CN1075654A - 含茯苓菌丝或其提取物的制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种以茯苓深层发酵醪液为基础，含
茯苓菌丝或其提取物的制剂及其制备方法，其特点是
与一般茯苓制品不同的是其产品是含有茯苓菌丝或
其提取物，发酵培养基完全采用天然食物成分，发酵
周期短，发酵醪液内菌丝浓度和粗多糖含量较高(分
别为1.5％和0.4％以上)。经过毒理试验，本产品安
全无毒，具有安神宁心，健脾消肿作用，并且可以大幅
度提高机体免疫功能，明显改善失眠，头晕，心悸，气
短，水肿，乏力等临床症状，本制剂可制成乳液、粉状、
口服液、饮料，并与其它食品或药品成分构成复方制
剂。
Description
本发明涉及一种以茯苓深层发酵醪液为基础，含茯苓菌丝或其提取物的制剂及其制备方法。
茯苓（poria cocos）是中国和亚洲许多国家最重要的、传统方剂频率最高的食药兼用中药材。一般入药或食品取其菌核，有补中、益肾、利尿、安神等功效，其药理成份主要有茯苓酸（pachymic acid）、层孔酸（eburicoic acid）、去氢层孔酸（dehydroeburicoic acid）、松苓酸（Pinicklic acid）等三萜类化合物和卵磷脂、麦角甾醇、胆碱、腺嘌呤等。然而从茯苓菌核中分离的（β-Pachyman）却没有抗癌活性。T·Narui等（1980），户上昌纪等（1982，1983）金山久等（1986）报道，发酵茯苓菌丝中的多糖在结构、特性等方面与Pachyman不同。其中某些组分有强抗癌活性。以上研究成果说明，发酵菌丝可能成为生产保健食品及制剂的新资源。但是迄今报道的茯苓深层发酵技术，发酵周期较长（7天），菌丝和多糖收率不高（分别为1%和0.29%）。发酵茯苓菌丝也没有在食品或药品当中应用。
本发明目的是通过对培养茯苓培养基和发酵条件的研究，提高茯苓菌丝的发酵水平，并利用茯苓菌丝和发酵醪液加工制成保健制剂。
本发明使用的菌种为Poria COCOS 5-78，购自中科院菌种保藏中心。
本发明设计的发酵培养基成份如下：
碳源，每升中含：
葡萄糖 5～80克
蔗糖 5～80克
饴糖 5～80克
淀粉 5～40克
玉米粉 5～40克
燕麦粉 5～40克
米粉 5～40克
马铃薯 5～40克
以上成份1种或2种以上;
氮源，每升中含：
豆粉 3～30克
大豆粉 3～30克
豆粕粉 3～40克
花生蛋白粉 3～30克
花生粕粉 3～40克
芝麻 3～30克
芝麻粕粉 3～40克
小麦胚芽粉 3～20克
玉米胚芽粉 3～20克
酵母粉 1～20克
以上成份1种或2种以上;
其他，每升含：
珍珠粉 0.2～10克
贝母粉 0.2～10克
活性钙粉 0.2～10克
牡蛎粉 0.4～10克
骨粉 0.4～10克
以上成份1种或2种以上。
本发明按以下发酵条件进行发酵培养。
斜面菌种培养温度15～32℃，培养时间6～18天;
摇瓶种子通过三级逐级扩大培养：
一级：500毫升摇瓶，培养基装量50～200毫升（按常规高压灭菌），接种量，斜面菌种0.5～3厘米2/瓶，15～32℃，100～250rpm振荡培养5～18天;
二级：除接种量3～30%以外，其他同一级摇瓶;三级：5升摇瓶，培养基装量0.5～2升，接种量3～30%，培养条件与时间同一、二级种子培养。种子罐分0～2级，采用搅拌方式或气升式发酵罐，容量：一级种子罐50～200升，二级种子罐，300～2000升，接种量3～30%，发酵温度15～32℃，搅拌速度50～300rpm，通气量1∶0.5-1，培养时间2-12天;
发酵罐，采用搅拌式或气升式发酵罐，容量200～10000升，接种量与发酵条件与种子罐相同，发酵时间48～144小时，当醪液淀粉反应阴性，可溶性固形物≤4时，可终止发酵，得到发酵原液。
本发明采用以下方法将发酵原液加工为含茯苓菌或菌丝提取物的制剂。
1.含茯苓菌丝的制剂：
按以下配比进行调配：
茯苓发酵原液 1000克
红枣（或枸杞、山楂、木耳、山药等） 0～80克
豆粉（或花生蛋白粉、奶粉） 0～70克
蔗糖 1000克
琼脂（或黄原胶、明胶、羧甲基纤维素、1～5克海藻酸等）
上述调配好的发酵原液通过胶体磨和高压匀浆泵进行均质处理，均质压力20～60NPa，然后灌装到玻璃瓶中，封口后高压灭菌，压力0.10～0.14MPa，时间20～60分钟，即为含茯苓菌丝的乳液制剂。
发酵原液不经调配，经打浆机打浆后，真空浓缩3～10倍后，喷雾干燥，喷粉入口温度160～200℃，出口温度100～120℃，或浓缩后在60～70℃，0.0080～0.0087MPa真空干燥，即得到发酵茯苓全粉。该全粉可以作为营养剂装填胶囊直接食用，也可作为加工食品、药品的原料。
发酵原液经离心或过滤，分为菌丝和滤液两部分。菌丝在60～100℃温度下干燥为菌丝粉，加5～15倍水，在80～100℃温度下提取0.5～5小时，同样步骤重复1～3次，得到的提取液与前述分离菌丝后的滤液合并加辅料调配，直接或浓缩2～8倍后灌装至玻璃瓶或铁质饮料罐内，封口后，在80～121℃温度下杀菌20～60分钟，得到发酵茯苓口服液或饮料。
本产品具有以下特点：
1.与一般茯苓制品不同，本产品是含茯苓菌丝或菌丝提取物的保健制剂。
2.发酵培养基完全采用天然食物成分，特别是以淀粉或含淀粉的食物成份为碳源，以酵母、大豆、花生、芝麻、燕麦、玉米或小麦胚芽为氮源，以珍珠粉、牡蛎粉、活性钙粉、骨粉代替一般发酵培养基中的无机成份。
3.与前人报道相比，发酵周期较短（4天），发酵醪液内菌丝浓度和粗多糖含量较高（分别为1.5%和0.4%以上）。
4.经过毒理试验，证明本产品安全无毒。
5.本产品具有宁心安神、健脾消肿作用，可以大幅度提高机体免疫功能，明显改善失眠、头晕、心悸、气短、水肿、乏力等临床症状。
实施例1.
按以下组成配制1升培养基
葡萄糖 20克 豆粕粉 5克
酵母粉 2克 珍珠粉 0.5克
玉米粉 5克 骨粉 0.5克
加水至一升 PH自然
以上培养基分装于500毫升三角烧瓶，每瓶150毫升，0.1MPa灭菌，每瓶接种茯苓5.78斜面菌种1厘米2，置于140rpm旋转摇瓶机上，在25±1℃温度下振荡培养8天，得到一级摇瓶种子液;用500毫升三角瓶，上述同样培养基，每瓶接种一级摇瓶种子液5毫升，在同样条件下培养4天得到二级摇瓶种子液;
按以下组成配制10升培养基
葡萄糖 200克 酵母粉 20克
玉米粉 50克 豆粕粉 50克
珍珠粉 5克 骨粉 5克
加水至10升 PH自然
以上培养基分装于5升三角瓶，每瓶1.5毫升，0.1MPa灭菌，每瓶接种二级摇瓶种子液70毫升，与一、二级摇瓶同样条件下振荡培养4天，得到三级摇瓶种子液。
用200升不锈钢搅拌式发酵罐，按以下配比投料：
葡萄糖 3公斤 豆粕粉 1.5公斤
酵母粉 0.3公斤 珍珠粉 75克
玉米粉 1.5公斤 骨粉 75克
加水至150升 PH自然
0.14MPa下灭菌0.5小时，接入三级种子液7.5升。发酵温度25±1℃，搅拌速度80rpm，通风量1∶0.5，96小时后终止发酵，放罐，得到茯苓发酵原液140升，原液呈浅棕色粘稠，有特殊的水果香味，PH3.2，可溶性固形物2.5%，淀粉反应阴性，菌丝浓度1.6%（干基）。
实施例2.
二、三级摇瓶种子液培养步骤及发酵罐与实施例1相同，按以下配比投料：
葡萄糖 22.5公斤 玉米胚芽粉 0.4公斤
玉米淀粉 1.05公斤 贝母粉 0.1公斤
酵母粉 0.23公斤 骨粉 0.05公斤
大豆蛋白粉 0.4公斤 加水至150升 PH自然
灭菌及发酵条件同实施例1，发酵96小时后终止，放罐，得到茯苓发酵原液140升，PH3.0，可溶性固形物2.2%，淀粉反应阴性，菌丝浓度2.0%（干基），原液中胞内粗多糖含量0.3%，胞外粗多糖含量0.8%。
实施例3.
按实施例2步骤制取发酵原液，取100公斤，在夹层锅内，添加蔗糖6公斤，琼脂100克，明胶100克，加热至100℃，20分钟，通过打浆机打浆，经胶体磨和高压匀浆泵进行均质处理，均质压力25MPa，将均质后的棕色乳液灌装到玻璃瓶中，封口后，在0.1MPa压力下灭菌0.5小时，即得到含茯苓菌丝的制剂，该制剂为浅棕色乳液，内含氨基酸、膳食纤维，钙、磷、铁、锌、维生素B、E、胡罗卜素和多糖。毒理学二级段毒性试验显示无毒性。小鼠免疫试验表明该制剂显著提高实验动物体液和细胞免疫功能。
将得到的含茯苓菌丝的乳液，用小鼠进行急性经口LD50测定，经口蓄积毒性试验，骨髓嗜多染细胞微核试验和AnRS试验。
40只健康成年小鼠，雌雄各半，各剂量组均无死亡，雌性LD50＞21.5克/公斤体重;雄性LD50＞21.5克/公斤体重;表明该乳液为实际无毒类物质。
40只健康成年小鼠，雌雄各半，连续给药28天后，观察一周，未见死亡，蓄积系数＞12.8，属轻度蓄积性。50只健康成年小鼠，雌雄各半，通过骨髓嗜多染细胞微核试验，表明该乳液未显示致突变作用。
| 组别 | 剂量 | 动物数（只） | 检查细胞数（个） | 含微核细胞数（个） | 微核率（％） |
| 阴性对照 | 10 | 10×100 | 33 | 3.3 | |
| 1/20 LD50 | 1 | 10 | 10×100 | 28 | 2.8 |
| 1/10 LD50 | 2 | 10 | 10×100 | 39 | 3.9 |
| 1/2 LD50 | 10 | 10 | 10×100 | 29 | 2.9 |
| 阳性对照 | 0.04(C .p) | 10 | 10×100 | 432 | 43.2 |
注：阳性对照为腹腔注射环磷酰胺。
＊ 与阴性对照组差异显著（ρ＞0.01）。
用25只雄性昆明小鼠，以腹腔注射环磷酰胺为阴性对照，在精子畸形试验中，本乳液未显示有致突变作用。
| 组别 | 剂量（克／公斤体重） | 动物数（只） | 检查细胞数（个） | 精子畸形数（个） | 畸形率（％） |
| 阴性对照 | 5 | 5×1000 | 119 | 23.8 | |
| 1/20 LD50 | 1 | 5 | 5×1000 | 72 | 14.4 |
| 1/10 LD50 | 2 | 5 | 5×1000 | 91 | 18.2 |
| 1/2 LD50 | 10 | 5 | 5×1000 | 137 | 27.4 |
| 阳性对照 | 0.04 | 5 | 5×1000 | 466 | 93.2* |
＊ 与阴性对照组比差异显著（ρ＜0.01）。
用鼠伤寒沙门氏菌营养缺陷型回复突变试验<AmeS试验>，该乳液呈阴性结果。
| 菌株浓度（μL/ | TA97 | TA98 | TA100 | TA102 | ||||
| -S9 | +S9 | -S9 | +S9 | -S9 | +S9 | -S9 | +S9 | |
| 0.0002 | － | － | － | － | － | － | － | － |
| 0.001 | － | － | － | － | － | － | － | － |
| 0.01 | － | － | － | － | － | － | － | － |
| 0.1 | － | － | － | － | － | － | － | － |
| 1 | － | － | － | － | － | － | － | － |
| 阴性对照 | － | － | － | － | － | － | － | － |
| 阳性对照 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
＊ S9为体外活化系统。
上述毒理学二阶段毒理试验证明该乳液无毒性。
将制得的含茯苓菌丝的乳液，用一月龄BALB/C近交系雄性小鼠，以自然饮水方式同喂2个月，日饮量9.78±0.93毫升或10.73±1.01毫升。测定各项免疫指标结果如下：
| 指标处理 | 迟发型过敏反应×±S.E(厘米） | 溶血素生成量×S.E | 巨噬细胞吞噬率×S.E% | 胸泉重×±S.E(毫克） | 脾脏重×±S.E（毫克） |
| 含茯苓菌丝乳液 | 0.134±0.066 | 131.8±59.4 | 27.8±6.9 | 47.5±6.9 | 99.5±15.9 |
| 对照 | 0.084±0.035 | 55.8±43.7 | 10.7±5.5 | 21.7±9.4 | 64.4±8.9 |
| t测验 | ρ＜0.01 | ρ＜0.01 | ρ＜0.01 | ρ＜0.01 | ρ＜0.01 |
| 提高％ | 59.5 | 136.2 | 159.8 | 118.9 | 54.57 |
实施例4：
按实施例2步骤制取发酵原液，在夹层锅内加发酵茯苓原液100公斤，大枣肉2公斤，去核山楂2公斤，黑木耳两公斤，蔗糖7公斤，明胶100克，以下调配、均质、灌装、杀菌步骤同实施例3，得到含茯苓菌丝的复方制剂。该制剂为棕色乳液，味酸甜，经过小鼠免疫试验证明显著提高实验动物体液和细胞免疫功能。
有雄性小鼠，以灌胃方式连续10天喂给制得的含茯苓菌丝的复方乳液，日灌胃量0.5毫升，测定网状内皮系统吞噬功能（吞噬速率），溶血素生成和丝裂原ρHA，ConA刺激脾细胞转化（3H-TdR掺入值）等免疫指标。
| 指标处理 | 网状内皮系统吞噬指数X±SE | 溶血素生成X±SE | 3H - TdR掺入值〈 CPm,X±SD | |
| ρHA | ConA | |||
| 试验组 | 0.0272±0.0033 | 1.04±0.26 | 28901.6±6072.2 | 78268.8±22188.2 |
| 对照组 | 0.0119±0.003 | 0.54±0.14 | 5282.1±2502.0 | 24846.4±6501.6 |
| t测验 | ρ＜0.05 | ρ＜0.01 | ρ＜0.001 | ρ＜0.001 |
33例心脑血管病、结蒂组织病、血液病、风湿病、地方心脏病、肿瘤病、慢性感染患者，男性12例，女性21例，年龄最大76岁，最小23岁，年均50.5岁，饮用得到的复方乳液，日饮2次，每次125毫升。观察临床症状及细胞免疫作用的变化。连续饮用四周，自觉症状消失，淋巴细胞转化率恢复达60～755之间，T4细胞＞355为显效;自觉症状好转或消失，淋巴细胞转化率在50～605，T4＞35%为有效;淋巴细胞转化率＜505，T4＜355为无效。结果如下;
| 项目 | 例数 | 饮用 | 效果 | ρ值 |
| 饮用前X±S | 饮用后X±S | |||
| 淋巴细胞转化率％ | 33 | 47.7±8.4 | 60.4±12.3 | ＜0.05 |
| T4% | 33 | 28.3± | 37.4±5.2 | ＜0.05 |
| 疗效评定观察项目 | 例数 | 显效 | 有效 | 无效 | 有效率％ |
| 心悸 | 22 | 8 | 4 | 8 | 54.5 |
| 气短 | 19 | 8 | 1 | 9 | 50 |
| 胸闷 | 19 | 4 | 5 | 10 | 47.4 |
| 失眠 | 18 | 6 | 5 | 7 | 61.1 |
| 恶心 | 4 | 3 | 1 | 75 | |
| 头晕 | 25 | 6 | 12 | 7 | 72 |
| 乏力 | 33 | 11 | 19 | 3 | 90.9 |
| 水肿 | 9 | 8 | 1 | 100% |
实施例5：
用2.5吨不锈钢机械搅拌式发酵罐，按以下配比投料：
葡萄糖 30公斤
酵母粉 3公斤
玉米淀粉 15公斤
大豆蛋白粉 15公斤
贝母粉 0.70公斤
活性钙粉 0.70公斤
水 1500公斤
实消条件同实施例1，以实施例2同样的发酵罐作为种子罐，同样步骤发酵72小时，得到约150升种子液，转入上述经过实消的发酵罐，与实施例1同样条件，发酵96小时后终止，得到约1500公斤原液，PH3.3，可溶性固形物2.5、菌丝浓度1.9%（干基），胞内粗多糖含量占原液0.4%。
将上述发酵原液在60℃，0.087MPa下减压浓缩至400公斤，再在65℃，0.008MPa下真空干燥得棕色发酵茯苓全粉37.5公斤，以此粉5公斤灌装硬胶囊，0.25克/粒，得发酵茯苓胶囊20000粒。
实施例6：
依实施例5所述方法制得发酵茯苓全粉，按以下配比添加辅料
发酵茯苓全粉 10公斤
乌龙茶 10公斤
去核大枣干粉 10公斤
以上成分混合均匀，纸袋包装，每袋3克，得含茯苓菌丝的茶剂10000袋。
实施例7：
按实施例5的培养基和发酵方法，用2.5吨不锈钢发酵罐发酵，得到1500公斤以酵茯苓原液。板框过滤分离菌丝，80±1℃烘干，得到干菌丝23公斤。将此干菌丝置夹层锅内，加水230公斤，加热至100℃，保持2小时，滤出提取液，加水138公斤，加热至100℃，保持1小时，滤出提取液，再加水138公斤，加热至100℃，保持1小时，滤出提取液;将三次提取液合并，共240公斤，与分离菌丝得到的滤液1380公斤合并，添加蜂蜜378公斤，柠檬酸1.5克，混匀后，用真空浓缩罐浓缩至800公斤，灌装10毫升口服液瓶。封盖，80℃灭菌30分种，得含茯苓菌丝提取物的口服液80000支。
Claims (4)
1、一种含茯苓菌丝或其提取物的制剂，其特征在于含有茯苓菌丝或茯苓菌丝提取物。
2、根据权利要求1所述的含茯苓菌丝或其提取物的制剂，其特征在于此制剂可以是乳液，澄清液或粉剂。
3、根据权利要求1所述的含茯苓菌丝或其提取物的制剂，其特征在于此制剂可以是单独由茯苓菌丝或茯苓菌丝提取物构成，也可以与食品或药品成分构成复方。
4、一种含茯苓菌丝或其提取物的制剂的制备方法，其特征在于：
（1）发酵培养基成分：
碳源，每升中含：
葡萄糖 5～80克
蔗糖 5～80克
饴糖 5～80克
淀粉 5～40克
玉米粉 5～40克
燕麦粉 5～40克
米粉 5～40克
马铃薯 5～40克
以上成份一种或二种以上;
氮源，每升中含：
豆粉 3～30克
大豆蛋白粉 3～30克
豆粕粉 3～40克
花生蛋白粉 3～30克
花生粕粉 3～40克
芝麻 3～30克
芝麻粕粉 3～40克
小麦胚芽粉 3～20克
玉米胚芽粉 3～20克
酵母粉 1～20克
以上成份一种或二种以上;
其它，每升含：
珍珠粉 0.2～10克
贝母粉 0.2～10克
活性钙粉 0.2～10克
牡蛎粉 0.4～10克
骨粉 0.4～10克
以上成分一种或二种以上。
（2）将茯苓发酵原液10000
与红枣（或枸杞、山楂、木耳、山药等） 0～80克
豆粉（或花生蛋白粉、奶粉） 0～70克
蔗糖 60～100克
琼脂（或黄原胶、明胶、羧甲基纤维素，1～5克海藻酸钠等）
（根据生产量按此比例放大）
调配好后通过胶体磨和高压匀浆泵进行均质处理，制成菌丝乳液。
（3）或发酵原液不经调配，经打浆机打浆后，真空浓缩3～10倍，喷雾干燥或真空干燥，得到茯苓发酵全粉。
（4）或发酵原液经离心过滤，分为菌丝和滤液，将菌丝在60～100℃温度下干燥为菌丝粉，加5～15倍80～100℃的热水，再将菌丝粉的热水提取物与滤液合并制成澄清液。
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|---|---|---|---|
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1993
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