CN109432152A

CN109432152A - 一种大蓟提取物及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN109432152A
Application number: CN201811231684.0A
Authority: CN
Inventors: 廖颖; 黎霞; 严伟; 冉然; 李艾妮; 吴灵俐; 佘诗琪
Original assignee: Sichuan Normal University
Current assignee: Sichuan Normal University
Priority date: 2018-10-22
Filing date: 2018-10-22
Publication date: 2019-03-08

Abstract

本发明公开了一种大蓟提取物，它是大蓟的提取物，它是按照如下方法制备的提取物：(1)取大蓟粉，采用90～98％的乙醇提取，得乙醇粗提物；(2)将乙醇粗提物过硅胶柱。本发明还公开了前述提取物的制备方法和用途。本发明大蓟提取物具有良好的抑制结核杆菌功效，为临床治疗结核病提供了一种新的选择。

Description

一种大蓟提取物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种大蓟提取物及其制备方法和用途。

背景技术

结核病是严重危害人类健康的主要传染病之一，其至今已有超过4000年的历史。我国是世界上结核病负担最高的国家之一，也是耐多药结核病的高负担国家之一。^[1]进入二十一世纪以来，我国全面推行以控制传染源为核心的现代结核病控制策略。1882年，R.Koch提出结核病主要是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的^[2-3]，结核杆菌为专性需氧性细菌，对生长温度要求较严格，在37℃时为最宜生长温度，温度低于30℃则无法生长。结核杆菌细胞壁中含有大量的分枝菌酸等脂类物质，为慢生长菌，在L-J(罗氏)培养基中根据接种量约2-4周出现肉眼可见的“菜花菌落。

自上世纪四十年代抗结核药物的发现和应用后，结核病的死亡率迅速降低，但随着菌株的不断变化，结核病的防治又出现了较多困难。据WHO报道，全世界约有20亿的人口曾经感染过结核杆菌，其中每年新增发病人数约800万人，每年大约有300万人死于结核病^[6]。且随着HIV感染者的人数不断上升、流动性人口的增加和耐药菌株的不断发展，结核病在全球的发病率逐渐呈现出上升趋势。

为方便治疗耐多药结核病和广泛耐多药结核病，WHO将抗结核药物分为五组，包括1)口服一线抗结核药：异烟肼(H)，利福平(R)，利福布汀(B)，吡嗪酰胺(Z)，乙胺丁(E)；2)注射剂：链霉素(S)，卡那霉素(Km)，卷曲霉素(Cm)，阿米卡星(Am)； 3)氟喹诺酮类：氧氟沙星(Ofx),左氧氟沙星(Lfx)，莫西沙星(Mfx)，加替沙星(Gfx)； 4)口服二线抗结核药物：对氨水杨酸钠(PAS)，环丝氨酸(Cs)，乙硫异烟胺(Eto)，丙硫异烟胺(Pto)；5)疗效不确切的抗结核药物：氯苯酚嗪(Cfz)，利立奈唑胺(Lzd)，阿莫西林/克拉维酸(Amx/Clv)，克拉霉素(Clr)，氨硫脲(Thz)，亚胺培南/西斯丁钠 (Lpm/Cin)，高剂量异烟肼。利福平和异烟肼更是初期治疗结核病的主要用药，但是其存在副作用。

中药历史悠久，中药毒副作用小，我国在治疗肺结核的方面具有很长的历史，古典药集中有记载许多的治疗肺结核的药物，也有许多的有关中药结核治疗的相关研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于新的抑制结核杆菌的药物及其制备方法和用途。

本发明大蓟提取物，它是按照如下方法制备的提取物：

(1)取大蓟粉，采用90～98％的乙醇提取，得乙醇粗提物；

(2)将乙醇粗提物过硅胶柱：

取乙醇粗提物，上样，依次用石油醚与乙酸乙酯的混合物1、石油醚与乙酸乙酯的混合物2、石油醚与乙酸乙酯的混合物3、乙酸乙酯、乙酸乙酯与甲醇的混合物、甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，减压浓缩、干燥；

所述石油醚与乙酸乙酯的混合物1中，石油醚与乙酸乙酯的体积比为9:1；

所述石油醚与乙酸乙酯的混合物2中，石油醚与乙酸乙酯的体积比为5:1；

所述石油醚与乙酸乙酯的混合物3，石油醚与乙酸乙酯的体积比为5:6；

所述乙酸乙酯与甲醇的混合物中，石油醚与乙酸乙酯的体积比为10:1。

步骤(1)中，所述乙醇的浓度为95％的乙醇；和/或，所述乙醇的用来为大蓟粉的10倍v/w。

步骤(1)中，所述提取的方法是超生提取，超声的功率为800w；和/或，提取工艺为提取30min，暂停10min，再超声30min；和/或，提取的次数为1～3次。

步骤(2)中，所述乙醇粗提物上样之前进行前处理，前处理方法为：采用甲醇溶解后，加入2倍量的硅胶，干燥。

本发明制备大蓟提取物的方法，步骤如下：

(1)取大蓟粉，采用90～98％的乙醇提取，得乙醇粗提物；

(2)将乙醇粗提物过硅胶柱：

步骤(1)中，所述乙醇的浓度为95％的乙醇；和/或，所述乙醇的用来为大蓟粉的10倍v/w；和/或，步骤(1)中，所述提取的方法是超生提取，超声的功率为800w；和/ 或，提取工艺为提取30min，暂停10min，再超声30min；和/或，提取的次数为1～3 次。

本发明还提供了前述提取物在制备抑制结核杆菌的药物中的用途。

本发明还提供了前述提取物在制备治疗结核病的药物中的用途。

本发明还提供了一种抑制结合杆菌的药物，它是以前述的提取物为有效成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。

本发明实验证实，本发明大蓟的提取物具有良好的抑制结核杆菌功效，为临床治疗结核病提供了一种新的选择。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1本发明提取物的制备

1、提取、分离方法

(1)提取

称取500g的大蓟粉，用5000mL 95％乙醇浸泡24h，浸泡后将粗粉和浸泡液倒入超声提取机中，65℃、超声功率800w超声提取30min，暂停10min，再超声30min，放出提取液用布氏漏斗抽滤。再向提取后的药渣中倒入5000mL的95％乙醇，按前述操作再重复提取两次。合并三次提取液，滤液用旋转蒸发仪于65℃减压回收得稠浸膏，冷冻干燥后得到冻干粉，为乙醇粗提物。

(2)分离

1)称取50.0g大蓟95％乙醇粗提取，加入甲醇加热使其完全溶解，称取100g硅胶加入溶液中，80℃水浴搅拌使其干燥，封口备用。

2)称取1000g硅胶，用石油醚将硅胶浸泡后缓慢加入层析柱中，待全部硅胶加入后，静置5min后用加压泵加压，将层析柱中的硅胶压至无法用玻璃棒压动。加压过程中注意硅胶柱内部需均匀不开裂，硅胶柱表面在一条水平面。

3)将拌好的样品加入层析柱中，用石油醚平衡10个柱体积后，以石油醚：乙酸乙酯9:1的体积比洗脱剂进行洗脱，直至洗脱液在紫外分光光度计下与洗脱剂一致则说明该部位洗脱干净，合并相同洗脱部位用旋转蒸发仪将其减压回收。再分别用石油醚：乙酸乙酯5:1,石油醚：乙酸乙酯5:6，乙酸乙酯，乙酸乙酯：甲醇10:1，甲醇按上述方法进行洗脱，合并甲醇洗脱部分，得甲醇部位提取物。

下面通过具体的药学试验来验证本发明的有益效果：

实验例1本发明提取物的抑菌活性检测

1、实验方法

1.1含药培养基的制备

受试提取物：实施例1制备的乙醇粗提物、甲醇部位提取物(提取物B)，以及石油醚：乙酸乙酯5:1部位的提取物(提取物A)；

阳性药物：利福平

表1改良罗氏培养基的配置

1)2％孔雀绿溶液配制：称取孔雀绿2.0g置于烧杯中，加入蒸馏水搅拌至完全溶解，灭菌后无菌操作定容至100mL。

2)清洁操作台面，接通鼓风干燥箱，85℃进行预热。

3)按照表1称取无机盐置于高压灭菌的烧杯中，加入600mL蒸馏水制备成盐溶液，沸水浴30min，生物安全柜中无菌冷却备用。

4)清洗鸡蛋，用75％乙醇浸泡10min后取出擦干，将消毒后的鸡蛋打入灭菌的烧杯中，观察鸡蛋是否新鲜，随后将新鲜的鸡蛋转入另一灭菌烧杯中，使用打蛋器将鸡蛋匀化。然后另取一灭菌烧杯，将蛋液用两层纱布过滤后置入烧杯中备用。

5)量取1000mL匀化后的蛋液加入冷却到室温的盐溶液中，加入20mL 2％的孔雀绿溶液，缓慢混匀，即为基础培养液。用10mL无菌移液管量取7mL培养基置于痰培养瓶中，分装三支，即为空白对照培养基。

6)称取提取物2.4g,放入500mL灭菌的锥形瓶中，加入少量吐温-80，水浴加热至中药溶解，待冷却后加入240mL基础培养液缓慢混匀，即制成10mg/mL的含药培养液。另取5只灭菌的100mL锥形瓶，分别向里面加入54mL、48mL、42mL、36mL、30mL 的含药培养液，然后再分别向里面加入6mL、12mL、18mL、24mL、30mL的基础培养液，混匀后培养液的浓度分别为9mg/mL、8mg/mL、7mg/mL、6mg/mL、5mg/mL。

7)另取5只灭菌的100mL锥形瓶，将上述培养液分别吸取30mL至瓶中，再向瓶中分别加入30mL基础培养液，混匀后即制成4.5mg/mL、4mg/mL、3.5mg/mL、3mg/mL、 2.5mg/mL的含药培养液。按照上述方法分别制备2mg/mL、1.5mg/mL、1mg/mL的含药培养液。

8)效价利福平胶囊，按上述方法制备利福平培养基，使培养基中的利福平浓度为250ug/mL。

9)分装培养液到培养管中，每管约7mL。

10)将培养管放在斜面架上，使培养基的斜面约为试管长度的2/3，放在已经预热的鼓风干燥箱中，待干燥箱温度升至85℃开始计时，凝固50min。

11)取出培养基观察培养基的外观，合格培养基需斜面颜色新鲜，斜面表面光滑无气泡，无变形，具有一定韧性，弃去不合格的培养基。

12)将培养基放于37℃恒温培养箱48h后观察培养基是否染菌，弃去染菌的培养基，没有培养物生长的培养管置于4℃冰箱保存备用。

1.2麦氏比浊管(NO.1McFarland)配制

称取0.025gBacl₂溶于装有9.912mL蒸馏水的中，然后向比浊管中缓慢加入98μL98％浓H₂SO₄，混匀后观察是否有大颗粒沉淀，如有则需弃去重新配制。每次使用前需剧烈摇晃比浊管使其浊度一致。

1.3菌悬液制备

取一只灭菌的超声分散管，用无菌吸管吸取1-2mL灭菌生理盐水放入，用接种环挑选2-3周长势较好的新鲜菌约1/4环落置于磨菌管底部，盖上盖子后置于细菌超声分散计数仪上超声60s,根据仪器的要求加入需要加入的盐水调节菌悬液的OD值，使其与标准比浊管浓度一致。此时菌液浓度约为3×10⁸CFU。

1.4菌液的稀释

在无菌带有螺旋盖的试管中以无菌吸管加入2mL灭菌生理盐水，待菌液静置后用枪头吸取20μL的菌液加入，即菌液稀释为3×10⁶CFU,同样方法再进行100倍稀释，即成 3×10⁴CFU。

1.5结核杆菌的接种

用22SWG标准接种环分别取一满环3×10⁴CFU的菌液，用划线法均匀接种至空白培养基和含药培养基表面，使菌液尽可能均匀的分布在培养基斜面上。接种后的培养基置于恒温培养箱内，37℃直立放置培养，3-4周后观察菌的生长结果，确定其抑菌效果。

1.6检测标准

根据《结核病实验室检验规程》，当斜面无菌落生长时，报告为“-”；当斜面生长菌落少于10个时，报告实际菌落数；当斜面生长菌落1/4斜面时，报告为“1+”；当斜面生长菌落为1/2斜面时，报告为“2+”；当斜面生长菌落大部分融合，报告为“3+”；当斜面生长菌落完全融合时，报告为“4+”。

2、实验结果

如在改良罗氏培养基中，1-2周时，结核杆菌在固体培养基中几乎没有生长，第3周开始，结核杆菌长出肉眼可见菌落，到第4周时，结核杆菌长出肉眼可见的较大菌落。利福平培养基中一直无结核杆菌生长。

提取物的生长情况如表2、表3所示：

表2大蓟乙醇粗提物的抑菌结果

表3各部位抑菌效果MTB

由表2和表3可知，大蓟乙醇粗提物具有一定的抑菌作用，但是抑菌效果不佳，而且甲醇部位的抑菌效果优良，最低杀菌浓度为2.5～3mg/mL之间，可以制备成为抑制结核杆菌的药物。

综上，本发明提取物(大蓟甲醇部位)具有良好的抑制结核杆菌的作用，为临床治疗治疗结核病提供了一种新的选择，应用前景良好。

Claims

1.一种大蓟提取物，其特征在于：它是按照如下方法制备的提取物：

(1)取大蓟粉，采用90～98％的乙醇提取，得乙醇粗提物；

(2)将乙醇粗提物过硅胶柱：

2.根据权利要求1所述的提取物，其特征在于：步骤(1)中，所述乙醇的浓度为95％的乙醇；和/或，所述乙醇的用来为大蓟粉的10倍v/w。

3.根据权利要求1所述的提取物，其特征在于：步骤(1)中，所述提取的方法是超生提取，超声的功率为800w；和/或，提取工艺为提取30min，暂停10min，再超声30min；和/或，提取的次数为1～3次。

4.根据权利要求1所述的提取物，其特征在于：步骤(2)中，所述乙醇粗提物上样之前进行前处理，前处理方法为：采用甲醇溶解后，加入2倍量的硅胶，干燥。

5.一种制备大蓟提取物的方法，其特征在于：步骤如下：

(1)取大蓟粉，采用90～98％的乙醇提取，得乙醇粗提物；

(2)将乙醇粗提物过硅胶柱：

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：

步骤(1)中，所述乙醇的浓度为95％的乙醇；和/或，所述乙醇的用来为大蓟粉的10倍v/w；和/或，步骤(1)中，所述提取的方法是超生提取，超声的功率为800w；和/或，提取工艺为提取30min，暂停10min，再超声30min；和/或，提取的次数为1～3次。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述乙醇粗提物上样之前进行前处理，前处理方法为：采用甲醇溶解后，加入2倍量的硅胶，干燥。

8.权利要求1～4任意一项所述提取物在制备抑制结核杆菌的药物中的用途。

9.权利要求1～4任意一项所述提取物在制备治疗结核病的药物中的用途。

10.一种抑制结合杆菌的药物，其特征在于：它是以权利要求1～4任意一项所述的提取物为有效成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。