CN1275604C - 用于白细胞活化和增殖的口服组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及保健食品、保健饮料和保健补充剂。本发明涉及含有能提高动物免疫功能的酵母细胞的生物组合物。本发明涉及该生物组合物的制造方法，以及利用该生物组合物通过促进白细胞活化和增殖对免疫缺陷疾病或免疫抑制的患者产生有益健康效果的方法。

Description

用于白细胞活化和增殖的口服组合物
1.发明领域
本发明涉及可以通过促进白细胞活化和增殖对患免疫缺陷疾病或免疫抑制的主体产生有益健康效果的含有酵母细胞的口服组合物。本发明还涉及制造这种口服组合物的方法以及这种组合物的使用方法。
2.发明背景
2.1免疫缺陷疾病
免疫系统保护机体不受潜在有害物质的损害，如微生物、毒素、癌细胞、和来自他人的血液和组织。免疫系统是高度专业性细胞、一个循环系统(独立于血管)和多个器官的复合体。淋巴管、淋巴节、以及位于扁桃腺、胸腺、肝、脾、阑尾、派尔结和骨髓中的淋巴样组织一起形成修复损伤、为机体排除感染的复杂网络。
免疫系统的主要细胞是淋巴细胞，包括巨嗜细胞、中性粒细胞和白细胞。作为淋巴系统主要细胞的淋巴细胞与巨嗜细胞和中性粒细胞相比相对较小。主要有两类白细胞：(1)B细胞，它们来源于骨髓中的母细胞(干细胞)，并成熟为浆细胞；和(2)T细胞，它们形成于干细胞从骨髓迁移到胸腺时，在胸腺中它们进行分裂、成熟和从非己分化为自体。还包括自然杀伤细胞，它们比B细胞和T细胞稍大，不需要B细胞和T细胞所需的成熟和分化过程，可以直接杀死入侵细胞。
B细胞是所谓抗体介导的免疫或体液免疫的组成部分。当受到抗原(在机体中诱导免疫应答的外源物质)刺激时，B淋巴细胞成熟为能产生IgM、IgG、IgA、IgE和IgD五类抗体(其受体专用于结合特异的抗原)之一的细胞。另一方面，T细胞负责细胞介导的免疫或细胞免疫、负责刺激B细胞，T细胞又可分为辅助T细胞(CD4+)、抑制性T细胞、和细胞毒性T细胞(CD8+)。T淋巴细胞依赖于称为主要组织相容性复合物(MHC)的独特细胞表面分子识别抗原片段，攻击并摧毁它们识别为抗原的疾病细胞。
免疫缺陷疾病是一类免疫系统功能不足的各种疾病，其使得感染更常见、更频繁，造成异常的重度、持久症状。免疫缺陷疾病可以是生来就有的(先天性)和/或后天获得的(获得性)。获得性免疫缺陷疾病的一些病因包括遗传和代谢性疾病(例如糖尿病、唐氏综合征、肾功能衰竭、营养不良、镰状细胞贫血病)、抑制免疫系统的化学药品和治疗(例如肿瘤化疗、皮质类固醇、免疫抑制性药物、放射治疗)，感染(例如水痘、巨细胞病毒感染、风疹、传染性单核细胞增多症、麻疹、重度细菌或真菌感染、重症结核)、血液病和血液相关肿瘤(例如粒细胞缺乏症、再生障碍性贫血、组织细胞增多病、骨髓纤维化、骨髓瘤)、烧伤、脾切除、酒精性肝硬化、慢性肝炎、正常老化、结节病和系统性红斑狼疮等。
一些免疫缺陷疾病是可以预防或治疗的。强烈推荐注意饮食、保持良好的卫生以及戒烟、戒毒。对可以产生抗体的可以接种灭活的(而非活的)疫苗。在感染症状出现前或刚出现时可以给予抗体。可以增强免疫系统的药物包括左旋咪唑、异丙肌苷和胸腺激素。通过输入或注射免疫球蛋白可以将低水平的抗体提高。一些试验性方法，例如胎胸腺细胞和胎肝细胞的移植、酶疗法和基因疗法，有时是有用的。对于白细胞不正常的患者一般不进行输血，除非对供血先照射以防止在受血者血液中产生攻击。另外，骨髓移植有时可以治疗严重的免疫系统缺陷。
虽然药物治疗、疫苗、输血和骨髓移植对预防和/或控制感染性疾病是有用的，但仍需要更有效、毒性更低的治疗免疫抑制或免疫缺陷疾病的更好的治疗形式和途径，特别是临床医生更多关注患者的生活质量时更是如此。本发明提供了一种用含酵母的口服组合物进行免疫疾病治疗和免疫缺陷控制的替代途径，以促进白细胞的活化和增殖。
2.2基于酵母的组合物
已有酵母和其成分被开发用于饮食补充剂或者药物。但没有现有技术方法使用在电磁场中培养的酵母来生产促进白细胞活化和增殖的产品。以下是酵母和其成分现有应用的一些例子：
美国专利6,197,295公开了一种可以用作饮食补充剂的富含硒的干酵母产品。酵母株Saccharomyces boulardii sequela PY 31(ACTT 74366)在硒盐存在下培养，其含有300到约6000ppm的细胞内硒。还公开了该含硒酵母产品与化疗药物联合给药减少流感样症状的方法。
美国专利6,143,731公开了一种含有来自酵母的全β-葡聚糖的饮食添加剂，给予动物或人时，能提供食物纤维来源、粪便膨胀剂、短链脂肪酸来源，降低胆固醇和LDL水平并提高HDL水平。
美国专利5,504,079公开了一种利用具有高免疫生物活性的改性酵母葡聚糖刺激免疫应答的方法。这种改性葡聚糖制剂与天然物质相比含有高比例的β(1-6)→β(1-3)糖苷键。这种改性葡聚糖由酵母属酵母的细胞壁通过用碱提取细胞并用乙酸或葡聚糖酶处理提取的葡聚糖而制成。也见相关的美国专利5,082,936。
美国专利4,348,483公开了一种制备具有高细胞内铬含量的铬酵母产品的方法。该方法包括让酵母细胞在控制的酸性pH值下吸收铬，然后加入营养物诱导该酵母细胞生长。该酵母细胞经干燥用作饮食补充剂。
这里引述这些文献并不是承认任何这些所引述的文献为相关的现有技术，或承认所引述的文献对本申请权利要求的专利性有实质性影响。所有关于这些文献的日期或内容的陈述都是以申请人现有信息为基础的，并不等于承认这些文献的日期或内容的正确性。
3.发明内容
本发明涉及用于通过促进白细胞活化和增殖治疗免疫缺陷疾病或免疫抑制的生物组合物或口服组合物。在一种实施方案中，本发明提供含有能对患有免疫缺陷疾病或处于免疫抑制状态的主体产生有益健康效果的活酵母的生物组合物。在另一实施方案中，本发明提供制备这种生物组合物的方法，以及使用该生物组合物的方法。
具体讲，本发明的方法包括在一系列电磁场存在下培养酵母细胞，使酵母细胞呈代谢活性。所用的电磁场各自以五个频率范围之一和一个宽范围的场强确定。起始酵母细胞是市场上有售的和/或公众可以获得的，例如(但不限于)酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。本发明制备生物组合物的方法还包括在电磁场存在下在植物提取物和动物胃液中调理或驯化所述活化酵母细胞。
所述制备方法可包括在电磁场存在下在大规模培养中扩大被活化并调理酵母细胞的数量，采取质量控制措施和包装。本发明的药物组合物包括活化并调理的酵母细胞和一种或多种药物可接受的赋形剂或载体。可以向所述生物组合物中加入其他成分如维生素和/或娇味剂，以形成本发明的口服组合物。这种额外的载体和成分可以提高口服组合物的有益健康效果、药理特性和感官特性。在制造过程中，活化的或活化并调理的酵母细胞可以被干燥，并保存一段时间。
本发明的生物或口服组合物由相关主体摄食或者用作待掺入相关主体食物中的添加剂。本发明包括含有活化并调理酵母细胞的饮食补充剂和营养组合物。优选所述主体是人类。
在各种实施方案中，本发明的生物或口服组合物用于通过促进白细胞的活化和增殖在免疫缺陷疾病或免疫抑制主体中产生有益健康效果。
4.附图简述
图1：酵母细胞的活化和调理。1.酵母细胞培养物；2.容器；3.电磁场源；4.电极。
图2：酵母细胞的大规模增殖。5.第一容器；6.第二容器；7.第三容器；8.酵母细胞培养物；9.电磁场源。
5.发明详细描述
本发明涉及可对免疫抑制或免疫缺陷主体产生有益健康效果的生物组合物。本发明提供该生物组合物的制备方法以及使用该生物组合物的方法。
在一个实施方案中，本发明提供含有酵母的生物组合物。与传统的酵母在食品加工中的应用不同，本发明的酵母细胞不是作为作用于食物成分的酶的来源。这些酵母不是作为主体的主要营养来源，酵母细胞也不是用作物质的载体，如金属盐的载体。本发明的酵母在口服或与食物一起由主体摄取时是活的。虽不拘于任何理论或机制，发明人相信本发明的培养条件激活和/或扩增了酵母细胞中的某种基因或一组基因的表达，使得酵母细胞可以高效地刺激动物的免疫系统，包括特异的和非特异的免疫反应。使用本发明的生物组合物所提供的有益健康效果已在动物免疫抑制或免疫缺陷模型中得到证实，显示出白细胞计数的提高。
在另一实施方案中，本发明提供制备本发明生物组合物中之酵母细胞的方法。起始材料是易于从市场上获得或从公共微生物保藏机构获得的普通酵母细胞。本发明的方法包括可重复应用来激活酵母细胞的一套培养条件。本发明方法中所用培养条件的关键特征是施用于生长中的活酵母细胞培养物的具有确定频率范围和场强的一系列交变的电磁场。该方法还包括调理或驯化被活化的活酵母细胞以适应主体胃的酸性环境的步骤。这些方法中使用的电磁场可以在各种规模下重复设置，从而使得甚至可以大规模制造本发明的生物组合物。通过小心控制培养条件，可以将普通的酵母细胞可重复地、成常规地活化转变成本发明的酵母细胞。
在又一实施方案中，本发明提供口服组合物的制造方法，所述口服组合物含有本发明的活化并调理的酵母和其他成分，包括但不限于，药物可接受的载体或赋形剂、维生素、草药提取物、矿物质、氨基酸、调味剂、着色剂或防腐剂。
在又一实施方案中，本发明的生物组合物可以添加到主体食用的食物中。如相关领域技术人员所知，可以使用许多方法将本发明的生物或口服组合物与食物混合，而保持酵母细胞存活。在一个具体的实施方案中，就在食用前将含有本发明活酵母细胞的培养液直接加入到食物中。也可以在食用前将干酵母粉配制然后直接加入到食物中。
在各种实施方案中，本发明的口服组合物可以由主体直接摄取或直接喂给主体。例如，主体可以直接饮用含有活化并调理酵母细胞的培养液或其提取部分。含有干酵母细胞的口服组合物也可以以固体剂型给予主体。
虽然不是必需的，本发明的生物或口服组合物可以与其他治疗形式如(但不限于)外科手术、化疗药物、抗感染药物、输血、骨髓移植、疫苗和放射疗法联合或交替使用。因为本发明的生物组合物是口服给药的，专业医护人员的帮助在该组合物的给药中一般不是必需的。
在下面的5.1节中描述本发明的酵母细胞和其制造方法。5.2节中描述本发明生物组合物在患免疫缺陷疾病或免疫抑制状态的主体中的应用。
                5.1酵母细胞培养物的制备
该生物组合物中的酵母细胞是在交变电磁场的存在下、在合适的培养基中，在一段时间内培养多个酵母细胞而制备的。该方法包括第一个步骤-活化酵母细胞，和第二个步骤-调理已活化的酵母细胞。活化过程包括在一组特定频率和场强的五个电磁场中培养酵母细胞。调理过程包括在电磁场存在下、在含植物提取物和动物胃液的培养基内进一步培养已活化的酵母细胞。活化并调理的酵母细胞可以在合适的条件下干燥后以干细胞的形式储存。活化并调理的干酵母细胞日后可以用于本发明生物组合物的大规模生产培养过程。本发明的各种培养过程可以是批次过程，也可以是连续过程。
                        5.1.1酵母
在各种实施方案中，酵母属(Saccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、Crebrothecium、地霉菌属(Geotrichum)、汉逊酵母属(Hansenula)、克勒克酵母属(Kloechera)、油脂酵母属(Lipomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、红酵母属(Rhodotorula)、球拟酵母属(Torulopsis)、丝孢酵母属(Trichosporon)和维克氏酵母属(Wicherhamia)等属类的酵母可用于本发明。通常优选用于食品加工的真菌。
酵母菌株的非限定性例子包括：酵母属菌株AS2.311；栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe Linder)AS2.214、AS2.248、AS2.249、AS2.255、AS2.257、AS2.259、AS2.260、AS2.274、AS2.994、AS2.1043、AS2.1149、AS2.1178、IFFI 1056；清酒酵母(Saccharomyces sake Yabe)ACCC2045；葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum Beijer)IFFI 1023、IFFI1032、IFFI 1044、IFFI 1072、IFFI 1205、IFFI 1207；鲁氏酵母(Saccharomycesrouxii Boutroux)AS2.178、AS2.180、AS2.370、AS2.371；酿酒酵母卵形变种(Saccharomyces cerevisiae Hansen Var.ellipsoideus)ACCC2043、AS2.2、AS2.3、AS2.8、AS2.53、AS2.163、AS2.168、AS2.483、AS2.541、AS2.559、AS2.606、AS2.607、AS2.611、AS2.612；卡尔斯伯根糖酵母(Saccharomyces carlsbergensis Hansen)AS2.162、AS2.189、AS2.200、AS2.216、AS2.265、AS2.377、AS2.417、AS2.420、AS2.440、AS2.441、AS2.443、AS2.444、AS2.459、AS2.595、AS2.605、AS2.638、AS2.742、AS2.745、AS2.748、AS2.1042；橙黄红酵母(Rhodotorula aurantiaca(Saito)Ladder)AS2.102、AS2.107、AS2.278、AS2.499、AS2.694、AS2.703、AS2.704和AS2.1146；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae Hansen)ACCC2034、ACCC2035、ACCC2036、ACCC2037、ACCC2038、ACCC2039、ACCC2040、ACCC2041、ACCC2042、AS2.1、AS2.4、AS2.11、AS2.14、AS2.16、AS2.56、AS2.69、AS2.70、AS2.93、AS2.98、AS2.101、AS2.109、AS2.110、AS2.112、AS2.139、AS2.173、AS2.182、AS2.196、AS2.242、AS2.336、AS2.346、AS2.369、AS2.374、AS2.375、AS2.379、AS2.380、AS2.382、AS2.393、AS2.395、AS2.396、AS2.397、AS2.398、AS2.399、AS2.400、AS2.406、AS2.408、AS2.409、AS2.413、AS2.414、AS2.415、AS2.416、AS2.422、AS2.423、AS2.430、AS2.431、AS2.432、AS2.451、AS2.452、AS2.453、AS2.458、AS2.460、AS2.463、AS2.467、AS2.486、AS2.501、AS2.502、AS2.503、AS2.504、AS2.516、AS2.535、AS2.536、AS2.558、AS2.560、AS2.561、AS2.562、AS2.576、AS2.593、AS2.594、AS2.614、AS2.620、AS2.628、AS2.631、AS2.666、AS2.982、AS2.1190、AS2.1364、AS2.1396、IFFI 1001、IFFI 1002、IFFI 1005、IFFI1006、IFFI 1008、IFFI 1009、IFFI 1010、IFFI 1012、IFFI 1021、IFFI 1027、IFFI 1037、IFFI 1042、IFFI 1045、IFFI 1048、IFFI 1049、IFFI 1050、IFFI1052、IFFI 1059、IFFI 1060、IFFI 1062、IFFI 1202、IFFI 1203、IFFI 1209、IFFI 1210、IFFI 1211、IFFI 1212、IFFI 1213、IFFI 1215、IFFI 1220、IFFI1221、IFFI 1224、IFFI 1247、IFFI 1248、IFFI 1251、IFFI 1270、IFFI 1277、IFFI 1289、IFFI 1290、IFFI 1291、IFFI 1292、IFFI 1293、IFFI 1297、IFFI1300、IFFI 1301、IFFI 1302、IFFI 1307、IFFI 1308、IFFI 1309、IFFI 1310、IFFI 1311、IFFI 1331、IFFI 1335、IFFI 1336、IFFI 1337、IFFI 1338、IFFI1339、IFFI 1340、IFFI 1345、IFFI 1348、IFFI 1396、IFFI 1397、IFFI 1399。优选的酵母菌株包括但不限于酿酒酵母AS2.501、AS2.502、AS2.503、AS2.504、AS2.535、AS2.558、AS2.560、AS2.561、AS2.562。
通常，本发明可用的酵母菌株可以从私人或公共实验室培养物中获得，或者从公共菌种保藏中心获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)，美国弗吉尼亚州，马纳萨斯，大学路10801号，邮编20110-2209；以及中国科学院微生物研究所中国微生物保藏管理委员会中国普通微生物保藏管理中心(CGMCC)，中国北京海淀区2714信箱，邮编100080。
下述第6和第7节中给出了使用酿酒酵母菌株IFFI 1202的本发明的非限定性实施例。
虽然优选使用纯酵母菌株，但并不限于以纯酵母菌株开始制备本发明的酵母细胞。该生物组合物中的酵母细胞可以通过不同种或菌株的酵母细胞混合培养获得。酵母细胞混合物的成分可以用本领域熟知的标准酵母鉴定技术来确定。
在本发明的各种实施方案中，应用了酵母处理、转移和储存的标准技术。虽然无菌条件不是必需的，但在实施本发明的生产方法中，特别是当该生物组合物用于人类时，无菌条件或干净的环境是非常有利的。生产方法可以采用本领域的标准操作，以符合产品安全和质量控制的行政要求。
                    5.1.2电磁场
本文使用的术语“交变电磁场”、“电磁场”或“EM场”是同义词。本发明可用的电磁场可以通过本领域熟知的各种方法产生。图1是示范装置的说明图。电磁波源(3)产生具有所需频率和场强的电磁场。该电磁波源由一个或多个能产生电磁波的信号发生器组成，所述电磁波优选为正弦波，优选频率范围为8000MHz-13000MHz。这样的信号发生器为本领域所熟知(例如位于美国加利福尼亚Palo Alto的惠普公司生产的HP 83721B和HP83741A)。也可以使用能够产生较窄频率范围信号的信号发生器。如果需要，可以用信号放大器来增强输出信号，由此增加电磁场的强度。
电磁场可以通过多种方式作用于培养物，包括将酵母细胞紧靠与电磁波源相连的信号发射器放置。一般将酵母细胞置于由非电导体材料制成的容器中，这些材料包括塑料、树脂、玻璃和陶瓷，但不仅限于此。
在一个实施方案中，由浸没于酵母细胞培养物(1)中的电极(4)形式的信号发射器施加电磁场。在优选的实施方案中，一块金属板置于绝缘容器底部(2)，形成一个电极；另一个电极由多个置于容器内部的金属线或金属管组成，它们的排列使电磁场的能量能够均匀分布于培养物中。优选铜制的电极。在垂直设置的培养容器中，金属线或金属管的末梢位于距离容器底部3-30厘米的位置(即距底部为容器高度的2％至10％)。表1提供了一些电极线和绝缘容器的典型尺寸。但表1中的尺寸只用于举例说明，不应理解为仅限于这些尺寸。
表1
  绝缘容器中培养基的高度(cm)   电极线与容器底部之间的距离(cm)   电极线与容器底部之间距离的调节范围(cm)
  15-20   3   3-5
  20-30   5   5-7
  30-50   7   7-10
  50-70   10   10-15
  70-100   15   15-20
  100-150   20   20-30
  150-200   30   25-30
所用电极线的数目取决于培养物的体积和电极线的直径。例如，10升或10升以下的培养物可以使用2到3条直径在0.5-2.0毫米之间的电极线。对于10-100升的培养物，电极线或管的直径可以为3.0-5.0毫米。对于100-1000升的培养物，电极线或管的直径可以为6.0-15.0毫米。对于1000升以上的培养物，电极线或管的直径可以为20.0-25.0毫米。
                5.1.3酵母细胞的活化
根据本发明，制备本发明活化酵母细胞的方法包括在一组五个交变电磁场中培养酵母细胞。
培养过程首先是将所选的酵母菌株接种物(例如5.1.1节中描述的酵母细胞中的一种)接种于1000毫升培养基中，使该培养物的起始细胞密度大于约1×108个/1000毫升。例如，可以使用酿酒酵母IFFI 1202菌株。初始培养物可以为更大规模的培养提供菌种。培养物的温度保持在28℃到32℃的范围，培养22到30小时后再置于电磁场中，典型的情况是在30℃培养28小时。
培养过程优选在溶解氧浓度为0.025到0.08mol/m3的条件下进行，更优选0.04mol/m3。氧气水平可以通过本领域所知的任何常规方法来控制，包括搅拌和/或发泡，但不仅限于此。
最优选该培养过程在含有能被酵母细胞吸收的养分源的液体培养基中进行。表2提供了本发明中用来培养酵母细胞的一种示例性的培养基。
表2
  培养基成分   数量
  蔗糖   18g
  维生素B12   20μg
  维生素B3   40μg
  维生素H   10μg
  胎牛血清   35ml
  KH2PO4   0.20g
  MgSO4·7H2O   0.25g
  NaCl   0.30g
  CaSO4·2H2O   0.20g
  CaCO3·5H2O   4.0g
  蛋白胨   2.5g
  高压蒸汽灭菌水   1000ml
通常，糖类等碳水化合物，例如蔗糖、葡萄糖、果糖、右旋糖、麦芽糖、木糖等以及淀粉，可以单独或联合作为培养基中可吸收碳的来源使用。培养基中碳水化合物的精确用量部分取决于培养基中的其它成分，但通常介于培养基重量的约0.1％到5％之间，优选大约0.2％到2％。这些碳源在培养基中可以单独或联合使用。可以掺入培养基中的无机盐包括能够提供钠、钙、磷酸根、硫酸根、碳酸根等离子的常规盐。营养性的无机盐的非限制性实例有KH2PO4、(NH4)2HPO4、CaCO3、MgSO4、NaCl和CaSO4。
需要注意的是，表2中提供的培养基的成分不是限定性的。该方法的规模可以根据需要按比例增减。考虑到操作的和经济上的因素，例如培养的规模和培养基成分的本地供应等，本领域技术人员可以对培养基进行各种不同的改进。
在一个实施方案中，一组五个电磁场作用于酵母细胞培养物，每个电磁场具有在一给定范围内的不同频率组和在一给定范围内的不同场强组。
第一个电磁场的频率范围在9921到9930MHz之间，场强范围在220到240mV/cm之间，可以通过本领域所知的任何方法作用于培养物，如5.1.2节中描述的设备。酵母培养物置于第一个电磁场中约36个小时。
第二个电磁场的频率范围在10121到10130MHz之间，场强范围在225到245mV/cm之间。酵母培养物置于第二个电磁场中约18个小时。
第三个电磁场的频率范围在12141到12150MHz之间，场强范围在235到255mV/cm之间。酵母培养物置于第三个电磁场中约38个小时。
第四个电磁场的频率范围在12831到12840MHz之间，场强范围在270到290mV/cm之间。酵母培养物置于第四个电磁场中约24个小时。
第五个电磁场的频率范围在12871到12880MHz之间，场强范围在250到270mV/cm之间。酵母培养物置于第五个电磁场中约20个小时。
在次优选的实施方案中，酵母细胞可以按照不同顺序在这五个电磁场中培养。在其它实施方案中，磁场特征在上述范围内的一组电磁场可以用来激活酵母细胞。从一个电磁场切换到另一个电磁场时，酵母细胞可以在同一个容器中、使用同一套电磁波发生器和发射器。被活化酵母细胞可以通过本领域所知的多种方法从培养物中回收，并在低于约0℃到4℃的温度储存。从液体培养物中回收的被活化酵母细胞可以经干燥处理以粉末的形式保存。优选每克酵母细胞粉末中所含酵母细胞数量大于约1×1010个。
                5.1.4酵母细胞的调理
根据本发明，通过在有动物胃提取物(例如胃液)的条件下培养活化的酵母细胞，可以对其性能加以优化。上述动物的生理学特点应与将服用此生物组合物的主体相似。该额外的调理过程使活化的酵母细胞可以适应并耐受主体胃中的酸性环境。调理本发明被活化酵母细胞的方法包括在至少一组两个交变电磁场存在下在上述物质中进行培养。
培养过程开始时，将每克含约1010个细胞的干燥的活化酵母约10克(按5.1.3节中所述方法制成)接种于1000毫升的调理培养基中。培养中的相同数目的酵母细胞也可以作为接种物。每1000毫升调理培养基中含大约700毫升动物胃液和约300毫升野山楂汁。该方法的规模可根据需要按比例增减。
动物的胃液可以从新鲜屠宰动物的胃内容物中获得。该动物优选在洁净的环境中饲养，并喂以标准饲料，优选无菌饲料(当然，上述要求并非为绝对必要)。例如，将120天的猪的胃内容物与2000毫升蒸馏水混合，无搅拌、静置6小时。取上清液作为调理培养用的胃液。猪的胃液可以对多种哺乳动物包括人类使用的酵母细胞进行调理。其它收集胃液的方法包括将混合物离心或过滤以去除碎屑和/或微生物。通过以上方法获得的胃液可以储存于4℃。
野山楂汁是野山楂果实的提取物。将果实切片，风干，优选水分小于约8％(如果需要可以使用商用干燥器)，粉碎干果实至小于约20目，每500克粉碎的野山楂与1500毫升水混合。将混合物无搅拌地静置6小时，收集上清液作为调理过程用的野山楂汁。其它收集山楂汁的方法包括将混合物离心或过滤。优选在无菌条件下进行收集和储存步骤。
将被活化的酵母细胞置于第一个电磁场中进行培养。该电磁场可以利用5.1.2节中描述的设备或本领域所知的其它方法施加。该电磁场的频率范围是12831到12840MHz，场强范围是290到320mV/cm。温度保持在28℃到32℃，典型温度是30℃。酵母培养物置于该第一个电磁场中约36到42小时，优选36小时。
然后，将活化的酵母细胞置于第二个电磁场中进行培养，其电磁场特性为：频率12871到12880MHz，场强约290到310mV/cm。温度保持在28℃到32℃，典型温度是30℃。酵母培养物置于第二个电磁场中约28到32小时，优选30小时。
在次优选的实施方案中，酵母细胞可以按照不同顺序置于上述电磁场中进行培养。在其它实施方案中，磁场特性在上述范围内的一组电磁场可以用来调理酵母细胞。从一个电磁场切换到另一个电磁场时，酵母细胞可以在同一个容器中、使用同一套电磁波发生器和发射器。活化的酵母细胞可以通过本领域所知的多种方法从培养物中回收，并在低于约0℃到4℃的温度下储存。
活化并调理的酵母细胞可以在生物组合物中直接使用，或作为大规模生产的初始培养物。从液体培养物中回收的活化的酵母细胞可以经干燥处理以粉末的形式储存。优选该粉末中酵母细胞的数量大于约每克1×1010个。
                5.1.5大规模生产
本发明还包括大规模生产本发明生物组合物的方法。按5.1.3和5.1.4节方法制备的活化并调理的酵母细胞经过大规模繁殖，制成本发明生物组合物。该方法包括在一个或多个电磁场中培养酵母细胞一段时间，用新鲜培养液稀释生长中的酵母细胞，并重复此过程。该方法可以是批次的也可以是连续的。
在一个优选的实施方案中，安装一套三个容器(5，6，7)，每个容器中有一组电极可以产生5.1.2节中所述的电磁场，并各含1000升培养基，见图2。培养基包含列于表3中的可被酵母细胞吸收的营养物质。
表3
  材料  数量
  野山楂汁  300升
  酸枣汁  300升
  五味子汁  300升
  大豆汁  100升
野山楂汁是新鲜野山楂果实的提取物。将果实洗净、风干或用商用干燥器干燥至水分含量小于约8％。将干燥的果实粉碎至小于约20目，按照每100公斤粉碎果实400升水的比例与水混合，在28℃到30℃条件下连续搅拌12小时。混合物经1000转/分钟离心收集上清液，按上述方法使用。这些步骤优选在无菌条件下进行。
酸枣汁是新鲜酸枣树果实的提取物。将果实洗净、干燥至水分含量小于约8％。将干燥的果实粉碎至小于约20目，按照每100公斤粉碎果实400升水的比例与水混合，在28℃到30℃条件下连续搅拌12小时。混合物经1000转/分钟离心收集上清液，按上述方法使用。这些步骤优选在无菌条件下操作。
五味子汁是中国五味子属(Schisandra chinensis)植物新鲜浆果的提取物。将果实洗净、干燥至水分含量小于约8％。将干燥的果实粉碎至小于约20目，按照每100公斤粉碎果实400升水的比例与水混合，在28℃到30℃条件下连续搅拌12小时。混合物经1000转/分钟离心收集上清液，按上述方法使用。这些步骤优选在无菌条件下进行。
大豆汁的制备是将大豆洗净、干燥至水分含量小于约8％。将干燥的大豆粉碎至小于约20目，按照每30公斤粉碎大豆130升水的比例与水混合，在28℃到30℃条件下连续搅拌12小时。混合物经1000转/分钟离心收集上清液，按上述方法使用。这些步骤优选在无菌条件下进行。
将活化并调理的酵母细胞接种于第一个容器中。将按照5.1.3节和5.1.4节方法制备的酵母干粉约1000克加入1000升培养基中。每克酵母干粉约含约1010个酵母细胞。也可以使用液体培养基中等量的酵母细胞替代脱水酵母细胞。
第一个容器(5)中，酵母细胞被置于一组两个电磁场中。第一个电磁场，可以通过5.1.2节中的设备施加，频率范围是12831到12840MHz，优选12836MHz；场强范围是300到320mV/cm，优选316mV/cm为优选。酵母培养物置于第一个电磁场中约16小时。然后，将酵母培养物置于第二个电磁场中约12小时，该磁场的频率范围是12871到12880MHz，优选12872MHz；场强范围是310到330mV/cm，优选316mV/cm。将酵母细胞从第一个容器转移至第二个容器中，该容器内有1000升培养基。实际上首批酵母培养物被新鲜培养基稀释了约50％。
第二个容器(6)中，酵母细胞仍被置于一组两个电磁场中，频率与第一个容器中的电磁场频率相似，但场强略高。第一个电磁场的场特性如下：频率范围12831到12840MHz，优选12836MHz；场强范围330到350mV/cm，优选334mV/cm。酵母培养物置于该电磁场中约24小时。然后，酵母培养物被置于第二个电磁场中约12小时。该电磁场的频率范围是12871到12880MHz，优选12872MHz；场强范围是320到340mV/cm，优选334mV/cm。将第二个容器中的酵母细胞转移至第三个容器中，该容器内有1000升培养基。第二批酵母培养物再次被新鲜培养基稀释了约50％。
在第三个容器(7)中，酵母细胞仍被置于两个电磁场中，频率与在第一个容器和第二个容器中所用的电磁场频率相似，但是场强较低。第一个电磁场的场特性如下：频率范围12831到12840MHz，优选12836MHz；场强范围250到270mV/cm，优选263mV/cm。酵母培养物置于该电磁场中约24小时。其后，酵母培养物被置于第二个电磁场中约12小时。该电磁场的频率范围是12871到12880MHz；场强范围约是250到270mV/cm，优选263mV/cm。
此阶段最后的酵母细胞培养物可以直接作为本发明的生物组合物使用，或用于制成本发明中所包含的其它组合物。能够加强组合物保健作用、药理学特性和/或感官特性的其它成分也可以加入其中。为了保持组合物的生物存活力和新鲜程度，后续和包装工艺优选在低于室温的温度下进行，更优选0℃到4℃。培养结束时培养基中酵母细胞的典型浓度为至少每毫升约103个细胞。在本发明的一个实施方案中应用了质量控制和包装的标准方法，口服组合物包装在盛装液体的容器中，每个容器内约30到50毫升或100毫升的活酵母细胞培养物。酵母细胞的浓度为每毫升至少4×103个或更多酵母细胞，例如每毫升约104个细胞。
在另一个实施方案中，活化并调理的酵母细胞可以按照下述方法干燥。首先将酵母细胞培养物在75到100g条件下离心10到20分钟，去除上清液。该含水量最高85％的沉淀物在第一个干燥器中干燥5分钟，温度不超过60±2℃，使酵母细胞迅速进入休眠状态。然后将酵母细胞在第二个干燥器中干燥约8分钟，温度不超过65±2℃，以进一步去除水分。将该含水量最高12％的干燥酵母细胞冷却至室温。用标准制药方法将干燥酵母细胞以不同固体剂型进行包装，每个剂量形式中含预定量的干燥物质。优选每克干燥物中含至少106个酵母细胞。
通常将活性成分与液态载体或细粉末状固态载体均匀、密切混合，制成组合物。
                5.1.6优选实施方案
在一个优选实施方案中，本发明提供一种制备含活化并调理酵母细胞的生物组合物的方法，所述方法包含任何顺序的下列步骤：
(a)在频率为9923MHz和场强为233mV/cm的第一电磁场或电磁场组中培养酵母细胞；
(b)在频率为10127MHz和场强为240mV/cm的第二电磁场或电磁场组中培养酵母细胞；
(c)在频率为12145MHz和场强为247mV/cm的第三电磁场或电磁场组中培养酵母细胞；
(d)在频率为12836MHz和场强为272mV/cm的第四电磁场或电磁场组中培养酵母细胞；
(e)在频率为12872MHz和场强为252mV/cm的第五电磁场和电磁场组中培养酵母细胞；
在上述五个步骤最后一步完成后，以任何顺序进行下列步骤：
(f)在频率为12836MHz和场强为296mV/cm的第六电磁场或电磁场组中，在含野山楂汁和哺乳动物胃液的液体培养基中培养酵母细胞；
(g)在频率为12872MHz和场强为302mV/cm的第七电磁场或电磁场组中，在含野山楂汁和哺乳动物胃液的液体培养基中培养酵母细胞。
本发明包括上述方法结束后获得的活化并调理的酵母细胞。酵母细胞优选为酿酒酵母IFFI 1202菌株。这些酵母细胞可以用于下述方法，进一步增加活化并调理的酵母细胞数量。
在另一个优选实施方案中，本发明提供一种大规模生产含活化并调理酵母细胞的生物组合物的方法，所述方法包括在含野山楂汁、酸枣汁、五味子汁和大豆汁的培养基中，在一组或多组电磁场中培养用本节上文所述优选实施方案制备的活化并调理的酵母细胞。每一组电磁场包括下述顺序的两个电磁场：
(h)频率为12836MHz、场强为250-350mV/cm的第八个电磁场；
(i)频率为12872MHz、场强为250-340mV/cm的第九个电磁场。
该组电磁场可以重复若干次，例如三次。
                    5.2使用方法
                     5.2.1制剂
本发明生物组合物的活性成分为依上述方法制备的活化并调理的活酵母细胞，并选择性含有药物可接受的载体或赋形剂，和/或其它成分。其它可以加入本发明生物组合物的成分包括草药提取物、维生素、氨基酸、金属盐、金属螯合剂、着色剂、增味剂和防腐剂等，但不仅限于此。
在一个实施方案中，本发明适于口服的组合物可以是独立单位，如胶囊剂、扁囊剂或片剂，每个独立单位含预定量的活化并调理的酵母细胞；也可以是粉剂、颗粒剂，或水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液，水包油乳液或油包水液态乳液。通常这样制备该组合物，将活性成分与液态载体和/或细粉末状固态载体或两者兼有均匀、密切混合，然后，如果需要，将产品定型成想要的形式。这种产品根据剂量和使用情况可以作为药物或饮食补充剂。
本发明的口服组合物还可以含有粘合剂(例如预胶化玉米淀粉、聚乙烯基吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；粘合或填充剂(例如乳糖、戊聚糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或硅石)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)；或湿润剂(例如十二烷基硫酸钠)。这些片剂或胶囊剂可以按本领域熟知的方法进行包衣。
口服液体制剂例如可以是溶液、糖浆剂或悬浮剂，或者它们可以被制成干燥产品，用前再用水或其它适宜的液体配制。用来重配干产品的液体温度应低于65℃。这些液体制剂可以通过常规方法制备，并应用药物可接受的添加剂，如悬浮剂(例如山梨糖醇浆、纤维素衍生物或氢化食用油脂)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性赋形剂(例如杏仁油、油性酯、乙醇或分馏植物油)；和防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。如下所述，适当加入缓冲盐、矫味剂、着色剂和甜味剂，也可以将该制剂制成近似食品的产品。
该生物组合物的任何剂型都可以向主体提供有效剂量。剂型包括片剂、胶囊剂、分散剂、悬浮剂、溶液、胶囊等等。片剂和胶囊剂因为易于服用而成为最有利的口服剂型，其中使用上述固体药物载体。在另一个实施方案中，优选的剂型是细胞悬浮剂，每毫升悬浮剂中至少含1×103个酵母细胞。片剂例如可以通过与任选的一种或多种助剂一起压缩或模制而成。压缩片剂可以通过将粉状或颗粒状等自由流动的活化并调理的干酵母细胞，任意与粘合剂、滑润剂、惰性稀释剂、表面活性剂或分散剂混合，置于适宜的机器中压缩制成。优选该组合物是含500到700毫克(大于1×106个细胞/克)粉末状活酵母细胞的胶囊。优选剂量为每天2到4个胶囊。
在另一个实施方案中，可以直接将含活化并调理的酵母细胞的生物组合物加入食物当中，通过正常进餐来摄取有效量的酵母细胞。在活化并调理的酵母细胞保持存活的前提下，可以用本领域技术人员所知的任何方法在天然或加工食品中加入或掺入该生物组合物。本发明的营养组合物优选在温度约0℃到4℃的条件下制备和储存。这里使用的“食物”一词广义地指任何用来提供营养以维持或促进包括人类在内的动物生长的液体或固体物质。多种食品或饮料可以用来组成含本发明活化并调理酵母细胞的营养组合物，包括但不限于果汁、草药提取物、茶类饮料、乳制品、大豆制品(如豆腐)和稻米产品。
    5.2.2患有免疫缺陷性疾病或免疫抑制的主体的使用
本发明进一步提供使用本发明生物组合物的各种方法。在一个实施方案中，该生物组合物作为药物用来治疗、缓解和减轻免疫缺陷性疾病或免疫抑制。在另一个实施方案中，该生物组合物用作饮食的补充剂、健康食品或健康饮料。使用方法包括给予主体有效量的生物组合物。该生物组合物可以以液体或固体的形式口服，或通过给饲管肠内给药。这里使用的“有效量”一词是指对免疫缺陷疾病或免疫抑制的情况，足以提供治疗作用或有益健康效果的量。
根据本发明，该生物组合物可以对患有免疫抑制或免疫缺陷疾病的主体产生有益健康的效果。优选主体为人类。需要使用该组合物的主体是被诊断为处于免疫抑制状态或有该疾病任何阶段症状的主体。这里“免疫缺陷疾病”和“免疫抑制”包括但不限于先天性免疫缺陷疾病和获得性免疫缺陷疾病，或各种免疫抑制疾病，包括由下列原因造成的免疫抑制：遗传和代谢性疾病(例如糖尿病、唐氏综合征、肾功能衰竭、营养不良、镰状细胞贫血病)、抑制免疫系统的化学药品和治疗(例如肿瘤化疗、皮质类固醇、免疫抑制性药物、放射治疗)，感染(例如水痘、巨细胞病毒感染、风疹、人类免疫缺陷病毒感染(爱滋病)、传染性单核细胞增多症、麻疹、重度细菌或真菌感染、重症结核)、血液病和肿瘤(例如粒细胞缺乏症、再生障碍性贫血、组织细胞增多病、白血病、淋巴瘤、骨髓纤维化、骨髓瘤)、烧伤、脾切除、酒精性肝硬化、慢性肝炎、正常老化、结节病和系统性红斑狼疮等。
主体可以是正在同时接受其他抗免疫缺陷疾病或相应症状治疗的患者，也可以是已经接受了一种治疗(例如输血和骨髓移植)并似乎有临床免疫力的患者。本发明的生物组合物可以作为任何治疗方案的辅助疗法，这些方案包括但不限于抗生素、药物疗法、疫苗、输血和骨髓移植。
主体可以没有被诊断患有免疫缺陷疾病，但是因为遗传因素和/或环境因素易患此病或是此病的高危人群。主体也可以是具有免疫缺陷疾病高危特征的人，如免疫系统功能减弱、接受抗炎症药物治疗、营养不良或处于应激状态的主体。
对于不同的主体，该生物组合物治疗和有益健康的效果表现为限制、抑制、缓解或减轻免疫抑制或免疫缺陷疾病的症状，增加不同种类外周血白细胞的数目，提高主体的生活质量，和/或减少成功治疗(例如输血、骨髓移植)后复发的几率。与免疫缺陷疾病或免疫抑制有关的体征和症状，包括但不限于苍白、消瘦、皮疹、脓疱、湿疹、血管破裂、脱发、紫癜、结膜发红(结膜炎)、淋巴结肿大、耳膜穿孔结痂、鼻腔结痂、腹泻、严重腹胀和体重减轻。
特别是，本发明提供一种促进主体(例如人类)白细胞活性和增殖或增加白细胞数目的方法，包括使主体口服本发明的生物组合物。本发明还提供一种缩短患有免疫抑制或免疫缺陷疾病主体的康复时间的方法，包括使该主体口服本发明的生物组合物。
主体需要的有效剂量随治疗病情和病情严重程度而有所不同。剂量也会随年龄、体重和患者的个体反应有所变化，同时给药频率也可能发生变化。通常，每天服用活化并调理的酵母细胞的总剂量是约105到5×106个细胞，优选约4×105到约13×105个细胞，顿服或分次服用(口服)。例如，每日优选口服用量是约7×105到约9×105个细胞，而作为饮食补充剂每日口服量是约5×105到6×105个细胞。疗程应为至少13周。某些情况下所用剂量需要超出上述剂量范围，这一点对本领域专业人员来说是显而易见的。酵母细胞可以服用一段时间，直到细菌和病毒引起的症状和/或感染已被控制，或疾病已经部分或完全消退。其次，值得注意的是，营养学家、饮食学家、临床医生或主管治疗的内科医生根据患者个体反应知道如何及何时中止、调整或结束使用该生物组合物作为药物或饮食补充剂。
本发明生物组合物对免疫抑制或免疫缺陷疾病的发生及其严重程度的疗效可以通过本领域技术人员所知的任何方法进行监控，包括但不限于：a)用本领域熟知的检测方法观察不同种类白细胞数目、生物活性和形态的变化；b)检测细胞因子等生物指标水平的变化。
通过下述实施例进一步详细说明本发明，该实施例详细描述了为研究本发明活化并调理酵母细胞的疗效和安全性所做的动物实验。
                    6.实施例
下述实施例利用Wistar大鼠免疫缺陷疾病或免疫抑制模型举例说明了本发明生物组合物的效果。
环磷酰胺是一种常用的肿瘤化疗药，可以减少治疗中患者的白细胞数目。给Wistar大鼠喂食环磷酰胺也可以使大鼠白细胞数目减少，与使用环磷酰胺治疗的肿瘤患者白细胞减少情况相似。因此，本实验用环磷酰胺建立白细胞数目减少的Wistar大鼠动物模型。
生物组合物依5.1节和其中各部分所述方法制备，每毫升含103个活化并调理的酿酒酵母IFFI1202菌株酵母细胞。
                    6.1准备动物
实验所用的动物为Wistar大鼠，雌雄各半，3～4个月大，平均体重约80～100克(由中国军事医学科学院动物所提供)。大鼠被分为三个实验组和一个对照组，每组10只大鼠。每组重复三次(即共用120只大鼠)。
                    6.2实验设计
实验第一天，给三个实验组的大鼠(AY、NY和CK1组)喂食环磷酰胺，每千克体重60毫克。实验第10天，给三个实验组的大鼠喂食环磷酰胺，每千克体重20毫克。实验第14天，给三个实验组的大鼠喂食环磷酰胺，每千克体重20毫克。实验第21天，给三个实验组的大鼠喂食环磷酰胺，每千克体重30毫克。继续饲养大鼠7天，一共饲养28天。
实验第1天到28天，AY组大鼠同时喂食生物组合物，每天2次，间隔12小时，每次1毫升；给NY组大鼠喂食未经处理的酵母细胞，每天2次，每次1毫升；给CK1组的大鼠喂食生理盐水，每天两次，每次1毫升。
CK2组的大鼠不使用任何化疗药物，每天喂食生理盐水2次，每次1毫升，共28天。
从大鼠尾动脉采血。用血细胞计数器测定实验第1天处理前、处理后第7天、14天、21天、28天大鼠血中白细胞的数目。
                        6.3结果
表4显示各实验组和对照组大鼠白细胞数。
表4白细胞计数(×103/mm3)
  动物数(只)   处理前   处理后第7天   处理后第14天   处理后第21天   处理后第28天
  AY   10×3   14.2±3.2   8.4±2.6   9.3±2.8   12.8±2.7   14.3±2.4
  NY   10×3   14.2±3.2   2.6±0.33   2.4±0.27   2.1±0.22   3.6±0.37
  CK1   10×3   14.2±3.3   2.6±0.37   2.3±0.29   2.1±0.23   3.7±0.38
  CK2   10×3   14.2±3.2   14.2±3.4   14.2±3.3   14.7±3.2   14.4±3.2
与每天两次接受1毫升未经处理酵母细胞的大鼠(NY组)和每天两次接受1毫升生理盐水的大鼠(CK1组)相比，每天两次接受1毫升本发明生物组合物的大鼠(AY组)白细胞数目降低最少(是前两组的4倍多)。此外，尽管继续喂食环磷酰胺，处理两周后AY组大鼠血白细胞数目开始恢复。处理4周结束时，AY组大鼠血中白细胞数目恢复到喂食环磷酰胺前的正常水平。相反，实验结束时，NY组和CK1组大鼠的白细胞数目仍然很低。
                        7.实施例
下述实施例利用Beagle犬免疫缺陷疾病或免疫抑制模型举例说明本发明生物组合物的效果。
环磷酰胺是一种常用的肿瘤化疗药，可以减少治疗中患者的白细胞数目。给Beagle犬静脉注射环磷酰胺也可以减少犬的白细胞数目，与接受环磷酰胺治疗的肿瘤患者白细胞减少的情况相似。因此，该实验使用环磷酰胺建立白细胞数目减少的Beagle犬动物模型。
生物组合物依5.1节和其中各部分所述方法制备，每毫升中含103个活化并调理的酿酒酵母IFFI1202菌株酵母细胞。
                      7.1准备动物
实验所用的动物为Beagle犬，雌雄各半，12～14个月大(由中国军事医学科学院动物所提供)。犬被分为三个实验组和一个对照组，每组10只(即共用40只犬)。
                    7.2实验设计
实验第1天，给三个实验组的犬(AY、NY、CK1组)静脉注射环磷酰胺，每千克体重10毫克。实验第3天，给三个实验组的犬静脉注射环磷酰胺，每千克体重10毫克。实验第14天，给三个实验组的犬静脉注射环磷酰胺，每千克体重15毫克。继续饲养14天，共饲养28天。
与此同时，从实验的第1天到第28天，给AY组犬每天两次喂食生物组合物，每次10毫升，间隔12小时。给NY组犬每天两次喂食未经处理的酵母细胞10毫升，CK1组犬每天两次喂食生理盐水10毫升。
CK2组犬不注射环磷酰胺，只是每天两次喂食生理盐水10毫升，共28天。
抽取犬的静脉血。用血球计数器测定实验第1天处理前、处理后第7天、第14天、第21天和第28天血中的白细胞数。
                    7.3结果
表5显示各实验组和对照组白细胞数目。
表5白细胞计数(×103/mm3)
  动物数(只)   处理前   处理后第7天   处理后第14天   处理后第21天   处理后第28天
  AY   10   16.9±3.4   10.7±2.7   12.5±2.3   14.8±2.4   17.3±2.5
  NY   10   17.4±3.2   4.4±1.3   5.5±1.7   7.2±1.7   8.8±1.7
  CK1   10   17.7±3.3   4.6±1.4   5.8±1.6   7.7±1.4   8.7±1.5
  CK2   10   17.4±3.2   17.6±3.4   17.3±3.0   17.5±3.1   17.7±3.3
与每天两次接受10毫升未经处理酵母细胞的犬(NY组)和每天两次接受10毫升生理盐水的犬(CK1组)相比，每天两次接受10毫升本发明生物组合物的犬(AY组)白细胞数目降低最少(是前两组的4倍多)。此外，尽管继续使用环磷酰胺，用生物组合物处理两周后AY组犬的白细胞数目开始恢复。处理4周后，AY组犬白细胞数目恢复到使用环磷酰胺前的正常水平，甚至更高。相反，在实验结束时，NY组和CK1组犬的白细胞数目仍然很低。
本发明不限于所述的特定实施方案的范畴，这些方案仅用于说明本发明的某些特点，功能相当的方法和成分也在本发明的范围之内。实际上，借助上文的有关描述和附图，本说明书所述实施方案以外的各种变化方案对于本领域的技术人员是显而易见的。上述变化方案应在附后的权利要求范围内。
本说明书所提及的所有出版物、专利和专利申请均作为参考文献引入本说明书中，如同逐一明确指明作为参考文献引入本说明书一样。

Claims (24)

1.一种用于白细胞活化和增殖的含有活化酵母细胞的生物组合物，其中所述酵母细胞通过包含任何顺序的下列步骤的方法制备：
(a)在频率为9921-9930MHz和场强为220-240mV/cm的第一电磁场或电磁场组中培养酵母细胞；
(b)在频率为10121-10130MHz和场强为225-245mV/cm的第二电磁场或电磁场组中培养酵母细胞；
(c)在频率为12141-12150MHz和场强为235-255mV/cm的第三电磁场或电磁场组中培养酵母细胞；
(d)在频率为12831-12840MHz和场强为270-290mV/cm的第四电磁场或电磁场组中培养酵母细胞；
(e)在频率为12871-12880MHz和场强为250-270mV/cm的第五电磁场或电磁场组中培养酵母细胞。
2.一种用于白细胞活化和增殖、含有活化并调理的酵母细胞的生物组合物，其中所述酵母细胞通过包含任何顺序的下列步骤的方法制备：
(a)在频率为9921-9930MHz和场强为220-240mV/cm的第一电磁场或电磁场组中培养酵母细胞；
(b)在频率为10121-10130MHz和场强为225-245mV/cm的第二电磁场或电磁场组中培养酵母细胞；
(c)在频率为12141-12150MHz和场强为235-255mV/cm的第三电磁场或电磁场组中培养酵母细胞；
(d)在频率为12831-12840MHz和场强为270-290mV/cm的第四电磁场或电磁场组中培养酵母细胞；
(e)在频率为12871-12880MHz和场强为250-270mV/cm的第五电磁场或电磁场组中培养酵母细胞；
在上述五个步骤最后一步完成后，还包含任何顺序的下列步骤：
(f)在频率为12831-12840MHz和场强为290-320mV/cm的第六电磁场或电磁场组中，在含有野山楂汁和哺乳动物胃液的液体培养基中培养酵母细胞；以及
(g)在频率为12871-12880MHz和场强为290-310mV/cm的第七电磁场或电磁场组中，在含有野山楂汁和哺乳动物胃液的液体培养基中培养酵母细胞。
3.一种用于白细胞活化和增殖、含有活化并调理的酵母细胞的生物组合物，其中权利要求2的活化并调理的酵母细胞在任何顺序的下述电磁场存在下，在含有野山楂汁、酸枣汁、五味子汁和大豆汁的液体培养基中培养一次或多次：
(h)频率为12831-12840MHz和场强为300-320mV/cm的第八电磁场或电磁场组；和
(i)频率为12871-12880MHz和场强为310-330mV/cm的第九电磁场或电磁场组。
4.权利要求1、2或3的生物组合物，其中所述活化的、或活化并调理的酵母细胞是酵母属的细胞。
5.权利要求1、2或3的生物组合物，其中所述活化的、或活化并调理的酵母细胞是酿酒酵母菌株IFFI 1202的细胞。
6.权利要求1、2或3的生物组合物，其中所述活化的、或活化并调理的酵母细胞的浓度为每毫升103个细胞。
7.权利要求1、2或3的生物组合物，其中所述活化的、或活化并调理的酵母细胞是干燥的。
8.含有权利要求2或3的活化并调理的酵母细胞的组合物，其中所述活化并调理的酵母细胞被包装为固体剂型。
9.权利要求8的组合物，其中每个固体剂量形式含有5×105到7×105个酵母细胞。
10.一种用于白细胞活化和增殖的药物组合物，其含有权利要求2或3的活化并调理的酵母细胞和药物可接受的载体。
11.一种用于白细胞活化和增殖的饮食补充剂，其含有权利要求2或3的活化并调理的酵母细胞和选自下组的一种或多种成分：维生素、氨基酸、金属螯合物、植物提取物、着色剂、增味剂和防腐剂。
12.一种用于白细胞活化和增殖的营养组合物，其含有权利要求2或3的活化并调理的酵母细胞和选自下组的食品：果汁饮料、茶饮料、乳制品、大豆制品和稻米制品。
13.一种制备含活化酵母细胞的生物组合物的方法，所述方法包括任何顺序的下列步骤：
(a)在频率为9921-9930MHz和场强为220-240mV/cm的第一电磁场或电磁场组中培养酵母细胞；
(b)在频率为10121-10130MHz和场强为225-245mV/cm的第二电磁场或电磁场组中培养酵母细胞；
(c)在频率为12141-12150MHz和场强为235-255mV/cm的第三电磁场或电磁场组中培养酵母细胞；
(d)在频率为12831-12840MHz和场强为270-290mV/cm的第四电磁场或电磁场组中培养酵母细胞；
(e)在频率为12871-12880MHz和场强为250-270mV/cm的第五电磁场或电磁场组中培养酵母细胞。
14.一种制备含有活化并调理的酵母细胞的生物组合物的方法，所述方法包括任何顺序的下列步骤：
(a)在频率为9921-9930MHz和场强为220-240mV/cm的第一电磁场或电磁场组中培养酵母细胞；
(b)在频率为10121-10130MHz和场强为225-245mV/cm的第二电磁场或电磁场组中培养酵母细胞；
(c)在频率为12141-12150MHz和场强为235-255mV/cm的第三电磁场或电磁场组中培养酵母细胞；
(d)在频率为12831-12840MHz和场强为270-290mV/cm的第四电磁场或电磁场组中培养酵母细胞；
(e)在频率为12871-12880MHz和场强为250-270mV/cm的第五电磁场或电磁场组中培养酵母细胞；
在上述五个步骤最后一步完成后，还包含任何顺序的下列步骤：
(f)在频率为12831-12840MHz和场强为290-320mV/cm的第六电磁场或电磁场组中，在含有野山楂汁和哺乳动物胃液的液体培养基中培养酵母细胞；以及
(g)在频率为12871-12880MHz和场强为290-310mV/cm的第七电磁场或电磁场组中，在含有野山楂汁和哺乳动物胃液的液体培养基中培养酵母细胞。
15.一种制备含活化并调理的酵母细胞的生物组合物的方法，所述方法包括在所述顺序的下述电磁场存在下，在含有野山楂汁、酸枣汁、五味子汁和大豆汁的液体培养基中培养按权利要求13的方法制备的化活并调理的酵母细胞：
(h)频率为12831-12840MHz和场强为300-320mV/cm的第八电磁场或电磁场组；和
(i)频率为12871-12880MHz和场强为310-330mV/cm的第九电磁场或电磁场组。
16.权利要求14或15的方法，其还包括在培养步骤后干燥所述活化并调理的酵母细胞。
17.权利要求16的方法，其中所述干燥步骤包括(i)在不超过65℃的温度下干燥一段时间使酵母细胞休眠；和(b)在不超过70℃的温度下干燥一段时间以将水分含量减低到5％以下。
18.权利要求14或15的方法，其中所述酵母细胞是酿酒酵母菌株IFFI 1202的细胞。
19.权利要求2或3的生物组合物在制备用于提高患有免疫缺陷疾病的哺乳动物白细胞计数的药中的应用。
20.权利要求2或3的生物组合物在制备用于减缓哺乳动物中免疫缺陷症状的药中的应用。
21.权利要求19的应用，其中生物组合物中的所述酵母细胞为酿酒酵母细胞。
22.权利要求19的应用，其中生物组合物中的所述酵母细胞为酿酒酵母菌株IFFI 1202的细胞。
23.权利要求20的应用，其中生物组合物中的所述酵母细胞为酿酒酵母细胞。
24.权利要求20的应用，其中生物组合物中的所述酵母细胞是酿酒酵母菌株IFFI 1202的细胞。
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