粗提物采用石油醚脱脂，然后上大孔树脂，水洗脱至无色；然后用乙醇溶液洗脱，洗脱液减压浓缩蒸干，得到植物总黄酮(CJF)；
步骤(1)中所述的过筛的目数优选为10～100目；
步骤(1)中所述的乙醇的体积分数优选为70％；
步骤(1)中所述的加热回流提取的温度优选为90～100℃；所述的加热回流提取次数优选为2～4次；所述的加热回流提取每次提取的时间优选为2～4h；
步骤(1)中所述的加热回流提取的温度进一步优选为100℃微沸状态下；所述的加热回流提取次数进一步优选为3次；所述的加热回流提取每次提取的时间进一步优选为3h；
步骤(1)中所述的减压浓缩的温度为40～45℃；
步骤(1)中所述的减压浓缩的温度优选为40℃；
步骤(2)中所述的石油醚脱脂的具体方法为：大蓟乙醇粗提物用石油醚萃取至基本无颜色为止；所述的石油醚与大蓟乙醇粗提物的体积比优选为1:1；
步骤(2)中所述的大孔树脂优选为大孔树脂AB-8；
步骤(2)中所述的乙醇的体积分数优选为50％；
步骤(2)中所述的减压浓缩的温度优选为40～45℃；
步骤(2)中所述的减压浓缩的温度优选为40℃；
一种植物总黄酮，通过上述制备方法制备得到；
所述的植物总黄酮具有抗肿瘤作用，可以应用于制备抗肿瘤药物；
所述的植物总黄酮具有护肝作用，可以应用于制备护肝药物；
一种抗肿瘤药物，含有上述植物总黄酮(CJF)；
一种护肝药物，含有上述植物总黄酮(CJF)；
本发明的原理：植物来源的总黄酮(CJF)可以保护四氯化碳损伤的肝细胞，减少化学毒物对肝细胞的生长。本发明发现和确证CJF具有显著的护肝活性，且CJF的使用剂量低，在同样剂量下的毒副作用也较低。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明首次发现CJF在体外能够保护L02细胞不受四氯化碳损伤。
(2)CJF在体外能明显抑制肝癌细胞HepG2的增殖，同阳性对照效果相当。
(3)CJF的用药剂量比较低，而且在有效用药剂量范围内毒性较低。
(4)CJF为黄酮类化合物。
附图说明
图1是CJF对HepG2细胞增殖的抑制效果图，其中，5-F：五-氟尿嘧啶。
图2是CJF对四氯化碳诱导的L02细胞的保护作用图，其中，**：与control组比较，P<0.01；***：与control组比较，P<0.001。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中，人正常肝细胞L02、人肝癌细胞HepG2购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心；大蓟根上部分采自河南。
CJF从大蓟根上部分中制备得到；
实施例1 从大蓟根上部分中制备得到CJF
(1)将购买的大蓟根上部分粉碎后过20目筛，称取100g，用体积分数为70％的乙醇溶液在100℃微沸状态下加热回流提取3次，每次3h，合并提取液，用2层40目纱布过滤，然后用旋转蒸发仪在40℃下减压浓缩蒸干至膏状，得到大蓟乙醇粗提物，黄酮含量为4.33mg/g；
(2)对步骤(1)制备得到的大蓟乙醇粗提物采用等体积石油醚脱脂，萃取至基本无颜色为止；然后上大孔树脂AB-8，水洗脱至无色；再用体积分数为50％的乙醇溶液洗脱，洗脱液用旋转蒸发仪在40℃下减压浓缩蒸干，即制得植物总黄酮(CJF)；测得其黄酮含量为203.33mg/g。
实施例2 从大蓟根上部分中制备得到CJF
(1)将购买的大蓟根上部分粉碎后过10目筛，称取100g，用体积分数为70％的乙醇溶液在90℃条件下加热回流提取4次，每次2h，合并提取液，用2层40目纱布过滤，然后用旋转蒸发仪在45℃下减压浓缩蒸干至膏状，得到大蓟乙醇粗提物，黄酮含量为4.05mg/g；
(2)对步骤(1)制备得到的大蓟乙醇粗提物采用等体积石油醚脱脂，萃取至基本无颜色为止；然后上大孔树脂AB-8，水洗脱至无色；再用体积分数为50％的乙醇溶液洗脱，洗脱液用旋转蒸发仪在45℃下减压浓缩蒸干，即制得植物总黄酮(CJF)；测得其黄酮含量为203.33mg/g。
实施例3 从大蓟根上部分中制备得到CJF
(1)将购买的大蓟根上部分粉碎后过100目筛，称取100g，用体积分数为70％的乙醇溶液在100℃微沸状态下加热回流提取3次，每次4h，合并提取液，用2层40目纱布过滤，然后用旋转蒸发仪在40℃下减压浓缩蒸干至膏状，得到大蓟乙醇粗提物，黄酮含量为4.17mg/g；
(2)对步骤(1)制备得到的大蓟乙醇粗提物采用等体积石油醚脱脂，萃取至基本无颜色为止；然后上大孔树脂AB-8，水洗脱至无色；再用体积分数为50％的乙醇溶液洗脱，洗脱液用旋转蒸发仪在40℃下减压浓缩蒸干，即制得植物总黄酮(CJF)；测得其黄酮含量为203.33mg/g。
实施例4 MTT法检测CJF对肝癌细胞HepG2增殖的影响
将HepG2细胞以1×105个/mL浓度接种于96孔细胞培养板(100μL/孔)，置37℃，5％CO2恒温培养箱中培养；待孔板中的细胞完全贴壁后，加入含有不同终浓度(25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL)CJF(实施例1制备)的细胞培养液100μL，同时设细胞对照组，即加入与样品液等量的完全培养液；阳性对照组，加与样品同浓度梯度同体积的五-氟尿嘧啶作为阳性对照，每个浓度设6个平行。在37℃，5％CO2培养箱中继续培养，24h后取出，倒置显微镜观察细胞形态的变化。用1mL注射器小心地吸弃96孔板中的培养液，用不含钙、镁离子的PBS洗板2次，然后每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL(需关灯操作，MTT见光易分解)和DMEM完全培养液180μL，在37℃，5％CO2培养箱中继续培养4h。小心吸弃孔内的细胞培养液，每孔加入150μL DMSO，振荡10min；用酶联免疫检测仪在波长为490nm下测定其吸光度值。
结果见图1，CJF能够抑制HepG2细胞增殖，并呈现梯度依赖性。
实施例5 CJF对四氯化碳损伤的正常人肝细胞L02细胞的保护作用
取对数生长期的L02细胞，以1×105个/mL浓度接种于96孔细胞培养板(100μL/孔)，置37℃，5％CO2恒温培养箱中培养。待孔板中的细胞完全贴壁后，吸弃上清，按如下分组要求给药，每组6个复孔。样品组：加入含有不同终浓度(12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL)CJF(实施例1制备)的细胞培养液；正常细胞对照组和模型组(control组)：加入与样品液等量的培养液；阳性对照组：加入与样品组相同浓度梯度的水飞蓟素。6h后除正常细胞对照组加入不含CCl4的100μL培养液，其余各孔中都加100μL含CCl4(10mmol/L)的培养液。37℃，饱和湿度，5％的CO2恒温培养箱中培养24h后，倒置显微镜观察细胞形态的变化。并小心地吸弃96孔板中的培养液，用不含钙、镁离子的PBS洗板2次，然后每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL(需关灯操作，MTT见光易分解)和DMEM完全培养液180μL，在37℃，5％CO2培养箱中继续培养4h。小心吸弃孔内的细胞培养液，每孔加入150μL DMSO，振荡10min。用酶联免疫检测仪在波长为490nm下测定其吸光度值。
结果见图2，与模型组对比，样品组细胞存活率显著增大，并呈现浓度依赖性，且细胞存活率与阳性对照相当。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种植物总黄酮的制备方法，其特征在于包含如下步骤：
(1)将大蓟根上部分粉碎过筛，然后用乙醇溶液加热回流提取，提取液过滤，然后减压浓缩蒸干至膏状，得到大蓟乙醇粗提物；
(2)对步骤(1)制备得到的大蓟乙醇粗提物采用石油醚脱脂，然后上大孔树脂，水洗脱至无色；然后用乙醇溶液洗脱，洗脱液减压浓缩蒸干，得到植物总黄酮。
2.根据权利要求1所述的植物总黄酮的制备方法，其特征在于；
步骤(1)中所述的乙醇的体积分数为70％。
3.根据权利要求1所述的植物总黄酮的制备方法，其特征在于；
步骤(1)中所述的加热回流提取的温度为90～100℃；所述的加热回流提取次数为2～4次；所述的加热回流提取每次提取的时间为2～4h。
4.根据权利要求1所述的植物总黄酮的制备方法，其特征在于；
步骤(1)中所述的过筛的目数为10～100目；
步骤(1)中所述的减压浓缩的温度为40～45℃。
5.根据权利要求1所述的植物总黄酮的制备方法，其特征在于；
步骤(2)中所述的石油醚与大蓟乙醇粗提物的体积比为1:1。
6.根据权利要求1所述的植物总黄酮的制备方法，其特征在于；
步骤(2)中所述的大孔树脂为大孔树脂AB-8。
7.根据权利要求1所述的植物总黄酮的制备方法，其特征在于；
步骤(2)中所述的乙醇的体积分数为50％。
8.根据权利要求1所述的植物总黄酮的制备方法，其特征在于；
步骤(2)中所述的减压浓缩的温度为40～45℃。
9.一种植物总黄酮，其特征在于：通过权利要求1～8任一项所述的制备方法制备得到。
10.权利要求9所述的植物总黄酮在制备抗肿瘤药物或护肝药物中的应用。
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