CN103315362B - 一种茯苓固态发酵功能饮品及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种茯苓固态发酵功能饮品，其组成中提取物固态重量比例包括：茯苓-香菇或香菇柄-山楂叶的固态发酵复合物重量比例包括5，山楂1，党参1，枸杞1，三七或葛根0.1，罗汉果0.1。提取方法包括：蒸馏水或软化水提取，料液比1∶10，温度45-55℃，压力0.06兆帕条件下浸提20分钟，过滤得第一次浸提液；滤渣加首次提取水量，同上条件下浸提20分钟，过滤得第二次浸提液；将两次浸提液混合，得到提取液。本发明利用茯苓分解纤维素的能力，固体发酵茯苓，不仅有利于香菇或香菇柄多糖、氨基酸以及山楂叶总黄酮类物质、膳食纤维、糖类物质的释放，还有利于茯苓自身代谢产物的合成，丰富自身的营养价值，从而使发酵产物体系的构成更加多样化。
Description
技术领域
本发明涉及一种以香菇或香菇柄和山楂叶为特殊基质，通过细胞工程定向选育茯苓珍稀食药用真菌优良菌株的方法，以及在以香菇或香菇柄和山楂叶为主料组成的特殊基质下，通过茯苓固体发酵制备功能饮品的方法。
背景技术
茯苓(Wolfiporia cocos)，担子菌门、担子菌纲、多孔菌目、多孔菌科、茯苓属。茯苓是一种重要的药用菌，被誉为中药“八珍”之一，在中国已有几千年的历史。古人称茯苓为“四时神药”，因为它功效非常广泛，不分四季，将它与各种药物配伍，不管寒、温、风、湿诸疾，都能发挥其独特功效。茯苓具有渗湿利尿、合胃健脾、宁心安神、抑菌、增强机体抗病能力及降低血糖的功效，茯苓多糖能增强人体免疫功能,可以提高人体抗病能力,起到防病、延缓衰老的作用,还可以促进细胞分裂,抗诱变、抗肿瘤,是一种可食可药的菌类。其在自然界中生长于针叶林腐殖层下，分解纤维素、木质素能力强。
素有“菇中皇后”美誉的香菇（Lentimus edodel）因其肉质肥厚、味道鲜美、营养丰富而深受民众喜爱，并被评为是集营养和保健于一体的世界十大最佳食品之一，随之发展起来的香菇产业也在我国农副业发展中起着举足轻重的作用。从上个世纪八十年代起，我国的香菇产量增长迅速，2002年达到9万吨，占世界香菇总产量的78%，居世界首位，产品远销欧美和东南亚等117个国家和地区，在全球香菇外销市场占有率为92%，2010年，我国的香菇销售量更是达到427.6万亿美元，我国年产香菇约50万吨,而香菇柄占总重的30%左右,香菇柄和子实体一样，富含大量的营养活性成分,具有抗氧化、提高免疫力、降血脂、护肝排毒等多种功效，但大都没有被充分地开发和利用、将香菇柄当作废弃物处理。因此，香菇柄的资源化开发利用依然是一个热点问题。
山楂为蔷薇科山楂属植物山里红或山楂的干燥成熟果实，其根、茎(山楂木)、叶(山楂叶)、花、果实(肉)、种子(山楂核)均可入药，其中山楂叶用于活血化淤，理气通脉。早在东晋《肘后方》中方就有山楂叶“茎叶煮汁，洗漆疮”的记载，广西、江西的地方的药材标准均载有山楂叶，2005年版《中国药典》也正式收载山楂叶。近年来山楂叶的研究有了较大的进展。山楂叶含有多种生物活性物质，其中总黄酮可通过调节血脂、保肝护心、抗脂质过氧化损伤达到防治动脉粥样硬化(AS)的作用；多酚类成分具有明显的清除超氧阴离子的活性，是抗氧化作用的主要活性成分；山楂叶中含有17种氨基酸，其中丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、胱氨酸含量远高于山楂果实。目前，山楂叶的利用也相当丰富，除了将山楂叶加工成山楂叶茶外，也有人将山楂叶热水浸提制备发酵饮品。我省是山楂大省，每年都有大量修剪下来的枝条，因此不仅解决了取材问题，而且变废为宝，符合农业经济的可持续发展。
目前茯苓的饮品开发大多致力于在液体发酵方面，固体发酵茯苓制备功能饮品的报道寥寥无几，在特定基质下固体发酵茯苓制备功能饮品的研究未见报道。
发明内容
本发明的目的在于选择香菇或香菇柄和山楂叶为特殊基质，以茯苓为出发菌种固体发酵制备功能饮品的制备方法，实现农副产品下脚料香菇柄与山楂叶更多功能因子的提取及高效利用。
这种茯苓固态发酵功能饮品，其组成中提取物固态重量比例包括：
蒸馏水或软化水提取，料液比1∶10，温度45-55℃，压力0.06兆帕条件下浸提20分钟，过滤得第一次浸提液；滤渣加首次提取水量，同上条件下浸提20分钟，过滤得第二次浸提液；将两次浸提液混合，得到提取液；常规饮品糖酸比勾兑即可。
上述茯苓固态发酵功能饮品制备方法，包括如下步骤：
A、使用含有香菇或香菇柄和山楂叶的摇瓶培养基，经过摇瓶培养制成菌球，经酶解后制成原生质体；
B、原生质体进行茯苓固体发酵紫外诱变菌株的选育；
C、使用含有香菇或香菇柄和山楂叶的母种培养基再生培养
D、使用含有香菇或香菇柄和山楂叶的固态培养基进行固体发酵，
E、茯苓-香菇或香菇柄-山楂叶固态培养基固体发酵复合物后期处理；
F、饮料配方组合与提取；
G、勾兑得到成品。
上述茯苓固态发酵功能饮品制备方法，步骤A所述茯苓菌种选育包括：
将购买的茯苓菌种活化后，进行摇瓶培养，将制得的菌球经酶解后制成原生质体，将其进行紫外诱变处理后再生培养，
采用的摇瓶培养基组成是：葡萄糖20g，土豆120g，麸皮50g，香菇或香菇柄22g，山楂叶8g，加蒸馏水定容至1000mL；
其中土豆、麸皮、经煮沸20min后过滤，取滤液；香菇或香菇柄、山楂叶干燥后粉碎，过80目筛用粉。
上述茯苓固态发酵功能饮品制备方法，步骤A所述茯苓菌球酶解包括：原生质体制备所需酶液为6g/L纤维素酶+6g/L蜗牛酶，酶液用109g/L甘露醇溶液配制，酶解温度为30℃，酶解时间为150min。
上述茯苓固态发酵功能饮品制备方法，步骤B所述紫外诱变菌株的选育包括：诱变时原生质体悬浮液用浓度为108g/L甘露醇溶液配制，浓度为105个/mL；以40s作为照射剂量诱变茯苓原生质体,连续诱变10批,每批稀释后涂布平皿；照射条件为紫外灯15W，照射距离30cm，照射剂量40s；连续诱变10批,每批稀释后涂布平皿,选出菌落直径最大、生长最旺盛的诱变株。
上述茯苓固态发酵功能饮品制备方法，步骤C再生培养包括：再生培养基采用母种培养基配方：香菇或香菇柄22g，山楂叶8g，琼脂20g，加蒸馏水定容至1000mL；其中香菇柄、山楂叶干燥后粉碎，过80目筛用粉；
再通过固体发酵复筛挑选出发菌种进入后面固体发酵阶段使用；
栽培料重量比例配方：香菇或香菇柄62%，山楂叶16%,麸皮20%，2%蔗糖，料水比为1:1.4；
选择菌丝洁白、浓密，长速快，且酶活高、多糖含量高，并且经多次转接后，遗传性状稳定的菌株，将此为菌种转接到PDA母种培养基中，进入固体发酵阶段待用。
上述茯苓固态发酵功能饮品制备方法，步骤D固体发酵包括：香菇或香菇柄用粉碎机粉碎并过筛，物料颗粒20-40mm，山楂叶用粉碎机轻微粉碎到大小80-100mm；麸皮市售；按照步骤C栽培料比例，2/3量装入500克容积玻璃瓶或普通规格聚丙烯塑料袋，白市布扎紧，0.1MPa灭菌2小时；
固态发酵条件：无菌条件下接入步骤C所得菌种，温度控制在20-25℃静置培养，湿度控制在60%-63%，茯苓菌丝发满瓶/袋后，即得茯苓-香菇柄-山楂叶发酵复合物。
上述茯苓固态发酵功能饮品制备方法，步骤E固态发酵复合物后处理包括：初步粉碎，35-40℃烘干3小时，45-50℃烘干3小时，55-60℃烘干1小时，粉碎机粉碎并过筛，筛孔尺寸20-40mm；装袋备用，避光保存。
上述的茯苓固态发酵功能饮品制备方法，步骤F配方固态重量比例包括：茯苓-香菇或香菇柄-山楂叶的固态发酵复合物5，山楂1，党参1，枸杞1，三七或葛根0.1，罗汉果0.1。
上述的茯苓固态发酵功能饮品制备方法，步骤F提取茯苓-香菇或香菇柄-山楂叶的固态发酵复合物包括：蒸馏水或软化水提取，料液比1∶10，温度45-55℃，压力0.06兆帕条件下浸提20分钟，过滤得第一次浸提液；滤渣加首次提取水量，同上条件下浸提20分钟，过滤得第二次浸提液；将两次浸提液混合，得到提取液；过滤得第二次浸提液，将两次浸提液混合，得提取液，过滤；渣喂猪或肥田。
本发明采用香菇或香菇柄与山楂叶配伍，利用茯苓分解纤维素的能力，固体发酵茯苓，制备功能饮品。在特殊基质下培养茯苓，不仅有利于香菇柄香菇多糖、氨基酸以及山楂叶总黄酮类物质、有机酸类物质、多酚类等功能因子的释放，还有利于茯苓自身代谢产物的合成，丰富自身的营养价值，从而使发酵产物体系的构成更加多样化。所得的复合物将具备三种物质的分解合成产物，将具有更好的抗衰老、抗氧化、美容养颜的功效。
具体实施方式
下面结合具体实例详细说明本发明的方法步骤，本发明所用茯苓菌种购自上海农科院食用菌研究所。
茯苓固态发酵功能饮品制备方法，包括如下步骤：
A、使用含有香菇或香菇柄和山楂叶的摇瓶培养基，经过摇瓶培养制成菌球，经酶解后制成原生质体；
A-1将购买的茯苓菌种活化后，进行摇瓶培养，将制得的菌球经酶解后制成原生质体，将其进行紫外诱变处理后再生培养，
采用的摇瓶培养基组成是：葡萄糖20g，土豆120g，麸皮50g，香菇或香菇柄22g，山楂叶8g，加蒸馏水定容至1000mL；
其中土豆、麸皮、经煮沸20min后过滤，取滤液；香菇或香菇柄、山楂叶干燥后粉碎，过80目筛用粉。
其中香菇或香菇柄、山楂叶的初选：挑选无霉变并符合食品加工标准的香菇或香菇柄和山楂叶，去除香菇柄和山楂叶中的杂物，分别用流动水清洗干净；60℃干燥5小时；
A-2上述茯苓固态发酵功能饮品制备方法，步骤A所述茯苓菌球酶解包括：原生质体制备所需酶液为6g/L纤维素酶+6g/L蜗牛酶，酶液用109g/L甘露醇溶液配制，酶解温度为30℃，酶解时间为150min。
B、原生质体进行茯苓固体发酵紫外诱变菌株的选育；
B-1诱变时原生质体悬浮液用浓度为108g/L甘露醇溶液配制，浓度为105个/mL；以40s作为照射剂量诱变茯苓原生质体,连续诱变10批,每批稀释后涂布平皿；选出菌落直径最大、生长最旺盛的诱变株。
B-2分别接斜面培养和三角瓶培养,25℃斜面培养6d,测定每天生长的长度，计算出菌丝生长速率(cm/d)；
B-3摇瓶培养，培养至发酵终点,测定菌丝体多糖含量。从30株诱变株中选出菌丝生长速率、多糖含量2项数据较好的2株进行固体发酵复筛；
B-4、取复筛的2株茯苓诱变株转接5次，重复测定生长速率、多糖含量，以进行遗传性状稳定性实验。
C、使用含有香菇和山楂叶的母种培养基再生培养
C-1再生培养包括：再生培养基采用母种培养基配方：香菇或香菇柄22g，山楂叶8g琼脂20g，加蒸馏水定容至1000mL；其中香菇柄、山楂叶干燥后粉碎，过80目筛用粉；
C-2再通过固体发酵复筛挑选出发菌种进入后面固体发酵阶段使用；
栽培料重量比例配方：香菇或香菇柄62%，山楂叶16%,麸皮20%，2%蔗糖，料水比为1:1.4；
C-3选择菌丝洁白、浓密，长速快，且酶活高、多糖含量高，并且经多次转接后，遗传性状稳定的菌株，将此为菌种转接到PDA母种培养基中，进入固体发酵阶段待用。
D、使用含有香菇和山楂叶的固态培养基进行固体发酵，
D-1香菇或香菇柄用粉碎机粉碎并过筛，物料颗粒20-40mm，山楂叶用粉碎机轻微粉碎到大小80-100mm；麸皮市售；
D-2按照步骤C栽培料比例，2/3量装入500克容积玻璃瓶或普通规格聚丙烯塑料袋，白市布扎紧，0.1MPa灭菌2小时；
D-3固态发酵条件：无菌条件下接入步骤C所得菌种，温度控制在20-25℃静置培养，湿度控制在60%-63%，茯苓菌丝发满瓶/袋后，即得茯苓-香菇柄-山楂叶发酵复合物。
E、茯苓-香菇柄-山楂叶固态培养基固体发酵复合物后期处理；
E-1初步粉碎，35-40℃烘干3小时，45-50℃烘干3小时，55-60℃烘干1小时，粉碎机粉碎并过筛，筛孔尺寸20-40mm；装袋备用，避光保存。
烘干装盘后放在烤架上，一般摆放8～10层，每层的间距应为20厘米。烘干室温度升到35℃时，入室烘干。烘干时必须先低温，然后逐渐升高温度，1h增温5℃。
F、饮料配方组合与提取；
F-1提取物固态重量比例包括：茯苓-香菇或香菇柄-山楂叶的固态发酵复合物5，山楂1，党参1，枸杞1，三七0.1，罗汉果0.1。
F-2提取方法包括：蒸馏水或软化水提取，料液比1∶10，温度45-55℃，压力0.06兆帕条件下浸提20分钟，过滤得第一次浸提液；滤渣加首次提取水量，同上条件下浸提20分钟，过滤得第二次浸提液；将两次浸提液混合，得到提取液；过滤得第二次浸提液。将两次浸提液混合，得提取液，过滤；渣喂猪或肥田。
G、勾兑得到成品，可用食品中允许使用的甜味剂替代白砂糖，以供特殊人群使用，亦可作为基本原料与其他果汁勾兑。
H、灌装与保存：按照食品或药品口服液无菌灌装工艺要求灌装，易拉罐或棕色口服液瓶，低温避光保存。
I、相关检验：
(1)感官指标
暗红色、无杂质，具有香菇、山杏的特殊菌果香味，口味醇正。放置60天不出现分层，允许少量沉淀。
(2)理化指标
多糖含量应≥4%，可溶性固形物含量≥5%。
(3)微生物指标
细菌总数≤100cfu/mL，大肠菌群≤3cfu/100mL，致病菌不得检出。
关于本发明的有关对比研究说明：
1、以茯苓原生质体紫外诱变技术选育的优良菌株13H-01、13H-09，分解香菇柄和山楂叶能力强，在此培养基上菌丝长势快，多糖含量高。并以13H-09菌株作为本技术出发菌株。
表1：不同茯苓菌株母种培养基长速对比：
| 菌株 | 培养基 | 长速/cm/d | 长势 |
| ck | A中母种培养基 | 0.17 | + |
| 13H-01 | A中母种培养基 | 0.24 | ++ |
| 13H-09 | A中母种培养基 | 0.29 | +++ |
“+”的表示生长势强弱、密度大小；表中数据为3次试验之均值。
表2：不同茯苓菌株固态发酵培养生长情况对比
| 菌株 | 培养基 | 满瓶时间/d |
| ck | B中固态发酵培养基 | 50 |
| 13H-01 | B中固态发酵培养基 | 48 |
| 13H-09 | B中固态发酵培养基 | 45 |
培养温度24-26℃；表中数据为3次试验之均值。
将固体复合物浸提液通过定性反应及薄层显色分析等分析方法进行分析，确定其成分除多糖外，还含有黄酮类物质、多酚类物质、生物碱类、甾类化合物等功能因子。
2、制得的茯苓-香菇柄-山楂叶固态发酵复合物提取液具有更强的抗衰老、抗氧化作用。
2-1、果蝇寿命试验
将四种受试物采用热水浸提的经典提取方法获得浸提液，由于浸提液中多糖为主要功能物质，因此，采用多糖浓度作为浸提液的指标因素。采用苯酚-硫酸法测定多糖含量；受试物中香菇柄、山楂叶的取材地点相同。
表3果蝇寿命实验各受试物浓度及添加量
| 受试物 | 多糖浓度(mg/mL) | 添加量(mL) |
| 茯苓普通培养物提取液 | 12.16 | 10 |
| 香菇柄+山楂叶提取液 | 11.45 | 10 |
| 固体发酵前复合组方提取液 | 16.52 | 10 |
| 固态发酵后培养物提取液 | 29.24 | 10 |
注：茯苓普通培养物，以棉籽皮代替香菇柄，山楂叶；
把蘸有乙醚的棉球放入带有内径1mm针头的10ml注射器内，来回抽动，将乙醚蒸汽打入成有500只果蝇（雄果蝇）的空容器中（严防液态乙醚打入），待果蝇完全麻痹后，维持两分钟，然后倒入白纸上，用鹅毛随机分为5组，每组100只，分别移入含有不同受试物的果蝇培养基中。每个培养基中将果蝇分为4组，每组25只。然后将其置于温箱培养（25±0.5℃，湿度60-65％）。每天早晚各观察一次，记录死亡的果蝇数，进而计算果蝇的寿命。注意观察培养的形状，培养基及时更换，直至最后一只果蝇死亡为止。
表4不同受试物对果蝇寿命的影响
注:最高平均寿命：每组受试物培养基中，最后五只死亡果蝇寿命的平均值。
a表示P<0.05
不同受试物在基础培养基中添加量均为10mL/100g。果蝇基础培养基：将10g玉米粉倒入烧杯中，加入36mL自来水，加热调成糊状；将1.5g琼脂置于烧杯中，加40mL自来水，煮沸使之充分溶解，再加入白砂糖13.5g、苯甲酸0.15g(用3mL95%酒精溶解)煮沸溶解；将上述两者混合，煮沸，称重，补加沸水使总重量至99g，待降到合适温度时立即加入干酵母粉1g，充分调匀即可。
四种受试物均可延长果蝇的寿命，通过上述数据的对比发现，经本工艺固体发酵后，明显提高了香菇柄和山楂叶功能因子的释放，达到了1+1>2的高效模式。
2-2、小鼠体内抗氧化作用实验
通过抗氧化实验,观察本工艺固体发酵复合物提取液对鼠血中超氧化物歧化酶(SOD)活力、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力、脂质过氧化物(MDA)含量及组织中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力、脂质过氧化物(MDA)含量。
试验采用清洁级雌性昆明种小鼠，体重18-22g，六周龄，由河北医科大学实验动物部提供。小鼠随机分成5组，每组8只。1个空白对照组，1个模型对照组和3个受试样品剂量组，3个剂量组[2.5、5、10g（多糖制剂）]/kg，用蒸馏水按所需剂量用多糖制剂配成混悬液）给予不同浓度受试样品，对照组给予生理盐水，灌胃量按2mL/100g体重计算，每日一次，连续30天。最后一次给药后禁食8h。
实验结束后处死小鼠，制备血液、肝组织匀浆标本。腹腔动脉取血,5%EDTA-Na抗凝待测谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、脂质过氧化物(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)。
用TBA荧光法当日测定血中脂质过氧化物MDA含量，同时用10nmoL/mL四乙氧基丙烷做一标准曲线),测得的荧光强度在标准曲线上可查得相应的MDA含量。用TBA荧光法测定组织中MDA含量。
DTNB法当日测血中活力谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px），37℃水浴中进行酶促反应3min,终止反应,离心,显色,于422nm波长读OD值,按照公式计算出酶活力单位数。用DTNB法测定组织中GSH-Px含量。
羟胺法当日测SOD活性,37℃水浴40min,加试剂终止反应,显色10min后,于550nm处测定OD值,根据OD值计算出SOD活力单位数。
表5：对小鼠血中SOD、GSH-Px活力及MDA含量的影响(x±s,n=8)
| 剂量(g/kg) | SOD(NU/mL) | GSH-Px(U/mL) | MDA(nmol/mL) |
| 模型对照 | 235.28±4.26b | 39.37±2.54b | 2.15±0.12b |
| 2.5 | 160.32±4.12 | 28.43±4.32 | 3.16±0.32 |
| 5 | 175.53±3.22 | 30.76±1.27 | 2.86±0.54 |
| 10 | 200.21±2.46 | 34.31±2.13 | 2.45±0.19 |
| 空白对照 | 151.62±5.85 | 27.31±2.46 | 3.48±0.62 |
可知，不同剂量的茯苓多糖制剂均可提高SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量。且模型对照效果显著，说明造模成功。P<0.05差异显著，剂量为10g/kg组与对照相比，差异极显著。
表6：对小鼠肝组织中MDA含量及GSH-Px活力的影响(x±s)
| 剂量(g/kg) | MDA(nmol/mg) | GSH-Px(U/mg) |
| 模型对照 | 0.0421±0.004c | 22.01±0.18c |
| 2.5 | 0.0441±0.006 | 19.98±1.02 |
| 5 | 0.0439±0.002 | 20.86±0.59 |
| 10 | 0.0431±0.005 | 21.32±0.28 |
| 空白对照 | 0.0443±0.007 | 19.56±1.27 |
可知，与空白对照相比，MDA的含量随着剂量的增加，逐步递减，虽然不是线性关系但差异显著，GSH-Px的活力也逐步升高。P<0.05差异显著，c表示P<0.01差异极显著。
综上所述，茯苓-香菇柄-山楂叶固态发酵工艺有增效作用，其提取液具有抗衰老、抗氧化的功效。
实施例2
上述工艺D-1中，茯苓-香菇柄-山楂叶固态发酵复合物，再配伍组分山楂、党参、枸杞、葛根、罗汉果，比例5:1:1:1:0.1:0.1(w/w)；把葛根换为三七，余同。
Claims (1)
1.一种茯苓固态发酵功能饮品，由以下重量比例的原料制成：
蒸馏水或软化水提取，料液比1∶10，温度45-55℃，压力0.06兆帕条件下浸提20分钟，过滤得第一次浸提液；滤渣加首次提取水量，同上条件下浸提20分钟，过滤得第二次浸提液；将两次浸提液混合，得到提取液；常规饮品糖酸比勾兑即可；
其中所述的茯苓-香菇或香菇柄-山楂叶的固态发酵复合物，是以香菇或香菇柄和山楂叶为特殊基质，以茯苓为出发菌种固体发酵制备的。
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