CN103976351B - 一种增强免疫力改善睡眠的保健食品及其二步发酵制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种增强免疫力改善睡眠的保健食品及其二步发酵制备方法，该方法包括：蜜环菌固体发酵：以含有增强免疫力功能的天然组分为药性培养基质，接种蜜环菌液体菌种进行双向固体发酵制备具有增强免疫力功能的药性菌质；乳酸菌液体深层发酵：以药性菌质为原料，粉碎后添加酵母粉、谷氨酸钠、水制成发酵培养基，接种乳酸菌进行液体深层发酵生产改善睡眠的γ-氨基丁酸，制备同时具有增强免疫力和改善睡眠功能的发酵液；采用发酵液，制备成不同剂型的增强免疫力改善睡眠的保健食品。本发明制备的保健食品同时具有增强免疫力和改善睡眠功能，该制备方法稳定，适合大规模生产，市场前景广阔。

Description

一种增强免疫力改善睡眠的保健食品及其二步发酵制备方法

技术领域

本发明涉及生物保健食品及其制备领域，具体涉及一种增强免疫力改善睡眠的生物保健食品及采用蜜环菌、乳酸菌固液二步发酵制备该保健食品的方法。

背景技术

据世界卫生组织一项全球性调查表明，全球真正健康的人仅占5%，诊断有病的人也只占20%，75%的人处于亚健康状态，特别是白领和老年人中，亚健康所占比例更高。免疫力低下、睡眠障碍是亚健康最重要的表现形式，严重降低人们的生活质量，因此增强免疫力和改善睡眠的保健食品有巨大的市场前景。

蜜环菌是一种食药兼用真菌，研究表明它可显著提高机体免疫功能，同时具有较强的神经调节功能和明显的催眠镇静、抗惊厥作用。但受自然条件的影响，野生蜜环菌资源有限，大大限制了蜜环菌健康功效的发挥。研究证实蜜环菌发酵菌丝体和发酵液均具有与天然蜜环菌相似的药理作用和临床效果，目前利用固体发酵、液体发酵生产蜜环菌活性成分已获得成功。但是，并无利用蜜环菌和具有一定功效的药性基质双向固体发酵以强化二者功效的报道。

庄毅等首次提出双向发酵的概念，指出食药用真菌与含有活性成分的中药材进行发酵具有双向性，能产生1+1>2的生理效果，如专利201110271923.7《一种具有降血糖功效的真菌药性菌质及其制备方法》选用具有降血糖功效的药性基质和真菌菌种作为双向发酵获得具有明显的降低血糖又不增加胰岛素浓度的作用的药性菌质，专利200910058889.8《含有灵芝的发酵菌质混合物、制备方法及其应用》以灵芝和含有丹参的药性基质进行双向发酵，得到兼具丹参药材和灵芝真菌功效的菌质发酵终产物。因此，选用蜜环菌和具有增强免疫力功能的药性基质进行固体发酵，通过药性基质对蜜环菌菌丝体生长代谢过程的影响和蜜环菌真菌酶系对药性基质改造在内的双向性固体发酵后，得到兼具药性基质和蜜环菌增强免疫力功能的药性菌质，可作为保健食品原料，对免疫力低下者能够产生1+1>2的效果。

γ-氨基丁酸是一种重要的抑制性神经递质，现代医学研究证明γ-氨基丁酸具有快速改善睡眠的功效，卫生部2009年第12号公告批准乳酸菌发酵法制备的γ-氨基丁酸为新资源食品。从传统发酵食品中筛选的乳酸菌安全性高，可用于γ-氨基丁酸的生产，如专利200780006225.6《能够生产γ-氨基丁酸的乳酸菌》从未精制的酱油中分离到能够生产GABA的乳酸菌凝乳酶乳酸杆菌，专利200910183478.1《一株高效转化L-谷氨酸为γ-氨基丁酸乳酸菌的选育》从自制酸菜中筛选出一株能利用L-谷氨酸生产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌。但是乳酸菌只能利用单糖、二糖等小分子碳源，不能直接利用含淀粉以及纤维质的天然基质，而真菌具有降解淀粉和纤维质的酶系，可将淀粉质、纤维质分解为可供乳酸菌利用的小分子碳源，将真菌发酵与乳酸菌发酵相耦合进行分步发酵可解决这一问题。

发明内容

针对目前并无蜜环菌和γ-氨基丁酸复方产品，本发明提供了一种以功能强化的蜜环菌药性菌质和γ-氨基丁酸配方，同时具有增强免疫力和改善睡眠功能的保健食品，同时提供了该保健食品利用蜜环菌、乳酸菌二步发酵的制备方法。

一种增强免疫力改善睡眠的保健食品的二步发酵制备方法，包括如下步骤：

（1）蜜环菌固体发酵：以含有增强免疫力功能的天然组分为药性培养基质，接种蜜环菌液体菌种进行双向固体发酵制备具有增强免疫力功能的药性菌质；

（2）乳酸菌液体深层发酵：以步骤（1）的药性菌质为原料，粉碎后添加酵母粉、谷氨酸钠、水制成发酵培养基，接种乳酸菌进行液体深层发酵生产改善睡眠的γ-氨基丁酸，制备同时具有增强免疫力和改善睡眠功能的发酵液；

（3）采用步骤（2）的发酵液，制备成不同剂型的增强免疫力改善睡眠的保健食品。

本发明第一步以含有增强免疫力功能的天然组分作为药性培养基质，接种蜜环菌进行双向固体发酵，通过药性培养基质对蜜环菌菌丝体生长代谢过程的影响和蜜环菌真菌酶系对药性培养基质改造在内的双向性固体发酵后，得到兼具药性基质和蜜环菌增强免疫力功能的药性菌质；第二步以蜜环菌降解后含有小分子碳源等营养物质的药性菌质为原料，添加酵母粉以及谷氨酸钠制作液体培养基，接种可产生γ-氨基丁酸的乳酸菌进行发酵，制备具有增强免疫力和改善睡眠功能的发酵液；最后，发酵液经过过滤、浓缩、喷雾干燥、造粒、装囊、压片等工艺制备成保健食品。

步骤（1）中，所述的蜜环菌可采用现有技术，蜜环菌液体菌种采用现有的常规工艺制得，蜜环菌为蜜环菌ACCC50063，即中国农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）保藏的菌种。

步骤（1）中，所述的蜜环菌液体菌种的接种量为2%-10%，即所述的蜜环菌液体菌种的加入的体积量（mL）为药性培养基质的质量（g）的2%-10%（mL/g），以100g药性培养基质为基准，加入2-10mL的蜜环菌液体菌种。

步骤（1）中，所述的药性培养基质的制备：先称取以下重量百分含量的原料：全粒大麦70%-80%、大豆10%-20%、黄芪2%-3%、红景天1%-2%、党参1%-2%、百合1%-2%、天麻1%-2%、石膏粉0.5%-1.5%，将各组分混合、粉碎，然后加水至水分含量为60%-65%，116℃-126℃灭菌0.5h-1.5h。优选的，所述的药性培养基质的制备：先称取以下重量百分含量的原料：全粒大麦75%、大豆13%、黄芪3%、红景天2%、党参2%、百合2%、天麻2%、石膏粉1%；将各组分混合、粉碎，然后加水至水分含量为60%-65%，121℃灭菌1h。

步骤（1）中，所述的双向固体发酵的条件为：发酵温度在25-28℃，发酵时间在25-30天，以该蜜环菌固体发酵为宜。

步骤（2）中，所述的乳酸菌为植物乳酸菌，优选的为从四川泡菜中筛选的植物乳杆菌LW106（保藏编号为：CGMCCNO.5655），即采用中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC保藏的菌种，植物乳酸菌液体菌种采用MRS培养基28℃静置培养48h获得。

步骤（2）中，所述的发酵培养基采用以下重量份的原料：水1000重量份、药性菌质40-50重量份、酵母粉5-10重量份、谷氨酸钠15-20重量份，将药性菌质、酵母粉和谷氨酸钠溶于水，添加醋酸和醋酸钠配制成pH为5-6的缓冲液，116℃-126℃灭菌20min-40min。作为优选，所述的发酵培养基采用以下重量份的原料：水1000重量份、药性菌质50重量份、酵母粉7.5重量份、谷氨酸钠20重量份，将药性菌质、酵母粉和谷氨酸钠溶于水，添加醋酸和醋酸钠配制成pH为5.5的缓冲液，121℃灭菌30min。

步骤（2）中，所述的乳酸菌的接种量为1%-5%，即所述的乳酸菌的加入的体积量为发酵培养基体积的1%-5%。

步骤（2）中，所述的液体深层发酵的条件为：发酵温度在28-32℃，发酵时间在48-72h，以该发酵条件为宜。

步骤（2）中，所述的发酵液中γ-氨基丁酸的含量为9-12g/L。

步骤（3）中，所述的发酵液，通过过滤、浓缩、喷雾干燥、制粒、装囊、压片等工艺制备成不同剂型的保健食品。

所述的增强免疫力改善睡眠的保健食品的剂型为口服剂型，优选为片剂或胶囊，发酵液经过滤、浓缩、喷雾干燥、制粒、压片后得到片剂，发酵液经过滤、浓缩、喷雾干燥、制粒、装囊后得到胶囊。具体地，发酵液首先经过过滤、浓缩、喷雾干燥成粉末，粉末过筛后经沸腾制粒得干燥颗粒，颗粒用颗粒整粒机以20目筛进行整粒，整粒所得颗粒加入相对于整粒所得颗粒的重量0.5%崩解剂羧甲淀粉钠和相对于整粒所得颗粒的重量0.1%润滑剂硬脂酸镁在多维运动混合机中充分混匀5分钟灌胶囊或压成片剂，每粒胶囊/片剂0.35g。

通过上述二步发酵制备方法制备的增强免疫力改善睡眠的保健食品，具有同时增强免疫力和改善睡眠的保健功能。

蜜环菌与增强免疫力的药性培养基质双向发酵可制备增强免疫力效果显著的药性菌质，而药性培养基质通过蜜环菌的降解作用，可为乳酸菌发酵产γ-氨基丁酸提供营养和碳源，同时通过乳酸菌的降解和转化，药性菌质更易吸收和利用。因此采用蜜环菌和乳酸菌二步发酵可制备可同时增强免疫力和改善睡眠的保健食品。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

（1）本发明根据蜜环菌具有增强免疫力和改善睡眠功能，γ-氨基丁酸具有快速改善睡眠功能，二者配伍具有显著增强免疫力和改善睡眠的功能，提供了一种以功能强化的蜜环菌药性菌质和γ-氨基丁酸配伍的可同时增强免疫力和改善睡眠的保健食品及其制备方法，该方法采用二步发酵法将食用菌发酵与乳酸菌发酵有机结合，其中第一步利用蜜环菌和具备增强免疫力功能药性培养基质的双向固体发酵制备兼具蜜环菌和药性基质增强免疫力功能的药性菌质，该过程不仅能产生1+1＞2的生理功效，还可将药性培养基质中的大分子碳源降解为乳酸菌易于利用的小分子碳源，为第二步乳酸菌液体深层发酵产生改善睡眠的γ-氨基丁酸提供必要的营养和碳源，同时通过乳酸菌的降解和转化药性菌质也更易吸收、利用。

（2）本发明制备的保健食品经实验证明具有增强免疫力和改善睡眠化功能。

（3）本发明采用的制备方法，不仅原料成本低，整个生产过程都采用低温发酵，条件温和，没有毒害物质的摄入，产品安全性、附加值高，可实现规模化生产，市场前景广阔。

（4）本发明制备的保健食品采用片剂、胶囊剂型，方便携带及服用。

附图说明

图1为本发明增强免疫力改善睡眠的保健食品的二步发酵制备方法的流程图。以下没有特别说明的情况下，百分数均是指重量百分数。

具体实施方式

以下按照图1工艺流程对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1

1、蜜环菌固体发酵：

①药性培养基质的制作

配方：全粒大麦80%、大豆13.5%、黄芪2%、红景天1%、党参1%、百合1%、天麻1%、石膏粉0.5%；

配制方法：按配方比例将各组分混合、粉碎，加水至水分含量为65%；121℃灭菌1h，得到药性培养基质；

②接种发酵

将蜜环菌ACCC50063的液体菌种（常规工艺制备）按3%体积质量比接种到①中药性培养基质，即蜜环菌ACCC50063液体菌种的加入的体积量（mL）为药性培养基质的质量（g）的3%（mL/g），25℃培养30天制备具有增强免疫力功能的药性菌质；

2、乳酸菌液体深层发酵：

①发酵培养基制作

配方：药性菌质40g、酵母粉5g，谷氨酸钠15g，自来水1L（即1000g）；

配制方法：按配方比例将药性菌质、酵母粉、谷氨酸钠溶于水，添加醋酸和醋酸钠配制成pH为5.5的缓冲液，121℃灭菌30min，得到发酵培养基；

②接种发酵

将从四川泡菜中筛选的植物乳杆菌LW106（保藏编号为：CGMCCNO.5655）液体菌种（MRS培养基28℃静置培养48h）按1%比例接种到①中发酵培养基，即植物乳杆菌的加入的体积量为发酵培养基体积的1%，28℃静置培养72h制备具有增强免疫力和改善睡眠功能的发酵液；

3、第2步制备的发酵液首先经过过滤、浓缩、喷雾干燥成粉末，粉末过筛后经沸腾制粒得干燥颗粒，颗粒用颗粒整粒机以20目筛进行整粒，整粒所得颗粒加入相对于整粒所得颗粒重量的0.5%崩解剂羧甲淀粉钠和相对于整粒所得颗粒重量的0.1%润滑剂硬脂酸镁在多维运动混合机中充分混匀5分钟压成片剂，每片0.35g。

实施例2

1、蜜环菌固体发酵：

①药性培养基质的制作

配方：全粒大麦80%、大豆13.5%、黄芪2%、红景天1%、党参1%、百合1%、天麻1%、石膏粉0.5%；

配制方法：按配方比例将各组分混合、粉碎，加水至水分含量为60%；121℃灭菌1h，得到药性培养基质；

②接种发酵

将蜜环菌ACCC50063的液体菌种（常规工艺制备）按3%体积质量比接种到①中药性培养基质，即蜜环菌ACCC50063液体菌种的加入的体积量（mL）为药性培养基质的质量（g）的3%（mL/g），25℃培养30天制备具有增强免疫力功能的药性菌质；

2、乳酸菌液体深层发酵：

①发酵培养基制作

配方：药性菌质40g、酵母粉5g，谷氨酸钠15g，自来水1L（即1000g）；

配制方法：按配方比例将药性菌质、酵母粉、谷氨酸钠溶于水，添加醋酸和醋酸钠配制成pH为5.5的缓冲液，121℃灭菌30min，得到发酵培养基；

②接种发酵

将从四川泡菜中筛选的植物乳杆菌LW106（保藏编号为：CGMCCNO.5655）液体菌种（MRS培养基28℃静置培养48h）按1%比例接种到①中发酵培养基，即植物乳杆菌的加入的体积量为发酵培养基体积的1%，28℃静置培养72h制备具有增强免疫力和改善睡眠功能的发酵液；

3、第2步制备的发酵液首先经过过滤、浓缩、喷雾干燥成粉末，粉末过筛后经沸腾制粒得干燥颗粒，颗粒用颗粒整粒机以20目筛进行整粒，整粒所得颗粒加入相对于整粒所得颗粒重量的0.5%崩解剂羧甲淀粉钠和相对于整粒所得颗粒重量的0.1%润滑剂硬脂酸镁在多维运动混合机中充分混匀5分钟装成胶囊，每粒0.35g。

实施例3

1、蜜环菌固体发酵：

①药性培养基质的制作

配方：全粒大麦75%、大豆13%、黄芪3%、红景天2%、党参2%、百合2%、天麻2%、石膏粉1%；

配制方法：按配方比例将各组分混合、粉碎，加水至水分含量为63%；121℃灭菌1h，得到药性培养基质；

②接种发酵

将蜜环菌ACCC50063的液体菌种（常规工艺制备）按5%体积质量比接种到①中药性培养基质，即蜜环菌ACCC50063液体菌种的加入的体积量（mL）为药性培养基质的质量（g）的5%（mL/g），28℃培养25天制备具有增强免疫力功能的药性菌质；

2、乳酸菌液体深层发酵：

①发酵培养基制作

配方：药性菌质50g、酵母粉7.5g，谷氨酸钠20g，自来水1L（即1000g）；

配制方法：按配方比例将药性菌质、酵母粉、谷氨酸钠溶于水，添加醋酸和醋酸钠配制成pH为5.5的缓冲液，121℃灭菌30min，得到发酵培养基；

②接种发酵

将从四川泡菜中筛选的植物乳杆菌LW106（保藏编号为：CGMCCNO.5655）液体菌种（MRS培养基28℃静置培养48h）按1%比例接种到①中发酵培养基，即植物乳杆菌的加入的体积量为发酵培养基体积的1%，32℃静置培养48h制备具有增强免疫力和改善睡眠功能的发酵液；

3、第2步制备的发酵液首先经过过滤、浓缩、喷雾干燥成粉末，粉末过筛后经沸腾制粒得干燥颗粒，颗粒用颗粒整粒机以20目筛进行整粒，整粒所得颗粒加入相对于整粒所得颗粒重量的0.5%崩解剂羧甲淀粉钠和相对于整粒所得颗粒重量的0.1%润滑剂硬脂酸镁在多维运动混合机中充分混匀5分钟压成片剂，每片0.35g。

实施例4

1、蜜环菌固体发酵：

①药性培养基质的制作

配方：全粒大麦75%、大豆13%、黄芪3%、红景天2%、党参2%、百合2%、天麻2%、石膏粉1%；

配制方法：按配方比例将各组分混合、粉碎，加水至水分含量为62%；121℃灭菌1h，得到药性培养基质；

②接种发酵

将蜜环菌ACCC50063的液体菌种（常规工艺制备）按5%体积质量比接种到①中药性培养基质，即蜜环菌ACCC50063液体菌种的加入的体积量（mL）为药性培养基质的质量（g）的5%（mL/g），28℃培养25天制备具有增强免疫力功能的药性菌质；

2、乳酸菌液体深层发酵：

①发酵培养基制作

配方：药性菌质50g、酵母粉7.5g，谷氨酸钠20g，自来水1L（即1000g）；

配制方法：按配方比例将药性菌质、酵母粉、谷氨酸钠溶于水，添加醋酸和醋酸钠配制成pH为5.5的缓冲液，121℃灭菌30min，得到发酵培养基；

②接种发酵

将从四川泡菜中筛选的植物乳杆菌LW106（保藏编号为：CGMCCNO.5655）液体菌种（MRS培养基28℃静置培养48h）按1%比例接种到①中发酵培养基，即植物乳杆菌的加入的体积量为发酵培养基体积的1%，32℃静置培养48h制备具有增强免疫力和改善睡眠功能的发酵液；

3、第2步制备的发酵液首先经过过滤、浓缩、喷雾干燥成粉末，粉末过筛后经沸腾制粒得干燥颗粒，颗粒用颗粒整粒机以20目筛进行整粒，整粒所得颗粒加入相对于整粒所得颗粒重量的0.5%崩解剂羧甲淀粉钠和相对于整粒所得颗粒重量的0.1%润滑剂硬脂酸镁在多维运动混合机中充分混匀5分钟装成胶囊，每粒0.35g。

试验例1

毒理试验：

试验目的：检验产品是否具有毒性

试验材料：实施例4制得的胶囊。

样品：人体口服推荐摄入量为每日两次，每次两粒，每粒0.35g/粒（体重按60kg计），0.03g/kg·bw，取胶囊内容物进行试验。

实验动物：清洁级ICR小鼠、SD大鼠及饲料。

饲养条件：温度20-25℃、相对湿度40%-70%的屏障系统。

试验方法：

小鼠急性经口毒性试验：取实施例4制得的胶囊内容物，用无菌水配制成0.500g/mL，按最大灌胃量20mL/kg·bw一日内二次性灌胃给养，受试物给予剂量为20.0g/kg·bw。

Ames试验：取实施例4制得的胶囊内容物，用无菌水配制成0.500g/mL，为5000ug/皿的剂量，试验设5个剂量，1000、200、40、8ug/皿4个剂量用无菌水按一定倍比逐级稀释配制成10、2、0.4、0.08mg/mL，加样量均为0.1mL/皿，加入0.1mL/皿，同时设阳性、阴性及溶剂对照，计数每皿回变菌落数。

小鼠骨髓细胞微核试验：以40mg/kg·bw剂量的环磷酰胺为阳性对照，无菌水为阴性对照，试验组3个剂量分别为10.0g/kg·bw、5.0g/kg·bw、2.5g/kg·bw，取实施例4制得的胶囊内容物用无菌水配制成0.5、0.25、0.125g/mL，以20mL/kg·bw灌胃2次，采用30h给受试物法，两次给样间隔24h，第二次给样6h后处死动物，取胸骨常规制片、镜检、每鼠计数1000个骨髓嗜多染红细胞，观察含微核的嗜多染红细胞并观察微核发生率。

小鼠精子畸形试验：以40mg/kg·bw剂量的环磷酰胺为阳性对照，无菌水为阴性对照，试验组3个剂量分别为10.0g/kg·bw、5.0g/kg·bw、2.5g/kg·bw，取实施例4制得的胶囊内容物用无菌水配制成0.5、0.25、0.125g/mL，以20mL/kg·bw灌胃，每天1次，连续5d。于首次给样后的第35天处死动物，取两侧附睾精子滤液按常规制片、镜检，每鼠计数1000个完整的精子，计算精子畸形发生率。

30天喂养试验：实施例4制得的胶囊人体推荐量1.4g/人/天，按人体推荐量的30、65、100倍设0.70g/kg·bw/d、1.52g/kg·bw/d、2.33g/kg·bw/d设三个剂量组，另设一个空白对照组0g/kg·bw，受试样品掺入基础饲料中饲喂大鼠，连续喂养30天，每周称1次体重和2次食物摄入量，计算每周及总的食物利用率，每天观察有无中毒变现和死亡，试验结束观察血液学、血液生化、脏器系数指标，并进行病理学检查。

试验结果：

1、急性经口毒性试验结果：受试样品对雌雄性小鼠急性经口的最大耐受量（MTD）均大于20.0g/kg·bw，属无毒级。

2、三项遗传毒性试验结果：Ames试验、小鼠骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸形试验结果均为阴性。

3、30天喂养试验结果：实验期间，动物生长发育良好，各剂量组体重、食物利用率、脏器重量、脏器系数均无异常改变，血液学指标与生化各项指标均在正常范围，各脏器病理学检查均未见与受试品相关的病理改变、给予人体推荐量100倍的受试物未观察到有害作用。

试验例2

增强免疫力功能试验：

试验目的：检验产品是否具有增强免疫力的功能

试验材料：实施例4制得的胶囊。

样品：人体口服推荐摄入量为每日两次，每次两粒，每粒0.35g/粒（体重按60kg计），0.03g/kg·bw，取胶囊内容物进行试验。

实验动物：清洁级ICR小鼠及饲料。

饲养条件：温度20-25℃、相对湿度40%-70%的屏障系统。

试验方法：按照《保健食品检验与评价技术规范》（2003版）评价标准进行动物实验，设低、中、高3个剂量和阴性对照组（无菌水），低、中、高3个剂量组分别相当于人用最大推荐剂量的5倍、10倍、30倍，即0.15g/kg·bw/d，0.30g/kg·bw/d，0.90g/kg·bw/d，低、中、高3个剂量配制浓度分别为15、30、90mg/mL。经口每日一次给予小鼠相应剂量的受试物，小鼠灌胃量为10mL/kg·bw，连续灌胃一个月后测定各增强免疫力功能指标。

实验结果：经口给小鼠0.15g/kg·bw/d，0.30g/kg·bw/d，0.90g/kg·bw/d低、中、高3个剂量的受试样品，中、高剂量组能显著提高小鼠迟发性变态反应程度（P<0.05，P<0.01）、提高小鼠血清溶血素（P<0.05，P<0.05），高剂量组能提高小鼠NK细胞活性（P<0.01）。受试物对小鼠体重、胸腺/体重比值、脾脏/体重比值、脾淋巴细胞转化实验、抗体生成细胞以及单核巨噬细胞功能未见明显影响（P>0.05），说明该样品具有增强免疫力的功能。

具体实验结果数据如下：

表1对绵羊红细胞诱导小鼠迟发型变态反应（DTH）的影响(n=10，x±s)

组别	左后足跖部24h厚度差(cm)	P值
			阴性对照组	0.033±0.012
低剂量组	0.034±0.018	0.865
			中剂量组	0.048±0.010	0.039*
高剂量组	0.059±0.016	0.008**

注：*P<0.05，**P<0.01

表2：对小鼠血清溶血素的影响(n=10，x±s)

组别	血清溶血素抗体积数值	P值
			阴性对照组	241.3±17.4
低剂量组	241.6±21.6	0.985
			中剂量组	256.2±22.1	0.042*
高剂量组	269.8±18.3	0.047*

注：*P<0.05，**P<0.01

表3：对小鼠NK细胞活性的影响(n=10，x±s)

组别	NK细胞活性（%）	P值
			阴性对照组	32.6±2.8
低剂量组	33.4±5.3	0.956
			中剂量组	31.9±6.5	0.935
高剂量组	45.2±4.6	0.007**

注：*P<0.05，**P<0.01

试验例3

改善睡眠功能试验：

试验目的：检验产品是否具有改善睡眠的功能

试验材料：实施例4制得的胶囊。

人体口服推荐摄入量为每日两次，每次两粒，每粒0.35g/粒（体重按60kg计），0.03g/kg·bw，取胶囊内容物进行试验。

实验动物：清洁级ICR小鼠及饲料。

饲养条件：温度20-25℃、相对湿度40%-70%的屏障系统。

试验方法：按照《保健食品检验与评价技术规范》（2003版）评价标准进行直接催眠实验、延长巴比妥钠睡眠时间实验、巴比妥钠阈下剂量催眠实验、巴比妥钠睡眠潜伏期试验，设低、中、高3个剂量和阴性对照组（无菌水），低、中、高3个剂量组分别相当于人用最大推荐剂量的5倍、10倍、30倍，即0.15g/kg·bw/d，0.30g/kg·bw/d，0.90g/kg·bw/d，低、中、高3个剂量配制浓度分别为15、30、90mg/mL。经口每日一次给予小鼠相应剂量的受试物，小鼠灌胃量为10mL/kg·bw，连续灌胃30d后测定各睡眠指标。

实验结果：经口给小鼠0.15g/kg·bw/d，0.30g/kg·bw/d，0.90g/kg·bw/d低、中、高3个剂量的受试样品，低、中、高3个剂量组均能明显缩短巴比妥钠诱导睡眠潜伏期（P<0.05,0.01,0.01），均能明显提高阈下剂量巴比妥钠诱导小鼠睡眠的发生率（P<0.05,0.01,0.01），低中高剂量组能明显延长巴比妥钠诱导的睡眠时间（P<0.05,0.01,0.01），说明实施例4制得的胶囊有改善睡眠的作用，且改善睡眠的作用成剂量效应关系。

具体实验结果数据如下：

表4对巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间的影响(n=15，x±s)

组别	睡眠时间（min）	P值
			阴性对照组	18.5±8.7
低剂量组	36.8±5.6	0.032*
			中剂量组	43.5±6.5	0.006**
高剂量组	45.8±7.3	0.004**

注：*P<0.05，**P<0.01

表5对阈下剂量巴比妥钠诱导小鼠睡眠发生率的影响(n=15，x±s)

组别	睡眠发生率（%）	P值
			阴性对照组	20
低剂量组	65	0.021*
			中剂量组	86	0.007**
高剂量组	90	0.003**

注：*P<0.05，**P<0.01

表6对巴比妥钠诱导小鼠睡眠潜伏期的影响(n=15，x±s)

组别	睡眠时间（min）	P值
			阴性对照组	36.8±8.5
低剂量组	27.9±5.4	0.046*
			中剂量组	24.6±5.1	0.007**
高剂量组	20.1±6.6	0.006**

Claims (9)

1.一种增强免疫力改善睡眠的保健食品的二步发酵制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)蜜环菌固体发酵：以含有增强免疫力功能的天然组分为药性培养基质，接种蜜环菌液体菌种进行双向固体发酵制备具有增强免疫力功能的药性菌质；

所述的药性培养基质的制备：先称取以下重量百分含量的原料：全粒大麦70％-80％、大豆10％-20％、黄芪2％-3％、红景天1％-2％、党参1％-2％、百合1％-2％、天麻1％-2％、石膏粉0.5％-1.5％，将各组分混合、粉碎，然后加水至水分含量为60％-65％，116℃-126℃灭菌0.5h-1.5h；

(2)乳酸菌液体深层发酵：以步骤(1)的药性菌质为原料，粉碎后添加酵母粉、谷氨酸钠、水制成发酵培养基，接种乳酸菌进行液体深层发酵生产改善睡眠的γ-氨基丁酸，制备同时具有增强免疫力和改善睡眠功能的发酵液；

(3)采用步骤(2)的发酵液，制备成不同剂型的增强免疫力改善睡眠的保健食品。

2.根据权利要求1所述的增强免疫力改善睡眠的保健食品的二步发酵制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的蜜环菌液体菌种的接种量为2％-10％。

3.根据权利要求1所述的增强免疫力改善睡眠的保健食品的二步发酵制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的药性培养基质的制备：先称取以下重量百分含量的原料：全粒大麦75％、大豆13％、黄芪3％、红景天2％、党参2％、百合2％、天麻2％、石膏粉1％；将各组分混合、粉碎，然后加水至水分含量为60％-65％，121℃灭菌1h。

4.根据权利要求1所述的增强免疫力改善睡眠的保健食品的二步发酵制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的双向固体发酵的条件为：发酵温度在25-28℃，发酵时间在25-30天。

5.根据权利要求1所述的增强免疫力改善睡眠的保健食品的二步发酵制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的发酵培养基采用以下重量份的原料：水1000重量份、药性菌质40-50重量份、酵母粉5-10重量份、谷氨酸钠15-20重量份，将药性菌质、酵母粉和谷氨酸钠溶于水，添加醋酸和醋酸钠配制成pH为5-6的缓冲液，116℃-126℃灭菌20min-40min。

6.根据权利要求1所述的增强免疫力改善睡眠的保健食品的二步发酵制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的乳酸菌的接种量为1％-5％。

7.根据权利要求1所述的增强免疫力改善睡眠的保健食品的二步发酵制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的液体深层发酵的条件为：发酵温度在28-32℃，发酵时间在48-72h。

8.根据权利要求1所述的增强免疫力改善睡眠的保健食品的二步发酵制备方法，其特征在于，所述的增强免疫力改善睡眠的保健食品的剂型为片剂或胶囊。

9.根据权利要求1～8任一项所述的制备方法制备的增强免疫力改善睡眠的保健食品。