CN1481823A - 有益于肝脏的膳食补充剂 - Google Patents

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Abstract

含有多种酵母细胞的组合物，其中所述的多种酵母细胞的特征在于其能够使哺乳动物中血清GPT，AP和/或LDH－5的水平正常化，这些酵母细胞具有这种能力的原因是因为它们曾经被在具有特定频率和特定场强的交流电场存在的情况下培养过。本发明还包括制造和使用这些组合物的方法。

Description

有益于肝脏的膳食补充剂
技术领域
本发明涉及对肝脏有益并且可被用作膳食补充剂的组合物。这些组合物含有可以通过在特定频率和场强的电磁场中生长而得到的酵母细胞。
背景技术
肝脏疾病有很多类型，包括急性肝炎、慢性肝炎、毒性肝损伤、肝癌、肝硬化、脂肪肝、门静脉高压等等。在一些患者中，肝脏疾病发展成肝硬化，或者在一段时间后甚至形成肝癌(A report by the research groupon liver diseases，Health and Welfare Ministry，1979)。因此，对肝炎的预防、观察和治疗对肝硬化和肝癌的预防是重要的。近年来，已经研制出了肝炎和肝硬化动物模型，如今正在将这些模型应用于肝脏疾病研究(Mori etal.，Hepatic，Cholecyst，Pancresto 19(5)：905-910(1989))。
休息和膳食是用于治疗急性肝炎的主要方法，而各种其它方法被用来治疗活性型慢性肝炎，特别是乙型肝炎。干扰素、阿糖腺苷和阿昔洛韦已经被用于肝炎治疗。但是，这些药物的长期使用会引起严重的副作用。因此，强烈希望研制出治疗肝脏疾病的安全有效的方法。
发明概述
本发明基于这样的发现：某些酵母细胞可以被具有特定频率和场强的电磁场活化，从而产生有益于肝脏的物质。因此，可以将含有这些活化酵母细胞的组合物用作改善肝脏健康的膳食补充剂，例如改善肝炎症状、肝硬化、脂肪肝和其它肝脏疾病。
本发明包括一种含有多种酵母细胞的组合物，这些酵母细胞曾被培养在频率范围为大约18000-18500MHz(例如18180-18240MHz)、场强范围为大约50-500mV/cm(例如100-450mV/cm)的交流电场中。将这些酵母细胞在交流电场中的培养一段时间，这段时间足以将所述的多种酵母细胞活化，以产生有益于肝脏的物质。例如，当摄入培养的酵母细胞的时候，这些酵母细胞可以使哺乳动物体内的谷氨酸丙酮酸转氨酶(GPT)，碱性磷酸酶(AP)，和/或乳酸脱氢酶5(LDH-5)的血清水平正常化。
在一个实施方案中，在所述的时间段内，交流电场的频率和/或场强可以在上述的范围内变化。换句话说，可以使所述的酵母细胞暴露于一系列电磁场。典型的时间段是40-100小时(例如50-80小时)。
可以被包含在此组合物中的酵母细胞全都可以从中国普通微生物菌种保藏中心(China General Microbiological Culture Collection Center)(“CGMCC”)得到，此保藏中心是布达佩斯条约认可的保藏中心(中国微生物菌种保藏管理委员会，中国科学院微生物研究所，海淀区，2714信箱，北京，100080，中国)。可以使用的酵母种类包括但不限于通常在食品和制药工业中使用的那些种类，例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)，薛瓦酵母(Saccharomyces chevalieri)，德尔布酵母(Saccharomyces delbrueckii)，少孢酵母(Saccharomyces exiguous)，发酵性酵母(Saccharomycesfermentati)，洛格酵母(Saccharomyces logos)，蜂蜜酵母(Saccharomycesmellis)，卵形酵母(Saccharomyces oviformis)，罗斯酵母(Saccharomycesrosei)，鲁酵母(Saccharomyces rouxii)，清酒酵母(Saccharomyces sake)，葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)，威尔酵母(Saccharomyceswillianus)，黄酒酵母(Saccharomyces sp.)，八孢裂殖酵母(Schizosaccharomyces octosporus)，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)，掷孢酵母(Sporobolomyces roseus)，白球拟酵母(Torulopsiscandida)，famta拟酵母(Torulopsis famta)，圆球拟酵母(Torulopsisglobosa)，平常球拟酵母(Torulopsis inconspicua)，贝雷丝孢酵母(Trichosporon behrendii)，头状丝孢酵母(Trichosporon capitatum)，丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)，维克酵母(Wickerhamia fluoresens)，木生念珠菌(Candida arborea)，克鲁斯念珠菌(Candida krusei)，朗比克念珠菌(Candida lambica)，解脂念珠菌(Candida lipolytica)，近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)，铁红念珠菌(Candida pulcherrima)，皱落念珠菌(Candida rugousa)，热带念珠菌(Candida tropicalis)，产朊念珠菌(Candida utilis)，Crebrothecium ashbyii，白地霉(Geotrichumcandidum)，异常汉逊酵母(Hansenula anomala)，产阿拉伯糖醇汉逊酵母(Hansenula arabitolgens)，杰丁汉逊酵母(Hansenula jadinii)，土星汉逊酵母(Hansenula saturnus)，schneggii汉逊酵母(Hansenula schneggii)，亚膜汉逊酵母(Hansenula subpelliculosa)，柠檬形克勒克酵母(Kloeckeraapiculata)，油脂酵母(Lipomyces starkeyi)，粉状毕赤酵母(Pichiafarinosa)，膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)，红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)，红酵母(Rhodotorula glutinis)，小红酵母(Rhodotorula minuta)，深红酵母(Rhodotorula rubar)，橙黄红酵母(Rhodotorula aurantiaca)，路德类酵母(Saccharomycodes ludwigii)，和墨类酵母(Saccharomycodes sinenses)。例如，所述的酵母细胞可以是汉逊酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae Hanson)AS2.375，AS2.501，AS2.502，AS2.503，AS2.504，AS2.535，AS2.558，AS2.560，AS2.561，AS2.562，或IFFI1048；或者汉逊卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensisHansen)AS2.420或AS2.444。
除非作出相反的限定，本文使用的所有科技术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的意思。下文描述示例性的方法和材料，在本发明的测试或者实践中也可以使用与本文所述的方法和材料类似或等效的方法和材料。本文提及的所有出版物和其它文献在此全部引入作为参考。在内容相互抵触的情况下，以本发明的说明书、包括定义为准。所述的材料、方法和实施例都仅仅是说明性的，不能理解为对本发明的限制。在本发明的全部说明书和权利要求中，措词“包含(comprise)”或其变体如“含有(comprises)”或“包括(comprising)”，应该被理解为表示包含所陈述的整数或者整数组，但是并不排除任何其它整数或者整数组。
从下面的发明详述以及权利要求中，可以明白本发明的其它特点和优势。
附图说明
图1是一幅示意图，其显示了使用电磁场来活化酵母细胞的示例性装置。1：酵母培养物；2：容器；3：电源。
图2是一幅示意图，其显示了制作本发明酵母组合物的示例性装置。此装置包括信号发生器和相互连接的容器1、2和3。
发明详述
本发明基于这样的发现：某些酵母细胞株可以被具有特定频率和场强的电磁场(“EMF”)活化，从而产生在肝脏疾病治疗中有用的制剂。含有活化酵母细胞的酵母组合物可以被用作健康饮料或者药丸形式的膳食补充剂。在某些实施方案中，本发明的酵母组合物可以改善肝脏功能，从而使谷氨酸丙酮酸转氨酶，碱性磷酸酶，和/或乳酸脱氢酶5的血清水平正常化。
由于包含在这些酵母组合物中的活化酵母细胞，曾经经受过酸性条件(pH2.5-4.2)的培养，所以该组合物在胃中是稳定的并且可以被继续运行到小肠。一旦进入小肠中，这些酵母细胞就被各种消化酶破裂，这样，生物活性物质就被被释放出来很容易被吸收。
本发明的发明者没有被任何理论或者机理所束缚，相信：EMF激活或者增强酵母细胞中的一个基因或一组基因的表达，或者改变了酵母细胞中某些细胞组分(例如DNA，RNA，酶/蛋白质)的构象和/或活性，这样引起有益于肝脏的制剂产生。I.用于本发明的酵母菌株
在本发明中使用的酵母的类型包括，但不限于下列种属：酵母菌属(Saccharomyces)、念珠菌属(Candida)、Crebrothecium、地丝菌属(Geotrichum)、汉逊酵母菌属(Hansenula)、克勒克酵母属(Kloeckera)、油脂酵母属(Lipomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、红酵母属(Rhodotorula)、类酵母属(Saccharomycocde)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)，球拟酵母属(Torulopsis)、丝孢酵母属(Trichosporon)、威克酵母属(Wickerhamia)。
上面所列类别中的示例性种类包括但不限于表1中描述的种类。本发明中使用的酵母菌株可以从实验室培养中得到，或者从公众可以获取的培养物保藏中心那里得到，保藏中心例如CGMCC和美国典型培养物保藏中心，10801 University Boulevard，马纳萨斯，VA 20110-2209。有用菌株(带有CGMCC的保藏号)的非限制性实例是汉逊酿酒酵母AS2.375，AS2.501，AS2.502，AS2.503，AS2.504，AS2.535，AS2.558，AS2.560，AS2.561，AS2.562，和IFFI1048；和汉逊卡尔酵母AS2.420或AS2.444。其它可以使用的非限定性例子被描述在表1中。通常，本发明优选的酵母菌属是在葡萄酒工业和食物发酵中使用的那些酵母菌株。因此，含有这些酵母细胞的组合物对于人消费是安全的。
本发明酵母组合物的制备并不限于从纯的酵母菌株开始，但是这样做是优选的。可以通过培养不同种类或菌株的酵母细胞的混合物来生产本发明的酵母组合物。
                  表1示例性的酵母菌株
             汉逊酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae Hansen)
  ACCC2034   ACCC2035   ACCC2036   ACCC2037   ACCC2038
  ACCC2039   ACCC2040   ACCC2041   ACCC2042   AS2.1
  AS2.4   AS2.11   AS2.14   AS2.16   AS2.56
  AS2.69   AS2.70   AS2.93   AS2.98   AS2.101
  AS2.109   AS2.110   AS2.112   AS2.139   AS2.173
  AS2.174   AS2.182   AS2.196   AS2.242   AS2.336
  AS2.346   AS2.369   AS2.374   AS2.375   AS2.379
  AS2.380   AS2.382   AS2.390   AS2.393   AS2.395
  AS2.396   AS2.397   AS2.398   AS2.399   AS2.400
  AS2.406   AS2.408   AS2.409   AS2.413   AS2.414
  AS2.415   AS2.416   AS2.422   AS2.423   AS2.430
  AS2.431   AS2.432   AS2.451   AS2.452   AS2.453
    AS2.458     AS2.460     AS2.463     AS2.467     AS2.486
    AS2.501     AS2.502     AS2.503     AS2.504     AS2.516
    AS2.535     AS2.536     AS2.558     AS2.560     AS2.561
    AS2.562     AS2.576     AS2.593     AS2.594     AS2.614
    AS2.620     AS2.628     AS2.631     AS2.666     AS2.982
    AS2.1190     AS2.1364     AS2.1396     IFFI1001     IFFI1002
    IFFI1005     IFFI1006     IFFI1008     IFFI1009     IFFI1010
    IFFI1012     IFFI1021     IFFI1027     IFFI1037     IFFI1042
    IFFI1043     IFFI1045     IFFI1048     IFFI1049     IFFI1050
    IFFI1052     IFFI1059     IFFI1060     IFFI1062     IFFI1063
    IFFI1202     IFFI1203     IFFI1206     IFFI1209     IFFI1210
    IFFI1211     IFFI1212     IFFI1213     IFFI1214     IFFI1215
    IFFI1220     IFFI1221     IFFI1224     IFFI1247     IFFI1248
    IFFI1251     IFFI1270     IFFI1277     IFFI1287     IFFI1289
    IFFI1290     IFFI1291     IFFI1292     IFFI1293     IFFI1297
    IFFI1300     IFFI1301     IFFI1302     IFFI1307     IFFI1308
    IFFI1309     IFFI1310     IFFI1311     IFFI1331     IFFI1335
    IFFI1336     IFFI1337     IFFI1338     IFFI1339     IFFI1340
    IFFI1345     IFFI1348     IFFI1396     IFFI1397     IFFI1399
    IFFI1411     IFFI1413     IFFI1441     IFFI1443
汉逊酿酒酵母卵形变种(Hansen)Dekker(Saccharomyces cerevisiae Hansen Var.Ellipsoideus(Hansen)Deklker))
    ACCC2043     AS2.2     AS2.3     AS2.8   AS2.53
    AS2.163     AS2.168     AS2.483     AS2.541   AS2.559
    AS2.606     AS2.607     AS2.611     AS2.612
薛瓦季酵母(Saccharomyces chevalieri Guiliermond)
    AS2.131     AS2.213
德氏酵母菌(Saccharomyces delbrueckii)
 AS2.285
德尔布酵母Lindner ver.mongolicus(Saito)Lodder et van Rij(Saccharomyces delbrueckii Lindner ver.mongolicus(Saito)Lodder et vanRij)
 AS2.209  AS2.1157
少孢汉逊酵母(Saccharomyces exiguous Hansen)
 AS2.349  AS2.1158
发酵性酵母(Saito)Lodder et van Rij(Saccharomyces fermentati(Saito)Lodder et van Rij)
 AS2.286  AS2.343
洛格酵母van laer et Denamur ex Jorgensen(Saccharomyces logos van laer et Denamur ex Jorgensen)
 AS2.156  AS2.327  AS2.335
蜂蜜酵母(Fabian et Quinet)Lodder et kreger van Rij(Saccharomyces mellis(Fabian et Quinet)Lodder et kreger van Rij)
 AS2.195
小椭圆蜂蜜酵母Osterwalder(Saccharomyces mellis Microellipsoides Osterwalder)
 AS2.699
卵形酵母Osteralder(Saccharomyces oviformis Osteralder)
 AS2.100
罗斯酵母(Guilliermond)Lodder et Kreger van Rij(Saccharomyces rosei(Guilliermond)Lodder et Kreger van Rij)
 AS2.287
鲁酵母Boutroux(Saccharomyces rouxii Boutroux)
 AS2.178  AS2.180  AS2.370  AS2.371
清酒酵母Yabe(Saccharomyces sake Yabe)
 ACCC2045
木生念珠菌(Candida arborea)
 AS2.566
朗比可念珠菌(Lindner et Genoud)van.Uden et Buckley(Candida lambica(Lindner et Genoud)van.Uden et Buckley)
 AS2.1182
克鲁斯念珠菌(Castellani)Berkhout(Candida krusei(Castellani)Berkhout)
 AS2.1045
解脂念珠菌(Harrison)Diddens et Lodder(Candida lipolytica(Harrison)Diddens et Lodder)
 AS2.1207  AS2.1216  AS2.1220  AS2.1379  AS2.1398
 AS2.1399  AS2.1400
近平滑念珠菌(Ashford)Langeron et Talice Var.Intermedia Van Rij et Verona(Candida parapsilosis(Ashford)Langeron et Talice Var intermedia Van Rij etVerona)
 AS2.491
近平滑念珠菌(Ashford)Langeron et Talice(Candida parapsilosis(Ashford)Langeron et Talice)
 AS2.590
铁红念珠菌(Lindner)Windisch(Candida pulcherrima(Lindner)Windisch)
 AS2.492
皱落念珠菌(Anderson)Diddens et Lodder(Candida rugousa(Anderson)Diddens et Lodder)
 AS2.511  AS2.1367   AS2.1369   AS2.1372  AS2.1373
 AS2.1377  AS2.1378  AS2.1384
热带念珠菌(Castellani)Berkhout(Candida tropicalis(Castellani)Berkhout)
 ACCC2004  ACCC2005  ACCC2006  AS2.164  AS2.402
 AS2.564  AS2.565  AS2.567  AS2.568  AS2.617
 AS2.637  AS2.1387  AS2.1397
产朊念珠菌Henneberg Lodder et Kreger Van Rij(Candida utilis Henneberg Lodder et Kreger Van Rij)
 AS2.120  AS2.281  AS2.1180
Crebrothecium ashbyii(Guillermond)Routein(阿氏假囊酵母菌)(Crebrothecium ashbyii(Guillermond)Routein(Eremothecium ashbyiiGuilliermond))
 AS2.482  AS2.482  AS2.1197
白地霉(Geotrichum candidum Link)
 ACCC2016  AS2.361  AS2.498  AS2.616  AS2.1035
 AS2.1062  AS2.1080  AS2.1132  AS2.1175  AS2.1183
异常汉逊酵母(Hansen)H et P sydow(Hansenula anomala(Hansen)H et P sydow)
 ACCC2018  AS2.294  AS2.295  AS2.296  AS2.297
 AS2.298  AS2.299  AS2.300  AS2.302  AS2.338
 AS2.339  AS2.340  AS2.341  AS2.470  AS2.592
 AS2.641  AS2.642  AS2.782  AS2.635  AS2.794
产阿拉伯糖醇汉逊酵母Fang(Hansenula arabitolgens Fang)
 AS2.887
杰丁汉逊酵母(A.et R Sartory Weill et Meyer)Wickerhan(Hansenula jadinii(A.et R Sartory Weill et Meyer)Wickerhan)
 ACCC2019
土星汉逊酵母(K1ocker)H et P sydow(Hansenula saturnus(Klocker)H et P sydow)
 ACCC2020
 schneggii汉逊酵母(Weber)Dekker(Hansenula schneggii(Weber)Dekker)
 AS2.304
亚膜汉逊酵母Bedford(Hansenula subpelliculosa Bedford)
 AS2.740  AS2.760  AS2.761  AS2.770  AS2.783
 AS2.790  AS2.798  AS2.866
柠檬形克勒克酵母(Reess emend.Klocker)Janke(Kloeckera apiculata(Reess emend.Klocker)Janke)
 ACCC2022  ACCC2023  AS2.197  AS2.496  AS2.714
 ACCC2021  AS2.711
油脂酵母Lodder et van Rij(Lipomycess starkeyi Lodder et van Rij)
 AS2.1390  ACCC2024
粉状毕赤酵母(Lindner)Hansen(Pichia farinosa(Lindner)Hansen)
 ACCC2025  ACCC2026  AS2.86  AS2.87  AS2.705
 AS2.803
膜醭毕赤酵母Hansen(Pichia membranaefaciens Hansen)
 ACCC2027  AS2.89  AS2.661  AS2.1039
红冬孢酵母Banno(Rhodosporidium toruloides Banno)
 ACCC2028
红酵母(Fresenius)Harrison(Rhodosporidium glutinis(Fresenius)Harrison)
 AS2.2029  AS2.280  ACCC2030  AS2.102  AS2.107
 AS2.278  AS2.499  AS2.694  AS2.703  AS2.704
 AS2.1146
小红酵母(Saito)Harrison(Rhodotorula minuta(Saito)Harrison)
 AS2.277
深红酵母(Demme)Lodder(Rhodotorula rubar(Demme)Lodder)
 AS2.21  AS2.22  AS2.103  AS2.105  AS2.108
 AS2.140  AS2.166  AS2.167  AS2.272  AS2.279
 AS2.282  ACCC2031
橙黄红酵母(Saito)Lodder(Rhodotorula aurantiaca(Saito)Lodder)
 AS2.102  AS2.107  AS2.278  AS2.499  AS2.694
 AS2.703  AS2.704  AS2.1146
汉逊卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis Hansen)
 AS2.113  ACCC2032  ACCC2033  AS2.312  AS2.116
 AS2.118  AS2.121  AS2.132  AS2.162  AS2.189
 AS2.200  AS2.216  AS2.265  AS2.377  AS2.417
 AS2.420  AS2.440  AS2.441  AS2.443  AS2.444
 AS2.459  AS2.595  AS2.605  AS2.638  AS2.742
 AS2.745  AS2.748  AS2.1042
葡萄汁酵母Beijer(Saccharomyces uvarum Beijer)
 IFFI1023  IFFI1032  IFFI1036  IFFI1044  IFFI1072
 IFFI1205  IFFI1207
威尔酵母Saccardo(Saccharomyces willianus Saccardo)
 AS2.5  AS2.7  AS2.119  AS2.152  AS2.293
 AS2.381  AS2.392  AS2.434  AS2.614  AS2.1189
 sp.酵母(Saccharomyces sp.)
 AS2.311
路德类酵母Hansen(Saccharomyces ludwigii Hansen)
 ACCC2044  AS2.243  AS2.508
sinenses类酵母Yue(Saccharomyces sinenses Yue)
 AS2.1395
八孢裂殖酵母Beijerinck(Schizosaccharomyces octosporus Beijerinck)
 ACCC2046  AS2.1148
粟酒裂殖酵母Lindner(Schizosaccharomyces pombe Lindner)
 ACCC2047  ACCC2048  AS2.214  AS2.248  AS2.249
 AS2.255  AS2.257  AS2.259  AS2.260  AS2.274
 AS2.994  AS2.1043  AS2.1149  AS2.1178  IFFI1056
掷孢酵母Kluyver et van Niel(Sporobolomyces roseus Kluyver et van Niel)
 ACCC2049  ACCC2050  AS2.19  AS2.962  AS2.1036
 ACCC2051  AS2.261  AS2.262
白球拟酵母(Saito)Lodder(Torulopsis candidi(Saito)Lodder)
 AS2.270  ACCC2052
famta拟酵母(Harrison)Lodder et van Rij(Torulopsis famta(Harrison)Lodder et van Rij)
 ACCC2053  AS2.685
圆球拟酵母(Olson et Hammer)Lodder et van Rij(Torulopsis globosa(Olson et Hammer)Lodder et van Rij)
 ACCC2054  AS2.202
平常球拟酵母Lodder et Kreger van Rij(Torulopsis inconspicua Lodder et Kreger van Rij)
 AS2.75
贝雷丝孢酵母Lodder et Kreger van Rij(Lodder et Kreger van Rij)
 ACCC2056  AS2.1193
头状丝孢酵母Diddens et Lodder(Trichosporon capitatum Diddens et Lodder)
 ACCC2056  AS2.1385
丝孢酵母(de Beurm et al.)Ota(Trichosporon cutaneum(de Beurm et al.)Ota)
 ACCC2057  AS2.25  AS2.570  AS2.571  AS2.1374
威克酵母(Soneda)Soneda(Wickerhamia fluorescens(Soneda)Soneda)
 ACCC2058  AS2.1388
II.电磁场的施加
可以通过各种本领域已知的方法来产生和施加用于本发明的电磁场。例如可以通过施加交流电场或者振荡磁场来产生EMF。
可以通过电极与培养基的直接接触、或者通过电磁感应，将交流电场施加给细胞培养物。见例如图1。使用电极与培养基相接触的方法，可以在培养基中产生相对高的电场。必须注意防止在电极处的电解将非目的离子引入培养基，并且主意防止接触电阻、气泡或者电解的其它特性使电场水平下降到目的电场水平以下。电极应该与其环境相匹配，例如在氯离子富集的溶液中使用Ag-AgCl电极，而且电极应该在尽可能低的电压下运转。关于综述，见Goodman等的Effects of EMF on Molecules andCells，International Review of Cytology，A Survey of Cell Biology，Vol.158，Academic Press，1995。
也可以通过施加振荡磁场来产生本发明使用的EMF。可以用通过赫姆霍兹线圈的振荡电流来产生振荡磁场。此振荡磁场又会诱导出电场。
本发明使用的EMF的频率范围为大约18000MHz-18500MHz。示例性的频率包括18205，18211，18217，18223，和18227MHz。本发明使用的场强范围为大约100-450mV/cm(例如：100-150，210-260，300-340，或者380-420mV/cm)。示例性的场强是240，248，408，415，和315mV/cm。
当将一系列EMF施加到酵母培养物的时候，可以将酵母培养物保持在相同的容器中，使用一套相同的EMF发生器和发射器来改变频率和/或场强。系列中的每个EMF都可以具有不同的频率或者不同的场强；或者不同的频率和不同的场强。这些频率和场强优选处于上述的范围内。尽管可以在系列中使用任何有效数目的EMF，但是优选将酵母培养物暴露于总数为2，3，4，5，6，7，8，9或者10个EMF的系列中。
尽管在EMF存在的情况下，酵母细胞甚至可以在培养几个小时后被激活，但是优选的情况是，应该允许含有活化酵母细胞的组合物在EMF存在的情况下繁殖和生长总计40-100个小时。
图1描述了产生交流电场的示例性装置。可以通过AC源(3)产生所需频率和强度的电场，AC源(3)能够产生优选为正弦波形的、频率范围为5-20,000MHz的交流电场。也可以使用能够用较窄的频率范围产生信号的信号发生器。如果需要，可以使用信号放大器来增加输出。培养容器(2)可以由非导电性材料如玻璃、塑料或者陶瓷制成。连接培养容器(2)和信号发生器(3)的缆线，优选为高频率同轴电缆，其传输频率为至少30GHz。
可以通过多种方法将交流电场施加于所述的培养基，这些方法包括将酵母培养物(1)放置到与信号发射器(例如能够传送EMF的金属线或者管)非常接近的地方。所述的金属线或者管可以由红铜制造，而且可以被放置到容器(2)内直至3-30cm的深度。例如，如果容器(2)中的流体深度为15-20cm，20-30cm，30-50cm，50-70cm，70-100cm，100-150cm或者150-200cm，那么金属线距容器(2)底部的长度可以分别是3-5cm，5-7cm，7-10cm，10-15cm，15-20cm，20-30cm和25-30cm。所用金属线/管的数目可以是1-10个(例如：2-3)。尽管并不要求，但是建议对于10L体积的培养物，应该使用直径为0.5-2mm的金属线/管。对于体积为10-100L的培养物，可以使用直径为3-5mm的金属线/管。对于体积为100-1000L的培养物，可以使用直径为6-15mm的金属线/管。对于体积大于1000L的培养物，可以使用直径为20-25mm的金属线/管。
在一个实施方案中，通过浸入培养物(1)的电极来施加电场。在这个实施方案中，一个电极可以是放置在容器(2)底部的金属板，另一个电极可以含有均匀分布在培养物(1)中的多个电极线，这样可以实现电场能量的均匀分布。所用电极线的数量取决于培养物的体积以及金属线的直径。III.培养基
本发明使用的培养基含有能够被酵母细胞吸收的营养源。可以将复合含碳物质以适当的形式(例如蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、和木糖)作为酵母细胞的碳源。可以根据培养基的其它组分调节碳源的确切量。通常，含碳物质的量的范围为大约培养基重量的0.1％-10％，优选为大约0.1％-5％，最优选为大约2％。这些碳源可以单独或者组合使用。同样可以将含有氨基酸的物质以合适的形式(例如牛肉膏和蛋白胨)单独或者组合加入。通常含氨基酸物质的量的变化范围为大约培养基重量的0.1％-1％，优选为大约0.1％-0.5％。可以加入到培养基中的无机盐是能够产生钠、钾、钙、硫酸盐、硫酸盐、碳酸盐和类似离子的常规盐。营养无机盐的非限制性实例是(NH4)2HPO4，CaCO3，KH2PO4，K2HPO4，MgSO4，NaCl，和CaSO4。IV.酵母细胞的电磁激活
为了活化或者增强酵母细胞产生有益于肠胃系统的制剂的能力，将这些细胞在适当的介质中、在无菌条件下、在20℃-35℃(例如28℃-32℃)、在上述的交流电场或者一系列交流电场中培养足够长的时间(例如10-150小时)。
在图1中描述了进行培养的典型装置(见上)。典型的培养基含有每1000ml无菌水中的下列物质：20g的蔗糖，40μg的维生素B1，50μg的维生素B6，0.2g的KH2PO4，0.2g的MgSO4·7H2O，0.25g的NaCl，0.1g的CaSO4·2H2O，3.0g的CaCO3·5H2O，和2.5g的蛋白胨。随后将目的菌株加入到培养基中以形成含有1×108个细胞/1000ml培养基的混合物。酵母细胞可以是表1中列出的任何菌株。随后将该混合物加入到图1所示的装置中。
酵母细胞的活化过程涉及下列步骤：(1)将活化装置的温度保持在24-33℃(例如28-32℃)，并将酵母细胞培养30-42个小时(例如38小时)；(2)施加频率为大约18205MHz、场强为大约210-260mV/cm(例如239-241mV/cm)的交流电场13-20小时(例如15小时)；(3)随后施加频率为大约18211MHz、场强为大约220-260mV/cm(例如247-249mV/cm)的交流电场15-25小时(例如19小时)；(4)而后施加频率为大约18217MHz、场强为大约380-420mV/cm(例如大约406-410mV/cm)的交流电场20-30小时(例如25小时)；(5)随后施加频率为大约18223MHz、场强为大约380-420mV/cm(例如413-417mV/cm)的交流电场中培养9-12小时(例如10小时)；和(6)而后施加频率为18277MHz、场强为大约300-330mV/cm(例如313-317mV/cm)的交流电场9-12小时(例如10小时)。通过各种本领域已知的方法，从培养基中回收活化的酵母细胞，干燥(例如通过冻干)并且储存在4℃。优选地，干燥的酵母细胞的浓度不小于1010细胞/g。V.酵母细胞对胃环境的适应
由于本发明的酵母组合物在到达小肠以前必须通过胃，而有效组分是在小肠中从这些酵母细胞中释放出来，因此优选将这些酵母细胞在酸性条件下培养以使这些细胞适应胃液。这种适应过程能够使酵母在酸性胃环境中有更好的生存能力。
为了达到这一目的，可以将含有活化酵母细胞的酵母粉以10g(每克含有超过1010个活化的细胞)/1000ml与高酸性适应的培养基混和。而后对酵母混合物进行培养，首先在频率为大约18223MHz、场强为390-420mV/cm(例如403-407mV/cm)的交流电场存在的情况下、在大约28-32℃培养25-48小时(例如46小时)。将所得到的酵母细胞进一步在频率为大约18227MHz、场强为300-330mV/cm(例如大约315-319mV/cm)的交流电场存在的情况下、在大约28-32℃培养15-25小时(例如20小时)。随后将所得到的适应化酵母细胞干燥并以粉末形式(≥1010细胞/g)室温储存或者在0-4℃真空储存。
典型的适应化培养基是通过将700ml新鲜猪胃液和300ml野生中国山楂提取物混和制成的。用0.1M的盐酸(HCL)和0.2M的苯二酸氢钾(C6H4(COOK)COOH)将的pH调节到2.5。新鲜猪胃液的制备如下。将大约4月龄的新生荷兰白猪处死，回收它们胃中的全部内含物并将其与2000ml的水在无菌条件下混和。随后使该混合物在无菌条件下，在4℃静置6小时以沉淀食物残渣。收集上清液以用于适应化培养基。关于野生中国山楂提取物的制备，在无菌条件下干燥500g新鲜的野生中国山楂，以减少水份含量(≤8％)。随后研磨(≥20目)此干果并将其加入1500ml的无菌水。将混合物在无菌条件下、在4℃静置6小时。收集山楂上清液以在适应化培养基中使用。VI.酵母混合物的制备
为了制备本发明的酵母混合物，可以使用图2中描述的装置或其等效装置。此装置包括第一容器(1)、第二容器(2)、和第三容器(3)，每个容器装备有一对电极(4)。所述电极中的一个是放置于容器底部上的金属板，另一个电极包含多个均匀分布在容器空间内的电极线，以实现电场能量的均匀分布。所有三对电极都被连接到一个普通的信号发生器。
用于此目的的培养基是一种混合的水果提取物溶液，每1000L该溶液含有下述组分：300L的野生中国山楂提取物、300L枣提取物、300L五味子(Schisandra chinensis(Turez)Bail seeds)提取物、和100L的大豆提取物。关于山楂、枣、五味子提取物的制备，清洗新鲜的水果并在无菌条件下干燥以将水含量减少到不超过8％。而后研磨(≥20目)100千克的干果并将其加入到400L的无菌水中。将混合物在无菌条件下、在室温搅动12小时，随后以1000rpm离心以去除不溶的残余物。关于大豆提取物的制备，清洗新鲜的大豆并将其在无菌条件下干燥以将含水量减少到不超过8％。随后将30千克的大豆研磨成不小于20目的颗粒，加入130L无菌水。将混合物在无菌条件下、在室温搅动12小时，随后以1000rpm离心以去除不溶的残余物。为了制造培养基，将这些提取物根据上面的配方混和，将溶液在121℃下热压消毒30分钟，并在使用前冷却到40℃以下。
将如上(上面的V部分)制备的1000g活化的酵母粉加入到1000L混合的水果提取物溶液中，将酵母溶液转移到图2中所示的第一容器(I)中。随后，在频率为大约18223MHz、场强为390-420mV/cm(例如403-407mV/cm)的交流电场存在的情况下、在大约28-32℃的无菌条件下培养16小时。将酵母细胞进一步在频率为大约18227MHz、场强为320-350mV/cm(例如333-337mV/cm)的交流电场存在的情况下培养。将培养继续进行另12个小时。
随后将酵母培养物从第一容器(1)转移到含有1000L培养基的第二容器(2)(如果需要，可以在现在可以使用的第一容器(1)中开始新的一批酵母培养物培养)中，随后将其处于频率为大约18223MHz、场强为200-220mV/cm(例如206-210mV/cm)的交流电场中10小时。然后将电场的频率和场强分别改变为大约18227MHz和210-230mV/cm(例如213-217mV/cm)。将培养继续进行另10个小时。
而后将酵母培养物从第二容器(2)转移到含有1000L培养基的第三容器(3)中，并将其处于频率为大约18223MHz、场强为90-110mV/cm(例如104-108mV/cm)的交流电场中12小时。然后将电场的频率和场强分别改变为大约18227MHz和100-120mV/cm(例如103-107mV/cm)。将培养继续进行另8个小时。
将来自第三容器(3)的酵母培养物包装到真空密封的瓶中以用作膳食补充剂如健康饮料。如果需要，还可以将成品酵母培养物在24小时内干燥并以粉末形式储存。该膳食补充剂可以每次30-60ml、每天3-4次地摄取3个月，优选在餐前和就寝前10-30分钟摄取。
在一些实施方案中，还可以以无菌可注射制剂的形式通过静脉或者腹膜给予本发明的组合物。这样的无菌制剂制备如下。将灭菌的健康饮料组合物首先在超声波(1000Hz)下处理10分钟，随后在4355rpm离心另10分钟。使用1MNaOH将所得到上清液的pH调节到7.2-7.4，并随后在无菌条件下通过膜(对于静脉注射0.22μm，对于腹膜内注射0.45μm)进行过滤。在使用前，将所得到的无菌制剂浸入35-38℃的水浴中30分钟。
本发明的酵母组合物衍生于食品和制药工业中使用的酵母。因此这些酵母组合物没有与许多制药化合物相关的副作用。
实施例
以下实施例的目的是为了描述本发明的材料和方法。对于本领域的技术人员来说显而易见的所述条件与参数的合适变体和适应性变化，都处于本发明的精神和范围内。
使用汉逊酿酒酵母AS2.560，在交流电场存在的情况下培养，按照如上所述的方法制备以下实验中所使用的活化酵母组合物，所述的交流电场具有被列在以上IV部分中的建议使用范围之后的括号中所例举的电场频率和场强。除了在没有EMF的情况下进行培养，以如VI部分中所述的相同方法制备对照酵母组合物。除非作出相反的限定，所有的酵母组合物和相应的对照组合物均通过胃内给食给予所述的动物。实施例1：血清谷氨酸丙酮酸转氨酶活性
谷氨酸丙酮酸转氨酶(GPT)通常在肝细胞中表达。当肝脏组织经历坏死或者其它损害时，GPT被释放到血液中从而升高了血清GPT水平。因此，血清GPT水平是肝脏功能的重要指示器。
在此研究中，将32只Wistar大鼠(170-200g，8-10月龄)分为4组，每组4只雌性鼠和4只雄性鼠。组A中的大鼠每天给予3ml的活化酵母组合物，给予8天。在第一和第五天，还给这些大鼠注射5mg四氯化碳/1000g体重。以相同的方法处理组B和组C中的大鼠，只是分别使用对照酵母组合物和盐水代替活化酵母组合物给予这些大鼠。以与组C相同的方法处理组D中的大鼠，但是不给予四氯化碳。在第8天，处死大鼠，抽取血样用于测定血清GPT水平。
为了实现这一目的，将来自每只动物的0.1ml血清与0.5ml谷氨酸丙酮酸底物溶液(1M)混和并在37℃的水浴中温育30分钟。而后加入0.5ml的2，4-二硝基苯肼并继续温育20分钟。最后加入5ml0.4M的NaOH。以相同的方法制备对照反应物，但是血清是在温育步骤之后30分钟、而不是之前30分钟被立即加入。将对照反应物用于校准，在520nm处测定样品的光密度。通过使用标准曲线来测定GPT浓度。数据显示在下表2中。
表2
组 动物数量     血清GTP
 A  8  61.3±18.64
 B  8  279.6±132.38
 C  8  288.5±126.83
 D  8  101.6±32.07
这些数据证实：活化的酵母组合物明显地将四氯化碳处理大鼠的血清GPT恢复到正常水平。实施例2：血清碱性磷酸酶活性
血清碱性磷酸酶(AP)主要由肝脏产生。AP的血清水平是肝脏健康的指示器，其水平的升高提示肝脏不健康。
在此研究中，将32只雄性斯普拉格-道立大鼠(Sprague-Dawley rats)(120-150g)分成4组。每天给予组A中的大鼠3ml活化酵母组合物，给予13天。在此时间段内，每3天给这些动物注射2mg含有15％四氯化碳的液体石蜡/1000g体重(共计四次)。以相同的方法处理组B和组C中的大鼠，只是分别使用对照酵母组合物和盐水代替活化酵母组合物给予这些大鼠。以与组C相同的方法处理组D中的大鼠，但是不给予石蜡。
在第13天，在最后的四氯化碳注射之后，使动物禁食16小时。处死这些动物，测定它们的血清GPT和AP水平。GPT水平如上测定。对于AP水平的测定，将0.1ml来自动物的血清与4ml AP底物溶液混和并在37℃的水浴中温育7分钟。随后加入1ml 0.6％的4-AAP(丙氨酸氨肽酶)和1ml 4.8％的K3Fe(CN)6。除了使用PHEN标准溶液代替血清，以相同的方法制备标准。空白对照不加入血清或者PHEN溶液。
使用空白对照来校准分光光度计，在500nm处测量样品的光密度。碱性磷酸酶(AP)活性被计算为：[(测试样品的OD)/(标准的OD)]×10。实验数据显示在下面的表3中。
表3
组 动物数量 血清GPT(单位/毫升血清) AP(单位/100毫升血清) 肝脏重量(g/100g体重)
 A     8  42.2±19.4  33.6±5.2  3.81±0.21
 B     8  162.9±78.3  55.9±7.2  5.07±0.19
 C     8  167.4±89.5  57.4±5.5  5.19±0.25
 D     8  27.3±7.3  42.2±12.0  3.72±0.30
这些结果表明：与对照组合物不同，本发明的活化酵母组合物将被注射了肝脏损伤制剂的大鼠的GPT和AP的血清水平正常化。实施例3：乳酸脱氢酶5的活性
乳酸脱氢酶5(LDH-5)水平的升高往往伴随着由乙肝病毒引起的肝炎。在此实验中，评价了所述的活化酵母组合物在小鼠模型中对肝炎治疗的效力。
使用制备自杂种小鼠的肝脏提取物来免疫纯种小鼠以诱导慢性肝炎。具体地说，将来自杂种小鼠的肝脏切碎并在低温离心机中以10,000g的转速离心30分钟。收集上清液并将其与弗氏完全佐剂(Freund′s completeadjuvant)混和，以形成用于注射到新断奶的雄性C57BL小鼠中的乳剂。
将40只新断奶的C57BL小鼠分成4个相等的组。每天给予组A中的每只小鼠1ml活化酵母组合物，给予9周。在最开始的5周，每周两次地给每只这些小鼠注射0.1ml地肝脏提取物乳剂。在剩下的4周里，一周一次地给予注射。以相同的方法处理组B和组C中的大鼠，只是分别使用对照酵母组合物和盐水代替活化酵母组合物给予这些大鼠。以与组C相同的方法处理组D中的大鼠，但是不给予肝脏乳剂。
在治疗最后一天的24小时以后，处死动物并收集动物的血清。使用醋酸纤维素电泳从血清中分离出LDH-5。通过PEG(聚乙二醇)沉淀法测定CICs(循环中免疫复合物)。结果见下表4。
表4
    组     动物数量   LDH-5(μg/L)     CLCOD
    A     10     61±5.21   0.025±0.003
    B     10     94±7.31   0.059±0.007
    C     10     93±6.41   0.061±0.007
    D     10     58±2.47   0.023±0.002
这些数据证实：与对照相比，活化的酵母组合物显著地降低了被诱发肝炎的小鼠的血清LDH-5和CLC水平。
虽然已经对本发明的一些实施方案进行了阐述，但是很明显，可以对这些基本构想进行改变，以提供利用本发明组合物和方法的其它实施方案。

Claims (9)

1、一种含有多种酵母细胞的组合物，其中所述的多种酵母细胞的特征在于：与未经如下交流电场培养过酵母细胞相比，作为它们曾经被在频率范围是18180-18240MHz、场强范围是100-450mV/cm的交流电场存在的情况下培养过的结果，其能够使哺乳动物中血清谷氨酸丙酮酸转氨酶(GPT)，碱性磷酸酶(AP)，或者乳酸脱氢酶5(LDH-5)的水平正常化。
2、权利要求1的组合物，其中所述的频率范围是18205-18227MHz。
3、权利要求1的组合物，其中所述的场强范围是210-420mV/cm。
4、权利要求1的组合物，其中所述的酵母细胞选自：酿酒酵母，卡尔酵母，薛瓦酵母，德尔布酵母，少孢酵母，发酵性酵母，洛格酵母，蜂蜜酵母，卵形酵母，罗斯酵母，鲁酵母，清酒酵母，葡萄汁酵母，威尔酵母，黄酒酵母，八孢裂殖酵母，粟酒裂殖酵母，掷孢酵母，白球拟酵母，famta拟酵母，圆球拟酵母，平常球拟酵母，贝雷丝孢酵母，头状丝孢酵母，丝孢酵母，维克酵母，木生念珠菌，克鲁斯念珠菌，朗比克念珠菌，解脂念珠菌，近平滑念珠菌，铁红念珠菌，皱落念珠菌，热带念珠菌，产朊念珠菌，Crebrothecium ashbyii，白地霉，异常汉逊酵母，产阿拉伯糖醇汉逊酵母，杰丁汉逊酵母，土星汉逊酵母，schneggii汉逊酵母，亚膜汉逊酵母，柠檬形克勒克酵母，油脂酵母，粉状毕赤酵母，膜醭毕赤酵母，红冬孢酵母，红酵母，小红酵母，深红酵母，橙黄红酵母，路德类酵母，和墨类酵母。
5、权利要求1的组合物，其中所述的酵母细胞是保藏在中国普通微生物菌种保藏中心的菌株，其保藏号选自汉逊酿酒酵母AS2.375，AS2.501，AS2.502，AS2.503，AS2.504，AS2.535，AS2.558，AS2.560，AS2.561，AS2.562和IFFI1048，以及汉逊卡尔酵母AS2.420和AS2.444的细胞。
6、权利要求1的组合物，其中所述组合物的形式是片剂、粉剂或者健康饮料的形式。
7、权利要求1的组合物，其中所述组合物的形式是健康饮料的形式。
8、一种治疗受试者肝炎的方法，其包括经口服给予所述的受试者权利要求1的组合物。
9、一种酵母组合物的制备方法，其包括在交流电场存在的情况下将多种酵母细胞培养一段时间，所述交流电场的频率范围是18180-18240MHz、场强范围是100-450mV/cm，其中所述一段时间足以充分地提高所述多种酵母细胞使具有肝脏问题的哺乳动物的血清GPT、AP、或者LDH-5水平正常化的能力。
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