CN115569156B - 一种显著改善支气管哮喘炎症的参灵草菌质提取物及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种显著改善支气管哮喘炎症的参灵草菌质提取物及应用，其制备方法包含改良固、液PD培养基的配制、固体药性培养基的配制、菌种活化、种子液制备、固体发酵优化及发酵产物的提取制备；本发明以太子参为药性基质，灵芝、蛹虫草为发酵菌株进行共培养发酵，确定了参灵草菌质的最佳发酵工艺，并经研究发现参灵草菌质可以降低BA小鼠血清中IgE的含量，升高BALF中IFN‑γ的含量，降低IL‑4、IL‑5和IL‑13的含量，进而显著减轻BA小鼠的气道炎症，为防治支气管哮喘炎症药物的研发提供了新的物质基础和研究方向。

Description

一种显著改善支气管哮喘炎症的参灵草菌质提取物及应用

技术领域

本发明涉及一种改善支气管哮喘炎症的参灵草菌质提取物及应用，属于药物技术领域。

背景技术

支气管哮喘(Bronchial Asthma,BA)是一种常见的气道慢性炎症性疾病,以气道慢性炎症、气道对多种刺激因素呈现的高反应性以及气道重构为主要特征。临床表现为反复发作的喘息、气急、胸闷或咳嗽等症状。哮喘的发病机制复杂，至今仍没有非常有效的治疗手段，临床治疗多以控制其发作为主,而且哮喘目前还不能被根治，因此寻求新的更有效的防治方法和治疗药物迫在眉睫。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种显著改善支气管哮喘炎症的参灵草菌质提取物及应用，为支气管哮喘提供新的药物选择。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种显著改善支气管哮喘炎症的参灵草菌质提取物，该参灵草菌质提取物采用包含以下步骤的方法进行制备：

(1)改良PDA培养基的配制：将土豆削皮，称取200g，洗净、切块，倒入带盖的锅中，加水500mL小火煮沸30min直至土豆煮烂；然后用四层纱布过滤，水补足1000mL搅拌均匀，分装于锥形瓶，按 2％葡萄糖、2％琼脂、1％蛋白胨的重量配置比例加入葡萄糖、琼脂、蛋白胨，pH自然，加塞，外面再用报纸包一层，然后用橡皮筋缠下，写上编号、标记及日期，灭菌条件：121℃，30min；

(2)改良液体马铃薯培养基的配制：操作同步骤(1)改良PDA 培养基的配制，但配方中不加入2％琼脂，其余药品(葡萄糖、蛋白胨)均不变；

(3)固体药性培养基的配制：将太子参药材，60℃热风干燥，粉碎过60目筛，往培养瓶中称取适量大米，浸泡过夜，然后称取一定比例太子参粉末于其中，加水适量，使含水量达20-30％，混合均匀写上编号、标记及日期pH自然，121℃、60min条件灭菌；

(4)菌种的活化：沾取斜面保存的灵芝菌种B1.4和蛹虫草菌种 B1528的孢子，分别用接种环接在改良PDA培养基上，在培养皿的背面标记时间、日期、姓名，分别放入26℃和20℃培养箱培养，待菌丝长满培养皿后用做液体培养基；

(5)蛹虫草菌种B1528种子液的制备：无菌条件下，用手术刀从长满蛹虫草菌种B1528菌丝的平板培养皿中切出0.3×0.3cm大小的菌种，取5-7块装入有200mL种子液培养基的锥形瓶中，接种结束以后，放入25℃的恒温摇床中，200r/min，黑暗条件下培养5-7天，至种子液粘稠，含有大量大小相似的菌丝且三角瓶的瓶壁上出现外圈为白、内圈为淡黄色的菌膜；

(6)灵芝菌种B1.4种子液的制备：无菌条件下，用手术刀从长满灵芝菌种B1.4菌丝的平板培养皿中切出0.3×0.3cm大小的菌种，取5-7块装入有200mL种子液培养基的锥形瓶中，接种结束以后，放入25℃的恒温摇床中，200r/min，黑暗条件下培养7-10天，直至培养液澄清、含有大量细小星芒状菌球、大小均匀，且三角瓶壁上出现一圈白色菌膜；

(7)固体发酵：初始固体培养基成分为浸泡过夜的大米24g，太子参粉末6g，固体培养基灭菌60min后室温冷却，无菌条件下取灵芝菌种B1.4和蛹虫草菌种B1528两菌种子液按2：1比例混匀，吸取两菌混合液24mL加入到初始固体培养基中，用灭菌过的玻璃棒将其均匀搅拌，封口膜封口后放入25℃恒温培养箱中，黑暗条件下培养18d，添加碳源为蔗糖5g/kg、添加氮源为硫酸铵8g/kg，添加无机盐为氯化钾0.4g/kg，发酵结束后，产物60℃干燥后即得参灵草菌质；

(8)参灵草菌质提取物制备：称取一定量(如1kg)参灵草菌质，使用80％乙醇超声提取，时间为2小时，重复三次，提取料液比为1:15，三次提取的药液混合在一起，进行减压浓缩，直至旋转蒸发仪冷凝管中无液体流下，浸膏无醇味、流动性差，获得参灵草菌质提取物(1kg参灵草菌质可经提取获得浸180.8g，提取率为18.08％)。

作为一种优选方案，参灵草菌质提取物可以应用在制备治疗支气管哮喘炎症的药物中。

上述应用中，作为一种优选方案，可以取参灵草菌质提取物，制成包括颗粒剂、胶囊剂、片剂、注射剂、口服液、软胶囊剂、滴丸剂在内的药剂上可以接受的剂型。

本发明的有益效果：本发明以太子参为药性基质，灵芝、蛹虫草为发酵菌株进行新型固体发酵，构建了太子参-灵芝-蛹虫草这一新型发酵组合，并将其发酵产物命名为参灵草菌质。通过对培养时间、添加碳源、添加氮源和添加无机盐等参数控制，以太子参总皂苷、灵芝三萜、虫草素增加量为跟踪指标，确定参灵草菌质新型中药原料药最佳发酵工艺。探讨参灵草菌质对哮喘小鼠气道炎症的干预作用研究，为治疗支气管哮喘药物的研发提供了新的物质基础、研究方向和理论参考。

灵芝(Ganoderma lucidum)是我国传统中药材，灵芝补益功效良好，具有止咳平喘、扶正固本和益气健脾等功效，对于肺虚咳喘，虚劳短气，等症状有着良好的治疗效果。灵芝化学成分复杂，生物活性种类繁多，主要有三萜类化合物、多糖、生物碱等。其中主要活性成分三萜类化合物及甾醇常被用来作为灵芝的主要质控指标。

蛹虫草(Cordyceps militaris)，温而不燥，药性平和、平稳，归肺、肾经，拥有补肾益肺、止血化痰等功能。蛹虫草的次生代谢产物虫草素是其最具代表性的活性成分，具有提高免疫力和抗病力等作用，表现为抗炎、免疫调节、抗肿瘤等作用。

太子参(Radix Pseudostellariae)味甘、微苦、性平，具有益气生津、补肺健脾等功效，功效似人参但又有不同，重点在于“清补”，具有益气但不升提,生津但不助湿，扶正却不恋邪，补虚又不峻猛的特点。太子参的有效成分主要包括皂苷类、环肽类及甾醇类等。其中太子参皂苷类成分多种多样，比如太子参总皂苷类等。太子参总皂苷具有抗炎、抗氧化、调节免疫以及抗疲劳等作用，其应用在多数疾病上都有新的进展，譬如哮喘、肝炎、糖尿病以及冠心病等，也有增强免疫的作用。

本发明的创新点在于：1、首次将灵芝和蛹虫草两种药用真菌在太子参药性基质中进行共培养发酵，构建了太子参-灵芝-蛹虫草这一新型发酵组合，获得全新产物参灵草菌质。2、研究发现参灵草菌质可以降低BA小鼠血清中IgE的含量，升高BALF中IFN-γ的含量，降低 IL-4、IL-5和IL-13的含量，进而显著减轻BA小鼠的气道炎症，为哮喘的防治研究提供了新的物质基础和药物研发思路。

附图说明

图1是本发明的发酵工艺流程图；

图2是不同交互因素对太子参总皂苷含量影响的响应面曲面图；

图3是不同交互因素对灵芝三萜含量影响的响应面曲面图；

图4是参灵草菌质醇提物对哮喘小鼠肺组织形态影响图(HE染色， x200)；

图5是参灵草菌质对哮喘小鼠肺脏、脾脏指数的影响图；

图6是参灵草菌质对哮喘小鼠血清IgE含量的影响图；

图7是参灵草菌质对哮喘小鼠BALF中IL-4、IL-5含量的影响图；

图8是参灵草菌质对哮喘小鼠BALF中IL-13、IFN-γ含量的影响图；

图9是参灵草菌质对哮喘小鼠肺组织中SOD活性和MDA含量的影响图。

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步的说明。

一、参灵草菌质的发酵工艺优化

1实验材料

1.1菌种：灵芝(Ganoderma Lucidum)菌种B1.4和蛹虫草(Cordyceps militaris)菌种B1528均由贵州中医药大学菌物药研究中心提供，现于贵州中医药大学基础医学院形态实验室，-80℃条件下，甘油管冻存。所述的灵芝菌种B1.4于2019年10月9日在中国典型培养物保藏中心(中国.武汉.武汉大学)保藏，保藏号：CCTCC NO：M 2019790，蛹虫草菌种B1528于2019年10月9日在中国典型培养物保藏中心(中国.武汉.武汉大学)保藏，保藏号：CCTCC NO：M 2019789。

1.2药材：太子参(产地：贵州，批号：20111903，生产厂家：安国市广济药业有限责任公司)。

1.3实验用具：标签纸、剪刀、漂浮板、酒精灯、纱布、量筒、玻璃棒、接种针、培养瓶、培养皿、烧杯、称量纸、容量瓶、试管、药匙、计时器、离心管、微孔滤膜、一次性注射器、高液小瓶、一次性胶头滴管等。

1.4实验试剂

表1-1实验试剂

2、发酵工艺流程：见图1。

3实验方法

3.1培养基的制备

改良PDA培养基的配制：将土豆削皮、称取200g、洗净、切块将其倒入带盖的锅中(洗净并用去离子水润洗)，然后加水约500mL 小火煮沸30min直至土豆煮烂；然后用四层纱布过滤，水补足1000 mL搅拌均匀，分装于锥形瓶，按配置比例加入药品(2％葡萄糖，2％琼脂，1％蛋白胨)pH自然，加塞，外面再用报纸包一层，然后用橡皮筋缠下，写上编号、标记及日期。灭菌条件：121℃30min。

改良液体马铃薯培养基的配制：操作同改良PDA培养基的配制等同，但是配方中不加入2％琼脂，其余药品均不变。

固体药性培养基的配制：将太子参药材，60℃热风干燥，粉碎过 60目筛。往培养瓶中称取适量大米，浸泡过夜，然后称取一定比例太子参粉末于其中，加水适量(使含水量达20-30％，标准为手抓一把调配好的培养料，用手握紧，指缝渗水而不滴下)，混合均匀写上编号、标记及日期pH自然，121℃、60min条件灭菌。

3.2菌种的活化及种子液的制备

3.2.1菌种的活化：沾取斜面保存的灵芝菌种B1.4和蛹虫草菌种 B1528的孢子，分别用接种环接在改良PDA培养基上，在培养皿的背面做好标记(时间、日期、姓名等)，分别放入26℃和20℃培养箱培养，待菌丝长满培养皿后用来做液体培养基。

3.2.2种子液的制备：马铃薯液体培养基：土豆200g/1000ml煮汁，葡萄糖2％，pH自然。

3.2.2.1蛹虫草菌种B1528种子液的制备：无菌条件下，用手术刀从长满蛹虫草菌种B1528菌丝的平板培养皿中切出0.3×0.3cm大小的菌种，取5-7块装入有200mL种子液培养基的锥形瓶中，接种结束以后，放入25℃的恒温摇床中，200r/min，黑暗条件下培养5-7天，至种子液粘稠，含有大量大小相似的菌丝，且三角瓶的瓶壁上出现外圈为白、内圈为淡黄色的菌膜。

3.2.2.2灵芝菌种B1.4种子液的制备：无菌条件下，用手术刀从长满灵芝菌种B1.4菌丝的平板培养皿中切出0.3×0.3cm大小的菌种，取 5-7块装入有200mL种子液培养基的锥形瓶中，接种结束以后，放入25℃的恒温摇床中，200r/min，黑暗条件下培养7-10天，直至培养液澄清、含有大量细小星芒状菌球、大小均匀，且三角瓶壁上出现一圈白色菌膜。

3.3固体发酵：本实验初始固体培养基成分为80％大米(浸泡过夜) 和20％太子参粉末。固体培养基灭菌60min后室温冷却，无菌条件下取灵芝菌种B1.4和蛹虫草菌种B1528两菌种子液按2：1比例混匀，吸取两菌混合液24mL加入到初始固体培养基中，用灭菌过的玻璃棒将其均匀搅拌，封口膜封口后放入25℃恒温培养箱中，黑暗条件下培养15d。单因素实验中设定空白对照和各因素不同条件组，每个条件做4个平行。

3.4重要成分含量检测

3.4.1太子参总皂苷含量测定

标准品溶液的制备：将25mL的容量瓶用超纯水和甲醇分别超声清洗三次，每次10min，60℃烘干后放入万分之一的天平中去皮，精密称取人参皂苷Rb1 3.2mg，加入甲醇溶解定容至25mL，震荡摇匀至其溶解。即获得浓度为0.128mg/mL的标准品溶液。

供试品的提取：取参灵草菌质粉末0.1g，用20mL无水乙醇超声提取120min，取续滤液于蒸发皿中，60℃水浴挥干，将蒸发皿中残渣用甲醇溶解，并定容至10mL容量瓶中。取0.2mL溶液于试管中，低温(微热风)挥干，即得所需供试品。

标准曲线绘制及太子参总皂苷含量测定：精密吸取人参皂苷Rb1 的标准品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL，分别置于试管中，低温(微热风)挥去溶剂，向已挥干溶剂的标准品溶液试管中加入5％的香草醛－冰醋酸溶液0.2mL，摇匀后，加入60％硫酸溶液5mL，混合均匀后于60℃水浴中保温20min，取出冷水中冷却5min 后，吸取200μL溶液于96孔板中，每个浓度设两个复孔，用酶标仪于560nm测定吸光度，对相应的浓度(C)测定标准曲线,得回归方程。供试品吸光度测定同上，并以甲醇为空白对照组。注意，将供试品，标准品名称、编号等信息清晰写在标签纸上，避免出现数据混淆等状况。

3.4.2灵芝三萜含量测定

标准品溶液制备：精密称取齐墩果酸4.4mg，于10mL容量瓶中甲醇定容，振荡混匀即可配置成浓度为0.44mg/mL的齐墩果酸标准品溶液。

供试品的提取：精密称取参灵草菌质粉末2g，放入50mL离心管中，加40mL无水乙醇，超声处理45min，4000r/min室温离心10 min，取200μL上清液，置于试管中，(挥干，放冷)低温(微热风) 挥干，即得供试品。

标准曲线绘制和灵芝三萜含量测定：精密吸取齐墩果酸标准品溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mL，分别置于试管中，(挥干，放冷)低温(微热风)挥去溶剂，精密加入新配置的5％香草醛冰醋酸溶液0.2 mL，再加入0.8mL高氯酸，摇匀，置70℃水浴上加热15min，立即置冰浴中冷却5min，取出，精密加入乙酸乙酯4mL，摇匀；使用酶标仪测于546吸光度，对相应的浓度(C)测定标准曲线,得回归方程。供试品吸光度测定同上，并以甲醇为空白对照组，将所的吸光度带入标准曲线计算，即得参灵草菌质中三萜含量。

3.4.3虫草素含量测定

标准品溶液的配制：精密称取虫草素标准品2.2mg，用甲醇配成 0.22mg/mL的标准品溶液，振荡混匀。

供试品的提取：精密称取参灵草菌质粉末0.1g，甲醇溶解定容至 10mL，超声提取30min，3000r/min离心5min，吸取上清液1mL，用0.22μm微孔滤膜滤过即可。

标准曲线的制备及虫草素含量测定：精密吸取虫草素标准品溶液 1mL、2mL、3mL、4mL、5mL于10mL容量瓶中，加入甲醇溶液定容，用0.22μm微孔滤膜滤过装入高液小品即可。采用高效液相色谱法(HPLC)检测虫草素含量，色谱条件如下：色谱柱：Agilent PoarisC18-A(250mm×4.6mm，5μm)，流动相甲醇-水(20：80，v/v)，流速0.8mL/min，检测波长260nm，进样20μL，30min等度洗脱。最终以质量浓度为x轴，峰面积为y轴做标准曲线。将供试品检测所得峰面积带入标准曲线，计算即得参灵草菌质中虫草素含量。

3.5单因素实验

3.5.1培养时间

实验室前期发酵过程中发现，发酵瓶菌丝在第7天长满瓶底，第 9到10天发生转色，故将时间因素起始点定于发酵开始后第10天。根据发酵过程中瓶底菌丝的生长情况，将发酵时间设定为10、12、 14、16、18、20天，太子参6g，大米24g，葡萄糖0.03g，水5mL，灵芝菌种B1.4-蛹虫草菌种B1528接种比例为2:1，总接种量为24mL。 25℃黑暗条件下培养，每个条件设置4个平行样品。在发酵的第10、 12、14、16、18、20天对发酵产物中太子参总皂苷、灵芝三萜、虫草素含量进行测定。

3.5.2添加碳源

发酵时间18天，太子参6g，大米24g，葡萄糖0.03g，水5mL，灵芝菌种B1.4-蛹虫草菌种B1528接种比例为2:1，总接种量为24mL。设低聚麦芽糖、可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖四个条件为添加碳源，添加量4‰，灵芝菌种B1.4-蛹虫草菌种B1528接种比例为2:1，总接种量为24mL。25℃黑暗条件下培养，每个条件设置4个平行样品。检测发酵产物中太子参总皂苷、灵芝三萜、虫草素的含量。

3.5.3添加氮源

发酵时间18天，太子参6g，大米24g，葡萄糖0.03g，水5mL，灵芝菌种B1.4-蛹虫草菌种B1528接种比例为2:1，总接种量为24mL。设定蛋白胨、酵母、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、硝酸钠六个条件为添加氮源，添加量均为8‰。25℃黑暗条件下培养，每个条件设置4个平行样品。检测发酵产物中太子参总皂苷、灵芝三萜、虫草素的含量。

3.5.4添加无机盐

发酵时间18天，太子参6g，大米24g，葡萄糖0.03g，水5mL，灵芝菌种B1.4-蛹虫草菌种B1528接种比例为2:1，总接种量为24mL。设定氯化铁、氯化钾、硫酸镁、硫酸锌四个条件为添加无机盐，添加量为0.05％。25℃黑暗条件下培养，每个条件设置4个平行样品。检测发酵产物中太子参总皂苷、灵芝三萜、虫草素的含量。

3.6Box-Behnken实验

响应面法是利用实验后所得数据，通过Design-Expert软件分析给出的多元二次回归方程拟合各因素与响应值之间的函数关系，以获取最优生产工艺参数的统计方法。具有精确度高、实验次数少、实验周期短等优点，与单因素分析法比，该方法能同时研究多个因素间的交互作用。Box-Behnken实验是响应面设计的一种类型。

根据上述添加碳源、添加氮源及添加无机盐单因素实验结果，确定最优单因素分别为蔗糖、硫酸铵和氯化钾。以蔗糖(A)、硫酸铵 (B)和氯化钾(C)为独立自变量，药性菌质的太子参总皂苷(Y1)、灵芝三萜(Y2)和虫草素(Y3)的含量为响应值，根据Box-Behnken 中心实验设计法设计出三因素三水平的响应面分析，完成药性菌质的最终发酵工艺优化。

表1-2 Box-Behnken试验因素与水平

3.7验证实验

Box-Behnken实验结果分析得到优化方案后，根据实验理论预测值给出的因素水平添加量进行验证实验，将验证实验检测结果与预测结果对比后进行可靠性分析，最终确定参灵草菌质最优发酵工艺。

3.8数据处理及分析

使用Microsoft Excel对上述单因素进行结果处理及分析，利用 Design-Expert12.0软件对实验数据进行响应面法试验设计和数据分析。

4实验结果

4.1单因素实验结果

4.1.1培养时间

以培养温度25℃，灵芝菌种B1.4、蛹虫草菌种B1528两菌的接种比例为2：1(接种量为24mL)，太子参粉末6g，大米24g(浸泡过夜)，为基本培养条件进行培养，之后对三种检测指标进行检测，结果见表1-3。

由表可知，发酵产物在12天时，虫草素含量最高，达到 296.04±0.41μg/g，之后几天含量呈快速下降，而太子参总皂苷和灵芝三萜的含量则是随时间的增加而增加，于第18天达到最高，分别为 45.77±1.6mg/g和3.2±0.16mg/g，之后含量均呈下降趋势，根据最终获得药性菌质提取物中各组分对哮喘的治疗作用的重要程度，以获得更多的太子参总皂苷和灵芝三萜为目标，确定最佳发酵时间为18天，之后各因素发酵时间均固定为18天。

表1-3时间因素对发酵产物中太子参总皂苷、灵芝三萜和虫草素含量的影响(n＝4)

4.1.2添加碳源

以培养温度25℃，灵芝菌种B1.4、蛹虫草菌种B1528两菌的接种比例为2：1(接种量为24mL)，太子参粉末6g，大米24g(浸泡过夜)，为基本培养条件进行培养，发酵18天后对三种检测指标进行检测，结果见表1-4。

相对于空白对照组，不同碳源的添加对发酵产物中太子参总皂苷 (43.42±1.5mg/g)、灵芝三萜(13.92±0.49mg/g)和虫草素(58.97±0.13 μg/g)含量的影响也不相同，蔗糖对三种物质含量的增加均有促进作用，葡萄糖、麦芽糖和可溶性淀粉则对灵芝三萜和虫草素的生成有明显抑制作用，故确定添加碳源为蔗糖。

4.1.3添加氮源

以培养温度25℃，灵芝菌种B1.4、蛹虫草菌种B1528两菌的接种比例为2：1(接种量为24mL)，太子参粉末6g，大米24g(浸泡过夜)，蔗糖4g/kg，为基本培养条件进行培养，发酵18天后对三种检测指标进行检测，结果见表1-5。

以硫酸铵为添加氮源时，太子参总皂苷(26.75±0.46mg/g)和灵芝三萜(3.66±0.11mg/g)含量较之空白对照组均有明显增加，而各添加氮源组的虫草素含量较之空白对照组下降明显，其中硝酸钠组的三项检测指标含量均最低，因此原则添加氮源为硫酸铵。

表1-4不同添加碳源对发酵产物中太子参总皂苷、灵芝三萜和虫草素含量的影响(X±S，n＝4)

表1-5不同添加氮源对发酵产物中太子参总皂苷、灵芝三萜和虫草素含量的影响(n＝4)

4.1.4添加无机盐

以培养温度25℃，灵芝菌种B1.4、蛹虫草菌种B1528两菌的接种比例为2：1(接种量为24mL)，太子参粉末6g，大米24g(浸泡过夜)，蔗糖4g/kg，硫酸铵8g/kg为基本培养条件进行培养，发酵 18天后对三种检测指标进行检测，结果见表1-6。

表中可知，添加氯化钾组太子参总皂苷(12.86±0.43mg/g)、灵芝三萜(1.82±0.02mg/g)和虫草素(543.85±0.28μg/g)含量均较空白组有所增加，氯化铁、硫酸锌和硫酸镁对总皂苷和总三萜含量变化影响不大，但氯化铁对虫草素生长具有明显的抑制作用，硫酸锌和硫酸镁均有一定的抑制虫草素生长的作用。综合考虑最终确定添加无机盐为氯化钾。

表1-6不同添加无机盐对发酵产物中太子参总皂苷、灵芝三萜和虫草素含量的影响(n＝4)

4.2 Box-Behnken实验结果

在单因素实验的基础上，选择添加碳源、添加氮源、添加无机盐的添加量为影响因素，分别以虫草素、灵芝三萜含量及太子参总皂苷含量为评价指标，进行三因素三水平响应面分析实验，但因虫草素含量检测结果不稳定且差异性较大，综合考虑后，本实验最终确定以太子参总皂苷和灵芝三萜含量作为最终评价指标进行分析。结果如表 1-7、表1-8、表1-9：

利用Design Expert 12软件对蔗糖(A)、硫酸铵(B)、氯化钾(C) 三个因素对太子参总皂苷(Y1)、灵芝三萜(Y2)进行响应面分析，建立三元二次回归方程，如下：

Y1＝20.73-0.27625*A+0.84375*B+0.125*C+0.505*AB+0.2075*AC+1.1 325*BC-3.75417*A2-5.02917*B2-3.62667*C2

Y2＝0.99-0.012375*A+0.0275*B+0.069875*C+0.0125*AB+0.02225*A C-0.0075*BC-0.096125*A2-0.066375*B2-0.031125*C2

由表1-8、1-9中的方差分析可以看出，太子参总皂苷和灵芝三萜回归模型P<0.05，说明回归模型达到显著水平，失拟项P(太子参总皂苷)＝0.0657>0.05，P(灵芝三萜)＝0.7080>0.05，差异不显著，表明该未知因素对试验结果干扰较小，残差均由随机误差所引起。模型的相关系数R²(太子参总皂苷)＝0.9555，R²(灵芝三萜)＝0.8960，说明该模型拟合度较好，实验误差较小，模型成立。

表1-7 Box-Behnken试验因素与水平

表1-8回归模型方差结果分析(太子参总皂苷)

注：R-Squared＝0.9555，Adj R-Squared＝0.79600.8753，Adeq Precision＝10.4544

表1-9回归模型方差结果分析(灵芝三萜)

注：R-Squared＝0.8960，Adj R-Squared＝7087，Adeq Precision＝7.1068

由表中F值可看出，各考察因素对参灵草菌质太子参总皂苷含量影响因素次序为B(硫酸铵)>A(蔗糖)>C(氯化钾)，灵芝三萜为C(氯化钾)>B(硫酸铵)>A(蔗糖)。根据回归方程作响应曲面图，结果见图2、图3，响应面在底面的投影为等高线，其形状反映了两种因素交互影响的大小，响应面曲面图的最高点为交互因素的最佳条件。

基于该模型，为确定各因素的最佳取值，Y分别对A、B、C的偏导为零，对拟合出的二次方程求导，得出方程组，求解方程组，对结果四舍五入取整数蔗糖(A)＝5.227g/kg、硫酸铵(B)＝8.373g/kg、氯化钾(C)＝0.40g/kg，结合单因素实验结果，得最佳培养条件和培养基组成为：蔗糖5.227g/kg、硫酸铵8.373g/kg、氯化钾0.40g/kg，蛹虫草-灵芝接种比例为1:2(共24mL)，太子参添加量为(6g/30g)，培养时间18天。在上述条件下太子参总皂苷、灵芝三萜含量的预测值分别为18.857mg/g和0.997mg/g。

4.3验证实验结果

为检验Box-Behnken实验模型是否可靠，结合实验操作的实际情况，将预测值中各种添加物质的添加量进行调整，最终确定发酵条件为蔗糖 5g/kg、硫酸铵8g/kg、氯化钾0.40g/kg，灵芝、蛹虫草的接种比例为2：1(共24mL)，太子参添加量为(6g/30g)，培养时间18天，同时设置原始固体培养基为空白对照组，每组4个平行实验。在上述条件下发酵获得的参灵草菌质中太子参总皂苷和灵芝三萜的含量分别为17.51±0.12mg/g和1.10±0.01mg/g，与预测值基本一致，其中太子参总皂苷含量较优化前提高了11.26％。

5讨论

本发明以灵芝(菌种B1.4)、蛹虫草(菌种B1528)作发酵菌株，以太子参粉末、大米和水组成初始药性基质，将两菌在药性基质上进行共培养，使两种药用真菌与太子参药性基质进行固体发酵，达到提升发酵产物中重要活性成分含量、产生潜在的新物质及新功能的目的。研究表明，发酵后太子参、灵芝和蛹虫草的重要有效成分太子参总皂苷、灵芝三萜和虫草素含量均发生了变化。

基于前期工作基础，确定灵芝与蛹虫草两菌可兼容生长。灵芝菌 B1.4与蛹虫草B1528两菌共培养过程中重要成分灵芝三萜和虫草素均有明显提升，且不同比例菌液的共培养，所得发酵产物的生物量与活性成分含量也有明显差异。此外，培养基的组成会对发酵产物中重要活性成分含量的变化产生显著影响。在单以大米作为固体培养基时，固体发酵产物中虫草素与灵芝三萜的含量与添加有太子参的固体培养基培养出来的发酵产物相比含量变化明显，证明采用外源中药作为添加物对提高发酵菌株活性代谢产物的生物合成具有正向调控作用。作为外源中药的太子参，过高的添加量也会对发酵后所获得发酵产物中的活性成分含量有着明显抑制作用。

本实验将灵芝和蛹虫草菌液按2：1的比例混合后，与太子参药性基质进行固体发酵，不同于以往的单菌双向固体发酵，两种药用真菌在共培养的过程中形成了稳定的互作关系，通过共培养，可提高发酵产物中多种活性物质的含量，产生潜在的新物质。这可能是由于共培养系统中存在更为丰富的酶系统，再加上生物诱导效应利用了中间代谢物，使发酵产物中活性物质发生了复杂的生物转化，促进了发酵产物的形成。利用真菌与真菌的相互作用进行共培养，可以调节生物活性产物的代谢方式，诱导其产生细胞外次级代谢产物，除此之外，还可以诱导不同酶的产生。用共培养进行真菌发酵，是增加天然产物库的有效方法之一，不仅能够帮助发现新的次级代谢产物，还可以激活微生物的生产力。在本实验中除了真菌之间的共培养作用，还使用了太子参药性基质作为共培养环境，太子参的有效活性成分也会影响共培养产物中次级代谢产物的产量。

不同有效成分在不同条件下的生成情况也不尽相同，通过单因素实验确定双向固体发酵过程中所需的添加碳源、添加氮源、添加无机盐和最佳培养时间，研究在不同生长条件下活性成分的变化情况。实验结果显示，发酵过程中最佳的添加碳源、添加氮源和添加无机盐分别为蔗糖、硫酸铵，氯化钾，最佳培养时间为18天。

采用Box-Behnken实验对影响发酵产物中活性物质含量及产量的因素：蔗糖、硫酸铵、氯化钾的添加水平进行了优化，得到了二次经验模型，对模型进行求解，得到各因素的最优预测值，分别为蔗糖 (A)＝5.227g/kg、硫酸铵(B)＝8.373g/kg、氯化钾(C)＝0.40g/kg。为了方便实验过程中的可操作性，将最佳预测值进行四舍五入后确定为蔗糖5g/kg、硫酸铵8g/kg、氯化钾0.4g/kg。

结合本实验的前期工作情况，确定双向固体发酵过程中最佳培养条件为发酵时间18天，培养温度25℃，太子参6g，大米24g，水6 mL，蛹虫草-灵芝接种比例为2:1(总接种量为24mL)，添加碳源为蔗糖5g/kg、添加氮源为硫酸铵8g/kg，添加无机盐为氯化钾0.4g/kg。

本实验使用共培养固体发酵技术，利用灵芝和蛹虫草两种药用真菌与太子参药性基质进行生物转化，通过药用真菌的酶类物质将中药底物进行结构改造和修饰，同时利用太子参药性菌质为两菌生长提供营养，进而得到一种全新的产物——参灵草菌质。经过优化后的参灵草菌质中的太子参总皂苷、灵芝三萜含量均有所提升，也证明了参灵草菌质发酵过程中实现了微生物转化。通过本实验所得结果，可以为药用真菌生物转化中药的未来发展提供可行性依据和实验操作参考。二、参灵草菌质对哮喘小鼠气道炎症的干预作用研究

1实验材料

1.1实验动物与药物

1.1.1动物来源

80只SPF级BALB/C雄性小鼠(均购于长沙天勤实验动物中心，实验动物许可证号：SCXK(湘)2019-0014)，体重18～22g。将小鼠置于温度较稳定(25℃左右)的饲养房中喂养，饲养过程中给予小鼠充足的SPF级固体颗粒饲料和无菌水(经高压灭菌)，饲养期间保持环境安静整洁，定时更换小鼠垫料和饮用水。

1.1.2实验用药

药物原料来源及乙醇提取物的制备：

(1)药物原料来源：太子参(产地：贵州，批号：20111903，生产厂家：安国市广济药业有限责任公司)、醋酸地塞米松片(批号： 2006026，生产厂家：新乡市常乐制药有限责任公司)为当地一品药业采购；灵芝-蛹虫草共培养产物以及参灵草菌质均为本实验室通过固体发酵所得。

(2)实验药物制备：

①制备方法：使用80％乙醇超声提取，时间为2小时，重复三次，提取料液比为1:15，三次提取的药液混合在一起，进行减压浓缩，直至旋转蒸发仪冷凝管中无液体流下，浸膏无醇味、流动性差。

②不同药物乙醇提取物的制备：参灵草菌质乙醇提取物的制备：称取1kg参灵草菌质，按①中方法提取，减压浓缩获得浸膏180.8g，提取率为18.08％；太子参乙醇提取物的制备：称取太子参粉末200g，按①中方法提取，减压浓缩获得浸膏26.7g，提取率为13.34％；灵芝 -蛹虫草共培养产物乙醇提取物的制备：称取灵芝-蛹虫草共培养产物 200g，提取方法同①，获得浸膏82.5g，提取率为41.25％。灌胃给药时根据所需给药浓度使用生理盐水配置。

③阳性药物：将醋酸地塞米松片研磨成粉，每日灌胃给药前使用生理盐水配置成一定浓度，备用。

(3)致敏液与激发液配置：

卵清蛋白(OVA)致敏液：称取5mg OVA(Ⅴ级：sigma-Aldrich) 溶于10mL磷酸盐缓冲液(PBS)，配制而成浓度为0.5mg/mL的OVA 溶液，与等量氢氧化铝凝胶(sigma-Aldrich)混合，震荡混匀，所得混悬液为OVA致敏液，现用现配。

5％OVA雾化激发液：取5g OVA粉末(II级：sigma-Aldrich)溶于100mL PBS中，振荡混匀，现用现配。

2实验方法

2.1支气管哮喘小鼠模型的建立

2.1.1造模方法

致敏阶段：对除空白对照组外的其他小鼠进行腹腔注射致敏。于第0、7、14天对每只小鼠进行腹腔注射0.2mL OVA(V级)混悬液致敏，空白对照组腹腔注射等体积PBS缓冲液。每3天进行一次称重。

雾化激发阶段：于第21天起对各组小鼠进行雾化激发和灌胃给药干预，连续12天。雾化激发前1小时对所有小鼠进行灌胃给药，空白对照组和模型组给予生理盐水灌胃。除空白对照组外，其余各组小鼠均用5％OVA(II级)混悬液进行雾化激发，空白对照组小鼠给予同等体积的PBS进行雾化激发。期间观察小鼠行为反应，给药灌胃期间，要根据小鼠体重确定给药量。

2.1.2动物分组及给药

将80只雄性BALB/c小鼠于标准动物实验房中适应性喂养三天，随机分为8组，分别为空白对照组、哮喘模型组、DEX(醋酸地塞米松片0.125mg/kg)组、太子参组(200mg/kg)、灵芝-蛹虫草共培养组(200mg/kg)以及参灵草菌质高、中、低剂量组(400mg/kg、200 mg/kg、100mg/kg)，每组10只。哮喘模型组与空白对照组给予同等体积的生理盐水灌胃。每3天进行体重变化记录及进行鼠笼垫料更换，每日定时给予饲料和无菌水。

2.2动物取材

2.2.1小鼠血清的制备

取材当天，对小鼠麻醉后进行眼球取血，将所取血液进行标记，室温放置。待所有小鼠取血完毕，将离心管室温放置2h后，在离心机3500r/min，4℃的条件下离心15min，将上清液分装至200μL的离心管中，做好标记，-80℃冰箱中冷冻备用。

2.2.2支气管肺泡灌洗液(BALF)的收集

对取血后的小鼠进行脱颈处死，并进行双侧肺泡灌洗(BAL)。具体操作方法如下：将小鼠用针头固定于解剖板上，将小鼠颈部打开，暴露气管，进行气管插管后用缝合线将针管与气管固定，用4℃预冷的PBS缓冲液0.8mL、0.7mL进行2次支气管肺泡灌洗，后将支气管肺泡灌洗液回收，回收率在70-80％。将回收后的BALF于4℃， 300r/min的条件下离心10min，将上清液分装于EP管，标记后放入 -80℃冰箱冻存备用。

2.2.3小鼠肺、脾组织标本留取

小鼠处死并进行BALF收集后，将小鼠的肺组织与心脏分离，用 4℃预冷后的PBS缓冲液对小鼠肺组织进行冲洗，去除组织外围血液，用滤纸吸干组织表面液体后进行称重记录，后将小鼠左肺置于4％多聚甲醛溶液中固定，用纱布帮助肺叶完全浸入固定液，室温放置24h，用来进行病理检查；将小鼠右肺标号后迅速放入液氮中保存，待取材结束后将组织放入-80℃冰箱中冻存备用。将小鼠脾组织分离后，用 PBS缓冲液清洗表面残留血液，滤纸吸干组织表面液体后进行称重记录。之后将小鼠脾组织迅速放入液氮中保存，待取材结束后将组织放入-80℃冰箱中冻存备用。

2.3指标检测

2.3.1行为学观察

观察实验期间小鼠是否出现哮喘症状，按时观察记录各组小鼠的活动状态、皮毛光滑度、饮食状况、二便情况以及体重变化等。

2.3.2脏器指数测定

将刚取出的小鼠肺叶和脾脏用生理盐水轻轻漂洗后，用滤纸吸干组织表面水分后精密称取肺脏、脾脏的重量，记录后计算分析。

2.3.3血清中IgE含量，BALF中IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ含量检测

使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)对小鼠血清中IgE含量，BALF 中IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ含量精选测定。严格按照试剂盒的实验步骤操作：

(1)标准品的加样：试剂盒从4℃冰箱中取出，室温环境中放置60 min，设置标准孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。

(2)加样：分别设空白孔与待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μL,然后再加待测样品10μL(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

(3)加酶：除空白空外，其余各孔加入100μL酶标试剂。

(4)温育：用封板膜封板后置于37℃温育60min。

(5)配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。

(6)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

(7)显色：每孔加入显色剂A50μL,轻轻震荡混匀，37℃避光显色 15min。

(8)终止及测定：取出酶标板后，加入终止液，15min内置于酶标仪中，以空白孔调零，450nm波长处测定吸光度。根据标准品的浓度及对应OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD 值计算出样品的相应浓度。然后将结果输入SPSS 25.0统计软件，进行统计学处理。

2.3.4肺组织中超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量的检测

(1)肺组织匀浆的制备：

准确称取各组小鼠肺组织100mg，放入EP管中，加入1mL生理盐水，用匀浆机匀浆，制备成10％的肺组织匀浆液，3000r/min、离心10min，取上清液，-80℃冻存备用。

(2)肺组织蛋白浓度的测定：

①高效RIPA裂解液配置：裂解液按RIPA与PMSF配比为100:1 配制，混匀(现配现用)。

②样本处理：准确称取肺组织样本20mg，将组织剪碎，加入 200mL裂解液，冰上放置30min，时组织充分裂解。使用组织匀浆机，将组织完全破碎，制成组织匀浆液；将裂解后的样品12000r/min 离心5min，取上清，移至EP管中，标记、备用；

③BCA工作液的制备：根据标准品和样品数量，按BCA试剂与Cu试剂50:1的比例配制成BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定，用多少配多少。

④标准品的稀释：取10mL BSA标准品用PBS稀释至100mL (样品一般可用PBS稀释)，使终浓度为0.5mg/mL。将标准品按0、 2、4、6、8、12、16、20μL加到96孔板的蛋白标准品孔中，加PBS 补足至20mL。

⑤样品稀释：将样品作3个梯度稀释(2倍、4倍、8倍稀释)，加20mL到96孔板的样品孔中，每个样本3个平行。

⑥各孔加入200mL BCA工作液，37℃放置15-30分钟。

⑦用酶标仪测定A562 nm，根据标准曲线计算出蛋白浓度。

(3)对哮喘小鼠肺组织超氧化物歧化酶(SOD)的检测

总SOD活力计算定义：每mg组织蛋白在1mL反应液中SOD 抑制率达50％时所对应的SOD量为一个活力单位(U)。

SOD检测的操作步骤：根据试剂盒说明书配制好相应的工作液， SOD检测的试剂添加量和操作步骤按表2-1进行。

表2-1 SOD检测主要试剂

(4)对哮喘小鼠肺组织丙二醛(MDA)

根据试剂盒说明书配制好相应的工作液，MDA检测的试剂添加量和操作步骤按表2-2进行。

表2-2MDA检测主要试剂

将上述各管振荡混匀，将使馆用保鲜膜扎住管口，针刺一个小孔后95℃水浴加热40min。取出后流水冷却后3500r/min离心10min。取上清，取200μL上清液至酶标板，每个样品两个复孔，酶标仪532 nm测吸光度，反复读取3次，进行数据统计。

2.4病理切片HE染色

(1)组织固定：用4％多聚甲醛固定各组小鼠肺组织24h，

(2)组织脱水：对部分组织去结缔组织后，自来水冲洗过夜，以洗去多余多聚甲醛。脱水的流程为50％乙醇(30min)，60％乙醇(30 min)，70％乙醇(30min)，80％乙醇(30min)，90％乙醇(30min)， 95％乙醇Ⅰ(30min)，95％乙醇II(30min)，无水乙醇Ⅰ(30min)，无水乙醇II(30min)。

(3)组织透明：二甲苯与无水乙醇1：1混合液(10min)，二甲苯Ⅰ (10min)，二甲苯II(10min)，使组织成透明状为止。

(4)组织浸蜡与包埋：透明后将组织分别于60℃的石蜡Ⅰ和石蜡II 中浸蜡1h，使石蜡完全浸入组织中。肺叶包埋时取肺叶的最大面作为包埋面，由于肺叶较轻，包埋时需将肺叶按实于包埋盒底部，展平，包埋后写清组织编号。

(5)切片:将蜡块固定于切片机，切片厚度为5μm，切片后于42℃恒温水浴锅中展片，37℃恒温箱中烘片过夜。

(6)切片脱蜡：将石蜡切片依次放入二甲苯Ⅰ(20min)、二甲苯II (20min)、二甲苯Ⅲ(20min)、无水乙醇Ⅰ(5min)、无水乙醇II(5 min)、95％乙醇(5min)、90％乙醇(5min)80％乙醇(5min)、70％乙醇(5min)，然后蒸馏水浸洗5min。

(7)染色：玻片入苏木素染液染色2min，入盐酸酒精分化3s，自来水浸洗返蓝。玻片入伊红染液染色3min，自来水洗浸洗30s。

(8)脱水、透明及封片：按无水乙醇I、无水乙醇II，二甲苯Ⅰ、二甲苯II的顺序进行脱水透明，于通风橱内自然风干后用中性树胶封片，最后镜检。

2.5数据统计

实验数据应用ExceL与SPSS 25.0软件进行统计学处理，所有数据用均数±标准差表示，检验水准α＝0.05。以P<0.05为差异有统计学意义，P>0.05为差异无统计学意义。肺组织进行HE染色后，显微镜镜检，图像采集分析。

3实验结果

3.1各组小鼠的一般状态

致敏阶段，致敏小鼠体重增长趋势正常，精神状况和活动状态等与空白组无明显差异。雾化开始后(即第21天)，各组致敏小鼠均出现打喷嚏、呼吸频率增加、腹肌收缩、烦躁等典型哮喘发作症状，并伴有扎堆聚集、行动迟滞等状况。空白对照组小鼠实验期间体重增长平稳，其余各组小鼠致敏阶段体重平稳增长，但第21天开始进行每日的雾化激发及给药后，体重均出现了下降的情况，除模型组小鼠外其余各组哮喘小鼠均随着时间变化有所提升，以上情况提示哮喘小鼠模型造模成功。首次雾化激发结束后，部分小鼠出现竖毛等情况，随着雾化激发次数的增加，模型组大部分小鼠出现毛色无光泽、竖毛，食欲明显下降、食量减少严重，精神萎靡、二便失禁和体重明显下降等现象，且持续时间较长。其余各组小鼠雾化激发前期虽同样出现上述情况，但在灌胃给药几天后上述现象均有所减轻，其中参灵草菌质高剂量组和醋酸地塞米松(DEX)组的小鼠给药后体重上升最明显。

3.2 HE染色结果分析

图4显示，空白组小鼠肺内结构清晰，肺泡间隔未见增厚，无充血、水肿及炎性细胞浸润。OVA诱导的BA小鼠肺组织HE染色均可见不同程度的气道壁增厚，管腔狭窄，血管及结缔组织周围炎性细胞浸润等现象。模型组小鼠肺支气管上皮细胞显著增生，排列紊乱，血管和支气管周围可见大量炎性细胞浸润。其余各组肺泡炎症仍较明显，肺泡结构紊乱、间隔增宽，但与模型组对比程度均有所减轻。参灵草菌质高剂量组与DEX组虽有轻微炎症反应，但肺泡结构较模型组明显清晰，炎症较轻，并且参灵草菌质高剂量组炎症情况较DEX 组轻。HE染色结果提示DEX、太子参醇提物、共培养产物醇提物和参灵草菌质醇提物均有减轻BA小鼠气道炎症的作用，其中参灵草菌质高剂量组减轻气道炎症作用效果最佳。

3.3参灵草菌质对BA小鼠肺脏、脾脏指数的影响

图5显示，与空白对照组相比，模型组和参灵草菌质中剂量组肺脏指数明显增加(P<0.05)，其余各组肺脏均有不同程度的增加，但无统计学意义(P>0.05)，提示肺部可能出现炎性水肿；与模型组相比，各给药组小鼠肺脏指数均有显著下降(P<0.05)，提示小鼠肺组织水肿较轻，其中给药组中菌质高剂量组小鼠肺脏指数最小，说明水肿程度最轻。

脾脏是机体的最大免疫器官，是发生免疫应答和产生免疫效应的重要场所。本实验希望通过对各组实验小鼠脾脏的分析，辅助研究参灵草菌质对BA小鼠免疫系统的影响。但通过分析后发现，模型组、参灵草菌质中低剂量组小鼠脾脏指数无显著性差异(P>0.05)，除DEX 组外，各给药组小鼠脾脏指数与模型组均无显著差异(P>0.05)。

注：与空白组相比，^#P<0.05；与模型组相比，^*P<0.05；与DEX 组相比^○P<0.05；与共培养组相比^△P<0.05；与太子参组相比^▲P<0.05

3.4参灵草菌质对BA小鼠血清中IgE含量的影响

由图6可知，与空白对照组相比，除DEX组外，其他OVA诱导的BA小鼠血清中IgE含量均显著增加，其中哮喘模型组小鼠血清中 IgE含量(15.18±1.1μg/mL，P<0.05)最显著，DEX组血清IgE含量虽有所增加，但无统计学意义(P>0.05)。参灵草菌质高、中低剂量组均能显著降低哮喘小鼠血清中IgE水平，与模型组相比具有显著性差异(13.2±0.8μg/mL、13.86±0.35μg/mL、14.63±0.69μg/mL，P<0.05)；太子参和灵芝-蛹虫草共培养组与模型组相比具有显著性差异 (13.29±0.75μg/mL、13.72±1.08μg/mL，P<0.05)；参灵草菌质高剂量组血清IgE含量与太子参组和共培养组差异无统计学意义。

注：与空白组相比，^#P<0.05；与模型组相比，^*P<0.05；与DEX组相比^○P<0.05；与共培养组相比^△P<0.05；与太子参组相比^▲P<0.05。

3.5参灵草菌质对BA小鼠BALF中IL-4含量的影响

图4可知，与空白对照组(112.75±10.51pg/mL)相比，各组BA小鼠BALF中IL-4含量均显著提升，差异有统计学意义(P＜0.05)；其中模型组(188.6±9.5pg/mL)小鼠升高最为显著。与模型组的对比， DEX组(136.63±7.47pg/mL)和参灵草菌质高剂量组(140.6±3.79pg/mL)小鼠BALF中IL-4含量均显著下降(P＜0.05)，太子参组 (157.24±3.48pg/mL)、共培养组(156.8±10.34pg/mL)、参灵草中剂量(155.27±10.1pg/mL)与低剂量组(143.4±8.57pg/mL)BA小鼠 BALF中IL-4含量较模型组均有显著下降(P＜0.05)，但下降程度较 DEX组和菌质高剂量组小。参灵草菌质高、低剂量组BALF中IL-4 含量较太子参组和共培养组相比显著降低(P＜0.05)。

3.6参灵草菌质对BA小鼠BALF中IL-5含量的影响

图7可知，与空白对照组(26.28±2.43pg/mL)相比，DEX组 (29.25±2.37pg/mL)和参灵草菌质高剂量组(27.34±1.05pg/mL)小鼠BALF中IL-5含量接近，统计结果为无显著性差异(P>0.05)，其余各组BA小鼠BALF中IL-5含量均显著提升，差异有统计学意义 (P＜0.05)；模型组(63.61±5.82pg/mL)BA小鼠IL-5含量是空白组小鼠的3倍左右。与模型组的对比，DEX组和参灵草菌质高剂量组小鼠BALF中IL-5含量均显著下降(P＜0.05)，IL-5的含量检测结果接近空白对照组。太子参组(35.78±0.99pg/mL)、共培养组 (30.39±3.3pg/mL)、参灵草中剂量(31.69±2.34pg/mL)与低剂量组 (41.05±4.05pg/mL)BA小鼠BALF中IL-5含量较模型组均有显著下降(P＜0.05)。注：与空白组相比，^#P<0.05；与模型组相比，^*P<0.05；与DEX组相比^○P<0.05；与共培养组相比^△P<0.05；与太子参组相比^▲P<0.05。

3.7参灵草菌质对BA小鼠BALF中IL-13含量的影

图8可知，与空白对照组(36.55±7.74pg/mL)相比，除DEX组 (38.92±6.68pg/mL)外，其余各组BA小鼠BALF中IL-13含量均显著提升(P＜0.05)；其中模型组(53.15±7.9pg/mL)小鼠升高最明显。与模型组的相比，DEX组、太子参组(47.86±2.35pg/mL)、共培养组(51.14±4.35pg/mL)、参灵草菌质高剂量组(42.22±6.13 pg/mL)、参灵草中剂量(46.0±7.34pg/mL)与低剂量组(53.09±6.59 pg/mL)BA小鼠BALF中IL-13含量较模型组均有所下降，但只有 DEX组和菌质高剂量组与模型组有显出差异(P＜0.05)，其余各组 BA小鼠BALF中IL-13含量与模型组对比，均无统计学意义。

3.8参灵草菌质对BA小鼠BALF中IFN-γ含量的影响

图8显示，与空白对照组(1027.7±81.53pg/mL)相比，参灵草菌质高剂量组(971.39±79.13pg/mL)BALF中IFN-γ含量无明显差异，其余各组BA小鼠BALF中IFN-γ含量均明显下降(P＜0.05)；其中模型组(781.61±53.31pg/mL)小鼠模型下降最明显。与模型组的相比，DEX组(839.94±53.75pg/mL)和共培养组(833.96±79.16pg/mL) 无明显差异(P>0.05)，参灵草菌质各剂量组IFN-γ有明显提升 (P<0.05)，其中参灵草高剂量组(971.39±79.13pg/mL)BA小鼠BALF 中IFN-γ含量上升明显，且差异具有统计学意义。

注：与空白组相比，^#P<0.05；与模型组相比，^*P<0.05；与DEX组相比^○P<0.05；与共培养组相比^△P<0.05；与太子参组相比^▲P<0.05。

3.9参灵草菌质对BA小鼠肺组织中SOD活性和MDA含量的影响

图9显示，与空白对照组(171.91±9.46U/mgprot)比较，模型组小鼠(76.57±5.61U/mgprot)肺组织匀浆中SOD活性明显下降(P<0.05)，其中模型组SOD活力下降约为空白组的两倍，各给药组 SOD活力有不同程度的下降(P<0.05)。与模型组对比，给药组BA 小鼠肺组织匀浆中SOD活力均有所上升，但太子参组上升不显著 (P>0.05)，其中DEX组(132.77±15.09U/mgprot)与参灵草菌质高剂量组(123.82±9.41U/mgprot)SOD活力上升最大。与太子参组和共培养组相比，参灵草菌质高剂量组SOD活力上升更显著。

与空白组(6.52±0.67nmol/mgprot)相比，各组BA小鼠肺组织匀浆中MDA含量均有显著升高(P<0.05)。与模型组 (17.16±2.09nmol/mgprot)对比，DEX组、太子参组、共培养组和参灵草菌质高中低剂量组(11.03±1.43nmol/mgprot、9.12±0.64 nmol/mgprot、10.20±0.77nmol/mgprot、10.20±0.77nmol/mgprot、 9.40±0.31nmol/mgprot、9.03±0.59nmol/mgprot)MDA含量下降明显 (P<0.05)。注：与空白组相比，^#P<0.05；与模型组相比，^*P<0.05；与DEX组相比^○P<0.05；与共培养组相比^△P<0.05；与太子参组相比^▲P<0.05

4讨论

4.1 BA小鼠模型制备的评价

成功制备BA动物模型对研究BA的发病机制以及对BA的控制与治疗有着重要意义。OVA诱导BA小鼠模型是现代BA研究中最常使用的模型制备方法之一。实验过程中，OVA诱导的BA小鼠在经过5％OVA雾化激发后，出现咳嗽、抓鼻、呼吸频率增加、节律性呼吸等典型哮喘发作症状，并伴有扎堆聚集、行动迟滞、二便失禁和体重下降等情况。肺组织HE染色结果显示OVA诱导的BA小鼠支气管上皮细胞显著增生，排列紊乱，管腔狭窄，血管和支气管周围可见大量炎性细胞浸润，气道壁增厚等现象。BA小鼠雾化激发后出现的行为学表现和肺组织病理染色结果显示本实验OVA诱导致敏的BA 小鼠模型制备成功。

4.2参灵草菌质对BA小鼠气道炎症的干预作用

各组小鼠HE染色肺组织病理形态组织图中，空白组小鼠肺内结构清晰，肺泡间隔未见增厚，无充血、水肿及炎性细胞浸润。模型组小鼠肺支气管上皮细胞显著增生，排列紊乱，血管和支气管周围可见大量炎性细胞浸润。其余各剂量组仍有较明显的肺泡结构紊乱，肺泡间隔增宽，成纤维细胞明显增多，但较模型组均有所减少，总体有一定改善。参灵草菌质高剂量组有轻微炎症反应，但肺泡结构较清晰，炎症情况同DEX组相似，但炎症浸润情况更轻，气道壁相对较薄。上述结果提示，参灵草菌质高剂量组降低BA小鼠肺组织中炎性细胞浸润，改善肺组织病理损伤的效果最好。

本实验研究发现，使用OVA诱导、激发的哮喘小鼠血清中的IgE 水平均有明显升高，参灵草菌质各剂量组均能显著减少哮喘小鼠血清中IgE水平，表明参灵草菌质能有效缓解哮喘发作。

本实验研究结果显示，在BA模型组小鼠BALF中，IL-4、IL-5、 IL-13水平明显高于空白对照组，这也与目前相关研究保持一致。而经参灵草菌质干预后的BA模型小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13水平较模型组显著降低，IFN-γ水平明显升高，提示参灵草菌质可以具有通过抑制哮喘炎性因子释放来减轻气道炎症的作用。

本实验结果显示，与空白对照组相比较，哮喘模型组小鼠肺组织中MDA含量增高，SOD活力降低，证明在哮喘模型组中存在氧化应激损伤。而经参灵草菌质给药干预后，参灵草菌质干预组小鼠肺组织中MDA含量较哮喘模型组小鼠降低，SOD活力增高，显示参灵草菌质可提高体内抗氧化酶系的活力，具有抗氧化应激的作用。

结论:1、通过对发酵条件和培养基进行优化，可以有效的提高参灵草菌质中重要活性成分(太子参总皂苷、灵芝三萜)的含量。

2、参灵草菌质醇提物能有效减轻哮喘小鼠肺组织中炎性细胞浸润程度，降低BA小鼠血清中IgE的含量，降低BALF中IL-4、IL-5和IL-13 的含量，升高IFN-γ的含量，进而显著改善BA小鼠的气道炎症。

3、参灵草菌质醇提物可以通过提高BA小鼠肺组织匀浆中SOD活性，降低MDA含量，清除体内自由基，增强机体的抗氧化能力，减少氧化应激。

Claims (3)

1.一种显著改善支气管哮喘炎症的参灵草菌质提取物，其特征在于，该参灵草菌质提取物采用包含以下步骤的方法进行制备：

（1）改良PDA培养基的配制：将土豆削皮，称取200g，洗净、切块，倒入带盖的锅中，加水500mL小火煮沸30min直至土豆煮烂；然后用四层纱布过滤，水补足1000mL搅拌均匀，分装于锥形瓶，按2%葡萄糖、2%琼脂、1%蛋白胨的重量配置比例加入葡萄糖、琼脂、蛋白胨，pH自然，加塞，外面再用报纸包一层，然后用橡皮筋缠下，写上编号、标记及日期，灭菌条件：121℃，30min；

（2）改良液体马铃薯培养基的配制：操作同步骤（1）改良PDA培养基的配制，但配方中不加入2%琼脂，其余均不变；

（3）固体药性培养基的配制：将太子参药材，60℃热风干燥，粉碎过60目筛，往培养瓶中称取适量大米，浸泡过夜，然后称取一定比例太子参粉末于其中，加水适量，使含水量达20-30%，混合均匀写上编号、标记及日期pH自然，121℃，60min条件灭菌；

（4）菌种的活化：沾取斜面保存的灵芝菌种B1.4和蛹虫草菌种B1528的孢子，分别用接种环接在改良PDA培养基上，在培养皿的背面标记时间、日期、姓名，分别放入26℃和20℃培养箱培养，待菌丝长满培养皿后用做液体培养基；

（5）蛹虫草菌种B1528种子液的制备：无菌条件下，用手术刀从长满蛹虫草菌种B1528菌丝的平板培养皿中切出0.3×0.3cm大小的菌种，取5-7块装入有200mL种子液培养基的锥形瓶中，接种结束以后，放入25℃的恒温摇床中，200r/min，黑暗条件下培养5-7天，至种子液粘稠，含有大量大小相似的菌丝且三角瓶的瓶壁上出现外圈为白、内圈为淡黄色的菌膜；

（6）灵芝菌种B1.4种子液的制备：无菌条件下，用手术刀从长满灵芝菌种B1.4菌丝的平板培养皿中切出0.3×0.3cm大小的菌种，取5-7块装入有200mL种子液培养基的锥形瓶中，接种结束以后，放入25℃的恒温摇床中，200r/min，黑暗条件下培养7-10天，直至培养液澄清、含有大量细小星芒状菌球、大小均匀，且三角瓶壁上出现一圈白色菌膜；

（7）固体发酵：初始固体培养基成分为浸泡过夜的大米24g，太子参粉末6g，固体培养基灭菌60min后室温冷却，无菌条件下取灵芝菌种B1.4和蛹虫草菌种B1528两菌种子液按2：1比例混匀，吸取两菌混合液24mL加入到初始固体培养基中，用灭菌过的玻璃棒将其均匀搅拌，封口膜封口后放入25℃恒温培养箱中，黑暗条件下培养18d，添加碳源为蔗糖5g/kg、添加氮源为硫酸铵8g/kg，添加无机盐为氯化钾0.4g/kg，发酵结束后，产物60℃干燥后即得参灵草菌质；

（8）参灵草菌质提取物制备：称取一定量的参灵草菌质，使用80%乙醇超声提取，时间为2小时，重复三次，提取料液比为1:15，三次提取的药液混合在一起，进行减压浓缩，直至旋转蒸发仪冷凝管中无液体流下，浸膏无醇味、流动性差，得参灵草菌质提取物。

2.权利要求1制得的参灵草菌质提取物在制备治疗支气管哮喘炎症药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：取参灵草菌质提取物，制成包括颗粒剂、胶囊剂、片剂、注射剂、口服液、滴丸剂在内的药剂上可以接受的剂型。