CN1509722A - 冬虫夏草多糖乳液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种冬虫夏草多糖乳液及其制备方法，属于含有多糖的药用配置品及其制备。该乳液理化性状为乳白色粘稠胶体溶液，相对密度≥1.010、pH值4.0－6.0、内含固态物质湿重≥本品重量的10％、含虫草多糖≥25mg/10ml，有发酵的香味，内含的虫草多糖由单一的葡萄糖组成，并有多糖肽及其它有效成分成分，分子量在10万以上，成水溶状态。本发明用三角烧瓶和配套的旋转式摇床单机乳液生产量大于0.1吨，并能获得稳产、高产虫草多糖等有效成分的效果，按本发明工业化生产乳液的方法能产生更大的效益。虫草多糖乳液可作营养食品的强化剂、食品保健品、中药制品，如口服液，适合各类人群使用，生物利用度好，无毒副作用。

Description

冬虫夏草多糖乳液及其制备方法

技术领域

本发明涉及含有多糖的药用配置品及其制备方法，具体是一种冬虫夏草多糖乳液及其制备方法。

背景技术

冬虫夏草(Caodyceps sinensis)是中国传统名贵药材，药理作用广泛。虫草多糖在现代冬虫夏草药理研究中是公认的最主要的有效成分，具有增强机体免疫，对人类多种疾病有效，并有抗癌作用。但虫草多糖成分复杂，分子量很大，一旦被干燥，在常温下很难复溶于水，也限制了药效的发挥。

中国专利1297774公开了一种“北冬虫夏草生产基质中有效成分的提取方法”，采取两条提取基质中有效成分的工艺方法，一种是先醇提后水提，另一种是稀醇粗提，然后分步提取。

中国专利1372002公开的“冬虫夏草菌粉与活性免疫虫草多糖冻干粉的生产方法及产品”，采用现代组织细胞培养技术，从天然冬虫夏草的有性子实体上分离获得冬虫夏草的无性型细胞，对其进行纯化和训化后，利用自动控制发酵法纪喷雾干燥、细胞破碎等工序生产出冬虫夏草菌粉；在以其为原料通过符合媒体取法及吸附法等工序制备出活性免疫虫草多糖冻干粉。

中国专利1271514公开了一种“菇状蛹虫草菌丝体的制备方法”，是将牛奶粉、葡萄糖、玉米粒、蔗糖、黄豆制成的豆浆、硫酸锌、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾混配加水制成培养基，接种后培养35-45天得菇状蛹虫草菌丝体，加0.02％-0.05％的消泡剂泡酊。该方法克服现有技术中设备庞大、工艺复杂、成品中有效成分含量低等缺点，制得产品中含虫草多糖及多种氨基酸等有益成分，用于食品、保健品行业。

中国专利1275403公开的“人工培养冬虫夏草菌粉入药的方法”，将天然的冬虫夏草及时分离菌种，在无菌条件下，将冬虫夏草菌种接种在固定培养基上，在温度15-22度，相对湿度60-70％下，培养60天左右，待长出子座后，在温度60-70度下，干燥48小时，最后粉碎过100目筛，即得冬虫夏草菌粉入药。它含有冬虫夏草的主要有效成份，虫草素和虫草多糖，它具有抗癌功能。生产方法比较简单，它不受自然环境、季节和地理等条件的限制。

中国专利1176107公开的“冬虫夏草菌深层培养液”，使冬虫夏草菌在由沙氏葡萄糖液体培养基与中药水提取液组成的复合液体培养基中培养出的产物。中药水提取液是由枸杞子、白术、女贞子、黄芪、茯苓、无花果、党参、黄精、薏苡仁、中的三味与山药、玉竹、肉苁蓉中的一味组方培养而得。

发明内容

本发明是为了解决目前冬虫夏草多糖提取液产率底，药用质量较差的不足，提供一种药用质量好，成本低，产率高的冬虫夏草多糖乳液及其制备方法。

一种冬虫夏草多糖乳液，是由冬虫夏草菌种依次经固体、液体培养基接种培养制备而成，该乳液的理化性状为乳白色粘稠胶体溶液，相对密度≥1.010，PH值4.0-6.0，内含固态物质湿重≥10％，含虫草多糖≥25mg/10ml，有发酵香味，内含的虫草多糖为单一的葡萄糖，并有多糖肽成份，分子量在10万以上，呈水溶状态。

一种冬虫夏草多糖乳液的制备方法，

a.固体培养基是由以下组分的原料制成的，

琼脂15-20g、玉米水500-600ml、土豆汁150-200ml、

葡萄糖20-40g、蜂蜜5-10ml、蛋白胨1-3g、酵母浸出汁2-4g、

维生素B₁5-10mg、磷酸二氢钾1-3g、加水至1000ml；

b.液体培养基是由以下组分的原料制成的，

葡萄糖20-40g、黄豆10-20g磨制的豆浆、维生素B₁5-10mg、

磷酸二氢钾1-3g、低亚硫酸钠0.1-0.4g、加水至1000ml；

制备时，冬虫夏草菌种先在固体培养基接种培养，再分级传输接种于液体培养基，液体菌种的接种量大于33％。

所述的制备方法，液体培养基在三角烧瓶培养中，装料量大于瓶容的40％，培养量大于瓶容的55％，在培养罐培养中装料量为罐容的50-55％，培养量为罐容的67-73％，而培养罐之间的罐容比按1∶4递增。

所述的制备方法，在批量生产和工业化生产的冬虫夏草多糖乳液在培养结束后处理中，加入0.02％的低亚硫酸钠，可防止乳酸非酶性褐变，保持产品性状，延长储存期。

这样制备的冬虫夏草多糖乳液材料来源方便，价格低廉，产率高，应用中无任何毒副作用，有非常好的生物利用度，适合各种年龄段的人群使用。由于大接种量的传输有利于抗杂菌感染，培养物种的菌龄一致性也比较好。

本品具有的效果是：

1.扶本固正，提高机体免疫。

2.降血脂；降血糖；降低衰老因素。

3.益肾强身，改善性功能。

4.提高机体体力和智力的抗疲劳能力。

5.抑制肿瘤，对癌症患者有减轻症状，防止扩散和康复作用。

6.与其他药物共用时有增效和降低其他药物不良反应的作用，在抗放化疗中尤为明显。

冬虫夏草多糖乳液的产品质量标准：

性状：本品为乳白色粘稠胶体溶液。

相对密度应不低于1.010。

PH值应为4.0-6.0。

微生物限度：细菌总数≤100个/ml。

霉菌(酵母菌)≤100个/ml。

大肠杆菌≤3个/ml。

致病菌：不得检出。

含量测定：

乳液内含固态物质湿重不得少于本品重量的10％(主要是冬虫夏草细胞)。

乳液内含虫草多糖不得少于25mg/10ml(取离心上清液测量)。

乳液内含有害离子、铅≤1mg/kg；砷≤0.5mg/kg；铜≤10mg/kg。

主要成分：虫草多糖，虫草细胞组织，18种以上氨基酸，多种维生素和微量元素。

功    能：免疫调节。

用    途：营养食品的强化剂，食品保健品，中药制品。

毒副作用：无任何毒副作用和不良反应。

使用方法：口服，每次20毫升，每日2-3次。儿童酌减，特别需要者可加倍使用。

贮存条件：室温，密封，置阴凉处。

保质期限：一年。

附图说明

图1为冬虫夏草多糖乳液及口服液的工艺流程图。

图2本发明的红外标准曲线图。

图3本发明与中国医学科学院药物研究所虫草产品的对照曲线图。

图4为乳液中虫草多糖纸色谱图。

图中A 半乳糖、B 葡萄糖、C 虫草多糖水解产品、D ABE混样、E 阿拉伯糖和鼠李糖混样；2#中国医科院样品曲线图、3#本发明曲线图。

具体实施方式

一.冬虫夏草菌种在试管斜面培养基即固体培养基中的培养(简称斜面)

用去皮马苓薯200g切成黄豆大的小块，加水500ml，煮沸20min，用的确良布滤去马苓薯小块，取汁150-200ml备用；

取长约20cm带叶带须的青玉米5个，用水洗净，加水约1.5L，在高压锅中将玉米煮熟，过滤出玉米水备用，配1000ml斜面用1/2量。

将琼脂剪成小块备用；

配制试管斜面培养基即固体培养基时，先将琼脂15g在玉米水600-650ml中加热，搅拌缓慢溶解，加入土豆汁150-200ml、葡萄糖30g、蜂蜜10ml、蛋白胨2g，酵母浸出汁2g，维生素B₁10mg、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g，加水补足1000ml，加热搅拌，均匀溶解，直至煮沸，以便用漏斗灌制斜面。

PH值：为自然值，配后不做调整，约为6。

试管的处理，棉塞的制做可按常规。灭菌条件为蒸气压力0.105Mpa，温度121℃，时间30min。

每支φ18×180mm试管灌培养基8ml，在手提高压蒸气灭菌锅内灭菌，灭菌后晾成约占试管长度3/4的斜面。新制成的斜面立即接种，不存放使用。

菌种接种可按常规无菌操作技术，在无菌室密封超净台即接种箱的酒精灯火焰旁接种。菌种取母种试管中离原种0.5cm处以外的新生菌膜一小块，正面朝上接入被接试管斜面中央。接种箱内放置一至两个甲醛已固化的三角烧瓶，接种钩用1-1.2mm钨丝制成。

冬虫夏草在斜面中的培养培养条件为恒温箱中温度25±1℃，时间11d，黑暗中培养。

培养好的菌种乳白色，长势旺盛，长满整个斜面，菌膜厚度约2mm，钩取时已有坚硬感，菌种一般7天已长好，再继续生长4天后使用。

二.冬虫夏草在三角烧瓶液体培养基中的培养

将黄豆15g在水中浸泡24h，用前冲洗干净，磨成豆浆后备用；

配制时，先将葡萄糖30g溶解在少量水中，加入黄豆15g磨制的豆浆，维生素B₁10mg、磷酸二氢钾1g，加水补足1000ml。PH值为自然值约为6。

灭菌条件为蒸气压力0.105Mpa，温度121℃，时间25min。少量烧瓶可在手提高压蒸气灭菌锅中灭菌，大量烧瓶应在卧式高压蒸气灭菌柜中灭菌。

装料量

1级液体培养基用500ml烧瓶，装料100ml；

2级液体培养基用500ml烧瓶，装料150ml；

3级液体培养基用3000ml烧瓶，装料1.3L；

4级液体培养基用3000ml烧瓶，装料1.3L(5级同4级)。

灭菌后的液体培养基应无沉淀，放置室温后可立即使用，也可在无菌室的紫外灯的照射下放置一天后使用。

按常规无菌操作技术和接种方法

1级液体菌种接种用斜面菌种，每支试管接一三角烧瓶。

2级液体菌种接种用1级液体菌种，一瓶接一瓶。

3级液体菌种接种用2级液体菌种，二瓶接一瓶

4级液体菌种接种用3级液体菌种，1/3瓶接一瓶。

(5级液体菌种参照4级液体菌种接种方法)

本技术的接种特点是菌种浓度高，接种量大于33％。

冬虫夏草液体菌种的培养条件：温度25±1℃，摇床转速190r/min，摇床旋转振幅24mm，1-2级液体菌种培养2-3d，3-4级(或5级)培养3d，黑暗条件。

培养好的各级菌种为乳白色，保持了虫草细胞的原有性状，培养液浓稠，少见菌丝球，有发酵的香味。

三.冬虫夏草多糖乳液的批量生产

配制液体培养基时，参照上述方法，在补足水量之后，再加入低亚硫酸纳0.03％，搅拌使之均匀溶解。

冬虫夏草多糖乳液批量生产时，三角烧瓶液体培养基的制备方法同3或4级液体培养基的制备，在卧式蒸气高压灭菌柜中多层安放时烧瓶口应多加一层牛皮纸和聚丙烯塑料罩。

用4级(或5级)液体菌种接种，接种量用4级(或5级)菌种量的1/3。

这样的接种方法可获得高浓度的菌种，大接种量传输，是稳产、高产虫草多糖的要素之一，同时，也有利于抗杂菌感染，菌龄的一致性也比较好。

批量生产条件：温度25±1℃，摇床转速190r/min，摇床旋转振幅24mm，培养时间5d，黑暗条件。

生产出的冬虫夏草多糖乳液为乳白色粘稠胶体如粥状物，内含大量保持了原有性状的虫草细胞(菌丝体)及虫草多糖，还有虫草中的其它有效成分，有发酵的香味，可略酸。

用配套发明的旋转式摇床生产，每台五天生产量＞0.1吨，

四.冬虫夏草多糖乳液工业化生产的菌种准备

制备液体培养基时，参照冬虫夏草在三角烧瓶液体培养基中的培养配方，再加入低亚硫酸钠0.02％。

将配制好的液体培养基向5000ml三角烧瓶灌入2.1L灭菌条件及制备方法同3级液体培养基制备。

接种时，将培养好的3级液体菌种的1/2接入冬虫夏草多糖乳液工业化生产的三角烧瓶菌种液体培养基中，按常规无菌操作技术和接种方法。

冬虫夏草多糖乳液工业化生产的菌种培养条件与技术特点说明与3-4级(或5级)液体培养基同。

冬虫夏草多糖乳液工业化生产的菌种转移系采用配套的冬虫夏草多糖乳液工业化生产的菌种转移罐。

菌种转移罐使用前灭菌条件为：蒸气压力0.15Mpa，温度128℃，时间50min。

打开转移罐的灌装口盖及菌种输出开关，对转移罐包扎灭菌，灭菌后关闭菌种输出开关，置无菌室中放置至室温后侍灌菌种。

灌装菌种时，打开接种箱底部窗口，将转移罐的灌装口放入接种箱内，按常规无菌操作技术和接种方法，按菌种转移量将培养好的菌种倒入罐内，盖好转移罐备用。

按常规无菌检查技术，对转移的菌种留样备查，应证明未污染杂菌，继续进入正常流程。

五.冬虫夏草多糖乳液的工业化生产

1.1-3级种子罐的菌种培养及菌种转移罐的使用

液体培养基的制备同冬虫夏草多糖乳液工业化生产的菌种准备，再加豆油0.1％或消泡剂甲基硅油0.01％。

灭菌条件：蒸气压力0.105Mpa，温度121℃，时间30min。

种子罐的空消和实消

未灌注液体培养基前对种子罐空消，灭菌条件按菌种转移罐使用前灭菌，空消时由通无菌空气的管路、罐底、取样管三处通蒸气加热，罐顶流量计通气口，接种口、补料口，安全阀等处打开放气开关，小流量放气，夹套同时通气加热。

种子罐空消后按配方比例灌注液体培养基，装液量为罐容的50-55％，盖好加料口，进行实消。首先由夹套通入蒸气加热，开搅拌器，机械消泡器同时工作，使液体培养基温度达100℃，然后如空消三处通气，多处小流量放气按灭菌条件实消，实消后关闭蒸气放气开关及进气开关，调正通入无菌空气，使罐压大于0.03Mpa，通气量1∶0.5，夹套通水冷却，使罐内液体培养基冷却至培养温度，并调整维持这个温度。

取样备查：首先对取样管处通蒸气灭菌，灭菌条件按菌种转移罐使用前准备灭菌，灭菌后取样，按常规无菌检查技术对液体培养基检查，应证明未污染杂菌，继续进入正常流程。

各级培养罐的罐容比为1∶4，装料量为50-55％，实消时不易“冒顶”，接种后装料量为67-73％，罐容不浪费。

1级种子罐的接种：将菌种转移罐与种子罐连接，对转移罐的菌种输出管的夹套通水冷却，开蒸气，对连接管路处灭菌，灭条件按菌种转移罐使用前准备，灭菌后通无菌空气，管路冷却后，再向菌种转移罐通入无菌空气，使转移罐压大于种子罐压0.05Mpa以上，然后用压差法接种，接种后关闭种子罐的接种开关，最后拆除菌种转移罐。

此法接种，由于接种造成染菌的机率很小，接种量为装料的33％。

2.3级种子罐的接种：当2.3级种子罐完成液体培养基制备后，对前后级连接的接种管道灭菌，灭菌条件按菌种转移罐使用前灭菌，灭菌后稍冷却管路，增加前级罐压大于后级罐压0.05Mpa以上，用压差法接种，接种量为33％。

种子罐的菌种培养：

培养温度25±1℃，搅拌速度120r/min，通气量(V/V)为1∶0.5，罐压0.03Mpa，培养时间2-3d，接种量33％。

定时取样备查，首先对种子罐取样管处通蒸气灭菌，灭菌条件按菌种转移罐使用前灭菌，灭菌后取样，按常规无菌检查技术对培养的液体菌种检查，证明未污染杂菌，继续进入正常流程。

2.冬虫夏草多糖乳液的工业化生产

液体培养基同冬虫夏草多糖乳液的批量生产，再加豆油0.1％或消泡剂0.01％。消泡剂为泡敌或甲基硅油。

培养罐的液体培养基制备，同1-3级种子罐的液体培养基制备，液体培养基的无菌检查同种子罐情况。

用培养好的3级种子罐的菌种接种，方法同2-3级种子罐的接种，接种量33％。

冬虫夏草多糖乳液在生产培养罐中的培养条件为：培养温度25±1℃，搅拌速度120r/min(每小时间歇搅拌20min)，通气量(V/V)为1∶05-1∶1，罐压0.05Mpa，培养时间5d(接种量33％)。

定时取样备查，首先对生产罐取样管处通蒸气灭菌，灭菌条件按菌种转移罐使用前准备，灭菌后取样，按常规无菌检查技术对培养的冬虫夏草多糖乳液检查，证明未污染杂菌，继续进入正常流程。

冬虫夏草多糖乳液放罐前检查，在培养时间接近5d时，应加强对取出的冬虫夏草多糖乳液中的多糖含量检查，当多糖含量达到顶峰稍有下降时，停止培养，做培养后处理(放罐前处理)。

工业化生产出的冬虫夏草多糖乳液特点同批量生产情况。

工业化生产的冬虫夏草多糖乳液在培养结束后的处理(批量生产的冬虫夏草多糖乳液培养结束后也做此种处理)，冬虫夏草多糖乳液在培养结束后，加入0.02％的低亚硫酸钠，搅拌溶解，加热煮沸。经处理的冬虫夏草多糖乳液，可压入储罐。

冬虫夏草多糖乳液完成批量生产或工业化生产(已作培养后处理)而暂时未做其它用途前，应经灭菌后密封储存。

生产结束后，立即贮存的乳液作如下处理：灭菌条件，蒸气压力0.05Mpa，温度112℃，时间40min

灌注在输液瓶中经上述灭菌处理的冬虫夏草多糖乳液的保质期可在二年以上。

液体培养基的制备，可根据生产需要放量配置。

六.冬虫夏草多糖口服液

配制方法是在储存的或培养结束后经处理的冬虫夏草多糖乳液中加入0.2％矫味剂如甜蜜素，即成冬虫夏草多糖口服液。

配制好的口服液在灌封前，首先对瓶子、瓶盖做好灌封前的准备，然后灌封，封后进行密封性检查，合格品进行成品灭菌，然后进行灯

合格品包装，抽验进行总检，合格品入库。

本发明经动物毒理实验证实其对小鼠的最大耐受量＞360mg/Kg(相当于人用剂量的144倍)

小鼠体重增长正常如下表

性别	给药前	第三天	第七天
				雌	18.70±0.75	21.70±1.55	23.00±1.03
雄	18.50±0.50	22.75±2.44	24.55±2.44

临床应用效果是根据《(新药中药临床指导原则》和《(临床疾病诊断依据治愈好转标准》进行的。

口服液与山莨菪碱联用治疗支气管哮喘60例临床观察报告。

资料：本组60例均在住院前给以吸氧，静脉推注氨茶碱，及β受体激动剂、抗菌素等而不见好转者。其中男35例，女25例，年龄最小14岁，最大67岁，平均年龄38岁。每次发作憋气持续时间3天2例，5天19例，7天29例，支气管哮喘史5年24例，10年26例，10年以上10例。

方法：在常规吸氧、纠酸、补液及电解质检测下给口服液一次20ml，每日3次；山莨菪碱10mg加生理盐水20ml雾化吸入，每日一次，7天为一疗程，5％葡萄糖生理盐水500ml加丁胺卡那霉素0.8g静脉点滴，每日一次，7天为一疗程。

疗效：本组60例均在用药后1-3天后开始出现憋气减轻，胸部压迫感消失，双肺哮鸣音较前减少，用药5天后，显效34例，占56.7％，有效26例，％占43.3。少数患者出现面红、口干、口渴(山莨菪碱所致)，但多能耐受，停药后可自行消失。

口服液治疗心律失常120例临床观察报告如下：

治疗组服用口服液，每日3次，每次20毫升，饭前30分钟送服，30天为一疗程，观察2个疗程。120例心律失常病人中，男65例，女21例；年龄23-29岁2例，30-39岁21例，40-49岁28例，60岁以上69例。病程1年以下者13例，1-3年34例，4-5年28例，6-10年24例，11-20年21例。

对照组服用“心肝宝”胶囊，一次2粒，一日3次，疗程及观察时间同治疗组。60例中，男39例，女21例，年龄40-49岁2例，50-59岁27例，60岁以上31例。

病程：1-3年17例，4-5年14例，6-10年26例，11-20年3例。

表1治疗120例与对照组60例疗效对比分析表

	显效(％)	有效(％)	无效(％)	总治疗(％)
					治疗组120例	64(53.3)	40(33.3)	16(13.3)	104(86.6)
对照组60例	8(13.3)	34(56.6)	18(30)	42(70)

两组总疗效比较差异有显著意义P＜0.05。

表2治疗前后各单项征候疗效表

表症状及体症	治疗组			对照组
							治疗前	治疗后	好转率	治疗前	治疗后	好转率
	闷痛胀痛串痛或痛有定处	120	118	98.3％	60	42							70％
心悸							120	114	95％	48	40	83％
	憋气或气短	120	114	95％	60	40							66.7％
舌质暗或有瘀斑							110	12	89.1％	60	36	60.0％
	脉细、涩、促、结、代	104	10	90.4％	58	30							51.7

表3病程与疗效的关系

病程	治疗组				对照组
									例数	显效	有效	无效	例数	显效	有效	无效
	1年以下	6	6	0	0	0	0	0									0
1-3年									48	30	10	8	30	2	26	2
	4-5年	26	20	6	0	8	2	4									2
6-10年									28	12	14	2	16	4	10	2
	11-20年	12	6	2	4	6	0	4									2
合计									120	74	32	14	60	8	44	8

表4检测指标对照表

检测指标	治疗组			对照组
							治疗前	治疗后	好转率	治疗前	治疗后	好转率
	心音	102	24	76.5	58	30							48.3
心率							104	4	96.2	60	28	53.3
	心电图	118	8	93.2	60	28							53.3

Claims (5)

1.一种冬虫夏草多糖乳液，其特征在于冬虫夏草菌种依次经固体、液体培养基接种培养制备而成，该乳液的理化性状为乳白色粘稠胶体溶液，相对密度≥1.010，PH值4.0-6.0，内含固态物质湿重≥10％，含虫草多糖≥25mg/10ml，有发酵香味，内含的虫草多糖由单一的葡萄糖组成，并有多糖肽成份，分子量在10万以上，呈水溶状态。

2.一种冬虫夏草多糖乳液的制备方法，其特征在于：

a.固体培养基是由以下组分的原料制成的，

琼脂15-20g、玉米水500-600ml、土豆汁150-200ml、

葡萄糖20-40g、蜂蜜5-10ml、蛋白胨1-3g、酵母浸出汁2-4g、

维生素B₁5-10mg、磷酸二氢钾1-3g、加水至1000ml；

b.液体培养基是由以下组分的原料制成的，

葡萄糖20-40g、黄豆10-20g磨制的豆浆、维生素B₁5-10mg、

磷酸二氢钾1-3g、低亚硫酸钠0.1-0.4g、加水至1000ml；

制备时，冬虫夏草菌种先在固体培养基接种培养，再分级传输接种于液体培养基，液体菌种的接种量大于33％。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于液体培养基在三角烧瓶培养中，装料量大于瓶容的40％，培养量大于瓶容的55％，在培养罐培养中装料量为罐容的50-55％，培养量为罐容的67-73％，而培养罐之间的罐容比按1∶4递增。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于批量生产和工业化生产的冬虫夏草多糖乳液在培养结束后处理中，加入0.02％的低亚硫酸钠，可防止乳酸非酶性褐变，保持产品性状，延长储存期。

5.一种冬虫夏草多糖口服液，其特征在于冬虫夏草多糖乳液中加入0.2％矫味剂如甜蜜素。

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