CN103932179A - 一种缓解压力及护肝的保健食品及其二步发酵制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种缓解压力及护肝的保健食品及其二步发酵制备方法，该方法包括：云芝固体发酵：以含有护肝的天然组分为药性培养基质，接种云芝液体菌种进行双向固体发酵制备具有护肝功效的药性菌质；乳酸菌液体深层发酵：以药性菌质为原料，粉碎后添加酵母粉、谷氨酸钠、水制成发酵培养基，接种乳酸菌进行液体深层发酵生产缓解压力的γ-氨基丁酸，制备同时具有缓解压力和护肝功效的发酵液；采用发酵液，制备成不同剂型的缓解压力及护肝的保健食品。本发明制备的保健食品同时具有缓解压力和护肝功能，市场前景广阔，此外该制备方法稳定，适合大规模生产。

Description

一种缓解压力及护肝的保健食品及其二步发酵制备方法
技术领域
本发明涉及一种生物保健食品及其制备领域，具体涉及一种缓解压力及护肝生物保健食品及采用云芝、乳酸菌固液二步发酵制备该保健食品的方法。
背景技术
近年来由于我国经济的迅速发展，国民生活水平的提高，饮食结构的变化，过量饮酒和因为食物中过量蛋白、脂类、糖类摄入带来的疾病和潜在危害越来越严重，如：酒精肝、脂肪肝、药物肝等。另一方面生活节奏的日益加快，人们在生活、学习、工作中的竞争越来越激烈，生活不规律，精神状况不佳，过大的压力易造成急躁、焦虑、郁闷等情绪问题，在困扰包括学生、白领等在内的脑力工作者的同时也很容易影响到肝。因此越来越多的人开始关注自身的亚健康问题，保肝护肝、缓解精神压力的食品和保健食品就越来越受青睐，目前市场上的保健食品以增强免疫力、抗疲劳、抗氧化、护肝等为主，且大多为单一功能的产品，并无可同时具有缓解压力和护肝的保健食品，难以满足人们养生保健的需求。
云芝是最具药用价值的真菌之一，具有清热、解毒、消炎、保肝、抗癌等功效。云芝多糖是云芝的主要的活性成分，云芝多糖最重要的作用是它对肝脏的保护，现代实验证明它对人体的肝脏损伤有修复作用，当肝中毒引起谷丙转氨酶(SGPT)增高后，服用云芝多糖可使SGPT很快趋于正常。对亚急性和慢性肝炎患者来说，服用云芝多糖亦可使转氨酶恢复正常。云芝菌丝体内和体外均可产生云芝多糖，但云芝菌丝体都是以传统固体或液体发酵制备，并无利用云芝和具有一定功效的药性基质通过双向发酵制备的报道。
庄毅等首次提出双向发酵的概念，指出食药用真菌与含有活性成分的中药材进行发酵具有双向性，能产生1+1>2的生理效果，如专利201110271923.7《一种具有降血糖功效的真菌药性菌质及其制备方法》选用具有降血糖功效的药性基质和真菌菌种作为双向发酵获得具有明显的降低血糖又不增加胰岛素浓度的作用的药性菌质，专利200910058889.8《含有灵芝的发酵菌质混合物、制备方法及其应用》以灵芝和含有丹参的药性基质进行双向发酵，得到兼具丹参药材和灵芝真菌功效的菌质发酵终产物。选用云芝和具有护肝功效的药性基质进行固体发酵，通过药性基质对云芝菌丝体生长代谢过程的影响和云芝真菌酶系对药性基质改造在内的双向性固体发酵后，得到兼具药性基质和云芝护肝功效的药性菌质，可作为保健食品原料，对保肝护肝能够产生1+1>2的效果。
γ-氨基丁酸是一种重要的抑制性神经递质，现代医学研究证明γ-氨基丁酸具有镇静神经、缓解压力的功效，卫生部2009年第12号公告批准乳酸菌发酵法制备的γ-氨基丁酸为新资源食品。从传统发酵食品中筛选的乳酸菌安全性高，可用于γ-氨基丁酸的生产，如专利200780006225.6《能够生产γ-氨基丁酸的乳酸菌》从未精制的酱油中分离到能够生产γ-氨基丁酸（GABA）的凝乳酶乳酸杆菌，专利200910183478.1《一株高效转化L-谷氨酸为γ-氨基丁酸乳酸菌的选育》从自制酸菜中筛选出一株能利用L-谷氨酸生产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌。但是乳酸菌只能利用单糖、二糖等小分子碳源，不能直接利用含淀粉以及纤维质的天然基质，而真菌具有降解淀粉和纤维质的酶系，可将淀粉质、纤维质分解为可供乳酸菌利用的小分子碳源，将真菌发酵与乳酸菌发酵相耦合进行分步发酵可解决这一问题。
发明内容
针对目前并无缓解压力及护肝的保健食品，一种同时缓解压力及护肝的保健食品，同时提供了该保健食品利用云芝、乳酸菌二步发酵制备方法。
一种缓解压力及护肝的保健食品的二步发酵制备方法，包括如下步骤：
（1）云芝固体发酵：以含有护肝的天然组分为药性培养基质，接种云芝液体菌种进行双向固体发酵制备具有护肝功效的药性菌质；
（2）乳酸菌液体深层发酵：以步骤（1）的药性菌质为原料，粉碎后添加酵母粉、谷氨酸钠、水制成发酵培养基，接种乳酸菌进行液体深层发酵生产缓解压力的γ-氨基丁酸，制备同时具有缓解压力和护肝功效的发酵液；
（3）采用步骤（2）的发酵液，制备成不同剂型的缓解压力及护肝的保健食品。
本发明第一步以含有护肝的天然组分作为药性培养基质，接种云芝进行双向固体发酵，通过药性培养基质对云芝菌丝体生长代谢过程的影响和云芝真菌酶系对药性培养基质改造在内的双向性固体发酵后，得到兼具药性基质和云芝护肝功效的药性菌质；第二步以云芝降解后含有小分子碳源等营养物质的药性菌质为原料，添加酵母粉以及谷氨酸钠制作发酵培养基，接种可产生γ-氨基丁酸的乳酸菌进行发酵，制备具有缓解压力和护肝功效的发酵液；最后，发酵液经过过滤、浓缩、制剂等工艺制备保健食品。
步骤（1）中，所述的云芝可采用现有技术，云芝液体菌种采用现有的常规工艺制得，如具体可选择云芝ACCC51345，即中国农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）保藏的菌种。
步骤（1）中，所述的云芝液体菌种的接种量为2%-10%，即所述的云芝液体菌种的加入的体积量（mL）为药性培养基质的质量（g）的2%-10%（mL/g），以100g药性培养基质为基准，加入2-10mL的云芝液体菌种。
步骤（1）中，所述的药性培养基质的制备：先称取以下重量百分含量的原料：全粒大麦70%-80%、大枣10%-20%、五味子1%-3%、绞股蓝1%-3%、白芍1%-3%、石膏粉0.5%-1.5%，将各组分混合、粉碎，然后加水至水分重量含量为60%-65%，116℃-126℃灭菌0.5h-1.5h。优选的，所述的药性培养基质的制备：先称取以下重量百分含量的原料：全粒大麦75%、大枣15%、五味子3%、绞股蓝3%、白芍3%、石膏粉1%，将各组分混合、粉碎，然后加水至水分重量含量为60%-65%，121℃灭菌1h。
步骤（1）中，所述的双向固体发酵的条件为：发酵温度在20-25℃，发酵时间在20-30天，以该云芝固体发酵条件为宜。
步骤（2）中，所述的乳酸菌为植物乳酸菌，优选的为从四川泡菜中筛选的植物乳杆菌LW106（保藏编号为：CGMCC NO.5655），即采用中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC保藏的菌种，植物乳酸菌液体菌种采用MRS培养基28℃静置培养48h获得。
步骤（2）中，所述的发酵培养基采用以下重量份的原料：水1000重量份、药性菌质40-50重量份、酵母粉5-10重量份、谷氨酸钠15-20重量份，将药性菌质、酵母粉和谷氨酸钠溶于水，添加醋酸和醋酸钠配制成pH为5-6的缓冲液，116℃-126℃灭菌20min-40min。作为优选，所述的发酵培养基采用以下重量份的原料：水1000重量份、药性菌质50重量份、酵母粉7.5重量份、谷氨酸钠20重量份，将药性菌质、酵母粉和谷氨酸钠溶于水，添加醋酸和醋酸钠配制成pH为5.5的缓冲液，121℃灭菌30min。
步骤（2）中，所述的乳酸菌的接种量为1%-5%，即所述的乳酸菌的加入的体积量为发酵培养基体积的1%-5%。
步骤（2）中，所述的液体深层发酵的条件为：发酵温度在28-32℃，发酵时间在48-72h，以该发酵条件为宜。
步骤（2）中，所述的发酵液中γ-氨基丁酸的含量为9-12g/L。
步骤（3）中，所述的发酵液通过过滤、浓缩、制剂等工艺制备成不同剂型的保健食品。
所述的缓解压力及护肝的保健食品的剂型为口服剂型，优选为片剂或胶囊，发酵液经过滤、浓缩、喷雾干燥、制粒、压片后得到片剂，发酵液经过滤、浓缩、喷雾干燥、制粒、装囊后得到胶囊。具体地，发酵液首先经过过滤、浓缩、喷雾干燥成粉末，粉末过筛后经沸腾制粒得干燥颗粒，颗粒用颗粒整粒机以20目筛进行整粒，整粒所得颗粒加入相对于整粒所得颗粒的重量0.5%崩解剂羧甲淀粉钠和整粒所得颗粒的重量0.1%润滑剂硬脂酸镁在多维运动混合机中充分混匀5分钟灌胶囊或压成片剂，每粒胶囊/片剂0.35g。
通过上述二步发酵制备方法制备的缓解压力及护肝的保健食品，该保健食品同时具有缓解压力和护肝的保健功能。
云芝与护肝的药性培养基质双向发酵可制备护肝效果显著的药性菌质，而药性培养基质通过云芝的降解作用，可为乳酸菌发酵产γ-氨基丁酸提供营养和碳源，同时通过乳酸菌的降解和转化，药性菌质更易吸收和利用，因此,采用云芝和乳酸菌二步发酵可制备可同时缓解压力和护肝的保健食品。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）本发明根据云芝具有护肝功效，γ-氨基丁酸具有缓解压力功效，二者配伍具有缓解压力及护肝功效，提供了一种以功能强化的的云芝药性菌质和γ-氨基丁酸配伍的保健食品制备方法，该方法将食用菌发酵与乳酸菌发酵有机结合，采用二步发酵法制备可同时缓解压力和护肝的保健食品，其中第一步利用云芝和具备护肝功效药性培养基质的双向固体发酵制备兼具云芝和药性基质护肝功效的药性菌质，该过程不仅能产生1+1＞2的生理功效，还可将药性培养基质中的大分子碳源降解为乳酸菌易于利用的小分子碳源，为第二步乳酸菌液体深层发酵产生具备缓解压力作用的γ-氨基丁酸提供必要的营养和碳源，同时通过乳酸菌的降解和转化药性菌质也更易吸收、利用。云芝、乳酸菌固液二步发酵相结合，可利用价值不高的天然原料生产高附加值的保健食品原料，市场前景广阔。
（2）本发明采用的制备方法，不仅原料成本低，整个生产过程都采用低温发酵，条件温和，没有毒害物质的摄入，产品安全性高，可实现规模化生产。
（3）本发明制备的保健食品采用经动物试验和人体试验证明具有缓解压力和护肝功效，产品附加值高。
（4）本发明制备的保健食品采用片剂、胶囊等剂型，方便携带及服用。
附图说明
图1为本发明缓解压力及护肝的保健食品的二步发酵制备方法的流程图；
图2为试验例2中受试者唾液皮质醇的变化率（起始点100%）。
具体实施方式
以下按照图1工艺流程对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。以下没有特别说明的情况下，百分数均是指重量百分数。
实施例1
1、云芝固体发酵：
①药性培养基质的制作
配方：全粒大麦80%、大枣16.5%、五味子1%、绞股蓝1%、白芍1%、石膏粉0.5%；
配制方法：按配方比例将各组分混合、粉碎，加水至水分含量为65%，121℃灭菌1h，得到药性培养基质；
②接种发酵
将云芝ACCC51345的液体菌种（常规工艺制备）按3%体积质量比接种到①中药性培养基质，即云芝ACCC51345液体菌种的加入的体积量（mL）为药性培养基质的质量（g）的3%（mL/g），20℃培养30天制备具有护肝功效的药性菌质；
2、乳酸菌液体深层发酵：
①发酵培养基制作
配方：药性菌质40g、酵母粉5g、谷氨酸钠15g，自来水1L（即1000g）；
配制方法：按配方比例将药性菌质、酵母粉、谷氨酸钠溶于水，添加醋酸和醋酸钠配制成pH为5.5的缓冲液，121℃灭菌30min，得到发酵培养基；
②将从四川泡菜中筛选的植物乳杆菌LW106（保藏编号为：CGMCCNO.5655）液体菌种（MRS培养基28℃静置培养48h）按1%比例接种到①中发酵培养基，即植物乳杆菌的加入的体积量为发酵培养基体积的1%，28℃静置培养72h制备具有缓解压力和护肝功效的发酵液；
3、第2步制备的发酵液首先经过过滤、浓缩、喷雾干燥成粉末，粉末过筛后经沸腾制粒得干燥颗粒，颗粒用颗粒整粒机以20目筛进行整粒，整粒所得颗粒加入相对于整粒所得颗粒重量的0.5%崩解剂羧甲淀粉钠和相对于整粒所得颗粒重量的0.1%润滑剂硬脂酸镁在多维运动混合机中充分混匀5分钟，压成片剂，每片0.35g。
实施例2
1、云芝固体发酵：
①药性培养基质的制作
配方：全粒大麦80%、大枣16.5%、五味子1%、绞股蓝1%、白芍1%、石膏粉0.5%；
配制方法：按配方比例将各组分混合、粉碎，加水至水分含量为60%，121℃灭菌1h，得到药性培养基质；
②接种发酵
将云芝ACCC51345的液体菌种（常规工艺制备）按3%体积质量比接种到①中药性培养基质，即云芝ACCC51345液体菌种的加入的体积量（mL）为药性培养基质的质量（g）的3%（mL/g），20℃培养30天制备具有护肝功效的药性菌质；
2、乳酸菌液体深层发酵：
①发酵培养基制作
配方：药性菌质40g、酵母粉5g，谷氨酸钠15g，自来水1L；
配制方法：按配方比例将药性菌质、酵母粉、谷氨酸钠溶于水，添加醋酸和醋酸钠配制成pH为5.5的缓冲液，121℃灭菌30min，得到发酵培养基；
②将从四川泡菜中筛选的植物乳杆菌LW106（保藏编号为：CGMCCNO.5655）液体菌种（MRS培养基28℃静置培养48h）按1%比例接种到①中发酵培养基，即植物乳杆菌的加入的体积量为发酵培养基体积的1%，28℃静置培养72h制备具有缓解压力和护肝功效的发酵液；
3、第2步制备的发酵液首先经过过滤、浓缩、喷雾干燥成粉末，粉末过筛后经沸腾制粒得干燥颗粒，颗粒用颗粒整粒机以20目筛进行整粒，整粒所得颗粒加入相对于整粒所得颗粒重量的0.5%崩解剂羧甲淀粉钠和相对于整粒所得颗粒重量的0.1%润滑剂硬脂酸镁在多维运动混合机中充分混匀5分钟，用胶囊填充机灌胶囊，每粒0.35g。
实施例3
1、云芝固体发酵：
①药性培养基质的制作
配方：全粒大麦75%、大枣15%、五味子3%、绞股蓝3%、白芍3%、石膏粉1%；
配制方法：按配方比例将各组分混合、粉碎，加水至水分含量为63%；121℃灭菌1h，得到药性培养基质；
②接种发酵
将云芝ACCC51345的液体菌种（常规工艺制备）按5%体积质量比接种到①中药性培养基质，即云芝ACCC51345液体菌种的加入的体积量（mL）为药性培养基质的质量（g）的5%（mL/g），25℃培养20天制备具有护肝功效的药性菌质；
2、乳酸菌液体深层发酵：
①发酵培养基制作
配方：药性菌质50g、酵母粉7.5g，谷氨酸钠20g，自来水1L；
配制方法：按配方比例将药性菌质、酵母粉、谷氨酸钠溶于水，添加醋酸和醋酸钠配制成pH为5.5的缓冲液，121℃灭菌30min，得到发酵培养基；
②将从四川泡菜中筛选的植物乳杆菌LW106（保藏编号为：CGMCC
NO.5655）液体菌种（MRS培养基28℃静置培养48h）按1%比例接种到①中发酵培养基，即植物乳杆菌的加入的体积量为发酵培养基体积的1%，32℃静置培养48h制备具有缓解压力和护肝功效的发酵液；
3、第2步制备的发酵液首先经过过滤、浓缩、喷雾干燥成粉末，粉末过筛后经沸腾制粒得干燥颗粒，颗粒用颗粒整粒机以20目筛进行整粒，整粒所得颗粒加入0.5%崩解剂羧甲淀粉钠和0.1%润滑剂硬脂酸镁在多维运动混合机中充分混匀5分钟，压成片剂，每片0.35g。
实施例4
1、云芝固体发酵：
①药性培养基质的制作
配方：全粒大麦75%、大枣15%、五味子3%、绞股蓝3%、白芍3%、石膏粉1%；
配制方法：按配方比例将各组分混合、粉碎，加水至水分含量为60%-65%；121℃灭菌1h，得到药性培养基质；
②接种发酵
将云芝ACCC51345的液体菌种（常规工艺制备）按5%体积质量比接种到①中药性培养基质，即云芝ACCC51345液体菌种的加入的体积量（mL）为药性培养基质的质量（g）的5%（mL/g），25℃培养20天制备具有护肝功效的药性菌质；
2、乳酸菌液体深层发酵：
①发酵培养基制作
配方：药性菌质50g、酵母粉7.5g，谷氨酸钠20g，自来水1L；
配制方法：按配方比例将药性菌质、酵母粉、谷氨酸钠溶于水，添加醋酸和醋酸钠配制成pH为5.5的缓冲液，121℃灭菌30min，得到发酵培养基；
②将从四川泡菜中筛选的植物乳杆菌LW106（保藏编号为：CGMCCNO.5655）液体菌种（MRS培养基28℃静置培养48h）按1%比例接种到①中发酵培养基，即植物乳杆菌的加入的体积量为发酵培养基体积的1%，32℃静置培养48h制备具有缓解压力和护肝功效的发酵液；
3、第2步制备的发酵液首先经过过滤、浓缩、喷雾干燥成粉末，粉末过筛后经沸腾制粒得干燥颗粒，颗粒用颗粒整粒机以20目筛进行整粒，整粒所得颗粒加入相对于整粒所得颗粒重量的0.5%崩解剂羧甲淀粉钠和相对于整粒所得颗粒重量的0.1%润滑剂硬脂酸镁在多维运动混合机中充分混匀5分钟，用胶囊填充机灌胶囊，每粒0.35g。
以下通过毒理及功能试验来进一步说明本发明。由于本发明的胶囊和片剂处剂型、辅料不同外，两者的主要原料、每日服用量、功效成分都相同，不影响产品的安全和功能。故以下针对胶囊进行毒理和功能试验。
试验例1
毒理试验：
试验目的：检验产品是否具有毒性
试验材料：实施例4制得的胶囊。
样品：人体口服推荐摄入量为0.35g/粒，每日两次，每次两粒（体重按60kg计），折合剂量0.03g/kg·bw，取胶囊内容物进行试验。
实验动物：清洁级ICR小鼠、SD大鼠及饲料。
饲养条件：温度20-25℃、相对湿度40%-70%的屏障系统。
试验方法：
小鼠急性经口毒性试验：取实施例4制得的胶囊内容物，用无菌水配制成0.500g/mL，按最大灌胃量20mL/kg·bw一日内二次性灌胃给养，受试物给予剂量为20.0g/kg·bw。
Ames试验：取实施例4制得的胶囊内容物，用无菌水配制成0.500g/mL，为5000ug/皿的剂量，试验设5个剂量，1000、200、40、8ug/皿4个剂量用无菌水按一定倍比逐级稀释配制成10、2、0.4、0.08mg/mL，加样量均为0.1mL/皿，加入0.1mL/皿，同时设阳性、阴性及溶剂对照，计数每皿回变菌落数。
小鼠骨髓细胞微核试验：以40mg/kg·bw剂量的环磷酰胺为阳性对照，无菌水为阴性对照，试验组3个剂量分别为10.0g/kg·bw、5.0g/kg·bw、2.5g/kg·bw，取实施例4制得的胶囊内容物用无菌水配制成0.5、0.25、0.125g/mL，以20mL/kg·bw灌胃2次，采用30h给受试物法，两次给样间隔24h，第二次给样6h后处死动物，取胸骨常规制片、镜检、每鼠计数1000个骨髓嗜多染红细胞，观察含微核的嗜多染红细胞并观察微核发生率。
小鼠精子畸形试验：以40mg/kg·bw剂量的环磷酰胺为阳性对照，无菌水为阴性对照，试验组3个剂量分别为10.0g/kg·bw、5.0g/kg·bw、2.5g/kg·bw，取实施例4制得的胶囊内容物用无菌水配制成0.5、0.25、0.125g/mL，以20mL/kg·bw灌胃，每天1次，连续5d。于首次给样后的第35天处死动物，取两侧附睾精子滤液按常规制片、镜检，每鼠计数1000个完整的精子，计算精子畸形发生率。
30天喂养试验：实施例4制得的胶囊人体推荐量1.4g/人/天，按人体推荐量的30、65、100倍设0.70g/kg·bw/d、1.52g/kg·bw/d、2.33g/kg·bw/d设三个剂量组，另设一个空白对照组0g/kg·bw，受试样品掺入基础饲料中饲喂大鼠，连续喂养30天，每周称1次体重和2次食物摄入量，计算每周及总的食物利用率，每天观察有无中毒变现和死亡，试验结束观察血液学、血液生化、脏器系数指标，并进行病理学检查。
试验结果：
1、急性经口毒性试验结果：受试样品对雌雄性小鼠急性经口的最大耐受量（MTD）均大于20.0g/kg·bw，属无毒级。
2、三项遗传毒性试验结果：Ames试验、小鼠骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸形试验结果均为阴性。
3、30天喂养试验结果：实验期间，动物生长发育良好，各剂量组体重、食物利用率、脏器重量、脏器系数均无异常改变，血液学指标与生化各项指标均在正常范围，各脏器病理学检查均未见与受试品相关的病理改变、给予人体推荐量100倍的受试物未观察到有害作用。
试验例2
缓解压力功能试验：
试验目的：检验产品对人体是否具有缓解压力的功能
试验材料：实施例4制得的胶囊。
样品：人体口服推荐量为每日2次，每次2粒，胶囊1号、2号，二者的包装、外观基本相同，但其中一个为实施例4制得的胶囊，另一个为安慰剂。
受试者选择：受试者为工作压力大的科研人员，年龄在35-55岁，性别不限，凡符合上述条件而自愿参加并保证配合者均可纳入试验。排除以下人员：对保健食品过敏者；短期内服用与受试功能相关的物品，影响到对结果的判断。
试验方法：当人体处在压力的状态下，唾液中就会分泌皮质醇，因此可以通过以唾液皮质醇为压力指标评价受试物缓解压力的作用。受试者随机分为试食组和安慰剂对照组，每天按推荐剂量服用，连续服用4周。试验期间不改变原来的饮食习惯，正常饮食。结果如图2所示，图2为受试者唾液皮质醇的变化率（起始点100%）由图2可知，与对照组相比，试食组受试者唾液皮质醇增加显著减少（p<0.05），说明实施例4制得的胶囊具有缓解压力的功效。
试验例3
护肝功能试验：
试验目的：检验产品对人体是否具有护肝的功能
试验材料：实施例4制得的胶囊。
人体口服推荐摄入量为每日两次，每次两粒，每粒0.35g/粒（体重按60kg计），0.03g/kg·bw，取胶囊内容物进行试验。
实验动物：雄性昆明种小鼠，体重18±2g。分笼饲养，自由饮食，观察3天后用于试验。
实验设计：按照《保健食品检验与评价技术规范》（2003版）评价标准进行，设低、中、高3个剂量和1个阴性对照组及1个模型对照组，低、中、高3个剂量组分别相当于人用最大推荐剂量的5倍、10倍、20倍，即0.15、0.30、0.60g/kg·bw/d，低、中、高3个剂量配制浓度分别为15、30、60mg/mL。空白对照组和模型对照组均给予蒸馏水，所有实验动物均食用全价营养配合饲料，自由摄食饮水。
经口每日一次给予小鼠相应剂量的受试物，小鼠灌胃量为10mL/kg·bw，连续灌胃30d，于实验第30天将各组动物隔夜禁食16h。模型对照组及受试组一次灌胃给予1%CCl4植物油溶液（5mL/kg·BW），空白对照组给予植物油，受试组继续给予实施例4制得的胶囊至实验结束（与CCl4灌胃间隔4h），给予CCl424h后小鼠摘取眼球取血，测定血清ALT、AST水平，并取肝脏进行组织病理学检查。
实验结果：
1.实施例4制得的胶囊对小鼠体重的影响
由表1可知，对各组小鼠试验的初始体重/结束体重(30d)的均值进行单因素方差分析，差异无显著性(P>0.05)结果表明实施例4制得的胶囊对动物的体重未见明显影响。
2.对CCl4肝损伤小鼠血清ALT及AST的影响
由表2可知，模型对照组小鼠的ALT、AST含量高于阴性对照组，经统计分析差异有统计学意义(P＜0.05)，实施例4制得的胶囊0.15、0.30、0.60g/kg·bw/d剂量组的ALT值低于模型对照组，经统计分析差异有统计学意义(P＜0.05)；低中高剂量组的AST值低于模型对照组，经统计分析差异有统计学意义(P＜0.05)。结果表明，实施例4制得的胶囊在相当于人体推荐摄入量的5倍、10倍和20倍剂量时，具有降低化学性肝损伤小鼠血清ALT和AST的作用。
3.实施例4制得的胶囊对CCl4肝损伤小鼠肝脏组织病理学的影响
由表3可知，对各组小鼠肝脏组织病理学指标量化值的均值进行单因素方差分析，各项指标均模型对照组比较差异有显著意义。结果表明，实施例4制得的胶囊在相当于人体推荐摄入量的5倍10倍和20倍剂量时，动物实验病理结果为阳性，表明其具有减轻化学性肝损伤小鼠肝脏的病理性损害作用。
表1实施例4制得的胶囊对小鼠体重的影响
表2实施例4制得的胶囊对小鼠血清ALT及AST的影响
组别 AST(U) ALT(U)
空白对照组 104.15±44.9 64.21±20.9
模型对照组 411.10±43.43 323.26±34.56
低剂量组 376.33±32.12 231.32±28.98
中剂量组 317.89±21.52 211.33±23.32
高剂量组 275.34±16.64 188.23±25.45
表3实施例4制得的胶囊对CCl4肝损伤小鼠肝脏组织病理学的影响
组别 水样变性 气球变性 脂肪变性 胞浆凝聚 细胞坏死
空白对照组 0 0 0 0 0
模型对照组 1.3±0.65 0.81±0.42 0.92±0.53 1.63±0.56 1.90±0.87
低剂量组 1.0±0.43 0.76±0.39 0.88±0.41 1.42±0.44 1.68±0.76
中剂量组 0.7±0.42 0.60±0.27 0.67±0.35 1.20±0.39 1.29±0.65
高剂量组 0.3±0.22 0.47±0.23 0.51±0.23 0.89±0.24 0.83±0.49

Claims (10)

1.一种缓解压力及护肝的保健食品的二步发酵制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）云芝固体发酵：以含有护肝的天然组分为药性培养基质，接种云芝液体菌种进行双向固体发酵制备具有护肝功效的药性菌质；
（2）乳酸菌液体深层发酵：以步骤（1）的药性菌质为原料，粉碎后添加酵母粉、谷氨酸钠、水制成发酵培养基，接种乳酸菌进行液体深层发酵生产缓解压力的γ-氨基丁酸，制备同时具有缓解压力和护肝功效的发酵液；
（3）采用步骤（2）的发酵液，制备成不同剂型的缓解压力及护肝的保健食品。
2.根据权利要求1所述的缓解压力及护肝的保健食品的二步发酵制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的云芝液体菌种的接种量为2%-10%。
3.根据权利要求1所述的缓解压力及护肝的保健食品的二步发酵制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的药性培养基质的制备：先称取以下重量百分含量的原料：全粒大麦70%-80%、大枣10%-20%、五味子1%-3%、绞股蓝1%-3%、白芍1%-3%、石膏粉0.5%-1.5%，将各组分混合、粉碎，然后加水至水分重量含量为60%-65%，116℃-126℃灭菌0.5h-1.5h。
4.根据权利要求1所述的缓解压力及护肝的保健食品的二步发酵制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的药性培养基质的制备：先称取以下重量百分含量的原料：全粒大麦75%、大枣15%、五味子3%、绞股蓝3%、白芍3%、石膏粉1%，将各组分混合、粉碎，然后加水至水分重量含量为60%-65%，121℃灭菌1h。
5.根据权利要求1所述的缓解压力及护肝的保健食品的二步发酵制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的双向固体发酵的条件为：发酵温度在20-25℃，发酵时间在20-30天。
6.根据权利要求1所述的缓解压力及护肝的保健食品的二步发酵制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的发酵培养基采用以下重量份的原料：水1000重量份、药性菌质40-50重量份、酵母粉5-10重量份、谷氨酸钠15-20重量份，将药性菌质、酵母粉和谷氨酸钠溶于水，添加醋酸和醋酸钠配制成pH为5-6的缓冲液，116℃-126℃灭菌20min-40min。
7.根据权利要求1所述的缓解压力及护肝的保健食品的二步发酵制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的乳酸菌的接种量为1%-5%。
8.根据权利要求1所述的缓解压力及护肝的保健食品的二步发酵制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的液体深层发酵的条件为：发酵温度在28-32℃，发酵时间在48-72h。
9.根据权利要求1所述的缓解压力及护肝的保健食品的二步发酵制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述的缓解压力及护肝的保健食品的剂型为片剂或胶囊。
10.根据权利要求1～9任一项所述的制备方法制备的缓解压力及护肝的保健食品。
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