CN1327047A - 一种用蚕蛹培养拟青霉菌的方法及药用用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用蚕蛹培养拟青霉菌的方法及药用用途,以蚕蛹作为寄主,通过菌种制作－菌种培养－蚕蛹选择－消毒处理－接种蚕蛹－培养僵蛹－培拟青霉霉菌(孢梗束、孢子粉)－采收干制－包装－冷藏等工艺,在蛹期培养拟青霉菌。原料蚕蛹易购、耐储、可进行长年培养,原料来源不受环境条件限制。本发明工艺在全自控无菌条件下接种,培养到采收包装,整个培养过程约30左右天,寄生率高达98%以上,产品质量好,无杂菌污染。本发明还公开了其药用用途,用于治疗或预防心脑血管、恶性肿瘤、性功能低下、癫痫、免疫功能低下、动脉硬化等疾病药物中。

Description

一种用蚕蛹培养拟青霉菌的方法及药用用途

本发明涉及拟青霉菌的培养技术，提供一种用蚕蛹培养拟青霉的方法，并公开了其药用用途，属于生物菌类培养技术领域。

拟青霉菌属含粉状拟青霉菌、蝉拟青霉、细脚拟青霉等，该属为半知菌亚门、丝孢纲、拟青霉属真菌。该菌与虫草菌同为虫生真菌类。半知菌中拟青霉是包含虫生真菌较多的一个属，通常选用桑蚕幼虫作为寄主培养拟青霉菌，培养期只能在养蚕季节进行，并且，在培养中直接将拟青霉菌种喷洒在蚕幼虫体或桑叶上，靠接触性自然感染培养，容易污染环境，感染时间长，寄生率低，不利于产业化生产，影响了拟青霉菌的产业化生产。

目前，国内外开发成正式药的药用真菌大多数集中在担子菌亚门的层菌纲中，其次在子囊菌的核菌纲中。在半知菌中能入药的仅有白僵菌属的僵蚕或僵蚕蛹。关于用蚕蛹培养拟青霉菌及药用用途的研究，国内外尚末见有报道。

本发明的目的在于公开一种用蚕蛹培养拟青霉菌的方法，解决了用蚕幼虫作为寄主，培养拟青霉菌受养蚕季节环境条件限制的问题；

本发明的另一个目的是提供拟青霉菌的医用用途。

本发明的采用以下技术解决方案：选用蚕蛹作为寄主培养拟青霉菌，通过以下技术工艺实现：

菌种制作-菌种培养-蚕蛹选择-消毒处理-接种蚕蛹-培养僵蛹-培拟青霉霉菌(孢梗束、孢子粉)-采收干制-包装-冷藏。

1、菌种制作：

采用含C、N源丰富的培养基，例如：鲜蚕蛹(或蚕蛹粉)10g、蛋白胨8g、奶粉8g、葡萄糖10g、磷酸二钾氢1.5g、磷酸二氢钠1.0g、硫酸镁500ng、水1000ml、PH：5.8配制成培养基。

首先将鲜蚕蛹搅碎(蚕蛹粉)加500ml水，煮沸10分钟，过滤，用此滤液溶解蛋白胨、奶粉、葡萄糖，取另一容器放入磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、硫酸镁元素，加入适量水溶解，合并药液，定容1000ml。充分搅拌后分装在500ml三角瓶内。每瓶250ml。将瓶口封好，置于灭菌锅内，在1.2Pa下灭菌30分钟。取出，置于洁净工作台上，冷却后接入黄豆粒大小的拟青霉菌种一块，瓶口按原样封好。

2、菌种培养：

将上述制备好的菌种置于培养室内培养：温度23℃±2℃。静止培养12小时，然后间歇振荡培养，每隔6小时振动培养20-30分钟。培养4-5天约100小时左右开始接种蚕蛹。

3、活蚕蛹的选择和消毒处理：

将活柞、家蚕蛹从茧壳中取出。选择无病、健壮、不发育的柞、家蚕活蛹，首先用流水冲洗干净，然后放入75％酒精溶液内浸泡3分钟，取出。移入5℃无菌室备用。(储备时间不超过6小时)。

4、接种蚕蛹：

将菌种和蚕蛹移入无菌室内工作台上，在无菌条件下，用注射器吸取菌液注入蛹体内：柞蚕蛹0.2ml左右；家蚕蛹0.1ml左右。接种后的蚕蛹摆放在培养盘中培养。

5、培养僵蛹：

培养温度15-18℃，培养时间：5-10天。将已僵化的蚕蛹放入洁净培养瓶内，柞蚕蛹每瓶7个，家蚕蛹每瓶17个。瓶口用塑料膜封好。移入高温室培养子实体。

6、培养拟青霉孢梗束：

23-25℃高温无光条件下培养3天，侍菌丝从蛹体上发出时，进行降温光照培养：光照强度为500勒克斯，温度18℃±2，湿度90％以上。培养时间约25天。整个培养时间：(从培养僵蛹到孢梗束长成)35天左右。

7、采收干制：

侍孢梗束从蛹体上长高2-7cm时，将其从培养瓶内取出，装入干燥盘中，阴干或冷冻燥。

8、包装储存：

为防止孢梗束从蛹体上脱落，采用真空包装，在-2℃度下避光保存。保存时间为3-5年。

蚕蛹拟青霉菌的用途：

该菌可广乏在医药、食品、保健品、制酒、饮料、日用化妆品、生物防治等领域应用。

在医药方面内服主要用于抗炎抑菌，提高机体免疫力，预防肿瘤发生，具有清热解毒、降胆固醇、抗疲劳和补肾壮阳等作用。可广泛地应用于各种肿瘤患者，免疫功能和性功能低下等患者，还可用于治疗癫痫、小儿惊痫、喉痹、中风、脑炎后遗症、瘰疬结核及动脉硬化病等疾病。外用治丹毒搔痒、灭诸疮瘢痕等。本发明可制成单方制剂也可与其它药物制成复合制剂，剂型包括药剂学中的任何剂型。

在食品方面可用于制作各种饮料、口服液、保健茶、保健酒，食品添加剂等。可起到抗疲劳、增强体力、延缓衰老。降低血脂，预防肿瘤等作用。

在外用或化妆品方面用于治疗丹毒、痤疮、粉刺，酒糟鼻、色斑等。

本发明的积极效果在于：本发明以蚕蛹作为寄主，在蛹期培养拟青霉菌，原料蚕蛹易购、耐储、可进行长年培养，原料来源不受环境条件限制。本发明工艺在全自控无菌条件下接种，培养到采收包装，整个培养过程约30左右天，寄生率高达98％以上，产品质量好，无杂菌污染，适合于产业化生产。

本发明产品经吉林省中医研究院药理研究室药理活性试验表明，该菌、具有多种药理活性无毒副作用，有些药效高于蛹虫草；北京中医研究院中药研究所对该菌化学成分测试结果为：该菌含有核苷类、氨基酸、牛磺酸、多糖、硒、锗、锌等微量元素等化学成分和天然冬虫夏基本一致；孢子粉的多糖含量是灵芝孢子粉3倍以上、核苷类含量高于灵芝孢子粉。

为了说明本发明的药用用途，采用同类药物对照的试验的形式给予证明：

试验品：拟青霉菌(称为白蛹粉)、粉状拟青霉孢子粉(称为白基粉)

对照品：蛹虫草(称黄基粉)、颐和春(对照阳性药物)。

试验动物：雄性健康未成年小鼠，体重12-15g。雄性wistar健康大白鼠体重150-200g，雌性健康KM封闭群小鼠18-22g

试验方法：

1、对成年去势雄性大鼠血清睾丸酮含量及附性器官重量的影响：

选择wistar雄性大鼠，体重150-200g左右80只，用乙醚麻醉后摘除以侧睾丸，正常饲养一周，使体内雄性激素代谢后，挑选状态健康的大鼠80只，随机分为组，每组8只。用乙醚麻醉后摘除双侧睾丸，正常饲养一周，使体内雄性激素代谢掉后，选健康大鼠随机分组，每组8只同时设正常对照组、去势对照组、阳性药对照组及各大、小剂量组连1g给药10天，每天1次对照组给同体积蒸馏水，末闪给药后称体重并处理死亡动物，取血离心，测血清睾酮含量，并立即剖取包皮腺、前列腺-贮精囊及提肛肌-海绵球肌，称重并计策脏器指数。结果采用组间t检验统计。结果见表1。

表1、对雄性去势大鼠血清睾酮含量及附性器官指数的影响(X＋S)

组别及剂量	动物数	血清睾酮量	附性器官指数(mg/10g体重)
						g/kg	n	nmol/L	包皮腺	前列腺-贮精囊	提肛肌-海绵球肌

正常对照组	8	17.81±9.29	4.32±1.05	37.86±11.26	38.39±11.74
						去势对照组	8	6.87±0.91	2.59±0.50	6.12±1.52	14.93±4.09
颐和春2.0	8	7.6±1.47	4.19±0.74	6.90±1.15	14.95±2.79
						黄基粉4.0	9	6.41±0.47	4.77±1.91*	7.69±1.59	13.3±2.10
黄基粉2.0	8	7.18±1.01	3.72±0.48*	7.15±1.19	11.82±2.17
						白基粉4.0	8	7.38±0.62	3.85±0.58*	7.49±2.00	14.3±3.08
白基粉2.0	8	7.79±1.22	4.14±0.96*	8.49±2.64*	15.18±5.10
						白蛹粉4.0	8	7.50±1.41	4.26±1.26*	12.05±8.17*	16.85±6.97
白蛹粉2.0	8	7.75±0.84	4.41±1.16*	8.36±2.17*	15.55±3.92

由表1结果可以看出，雄性大鼠去势后与正常对照比较，无论是血清睾酮含量还是附性器官指数均较正常对照组有非常明显的降低及减轻(p0.001)，说明去势模型成立，各给药组与去势组比较血清睾丸酮含量明显的增加趋势。尤其是白基粉二种样品更好些；对附怕器官指数各给药组对包皮腺的重量均有非常显著的增加作用(p0.001)，对前列腺-贮精囊的重量，白基粉及白蛹粉有显著的增加作用(p0.05)；对提肛肌-海棉球肌的重量，白及白蛹粉也呈现出明显的使重量增加的趋势。

2、对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响：

选择健康小鼠(体重18-22g)雌雄各半，随机分组给药，对照组给同体积蒸馏水，每天一次，连续10天，每次给药40min尾静脉注射墨汁0.1ml/10g体重，置于5ml0.1的NaCl溶液中，7230分光光度计比色，并摘取肝、脾脏器、扭力天平称重，参照NaIpem文献方法计算指数K及活性。组间t检验比较，结果见表2

表2、对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响(X±S)

组别	剂量g/kg	动物数n	吞噬指数k	吞噬活性a
					对照组	---	10	0.0277±0.0121	5.53±1.059
颐和组	2.0	10	0.0326±0.0165	5.51±0.732
					黄基粉	4.0	10	0.0291±0.0128	5.12±0.563
黄基粉	2.0	10	0.0439±0.0065**	6.01±0.751
					白基粉	4.0	10	0.0326±0.0158	5.36±1.154
白基粉	2.0	10	0.0645±0.0275**	6.64±1.132*
					白蛹粉	4.0	10	0.0758±0.0176***	7.28±0.229***
白蛹粉	2.0	10	0.0641±0.021**	7.23±0.739***

结果表明，各给药组连续1g给药后是，均可使小鼠噬细胞的吞噬功能增强，而阳性药物颐和春却无此作用，而对于吞噬活性白基粉及白蛹粉的作用有显著的统计学意义，黄基粉有增强趋势。

3、抗疲劳作用

选体重18-22g健康小鼠70只雌雄各半，随机分为8组，分组情况及给药剂量详见表3，连续给药7天，末次给药后0分钟将动物投入水温282、水深35cm的游泳槽内进行游泳试验，记录每只动物的游泳时间，组间t检验比较结果见表3

表3、抗疲劳作用(X±S)

组别	剂量g/kg	动物数n	游泳时间min
				对照组	---	10	91.41±11.66
颐和组	2.0	10	100.32±19.95
				黄基粉	4.0	10	105.65±9.97*

黄基粉	2.0	10	105.20±21.88
				白基粉	4.0	10	100.66±13.62
白基粉	2.0	10	98.76±12.73
				白蛹粉	4.0	10	87.59±30.43
白蛹粉	2.0	10	93.42±19.92

4、抗乏氧作用：

将80只健康小鼠(体重)20-22g雌雄各半，随机分为8组，一组为对照组，二组为颐和春药物对照组，其余6组为三个样品大、小剂量组，连续1g给荮10天，末次给药40min后将小鼠装入250ml的密闭广口瓶内，瓶内装5g钠石灰，瓶口涂凡士林封闭，观察并记录小鼠的死亡时间，结果见表4

表4、抗疲劳作用(X±S)

组别	剂量g/kg	动物数n	存活时间min
				对照组	---	10	26.27±9.22
颐和组	2.0	10	26.75±11.22
				黄基粉	4.0	10	27.64±10.56
黄基粉	2.0	10	32.03±13.40
				白基粉	4.0	10	28.58±11.46
白基粉	2.0	10	29.97±13.76
				白蛹粉	4.0	10	32.74±4.96
白蛹粉	2.0	10	27.94±9.10

表3结果表明：各给药组对小鼠的抗乏氧作用与对照组比较均有延长小鼠生存时间的趋势(p＜0.05)。

结论与讨论：通过上述各项药理活性实验表明，蚕蛹培养的拟青霉菌和粉状拟青霉孢子粉和蛹虫草均有补肾壮阳之功效，相对而言白基粉与白蛹粉的效果略好于蛹虫草及颐和春。拟青霉菌和粉状拟青霉菌有非常明显的增强免疫功能的作用。使注射化可的松造成免疫低下的动物(胸腺明显萎缩)免疫功能器官重量明显增加，同时增强小鼠的噬细胞吞噬功能，对健体强身扶正固本，起到较好的作用。抗乏氧和抗疲劳试验中粉状拟青霉菌也有明显的作用。

该菌、具有多种药理活性无毒副作用，有些药效高于蛹虫草；北京中医研究院中药研究所对该菌化学成分测试结果为：该菌含有核苷类、氨基酸、牛磺酸、微量元素等化学成分和天然冬虫夏基本一致；孢子粉的多糖含量是灵芝孢子粉3倍以上、核苷类含量高于灵芝孢子粉。

下面结合实施例进一步说明本发明，但不以实施例限定本发明的保护范围。

实施例1

用柞蚕蛹培养粉状拟青霉菌：

1、菌种制作：

采用鲜蚕蛹(或蚕蛹粉)10g、蛋白胨8g、奶粉8g、葡萄糖10g、磷酸二钾氢1.5g、磷酸二氢钠1.0g、硫酸镁500ng、水1000ml、PH：5.8配制成培养基。

将鲜柞蚕蛹搅碎(蚕蛹粉加500ml水)加500ml水，煮沸10分钟，过滤，用此滤液溶解蛋白胨、奶粉、葡萄糖，取另一容器放入磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、硫酸镁元素，加入适量水溶解，合并药液，定容1000ml。充分搅拌后分装在500ml三角瓶内。每瓶250ml。将瓶口封好，置于灭菌锅内，在1.2Pa下灭菌30分钟。取出，置于洁净工作台上，冷却后接入黄豆粒大小的粉状拟青霉菌种一块，瓶口按原样封好。

2、菌种培养：

将上述制备好的菌种置于培养室内培养：温度23℃±2℃。静止培养12小时，然后间歇振荡培养，每隔6小时振动培养20-30分钟。培养4-5天约100小时左右开始接种柞蚕蛹。

3、柞蚕蛹的选择和消毒处理：

将活柞蚕蛹从茧壳中取出。选择无病、健壮、不发育的柞、家蚕活蛹，首先用流水冲洗干净，然后放入75％酒精溶液内浸泡3分钟，取出。移入5℃无菌室备用。(储备时间不超过6小时)。

4、接种柞蚕蛹：

将菌种和柞蚕蛹移入无菌室内工作台上，在无菌条件下，用注射器吸取菌液注入蛹体内：柞蚕蛹0.2ml左右；接种后的蚕蛹摆放在培养盘中培养。

5、培养僵蛹：

培养温度15-18℃，培养时间：5-10天。将已僵化的蚕蛹放入洁净培养瓶内，柞蚕蛹每瓶7个，瓶口用塑料膜封好。移入高温室培养孢梗束。

6、培养拟青霉孢梗束：

23-25℃高温无光条件下培养3天，侍菌丝从蛹体上发出时，进行降温光照培养：光照强度为500勒克斯，温度18℃±2，湿度90％以上。培养时间约25天。整个培养时间：(从培养僵蛹到孢梗束长成)35天左右。

7、采收干制：

侍孢梗束从蛹体上长高2-7cm时，将其从培养瓶内取出，装入干燥盘中，阴干或冷冻燥。

8、包装储存：

为防止孢梗束从蛹体上脱落，采用真空包装，在-2℃度下避光保存。保存时间为3-5年。

用本发明方法接种柞蚕蛹2万个培养出蚕蛹粉状拟青霉子实体18700个详见表1

时间	接蛹数(个)	僵化数(个)	出子实体数(个)	采收时间
					5月7日	1000	987	970	6月12日
9月1日	2739	2731	2715	10月20日
					11月3日	5433	5400	5320	12月7日
1月8日	3000	2920	2910	2月14日
					4月3日	10000	9600	9300	5月7日

实施例2

用实施例1的方法，只是在接种菌种选择时选用孢子粉多的菌种，孢子粉的获取方法将蚕蛹冷冻干燥后，将其放入筛中筛取。其它培养方法同实施例1的培养方法。

试验结果：2000年5月-2001年5月采用上述方法共制培养柞蚕蛹5000个，获纯孢子粉200g详见下表2

接种时间	柞蚕菌蛹个数	采收孢子时间	采收孢子克数
				5月13日	1000	6月13日	37
10月7日	1000	11月9日	39
				2月3日	1000	3月4日	42
3月9日	1000	4月7日	41
				4月10日	1000	5月10日	41

实施例3

蚕蛹粉状拟青霉菌胶囊：

将冷冻干燥(或室温下阴干)的人工培养的蚕蛹粉状拟青霉或拟青霉孢子粉，进行超微粉碎或粉碎后过120目筛后，直接插入胶囊或加入辅料充分混合后装入胶囊。每粒025g一日三次、每次4-6粒。温水或黄酒送服。治疗肿瘤和恶性肿瘤，镇痛、安神。

实施例4

粉状拟青霉孢子粉加入灵芝孢子粉胶囊：

取粉拟青霉孢子粉500g、灵芝孢子粉500g、搅拌均匀，装入胶囊，每粒重05g每粒含粉拟青霉孢子粉和灵芝孢子粉各025克。主治各种肿瘤和恶性肿瘤，治疗白血病、风湿病痛等症。

实施例5

粉拟青霉菌有效成分及有效部位群提取及其制剂：

将培养的粉拟青霉菌丝和子实体粉碎、加水浸泡2小时、煮沸提取或用50％乙醇回流提取有效成分部分，经浓缩、干燥后再粉碎过120目，装胶囊或压片。

实施例6

蚕蛹粉状拟青霉饮料：

将蚕蛹粉拟青霉10g切成薄片，加水500ml煮沸、过滤、浓缩100ml、3度冰葙保存。可提高机体免疫力、防止动脉硬化。

实施例7

粉拟青霉酒

将蚕蛹粉拟青霉75g切成溥片，加入500ml白酒中，浸泡一周，日服三次，每次20ml，抗疲劳，对神经衰弱、风湿痹痛有疗效。

实施例8

蚕蛹粉拟青霉化妆品：

配方为将蚕蛹粉拟青霉或孢子粉提取浓缩液灭菌后，冷却至85度，然后将其加入到红花油或其它润肤剂中进行乳化反应，并不断搅拌，然后通冷却水，40度时加入香精，35度后停止搅拌，侍抽检化验合格后即可分装。

本产品对皮肤有治疗作用：如斑、粉刺、防晒等。

Claims (10)

1、一种蚕蛹培养拟青霉菌方法，其特征在于：以蚕蛹作为寄主，通过以下步骤制成拟青霉菌：

菌种制作、菌种培养、蚕蛹选择、消毒处理、接种蚕蛹、培养僵蛹、培拟青霉霉菌、采收干制、包装冷藏。

2、根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：拟青霉菌包括粉状拟青霉菌、蝉拟青霉、细脚拟青霉、粉状拟青霉孢梗束、粉状拟青霉素孢子粉。

3、拟青霉菌在制备治疗或预防肿瘤和恶性肿瘤疾病的药物的应用。

4、拟青霉菌在制备治疗或预防癫痫、小儿惊痫疾病的药物的应用。

5、拟青霉菌在制备治疗或预防动脉硬化、预防心、脑血管疾病的药物的应用。

6、拟青霉菌在制备治疗或预防病毒性肝炎疾病的药中应用。

7、拟青霉菌在制备治疗或预防免疫功能低下、抗疲劳、抗乏氧疾病的药中应用。

8、拟青霉菌在制备治疗或预防性功能低下疾病药物中的应用。

9、拟青霉菌在制备食品中的应用。

10、拟青霉菌在制备化妆品中的应用。