CN101766644A - 具有抗癌效果的蘑菇多糖体组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有抗癌效果的蘑菇多糖体组合物及其制备方法，该组合物包括：载体；及蘑菇多糖体，其中，蘑菇选自裂褶菌、巴西蘑菇、冬虫夏草、灵芝、云芝、樟芝、桑黄、珊瑚菇、香菇、柳松菇、猴头菇、杏鲍菇、花瓣茸、木茸、金针菇或上述蘑菇的组合。

Description

具有抗癌效果的蘑菇多糖体组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及具有抗癌功效的蘑菇多糖体组合物及其制备方法。

背景技术

近年来有许多研究发现蘑菇菌丝体或子实体中含有相当多的生理活性成分，如多糖体(β-Glucan)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、三萜类(Triterpenoids)等物质，具有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤等作用。而其中多糖体是研究最深入且最具潜力的抗肿瘤及免疫调节物质。

已知多糖体如β-葡聚糖，是一种良好的免疫促进剂，可有效刺激免疫细胞，不仅能增强生物体特异性免疫反应，同时也提高了非特异性免疫反应。多糖体能使生物体抵抗细菌、真菌、病毒及寄生虫的感染，以及抑制肿瘤的生长。近年来蘑菇多糖体(mushroom β-glucan)逐渐受到重视，主要原因在于蘑菇多糖体的分支度、分子量、水溶性以及结构稳定性都较酵母菌多糖体高出许多，具有较高的免疫促进能力。

具有抗肿瘤功效的多糖体，其生理活性可依多糖体的分子量大致区分为三类：(A)分子量在3,000～5,000左右，具有降低血糖的功能，(B)分子量在10,000～100,000之间，具消炎的作用，(C)分子量在30,000以上，则具有抗肿瘤作用，且分子量越大效果越好。

以往蘑菇多糖体大多萃取自子实体，但是子实体来源有限；近来研究已知约有50％蘑菇类可于液态培养中产生胞外多糖体，所以可取其培养液进行多糖体纯化；与子实体培养相比，液态培养较为迅速而简单。

然而，蘑菇类的成分复杂，如多糖、蛋白质、多肽类、三萜类、多种氨基酸、生物碱、酯类和有机酸等，所以萃取蘑菇多糖体需经繁琐的步骤，如热萃取、碱萃取、酸萃取等方式，故易残留有机溶剂、氨基酸与蛋白质，这些残留物可能对人体产生刺激性免疫反应。

已知蘑菇类抗肿瘤成分大部分是多糖体或是多糖体与蛋白质的复合物，而其抗肿瘤效果与剂量、次数、时间及给予途径有关，但是含有蛋白质的多糖体会引起动物体的免疫反应，产生发烧、红肿、腹水等不适的现象，因此须将蘑菇中的其他物质除去，仅萃取并纯化高分子多糖体，才能排除不利于人体的免疫反应。

为解决上述问题，本发明提供了新颖的具抗癌效果的蘑菇多糖体组合物及其制备方法。

发明内容

鉴于上述公知方法的缺陷，本发明的主要目的是提供一种具有抗癌效果的蘑菇多糖体组合物。

本发明的另一目的提供蘑菇多糖体的萃取方法，将液态发酵的蘑菇菌液，经由乙醇萃取，再利用陶瓷膜与分离技术纯化，萃取出高分子多糖体，并除去蛋白质等物质，以解决容易引起过敏反应的情形。

为达上述及其他目的，本发明提供具有抗癌效果的蘑菇多糖体组合物，包含蘑菇多糖体及载体。该蘑菇多糖体可选自所有食用蘑菇类与医药用蘑菇类的多糖体。该蘑菇包括，举例但非限制，裂褶菌(Schizophyllum commue)、巴西蘑菇(Agarics blaze)、冬虫夏草(Cordycepssinensis)、灵芝(Ganoderma lucidum)、云芝(Coriolus versicolor)、樟芝(Anthodia camphorate)、桑黄(Phellinus linteus)、珊瑚菇(Pleurotuscitrinopileatus)、香菇(Lentinula edodes)、田头菇属(Agrocybe sp.)如柳松菇(Agrocybe aegerita)、猴头菇(Hericium erinaceus)、杏鲍菇(Pleurotus eryngiig)、花瓣茸(Sparrasis crispa)、木茸(Auriculariaauricula)、金针菇(Flammulina velutipes)或上述蘑菇的组合。

本发明组合物的优选实施例为含有萃取自多种蘑菇的多糖体。

本发明组合物的更优选实施例为，组合物包括20-35％萃取自裂褶菌与灵芝的多糖体；25-45％萃取自冬虫夏草、樟芝、云芝与巴西蘑菇的多糖体；以及20-35％萃取自桑黄、珊瑚菇、香菇、柳松菇、猴头菇、杏鲍菇、花瓣茸、木茸与金针菇的多糖体。

根据本发明，该蘑菇多糖体组合物可以以注射或口服的方式，施用于有需要的对象。于实施例中，该组合物可单独使用或与其他药物结合使用。

根据本发明，该蘑菇多糖体组合物的载体可为液态、固态或半固态，且为医药上可接受的载体。于优选实施例中，该载体为水，且以二次蒸馏水为更优选。

根据本发明，具有抗癌效果的蘑菇多糖体组合物，可应用于治疗或预防癌症。

根据本发明，该蘑菇多糖体组合物具有提高免疫活性的效果，包括促进吞噬细胞的吞噬活性及自然杀伤细胞的细胞毒活性。

根据本发明，该蘑菇多糖体组合物具有促进细胞因子生成的效果，该细胞因子包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及/或干扰素-γ(INF-γ)。

本发明还提供制备蘑菇多糖体的方法，该方法包括：(a)将蘑菇菌丝体液态发酵，得到蘑菇菌液，(b)将步骤(a)所得的蘑菇菌液均质化并静置沉淀，以收取上清液，(c)将步骤(b)所得的上清液用乙醇沉淀并收集沉淀物，(d)用水溶解沉淀物而形成水溶液，及(e)用陶瓷膜与分离膜系统透析该水溶液，以获得蘑菇多糖体。所获得的蘑菇多糖体可应用于本发明的组合物。

根据本发明，上述方法所使用的蘑菇可选自所有食用蘑菇类与医药用蘑菇类，包括，举例但非限制，裂褶菌、巴西蘑菇、冬虫夏草、灵芝、云芝、樟芝、桑黄、珊瑚菇、香菇、田头菇属如柳松菇、猴头菇、杏鲍菇、花瓣茸、木茸、金针菇，或上述蘑菇的组合。

根据本发明，进行该制备方法之前，先以液态培养的方式，让蘑菇产生大量高分子多糖体，再经由均质机搅拌，破坏蘑菇菌丝体，让菌丝体中所含有效成分释放到培养液中，并静置较长时间，以使有效成分完全释放。

在优选实施例中，将该培养菌液均质化后静置18-24小时。

在优选实施例中，将静置的培养液先用筛网过滤，去除大片段菌丝体碎片，再用乙醇萃取过滤液，将蘑菇有效物质(多糖体或是多糖体与蛋白质的复合物)沉淀，其中最好是乙醇为与过滤液等量(1∶1)，且最好使用浓度95％的乙醇进行萃取。

在优选实施例中，用水溶解经乙醇萃取的沉淀物得到多糖体水溶液，最好使用二次蒸馏水。接着，使用陶瓷膜与分离技术纯化该多糖体水溶液，以萃取出高分子多糖体并去除小分子的杂质与多肽类、蛋白质等容易引起过敏反应的物质，使滤液只剩下纯化的蘑菇高分子多糖体萃取液。

由于蘑菇多糖体可以耐高温高压，所以可将纯化所得的溶液高压灭菌处理，不仅可达灭菌效果，更可促使蛋白质与一些有机物质失去活性，藉此避免蘑菇多糖体与蛋白质的复合物具有活性，因而去除了刺激动物体免疫系统产生过敏性的不适现象。

在优选实施例中，配合无菌设备如0.22微米(μm)过滤膜，将所得的蘑菇高分子多糖体萃取液分装制成液态剂型。该剂型可应用为本发明之的蘑菇多糖体组合物。

根据本发明，用于此制备方法的蘑菇菌液可为一种蘑菇菌液、或为两种以上蘑菇菌液的混合。各蘑菇菌液亦可利用此制备方法分别萃取出高分子多糖体后，再加以混合。

附图说明

图1说明本发明用于纯化蘑菇多糖体的陶瓷膜与分离膜系统。

图2说明口服喂食本发明蘑菇多糖体的小鼠，其粒细胞的吞噬活性。实验组为每日口服本发明蘑菇多糖体0.1毫升，对照组为每日口服磷酸缓冲液(PBS)0.1毫升。＊表示实验组与对照组有显著差异，P＜0.05(ANOVA)。

图3说明腹腔注射本发明的蘑菇多糖体的小鼠，其粒细胞的吞噬活性。实验组为每日腹腔注射蘑菇多糖体针剂0.05毫升，对照组为每日腹腔注射磷酸缓冲液(PBS)0.05毫升。＊表示实验组与对照组有显著差异，P＜0.05(ANOVA)。

图4说明口服喂食本发明蘑菇多糖体的小鼠，其粒细胞的吞噬指数，以平均萤光强度(FI)表示。实验组为每日口服本发明的蘑菇多糖体0.1毫升，对照组为每日口服磷酸缓冲液(PBS)0.1毫升。＊表示实验组与对照组有显著差异，P＜0.05(ANOVA)。

图5说明腹腔注射本发明蘑菇多糖体的小鼠，其粒细胞细胞的吞噬指数，以平均萤光强度(FI)表示。实验组为每日腹腔注射蘑菇多糖体针剂0.05毫升，对照组为每日腹腔注射磷酸缓冲液(PBS)0.05毫升。＊表示实验组与对照组有显著差异，P＜0.05(ANOVA)。

图6说明口服喂食本发明蘑菇多糖体的小鼠，其单核细胞的吞噬指数，以平均萤光强度(FI)表示。实验组为每日口服本发明的蘑菇多糖体0.1毫升，对照组为每日口服磷酸缓冲液(PBS)0.1毫升。＊表示实验组与对照组有显著差异，P＜0.05(ANOVA)。

图7说明腹腔注射本发明蘑菇多糖体的小鼠，其单核细胞的吞噬指数，以平均萤光强度(FI)表示。实验组为每日腹腔注射蘑菇多糖体针剂0.05毫升，对照组为每日腹腔注射磷酸缓冲液(PBS)0.05毫升。＊表示实验组与对照组有显著差异，P＜0.05(ANOVA)。

图8说明口服喂食本发明的蘑菇多糖体四周的小鼠，其各周的脾脏自然杀伤细胞的细胞毒活性。实验组为每日口服本发明的蘑菇多糖体0.1毫升，对照组为每日口服磷酸缓冲液(PBS)0.1毫升。＊表示实验组与对照组有显著差异，P＜0.05(ANOVA)。

图9说明腹腔注射本发明的蘑菇多糖体四周的小鼠，其各周的脾脏自然杀伤细胞的细胞毒活性。实验组为每日腹腔注射蘑菇多糖体针剂0.05毫升，对照组为每日腹腔注射磷酸缓冲液(PBS)0.05毫升。＊表示实验组与对照组有显著差异，P＜0.05(ANOVA)。

图10说明口服喂食本发明蘑菇多糖体四周的小鼠，其各周的血液中TNF-α含量(浓度pg/毫升)。实验组为每日口服本发明的蘑菇多糖体0.1毫升，对照组为每日口服磷酸缓冲液(PBS)0.1毫升。＊表示实验组与对照组有显著差异，P＜0.05(ANOVA)。

图11说明腹腔注射本发明蘑菇多糖体四周的小鼠，其各周的血液中TNF-α含量(浓度pg/毫升)。实验组为每日腹腔注射蘑菇多糖体针剂0.05毫升，对照组为每日腹腔注射磷酸缓冲液(PBS)0.05毫升。＊表示实验组与对照组有显著差异，P＜0.05(ANOVA)。

图12说明口服喂食本发明的蘑菇多糖体四周的小鼠，其各周的血液中IFN-γ含量(浓度pg/毫升)。实验组为每日口服本发明的蘑菇多糖体0.1毫升，对照组为每日口服磷酸缓冲液(PBS)0.1毫升。＊表示实验组与对照组有显著差异，P＜0.05(ANOVA)。

图13说明腹腔注射本发明的蘑菇多糖体四周的小鼠，其各周的血液中IFN-γ含量(浓度pg/毫升)。实验组为每日腹腔注射蘑菇多糖体针剂0.05毫升，对照组为每日腹腔注射磷酸缓冲液(PBS)0.05毫升。＊表示实验组与对照组有显著差异，P＜0.05(ANOVA)。

具体实施方式

以下通过特定的具体实施例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭示的内容了解本发明的其他优点与功效。

一、蘑菇菌种筛选与培养

本发明可使用的蘑菇菌株如裂褶菌、巴西蘑菇、冬虫夏草、灵芝、云芝、樟芝、桑黄、珊瑚菇、香菇、田头菇属如柳松菇、猴头菇、杏鲍菇、花瓣茸、木茸、金针菇等，但不限于上述菌株。

将菌种接种于YM培养基(YM培养基包含0.3％(w/w)酵母菌萃取物、0.3％麦芽抽出物、0.5％蛋白胨(peptone)、1.0％葡萄糖、1.5％琼脂)上，于28℃培养箱中培养5-7天，待菌丝长满YM固体培养基。

将在YM琼脂培养基上生长的菌丝体切一小块植入20毫升YM培养液中，在28℃恒温培养箱培养一周，作为液态发酵的菌种。

将培养完成的菌种接种至装有800毫升培养基(含4％葡萄糖与0.5％酵母菌萃取物)的1公升液态发酵槽内，于室温条件下培养。约20～30天后，蘑菇代谢物生成，发酵所得的培养液体中包含蘑菇多糖体、蛋白质、多肽类、三萜类、多种氨基酸、生物碱、酯类和有机酸等物质。

二、蘑菇多糖体的分离与纯化

收集上述发酵液并经由均质机搅拌，把蘑菇菌丝体、代谢物充分混匀，并静置18～24小时。待发酵液沉淀后，再用100目、200目与400目的筛网过滤，将大片段的菌丝体除去，取得过滤液。

在过滤液中添加等量且浓度为95％的乙醇，并静置18～24小时，等待结晶物质沉淀。用400目的筛网收集沉淀物，再以无菌水将沉淀物溶解回原体积(上述过滤液的体积)，而得水溶液。

而后，使用陶瓷膜与分离膜系统1(如图1所示)将上述水溶液透析，以萃取多种分子量的蘑菇高分子多糖体。分离系统使用内循环的管路原理，使含有蘑菇多糖体的无菌水溶液在陶瓷过滤膜管柱11中不断循环，小分子(如蛋白质、多肽类、三萜类、多种氨基酸、生物碱、酯类和有机酸等物质)因而渗透出管路，以达到除去小分子的目的，用收集瓶12收取蘑菇多糖体溶液。最后再添加无菌水，使蘑菇多糖体溶液具有原过滤液的体积。

由于蘑菇多糖体可以耐高温高压，所以可以将过滤液用高压灭菌杀菌，并促使蛋白质与一些有机物质失去活性，藉以去除刺激动物体免疫系统产生过敏性的不适现象。

再通过0.22微米(μm)过滤膜，将灭菌后残留在蘑菇高分子多糖体溶液中的聚集、无活性的蛋白质与多肽等物质过滤除去。接着在无菌室中使用灭菌过的分装器，将蘑菇高分子多糖体溶液分装并制备成液态剂型，即为本发明的蘑菇多糖体组合物。

本发明的蘑菇多糖体组合物可包含萃取自一或多种蘑菇的多糖体。当本发明的组合物包括两种以上的蘑菇多糖体时，该蘑菇培养液可分别制备成多糖体组合物后再混合；或可将蘑菇培养液先行混合再进行多糖体组合物的制备。

根据本实施例所得的组合物包括约20-35％萃取自裂褶菌与灵芝的多糖体；约25-45％萃取自冬虫夏草、樟芝、云芝与巴西蘑菇的多糖体；以及约20-35％萃取自桑黄、珊瑚菇、香菇、柳松菇、猴头菇、杏鲍菇、花瓣茸、木茸与金针菇的多糖体。

根据本实施例所得的蘑菇多糖体组合物，萃取自不同蘑菇的多糖体所占多糖体总量的比例如下：

裂褶菌为16％、灵芝为16％、冬虫夏草为14％、樟芝为13％、云芝为8％、巴西蘑菇为6％、桑黄为3％、珊瑚菇为3％、香菇为3％、柳松菇为3％、猴头菇为3％、杏鲍菇为3％、花瓣茸为3％、木茸为3％和金针菇为3％。

将上述组合物分为口服与针剂两组，进一步应用于下列实施例中。其中针剂所含的蘑菇多糖体含量，利用苯酚-硫酸法(Phenol-sulfuricacid method)测定，为0.036±0.002％。

三、蘑菇多糖体对吞噬细胞活性影响的分析

以下实施例使用五周龄的ICR品系雄性小白鼠(动物来源：台大医院动物繁植及研究中心)，在温度21±2℃、湿度65±5％，光照与黑暗各12小时(D∶L＝12∶12)的条件下饲养。实验动物经一个星期适应后开始进行蘑菇多糖体实验，口服组每天以胃管灌食0.1毫升的前述蘑菇多糖体组合物，腹腔注射组每天以腹腔注射0.05毫升的蘑菇多糖体针剂，对照组则以磷酸缓冲液代替蘑菇多糖体。食物及饮水正常供应，并依照动物房管理办法，定期检查小白鼠的状况，尽量减低小白鼠受到的环境压迫及人为伤害。

以下实施例的实验结果均以平均值±标准差(Mean±SD)表示，数据统计分析采用SAS(Statistical Analysis System，SAS Institute Inc.，USA)软件进行单因素方差分析(One way ANOVA)，并根据新复极差法(Duncan’s new multiple range test)进行各组间的差异性分析，若组间差异达P＜0.05，则视为差异具有显著性。

吞噬细胞活性分析：用于吞噬细胞活性分析的血液样本为较少量(100～150微升(μL))，且需与抗凝剂(肝素heparin)充分混和，因考虑到可重复采样与避免牺牲，故采用眼窝采血法，每周两次，方法如下：麻醉后，压迫小鼠颈部两侧，阻碍静脉血回流，使眼球充分外突，并使眼眶后静脉丛充血。自该眼睛的前眼角或后眼角处，用管径恰当且内壁有抗凝剂的毛细管，顺眼球周缘向眼窝中心插入，旋转毛细管以切开静脉丛，藉虹吸管原理将血液吸入毛细管中，再将血样移至加有抗凝剂的微量离心管中，充分混和后置于冰上备用。

血液中吞噬细胞活性分析：使用PHAGO-TEST试剂盒(ORPEGEN，Phama，F.R.G.)，通过单核细胞与粒细胞对带有萤光标记的大肠杆菌(FITC-标记的E.coli)的吞噬，再以流式细胞仪分析其吞噬能力，实验步骤如下：

1.将100微升含肝素且震荡混匀(vortex mixer)的全血放入标示适当的5毫升试管中，注意管壁上不可留有血液，每一样品各做两管(一管为试验管，一管为阴性对照管)，而后冰浴10分钟。

2.于各试管中，加入20微升震荡混匀的目标细胞(FITC-labeledE.coli)。将试验管置于37℃预热的水浴槽中，进行水浴作用10分钟；阴性对照组则留置冰浴10分钟。时间及温度需准确控制，且水浴槽需预热且加盖。

3.将试管置于冰上以终止吞噬作用，并于各管加入100微升冰冷的骤冷液(quenching solution)(锥虫蓝，trypan blue)，震荡混匀后进行冰浴2分钟，目的是排除未被细胞吞入的目标细胞的萤光干扰。其原理为锥虫蓝的吸收光谱与FITC的发散光谱重叠，而吞噬细胞的细胞膜完整，故可避免被锥虫蓝染色，同时保护被吞入的大肠杆菌不被染色，未被吞噬的大肠杆菌则会被锥虫蓝染色而无法发光(Sahlin etal.，1983)。

4.用3毫升的冲洗液清洗细胞，在4℃以250×g离心5分钟，小心去除上清液，避免碰到细胞团块，且重复清洗步骤一次。

5.于各管中，加入2毫升的裂解液(lysing solution)溶解及固定血液，混和均匀，于室温下作用20分钟，在4℃以250×g离心5分钟，吸除上清液。

6.于各管中，加入200微升DNA染色液(staining solution)，混和冰浴且避光10分钟，以染出白细胞。

7.利用流式细胞仪，分析粒细胞与单核细胞的吞噬能力。

实验结果如图2至图7所示。

吞噬活性用表现出吞噬作用的细胞的百分比(％)表示，亦即具有吞噬能力的单核细胞或粒细胞的比例。经口服喂食蘑菇多糖体的结果如图2所示，实验组在第5天的测量值达到最高(32.93％)，是对照组(13.74％)的2.4倍，并且差异具有显著性(P＜0.05)，与前一个时间点(第2天)相比提高了53.99％；实验组的吞噬活性于第9天下降(23.68％)，但与对照组相比仍有显著差异(P＜0.05)，实验组于第12天的吞噬活性(17.2％)虽仍比对照组高，但未达显著差异，接着在第16、19、23天实验组的吞噬活性呈现稳定状态，并与对照组相比有显著差异(P＜0.05)。整体而言，口服蘑菇多糖体可使细胞吞噬活性快速而显著提高，且口服一周即可获得明显差异。

经腹腔注射蘑菇多糖体的结果如图3所示，实验组在第9天之后的测量值与对照组相比都具有显著性差异(P＜0.05)，实验组的吞噬活性高峰出现在第12天(28.02％)，是对照组(10.16％)的2.76倍。比较口服与腹腔注射的结果，口服蘑菇多糖体会较注射蘑菇多糖体早产生显著差异(P＜0.05，口服组在第5天达到，而腹腔注射组在第9天达到)，比较吞噬活性最高值也是出现在口服组(32.93％)，高于腹腔注射组(28.02％)。

吞噬细胞的平均萤光强度(FI)代表每个细胞吞噬量的多少。口服蘑菇多糖体的结果如图4所示，实验组粒细胞的平均萤光强度呈现逐渐上升的趋势，第12天(7.76)开始与对照组相比具有显著差异(P＜0.05)，第16天以后渐渐稳定。最高值出现在第16天(9.92)；与处理前的第0天(4.06)相比，提高了2.44倍。单核细胞的萤光强度如第6图所示，口服蘑菇多糖体的实验组在第12天出现高峰(5.71)，是同时间对照组的2.30倍；12天以后至实验结束的测量值，实验组与对照组均在95％的可信区间具有显著差异。以上结果证实，口服蘑菇多糖体确能提高粒细胞及单核细胞吞噬外来物的量。

如图5所示，腹腔注射蘑菇多糖体的小鼠的粒细胞的平均萤光强度显著提高，注射第2天所测量的平均值5.95已高于对照组平均值3.8，但尚未达显著差异；第5天以后至实验结束的测量值，实验组与对照组均具有显著差异(P＜0.05)。实验组于第0天(2.65)到第2天(5.95)活性提高最显著，增加了2.25倍，第9天以后实验组的FI值皆为对照组的两倍以上。图7表示腹腔注射蘑菇多糖体的小鼠的单核细胞平均萤光强度，与粒细胞的结果相似，实验组于第5天以后的测量值均与对照组具有显著差异(P＜0.05)，也是在第0天(1.73)到第2天(5.13)活性提高最显著，增加2.97倍。上述结果可证实，腹腔注射蘑菇多糖体能有效促进粒细胞与单核细胞吞噬外来物的能力，且于注射后一星期内获得明显效果。

显然，本发明的蘑菇多糖体可显著提高吞噬细胞的吞噬活性与吞噬数量。

四、蘑菇多糖体对自然杀伤细胞活性的影响

自然杀伤细胞在细胞免疫中扮演重要的角色，其活性的提高可直接帮助清除体内病变及癌变的细胞。利用对自然杀伤细胞敏感的YAC-1细胞进行本实验，即YAC-1细胞的死亡率可表示自然杀伤细胞的细胞毒活性。

脏器收集：将前述实验小鼠腹面，以乙醇消毒后，剪开腹腔皮肤，取下脾脏、肝脏以及肾脏，肝脏与肾脏用PBS将脏器洗净后吸干，称重并计算器官相对重量(relative organ weight)。

器官相对重量(％)＝{器官重量(g)/体重(g)}×100％。

脾脏淋巴细胞收集：将脾脏置于含适量RPMI 1640培养基(Hyclone)的20毫米(mm)培养皿中，用镊子将脾脏撕碎，利用Ficoll-Hypaque以1000rpm离心30分钟，吸取培养液和Ficoll-Hypaque间淡黄色的液体，此层即为小鼠脾脏淋巴细胞。

YAC-1细胞的培养：YAC-1细胞培养于具有2毫摩尔浓度(mM)谷氨酰胺(L-glutamine)，并调整至含有1.5g/L碳酸钠、10mM HEPES、1.0mM丙酮酸钠及含10％小牛血清的90％RPMI 1640培养基中，每2到3天传代培养一次。传代培养时直接加入新鲜培养基稀释，再分装至新的培养瓶。

细胞毒活性测试：根据Kiessling等的方法加以修改(Kiessling et al.，1975)，使用LIVE/DEAD Cell-Mediated Cytotoxicity试剂盒(MolecularProbes)，实验步骤如下：

用PBS将YAC-1细胞浓度调成1×106细胞/毫升(cell/毫升)。按照每毫升YAC-1细胞悬浮液加入10μL DIOC18的量，将DIOC18加入15ml离心管底部，再加入YAC-1细胞悬浮液并混和均匀。于37℃培养箱中培养20分钟。用PBS冲洗两次后，用培养基溶散细胞并将细胞浓度调成1×106cell/毫升，置于37℃培养箱中，保持细胞存活率95％以上。

用RPMI 1640培养基(Hyclone)将小鼠脾脏淋巴细胞调成细胞浓度为2×106cell/毫升的细胞悬浮液。将20微升染色后的YAC-1细胞加入到200微升脾脏淋巴细胞悬浮液中，并加入220微升的PI溶液(40微克/毫升)染色，1000×g离心30秒后，再于37℃培养箱中培养二小时。用流式细胞仪计算脾脏淋巴细胞活性，计算绿色萤光的YAC-1细胞数，再计算绿色细胞中有多少细胞因为被淋巴细胞破坏，使其细胞膜不完整，而为绿中带红的细胞；脾脏淋巴细胞的细胞毒活性的计算方式为：具有绿色与红色萤光的细胞数/绿色萤光细胞数。

小鼠的自然杀伤细胞的细胞毒活性如图8与图9所示。

口服蘑菇多糖体的结果如图8所示，口服PBS的对照组变化不大，口服蘑菇多糖体的实验组于第2周(16.09％)与第1周(9.10％)相比显著提高了1.76倍，且第2周(16.09％)、第3周(17.96％)和第4周(17.17％)的细胞毒活性与对照组相比具有显著差异(P＜0.05)。腹腔注射蘑菇多糖体的结果如图9所示，实验组在第0周(7.7％)至第1周(17.75％)的变化最大，活性提高130.48％，第2周(22.99％)、第3周(30.3％)与第4周(29.91％)与注射PBS的对照组相比皆具有显著差异(P＜0.05)。

实验结果证实，本发明的蘑菇多糖体无论是通过口服还是腹腔注射的给药途径，皆可促进生物体内自然杀伤细胞的细胞毒活性。

五、蘑菇多糖体对细胞因子含量影响的分析

用于细胞因子(cytokine)含量分析的血液量约需1毫升，以心脏采血法收集血样，方法如下：小鼠麻醉后，从胸腔后端1/3处，自胸骨左侧缘垂直刺入肋骨间而达心脏。在见针筒有回血后，以一手固定针头的方向与深度，另一手则轻拉针筒内筒。将所得血样静置，待血清析出后，12000×g离心20分钟，将血清收集于离心管中，用于细胞因子含量的测定。

细胞因子含量分析：利用酶联免疫吸附法(ELISA)，使用ELISA试剂盒(Biosource)，测量血清中细胞因子(IFN-γ、TNF-α)的含量，详细实验步骤如下所述。

于孔板中加入培养缓冲液(Incubation Buffer)、(50微升/孔)，空白组则不加。分别加入标准品及样品(50微升/孔)，并使试剂均匀混和。加入生物素键结体(Biotin Conjugate)、(50微升/孔)，空白组则不加；均匀混和后，于37℃培养1.5小时。清洗4次。加入链霉抗生物素-HR工作液(Streptavidin-HRP Working Solution)、(100微升/孔)，空白组则不加；于室温下培养30分钟。清洗4次。加入稳定色原体(Stabilized Chromogen)、(100微升/孔)，于黑暗中室温培养20分钟。加入终止液(Stop Solution)、(100微升/孔)，均匀混和后，利用分光光度计(Ultrospec1000，PHARMACIA BIOTECH)(λ＝450nm)测量吸光值，所得数值均需扣除仅含稳定色原体和终止液的空白组的数值。加入终止液后，需在2小时内测量吸光值。

利用TNF-α及IFN-γ标准品与其吸光值绘制吸光值与细胞因子浓度的标准曲线，可用以计算出待测样品中细胞因子的浓度。

TNF-α含量的测量结果如图10与图11所示。

口服蘑菇多糖体的结果如图10所示，实验组在每个采样点的平均值皆高于对照组，实验组于第1周的测量值达到最高(28.8pg/毫升)，第2周(27.4pg/毫升)及第3周(26.2pg/毫升)TNF-α浓度下降，到第4周浓度回升(27pg/毫升)，第0周(24.4pg/毫升)到第1周增加率最大，为18.03％。第1、2、4周，口服蘑菇多糖体的实验组与口服PBS的对照组具有显著差异(P＜0.05)。

腹腔注射蘑菇多糖体的结果如图9所示，实验组于第2周出现高峰(27.3pg/毫升)，最大增加率出现在第1周到第2周(8％)之间。第2周及第4周的测量值，实验组与对照组相比具有显著差异(P＜0.05)。

IFN-γ含量的测量结果如图12与图13所示。

口服蘑菇多糖体的结果如图12所示，实验组在第1周与第4周出现相对高点，其中，第4周的IFN-γ测量值最高(28.1pg/毫升)。且实验组的结果在第1周(27.0pg/毫升)与第4周，比较对照组的结果具有显著差异(P＜0.05)。

腹腔注射蘑菇多糖体的结果如图13所示，实验组的IFN-γ浓度逐渐增加，在第3周达到最高浓度(28.3pg/毫升)，而第4周又降低，最大增加率出现在第0周到第1周之间，为7.88％；关于第2、3、4周的测量值，实验组与对照组相比具有显著差异(P＜0.05)。

实验结果证实，本发明的蘑菇多糖体无论是通过口服或是腹腔注射的给药途径，皆可促进生物体内细胞因子含量增加。

六、蘑菇多糖体的抗癌效果

1蘑菇多糖体的肿瘤抑制试验

以皮下注射的方式将1×106/50微升的路易氏肺癌细胞(Lewis lungcarcinoma cells)植入C57BL/6JNarl小鼠的背上。小鼠植入肿瘤24小时后开始给予蘑菇多糖体，口服组每天以胃管灌食0.1毫升，腹腔注射组每天以腹腔注射0.05毫升的多糖针剂。处死实验小鼠时取出肿瘤秤重，并计算肿瘤抑制率。

处死前小鼠的活力以口服多糖体组最好，腹腔注射组次之，对照组最差。观察肿瘤的外观，对照组的肿瘤最大，腹腔注射组次之，两者的肿瘤都在小鼠的背部形成明显的椭圆状突起；口服多糖体组的肿瘤则明显地较对照组及腹腔注射组小，只在植入处形成一圆形硬块。解剖时发现，对照组的肿瘤周围与内部有明显的血液与脓聚集，肿瘤向下浸润到肌肉组织，需以剪刀才能分开；口服多糖体组的肿瘤则是一实心硬块，仅存在于皮肤与肌肉之间，没有浸润到肌肉，也没有观察到显著的血液或脓聚集。

各组取出肿瘤秤重的结果如表1，对照组的肿瘤最重(0.46g)，腹腔注射多糖体组次之(0.36g)，口服多糖体组最轻(0.27g)，与对照组相比，口服多糖体组达到显著差异(P＜0.05)。将各组的肿瘤重量与对照组相比计算肿瘤抑制率，口服多糖体组达40.58％，腹腔注射多糖体组为21.01％。

表1、多糖体组合物对肿瘤的抑制效果

2.蘑菇多糖体的肿瘤转移抑制试验

将路易氏肺癌细胞植入C57BL/6品系的小鼠后腿，七天后腿部癌细胞会增生而肿大(原发性癌)；进行癌细胞接种后三天起，每天喂食蘑菇多糖体组合物两次，各组在癌细胞注射后七天起，以钴60处理原发癌5天进行治疗，经治疗后2星期观察各组小鼠的后腿肿瘤，并处死小鼠以观察其肺脏发生肿瘤颗粒的情形。

实验结果如表2所示，对照组(未服用多糖体组合物、未进行放射治疗)的小鼠100％发生肿瘤转移现象，肺部肿瘤颗粒数平均为12.3；未服用多糖体组合物、但进行放射治疗的小鼠，则100％皆会发生肿瘤转移现象，肺部肿瘤数为13.7；服用多糖体组合物、但未进行放射治疗的小鼠，肿瘤转移比率降低且肺部肿瘤数亦减少；服用多糖体组合物、且进行放射治疗的小鼠，肿瘤转移比率显著降低至12.5％，而肺部肿瘤数降低为0.85。

表2、多糖体组合物对肿瘤转移的抑制效果

上述结果证实了本发明的蘑菇多糖体组合物无论是口服或注射方式，皆具有抗癌的功效，包括抑制肿瘤生长与降低肿瘤转移。而且，同时使用本发明的蘑菇多糖体组合物强化体内免疫细胞的抗癌活性，并配合其他癌症控制方法(如：放射治疗或药物治疗)，可使抗癌功效更为提高。

上述实施例仅示例性说明本发明的组合物及其制备方法，而非用于限制本发明。任何本领域技术人员均可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰与改变。因此，本发明的权利保护范围如前述权利要求的范围所述。

Claims (8)

1.一种具有抗癌效果的蘑菇多糖体组合物，该组合物包括：

载体；及

蘑菇多糖体，其中，该蘑菇选自裂褶菌、巴西蘑菇、冬虫夏草、灵芝、云芝、樟芝、桑黄、珊瑚菇、香菇、柳松菇、猴头菇、杏鲍菇、花瓣茸、木茸、金针菇或上述蘑菇的组合。

2.如权利要求1所述的组合物，其中，该蘑菇多糖体包括20至35％萃取自裂褶菌与灵芝的多糖体；25至45％萃取自冬虫夏草、樟芝、云芝与巴西蘑菇的多糖体；以及20至35％萃取自桑黄、珊瑚菇、香菇、柳松菇、猴头菇、杏鲍菇、花瓣茸、木茸与金针菇的多糖体。

3.如权利要求1所述的组合物，可以注射或口服的方式，施用于有需要的对象。

4.如权利要求1所述的组合物，其中载体为液态、固态或半固态。

5.如权利要求1所述的组合物，其中载体为水。

6.一种如权利要求1的蘑菇多糖体的制备方法，包括：

(a)将蘑菇菌丝体液态发酵，而得蘑菇菌液；

(b)将步骤(a)所得的蘑菇菌液均质化并静置沉淀，以取得上清液；

(c)用乙醇沉淀上清液并收集沉淀物；

(d)用水溶解沉淀物，而得水溶液；及

(e)用陶瓷膜与分离膜系统透析水溶液，以获得蘑菇多糖体。

7.如权利要求6所述的方法，其中蘑菇菌液均质化后静置18至24小时。

8.如权利要求6所述的方法，其中乙醇为与上清液等量且浓度为95％的乙醇。

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