CN104905262A - 一种制备虫草灵芝复合制剂的方法 - Google Patents

一种制备虫草灵芝复合制剂的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种制备虫草灵芝复合制剂的方法，采用高密度微颗粒培养技术培养蛹虫草菌、灵芝菌，减压真空干燥得蛹虫草菌颗粒干粉、灵芝菌颗粒干粉；干粉采用低温超微粉碎破壁和高压均质破壁技术相结合充分释放生物活性物质；60Co-γ辐照常温充分高效提取组织或结构物质中的生物活性物质；经葡聚糖聚合，聚乙二醇和甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰，得蛹虫草灵芝生物活性物质亚微米包被颗粒，粒径200～700nm，再添加水苏糖、紫苏油灌装软胶囊，或添加甘露醇压片，得片剂。本发明采用高酶活、富营养、强增氧，高剪切制备菌体原料，产率高效益明显；生物活性物质损失小得率高；专一导向肠胃吸收，无损失，吸收好，效率效益突出，成本低。

Description

一种制备虫草灵芝复合制剂的方法
技术领域
本发明涉及一种食用菌复合制剂的制备方法，具体的涉及一种制备虫草灵芝复合制剂的方法。
背景技术
蛹虫草(Cordyceps militaris)，属子囊菌亚门，麦角菌目，麦角菌科、虫草属的模式种。蛹虫草含有多种活性物质，包括虫草多糖、虫草素、虫草酸、腺苷、核苷、麦角甾醇、SOD等。经临床医学证明，人工培养的蛹虫草与天然的冬虫夏草具有相似的活性物质和药理作用，且虫草素和虫草多糖含量更高，能够双向调节全身代谢、提高免疫能力、增强巨噬细胞的吞噬功能、促进抗体的形成，主要有保肺益肾养肝、止咳平喘祛痰、润肤防皱抗衰老、抗菌抗炎、镇静、扩张血管、降低血压、降低血糖、抗疲劳、耐缺氧等作用。目前，国内蛹虫草栽培和加工业鱼龙混杂，品质和质量难以保障，国内蛹虫草菌种多来自野生种驯化，无性繁殖和购买杂交种转管等，存在菌种质量良莠不齐，活性物质含量不可靠，子实体产量不稳定等现象；蛹虫草加工技术简单、缺乏创新、无核心技术、有效吸收利用率低，重形式、炒概念、轻效果，不能为民众和市场提供可靠产品。
灵芝(Ganoderma Lucidum)，属担子菌亚门，多孔菌目，灵芝科，灵芝目灵芝属灵芝种。灵芝分为赤芝、黑芝、青芝、白芝、黄芝、紫芝。赤灵芝主要活性物质有灵芝多糖、麦角甾醇、三萜、生物碱、有机锗、氨基酸等。经临床医学证明，赤灵芝具有调节免疫、延缓衰老、改善记忆、抗疲劳、耐缺氧、抗辐射、抗突变、抑制肿瘤、调节血气、调节血糖、改善肠胃功能、改善睡眠、护肝、美容、调节血压等作用。
现有用虫草灵芝制备的制剂，如CN103549386公布的复合虫草灵芝组合物，其中虫草菌粉100-300份，灵芝菌粉100-220分、云芝菌粉100-220份。CN101559073公布的虫草灵芝多糖复合制剂，虫草多糖1-9，灵芝多糖1-9，其多糖含量大于30％，腺苷含量大于0.1，甘露醇含量度2％。
发明内容
本发明的目的是针对上述现状，旨在提供一种生物活性物质提取率高，含量高，不破坏虫草灵芝功能成分，能专一导向肠道吸收，靶向性强，易吸收利用率高的制备虫草灵芝复合制剂的方法.。
本发明目的的实现方式为，一种制备虫草灵芝复合制剂的方法.，具体步骤如下，
(1)蛹虫草、灵芝菌培养：蛹虫草、灵芝菌分别采用培养液培养出蛹虫草菌、灵芝菌；
所述1000ml培养液中营养成分比例为，碎米50～200g，蔗糖20～60g，蛋白胨5～10g，酵母粉5～10g，MgSO4/MgCl21～10g，KH2PO4/K2HPO42～8g；培养条件：温度20℃，pH 5～7，剪切转速500～1600rpm；
其中MgSO4/MgCl2＝1:1，KH2PO4/K2HPO4＝1:1；
(2)将步骤(1)所得的蛹虫草菌、灵芝菌于60～90℃、减压真空干燥24～48h，至含水量8～12％；减压真空压力3kPa；
(3)将经步骤(2)干燥的蛹虫草菌颗粒干粉、灵芝菌颗粒干粉按蛹虫草菌颗粒干粉50～90％，灵芝菌颗粒干粉10～50％比例置于超微粉碎破壁，于低温温度4～10℃超微粉碎破壁，转速100～500rpm，10kg/h；
(4)高压均质：将步骤(3)破壁后的混合粉高压均质破壁，释放生物活性物质，高压均质压力为1.2～2.0×105kPa，循环6～15次，得高压均质破壁悬浮液；
(5)辐照提取：将步骤(4)高压均质破壁悬浮液在室温下与无水乙醇按体积比为1:1～4混合；装袋封口，60Co-γ辐照提取，辐照吸收剂量为1～12kGy，得辐照提取液；
(6)亚微米颗粒制备：取葡聚糖T-40 5～10g溶于100ml二甲基亚砜中，通氮气，加1g聚乙二醇和2g甲基丙烯酸缩水甘油酯，反应修饰2～3h，加100～500ml无水乙醇，收集沉淀，沉淀溶解于20～80ml，pH 8.0的磷酸缓冲液中，通氮气，加10～30ml步骤(5)的辐照提取液，1ml引发剂APS，在70℃下聚合反应2～5h，离心30min，转速8000～20000rpm，透析24-48h；
(7)干燥：采用真空冷冻干燥，于4～10℃，真空度≦50Pa条件下干燥16～40h，获得蛹虫草灵芝生物活性物质亚微米包被颗粒，粒径200～700nm；
(8)制剂：蛹虫草灵芝生物活性物质亚微米包被颗粒添加水苏糖紫苏油灌装得软胶囊，或添加甘露醇压片得片剂。
本发明采用有性繁殖和无性繁殖并行法制种技术，通过性状和质量指标选育菌种，高酶活、富营养、强增氧、气水流对冲高速剪切液体深层发酵培养高密度液体微颗粒菌体，采用低温超微粉碎破壁和高压均质技术，充分释放生活活性物质，如多糖、虫草素、腺苷、三萜类化合物、麦角甾醇等,破壁率100％；60Co-γ辐照源辐照提取生物活性物质，提取效率高，操作简单，无污染，提取率高，利用率高；用可降解葡聚糖T-40包被活性性因子，利用聚乙二醇(PEG5000)和甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)修饰葡聚糖，制备亚微米颗粒，直接被肠道靶向吸收，避免肝脏巨噬细胞吞噬，提高直接利用率。
本发明的有益效果：本发明采用高酶活、富营养、强增氧，高剪切制备高密度液体微颗粒菌体原料，产率高效益明显；低温超微粉碎破壁与高压均质技术结合，60Co-γ辐照提取，生物活性物质损失小得率高；采用葡聚糖聚合物制备亚微米生物活性物质颗粒，专一导向肠胃吸收，无损失，吸收好，效率效益突出，成本低，易于推广。
附图说明
图1、2为无水葡萄糖对照品、虫草灵芝复合胶囊总多糖红外光谱图，
图3、4为熊果酸对照品、虫草灵芝复合胶囊总三萜红外光谱图，
图5、6为混合对照品(HPLC)、虫草灵芝复合胶囊HPLC图谱。
具体实施方式
本发明采用高密度微颗粒培养技术培养蛹虫草菌、灵芝菌；低温超微粉碎破壁和高压均质破壁技术相结合充分释放生物活性物质；60Co-γ辐照常温充分高效提取组织或结构物质中的生物活性物质；经靶向基团修饰的葡聚糖聚合物制备虫草灵芝活性物质亚微米颗粒，添加水苏糖、紫苏油灌装软胶囊，或添加甘露醇压片，得制剂。
具体步骤是：
(1)蛹虫草、灵芝菌培养：蛹虫草、灵芝菌分别采用培养液培养出蛹虫草菌、灵芝菌；
所述1000ml培养液中营养成分比例为，碎米50～200g，蔗糖20～60g，蛋白胨5～15g，酵母粉5～10g，MgSO4/MgCl21～10g，KH2PO4/K2HPO42～8g；培养条件：温度20℃，pH 5～7，剪切转速500～1600rpm；
其中MgSO4/MgCl2＝1:1，KH2PO4/K2HPO4＝1:1。
优选的，1000ml培养液中营养成分比例为，碎米80～150g，蔗糖30～50g，蛋白胨5～8g，酵母粉6～10g，MgSO4/MgCl23～8g，KH2PO4/K2HPO44～6g；培养条件：温度20℃，pH 6～7，剪切转速800～1200rpm；
其中MgSO4/MgCl2＝1:1，KH2PO4/K2HPO4＝1:1。
更优选的是，步骤(1)中，培养液中，碎米100g，蔗糖40g，蛋白胨7g，酵母粉10g，MgSO4/MgCl25g，KH2PO4/K2HPO44g；培养温度20℃，pH 6～7，剪切转速1200rpm。其中MgSO4/MgCl2＝1:1，KH2PO4/K2HPO4＝1:1。
本发明对菌种培养：采用液体深层发酵培养，富营养，即单位体积有充足的营养供高密度菌种繁殖需求；高酶活，即增加单位体积Mg2+，提高菌种繁殖代谢活力；强增氧，即保障高密度菌体繁殖供氧需求，高速剪切，即采用气水流对冲，800～1200rpm快速分离分散新生细胞，均匀分散繁殖，由此获得高密度微颗粒高含量高活性蛹虫草、灵芝菌体原料。
步骤(1)培养的蛹虫草菌种虫草多糖含量6-8％，虫草素含量3～4‰；赤灵芝菌种灵芝多糖5-8％，灵芝总三萜含量3～5％。
(2)将步骤(1)所得的蛹虫草菌、灵芝菌于60～90℃、减压真空干燥20-48h，至含水量8～12％；减压真空压力3kPa；
优选的，步骤(2)中，蛹虫草菌、灵芝菌于60～70℃，减压真空干燥40～48h，至含水量8％，减压真空度3kPa。
(3)将经步骤(2)干燥的蛹虫草菌颗粒干粉、灵芝菌颗粒干粉按蛹虫草菌颗粒干粉50～90％，灵芝菌颗粒干粉10～50％比例置于超微粉碎破壁，于4～10℃超微粉碎破壁，转速100～500rpm，10kg/h；
优选的是，步骤(3)中，蛹虫草菌颗粒干粉、灵芝菌菌颗粒干粉按蛹虫草菌颗粒干粉70～90％，灵芝菌菌颗粒干粉10～30％比例置于低温超微粉碎破壁，超微粉碎破壁转速400～500rpm；
更优选的，所述步骤(3)中，蛹虫草菌颗粒干粉、灵芝菌菌颗粒干粉按蛹虫草菌颗粒干粉80％，灵芝菌菌颗粒干粉20％，低温超微粉碎破壁转速400rpm。
步骤(3)1000ml培养液生产120～200g干菌物，菌种颗粒浓度1×105～2×105个/ml，菌种颗粒粒径0.2～0.3mm，双核细胞≥55％。
(4)高压均质：将步骤(3)破壁后的混合粉高压均质破壁，释放生物活性物质，高压均质压力为1.2～2.0×105kPa，优选的，1.6×105kPa，循环6～15次；优选的，循环10次，破壁率100％。
(5)辐照提取：将步骤(4)高压均质破壁悬浮液在室温下与无水乙醇按体积比为1:1～4混合；装袋封口，60Co-γ辐照提取，辐照吸收剂量为1～12kGy，得辐照提取液；
优选的，步骤(5)中，高压均质破壁粉与乙醇混合，料液体积比为1:2，60Co-γ辐照提取，辐照吸收剂量为选6～8kGy。
(6)亚微米颗粒制备：取葡聚糖T-40 5～10g溶于100ml二甲基亚砜中，通氮气，加1g聚乙二醇(PEG5000)和2g甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)，反应修饰2～3h，加100～500ml无水乙醇，收集沉淀，沉淀溶解于20～80ml，pH 8.0的磷酸缓冲液中，通氮气，加10～30ml步骤(5)的辐照提取液，1ml引发剂APS，在70℃下聚合反应2～5h，离心30min，转速8000～20000rpm，透析24-48h。
优选的，步骤(6)中，取葡聚糖T-40 8～10g溶于100ml二甲基亚砜中，通氮气，加1g聚乙二醇和2g甲基丙烯酸缩水甘油酯，反应修饰2～3小时，加200～300ml无水乙醇，收集沉淀，沉淀溶解于40～60ml，pH 8.0的磷酸缓冲液中，通氮气，加10～15ml步骤(5)的辐照提取液，1ml引发剂APS，在70℃下聚合反应2～5h，离心转速10000～12000rpm，透析20～30h。
更优选的是，步骤(6)中，取葡聚糖T-40 10g溶于100ml二甲基亚砜中，通氮气，加1g聚乙二醇和2g甲基丙烯酸缩水甘油酯，反应修饰3h，加200ml无水乙醇，收集沉淀，沉淀溶解于50ml，pH 8.0的磷酸缓冲液中，通氮气，加10ml步骤(5)的辐照提取液，1ml引发剂APS，在70℃下聚合反应3h，离心转速12000rpm，透析26h。
(7)干燥：采用真空冷冻干燥，温度4～10℃，真空度1～50Pa，干燥20～30h，获得蛹虫草灵芝生物活性物质亚微米包被颗粒，粒径200～700nm，包被率≧90％。
优选的，所述步骤(7)中，冷冻干燥24h。
(8)制剂：蛹虫草灵芝生物活性物质亚微米包被颗粒添加水苏糖紫苏油灌装得软胶囊，或添加甘露醇压片得片剂。
本发明的虫草灵芝胶囊制剂总多糖含量≧10％，虫草素含量≧3‰，总三萜含量≧2％。
下面参照附图说明本发明的优点：
参照图1、2，图1说明葡萄糖在625nm波长处有特征吸收峰，图2说明虫草灵芝复合制剂中总多糖经水解后在625nm处也有特征吸收峰，为同一物质葡萄糖，并且根据标准曲线的浓度和峰面积可以计算出虫草灵芝复合制剂中总多糖含量。
参照图3、4，图3熊果酸对照品在548nm波长处有特征吸收峰，三萜类化合物具有与熊果酸类似数目的芳香环和π键，所以具有相似的特征吸收峰和峰形，图4说明虫草灵芝复合制剂在波长457nm、540nm处亦有特征吸收峰，为三萜类化合物，根据标准曲线和峰面积可以计算出虫草灵芝复合制剂中总三萜含量。
参照图5、6，图5表明标准品腺苷在高压液相色谱分离过程中保留时间为10.06min，虫草素的保留时间为14.777min，图6中虫草灵芝复合制剂在相同条件下高压液相色谱分离过程中，在保留时间为10.06min、10.06min处与标准品具有相同的特征吸收峰，说明虫草灵芝复合制剂含有腺苷和虫草素，根据标准曲线浓度和峰面积可计算出虫草灵芝复合制剂中腺苷和虫草素含量。
下面用具体实施例详述本发明：
实施例1、
(1)用内含碎米50g，蔗糖40g，蛋白胨10g，酵母粉5g，MgSO41g，MgCl21g，KH2PO41g、K2HPO41g；培养条件：温度20℃，pH 5的1000ml培养液培养蛹虫草菌、灵芝菌，剪切速度为500rpm。
(2)将步骤(1)所得的蛹虫草菌、灵芝菌于90℃，真空压力3kPa，真空干燥24h，至含水量12％；
(3)将经步骤(2)干燥的蛹虫草菌颗粒干粉、灵芝菌颗粒干粉按蛹虫草菌颗粒干粉50％，灵芝菌菌颗粒干粉50％比例置于低温超微粉碎破壁，低温温度4～10℃，超微粉碎破壁转速100rpm，10kg/h；
(4)高压均质：将步骤(3)破壁后的混合粉高压均质破壁，释放生物活性物质，高压均质压力为1.2×105kPa，循环15次，细胞破壁率80～90％。
(5)辐照提取：将步骤(4)高压均质破壁悬浮液在室温下与无水乙醇按1:1(v/v)混合均匀，装袋封口，60Co-γ辐照提取，辐照吸收剂量为3kGy；
(6)亚微米颗粒制备：葡聚糖T-40 5g溶于100ml二甲基亚砜中，通氮气，加1g聚乙二醇和2g甲基丙烯酸缩水甘油酯，反应修饰3h，加200m无水乙醇，收集沉淀，沉淀溶解于20ml，pH 8.0的磷酸缓冲液中，通氮气，加10ml步骤(5)的辐照提取液，1ml引发剂APS，在70℃下聚合反应2h，离心30min，转速8000rpm，透析24h；
(7)干燥：采用真空冷冻干燥，温度4℃，真空度≦50Pa，干燥16h，获得蛹虫草灵芝生物活性物质亚微米包被颗粒，粒径600～700nm，包被率70～80％；
(8)制剂：添加水苏糖紫苏油灌装软胶囊。
本申请人作了步骤(1)中剪切速度对灵芝菌种液体深层发酵作用的活性物质及粒径的影响实验，实验结果见表1。
表1
由表1可见，剪切速度和灵芝菌体粒径、发酵生物量有明显关联，剪切速度为500rpm时，灵芝菌体粒径约为2.1mm，肉眼可清楚观察到呈小颗粒状，随着速度逐渐增大，菌体颗粒慢慢变小，速度达1200rpm时，粒径为0.5mm，呈微颗粒状，速度达1600rpm时，粒径为0.3mm，肉眼就不能直接看清，需要用显微镜观察和测量粒径。发酵生物量随着剪切速度的增大而增加，表明菌体吸收利用养分，生长增殖速度加快，剪切速度达1400rpm时，菌体粒径和发酵生物量趋于稳定。速度变化过程中，灵芝总三萜和多糖含量变化较小，说明剪切速度对灵芝菌的生长繁殖影响较大，而对生理代谢活动影响并不大。故本发明优选剪切转速800～1200rpm，更优选的剪切转速1200rpm。
实施例2，同实施例1，不同的是，
(1)1000ml培养液中含碎米100g，蔗糖40g，蛋白胨5g，酵母粉10g，KH2PO42g、K2HPO42g，MgSO4/MgCl2含量为表2配比量g数；培养条件：温度20℃，pH 6，剪切转速800rpm，培养出蛹虫草菌、灵芝菌。
(2)将步骤(1)所得的蛹虫草菌、灵芝菌于80℃、减压真空干燥30h，至含水量10％；
(3)将经步骤(2)干燥的蛹虫草菌颗粒干粉、灵芝菌颗粒干粉按蛹虫草菌颗粒干粉60％，灵芝菌菌颗粒干粉40％比例置于低温超微粉碎破壁，温度4～10℃，超微粉碎破壁转速200rpm；
(4)高压均质压力1.4×105kPa，循环12次，细胞破壁率≧90％。；
(5)辐照提取：高压均质破壁悬浮液与乙醇按1:2(v/v)混合均匀，装袋封口，60Co-γ辐照提取，辐照吸收剂量为8kGy；
(6)亚微米颗粒制备：取葡聚糖T-40 7g溶于100ml二甲基亚砜中，通氮气，加1g聚乙二醇和2g甲基丙烯酸缩水甘油酯，反应修饰2h，加500ml无水乙醇，收集沉淀，沉淀溶解于30ml pH 8.0的磷酸缓冲液中，通氮气，加30ml步骤(5)的辐照提取液，1ml引发剂APS，在70℃下聚合反应3h，离心30min，转速10000rpm，透析30h；
(7)干燥：冷冻干燥，温度10℃，真空度≦50Pa，干燥26h，获得蛹虫草灵芝生物活性物质亚微米包被颗粒，粒径500nm，包被率80～90％；
(8)制剂：添加甘露醇压片。
本申请人作了步骤(2)中MgSO4/MgCl21～10g配比量对蛹虫草液体微颗粒菌种发酵的影响，实验结果见表2。
表2
由表2可知，MgSO4/MgCl2(1:1)浓度对蛹虫草生长增殖和生理代谢有显著的影响，Mg2+从低浓度逐渐增大时，生物量在增加，说明蛹虫草菌生长繁殖加快，初级代谢产物和次级代谢产物虫草素和腺苷含量增加，说明蛹虫草菌生理代谢活动加强。当浓度达到5‰时，生物量和代谢产物比较稳定，且达到最大值，当浓度继续增加时，生物量和代谢产物仍趋于高位，但已开始下降，所以，Mg2+浓度对蛹虫草的生长繁殖和生理代谢有很紧密、很重要的关联。故MgSO4/MgCl2优选3～7g，更优选的优选5g。
实施例3，同实施例1，不同的是，
(1)1000ml培养液中含碎米150g，蔗糖20g，蛋白胨7g，酵母粉10g，MgSO42.5g、MgCl22.5g，KH2PO43g、K2HPO43g；培养条件：温度20℃，pH 7，剪切转速1000rpm培养出蛹虫草菌、灵芝菌。
(2)将步骤(1)所得的蛹虫草菌、灵芝菌于70℃、减压真空(真空度3kPa)干燥时间48h，至含水量8％；
(3)将经步骤(2)干燥的蛹虫草菌颗粒干粉、灵芝菌菌颗粒干粉按蛹虫草菌颗粒干粉70％、灵芝菌菌颗粒干粉30％置于低温(4～10℃)超微粉碎破壁，转速300rpm；
(4)将经步骤(3)破壁后的混合粉高压均值破壁，释放生物活性物质，高压均质压力1.6×105kPa，循环10次；
(5)辐照提取：高压均质破壁悬浮液在室温下与无水乙醇按1:3(v/v)比例混合，装袋封口，60Co-γ辐照提取，辐照吸收剂量为1kGy；
(6)亚微米颗粒制备：葡聚糖T-40 10g溶于100ml二甲基亚砜中，通氮气，加300ml无水乙醇，收集沉淀，沉淀溶解于50ml，pH 8.0的磷酸缓冲液中，通氮气，加30ml步骤(5)的辐照提取液，1ml引发剂APS，在70℃下聚合反应3h，离心转速16000rpm，透析35h；
(7)干燥：冷冻干燥，温度10℃，真空度≦50Pa，干燥30h，获得蛹虫草灵芝生物活性物质亚微米包被颗粒，粒径200～700nm，包被率≧90％；
(8)制剂：添加甘露醇压片。
本申请人作了步骤(3)中蛹虫草菌颗粒、灵芝菌颗粒超粉粉碎破壁转速效果研究，分别称取蛹虫草菌颗粒干粉、灵芝菌颗粒干粉10kg，低温温度4～10℃，实验结果见表3。
表3
由表3可见，随着超微粉碎转速增大，蛹虫草、灵芝细胞破壁率增加，转速为100rpm时，蛹虫草细胞破壁率为27％、灵芝细胞破壁率仅为8％，说明灵芝细胞壁的组织结构更致密，几丁质、纤维素或木质素更多，转速均匀增加，但破壁效果明显加快，速度达400rpm时，蛹虫草细胞破壁率为73％，灵芝细胞破壁率为62％，速度继续增加，破壁率增速变缓，机器连续工作能力及效率变差。
本申请人作了步骤(4)中蛹虫草菌、灵芝菌高压均质破壁均质压力效果研究，蛹虫草菌颗粒干粉、灵芝菌颗粒干粉低温超微粉碎破壁后，分别按料液比1:20(w/v)混合成悬浮液，均质压力分别为1.2×105、1.4×105、1.6×105、1.8×105、2.0×105kPa，实验结果见表4。
表4
从表4可以看出，在进料压力为1.2×105kPa时，蛹虫草细胞破壁率达90％，灵芝细胞破壁率为85％，进料压力增加到1.6×105kPa时，细胞破壁率≧93％，可以说细胞接近全破碎，在细胞破碎率数据统计时，已变得非常困难，需要分析测试大量样品，进行估算统计，所以，进料压力为1.6×105kPa时即是可以接受的理想条件。
实施例4，同实施例1，不同的是，
(1)1000ml培养液中含碎米150g，蔗糖40g，蛋白胨9g，酵母粉10g，MgSO43g、MgCl23g，KH2PO44g、K2HPO44g；培养条件：温度20℃，pH 7，剪切转速1200rpm培养出蛹虫草菌、灵芝菌。
(2)将步骤(1)所得的蛹虫草菌、灵芝菌于60℃、减压真空(真空度3kPa)干燥40h，含水量12％；
(3)将经步骤(2)干燥的蛹虫草菌颗粒干粉、灵芝菌菌颗粒干粉按蛹虫草菌颗粒干粉80％，灵芝菌菌颗粒干粉20％比例置于低温超微粉碎破壁，低温温度4～10℃，超微粉碎破壁转速400rpm，10kg/h；
(4)高压均质：将步骤(3)破壁后的混合粉高压均质破壁，释放生物活性物质，高压均质压力为1.8×105kPa，循环8次；
(5)辐照提取：将步骤(4)高压均质破壁悬浮液在室温下与无水乙醇混合，高压均质破壁悬浮液与无水乙醇的料液比为1:2(v/v)，装袋封口，60Co-γ辐照提取，辐照剂量按照表5的梯度辐照吸收量进行辐照。
(6)亚微米颗粒制备：葡聚糖T-40 8g溶于100ml二甲基亚砜中，通氮气，加1g聚乙二醇和2g甲基丙烯酸缩水甘油酯，反应修饰2h，加300ml乙醇沉淀收集，沉淀溶解于20ml，pH 8.0的磷酸缓冲液中，通氮气，加10ml步骤(5)的辐照提取液，1ml引发剂APS，在70℃下聚合反应2h，离心转速12000rpm，30min，透析40h；
(7)干燥：采用真空冷冻干燥，获得蛹虫草灵芝生物活性物质亚微米包被颗粒；温度4℃，真空度≦50Pa，干燥40h，获得蛹虫草灵芝生物活性物质亚微米包被颗粒，粒径600～1000nm，包被率70～80％；
(8)制剂：添加水苏糖紫苏油灌装软胶囊。
本申请人作了步骤(5)在不同辐照剂量辐照后，将辐照提取液离心、过滤，取上清，分别测定多糖、虫草素，总三萜含量生物活性物质提取效果分析研究，实验结果见表5。
表5
从表5可见，辐照剂量为1或2kGy时，活性物质提取率较低，虫草素和总三萜没有检测到或检测量很低，随着辐照剂量的增加，多糖检测含量逐渐增大，当剂量为12kGy时，多糖检测量为4.75g/100g。虫草素和总三萜含量随着辐照剂量的增加，先增大后降低，虫草素检测含量在辐照剂量为8kGy时达到最大值，为182mg/100g，当辐照剂量为7kGy时，总三萜的检测含量最大，为1.64g/100g。与超声提取方法比较，辐照剂量为6～8kGy时，活性物质提取效果较好。故本发明优选辐照剂量为6～8kGy。
实施例5，同实施例1，不同的是，
(1)1000ml培养液中含碎米200g，蔗糖20g，蛋白胨10g，酵母粉5g，MgSO42.5g、MgCl22.5g，KH2PO44g、K2HPO44g；培养条件：温度20℃，pH 7，剪切转速1600rpm培养出蛹虫草菌、灵芝菌。
(2)将步骤(1)所得的蛹虫草菌、灵芝菌于70℃、减压真空(真空度3kPa)干燥45h，含水量8％；
(3)将经步骤(2)干燥的蛹虫草菌颗粒干粉、灵芝菌菌颗粒干粉按蛹虫草菌颗粒干粉50％，灵芝菌菌颗粒干粉50％比例置于低温超微粉碎破壁，低温温度4～10℃，超微粉碎破壁转速500rpm，10kg/h；
(4)高压均质：将步骤(3)破壁后的混合粉高压均质破壁，释放生物活性物质，高压均质压力为2.0×105kPa，循环6次；
(5)辐照提取：高压均质破壁蛹虫草菌和灵芝菌混合液与无水乙醇在室温下混合，高压均质破壁悬浮液与乙醇的料液比为1:4(v/v)，充分混匀，装袋封口，60Co-γ辐照提取，辐照吸收剂量为5kGy；
(6)亚微米颗粒制备：葡聚糖T-40 10g溶于100ml二甲基亚砜中，通氮气，加1g聚乙二醇(PEG5000)和2g甲基丙烯酸缩水甘油酯，反应修饰2h，加300ml无水乙醇，收集沉淀，沉淀溶解于60ml，pH8.0的磷酸缓冲液中，通氮气，加20ml步骤(5)的辐照提取液，1ml引发剂APS，反应温度70℃条件下聚合反应时间5h，离心15min，转速16000rpm，透析26h；
(7)干燥：采用真空冷冻干燥，获得蛹虫草灵芝生物活性物质亚微米包被颗粒；温度4℃，真空度≦50Pa，干燥26h，获得蛹虫草灵芝生物活性物质亚微米包被颗粒，粒径200～700nm，包被率85～95％；
(8)制剂：添加水苏糖紫苏油灌装软胶囊。
本申请人作了步骤(6)中蛹虫草灵芝活性物质亚微米颗粒制备工艺中聚合反应时间对粒径、包被率影响的研究，聚合反应时间分别为1、2、3、4、5h，分析聚合物的成粒性、粒径、包被率见表6。成粒性用数量级次幂(10n)/ml表示，包被率用总含量减去剩余物质含量表示。
表6
由表6可见，聚合反应时间对葡聚糖聚合物成粒性、粒径和活性物质包被率有很大的影响。葡聚糖单体随着时间反应不断聚合形成颗粒，反应时间在1h内，形成的颗粒很少，反应时间达到2h时，就可大量检测到聚合颗粒，粒径约为300nm，包被率为55％；反应时间为3h时，葡聚糖单体90％以上已经聚合形成颗粒，达到103个/ml，粒径约为700nm，活性物质包被率为85％。达到了很好的效果，反应时间继续增加，聚合物颗粒之间相互链接聚合，形成片状、团状或网状，粒径也发展为不规则的大片段，此时，活性物质被包裹在聚合物网络内，可利用性很差。故本发明选择聚合反应时间优选为3h。
实施例6，同实施例1，不同的是，
(1)用内含碎米200g，蔗糖40g，蛋白胨8g，酵母粉6g，MgSO44g，MgCl24g，KH2PO43g、K2HPO43g；培养条件：温度20℃，pH 5的1000ml培养液培养蛹虫草菌、灵芝菌，剪切速度为1100rpm。
(2)将步骤(1)所得的蛹虫草菌、灵芝菌于80℃，真空压力3kPa，真空干燥36h，至含水量9％；
(3)将经步骤(2)干燥的蛹虫草菌颗粒干粉、灵芝菌颗粒干粉按蛹虫草菌颗粒干粉60％，灵芝菌菌颗粒干粉40％比例置于低温超微粉碎破壁，低温温度4～10℃，超微粉碎破壁转速300rpm，10kg/h；
(4)高压均质：将步骤(3)破壁后的混合粉高压均质破壁，释放生物活性物质，高压均质压力为1.2×105kPa，循环10次，细胞破壁率≧90％。
(5)辐照提取：将步骤(4)高压均质破壁悬浮液在室温下与无水乙醇按1:1(v/v)混合均匀，装袋封口，60Co-γ辐照提取，辐照吸收剂量为6kGy；
(6)亚微米颗粒制备：葡聚糖T-40 7g溶于100ml二甲基亚砜中，通氮气，加1g聚乙二醇和2g甲基丙烯酸缩水甘油酯，反应修饰2h，加300m无水乙醇，收集沉淀，沉淀溶解于50ml，pH 8.0的磷酸缓冲液中，通氮气，加10ml步骤(5)的辐照提取液，1ml引发剂APS，在70℃下聚合反应2h，离心15min，转速18000rpm，透析30h；
(7)干燥：采用真空冷冻干燥，温度≦10℃，真空度≦50Pa，干燥20h，获得蛹虫草灵芝生物活性物质亚微米包被颗粒，粒径300～500nm，包被率80～90％；
(8)制剂：添加甘露醇压片。
实施例7，同实施例1，不同的是，
(1)用内含碎米150g，蔗糖60g，蛋白胨6g，酵母粉10g，MgSO43g，MgCl23g，KH2PO44g、K2HPO44g；培养条件：温度20℃，pH 5的1000ml培养液培养蛹虫草菌、灵芝菌，剪切速度为900rpm。
(2)将步骤(1)所得的蛹虫草菌、灵芝菌于90℃，真空压力3kPa，真空干燥24h，至含水量10％；
(3)将经步骤(2)干燥的蛹虫草菌颗粒干粉、灵芝菌颗粒干粉按蛹虫草菌颗粒干粉90％，灵芝菌菌颗粒干粉10％比例置于低温超微粉碎破壁，低温温度4～10℃，超微粉碎破壁转速500rpm，10kg/h；
(4)高压均质：将步骤(3)破壁后的混合粉高压均质破壁，释放生物活性物质，高压均质压力为1.2×105kPa，循环12次，细胞破壁率≧95％。
(5)辐照提取：将步骤(4)高压均质破壁悬浮液在室温下与无水乙醇按1:3(v/v)混合均匀，装袋封口，60Co-γ辐照提取，辐照吸收剂量为8kGy；
(6)亚微米颗粒制备：葡聚糖T-40 9g溶于100ml二甲基亚砜中，通氮气，加1g聚乙二醇和2g甲基丙烯酸缩水甘油酯，反应修饰2h，加200m无水乙醇，收集沉淀，沉淀溶解于80ml，pH 8.0的磷酸缓冲液中，通氮气，加10ml步骤(5)的辐照提取液，1ml引发剂APS，在70℃下聚合反应3h，离心10min，转速20000rpm，透析28h；
(7)干燥：采用真空冷冻干燥，温度4℃，真空度≦50Pa，干燥24h，获得蛹虫草灵芝生物活性物质亚微米包被颗粒，粒径200～300nm，包被率≧85％；
(8)制剂：添加甘露醇压片。
实施例8，同实施例1，不同的是，
(1)用内含碎米100g，蔗糖40g，蛋白胨8g，酵母粉8g，MgSO42g，MgCl22g，KH2PO44g、K2HPO44g；培养条件：温度20℃，pH 7的1000ml培养液培养蛹虫草菌、灵芝菌，剪切速度为500rpm。
(2)将步骤(1)所得的蛹虫草菌、灵芝菌于70℃，真空压力3kPa，真空干燥36h，至含水量10％；
(3)将经步骤(2)干燥的蛹虫草菌颗粒干粉、灵芝菌颗粒干粉按蛹虫草菌颗粒干粉70％，灵芝菌菌颗粒干粉30％比例置于低温超微粉碎破壁，低温温度4～10℃，超微粉碎破壁转速400rpm，10kg/h；
(4)高压均质：将步骤(3)破壁后的混合粉高压均质破壁，释放生物活性物质，高压均质压力为1.4×105kPa，循环10次，细胞破壁率100％。
(5)辐照提取：将步骤(4)高压均质破壁悬浮液在室温下与无水乙醇按1:2(v/v)混合均匀，装袋封口，60Co-γ辐照提取，辐照吸收剂量为10kGy；
(6)亚微米颗粒制备：葡聚糖T-40 9g溶于100ml二甲基亚砜中，通氮气，加1g聚乙二醇和2g甲基丙烯酸缩水甘油酯，反应修饰2h，加200m无水乙醇，收集沉淀，沉淀溶解于40ml，pH 8.0的磷酸缓冲液中，通氮气，加10ml步骤(5)的辐照提取液，1ml引发剂APS，在70℃下聚合反应3h，离心15min，转速12000rpm，透析36h；
(7)干燥：采用真空冷冻干燥，温度4℃，真空度≦50Pa，干燥30h，获得蛹虫草灵芝生物活性物质亚微米包被颗粒，粒径200～300nm，包被率90％；
(8)制剂：添加水苏糖紫苏油灌装软胶囊。
实施例9，同实施例1，不同的是，
(1)用内含碎米150g，蔗糖40g，蛋白胨5g，酵母粉10g，MgSO40.5g，MgCl20.5g，KH2PO41g、K2HPO41g；培养条件：温度20℃，pH 5的1000ml培养液培养蛹虫草菌、灵芝菌，剪切速度为500rpm。
(2)将步骤(1)所得的蛹虫草菌、灵芝菌于80℃，真空压力3kPa，真空干燥30h，至含水量9％；
(3)将经步骤(2)干燥的蛹虫草菌颗粒干粉、灵芝菌颗粒干粉按蛹虫草菌颗粒干粉80％，灵芝菌菌颗粒干粉20％比例置于低温超微粉碎破壁，低温温度4～10℃，超微粉碎破壁转速300rpm，10kg/h；
(4)高压均质：将步骤(3)破壁后的混合粉高压均质破壁，释放生物活性物质，高压均质压力为1.6×105kPa，循环10次，细胞破壁率≧90％。
(5)辐照提取：将步骤(4)高压均质破壁悬浮液在室温下与无水乙醇按1:1(v/v)混合均匀，装袋封口，60Co-γ辐照提取，辐照吸收剂量为3kGy；
(6)亚微米颗粒制备：葡聚糖T-40 5g溶于100ml二甲基亚砜中，通氮气，加1g聚乙二醇和2g甲基丙烯酸缩水甘油酯，反应修饰2h，加200m无水乙醇，收集沉淀，沉淀溶解于70ml，pH 8.0的磷酸缓冲液中，通氮气，加10ml步骤(5)的辐照提取液，1ml引发剂APS，在70℃下聚合反应2h，离心30min，转速10000rpm，透析24h；
(7)干燥：采用真空冷冻干燥，温度4℃，真空度≦50Pa，干燥20h，获得蛹虫草灵芝生物活性物质亚微米包被颗粒，粒径400～600nm，包被率80～90％；
(8)制剂：添加水苏糖紫苏油灌装软胶囊。

Claims (9)

1.一种制备虫草灵芝复合制剂的方法.，其特征在于具体步骤如下，
(1)蛹虫草、灵芝菌培养：蛹虫草、灵芝菌分别采用培养液培养出蛹虫草菌、灵芝菌；
所述1000ml培养液中营养成分比例为，碎米50～200g，蔗糖20～60g，蛋白胨5～10g，酵母粉5～10g，MgSO4/MgCl2 1～10g，KH2PO4/K2HPO4 2～8g；培养条件：温度20℃，pH 5～7，剪切转速500～1600rpm；
其中MgSO4/MgCl2＝1:1，KH2PO4/K2HPO4＝1:1；
(2)将步骤(1)所得的蛹虫草菌、灵芝菌于60～90℃、减压真空干燥24～48h，至含水量8～12％；减压真空压力3kPa；
(3)将经步骤(2)干燥的蛹虫草菌颗粒干粉、灵芝菌颗粒干粉按蛹虫草菌颗粒干粉50～90％，灵芝菌颗粒干粉10～50％比例置于超微粉碎破壁，于低温温度4～10℃超微粉碎破壁，转速100～500rpm，10kg/h；
(4)高压均质：将步骤(3)破壁后的混合粉高压均质破壁，释放生物活性物质，高压均质压力为1.2～2.0×105kPa，循环6～15次，得高压均质破壁悬浮液；
(5)辐照提取：将步骤(4)高压均质破壁悬浮液在室温下与无水乙醇按体积比为1:1～4混合；装袋封口，60Co-γ辐照提取，辐照吸收剂量为1～12kGy，得辐照提取液；
(6)亚微米颗粒制备：取葡聚糖T-405～10g溶于100ml二甲基亚砜中，通氮气，加1g聚乙二醇和2g甲基丙烯酸缩水甘油酯，反应修饰2～3h，加100～500ml无水乙醇，收集沉淀，沉淀溶解于20～80ml，pH 8.0的磷酸缓冲液中，通氮气，加10～30ml步骤(5)的辐照提取液，1ml引发剂APS，在70℃下聚合反应2～5h，离心30min，转速8000～20000rpm，透析24-48h；
(7)干燥：采用真空冷冻干燥，于4～10℃，真空度≦50Pa条件下干燥16～40h，获得蛹虫草灵芝生物活性物质亚微米包被颗粒，粒径200～700nm；
(8)制剂：蛹虫草灵芝生物活性物质亚微米包被颗粒添加水苏糖紫苏油灌装得软胶囊，或添加甘露醇压片得片剂。
2.根据权利要求1所述的一种制备虫草灵芝复合制剂的方法.其特征在于：步骤(1)中，1000ml培养液中营养成分比例为，碎米80-150g，蔗糖30～50g，蛋白胨5～8g，酵母粉6～10g，MgSO4/MgCl2 3～8g，KH2PO4/K2HPO4 4～6g；培养条件：温度20℃，pH 6～7，剪切转速800～1200rpm；
所述MgSO4/MgCl2＝1:1，KH2PO4/K2HPO4＝1:1。
3.根据权利要求1所述的一种制备虫草灵芝复合制剂的方法.其特征在于：步骤(1)中，培养液中，碎米100g，蔗糖40g，蛋白胨7g，酵母粉10g，MgSO4/MgCl25g，KH2PO4/K2HPO4 4g；培养温度20℃，pH 6～7，剪切转速1200rpm；
所述MgSO4/MgCl2＝1:1，KH2PO4/K2HPO4＝1:1。
4.根据权利要求1所述的一种制备虫草灵芝复合制剂的方法.其特征在于：步骤(2)中，蛹虫草菌、灵芝菌于60～70℃，减压真空度3kPa，干燥40-48h，至含水量8％。
5.根据权利要求1所述的一种制备虫草灵芝复合制剂的方法，其特征在于：步骤(3)中，蛹虫草菌颗粒干粉、灵芝菌菌颗粒干粉按蛹虫草菌颗粒干粉70～90％，灵芝菌颗粒干粉10～30％比例置于低温超微粉碎破壁，超微粉碎破壁转速400～500rpm。
6.根据权利要求1所述的一种制备虫草灵芝复合制剂的方法，其特征在于：步骤(3)中，蛹虫草菌颗粒干粉、灵芝菌菌颗粒干粉按蛹虫草菌颗粒干粉80％，灵芝菌菌颗粒干粉20％，低温超微粉碎破壁转速400rpm。
7.根据权利要求1所述的一种制备虫草灵芝复合制剂的方法.其特征在于：步骤(5)中，高压均质破壁悬浮液与无水乙醇按料液体积比为1:1混合，60Co-γ辐照提取，辐照吸收剂量为6～8kGy。
8.根据权利要求1所述的一种制备虫草灵芝复合制剂的方法，其特征在于：步骤(6)中，取葡聚糖T-408～10g溶于100ml二甲基亚砜中，通氮气，加1g聚乙二醇和2g甲基丙烯酸缩水甘油酯，反应修饰2～3h，加200～300ml无水乙醇沉淀收集，沉淀溶解于40～60ml，pH 8.0的磷酸缓冲液中，通氮气，加10～15ml步骤(5)的辐照提取液，1ml引发剂APS，在70℃下聚合反应2～5h，离心30min，转速10000～12000rpm，透析24～30h。
9.根据权利要求1所述的一种制备虫草灵芝复合制剂的方法，其特征在于：步骤(6)中，取葡聚糖T-4010g溶于100ml二甲基亚砜中，通氮气，加1g聚乙二醇和2g甲基丙烯酸缩水甘油酯，反应修饰3h，加200ml无水乙醇，收集沉淀，沉淀溶解于50ml，pH 8.0的磷酸缓冲液中，通氮气，加10ml步骤(5)的辐照提取液，1ml引发剂APS，在70℃下聚合反应3h，离心转速12000rpm，透析26h。
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